抗Trastuzumab单克隆抗体制备及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立.pdf

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1、按摩与康复医学2011．6(中)ChineseManipulation&RehabilitationMediciqne2011，No．5355抗Trastuzumab单克隆抗体制备及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立王延涛，赵喜红。王锐(1．黑龙江哈尔滨哈药集团生物工程有限公司哈尔滨1500252。黑龙江哈尔滨哈药集团技术中心哈尔滨150025)摘要：本研究利用曲妥珠单抗(Trastu~umah)4次腹腔免疫6—8周龄BALB／e雌性小鼠。通过淋巴细胞杂交瘤技术、间接ELlSA筛选技术及腹水制备等技术制备并获得抗Trastuzumab单克

2、隆抗体。试验结果表明，通过细胞融合获得了一株能稳定分泌抗Trastuzumab的杂交瘤细胞株A6E8，其制备的腹水单克隆抗体纯化后效价为256000，该抗体属于IgG1亚类，链的类型为k链。利用制备的单克隆抗体(McAb)建立Trastuzumab双抗体夹心ELISA检测方法，试验结果显示，该检测方法特异性良好，不与其他抗体及蛋白发生交叉反应，所建立的Trastuzumab双抗体夹心ELISA方法最低检测限为1ng／mL。关键词：Trastuzumab单克隆抗体双抗体夹心ELISA药物代谢动力学【中图分类号]R4【文献标识码IA【文章编号】

3、1O08—1879(2011)06-0055—01乳腺癌是一种严重威胁妇女健康及生命的恶性肿瘤，其发得的单克隆抗体为IgG1亚类，轻链为k链。抗体特异性鉴定结病率约为成年女性1_1]。曲妥珠单抗是美国FDA批准上市果显示，该抗体能与市售曲妥珠单抗发生高亲和力结合，但不与的第一个重组人源化抗HER2受体单克隆抗体，由罗氏公司生人IgG1、鼠IgG1发生交叉反应，说明其具有较好的特异性。产并于1998年10月15日首次在美国上市，它主要用于治疗3．2Trastuzumab双抗体夹心ELISA方法的确定。HER2过度表达的转移性乳腺癌r2]。抗T

4、rastuzumab单抗的制3．2．1包被条件确定：用碳酸盐包被液稀释纯化的Trastuzum—备和其测方法的建立为开展Trastuzumab药物代谢动力学研究ab单抗至浓度lgg／mL，加入96孔酶标板，每孔100L，4℃包奠定了基础。被12h；1材料3．2．2封闭条件确定：用PBST洗涤3次，拍干后，每孔加入佐剂购自SIGMA公司；Trastuzumab由哈药集团技术中心200l5脱脂奶粉，37℃封闭1h；制备；6～8周龄Balb／c小鼠购自北京实验动物研究中心；SP2／O3．2．3一抗浓度确定：PBST洗涤3次，拍干后，将待检样品进细

5、胞购自中国科学院上海生命科学研究院。行1：100倍稀释，Trastuzumab标准品进行4倍稀释(4000～2方法lng)，每孔加人100L，37℃孵育50min；2．1单克隆抗体的制备。用纯化的曲妥珠单抗免疫5只Balb／3．2．4酶标二抗浓度确定：将HRP标记山羊抗人lgG—Fc抗c小鼠，经过3次基础免疫，选取效价最高(≥10000)的小鼠进行体1：5000稀释，每孔加入100／LL，37℃孵育50min；强化免疫。3-4天后利用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，3．2．5显色时间确定：PBST洗涤3次，拍干，加入底物液阳性杂交瘤筛选经过

6、3次克隆，挑选获得的阳性杂交瘤细胞进(OPD)，室温避光作用10min；行亚克隆建库，阳性克隆细胞株扩大培养后注射Balb／e小鼠腹3．2．6终止：每孔加入5OL终止液(2MH2SO4)，轻轻振摇混腔内诱生腹水，利用亲和层析方法纯化所得的小鼠腹水，进行匀，测定OD492值。sDs—PAGE纯度鉴定和间接ELBA测定抗体效价。3．3Trastuzumab双抗体夹心ELISA检测方法特异性的鉴定。2．2双抗体夹心ELISA检测方法建立。试验结果显示，检测样品中只有市售曲妥珠单抗出现强阳性反2．2．1双抗体夹心ELISA最佳反应条件确定(方阵滴定

7、法)：应，其他均为阴性，表明此方法具有较好的特异性。结果见参考李瑞等(2005)、焦奎等(2004)方法。表1。2．2．2双抗体夹心ELIsA方法特异性试验：按上述ELISA步表1Trastuzumab双抗体夹心EUSA特异性试验结果骤对人血清、猴血清、鼠血清、西妥昔单抗及曲妥珠单抗进行检测，以检验该方法的特异性。2．2．3双抗体夹心EL1SA方法的敏感性试验：将初浓度为4ug／mL的曲妥珠单抗连续作4倍梯度稀释，然后按照确定的3．4双抗体夹心ELISA方法敏感性的测定。将纯化抗原的浓ELISA反应条件进行测定。根据P／N值大于2．1，阳性

8、值大于度稀释到4ug／mL，之后连续作4倍梯度稀释，按照确定的0．2，检验该方法的敏感性。EuSA反应条件进行测定，试验结果显示，该方法能检测出约3结果与分析0．97ng／mL的