基于卵黄抗体的副溶血弧菌间接ELISA快速检测方法的建立.pdf

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1、2015年第3期(总第2lj试验研试验研究基于卯黄抗体的副溶血弧菌间接ELISA快速检测方法的建立闰茂仓①③胡伟丽②③张赛乐①王雪鹏④(①浙江省海洋水产养殖研究所浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室浙江温州325005②温州医科大学生命科技学院，浙江温州③宁波大学海洋学院浙江宁波④山东农业大学动物科技学院山东泰安)摘要本文主要研究了以水产致病性哈氏弧菌为抗原，免疫sPF蛋鸡，制备特异性卵黄抗体，从抗体的提取、纯化等方面进行了进一步的优化研究；建立基于IgY的快速、准确、定量的酶联免疫吸附试验(ELISA)检

2、测抗原菌浓度的技术；建立基于IgY的间接ELISA~']定抗原浓度的技术方法，确定抗原包被浓度、一抗IgY和酶标二抗最适稀释倍数，抗原包被条件的选择，底物的最佳反应时间等间接ELISA的实验条件建立了基于IgY的间接ELISA测定哈氏弧茵的方法，试验的最佳反应条件为：抗原最适工作浓度浓度为l×10。cfu／ml，包被4"C过夜；一抗IgY稀释度分别为1：2；购买的兔抗鸡IgY-HRP酶标抗体作1：20000稀释；选择底物的最佳反应时间为20rain。关键词卵黄抗体副溶血弧菌ELISA快速检测中图分类号：$852．

3、43文献标识码：A文章编号：1007—1733(2015)03—0001．02目前，国内外已经开展了大量弧菌病免疫检测技术的最适反应比，酶标二抗分别稀释为l：10000、1：15000、研究，但是大多是采用全菌苗制备多克隆抗体或多克隆1：20000、1：25000、1：30000，其他条件相同，进行间接抗体而建立的快速检测方法，而以主要致病因子作为免ELISA检测。根据P／N值确定酶标二抗的最适浓度。疫原、以卵黄抗体为免疫手段等方法建立的快速检测方1．2-3包被条件的选择以最佳抗原包被酶标板，包被法，因其具有较高

4、的专一性和特异性，受到更大的推条件分别为：37℃lh后4℃过夜；37℃2h后40C过夜；4℃崇。基于此，笔者用副溶血弧菌全菌苗制备了特异性卵过夜；37℃2h，一抗IgY、酶标二抗为最佳浓度，其他条黄抗体，以此为免疫手段，建立间接ELISA检测技术方件相同，进行间接ELISA检测。根据P／N值确定最佳包被法，旨在为开展海水养殖动物致病性弧菌的早期快速检条件。测和防控，为海水养殖动物弧菌病的防治奠定基础；以1．2．4灵敏度评价副溶血弧菌悬液稀释梯度为10、及为海产品食品质量安全控制提供技术支持。1O’、10、10、1

5、04、10、10cfu／ml为检测样品，同时l材料与方法做空白对照和阴性对照。通过比较样品和阴性对照OD4501．1IgY的初步分离、提取和纯化值，以P／N值2．1为最低检测限。按照参考文献制备。1．2．5特异性检测用已经建立起的间接ELISA检测常见1．2间接ELISA方法的建立的致病性海洋弧菌，例如，副溶血弧菌、哈氏弧菌、鳗1．2．1用棋盘式滴定法确定最佳抗原包被浓度和最佳一表1抗原包被浓度一抗稀释度(cfu／m1)项目1：21：2。1：21：21：21：21：21：21：21：2。抗浓度将10cfu／ml浓

6、度的副溶血弧菌作系列10倍梯度稀P1．7301．9011．9061．7551．9101．7391．493l_2120．5960．158109N1释至104cfu／ml。每个稀释度包被3个孔、每孔100uL，4"C．0801,0840．9530,8030．4130．2400．1590．1090．0410．023P／N1．6021．7542．0012．1874．6207．2549．396l1过夜。一抗IgY初始浓度为1．97mg／ml，依次作系列10倍稀．11914．5136．879P1．6491．7901．8411

7、．8231．83l1．8291．7131．1150．4070．107108N0释至1：10m，酶标抗体做1：20000稀释，间接ELISA~j定。．7420．7990．7870．4780．3840．232O．1550．0820．0340．020P／N2．2212．2412．3383．8184．7717．878I1．04012．63712．1245．350以能产生OD45o值为1．0左右，且P／N值(阳性对照OD450值．P0．4750．4800．5760．4810．6030．4420．4130．2750．1340

8、．027空白对照OD450值／阴性对照OD450值．空白对照OD450值)最10N0．1490．0930．0930．0570．0350．0240．0200．0190．0190．019P／N3．1955．1566．2008．41017．29518．83420．65014．4737．0531．421大的抗原稀释度和抗体稀释度作为抗原、抗体最适反应P0．0610．0670．07