流式细胞仪原理、应用幻灯

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1、流式细胞仪标本处理一般原则及方法流式细胞仪使用一般方法及技巧临床流式细胞仪应用简介殷跃锋流式细胞仪原理介绍双光源系统流式细胞仪在管道大约50倍直径距离处，鞘液中心速度与边缘速度达到稳定，形成稳定的层流。样本与鞘液未入管道时，边缘与中心速度一致。进入管道后，受管壁粘性阻力边缘速度下降，中心速度不变。流体形成层流后，会产生流体聚焦效应，所有颗粒均被推致流速最快的液流中。颗粒以衡定的速度作匀速运动。无论每秒检测数量为多少，颗粒经过检测区的速度是衡定的流式细胞仪标本准备染色的一般原则及方法标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。根据各种具体实验，选用不同的抗凝剂。可用的抗凝

2、剂如下：EDTA：2mg/ml枸椽酸钠：0.38%肝素：15IU/ml标本处理时间：新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析样本固定方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。样本处理标准试剂：一、10%BovineSerumAlbuminBSA1.溶解10gBSA至100ml蒸馏水中2.4ºC，20000g离心30分钟3.分装后-20ºC保存二、0.1%BSA-PBS缓冲液1.准备500ml，PH7.3PBS2.加入5ml10%BSA3.使用0.45um滤网过滤三、氯化铵溶血剂1.在一升蒸馏水中溶解8.29gNH4CL,1gKHCO3和3

3、7mgNa2EDTA2.调节PH值至7.23.在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤方法一：溶血法取100ul抗凝全血；2.快速加入2mlNH4CL溶血剂,混匀；3.室温孵育10分钟；4.4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2mlBSA-PBS；5.4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2mlBSA-PBS；6.4ºC，400g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。富集白细胞注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸为主的溶血剂（CoulterQ-Prep），基于NH4CL的BD公司的FACSLyse溶血剂。优点：溶血时间快？？？，在流式细胞仪上

4、可清楚地将淋巴、单核、粒及红细胞碎片相区分。缺点：需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响，随时间细胞形态变化大。方法二：密度离心法提取单个核细胞Histopaque1077为Ficoll与Sodiumdiatrizoate(泛影酸钠)混合物，其密度为1.119～1.077。通过离心可将全血中的粒细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.119～1.077的血浆层，而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。1.准备2ml抗凝血（根据实验要求确定用血量），等量PBS稀释；2.准备1mlHistopaque1077(Sigma)；3.室温下700g离心30分钟；4.仔细将含有单个核细胞血浆

5、层吸出；5.加4mlBSA-PBS，400g离心10分钟；6.加2mlBSA-PBS清洗2次。操作淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤便可。从组织获取淋巴细胞将样本置于陪替氏培养皿，加入15mlBSA-PBS；将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离；将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。方法：其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。制备大鼠肾脏浸润细胞解剖刀、CO2孵育箱、滤网以及含1mg/ml胶原酶的细胞培养液（无血清）材料：方法：1.将样本置于皮氏培养皿，用解

6、培刀切成小块；2.加入10ml胶原酶溶液，37ºCCO2培养箱孵育30分钟；3.滤网过滤；4.密度梯度法离心提纯淋巴细胞。其他类型细胞在组织中提取细胞通常使用酶消化法。同样对于不同组织处理方法也各异，以下是讲述通用的胶原酶消化法制备组织细胞。改良后的此法尚可用于制备人、鼠上皮细胞。材料解剖刀0.15%胰蛋白酶Hanks’s缓冲盐或PBS，pH7.3不含Ca、Mg离子的HBSSII型胶原酶1%BSA或5%FBS5ml的吸样管35um尼龙滤网DNase将样本置于皮氏培养皿，加15mlBSA-PBS，将样本切成1mm3大小，用镊子将其分离；HBSS或PBS洗清加入10ml无Ca、Mg离子0

7、.2%II型胶原酶溶液0.02%DNase1的HBSS；37ºC摇床上孵育15~60分钟，视样本类型而定；操作用5ml的吸样管反复吹打，制成单个细胞悬液；使用35um滤网过滤，300g离心5分钟；用PBS或细胞培养液重悬样本；对于某些样本过滤后仍有小块组织，重复第5步获取细胞，重复第7步；用含0.15%胰酶、0.02%DNase1不含Ca、Mg的HBSS重悬，37ºC孵育一段时间加入1%BSA或5%FBS，灭活酶活性。细胞培养许多原代细胞和培养细胞系，都为