鸭黄病毒荧光定量pcr检测方法建立

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1、鸭黄病毒荧光定量PCR检测方法建立　　摘要：根据鸭黄病毒HBJL株NS5基因序列设计合成了引物和探针，通过对荧光定量PCR反应条件的优化，建立了TaqMan荧光定量PCR检测鸭黄病毒的方法。结果表明，该方法具有很好的特异性和重复性，荧光定量PCR敏感性是常规PCR的100倍左右。同时对30枚人工接种的鸭胚进行检测并与常规PCR方法进行比较，检测结果也表明荧光定量PCR法比常规PCR的敏感性高。关键词：鸭黄病毒；TaqMan探针；荧光定量PCR中图分类号：S852.65+9.6文献标识码：A文章编号：0439-8114（2013）23-5811-032010年以来，中国

2、上海、浙江、江苏等地出现了蛋鸭产蛋量严重下降及蛋鸭死亡现象。同年在湖北省一些养鸭场也出现不明原因引起的产蛋量下降现象，临床表现为产蛋量严重下降甚至停止，且蛋鸭有一定的死亡率，剖检病死鸭脾脏呈现明显肿大，卵巢肉变，卵泡严重充血，出血[1]。临床诊断为鸭黄病毒感染引起的病毒病感染，该病的发生给养殖户带来了巨大的经济损失。为了提高鸭黄病毒检测的准确性和高效性，本研究拟建立一种能用于该病检测的一步法荧光定量PCR方法，为鸭黄病毒的流行病学、致病机理及诊断与防治等方面提供技术平台。81材料与方法1.1材料鸭黄病毒HBJL株为动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室保存，该毒株用8

3、～12日龄的鸭胚增殖。1.2主要试剂TaqDNA聚合酶、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、DEPC、dNTPs、Mg2+均购自宝生物工程（大连）有限公司；TransDNAMarkerⅢ购于北京全式金生物科技有限公司；ViralRNAMiniKit（50）购自上海华舜生物技术有限公司。1.3方法1.3.1引物和探针根据鸭黄病毒HBJL株NS5基因序列（GenBankNo.JF423123），使用PrimerPrimier5软件设计1对引物和1条探针。上游引物（DFV-F）序列为：5′-atgaataaggtggtgaaggtaatgc-3′，下游引物（DFV-R）序列为：

4、5′-cagattcgtgaaagtgttgagagc-3′，荧光探针（DFV-P）序列为：5′-catgactgttttcccatcacgtcccgg-3′，荧光探针DFV-P5′端标记的是荧光报告基团FAM，3′端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。引物和探针均由上海博亚生物技术有限公司合成，TE中溶解，-20℃保存备用。引物DFV-F和DFV-R用于荧光定量扩增，目的片断长130bp。1.3.2标准品的制备及病毒含量的检测8将毒株HBJL接种8～12日龄的鸭胚后，观察5～7d收集死亡鸭胚的胚体、尿囊膜和尿囊液，并混合研磨。冻融3次后12000r/min离心3次取上清

5、即为病毒液，测定病毒含量为103.7ELD50（0.2mL）（Medianembryolethaldose，ELD50），将病毒原液稀释为原来的1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6后接种8～12日龄鸭胚，每个稀释度接种5枚鸭胚。然后将病毒上清液用ViralRNAMiniKit提取RNA，加DEPC水溶解RNA后，-70℃保存作为标准品备用。1.3.3一步法荧光定量PCR反应条件的优化用矩阵法对荧光定量PCR的引物浓度、探针浓度、Mg2+浓度等进行筛选优化，以得到最佳的荧光定量PCR反应条件。荧光定量检测的循环条件为：42℃20min；94℃5

6、min；94℃10s，60℃50s，50个循环。把荧光检测的程序设定在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为530nm，自动计算出Ct值并给出定量结果。1.3.4荧光定量PCR与常规PCR敏感性比较试验为了比较荧光定量PCR与常规PCR的敏感性，用10倍系列稀释的标准品（病毒含量为103.7、102.7、101.7、100.7、10-0.3、10-1.3、10-2.38ELD50）为定量检测模板，用动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室自行建立的常规PCR及荧光定量PCR对检测模板进行检测，将PCR产物的电泳结果作为常规PCR的敏感性与荧光定量PCR检测的敏感性进行分

7、析比较[1]。1.3.5特异性试验为验证本方法的特异性，同时提取禽流感、禽白血病、禽大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、新城疫、减蛋综合征病鸭鸭胚的RNA，在相同条件下进行荧光定量PCR，观察反应的特异性。1.3.6重复性试验取鸭黄病毒浓度为102.7、101.7、100.7ELD50作为检测模板，用荧光定量PCR方法进行组间重复性检测，并对检测结果进行统计学分析。1.3.7人工感染鸭胚的检测用鸭黄病毒HBJL株的病毒尿囊液1∶1000稀释后，卵黄囊接种8～12日龄鸭胚30枚，0.2mL/只，另设接种生理盐水为阴性对照组，连续观察5d后收集鸭胚，弃去