《云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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学校代码：１０６７９研究生学号：Ｙ２０丨５１０６００７声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得大理大学或其他教育。机构的学位或证明而使用过的材料对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明，并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。研宄生签名：各抱日期：８论文使用和授权说明本人完全了解大理大学有关保留、使用学位论文的规定：，即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文复印件和论文电子版；允许论文被查阅或借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文；授权学校将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。（保密的论文在解密后应遵循此规定）研宄生签名：：日期导师签名：． 目录中文摘要........................................................................................................................1英文摘要........................................................................................................................4缩略词表........................................................................................................................81前言............................................................................................................................91.1鼠疫流行现状..................................................................................................91.2小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌流行现状....................................122材料与方法..............................................................................................................132.1实验材料........................................................................................................132.2实验方法........................................................................................................303实验结果..................................................................................................................383.1三种致病耶尔森菌PCR检测结果..............................................................383.2三种致病耶尔森菌筛查基因确定结果........................................................464讨论..........................................................................................................................525结论..........................................................................................................................57参考文献......................................................................................................................58附录..............................................................................................................................65附录1：测序结果................................................................................................65附录2：研究生期间发表论文............................................................................68综述..............................................................................................................................69致谢..............................................................................................................................77 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义硕士研究生：张艳导师：宋志忠指导老师：王鹏中文摘要目的了解云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森菌的分布及其流行现状；完善三种致病耶尔森菌的PCR基因检测方法。方法1.样本采集：共选取云南省野鼠鼠疫疫源地和云南省家鼠鼠疫疫源地共11个地区，家鼠鼠疫疫源地包括：梁河县、宜良县、保山市、弥勒县、弥渡县、玉溪市、文山市；野鼠鼠疫疫源地包括：玉龙县、剑川县、洱源县、鹤庆县。捕鼠采用鼠铗法；同时采集部分家鼠鼠疫疫源地的犬类肛拭子。2.三种致病耶尔森氏菌筛查基因确定：通过对采集的部分样本进行实验，确定筛查三种致病耶尔森氏菌的目标基因。3.PCR初筛：将采取的鼠结盲肠部及其内容物和犬类肛拭子共4985份样本置于10mL改良磷酸盐缓冲液（PBS）中，4℃冷增菌15-21天后用其沉淀液提取DNA，并对foxA、inv、0392基因进行PCR筛查。4.细菌筛查：将初筛过程中PCR阳性样本接种在CIN琼脂平板上，于28℃条件下、24h培养，挑取可疑菌落对foxA、inv、0392基因进行细菌PCR筛查。5.保菌处理：对细菌筛查阳性样本，提取其DNA进行PCR检测并保存其纯菌样本，置于-80℃冰箱保存。6.对实验结果进行统计和分析：数据分析采用R×C列联表的χ2检验，使用SPSS17.0进行统计分析，检验水准P<0.05为有统计学差异。1 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文结果1.三种致病耶尔森氏菌筛查基因确定情况：2016年1-5月采集宜良、丽江、弥勒、弥渡四个地区1344份样本和其他菌株进行foxA、inv、F1、0392基因筛查。其中foxA、inv基因分别对筛查小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌筛查具有特异性，F1基因对筛查鼠疫耶尔森氏菌会出现非特异性条带，0392基因对鼠疫耶尔森菌筛查不会出现非特异性条带具有特异性，采用0392基因作为对鼠疫耶尔森菌筛查的目标基因。2.