流式细胞仪原理及应用 简介

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1、流式细胞仪原理与应用FLOWCYTOMETRY(FCM)PresentedbyHaoSha10-13-2012一、FCM概况二、基本构造和原理三、实验中注意事项一、FCM概述流式细胞仪(FlowCytometer，FCM):是集合光电子物理、光电测量技术、液流技术、计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。流式细胞术（Flowcytometry，FCM）以流式细胞仪为主要工具，对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒细胞的各种成分进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。FCM的特点和优势特点:单细胞，也能区分群体细胞可分析小于1/10000比例的稀有细胞群、

2、单细胞克隆等；定量的多参数测量和分析（散射光和荧光，可多达27色）快速测量和分析（每秒可达1000-10000个细胞）分选细胞的高纯度（可达99%）；流式细胞仪的测量对象大小0.2~300um对象类型细胞类型：（1）高等真核细胞;（2）酵母；（3）细菌;（4）多细胞的聚集体，如胰岛等非生命颗粒：细胞核、染色体、其它细胞器以及乳化微球等。流式细胞仪的类型临床型——小型，科研与临床结合型。科研型——大型，基础研究和加速分选型。新型流式细胞仪——2～7根激光管，可检测27个参数。高速分选，50000个/sec。目前国内主要流式细胞仪厂家：BecktonDickinson(BD

3、)公司BACKMANCOULTER公司流式细胞仪图片BDFACSCaliburBDAccuri®C6LSRIIBDFACSCAriaIIBDInflux二、基本原理和构造•用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，包绕着样品单行排列并高速流动，依次通过检测区域。以激光作为发光源，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。基本构造1）FluidicsSubsystem——保证细胞单个通过检测区2）OpticsSubsystem:excitationcomponents——使检测细胞发出继发荧光Opticssubsy

4、stem:collectioncomponents——规范散射光、继发荧光3）Electronicssubsystem——将光信号转化为电信号，使检测结果完美的表达出来4）Sortingsubsystem——保证细胞的分选功能构造模式图光学系统流动室及液流驱动系统激光光源及光束形成系统1、FluidicsSubsystem流动室与液流驱动系统•流动室：核心部件，样品在此与激光相交；•液流层流原理：鞘液（PBS或去离子水），使流动细胞拉开距离，单个细胞通过；•要求分辨率高的样品（DNA）应用低速：周期InjectorTipSheathfluidFluorescencesign

5、alsFocusedlaserbeam液流与流速控制2、光学系统：激光光源及光束成形系统excitationcomponents激光：一般选配2～4跟激光，如355nm，405nm，488nm，633nm等；国内最多6激光27色，国外最多7激光。激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚焦，形成约22×66μm的光斑，这样激光能量较强，以激发荧光染料。LSRII：355nm，405nm，488nm，633nmInflux：355nm，405nm，457nm，488nm，532nm，561nm，640nm3、光学系统：collectioncomponents•由若干组透镜、滤光

6、片和小孔组成，它们将不同波长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。•主要光学原件：滤光片(Filter)–长通滤片LongPassFilter,LP（>500nm）650/60–短通滤片ShortPassFilter,SP（<500nm）–带通滤片BandPassFilterBP（450～550nm）光学系统的结构LSRIIAriaIIIInflux355nmDAPI/Hoechst**375nm*405nmPacificBlueAlexaFluor430BDHorizon™V450488nmFITC***AlexaFluor488PE***PI/PE-TexasRed**

7、*PE-Cy5*PerCP-Cy5.5***PerCP/7-AADPE-Cy7***561nm*633nmAPC***AlexaFluor647AlexaFluor700**APC-Cy7***APC-H7AlexaFluor7804、Electronicssubsystem信号检测与分析光信号PMT电信号散射光信号•散射光信号不依赖任何样品的制备技术，物理参数。–FSC(ForwardScatter)前向散射角：反应细胞大小和表面积，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。–SSC(SideSc