鸡IL2和NDVF基因的克隆、表达及其融合基因重组质粒的构建

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1、安徽农业大学硕士学位论文鸡IL-2和NDV-F基因的克隆、表达及其融合基因重组质粒的构建姓名：许发芝申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：余为一20040601摘要新城疫(NewcastleDisease，ND)是由新城疫病毒(Newcastlediseasevinls，NDV)引起的一种具有高度传染性的病毒性传染病。NDV能感染鸡、火鸡、鸭、鸽子和野生鹦鹉等多种禽类。由于ND给养禽业造成巨大经济损失，被国际兽疫局定为A类传染病。研究证明，在NDV感染过程中，位于病毒囊膜上的融合蛋白(F蛋白)是病毒穿入细胞，使宿主细胞产生融合和溶血的重要因子；同时也是病毒的主要保护性抗原。

2、正因为如此，F蛋白已经成为研究新城疫基因工程疫苗和DNA疫苗等新型疫苗的首选抗原。白细胞介素2(Imerleukin．2，IL．2)是由T细胞分泌的一种重要淋巴因子，它具有促进T细胞、B细胞的增殖和分化，增强单核细胞以及NK细胞的杀伤活性等免疫调节功能。IL．2的这种免疫调节功能，还表现在能够增强疫苗诱导的免疫反应。因此，近年来IL．2常被用来作为DNA疫苗的免疫佐剂，成为免疫学研究的热点。为了深入研究新城疫DNA疫苗，提高DNA疫苗的免疫应答效果，本研究运用分子克隆技术，分别获得了NDV的F基因和鸡的IL一2基因，并在真核细胞和原核细胞中进行了表达。首先。根据GenBank中登

3、录的F48E9株F基因序列和鸡IL．2基因序列以及真核表达质粒pcDNA3的多克隆位点，自行设计了两对F基因序列引物，’之们是PFA：5’一CCCAAGCTT-ATGGGCCCCAAATCTTClACC．3’，PFBS：5’一CGGGArCC．TCAGATTCTTGTAGTGGCCCTC一3’，PFBF：5’一CGGGATCC．GA订CTTGTAGTGGCCCTC．3’；两对鸡IL．2基因序列引物：它们是P璩s：5’．CGGGATCC—CTGCcATGATGTGCAAAGTAC一3’，PIAF：5’CGGGAreC!GG稻珏eGGACTGCCATGATGTGCAAAG．3’，PI

4、B：5’GCTC，fAGA．CnIATTTTTGCAGA：rATCTCAC．3’。为了便于基因的克隆和表达，我们在引物的5’端设计了相应的酶切位点、保护位点、连接臂、起始密码和终止密码。应用反转录聚合酶链反应(RT_PcR)技术，从接种NDVF48E9株的鸡胚尿囊液中扩增获得了大小约为1660bp的基因片段：从conA诱导培养8h的鸡脾淋巴细胞中扩增获得了大小约为440b口的基因片段，分别与GenBalll(中登录的NDVF基因和鸡IL．2基因大小一致。经单酶切鉴定，这两个片段中均存在与NDVF基因和鸡IL．2基因相同的酶切位点。将其分别连接到pcDNA3质粒上，经质粒PcR和双

5、酶切鉴定后，筛选获得阳性重组克隆pcDNA3．IL．2和pcDNA3．F。核苷酸序列测定分析表明，NDvF基因开放阅读框由1662个核苷酸组成，编码553个氨基酸，与已报道NDvF基因的同源性为99％；鸡IL．2基因开放阅读框由432个核苷酸组成，编码143个氨基酸，与已报道鸡IL一2基因的同源性为98％。这表明本实验已成功地克隆了NDvF基因和鸡IL．2基因。再通过连接臂将F基因和IL．2基因进行连接，插入到口cDNA3质粒的HindIII和xbaI多克隆位点之间，经质粒PCR、双酶切和序列测定进行了鉴定，结果表明，已成功地构建了融合基因的重组质粒，并将其命名为∞DNA3．F．

6、IL．2重组质粒。其次，为了检测NDvF基因疫苗的体外表达效果，我们将pcDNA3．F重组表达质粒和pcDNA3空质粒经由脂质体介导的方法分别转染到COs．7细胞和p815细胞内，通过免疫荧光染色法、RT-PcR法和wbstcmbiotcing法检测目的基因的表达。转染的p815细胞用G418经2～3周的克隆筛选，获得了具有G418抗性并能够稳定表达F基因的p815．F细胞株。免疫荧光染色的结果显示，F基因在转染的COS．7细胞和p815细胞株中，分别获得了～过性表达和稳定表达。RT．PCR实验结果表明，F基因被成功地整合到P815细胞株的染色体中并能正确地转录出其mRNA。wi

7、stemblo佳ing结果则表明，转染重组质粒的p815细胞裂解物在分子量约为60000的位置出现一条特异性的染色条带，而转染空质粒的p815细胞裂解物则没有任何条带出现。最后，应用DNA重组技术，将鸡IL．2基因亚克隆到原核表达质粒pGEx．4T．1中，并转化大肠杆菌BL2l菌株。经IPTG37℃诱导表达4h后，sDs．PAGE电泳结果显示，谷胱苷肽．s．转移酶(GsT)与鸡IL．2的融合蛋白得到了表达，分子量约为42000，主要以包涵体形式存在。表达产物在十二烷基肌氨酸钠存在