反向斑点杂交技术及其在基因诊断中的应用

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1、反向斑点杂交技术及其在基因诊断中的应用林炳生张太松510080广州中山大学达女基因诊断中心【摘要】反向斑点杂交采用生物索标记的引物进行靶核酸的扩增，将产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交，一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快速、简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测等多个方血，具有潜在的临床应用价值。【关键词】反向斑点杂交；基因诊断ReversedotblotmethodanditsuseingenediagnosisLINBingsheng,ZHANGTaisong.DaanGeneDiagnosticCent

2、erofSunYat-senUniversity,Guangzhou,510080China,[Abstract]Thereversedotblot(RDB)method,byusingbiotinelabeledprimers,amplifythetargetnucleicacidandhybridizewiththeprobescovalentlyboundtothenylonmembrane.Itcanidentifyseveralkindsoftargetsequenceinasingleassaywithreliabilityandspecificity.RDB

3、assaywaswidelyappliedtothepathogenidentification,genepointmutationassay,geneticpolymorphismdetection,andprovidesapromisingtoolforclinicalnucleicacidanalysis.[Keywords]reversedotblot(RDB)；genediagnosis反向斑点朵交(reversedotblot,RDB)是Saiki等[1]提出的一种斑点朵交技术，该技术采川固化了多种特异性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即对同时筛杳被检D

4、NA中的多种突变。这种以膜上固定探针取代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。本文拟对该技术的原理、方法、特点及其应用作简要综述。1原理和方法RDB检测点突变仍遵循等位基因特异性寡核伴酸(allelespecificoligonucleotide,ASO)法的基本原理[1],即通过位丁•寡核背酸探针中部的等位基因(或序列)特异性碱基与靶序列DNA的碱基配对和严格条件下杂交和洗脱來达到检测基因中少数碱呈变化(少一至单个碱慕)的口的。为传统ASO

5、点杂交不同的是，RDB以膜上固定ASO探针取代了固定靶DNA(基因组DNA或PCR扩增片段)，这就是“反向”的含义(如图1所示)。最初探针固定的方式是先用末端转移酶在合成的ASO探针的3端加上一段多聚(<1T)尾链(一-般为400个碱基左右)，这种帯尾的ASO点到膜上后再经紫外光照射，其多聚(dT)即可与尼龙膜表面的氨基作川而结合在膜上。1991年Zhang等⑵建立了使ASO与膜共价结合的化学法。此法先用EDC(乙基二甲氨基丙碳二亚胺)对膜进行“活化”处理，继而将亍端带有修饰氨基“臂”的-NH2A/膜表曲的-COOH和互反应形成共价结合。山于化学法结合效率高(80-90%

6、),且稳定性好(制备的ASO膜条室温下至少可存放半年)，目前已被普遍采用。FigLIheschematicofRDBprinciple图1.RDB杂交［理示意图RDB的主要特点是将多种不同序列的ASO固定在同一膜条上，其技术关键是根据靶序列位点的碱基组成和结构特点，通过优化杂交条件，使整个检测结杲达到最佳的杂交信号。尽管检测信号在各个杂交斑点上所就示的强度可能有些差别，但这不会影响阴阳性结果的判断［l］oRDB杂交信号的检测一般采用非放射性物质。非放射性物质标记的方法有扩増片段的随机标记法⑶和PCR引物的5端修饰法［1,2］,后者操作方便，被更多的研究者使用。2技术特点反

7、向斑点杂交具有以下特点：①将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样木DNA乂互不干扰，故能-次性筛查多个样本，每个样本又可筛杏多种不同的位点；②方便快捷。膜条制备时间较短，并能大最预先制备放于4°C保存待用（至少可存放半年）；经过一次PCR扩增和一次反向杂交就可以完成对标木的检测，若采用快速导流型杂交仪，则整个杂交过程在60min即可完成。③非放射性标记引物，避免同位素的半衰期所带來的引物保存期短的问题，并使操作更女全。④充分利用PCR的高灵敏度和探针杂交的高特异性。国内有学者对HBV进行了基因分型，检测下限可达到103拷贝