最新实验五--PCR产物的回收ppt课件.ppt

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1、实验五--PCR产物的回收一、实验目的及背景在生物技术实验中，ＰＣＲ反应获得的目的片段，酶切后所得特定的ＤＮＡ序列，分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它ＤＮＡ分开，这就需要有一套方法将目的ＤＮＡ从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的ＤＮＡ，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等。从凝胶中分离回收ＤＮＡ的方法现在常用的技术有：电洗脱法低熔点琼脂糖凝胶法玻璃奶法快速纯化凝胶回收试剂盒三、实验步骤切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入干净的离心管中称重，如凝胶重为100mg，可视为100μl

2、（100mg≈100μl），以此类推。加入3倍体积溶液GSB，于55℃水浴融胶6-10min，间断（2-3min）混合，确保胶块完全融化，当胶完全融化后，观察溶液的颜色，如颜色为紫色，加入适量3M醋酸钠（pH5.2），调整颜色和GSB颜色相同（黄色）。（为增加DNA回收量，可加入1倍体积异丙醇于已融化的凝胶溶液中，如凝胶重为100mg，加入100μl异丙醇）。待融化的凝胶溶液降至室温（高温时吸附柱结合DNA能力弱），加入吸附柱中静置1分钟，10,000×g离心1分钟，弃流出液。4.加入650μl溶液WB，10,000×

3、g离心1分钟，弃流出液。5.10,000×g离心1-2分钟，去除残留的WB。6.将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μlEB或去离子水（pH＞7.0）（EB或去离子水在60-70℃水浴预热，使用效果更好），室温静置1分钟。7.10,000×g离心1分钟，洗脱DNA。将洗脱出的DNA于-20℃保存。结果与分析１．分析ＤＮＡ回收效果。２．记录电泳结果。诊断学尿频、尿急、尿痛课时安排：1节教学课型：理论课教学目的要求：重点:尿频、尿急、尿痛定义及临床表现难点:寻找相关病因尿频、尿急、尿痛一.概述1、尿频定义

4、:是指单位时间内排尿次数增多。◆正常成人每天日间平均排尿4～6次◆夜间就寝后0～2次◆婴儿昼夜排尿20～30次如排尿次数明显增多，超过了上述范围，是尿频。2.尿急定义:是指患者一有尿意即迫不及待需要排尿，难以控制。◆急迫感◆迫不及待◆尿意一来,不易控制3.尿痛定义：是指患者排尿时感觉到耻骨上区、会阴部和尿道内疼痛或烧灼感。膀胱刺激征定义（又称尿路刺激征）尿频、尿急、尿痛合称为膀胱刺激征二.病因与临床表现(一)尿频1.生理性尿频◆饮水过多、精神紧张、气候寒冷、吃西瓜等由于进水量增加，通过肾脏的调节和滤过作用，尿量增多，排

5、尿次数亦增多，便出现尿频。生理性多尿特点：◆每次尿量不少、无伴随症状2.病理性尿频(1)多尿性尿频◆排尿次数多、每次尿量多、全日总尿量增多见于：◇糖尿病、尿崩症◇急性肾功能衰竭多尿期:如肾综合征出血热◇精神性多饮尿崩症是因抗利尿激素缺乏（中枢性或垂体性尿崩症）或肾脏对抗利尿激素反应缺陷（肾性尿崩症）而致的内分泌疾病。主要临床特征：烦渴多饮、多尿、低比重尿。精神性多饮：是多饮引起多尿，即喝得多，然后尿得多。精神性多饮与尿崩症，有本质上的不同：◆尿崩症是多尿引起多饮，即多尿，然后喝得多◆精神性多饮正好相反，是多饮引起多尿，

6、即喝得多，然后尿也多精神性多饮与尿崩症二者怎么区别呢?区别1◆精神性多饮在发病前常有一些诱因，如精神受刺激，与别人争执，情绪不稳等。◆尿崩症无这些诱因。区别2◆精神性多饮是先饮水增多，再出现多尿◆尿崩症多尿引起多饮区别3◆精神性多饮病人每天尿量和饮水量变化较大，如睡前服镇静安眠药，夜间尿量可大减，◆尿崩症每天尿量及饮水量比较恒定，变化不大。区别4◆精神性多饮病人症状较轻，无脱水表现。◆尿崩症多饮、多尿症状严重，有慢性脱水表现（（2）炎症性尿频特点：◆尿频但每次尿量减少◆多伴有尿急尿痛◆镜检：白细胞、红细胞、脓细胞多见于

7、：◇膀胱炎◇尿道炎◇前列腺炎◇尿道旁腺炎（3）神精性尿频特点：◆尿频，每次尿量少◆不伴尿急、尿痛◆尿镜检无炎性细胞见于：◆癔病◆神经源性膀胱炎（4）膀胱容量减少性尿频特点：◆持续性尿频◆药物治疗难以缓解◆每次尿量减少见于：◆膀胱肿瘤：◆妊娠子宫压迫膀胱◆卵巢囊肿压迫膀胱◆膀胱结核导致膀胱纤维性缩窄（5）非炎症性尿频刺激：◆尿路结石：膀胱结石◆异物◆尿频为主要表现(二)尿急1.炎症◆急性膀胱炎，尤其是膀胱三角区炎症◆尿道炎，尤其是后尿道炎症◆急性前列腺炎2.结石和异物3.肿瘤：膀胱癌、前列腺癌4.神经性神经性膀胱：是指控

8、制排尿功能的中枢神经系统或周围神经受到损害而引起的膀胱尿道功能障碍称为神经性膀胱。特点：尿急常伴有尿频，但尿频并不一定伴有尿急。5.高温环境下高温环境下尿液高度浓缩酸性高的尿刺激膀胱或尿道尿急(三)尿痛1.原因同尿频2.疼痛部位：◆耻骨上区◆会阴部◆尿道内3.疼痛性质◆灼痛或刺痛◆排尿开始痛：尿道炎◆终末性尿痛：后尿道炎、膀胱炎、