云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森菌的分离情况：2016年1月至2017年10月，共采集云南省11个地区样本4985份样本，其中foxA阳性样本菌株共248株，分离为4.97%；初筛0392阳性样本6份，阳性率0.12%、初筛inv阳性样本0份。3.云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森菌的统计学分析：云南省11个地区的三种致病耶尔森氏菌阳性率不完全相同（χ2=197.944，P<0.05）；其中0392基因统计分析P>0.05，无统计学意义。foxA阳性菌株（χ2=333.74，P<0.05）具有统计学差异。Inv均为阴性无差异。4.云南省部分鼠疫疫源地鼠类和犬类统计学分析：鼠类样本共4284份，犬类样本共701份。其中鼠类foxA阳性菌株有225株，分离率为4.97%。犬类肛拭子foxA阳性菌株有23株，分离率为3.28%，统计分析（χ2=4.95，P=0.024<0.05）具有统计学差异，即鼠类foxA阳性菌株分离率高于犬类肛拭子foxA阳性菌株分离率。5.云南省野鼠鼠疫疫源地和家鼠鼠疫疫源地统计学分析：云南省野鼠疫源地和家鼠疫源地foxA阳性菌株分离率不完全相同（χ2=164.51，P<0.05），野鼠鼠疫疫源地的foxA阳性菌株分离率比家鼠鼠疫疫源地的分离率高。其中在野鼠鼠疫疫源地中玉龙县的foxA阳性菌株分离率比其他三个县的分离率高，在家鼠鼠疫疫源地以梁河县和弥勒县的foxA阳性菌株分离率较高。6.云南省部分鼠疫疫源地foxA阳性菌株在鼠类型分布情况：不同鼠类型的foxA阳性菌株分离率有差异（χ2=86.20，P<0.05）。其中家鼠鼠疫疫源地鼠类型主要是褐家鼠和黄胸鼠，野鼠鼠疫疫源地鼠类型主要是齐氏姬鼠、大绒鼠和中华姬鼠。对五种鼠类型进行两两比较：大绒鼠和齐氏姬鼠的foxA阳性菌株分离率要高于其他三种鼠的分离率，且foxA阳性菌株分离率主要分布在野鼠鼠疫疫源地，以齐氏姬鼠、大绒鼠为主。7.玉龙县和剑川县foxA阳性菌株分布情况：玉龙县鼠类样本共有853份，以南溪村2 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文委会旦后村foxA阳性菌株分离率最高。玉龙县的鼠类样本以大绒鼠foxA阳性菌株分离率要高于其他类型鼠类。剑川县样本包括鼠样本794份样本，foxA阳性菌株分离率较高地区主要集中在石龙村和长乐村。剑川县采集鼠类样本foxA阳性菌株分离率无统计学差异。结论1.云南省野鼠鼠疫疫源地小肠结肠炎耶尔森菌鼠类标本总体分离率高于家鼠鼠疫疫源地。2.在初筛疫源地现场标本或者处理鼠疫疫情时，使用鼠疫菌染色体上的特异基因如YPO0392上基因比在质粒上的F1基因进行PCR中更具说服力。3.在对疫源地的三种致病耶尔森菌监测中，可采用0392、foxA、inv三种目标基因进行组合筛查三种致病耶尔森菌。关键词：三种致病耶尔森氏菌；鼠疫疫源地；基因3 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文DetectionofpathogenicYersiniafromsomeplaguefociinYunnanProvincebyPCRandItsepidemiologicalsignificanceMasterCandidate:ZhangYanTutor:SongZhi-zhongTheinstructor:WangPengAbstarctObjectiveTounderstandthedistributionandprevalenceofYersiniapestisamongsomeplaguefociinYunnanProvince;ToimprovethePCRgenetictestingmethodsforthreeYersinia;ToexploretherelationshipamongthreePathogenicYersinia.Method1.SampleCollection:Atotalof11plaguefociofYunnanProvince.Thehomeplaguefociinclude:LiangheCounty,YiliangCounty,BaoshanCity,MileCounty,andMiduCounty,YuxiCity,andWenshanCity.Thewildplaguefociinclude:YulongCounty,JianchuanCounty,EryuanCounty,andHeqingCounty.Therodenttrappingmethodwasadopted,andsomedoganalswabswerecollectedatthesiteofthehomeplague.2.ThreePathogenicYersiniascreeninggeneswereidentified:ThetargetgenesforthethreepathogenicYersiniaspecieswerescreenedbyconductingexperimentsoncollectedpartofsamples.3.PreliminaryScreeningofPCR:Atotalof4985samplestakenfromthemousececumwithitscontentsandthedog'sanalswabwereplacedin10mLofPBS,Aftercold-accumμLatingbacteriaat4°Cfor15-21days,andthenextracttheDNAwithitsprecipitate,andusingfoxA,inv,0392geneforPCRscreening.4.BacterialScreening:ThePCRpositivesampleswereinocμLatedonCINagar4 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文platesandculturedat28°Cfor24h.SuspiciouscolonieswerepickedforPCRscreeningoffoxA,inv,0392genes.5.SterilizationTreatment:Forbacteria-positivesamples,extracttheirDNAforPCRdetectionandpreservetheirpurebacteriasamples,andstoretheminarefrigeratorat-80°C.6.Analysis:Statisticsandanalysisofexperimentaldatausingchi-squaretest,statisticalanalysisusingspss17.0,testlevelP<0.05forstatisticaldifferences.Result1.IdentificationofthreepathogenicYersiniascreeninggenes:FromJanuarytoMay2016,1344samplesandotherstrainsfromfourregionsofYiliang,Lijiang,MileandMiduwerecollectedforscreeningoffoxA,inv,F1and0392genes.ThefoxA,invgenewerescreeningspecificityforYersiniaenterocolitica,Yersiniapseudotuberculosis，F1genescreeningYersiniapestiswillappearnon-specificbands,0392genesforscreeningYersiniapestiswillbespecificanditcanbeusedasatargetgeneforYersiniapestisscreening.2.IsolationofpathogenicYersiniapestisinsomeplaguefociinYunnanProvince:FromJanuary2016toOctober2017,atotalof4985samplesof11districtsinYunnanProvincewerecollected,Atotalof248strainsoffoxApositivestrainswereisolatedwithaseparationrateof4.97%;6samplesofpositivestrainswerescreened0392,withapositiverateof0.12%,and0positivesampleswerescreenedforinvpositivesamples.3.StatisticalanalysisofpathogenicYersiniainsomeplaguefociinYunnanProvince:ThepositiveratesofthreepathogenicYersiniain11areasinYunnanprovincewerenotstatisticallydifferent(χ2=197.94,P<0.05).Thestatisticalanalysisof0392gene(P>0.05)showednostatisticalsignificance.FoxAgenepositivesamples(χ2=333.74,P<0.05)showedthespecificstatisticaldifferences.Invgenewerenegativenodifference.4.StatisticalanalysisofsomeplaguefociinYunnanProvince:Atotalof4284mousesamplesand701dogsampleswerecollected.Amongthem,therewere2255 