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1、生物技术通报·技术与方法·BIOTECHNOLOGYBULLETIN2006年第1期适合原位RT2PCR的石蜡切片制作方法刘宏牛建新韩晓燕(石河子大学农学院园艺系,石河子832003)摘要:石蜡切片是原位RT2PCR中常用一种生物制片技术,简要阐述原位RT2PCR的原理以及适合于原位RT2PCR的石蜡切片的制作流程,对其易出现的问题和解决办法作了简要的概述。关键词:石蜡切片原位RT2PCRResearchoftheParaffinMethodSuitsinSituRT2PCRLiuHongNiuJianxinHanX
2、iaoyan(DepartmentofHorticulture,AgriculturalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832003)Abstract:TheparaffinslicewasabiologicalslicemakingtechnologycommonlyusedinInsituRT2PCR.ThisarticlebrieflyelaboratedtheInsituRT2PCRprinciple,aswellastheappropriateflowofparaffin
3、slicemakingfortheInsituRT2PCR.Andthequestionsthatwereeasyappearedintheparaffinmakingandthesolutionswerebriefelaboration.Keywords:ParaffinsliceInsituRT2PCR[1]20世纪80年代中期(1985),Karymullis发1原位PCR的基本原理明了PCR技术。从此,分子生物学领域中一项具有原位PCR(insituPCR,ISPCR)技术Haase于[3]强大生命力的聚合酶
4、链式反应技术诞生。在形态学1990年首次报道。其原理就是在组织细胞原位研究领域,将PCR技术与形态结构相结合,产生了进行PCR高效扩增,以检测单拷贝或低拷贝的特定原位PCR技术。近年来,PCR与逆转录酶结合的DNA或RNA序列。原位RT2PCR是原位PCR中逆转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT2PCR)常用的一种方法,它可将mRNA原位反转录为cD2技术得到了大量的改进和越来越广泛的应用,原位NA,然后进行原位PCR。因此,可用于扩增和检测RT2PCR技术应运而生。石蜡切片是原位RT2P
5、CR标本中罕见的mRNA,比如定量细胞表达特殊mR2中常用的制片技术,其特点是能够保存良好的形态NA丰度或检测扩增产物的细胞起源。其优点是逆结构,切片易于保存,便于进行回顾性研究,但其弱转录后,即在显微镜载玻片上进行扩增,鉴定信号细[2]点是敏感性较低。石蜡切片的制作一般要经过取胞的起源,不需要标本中提取mRNA。这样就不会材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片及封固有在核酸的分离步骤中潜在的信号丢失。原位逆转等过程。整个过程虽然并不复杂但要真正制出高质录PCR的基本步骤包括:标本制备、预处理、反转录量的切片,
6、每一个步骤的操作都很重要,需要不断的反应、原位PCR扩增、扩增后处理和原位检测。原摸索和改进。本文就适合于原位RT2PCR的石蜡位逆转录PCR的标本制备有三个重要目的:保存良切片的制作流程及其易出现的问题和解决办法作了好的形态学特征、使PCR试剂易于到达细胞内欲扩[4]简要的阐述。增的序列、避免扩增产物扩散或漏出细胞。因此,收稿日期:2005212229基金项目:国家自然科学基金资助项目(30060053、30360066);国家科技攻关计划引导项目(2003BA546C);兵团科委项目(NKB02SDXNK01SW
7、)作者简介:刘宏(19802),女,在读硕士,研究方向:从事果树生物技术的研究通讯作者:牛建新,njx105@163.com2006年第1期刘宏等:适合原位RT2PCR的石蜡切片制作方法59制作出合适的切片对原位PCR的成败有着至关重与包埋剂相混合的溶剂来处理材料,以便于包埋剂要的作用。的渗入。二甲苯是最常见的透明剂,二甲苯及浸蜡[8]2石蜡切片制作步骤时间过长则组织易脆、变硬。取材时将组织块厚2.1标本固定规定在0.1～0.3cm内,这样易固定脱水,但其收缩其目的:(1)保存组织细胞的形态结构,便于定性强,极易使组
8、织变脆导致切片时组织易破碎,故在位。(2)保存用做PCR模板的DNA或RNA。固这一过程中要严加控制。一般30min就可达到透定剂有两类(1)交联固定剂:甲醛、戊二醛。保持组明的程度,但温度较低时可适当延长时间或置于温织细胞形态好,但渗透慢。(2)沉淀固定剂:甲醇、乙箱中加热。另外在透明过程中还要注意更换二甲醇和丙酮。保存组织形态结构差,且影响
