基于hev中和表位的基因免疫诱导特异性抗体及中和作用研究

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1、基于HEV中和表位的基因免疫诱导特异性抗体及中和作用研究：王春玲,杨书才,孟继鸿,王立新【摘要】　　目的：观察基于戊型肝炎病毒中和表位(p179)的基因免疫是否能在小鼠体内诱导具有中和作用的抗体应答。方法：构建含HEV中和表位p179编码基因的真核表达质粒pVAX179,以肌肉注射法对BALB/c小鼠实施基因免疫，实验组每只小鼠给pVAX179100μg,并设立空质粒pVAX和HEVp179蛋白两个对照组。定期采集小鼠血清,ELISA法检测其特异性抗HEVIgG抗体及其亲合力；以基于PCR的体外中和实验检测抗体的中和活性。结果：pVAX17

2、9质粒基因免疫诱导小鼠体内产生了特异性抗HEVIgG抗体,抗体水平于第10周达高峰,OD值为0.55±0.13,与空质粒pVAX组(0.15±0.07)比较差异有统计学意义(P＜0.001)。第6周实验组抗体亲合力(ED50为2.5mol·L-1)高于蛋白对照组（ED50为2.0mol·L-1),基因免疫促进了抗体亲合力的成熟；体外中和实验证实产生的特异性抗体能够阻止HEV感染人肝癌细胞7721,具有中和HEV的活性。结论：基于戊型肝炎病毒中和表位(p179)的基因疫苗pVAX179能够在小鼠体内诱导产生具有中和作用的抗体应答。【关键词】戊型肝

3、炎病毒；中和表位；基因疫苗；抗体应答；中和作用　　［Abstract］Objective：Toinvestigateice.Methods：Theneutralizationepitope(s)HEVp179codinggeneidpVAX179.BALB/cmicemunizedi.m.id,mockDNA,and1μgproteinofHEVp179,respectively.SeracollectedattheindicatedtimesfromtinedthelevelsandavidityofspecificantiHEVIgGa

4、ntibodybyELISA.TheneutralizingactivityofinducedantiHEVantibodymunizationsaturationofantibodies.TheantiHEVlevelreachedthehightestvaluesabout10pVAX179immunizedmiceHEVp179proteinimmunizedgroup.Inaddition,thepostimmuneseraobtainedfrompVAXp179vaccinatedmiceice．　　［KeyidMegaKit购

5、自QIAGEN公司,纯化HEVp166［3］、HEVp179蛋白由本室自制,HRP标记羊抗小鼠IgG抗体购自Sigma公司,0.75%布比卡因和戊巴比妥钠购自上海禾丰制药有限公司,硫氰酸钠购自Sigma公司,大肠杆菌DH5α为本室保存。　　1.2重组质粒pVAX179的构建、鉴定及大量纯化　　以PCR法获得HEVp179编码基因,经NheⅠ和BamHⅠ双酶切后与酶切空载体pVAX进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,挑取转化菌落进行PCR筛选,阳性克隆进行DNA测序。大量纯化质粒DNA,微量紫外分光光度仪检测DNA浓度,并用生理盐水将浓度调

6、整至1μg·μl-1。　　1.3重组质粒pVAX179的体外表达　　在Nerk细胞小室内接种HepG2人肝癌细胞,24h后待其长到80%底面积时,采用脂质体Lipofectamine2000方法［4］转染真核表达质粒pVAX、pVAX179,浓度为1μg·μl-1。培养48h后采用间接免疫荧光法检测目的抗原在细胞内的表达,方法如下：0.01mol·L-1PBS(pH7.4)洗细胞3次,4%多聚甲醛室温固定10min后室温吹干；0.01mol·L-1PBS(pH7.4)洗细胞3次,以含5％BSA的TBST37℃封闭40min；用5％BSA的TBST

7、稀释抗HEV单克隆抗体(1∶1000),37℃作用60min；0.01mol·L-1PBS(pH7.4)洗细胞3次,5％BSATBST稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体37℃作用60min；0.01mol·L-1PBS(pH7.4)洗细胞3次,50%甘油的PBS封片,荧光显微镜下观察。　　1.4实验动物和基因免疫　　6～8周龄、16～18g体重的雌性BALB/c小鼠(H2d),购自复旦大学实验动物科学部。以免疫pVAX179重组质粒为实验组、空质粒pVAX和HEVp179蛋白为对照组,每组均为6只,肌肉注射法实施基因免疫,免疫剂量均为每只小

8、鼠100μgDNA(蛋白对照组每只小鼠1μgHEVp179蛋白),于第2、4周各加强免疫1次,共免疫3次。