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文strainsoffoxA-positivestrainsinthemouse,andtheisolationratewas4.97%.Therewere23strainsoffoxA-positivestrainsinthedoganalswab,andtheisolationratewas3.28%.Thestatisticalanalysis(χ2=4.95,P=0.024<0.05)showedthatthepositiverateoffoxAwashigherthanthatofcanineanalswabsSub-foxA-positiverate.5.QuantitativeanalysisoftheplagueandmouseplaguefociinYunnanProvince:ThepositiverateofthreepathogenicYersinia(χ2=164.51,P<0.05)arenotexactlythesame.ThepositiverateofYersiniaenterocoliticaisolatesfromtheplaguefociofwildratswashigherthanthatfromtheplaguefociofdomesticrats.TheisolationrateoffoxA-positivestrainsinYulongCountywashigherthanthatoftheotherthreecountiesinwildplaguefoci,andtheisolationrateoffoxA-positivestrainsinLiangheCountyandMileCountywashigherintheplaguefociofhomerats.6.DistributionoffoxA-positivestrainsinsomeplaguefociinYunnanProvince:DifferentfoxA-positivestrainsofdifferentmousetypeshavedifferentisolationrates(χ2=86.20,P<0.05).ThetypeofhamsterwasmainlyRattusnorvegicusandRattusflavipectus.ThetypeofwildplaguefocimainlyconsistedofApodemusagrarius,EupolyphaganigrumandApodemusagrarius.ThefoxApositiveseparationratemainlydistributedinthewildratplaguefoci,mainlytoApodemusagkistrodon,mammothandApodemusaganum.7.DistributionoffoxA-positivestrainsinYulongCountyandJianchuan:Atotalof853YulongCountyrodentssamplescollectedmainlyfromLuziVillageandTai'anTownshipthatwithfoxApositiveratehighest.TheresultsshowedthatthedistributionoffoxApositiverateindifferentmousetypesinYulongcountywasstatisticallysignificant(χ2=31.80,P<0.05).Therearedifferencesbetweenthetwopairsofanalysis,theresultsshowedthatthepositiverateoffoxAwashigherthanothertypesofrodents.ThesamplesofJianchuanCountyincluded794samplesofrats,collectedmainlyinJinhuaTownandShilongVillage.TheareaswithhighfoxApositiverateweremainlylocatedinShilongVillageandChangleVillage.ThestatisticallyanalyzedforthetypeofJianchuanmousewithoutstatisticaldifference(χ2=9.97,P>0.05).ThepositiverateofYersiniaenterocoliticainJianchuanCountywasfoundtobemoreevenlydistributedinthewildspecies.6 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文Conclusion1.YunnanwildratplaguefociofYersiniaenterocoliticarodentsoverallisolationrateishigherthantheLiangheandotherhomeratsplaguefoci.2.Intheinitialscreeningofon-sitespecimensoftheepidemicsourceorprocessingofaplagueepidemic,itismoreconvincingtousespecificgenesonthechromosomesofY.pestis,suchasYPO0392,forPCRthanforF1genesonplasmids.3.InthedetectionofthreepathogenicYersiniaspeciesintheepidemicarea,threetargetgenes,0392,foxAandinv,canbeusedtoscreenandscreenthethreepathogenicYersiniaspecies.Keywords:ThreepathogenicYersinia;plaguefoci;genes7 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文缩略词表（AbbreviationsList）缩略词英文全称中文全称Y.pYersiniapestis鼠疫耶尔森菌Y.eYersiniaenterocolitica小肠结肠炎耶尔森菌Y.pstYersiniapseudotuberculosis假结核耶尔森菌DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应bpBasepair(s)碱基对rpmRoundpermin每分钟转速foxAFerrioxaminereceptorgene铁草胺菌素受体蛋白基因invInvasiongene侵袭素基因F1SilkFibroin1荚膜蛋白StatisticalPackagefortheSocialSPSS社会科学统计软件包Sciences2Chi-square卡方WHOWorldHealthOrganization世界卫生组织8 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文1前言1.1鼠疫流行现状1.1.1全球鼠疫流行现状耶尔森氏菌属属于肠杆菌属有18个菌种，耶尔森氏菌属中致病性菌主要有三种分别是鼠疫耶尔森菌（简称Y.p）、假结核耶尔森菌（简称Y.pst）以及小肠结肠炎耶尔森菌（简称Y.e）[1]。鼠疫在自然生态系统中长期存在，属于甲类传染病，具有病死率高、传染性强的特点，是人畜共患的自然疫源性疾病。