玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性组分的制备及相关基因克隆研究.docx

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1、玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性组分的制备及相关基因克隆研究玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63是一种分离自马铃薯疮痂病自然衰退土壤中的重要生防菌,对黄瓜白粉病、棉花黄萎病等多种重要植物病害均有良好的防治效果。本文对玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63的生物活性组分及其相关基因进行了研究。玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63在燕麦液体培养基进行摇瓶发酵培养,每1000ml发酵液可提纯获得172-2mg粗提抗生素,采用牛津杯法活性检测表明对棉花黄萎病菌、马铃薯疮痂病菌抑菌活性稳定。定量测定表明

2、马铃薯疮痂病菌最敏感,0.3mg/ml粗提抗生素即可完全抑制其生长;粗提抗生素对变铅青链霉菌(TK24和TK54)的抑菌活性较低。薄层分析表明甲醇∶氯仿为1∶6时是粗提抗生素薄层层析的最佳展开条件,可分离出7个组分,其中组分Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ对马铃薯疮痂病菌具有抑菌活性,组分Ⅶ还对棉花黄萎病菌有抑菌活性。抗生素组分Ⅲ对马铃薯疮痂病菌的抑菌活性最强。采用制备型薄层硅胶板对抗生素组分Ⅲ进行了大量制备,TLC和HPLC分析表明薄层分离制备的抗生素组分Ⅲ纯度较高,紫外光谱最大吸收波长为198.1nm和274.5nm,与先前用HPL

3、C制备的组分13近似。玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63对自身抗生素组分Ⅲ具有较高的耐受性,因而其基因组中有相应的抗性基因。采用鸟枪法基因克隆技术在变铅青链霉菌中克隆了玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素组分Ⅲ的抗性基因,定位于1.7kb基因片段上,该基因片段有4个ORFs,ORF1编码386aa,与灰色链霉菌和天蓝色链霉菌的β-半乳糖苷酶高度同源;ORF2编码83aa,与除虫链霉菌MA-4680、天蓝色链霉菌、山丘链霉菌核糖体大亚基L2蛋白RNA结合域以及南昌链霉菌、除虫链霉菌的葡聚糖内切酶高度同

4、源,可能是链霉菌尚未发现的新基因。ORF3编码氨基酸与动球菌(KineococcusradiotoleransSRS30216)的醛/酮还原酶一致性和相似性均为66%。在ORF3相应位置的互补链上(1697-1352bp)存在一个ORF4,编码115aa,与除虫链霉菌的分泌蛋白(multidrugresistanceprotein,SpcT-likeeffluxprotein,450aa)有较低的同源性,这一编码区应进一步亚克隆研究其功能。采用鸟枪法以质粒pIJ702为载体在链霉菌常用宿主菌中建立了玫瑰黄链霉菌Me

5、n-myco-93-63合成相关基因克隆文库,以马铃薯疮痂病菌为指示菌从6000个转化。