广西牛群戊型肝炎病毒感染情况调查.pdf

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1、——46——中国动物检疫2011年第28卷第10期广西牛群戊型肝炎病毒感染情况调查李斌。，苏乾莲，赵武，秦毅斌，梁家幸，何颖‘，梁保忠，严子斌，覃勇，韦建华，段群棚，许力匆(1．广西兽医研究所，广西南宁530001；2．横县动物疫病预防控制中心，广西横县530300；3．百色市动物疫病预防控制中心，广西百色533000；4．河池市动物疫病预防控制中心，广西河池547000)摘要：为了解广西牛群中戊型肝炎(HE)的感染状况，应用反转录一套式聚合酶链式反应(RT_nPcR)对采自广西8个市牛群的粪、肝样品进行了戊型肝炎病毒(HEV)RNA检测。结果从广西6个市牛粪样品中检出HEV阳性率为19

2、．13％(35／183)，从4个市牛肝样品中检出HEV的阳性率为20％(5／25)，8个市牛粪、牛肝样品中HEV的总阳性率为19．23％(40／208)。表明广西受检牛群中存在HEV感染，应重视牛HE这一新发人畜共患传染病的防控。关键词：广西；牛；戊型肝炎病毒；反转录一套式聚合酶链式反应；人畜共患传染病中图分类号：$852．653文献标识码：B文章编号：1005．944X(2011)10．0046．03养牛业是广西的优势和特色产业，但至今尚未见广5’-IAYoGHAAYCAAGGHrGGCG-3’，HEV—B：5’一’Ib西牛HEV感染检测的相关报道。本研究应用反转录一YTGGTTRTC

3、RTARTCCTG．3’；内套引物HEV-C：5'-AC套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)，对采自广西8个市牛YTCHGGBGTBGCKGAGGA一3’，HEVD：5’．GCTCGCC粪、肝样品进行HEV检测，为广西牛群HE的流行病学ATTGGCTGAGAC一3’，引物由生工生物工程(上海)有限研究及监测防控提供科学依据。公司合成。1材料与方法1．5RNA模板的提取1．1牛粪、牛肝样品用TrizolReagent对处理好的牛粪、牛肝样品及采自广西8个市的奶牛场、屠宰场、菜市场的新鲜牛HEV阳阴性对照病料进行总RNA的提取。粪样品183份、新鲜牛肝样品25份。1．6反转录1．2HEVRN

4、A检测的阳性、阴性对照RT反应采用25儿反应体系，其组成如下：5XRT阳性对照：经RT-PCR检测和核苷酸序列测定为Bufer5儿，dNTPs(10mmol／L)2儿，引物HEV-BHEV阳性的猪粪病料；阴性对照：本实验室采集的，经(25~rnol／L)lL，RNA酶抑制剂(40U／儿)0．5儿，RT-PCR检测为猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性的猪粪M．MLV逆转录酶(2o0U／儿)O．5儿，RNA模板16儿。病料。RT反应条件：42℃60min，最后终止于4℃。1．3RNA抽提及RT-PCR试剂1．7套式PCR扩增TrizolReagent购自Invitrogen公司，M．MLV逆套

5、式PCR反应采用25儿反应体系，外套PCR组转录酶购自Promega公司，RNA酶抑制剂购自宝成如下：DEPCH，Ol7．6laL，10×DreamTaqBuffer生物工程(大连)有限公司，Taq酶购自Fermentas公(includes20mmol／LMgC12)2．5laL，dNTPs(10mmol／L)司，dNTPs购自生工生物工程(上海)有限公司，DNA0．5儿，外套PCR引物HEV-A、HEV-B(25~nol／L)Marker购自广州东盛生物科技有限公司，DEPCH，O自各0．5儿，DreamTaq酶(5U／xaL)0．4uL，eDNA模板己制备。3uL；内套PCR组成如

6、下：DEPCH2O17．6儿，10×1．4引物合成DreamTaqBuffer(includes20mmol／LMgCI2)根据基因I．Ⅳ型HEV的ORF2基因序列，合成两2．5laL，dNTPs(10mmol／L)0．5儿，内套PCR引对简并引物进行RT-nPCRt”，这两对引物可扩增四种基物HEV-C、HEV-D(25~mol／L)各0．5儿，Dream因型HEV的0RF2保守区内基因序列，其内套PCR扩Taq酶(5U／儿)0．4laL，外套PCR产物模板3。外、增产物大小为436bp。引物序列如下，外套引物HEV-A．内套PCR均为相同的反应条件：95℃预变性5min，进入循环95

7、℃50S一53℃50S一72℃1min，35基金项目：广西基本科研业务费专项(桂科专项10．1)；广西基本科研业务费专项(桂科专项11-1)个循环，72℃延伸10min，终止于4℃。通讯作者：赵武1．8PCR产物的检测中国动物检疫2011年第28卷第10期-47-取20儿内套PCR扩增产物，加入4儿6×表1广西8个市样品牛HEV检测结果LoaddingBufer，于混有EB替代物的1％琼脂糖凝胶中以120V100mA电泳40min，