世界范围内，过去曾发生3次鼠疫大流行，导致至少一亿六千万人死亡[2-4]，近20多年鼠疫在动物与人类间的疫情持续活跃，世界卫生组织（WHO）已将其列为重新抬头的传染病[5]。在全球范围中有58个国家有鼠疫自然疫源地，其中以非洲、亚洲、美洲为主[6-7]。根据世界卫生组织（WHO）报告，2010年1月至2015年12月，全球共有3,248例鼠疫菌感染，死亡率为17.98％[9-10]。根据WHO报道截止2017年12月4日，马达加斯加发生让世界震惊的鼠疫疫情有疑似病例2417例，死亡病例209例。从1954-2003年亚洲发病国家达到12个，发病人数也超出其他地区10%[8]，亚洲国家的鼠疫疫情也是较为严峻。全球范围内鼠疫自然疫源地主要分布于北纬60°至南纬35°之间的广阔地域，遍布欧洲、亚洲、非洲和美洲，鼠疫疫源地分布有明显的地域性，呈岛状，分布在草原、荒漠、森林、湿地等各种地貌景观中，且“经久不衰”[11]。在中国，鼠疫的自然疫源地分布广、范围大。中国鼠疫自然疫源地位于北纬21°～47°、东经73°～126°之间的广袤领域之内，占总国土面积约15%，且自然疫源面积达99.3万平方公里、分布遍及于19个省区[12-15]，1981～2012年，中国9个省(自治区)159个县(市、旗)发生人间鼠疫病例937人，死亡124人[16]，2013年至今，甘肃、云南等地相继发生人间鼠疫，且不断出现新的鼠疫自然疫源地及染疫动物，部分省（区）鼠疫疫源地疫情回升[17]。依据自然疫源地的宿主、媒介以及相关病原体的性状、地理位置、景观特征等，纪树立等把中国的鼠疫疫源地划分为10个[18]。其后，刘振才等又确立了青藏高原高寒草甸草原青海田鼠自然疫源地型第11个鼠疫疫源地的类型[19]，2005年由新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心首次证实的准噶尔盆地荒漠大沙鼠自然疫源地型是中国第12个9 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文鼠疫疫源地类型。2006年又发现和证实了云南丽江存在鼠疫疫源地，是中国第13个新的鼠疫疫源地[20]。1.1.2云南省鼠疫流行现状云南位于中国西南边境，目前认为云南省有三块鼠疫疫源地包括家鼠鼠疫疫源地、野鼠鼠疫疫源地和2006年发现的丽江玉龙鼠疫疫源地，共波及13州（市）和52个县[21]（见图一）。云南家鼠鼠疫疫源地位于海拔400～2100m的平坝（盆地）居民区农田景观地带主要分布在滇东、滇西南以及滇南广大地区，主要宿主为黄胸鼠（Rattustanezumi），优势蚤种为印鼠客蚤。云南家鼠鼠疫源地发生过散在病例和小范围的流行，自1982年复燃后2010年已经发展到46个县[22-23]，与缅甸接壤的云南被认为是第三次世界鼠疫大流行的起源地。云南省家鼠鼠疫疫源地实际上已经独立存在非常长的时间，而且还会继续存在下去[24]。云南省野鼠鼠疫疫源地主要分布在剑川山区，野鼠鼠疫疫源地目前是5个地区，分别是剑川县、洱源县、丽江、兰坪县、云龙县。其主要宿主为齐氏姬鼠（Apodemuschevrieri）和大绒鼠（Eothenomysmile-tus）等[25-26]，优势蚤种为方叶栉眼蚤（Ctenophthalmuquadrarus）和特新蚤指名亚种（Neopsyllaspecialisspecialis）等。在1974年发现位于2300-4000m海拔之间的剑川野鼠鼠疫疫源地，有报道显示自发现剑川野鼠鼠疫疫源地以来至90年代初，每间隔1～3年会出现一次鼠间鼠疫流行[27]。云南省野鼠鼠疫菌存在于当地的鼠疫自然疫源地时间较长，形成了各自独立循环的过程导致其各自具有独特的遗传学特征，但是根据目前的研究成果，也难区分剑川和玉龙疫源地是否同属于一类型疫源地[28-31]。云南省特殊的自然地理气候条件导致鼠疫自然疫源性长期存在，从1975年流行持续20多年，近几年也是断断续续出现鼠疫疫情。在2005年丽江野鼠疫源地发现5例肺鼠疫的病例[31]，继而2016年在家鼠鼠疫疫源地的西双版纳景洪发生一起人间鼠疫[32]；2017年分别在剑川县、玉龙县和鹤庆县分别有间断监测到鼠疫疫情。因此云南省的疫情严峻形势毋容置疑，是一个非常值得我们关注的公共卫生问题。10 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文图1：1982-2017年云南省鼠疫流行分布图（Figure1:DistributionofplagueepidemicinYunnanProvince,1982-2017）11 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文1.2小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌流行现状在我国，曾有过两次小肠结肠炎耶尔森菌的流行[33]，第一次发生于1986年的兰州市某奶牛厂导致107人感染，另一次发生于1987年辽宁省沈阳市某中学学生食堂，发病人数高达350余人[34-35]。这两次人群间小肠结肠炎耶尔森菌的流行引起了我国研究者的关注。全国目前已有19个省市直辖市对小肠结肠炎耶尔森菌进行了报道，说明该菌目前在我国处在一个大流行的趋势，其中云南省就是小肠结肠炎耶尔森菌的高发区。假结核耶尔森菌广泛分布于除南极洲外的各个大陆且分布具有明显的地理差异，其感染率一般都比小肠结肠炎耶尔森稍低[34]。该菌多分离于北半球以及澳大利亚、新西兰和巴西，北半球又以北欧、远东地区的分离率最高，非洲和南美洲则极少有报道[36]。假结核耶尔森菌高发的主要两个地区是芬兰与日本，特别是自上世纪年代以来，芬兰至少有6次假结核耶尔森菌的暴发流行被报道[37]。假结核耶尔森菌在世界各地多次引起人群不同规模的爆发，主要发生在芬兰、瑞典、日本、澳大利亚、加拿大等国[34]。新鲜食物的大规模供应有可能造成较大范围的暴发感染，该菌可在低温环境下生存．冰箱贮存食物是现代社会发生该苗感染的一个重要传染源，有人对假结核耶尔森菌在福建省内的分布进行了流行病学分析，证实了该菌在福建省内有广泛流行[38-39]。目前我国对假结核病耶尔森菌目尚没有暴发疫情的报道，云南省对假结核耶尔森菌也鲜有报道。云南作为鼠疫自然疫源地，也是第三次世界鼠疫流行的疑似发源地，现在云南鼠疫疫情间断发生，严峻形势毋容置疑，是一个非常值得我们关注的公共卫生问题。且关于三种致病性耶尔森菌的报道很少，了解三种致病耶尔森氏菌在云南分布情况，有助于探索耶尔森菌之间的相互关系和鼠疫菌的保存机制。本论文选取云南省部分鼠疫疫源地11个地区，进行标本采集，通过对样本进行冷增菌21天后提取DNA以及直接划平板法，用PCR反应的方式对三种致病耶尔森菌进行初筛，检测和分析三种致病耶尔森菌在云南省的分布和流行情况。12 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文2材料与方法2.1实验材料2.1.1云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测的实验材料1.云南省11个地区样本采集情况对云南省部分鼠疫疫源地11个地区共采集样本4985份样本，其中梁河县样本数量443份；玉溪样本数量416份；玉龙县鼠样本数量853份；宜良县样本数量495份；剑川县鼠样本数量794份；洱源县鼠样本数量86份；鹤庆县鼠样本数量267份；保山市样本数量405份；文山市样本数量402份；弥勒样本数量425份；弥渡样本数量399份。见图2。图2云南省11个鼠疫疫源地中三种致病耶尔森菌的采集样本数所占比例（Figure2:PercentageofsamplescollectedfromthreepathogenicYersiniaspeciesin11plaguefociinYunnanProvince）2.鼠类整体采集情况对云南省11个地区共采集鼠类样本4284份，分别是梁河县338份、玉溪331份、玉龙县85份、宜良县395份、剑川794份、洱源86份、鹤庆267份、保山303份、文山290份、弥勒327份、弥渡287份。见图3。13 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文图311个地区鼠类和犬类样本采集情况（Figure3:Samplecollectionofrodentsanddogsin11areas）在云南省11个地区采集的4284份鼠类样本中，其中鼠类型有15种，其中主要包括齐氏姬鼠1137份，黄胸鼠1032份、绒鼠761份、褐家鼠307中华姬鼠161等。具体见图4。图4云南省11个地区鼠类型分布情况（Figure4:DistributionofRatTypesin11AreasofYunnanProvince）14 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文（1）梁河县鼠类样本采集情况梁河县样本采集于2016年8月-2017年10月，样本包括鼠样本338份和狗肛拭子样本105份共443份样本。