流式细胞仪原理 流式细胞仪原理与应用

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1、流式细胞仪原理流式细胞仪原理与应用流式细胞仪原理与应用流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术,激光技术,流体力学,细胞化学,细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能.它不仅可测量细胞大小,内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原,细胞内DNA,RNA含量等,在血液学,免疫学,肿瘤学,药物学,分子生物学等学科广泛应用.流式细胞仪的技术指标与主要构造流式细胞仪主要由以下五部分构成:?流动室及液流驱动系统?激光光源及光束形成系统?光学系统?信号检测与存储,显示,分析系统?细胞分选系统.主要技术指标1.流式

2、细胞仪的分析速度:一般流式细胞仪每秒检测1000,5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞.2.流式细胞仪的荧光检测灵敏度:一般能测出单个细胞上5%即可区分.3.前向角散射(FSC)光检测灵敏度:前向角散射(FSC)反映被测细胞1的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm,0.5μm.4.流式细胞仪的分辨率:通常用变异系数CV值来表示,,一般流式细胞仪能够达到1000个/秒,分选细胞纯度可达99%以上.主要构造和工作原理:主要构造和工作原理:流动室及液流驱动系统流动室(FlowCell或FlowChamber)是流式细胞仪的核心部件,流动室由石英玻璃制成,单细胞

3、悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心,细胞在此与激光垂直相交,在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区.流动室里的鞘液流是一种稳定流动,控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统,压力感受器组成,只要调整好鞘液压力和标本管压力,鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向,能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等,从而使激光激发的荧光信息准确无误.流动室孔径有60m,100m,150m,250m等多种,供研究者选择.小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室.主要构造和工作原理:主要构造和工作原理:激光光

4、源及光束形成系统流式细胞仪可配备一根或多根激光管,常用的激光管是氩离子气体激光管,它的发射光波长488ηm,此外可配备氦氖离子气体激光管(波长633ηm)和/或紫外激光管.流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的,荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关,激光是一种相干光源,它能提供单波长,高2强度,高稳定性的光照,正是能达到这一要求的理想的激发光光源.在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜,将激光光源发出的横截面为圆3形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22m×66m),在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一

5、致.主要构造和工作原理:主要构造和工作原理:光学系统流式细胞仪的光学系统由若干组透镜,小孔,滤光片组成,大致可分为流动室前和流动室后两组.流动室前的光学系统由透镜和小孔组成,透镜和小孔(一般为2片透镜,1个小孔)的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束,使激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致,最大限度的减少杂散光的干扰;流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成,滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管.滤光片主要有三类:长通滤片(LP)--只允许特定波长以上的光线通过,短通滤片(SP)-

6、-只允许特定波长以下的光线通过,带通滤片(BP)--只允许特定波长的光线通过,不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT),如接收绿色荧光(FITC)的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525,接收色橙红色荧光(PE)的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575,接收红色荧光(CY5)的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675.主要构造和工作原理:主要构造和工作原理:信号检测系统当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和4荧光信号,散射光分为前向角散射(ForwardScatter,FS)和侧向

7、角散射或900散射(SideScatter,SS),散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备(如染色)无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光,它是我们要测定的荧光,荧光信号较强,这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光.前向角散射(FS)反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号;侧向角散射或900散射(SS)反映被测细胞的细胞膜,细胞质,核膜的折射率和细胞内颗粒的性状

8、,它由一个光电倍增管(P