《疏水层析HI》PPT课件

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1、疏水层析（HIC）一实验原理疏水层析(HydrophobicInteractionChromatographyHIC)是利用被分离样品中不同生物分子表面的疏水性差别，而将其分离纯化的一种层析技术。疏水层析的介质通常是一类在惰性支持物上接有疏水基团的层析载体，如苯基琼脂糖（PhenylSepharose）,辛基(Octyl),丁基(butyl)琼脂糖等。对于不同的蛋白质和多肽而言，其分子表面一般有着不同的疏水和亲水结构区域，当将这些生物样品加入到含有高盐（高离子）浓度缓冲液的HIC柱中时，由于溶液中高浓度盐离子与水分子的作用，降低了样品分子的溶剂化作用，从而增加暴露了样品

2、分子表面的疏水区，这样就促使样品分子表面疏水基团与HIC柱上的疏水基团相互作用结果使样品被吸附到HIC柱上。因此疏水层析亦称疏水相互作用层析。样品吸附在HIC柱上的强弱程度，取决于样品本身的疏水性质和样品环境中盐离子的强度。一般来说疏水性强的只需要较低的盐浓度，疏水性弱的则需要较高的盐浓度[如1.0mol/L(NH4)2SO4]。吸附在HIC柱上的生物分子，可以采用降低洗脱液中盐浓度的方法，使其从柱上洗脱下来，洗脱方法可以是梯度也可以是阶段洗脱的方式。样品中不同分子被洗脱的顺序依据其疏水性强与弱从先到后，从而达到分离的目的。二实验目的与要求通过苯基琼脂糖疏水层析柱，采用

3、阶段洗脱的方式分离——血红蛋白，以此了解疏水层析的原理、方法和实际的应用。三实验仪器与器材3-1、实验仪器（1）、层析工作站装置（2）、笔记本电脑（3）、紫外检测仪（4）、磁力搅拌器（5）、恒流泵（6）、天平（7）、混合器3-2、实验器材（1）、可调取液器（2）、量筒（3）、烧杯（4）、层析柱（5）、吸管（6）、吸管架（7）、滴管（8）、剪刀（9）、镊子（10）、玻棒（11）、骨勺（12）、洗耳球（13）、称量纸（14）、吸水纸（15）、保膜鲜（16）、标签纸（17）、记号笔四试剂与配制4-1、实验试剂（1）、BSA（2）、苯基琼脂糖（3）、磷酸氢二钠（4）、磷酸二氢钠

4、（5）、硫酸铵（6）、无水乙醇4-2、试剂配制（1）、BufferA（0.02mol/LpH7.2磷酸缓冲液含1.0mol/L硫酸氨）的配制：分别称取Na2HPO4___克，NaH2PO4___克和[NH4]2SO4___克于一烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至100毫升，混匀即可。（2）、BufferB（0.02mol/LpH7.2磷酸缓冲液）的配制：分别称取Na2HPO4___克和NaH2PO4___克于一烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至100毫升，混匀即可。（3）、乙醇（20%）溶液：取20.0ml无水乙醇，然后加80.0ml蒸馏水，混匀

5、即可。（4）、样品（10mg/ml）溶液：称取10.0mgBSA，加1.0mlBufferA溶液溶解[如有不溶物质，需在8000rpm离心5分钟，取上清作为上柱样品，本品易溶]。五实验步骤5-1、苯基琼脂糖[PhenylSepharose]凝胶的处理商品化的PhenylSepharose凝胶颗粒保存在20%的乙醇溶液中，使用时取适量体积的凝胶在砂芯漏斗中用大于10倍凝胶体积的蒸馏水充分洗涤，然后将洗净的凝胶转移到含有BufferA的烧杯中。5-2、装柱（1）、选择层析柱，观察柱底端过滤是否完好，将选择的层析柱垂直装好在台式铁架上，关闭柱底部出口，在柱内注入少许（约1.0

6、cm高）洗脱液。（2）、将烧杯中已处理好的PhenylSepharose凝胶，加适量的BufferA，搅成悬浮状，然后沿柱内壁细心的加至一定刻度。倒入时不要太快，以免产生泡沫和气泡。（3）、待树脂在柱子底部有明显沉积（10分钟左右）后，慢慢打开柱底部的出口，或用吸管吸去柱内上层过多的平衡液，继续向柱内加入悬浮的树脂直至沉积后柱床体高度为3.0厘米为止。（4）、在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败。另外树脂悬浮液的温度要相对恒定或应与室温接近，否则柱床体内易产生气泡而影响层析效果。（5）、检查层析柱是否装好。装好的层析柱应该没有“纹路”，节痕和气泡，并且柱床体表面平整

7、而均匀。这样方可投入使用，否则需要按上述步骤(1-4)重新装柱直至达到要求为止。（6）、在装柱的同时应将其他仪器设备接通电源，并按实验要求进行调试。5-3、平衡用5倍床体积的BufferA缓冲液，以0.5ml/min的流速，平衡30分钟，方可。5-4、加样（1）、移去层析柱上端出口塞，打开层析柱底端出口，小心使层析柱内液体流至层析柱床体表面时即行关闭。（2）、用自动取液器吸取样液1.0毫升沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面。加样完毕后，慢慢打开层析柱底端出口，使液面流至与树脂表面相平时即行关闭。5-5、洗涤用自动吸管（或滴管）吸取适