鼠类采样地点和鼠类型见表1。表1梁河县2016.8-2017.10样本来源情况和鼠类分布情况(Table1SampleSourcesandDistributionofRatsinLiangheCountyat2016.8-2017.10)鼠类采样地点样本数量（份）鼠类型样本数量（份）梁河县河西乡邦读村49臭鼩鼱43梁河县九保乡勐宋村51绒鼠3梁河县芒东镇39短尾鼩10梁河县芒东镇丙应村23黄胸鼠234梁河县芒东镇罗岗村25灰麝鼩6梁河县芒东镇杞木寨51齐氏姬鼠3梁河县芒东镇杞木寨大坪子21社鼠4梁河县芒东镇湾中村21斯氏家鼠8梁河县芒东镇翁冷村25锡金小鼠11梁河县芒东镇杏塘村2其他16梁河县遮岛镇31合计338合计338（2）玉溪市鼠类样本采集情况玉溪样本采集于2016年8月-2017年10月，样本包括鼠样本331份和狗肛拭子样本85份共416份样本。鼠类采样地点和鼠类型见表2。表2玉溪市2016.8-2017.10样本来源和鼠类分布情况（Table2SampleSourcesandDistributionofRatsin2016.8-2017.10inYuxiCity）鼠类采样地点样本数量（份）鼠类型样本数量（份）峨山青龙厂14黄胸鼠93峨山县城农贸市场9大臭鼩11峨山县化念镇151大足鼠1715 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文鼠类采样地点样本数量（份）鼠类型样本数量（份）峨山县小街镇兴旺村17褐家鼠78玉溪新平县大明奄、竜分腰村34斯氏家鼠23元江红龙厂36灰麝鼩11元江江东15小家鼠29元江那整16卡氏小鼠15元江澧江镇9其他54元江浅江镇26其他4合计331合计331（3）玉龙县鼠类样本采集情况丽江玉龙县样本采集于2016年8月-2017年10月，样本包括鼠样本853份样本。鼠类采样地点和鼠类型分布情况见表3。表3玉龙县2016.8-2017.10样本来源和鼠类型情况（Table3SampleSourcesandRatTypesin2016.8-2017.10inYulongCounty）采样地点样本数量（份）鼠类型样本数量（份）丽江市玉龙县海棠村3齐氏姬鼠520丽江市玉龙县太安乡红梅村1大耳姬鼠15丽江市玉龙县泰安汝南化3-4社69大绒鼠83丽江玉龙县南溪村委会旦后村41玉龙绒鼠200丽江玉龙县南溪村委会旦前村86长尾灰麝鼩10丽江玉龙县南溪村委会鹿子村133黄胸鼠5丽江玉龙县南溪村委会满下村87其他20丽江玉龙县太安乡吉子村汝南化4社230丽江玉龙县黄山镇南溪村委会鹿子村203合计853合计853（4）剑川县鼠类样本采集情况剑川样本采集于2016年8月-2017年10月，样本包括鼠样本794份样本。16 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文鼠类采样地点和鼠类型情况见表4。表4剑川县2016.8-2017.10样本来源和鼠类型情况（Table4SampleSourcesandRatTypesin2016.8-2017.10inJianchuanCounty）采样地点样本数量（份）鼠类型样本数量（份）剑川县甸南镇104贝氏树鼩14剑川县金华镇316齐氏姬鼠397剑川县沙溪镇石龙村278中华姬鼠16剑川县羊岑乡新松村26大绒鼠269剑川县沙溪镇长乐村70褐家鼠19黄胸鼠41其他38合计794合计794（5）洱源县鼠类样本采集情况洱源县样本采集于2016年8月-2017年10月，样本包括鼠样本86份样本。鼠类采样地点和鼠类型情况见表5。表5洱源县2016.8-2017.10样本来源和鼠类型情况(Table5SampleSourceandRatTypein2016.8-2017.10inEryuanCounty)采样地点样本数量（份）鼠类型样本数量（份）洱源县牛街乡福和78大绒鼠4洱源县牛街乡福田7褐家鼠39洱源县三营乡土登214线旁1黄胸鼠32齐氏姬鼠2其他9合计86合计86（6）鹤庆县鼠类样本采集情况鹤庆县样本采集于2016年8月-2017年10月，样本包括鼠样本267份样本。采样地点和鼠类型情况见表6。17 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文表6鹤庆县2016.8-2017.10样本来源和鼠类型情况（Table6SampleSourcesandRatTypesin2016.8-2017.10inHeqingCounty）采样地点样本数量（份）鼠类型样本数量（份）鹤庆县草海镇安乐村5臭鼩鼱9鹤庆县草海镇安乐沙子坪村23大绒鼠177鹤庆县草海镇黑泥绍7黄胸鼠54鹤庆县草海镇马厂村79齐氏姬鼠22鹤庆县草海镇马厂村北坡脚62社鼠5鹤庆县草海镇马厂村室内31鹤庆县草海镇马厂村竹兰阱三家村3鹤庆县草海镇小马厂村新峰村57合计267合计267（7）保山市鼠类样本采集情况保山市样本采集于2016年8月-2017年10月，样本包括鼠样本303份样本，狗肛拭子102份共405份样本。鼠类采样地点和鼠类型见表7。表7保山市2016.8-2017.10样本来源和鼠类型情况(Table7ThesamplesourceandrattypeofBaoshanCityin2016.8-2017.10)鼠类采样地点样本数量（份）鼠类型样本数量（份）保山隆阳区板桥董家湾28大臭鼩31保山隆阳区板桥水头村20短尾41保山隆阳区河图镇兰村18褐家鼠10保山隆阳区潞江镇知青农场10黄胸鼠139保山隆阳区辛街43灰麝鼩57保山隆阳区辛街汪宣村75社鼠8保山隆阳区辛街下东村8中华新猥9保山隆阳区辛街下庄双寨101其他8合计303合计30318 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文（8）文山市鼠类样本采集情况文山市样本采集于2016年8月-2017年10月，共采集样本405份，其中鼠类样本303份、犬类样本102份。鼠类采样地点和鼠类型见表8。表8文山市2016.8-2017.10样本来源和鼠类型情况（Table8SampleSourceandRatTypesofWenshanCityin2016.8-2017.10）鼠类采样地点样本数量（份）鼠类型样本数量（份）文山市秉烈乡清水井村60小家鼠40文山市城区35褐家鼠74文山市红甸乡八家寨村35黄胸鼠77文山市东山乡16卡氏小鼠12文山市古木乡7齐氏姬鼠13文山市红甸乡小耳朵村98其他18文山市红甸乡6斯氏家鼠23云南文山开化镇龙潭寨27锡金小鼠46其他18合计303合计303（9）宜良县鼠类样本采集情况宜良县样本采集于2016年4月-2016年6月，样本包括鼠样本85份和狗肛拭子样本99份共184份样本。鼠类样本采集地点和鼠类型见表9表9宜良县2016.4-2016.6样本来源和鼠类型情况（Table9SampleSourcesandRatTypesin2016.4-2016.6inYiliangCounty）鼠类采样地点样本数量（份）鼠类型样本数量（份）宜良县匡远镇木兴村委会小木兴村27卡氏小鼠85宜良县匡远镇山后村106齐氏姬鼠143宜良县匡远镇饲料厂8褐家鼠7宜良县北古城镇北墩子村27黄胸鼠65宜良县狗街镇槽河村计数13锡金小鼠4119 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文鼠类采样地点样本数量（份）鼠类型样本数量（份）宜良县匡远镇瑞星村44臭鼩鼱10宜良县七星村161绒鼠5其他13中华姬鼠21其他18合计395合计395（10）弥勒县鼠类样本采集情况弥勒县样本采集于2016年4月-2016年6月，样本包括鼠样本327份和狗肛拭子样本98份共425份样本。鼠类样本地点和鼠类型见表10。表10弥勒县2016.4-2016.6样本地点来源情况(Table10SampleSourcesandRatTypesin2016.4-2016.6inMileCounty)鼠类采样地点样本数量（份）鼠类型样本数量（份）弥勒县江边乡挨村村委会江西寨19褐家鼠78弥勒县江边乡干田村委会干田村11黄胸鼠188弥勒县江边乡平地村委会大窝铺109卡氏小鼠13弥勒县江边乡矣腊竹村11树鼩、松鼠14五山乡则居村委会老寨村11斯氏家鼠12五山乡则居村委会新寨村87小家鼠22五山乡则居村委会则居村77其他2合计327合计327（11）弥渡县鼠类样本采集情况弥渡县样本采集于2016年4月-2016年6月，样本包括鼠样本287份和狗肛拭子样本112份共399份样本。鼠类样本地点和鼠类型见表11。3.犬类样本采集情况犬类样本在云南省7个地区采集，共701份。分别是梁河县105份、玉溪85份、宜良100份、保山102份、文山99份、弥勒98份、弥渡112份。其中犬类20 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文主要有六种，其中以哈巴狗和土狗肛拭子样本采集最多。具体见图5。