抗猪ifn-β和ifn-γ单克隆抗体的制备及猪ifn-β双抗体夹心elisa方法的初步建立

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1、华中农业大学硕士学位论文抗猪IFN--β和IFN--γ单克隆抗体的制备及猪IFN--β双抗体夹心ELISA方法的初步建立姓名：王朋申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：方六荣201206抗猪IFN．13和IFN．Y单克隆抗体的制各及猪IFN-13双抗体夹心ELISA方法的初步建立摘要免疫功能可以分为天然免疫和获得性免疫两部分。机体的天然免疫应答是机体抵抗病原微生物(病毒、细菌等)入侵的第一道防线，同时也是获得性免疫的基础。I型干扰素的分泌和表达是天然免疫的一个重要方面，它包括IFN．Q和IFN．13。和I型干扰素相比II型干扰

2、素只能由NK细胞、CD8+T细胞、CD8+T细胞n亚群产生，包括IFN-丫，它是重要的免疫调节因子又被称为免疫干扰素。本研究制备了IFN．p和IFN吖的单克隆抗体并利用制各的单克隆抗体初步建立了猪IFN．13的双抗体夹心ELISA方法，具体工作如下：1．猪IFN．B、IFN-Y基因的克隆和表达根据Gerd3mlk提交的猪IFN．B、IFN吖的序列，设计特异性引物，以PK．15细胞RNA为模板通过RT-PCR扩增获得猪IFN．B基因和IFN吖基因，大小分别为498bp和444bp。将PCR产物分别克隆到原核表达载体pET-28a和真核

3、载体pCAGGS．HA中，获得猪IFN．B和IFN吖基因的原核表达质粒和真核表达质粒。将猪IFN．13和IFN吖基因的原核表达质粒分别转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后，两种质粒均能正确表达相应的蛋白，并且表达的猪IFN．B主要以包涵体形式存在，而猪IFN．1，主要以可溶性形式存在。将猪IFN．13和IFN-7基因的真核表达质粒分别转染Hela细胞，经Westernblot证实两种质粒均能在体外培养细胞中正确表达相应的蛋白。2．抗猪邛N．肛、IFNq,单克隆抗体的制各以原核表达蛋白免疫BALB／C小鼠，进行二次免疫后断尾采血检测

4、免疫效价并进行细胞融合。当血清效价达到1：6400后取脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2／0融合，利用间接ELISA进行筛选，共筛选到抗猪IFN．B的单克隆抗体4株，抗猪IFN吖的单克隆抗体8株，并经Westernblot和间接免疫荧光证实所得单克隆抗体均能与真核表达的相应蛋白发生特异性的反应。3．抗猪IFN．13的单克隆抗体的纯化和酶标将获得的4株分泌抗猪IFN．p单克隆抗体的杂交瘤细胞扩大培养后接种BALB／C小鼠制备腹水，经辛酸．硫酸铵法纯化后，用SDS．PAGE检测证实获得了纯度高的单抗，紫外分光光度计检测纯化后4株单克隆抗体的浓

5、度分别为2D126．9mg／ml、4A64．2mg／ml、2H63．4咖l、4G72．5mg／ml。将纯化后的单抗用辣根华中农业大学2012届硕士研究生学位论文过氧化物酶(HRP)标记，每株抗体标记3mg，标记完成后用间接ELISA检测效价。检测4株酶标抗体的效价分别为2D121：12800、4A61：12800、2H6l：32004G71：1000。4．猪ⅡTN_B双抗体夹心ELISA方法的初步建立及应用以CHO细胞表达的猪IFN．D为抗原，将4株纯化抗体和酶标抗体两两配对进行双抗体夹心实验，结果当以2D12为包被抗体、以4A6为

6、酶标抗体时，建立的ELISA方法的特异性和敏感性最好。进一步优化条件最终确定包被抗体的最佳包被浓度为2“edml，酶标抗体的最佳稀释度为1：2000。同时以真核表达的猪IFN．D为抗原建立标准曲线，初步建立了能够检测猪IFN．p的双抗体夹心ELISA法后。以建立的ELISA方法检测了PRV刺激PAM细胞后不同时间的细胞上清中的IFN．B，检测结果显示随着刺激时间的延长，IFN．p的量逐渐增多，与预期的实验结果相符。关键词：猪IFN．D；猪IFN吖；单克隆抗体；双抗体夹心抗猪IFN-B和IF吖单克隆抗体的制各及猪IFN—p双抗体夹心E

7、LISA方法的初步建立ABSTRACTAccordingtothedifferentimmunefunctions，immunesystemcanbedividedintotwoparts：innateimmunityandadaptiveimmunity．Theinnatesystemisthefirstlinetodefendinfectionbymicroorganismssuchasvirus，bacteria,italsocontributetotheinductionofadaptiveimmuneresponses．T

8、hesecretionandexpressionoftypeIinterferonisallimportantpartofinnateimmunity,itsinincludeIFN-0【andIFN—B．Thereareonlyth