枣疯病植原体rp基因分子的检测与鉴定试验进展.doc

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1、枣疯病植原体rp基因分子的检测与鉴定实验进展枣疯病是枣树生产上发生最普遍、危害最严重的传染性检疫病害。因其防治难度大•具有毁灭性，俗称为枣树的“癌症”，枣疯病已成为枣产区农民致富奔小康的重要制约因素，进一步了解和防治枣疯病是当务之急。本试验以田间感病的枣树品种为试材，采用PCR检测，克隆测序后进行序列比较分析，旨在研究JWB植原体的快速检测与鉴定技术，并为其他植原体病害的研究提供一定的参考。JWB植原体rp基因的分子鉴定研究1.DNA的提取：采用本实验室常用的改良CTAB法提取枣树总DNA。尽量去分除叶肉，而取叶脉部。图1枣树总DNA提取电泳图谱CKSXSHCk

2、：健康植株SX：陕西病株SH：山西病株通过CTA13法，提取的DNA如图1,由于植原体在枣树中分部不均匀，应该根据不同时期采取不同组织，本实验采取样品为叶子和枝条。通过对总DNA的粗提取物和总DNA提纯后的物质进行比对，由于枣树含糖量比较高，所以提纯后DNA的电泳效果较好，但是进行PCR比较，未测发现二者差异性，是否提纯DNA对实验的影响不大。此方法可以应用于枣树总DNA的提取中。本实验DNA的提取方法我们采用了两种方法，分别是CATB法和用试剂盒提取，通过对两种方法的采用，我们可以分析对比出两者之间的优缺点，为后面的实验分析提供依据。DNA提取图谱如下图所示：

3、CTAB法试剂盒提取CTAB的优势是对多糖的去除比较彻底，特异性髙，缺点就是过程繁琐，耗时长，而试剂盒提取DNA的优点就会纯度高，质量稳定，提取过程简单方便，但其特异性不高，容易降解。2.参考相关文献并借助计算机软件设计合成所需引物，进行JWB植原体rp基因的PCR扩增，并进行PCR产物的回收、克隆及测序。2.1JWB植原体rp基因的扩增2.1.1采用通用引物Rp(v)F1：5*-TCGCGGTCATGCAAAAGGCG-3*,RpRl：5f-ACGATATTTAGTTCTTTTTGG-3'2.1.2反应体系(25ul)成分体积(ul)ddH.O9.5Mix12

4、.5引物11引物21DNA模板1运行程序(35循环)预处理94°C(5min)变性94°C(45s)退火50-60°C(45s)延伸72°C(90s)延伸72°C(lOmin)进行JWB植原体rp基因的PCR扩增，得到1230bp的片段。如图3所示：(mcirker为4000)M123456CK1000-图3.不同退火温度下JWB植原体rp基因扩增图谱1：50.7°C2：51.9°C3：53.7°C4：56.1°C5：58°C6：59.2°CCK：对照JWB植原体rp基因回收图谱2.2PCR产物的回收图4.2.3PCR产物的克隆2.3.1连接本实验采用pMD19

5、-T作为载体，可以提髙PCR产物的连接，克隆效果，并且菌落显蓝时间短，有利于克隆体蓝白斑筛选，加速试验的进行，PMD19-T载体连接反应体系如下:体积(ul)4.50.5510试剂PCR产物PMD19-T载体溶液1总体积上述体系16*连接（7h左右）2.3.2转化本实验用大肠杆菌感受态细胞转化，实验步骤需在无菌条件下操作，动作要轻，克隆反应体系的建立，直接影响连接的效应，温度和时间在整个过程中起着关键性的作用。rp基因的大小为1230kb,处于l-2kb,所以最佳反应时间为10-15min,加样的整个过程需在冰盒上操作。转化过程中要严格控制时间（加连接产物于50

6、ulTransl-Tl感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴25分钟，42匸热激30s,立即至于冰上2min。37工培育lh,加好样37工放置30min,需按要求操作。否则可能降低可能效率。2.4运用DNAMAN软件，分析这些片段，获得保守序列（图4）,设计的三对对引物(如图3颜色标注的位置)：RPK1)：5*-TCGCGGTCATGCAAAAGGCG-3',RP1(2)：5,-ACTCCCATCGAAATAGAATC-3'；RP2(3)：5*-TTACCTCGTTTGTTTCCG-3*,RP1(2)：5*-ACTCCCATCGAAATAGAATC-3'；RP2(3)：5

7、*-TTACCTCGTTTGTTTCCG-31,RP3(1)：51-ACGATATTAGTTCTTTTTGG-3*进行扩增，分别得到926bp,642bp和926bp的片段(如图4所示)。1.总长1230bpRPl(l)：5*-TCGCGGTCATGCAAAAGGCG-3*RP3(1):5*-ACGATATTAGTTCTTTTTGG-3TCGCGGTCATGCAAAAGGCGATAAAAAAGTTTCAAAAAAATAATTTAAAGAAGGTATTTATATGAAAGTTAAAGCTGTCGCAAGTCAAATACCTATTGCGCCCAGAAAAACACGT

8、TTAGTTGTTGAT