图5云南省7个地区犬类样本采集情况(Figure5CollectionofCanineSamplesin7AreasofYunnanProvince)表11弥渡县2016.4-2016.6样本来源和鼠类型情况(Table11SampleSourcesandRatTypesin2016.4-2016.6inMiduCounty)鼠类采样地点样本数量（份）鼠类型样本数量（份）弥渡县红岩镇班局20柏氏姬鼠5弥渡县红岩镇班局村委会韩家庄8臭鼩鼱10弥渡县苴力镇苴力村委会下村8大耳姬鼠5弥渡县寅街镇上沙沟135大绒鼠20弥渡县弥祉镇高芹村13褐家鼠2弥渡县弥祉镇兴隆村48黄胸鼠104弥渡县寅街镇武邑村20齐氏姬鼠17弥渡县寅街乡永丰村9中华姬鼠124弥渡县寅街镇河东村8弥渡县寅街镇王田阁11其他7合计287合计28721 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文（1）梁河县犬类采集情况梁河县样本采集于2016年8月-2017年10月，样本包括鼠样本338份和狗肛拭子样本105份共443份样本。梁河县犬类样本地点和犬类类型见表12。表12梁河县犬类样本来源和犬类类型情况(Table12SamplesofdogbreedsanddogtypesinLiangheCounty)犬类采样地点样本数量（份）犬类型样本数量（份）梁河县河西镇邦读村委会15哈巴狗13梁河县芒东镇弯中村大坪子9狼狗10梁河县芒东镇弯中村一组9土狗81梁河县芒东镇翁冷村委会丙哪村25杂交狗1梁河县芒东镇翁冷村委会翁冷村一组17梁河县芒东镇翁冷村委会翁冷社3梁河县芒东镇翁冷村委会翁冷自然村3梁河县瑞泉村大平山二组19梁河县瑞泉村大平山三组4梁河县瑞泉村中平山1合计105合计105（2）玉溪县犬类样本采集情况玉溪样本采集于2016年8月-2017年10月，样本包括鼠样本331份和狗肛拭子样本85份共416份样本。犬类采样地点及犬类类型见表13。表13玉溪县犬类样本来源和犬类型情况(Table13DogSamplesandDogTypesinYuxiCounty)犬类采样地点样本数量（份）犬类型样本数量（份）甘庄街道朋程村3哈巴狗16卡腊村36沙皮狗3青龙厂小龙潭二队13土狗63青龙厂小龙潭一队14其他3洼垤分安桔村19合计85合计8522 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文（3）保山市犬类样本采集情况保山市样本采集于2016年8月-2017年10月，样本包括鼠样本303份样本，狗肛拭子102份共405份样本。犬类采样地点及犬类类型见表14。表14保山市犬类样本来源和犬类情况(Table14SamplesofdogbreedsanddogsinBaoshanCity)狗类采样地点样本数量（份）犬类样本数量（份）保山隆阳区板桥镇板桥村九组7哈巴狗25保山隆阳区板桥镇板桥村六组34狼犬狗4保山隆阳区辛街乡大村30土狗65保山隆阳区辛街乡辛街村30其他8合计102合计102（4）文山市犬类样本采集情况文山市样本采集于2016年8月-2017年10月，共采集样本405份，其中鼠类样本303份、犬类样本102份。犬类采样地点及犬类类型见表15。表15文山市犬类样本来源和犬类情况(Table15SamplesofdogbreedsanddogsinWenshanCity)狗类采样地点样本数量（份）犬类样本数量（份）文山市秉烈乡倮家邑村22哈巴狗2文山市簿竹镇新坦龙村26土狗96文山市马塘镇横塘子村26云南文山德厚镇感古村24合计98合计98（5）宜良县犬类样本采集情况宜良县样本采集于2016年4月-2016年6月，样本包括鼠样本85份和狗肛拭子样本99份共184份样本。犬类采样地点及犬类类型见表16。23 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文表16宜良县犬类样本来源和犬类情况(Table16SamplesofdogbreedsanddogsinLiliangcounty)犬类采样地点样本数量（份）犬类型样本数量（份）宜良县匡远镇大山后三社19哈巴狗18宜良县匡远镇大山后四社11土狗68宜良县匡远镇木兴村委会大木兴村6昆明犬2宜良县匡远镇木兴村委会小木兴村36狼犬2宜良县匡远镇七星村委会七星村27其他9合计99合计99（6）弥勒县犬类样本采集情况弥勒县样本采集于2016年4月-2016年6月，样本包括鼠样本327份和狗肛拭子样本98份共425份样本。犬类采样地点及犬类类型见表17。表17弥勒县犬类样本来源和犬类情况（Table17SamplesofdogbreedsanddogsinMileCounty）犬类采样地点样本数量（份）犬类型样本数量（份）虹溪镇刘家村委会刘家庄17土狗94江边乡埃村村委会25哈巴狗4江边乡干田村委会干田村5江边乡江边村委会埃腊竹村7江边乡平地村委会大窝铺3五山乡乌衣村委会大凹子村7五山乡则层村委会老寨村4新哨镇朗才村委会朗才村小组30合计98合计98（7）弥渡县犬类样本采集情况弥渡县样本采集于2016年4月-2016年6月，样本包括鼠样本287份和狗肛拭子样本112份共399份样本。犬类采样地点及犬类类型见表18。24 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文表18弥渡县犬类样本来源和犬类情况(Table18SamplesofDogsandDogsinMiduCounty)犬类采样地点样本数量（份）犬类型样本数量（份）弥渡县红岩镇班局村委会班局村22土狗71弥渡县红岩镇班局村委会韩家庄20哈巴狗26弥渡县红岩镇竹毛村委会白沙地18猫5弥渡县红岩镇竹毛村委会王新村10土狼犬4弥渡县红岩镇竹毛村委会小王亲2组11其他7弥渡县苴力镇苴力村委会下村5弥渡县弥城镇谷芹村委会高芹村26合计112合计1122.1.2三种致病耶尔森菌筛查基因确定的实验材料1.三种致病耶尔森氏菌确定筛查基因的样本整体情况宜良鼠85份和犬类肛拭子99份、弥勒鼠样本327份和狗肛拭子样本98份、弥渡鼠样本287份和狗肛拭子112份、丽江鼠类336份样本以及鼠疫菌40株（云南家鼠型29株、剑川野鼠型3株、丽江野鼠型7株和EV76菌1株）、临床分离菌45株、假结核耶尔森菌4株及小肠结肠炎耶尔森菌2株进行foxA、inv、F1目的基因筛查，见表19。表19三种致病耶尔森氏菌确定筛查基因实验样本情况(Table19DeterminationofscreeninggenetictestsamplesforthreepathogenicYersinia)样本地区样本数量（份）样本菌株样本数量（株）宜良184鼠疫菌40弥勒425临床分离菌45弥渡399假结核耶尔森菌4丽江336小肠结肠炎耶尔森菌2合计1344合计912.四个地区样本采集情况（1）宜良县家鼠鼠疫疫源地样本采集情况宜良县样本采集于2016年4月-2016年6月，样本包括鼠样本85份和狗肛25 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文拭子样本99份共184份样本。见表20-21表20宜良县2016.4-2016.6样本来源情况(Table20SampleSourcesofinYiliangCountyin2016.4-2016.6)鼠类采样地点样本数量（份）犬类采样地点样本数量（份）匡远镇木兴村委会小木兴村13匡远镇大山后三社19匡远镇山后村53匡远镇大山后四社11匡远镇饲料厂4匡远镇木兴村委会大木兴村6北古城镇北墩子村15匡远镇木兴村委会小木兴村36其他3匡远镇七星村委会七星村27合计85合计99表21梁河县2016.8-2017.10鼠种分布情况(Table21DistributionofratspeciesinLiangheCountyin2016.8-2017.10)鼠类型样本数量（份）犬类型样本数量（份）卡氏小鼠26哈巴狗18齐氏姬鼠20土狗68褐家鼠3昆明犬2黄胸鼠18狼犬2锡金小鼠12其他9其他6合计85合计99（2）弥勒县家鼠鼠疫疫源地样本采集情况弥勒县样本采集于2016年4月-2016年6月，样本包括鼠样本327份和狗肛拭子样本98份共425份样本。样本地点和鼠类型及犬类类型见表22、23。表22弥勒县2016.4-2016.6样本地点来源情况(Table22DistributionofratspeciesinLiangheCounty2016.8-2017.10)样本数量样本数量鼠类采样地点犬类采样地点（份）（份）26 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文弥勒县江边乡挨村村委会江西寨19虹溪镇刘家村委会刘家庄17弥勒县江边乡干田村委会干田村11江边乡埃村村委会25弥勒县江边乡平地村委会大窝铺109江边乡干田村委会干田村5弥勒县江边乡矣腊竹村11江边乡江边村委会埃腊竹村7五山乡则居村委会老寨村11江边乡平地村委会大窝铺3五山乡则居村委会新寨村87五山乡乌衣村委会大凹子村7五山乡则居村委会则居村77五山乡则层村委会老寨村4其他2新哨镇朗才村委会朗才村小组30合计327合计98表23弥勒县2016.8-2017.10鼠种分布情况(Table23DistributionofRatSpeciesinMileCountyin2016.8-2017.10)鼠类型样本数量（份）犬类型样本数量（份）褐家鼠78土狗94黄胸鼠188哈巴狗4卡氏小鼠13树鼩、松鼠14斯氏家鼠12小家鼠22合计327合计98（3）弥渡县样本采集情况弥渡县样本采集于2016年4月-2016年6月，样本包括鼠样本287份和狗肛拭子样本112份共399份样本。