信号肽和IL-4增强基于HEV中和表位（p179）基因疫苗诱导抗体应答的研究

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1、中文摘要中文摘要研究生：王春玲导师：王立新孟继鸿【关键词】：戊型肝炎病毒(HEV)：中和表位；基因疫苗；通用信号肽；自细胞介素4(IL-4)戊型肝炎病毒(hepatitisEvirus，HEV)是无包膜的单正链RNA病毒，主要通过胃肠道传播，是引发急性戊型肝炎(HepatitisE，HE)的病原体。目前HE尚无特效的抗病毒治疗药物，因此，HEV疫苗在HE防治中的作用受到人们的重视，而诱导具有保护作用的中和抗体是HEV疫苗的关键。在以往的研究中，我们利用His融合靶抗原的原核表达技术、抗原mapping技术和基于PCR的体外中

2、和试验等发现，HEV中和抗原表位位于ORF2编码蛋白的第452至617位氨基酸之间，这为研制基于中和表位的HEV疫苗奠定了物质基础。基因彼苗因其具有制备简单、性质稳定，经济以及由体内真核细胞表达的靶抗原具有与天然病毒抗原相似的构象结构等优点，而受人们关注并已用于HEV疫苗的研究。为进行基于HEV中和表位基因疫苗的研究，我们曾去掉原p166N端His-tag并构建p166编码基因的真核表达载体，但实验结果发现：这些真核表达载体不能有效表达p166多肽、也很难在小鼠体内诱导明显的抗体应答。为此，我们又以p166为基础重新进行了抗

3、原mapping试验，结果证实：不同的表达载体以及目的基因的长短直接影响靶抗原在体内、体外的表达，最终我们成功发现了能在真核细胞有效表达的、最短的、含中和抗原表位的p166的同源序列多肽—p179(位于ORF2编码蛋白第439,．-617位氦基酸)。在本研究中，我们以pVAX为真核表达载体、HEV-ORF243””(pl79)为靶基因构建重组质粒，以肌肉注射法进行基因免疫。观察该基因疫苗能否在小鼠体内诱导HEV特异性的体液免疫应答；在此基础上，我们拟在p179编码基因的5’端插入通用信号肽(tPA)编码序列，探讨真核表达载体

4、产生的分泌性靶抗原能否增强基因免疫诱导的特异性抗体应答；同时，引入白细胞介素4(IL4)作为基因免疫的分子佐剂，探讨IL．4对基于HEV中和表位-p179基因免疫诱导的免疫应答的增强作用。方法：将HEV-p179、tPA编码基因分别插入真核表达载体pVAX，构建重组质粒pVAX一179和pVAX．tPA．179。采用脂质体转染法分别将空质粒和重组质粒体外转染HEK-293T细胞和HepG2人肝癌细胞，并以Westemblot法和间接免疫荧光法检测靶抗原的表达；采用肌肉注射法分别于0、2、4周对Balb／e小鼠实施基因免疫(分

5、pVAX-179单独免疫组、pVAX-tPA-179单独免疫组以及与pUMVC．rolL4共免疫组等实验组，100¨∥100“l，只小鼠，每组8只小鼠)，设空质粒组对照。定期采集血清标本，ELISA法检测各组小鼠血清中抗HEV-IgG及其亚型，并以硫氰酸盐洗脱法检测血清特异性IgG抗体的亲合力。取第12周免疫小鼠脾细胞，经特异性抗原p179体外刺激72h后，采用ELISA法检测培养上清的细胞因子。采用基于PCR的体外中和试验检测基因免疫诱导的特异性抗体的中和活性。结果：1酶切实验及DNA序列分析证实：成功构建了pVAX-17

6、9和pVAX-tPA一179重组质粒，p179、和tPA的编码读码框架正确。检测．p179的体外表达显示：与空质粒pVAX作对比，pVAX·179、pVAX-tPA一179均能在体外真核细胞中有效地表达目的抗原-p179。提示：在目中文摘要的抗原基因5’端插入信号肽(tPA)编码基因未影响目的抗原的表达，未改变p179抗原袭位的构象。2检测免疫小鼠血清特异性lgG抗体，发现：基于HEV中和表位p179的基因疫苗能诱导Balb／c小鼠产生特异性的抗HEV-IgG抗体：与p179蛋白免疫相比：基因疫苗诱生的特异性tgG抗体以lg

7、G2a亚型为主、而p179蛋白免疫诱生的抗体主要以IgGl豫型为主；基因疫苗诱导抗体的亲合力明显高于p179蛋白免疫。提示：基因疫苗持续表达的抗原能促进抗体亲和力的成熟。体外中和试验显示：基因免疫诱导的特异性抗体具有阻止HEV体外感染人肝癌细胞7721的中和活性。3比较pVAX，179和pVAX．tPA．179免疫小鼠血清中特异性lgG抗体水平，发现：pVAX-tPA．179基因免疫组比pVAX．179基因免疫组提前1—2周产生特异性IgG抗体、而且抗体的总体水平显著高于pVAX．179组(P

8、示：pVAX4PA一179同耐提高了IgG{和IgG2a水平，但更加显著地提高了IgGj的水平。细胞因子检测也发现：pVAX．tPA．179免疫组小鼠脾细胞经抗原体外刺激72小时后产生了较高水平的IL-4、较低水平的IFN-Y，提示：引入通用信号肽作为基因免疫分子佐剂显著增强了基因免疫诱导