鸭疫里默氏杆菌抗体检测的全菌体抗原间接ELISA方法的建立

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1、一4一养禽与禽病防治2009年第6期中图分类号：$858．31文献标识码：A文章编号：1008—3847(20O9)06一O0O4一O4摘要：本研究建立了检测鸭疫里默氏杆菌些方法经试验研究和临床应用都表明具有很好的应(Rimerrllaanatipestr，RA)抗体的全茵体抗原间接用价值，但都存在抗原制备过程较为复杂的缺点。本ELISA方法，最佳血清稀释倍数为1：100。以R_A1的研究在已成功建立以重组抗原P25为包被抗原的间甲醛灭活全茵体为包被抗原，棋盘滴定法试验确定接ELISA方法的基础上，进一步建立以RA1甲醛灭其最

2、适抗原包被浓度为5X10CFU／mL。与全菌体裂活全菌体为包被抗原的间接ELISA方法，以为鸭疫解抗原和重组P25蛋白为包被抗原的间接ELISA方里默氏杆菌病的临床诊断和免疫效果评价提供一种法相比较，三者均可检测不同血清型RA标准阳性血更经济廉价的诊断检测方法。清，结果符合性良好。用该方法检测雏鸭接种鸭疫里1试验材料默氏杆菌蜂胶灭活疫苗后血清抗体水平的变化，发1．1试验菌株现免疫后10天抗体水平开始上升，二免后10天抗体RA1、2、3、4、5参考菌株由新加坡国家兽医中心水平达到峰值。TohSayLing博士惠赠，本实验室保存。

3、关键词：鸭疫里默氏杆菌全菌体抗原间接1．2培养基与试验血清酶联免疫吸附试验改良液体培养基(TSB，含5％小牛血清)、胰酶大豆琼脂培养基(A，含5％小牛血清)，购自广东环凯酶联免疫吸附试验(Enzyme—LinkedImmunosor-微生物有限公司，按常规方法配制；HRP标记的羊抗bentAssay，ELISA)是目前发展最快，应用最广的免疫鸭IgG抗体购自KPL公司；RA1、2、3、4、5型阳性血学检测技术之一。基本原理是利用酶标记的抗原或清、鸭源大肠杆菌阳性血清、鸭肝炎阳性血清、鸭瘟抗体，在固相载体上特异地定量检测抗体或抗

4、原。具阳性血清、鸭源肠炎沙门氏菌阳性血清和鸭阴性血有快速、敏感、简便及易于标准化等优点，被广泛应清由本实验室制备；鸭疫里默氏杆菌蜂胶佐剂灭活用于感染性疾病的试验诊断及肿瘤标志物、半抗原疫苗是将RA培养物经甲醛灭活后加蜂胶佐剂制成。和残留物等的检测。在以ELISA方法检测抗体时，包1．3实验动物被抗原的质和量对ELISA结果有非常明显的影响。1日龄商品代樱桃谷肉鸭购自广州郊区某种鸭用作包被的抗原主要包括分离纯化的抗原物质、重场，网上饲养，不接种任何疫苗或抗血清，以不含任组抗原、灭活的完整病原体(如菌体、病毒颗粒)等，何抗菌添加剂

5、的全价饲料自由采食。饲料购自广东其中以灭活的完整病原体作为包被抗原，对易培养省农业科学院畜牧研究所饲料厂。的一些细菌、病毒等而言不失为一种快速廉价的途2方法径【】1。目前国内外已经报道的检测鸭疫里默氏杆菌抗2．11型鸭疫里默氏杆菌灭活全菌体抗原的制备体的ELISA方法中，其包被抗原种类主要有：分离纯从纯培养的TSA平板上挑取RA1标准株单菌化的RA抗原组分，如荚膜、脂多糖和外膜蛋白等；落接种于10mLTSB培养基中，37振荡培养过夜RA的全菌体超声裂解物Ol以及重组抗原⋯21等。这后，取5mL培养物接种于500mLTSB培养基

6、中，37"12本研究得到广东省农业科技攻关重点项目(2005A20401004和2006A20301002)资助。作者简介：吴彩艳(1978一)，女，蒙古族，内蒙古赤峰人，硕士，从事预防兽医学研究工作。通讯作者：覃宗华：qzh21@yahoo．corn．cnTEL：020—85291691；蔡建平：jianpcai@yahoo．corn．cnTEL020-85292237。养禽与禽病防治2009年第6期一5一振荡过夜培养。离心收集菌体，以PBS(0．]mol／L，送检的经剖检和细菌分离鉴定为RA1感染的10份pH7．4)离心洗

7、涤两次，将细菌沉淀重悬于PBS，调整阳性血清进行检测，评价所建立的以灭活全菌体为细菌密度为1X10~CFU／mL，参照Hassan等31方法加包被抗原的间接ELISA方法的应用效果。入终浓度为l％的甲醛，37~C振荡培养24h。取50L2．7灭活全菌体包被抗原间接ELISA方法检测培养物涂布于TSA平板，37％培养24h，鉴定无活菌RAI蜂胶灭活疫苗免疫雏鸭的抗体消长动态体存在后离心收集培养物，以PBS离心洗涤两次，然将1日龄健康雏鸭随机分成2组，每组20只，后将细菌沉淀重悬于PBS，加入终浓度为5％的甲第1组于4日龄用RA1

8、蜂胶灭活苗颈部皮下注射疫醛，即为ELISA抗原，4℃保存备用。苗0．5mL／只，一周后同剂量加强免疫一次，第2组为2．2菌体抗原间接ELISA最佳反应条件的确定对照组。分别于第4、11、14、21、28、35、42日龄从二将上述灭活全菌体(抗原)从1：10开始作倍比组中随机抽