杆状病毒表达系统.ppt

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1、杆状病毒表达系统西北农林科技大学生命科学学院2018年杆状病毒简介杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180Kb之间。模式种是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）.核型多角体病毒有两种形式：一种为芽生病毒(buddedvirus,BV)，另一种则为包涵体病毒(occludedvirus,OV)。buddedvirusoccludedvirus杆状病毒生活周期芽出病毒：可以通过细胞-细胞间感染进行传播。包涵

2、体病毒：释放到环境中后，通过昆虫摄食进行传播。如果仅用于感染昆虫细胞系，包涵体形成相关的基因都不是必需的。杆状病毒基因表达的不同表达时相立即早期延迟早期晚期极晚期：该时相表达的蛋白（polyhedrinandp10）与包涵体形成相关，并且表达量极高。生物工程中可以利用这两个蛋白的启动子表达外源蛋白。杆状病毒表达载体系统1981年L.K.Miller根据AcMNPV分子生物学性质及现代分子生物学技术，从理论上阐述了杆状病毒作为载体表达外源基因的可行性。1983年G.E.Smith等成功地利用AcMNPV作为载体在Sf

3、细胞中表达了人β-干扰素基因，完成了从理论到实践的飞跃。G.E.Smith将AcMNPV的EcoRI-I片段（包含多角体蛋白基因）克隆到pUC8质粒上，然后把人β-干扰素基因克隆到BamHI位点。用重组的质粒和野生型的AcMNPV共同感染Sf细胞。得到的病毒通过空斑筛选(0.5%)，得到重组病毒。用重组病毒感染Sf细胞，得到β-干扰素。解决重组效率太低的问题1990年P.A.Kitts把一个Bsu36I位点引入到多角体基因附近。用Bsu36I线性化的AcMNPV后，重组效率提高15-150倍，30%的空斑是阳性克隆

4、。1993年P.A.Kitts把两个Bsu36I位点一起引入，结果使重组效率达到90%，但还是需要空斑筛选（多角体，蓝白斑）。直接通过病毒基因组DNA与转移载体（Transfervector）重组示意图构建Bacmid1993年V.A.Luckow用miniF-Kan替换了多角体polyhedrin基因，构建了能在昆虫细胞和大肠杆菌之间穿梭的杆状病毒重组DNA，命名为Bacmid。该名称取自Baculovirus和plasmid。JVirol.1993Aug;67(8):4566-79.LuckowVA,LeeSC

5、,BarryGF,OlinsPO.Bacmidpolyhedrin位点附近序列细节：目前使用的Bacmid大都源于这个Bacmid。获得重组病毒的方式转座：先将外源基因克隆到转移载体上，然后在大肠杆菌中通过转座，将外源基因转移到Bacmid上。提取重组Bacmid，转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：同源重组：先将外源基因克隆到转移载体上，然后与线性化Bacmid上共转染转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：“转座”和“同源重组”目前都在使用中。“转座”方式的代表是ThermoFisher的Bac-to-Bac系统。采用“同

6、源重组”方式的有Clontech的BacPAK系统、OET的FlashBac系统，以及BacmidLtd.的qBac系统。这两种方式与外源基因的表达量无关。几种获得重组病毒过程的对比杆状病毒表达系统的优化启动子、Kozak序列和UTR的优化改造。虽然p10或polyhedrin启动子已经是强启动子，但通过改变上下游相关序列依旧能极大地提高外源基因的产量：PLoSONE20149(5):e96562敲除影响外源基因表达/非必需的病毒基因。比如敲除几丁质酶和组织蛋白酶（ChiA/Cath）有助于分泌蛋白的表达：S.A.

7、Kabaetal./JournalofVirologicalMethods122(2004)113–118敲除p26,p10,p74极大地提高了外源基因的产量：CellBiolToxicol(2010)26:57–68糖基化改造把昆虫细胞中缺少的糖基化酶克隆到Bacmid上，使蛋白的糖基化更像哺乳动物细胞：抗凋亡Bacmid将靶向昆虫凋亡效应蛋白Caspase的小RNA序列克隆到Bacmid上，使病毒感染的昆虫细胞抗凋亡，从而提高外源基因的产量：Zhangetal.BMCBiotechnology(2018)18:

8、24宿主细胞Spodopterafrugiperda细胞系常用的有Sf9、Sf21细胞系适用于转染后获得重组病毒适用于蛋白表达Trichoplusiani细胞系商业化的HighFive细胞系不适用于转染后获得重组病毒适用于蛋白表达，产量高于Sf细胞总结杆状病毒表达载体系统具有如下优点：快速高产具备翻译后修饰系统生物安全性好表达的蛋白能正确折叠允许用于人类医