样本地点和鼠类型及犬类类型见表24、25。表24弥渡县2016.4-2016.6样本来源情况(Table24SampleSourcesofMiduCountyin2016.4-2016.6)鼠类采样地点样本数量（份）犬类采样地点样本数量（份）弥渡县红岩镇班局20弥渡县红岩镇班局村委会班局村2227 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文弥渡县红岩镇班局村委会韩家庄8弥渡县红岩镇班局村委会韩家庄20弥渡县苴力镇苴力村委会下村8弥渡县红岩镇竹毛村委会白沙地18弥渡县寅街镇上沙沟135弥渡县红岩镇竹毛村委会王新村10弥渡县弥祉镇高芹村13弥渡县红岩镇竹毛村委会小王亲2组11弥渡县弥祉镇兴隆村48弥渡县苴力镇苴力村委会下村5弥渡县寅街镇武邑村20弥渡县弥城镇谷芹村委会高芹村26弥渡县寅街乡永丰村9弥渡县寅街镇河东村8弥渡县寅街镇王田阁11其他7合计287合计112表25弥渡县2016.8-2017.10鼠种分布情况(Table25DistributionofRatSpeciesinMiduCountyin2016.8-2017.10)鼠类型样本数量（份）犬类型样本数量（份）柏氏姬鼠5土狗71臭鼩鼱10哈巴狗26大耳姬鼠5猫5大绒鼠20土狼犬4褐家鼠2其他7黄胸鼠104齐氏姬鼠17中华姬鼠124合计287合计112（4）丽江野鼠鼠疫源地样本采集情况丽江样本采集于2016年1月-2016年6月，样本包括鼠肠道样本336份，其采样地点和鼠类型见表26、27。28 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文表26丽江2016.4-2016.6样本来源情况(Table26SampleSourcesofLijiangin2016.4-2016.6)采样地点样本数量（份）丽江玉龙县黄山镇南溪村委会鹿子村203丽江市玉龙县大安乡吉子村委会汝南化4社133合计336表27丽江2016.8-2017.10鼠样本分布情况(Table27Distributionofratsamplesin2016.8-2017.10inLijiang)鼠类型样本数量（份）大耳姬鼠8大绒鼠6黄胸鼠5齐氏姬鼠120绒鼠194其他3合计3362.1.3实验试剂和仪器1.主要实验试剂表28实验所用主要试剂(Table28Mainreagentsintheexperiment)试剂名称厂家YERSINIASELECTIVEAGARBD（美国）（耶尔森选择培养基）PEPTONESORBITOLBILEBROTHSigma-AldrichFΜLKA（美国）（改良磷酸盐缓冲溶液）酵母粉OXIOD（英国）蛋白胨OXIOD（英国）琼脂北京陆桥生物技术公司十二水和磷酸氢二钠国药集团琼脂糖凝胶BiowestAgarose（西班牙）PREMIX天根生化科技有限公司29 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文DNA提取试剂盒天根生化科技有限公司QIAGEN（美国）EDTAAmresco（美国）TRISAmresco（美国）2.主要实验仪器表29实验所用主要仪器(Table.29Instrumentsintheexperiment)仪器名称型号规格或生产厂家生物安全柜NuAirLabGARPESclassⅡ（美国）高速冷冻离心机Eppendorfcentrifuge54（美国）立式压力蒸汽灭菌器Tomysx-50（日本）PCR仪SENSOLabCyclerPCR（德国）电泳仪HoeferPS3008（美国）凝胶成像系统SyngeneG:BOXCHEMIXR5（英国）超纯水仪艾科浦RM-200（美国）电子天平佑科Yp10001（上海）显微镜OLYMPUSCH2O（日本）移液枪EppendorfResearch（美国）恒温培养箱恒一GHP72700（上海）微波炉格兰仕WD800水浴锅JΜLABOWT84（德国）干燥箱烘箱DHG-8240A（江东）2.2实验方法2.2.1技术路线30 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文采集新鲜标本与改良PBS增菌液1：10混匀4℃冷增菌15~20天生物安全柜中取1ml混液提取全DNA筛查基因确定PCR初筛：F1、0392、foxA、inv(+)(—)—80℃冻存标本库0392(+)接种于耶尔foxA或inv(+)接种于森菌选择性平板，耶尔森菌选择性平28℃,24h。板，25℃，24h。挑选可疑菌落做细菌PCR噬菌体的(+)(—)分离鉴定提该可疑菌株DNA，—80℃冻存菌库0392、foxA、inv检测。阳性的菌株进行保种处理。2.2.2实验方法1.冷增菌培养将采集到的鼠鉴定后剖解取鼠结盲肠及其内容物和犬类肛拭子置于PBS增菌液中，放入4℃冰箱冷增菌15-21天。2.DNA的提取采用TIANAMPGenomicDNAkit试剂盒。使用前先在缓冲液GD和漂洗液31 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文PW中加入无水乙醇。（1）取培养好的冷增菌混浊液1mL分至离心管，12000rpm/min离心1min，上清用于噬菌体的筛查，取沉淀进行DNA提取。（2）向沉淀中加入200μL缓冲液GA，震荡至彻底悬浮。（3）向悬浮液中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。（4）再向管中加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀后置70℃水浴锅中放置10min，使溶液变清亮。简短离心去除管壁水珠。（简短离心均使用台式离心机）（5）再向管中加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，简短离心去除管壁水珠。（6）将步骤（5）中所得液体加入CB3吸附柱中12000rpm离心30sec，弃废液。将吸附柱放回收集管中。（7）向吸附柱中加入500μL缓冲液GD12000rpm离心30sec，弃废液后将吸附柱放回收集管中。（8）再向吸附柱中加入600μL漂洗液PW12000rpm离心30sec，弃废液后将吸附柱放回收集管中。（9）重复步骤(8)。（10）将吸附柱放回收集管，12000rpm离心2min,倒掉废液，将吸附柱置于室温放置10min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂白液和无水乙醇。（11）将吸附柱置于一个新的离心管中，悬空滴加50μL-200μL洗脱液TE，室温放置2-5min12000rpm离心2min,将DNA提取液收集到离心管中备检。3.PCR扩增（1）不同PCR扩增引物序列和退火温度以及产物大小表30PCR扩增引物序列和退火温度(Table30PCRamplificationprimersequencesandannealingtemperatures)引物引物序列5′→3′产物大小退火温度F1aGGAACCACTAGCACATCTGTT249bp55℃F1F1bACCTGCTGCAAGTTTACCGCCfoxAfoxA836GGTTCCTTGAGCGTATTGATG1094bp57℃foxA1950GGTCATCGGTTTCAGCAGTTT32 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文inv-1CGGTACGGCTCAAGTTAATCTGinv183bp57℃inv-2CCGTTCTCCAATGTACGTATCCFATGACGCATTCTCTCCAGATG0392272bp55℃RCAGAAAAAACACTACATATACC（2）不同PCR扩增的反应条件F1/0392PCR反应条件：95℃5min95℃1min55℃20s30x72℃30s72℃5minfoxA/inv/foxA+invPCR反应条件：95℃5min95℃15s55℃15s25x72℃30s72℃5min（3）PCR产物电泳和成像PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统拍照成像,产物置4℃冰箱保存。（4）三种致病耶尔森菌初筛目的基因结果判读。表31结果初步判读(Table31Preliminaryinterpretationoftheresults)结果判断F1/0392foxAinv鼠疫耶尔森菌+--小肠结肠炎耶尔森菌-+-假结核耶尔森菌--+33 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文4.梅里埃VITEK2Compact和Api20E生化试剂条生化鉴定。（1）API20E生化试剂条操作步骤（参照说明书）①取API0.85%NaCl（5mL）培养基或使用5mL0.85%无杂质生理盐水；②用吸管或接种针从分离物的平板上挑取单个分纯菌落至悬浮基物中建议适用新鲜培养；③仔细研匀以达到均一的细菌悬液；④用同一根吸管，将菌悬液充满[CIT]、[VP]和[GEL]管的管部和杯部（加满）其他管仅充满管部（不是杯部）；⑤ADH、LDC、ODC、H2S和URE管用矿物油覆盖以形成厌氧环境；⑥盖上培养盒；⑦孵育18~24小时。结果判读：TDA试验：加1滴TDA试剂深褐色为阳性反应；IND试验：加1滴JAMES试剂反应立即发生粉红色出现为阳性反应；VP试验：加1滴VP1和1滴VP2试剂至少等待10分钟浅粉或红色表示为阳性结果如浅粉红色在10至12分钟内出现判断结果为阴性；NO2测定：各加一滴Nit1和Nit2试剂于葡萄糖管内，待2~3分钟后，红色表示阳性，阴性反应（黄色）可能由於还原至N2（有时还有气泡）：加2-3mg锌粉到葡萄糖管，5分钟後，如果管保持黄色表示N2阳性。对照结果判读（加入附加试剂前阳性结果包括GLU试验的数量少于3个重新培养21小时且不要加任何试剂）。（2）VITEK2Compact操作步骤①用盐水分配器分装3mL无菌盐水（0.45%-0.5%Nacl，pH4.5-7.0）于5mL玻璃管中。纯种培养的细菌制备成细菌悬液。用接种环接种菌落至盐水管中，用已经校正的VITEK2比浊仪（校正需调零，再用标准校正管“0”麦氏单位调零，继续用“0.5”的标准校正管验证，注意摇匀不要有沉淀）配置相当于0.5-0.63的麦氏单位菌悬液。34 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文②把测试卡和菌液管放到载卡架上相应的卡槽内。注意编号和菌液相对应。将载卡架放入仪器的填充仓，开始填充卡，充填结束后，放入装载仓，读取条码。③将载卡架可以从装载室取出，试管放入危险垃圾进行处理。④8-10h左右，查看生化分析结果并打印结果单。5.非特异性条带鉴定（1）条带切胶回收、纯化并进行TA克隆测序切胶回收步骤：①将待回收的PCR产物经电泳后，从琼脂糖凝胶上快速切下目的DNA的片段。放在称量好重量放1.5mL离心管中，再次称量胶的重量。②用BufferGPS活化处理HibindDNA旋转柱。③加入1倍体积的溶胶液（XP2适量）在离心管中，置于55℃-66℃水浴锅水浴7min。期间轻摇离心管几次使胶完全溶解。④把活化好的HibindDNA旋转柱装好。⑤加入700μLDNA（琼脂糖溶液）到活化好的HibindDNA旋转柱的管中，室温10000r/min，离心1min。弃液体静置5-10min。⑥加入300μL结合缓冲液（XP2）洗涤柱子。室温10000r/min，离心1min弃液体。⑦加入700μL洗涤液（SPW）洗涤柱子。室温10000r/min，离心1min弃液体。⑧重复7的步骤。⑨弃液体后，10000r/min，离心回收柱子2min，37℃静置10min。取出回收柱子，套入一个干净的1.5mL的离心管中，加入30-50μLElutionBuffer室温1min。室温10000r/min，离心1min。把离心下的液体再加到回收柱静置2min。10000r/min，离心1min。⑩回收的DNA经过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其大小和浓度后。-20℃保存备用。6.引物设计0392引物根据染色体YPO0392片段在软件Primer5.0设计完成，并对0392进行鼠疫菌和非鼠疫菌的验证。0392引物序列见表21。35 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文7.细菌分离纯化和镜下观察。将PCR反应阳性的冷增菌液从原始管挑出，将其混匀用接种环挑取一环3-4分区接种于耶尔森选择培养平板上，经28℃，24培养后，观察并挑选可疑的单菌落对其进行纯化,接种于LB琼脂平板上，经28℃，24培养。三种致病耶尔森氏菌LB培养基菌落形态观察显微镜下的形态观察。见图6：分别是鼠疫耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌。图6三种致病耶尔森菌镜下形态（放大倍数10×40）（Figure6MicroscopicappearanceofthreeYersiniaspp.）2.2.3试剂配置1.主要培养基的配置（1）耶尔森选择培养基（Yersniaselectiveagar）1000mL双蒸水中加入59.5g耶尔森选择培养基，121℃高压灭菌30分钟。向9.5mL双蒸水中加入400μL头孢磺啶（10mg/mL）或者125μL（20mg/mL）混匀，将抗生素混合液加入冷却至56℃的耶尔森选择培养基，轻轻摇匀，倒平板后置于紫外线照射30min后，移至28℃温箱过夜，备用。（2）PBS（改良磷酸盐缓冲溶液）增菌液1000mL双蒸水中加入31gPBS，121℃高压灭菌30分钟，待其冷却后倒入10mL到50mL离心管置4℃冰箱保存，备用。（3）LB培养基1000mL双蒸水中加入10g蛋白胨、5g酵母粉、1gNa2HPO4、9gNaCl、15g琼脂粉。将pH值调至8.0，121℃高压灭菌30分钟，待其冷却到55-60℃后倒平板，紫外线照射30min后，移至28℃温箱过夜。36 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文（4）PCR反应体系配置F1、0392基因PCR反应体系总体积20μL，分别是2×mix10μL，引物1μL（上、下引物各0.5μL），模板1μL，去离子水8μL。foxA和inv基因PCR反应体系总体积20μL，分别是2×mix10μL，引物2μL（两种引物上、下引物各0.5μL），模板1μL，去离子水7μL。（5）琼脂糖凝胶配置称取1.2g琼脂粉（浓度1.5g/100mL）倒入瓶中，向瓶中加80mL0.5xTBE电泳缓冲液，放入微波炉加热完全熔化至透明，冷却至60℃加入4μLGoldview染料（浓度5μL/100mL），混匀后倒入放有梳子的槽内，30min后待凝固可拔梳。37 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文3实验结果3.1三种致病耶尔森菌PCR检测结果3.1.111个地区的三种致病耶尔森菌分布结果2016.1-2017.10共采集云南省部分鼠疫疫源地共11个地区样本4985份样本，最后检测foxA阳性样本菌株共248株，分离率为4.97%；初筛0392阳性样本6份，初筛阳性率0.12%、初筛inv阳性样本0份。1.对梁河县443份样本（鼠样本338份、犬类肛拭子105份）进行三种致病耶尔森氏菌筛查foxA阳性菌株样本有11株，分离率为3.25%；2.玉溪市共426样本（鼠样本331份、犬类样本85份）其中foxA阳性菌株有7株，分离率为1.68%；3.玉龙县共853份样本（其中包括筛查基因确定的336份样本和三种致病耶尔森菌筛查的517份样本）foxA阳性菌株146株，分离率为17.12%；4.宜良县样本共495份（其中包括确定基因的184份样本和三种致病耶尔森菌筛查筛查的311份样本，鼠类样本395份、犬类样本100份）foxA阳性菌株2株，分离率为0.40%；5.剑川县样本共794份，foxA阳性菌株47株，分离率为5.92%；6.洱源县样本共86份，其中0392阳性样本2份和foxA阳性菌株2株，阳性率和分离率分别是2.33%、1.16%；7.鹤庆县样本共264份，其中0392阳性样本4份和foxA阳性菌株8株，阳性率分别为1.50%、3.00%；8.保山市样本共405份（鼠类样本303份、犬类肛拭子样本102份），foxA阳性菌株4株，分离率0.99%；9.文山市共402份样本（鼠类样本303份、犬类肛拭子样本99份）三种致病耶尔森菌检测均阴性。10.弥勒县样本数分别是425（鼠类样本327份、犬类肛拭子样本98份），其中foxA阳性菌株是18株，分离率是1.00%；11.弥渡县样本数共399份（鼠类样本287份、犬类肛拭子样本112份）其中foxA阳性菌株是4株，分离率是1.00%；见表32。38 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文表32各个地区三种致病耶尔森氏菌的分离情况(Table32SeparationofthreepathogenicYersiniaspeciesinvariousregions)采样样本数量0392阳性foxA阳性Inv阳性地区（份）数量（份）阳性率（%）数量（份）分离率（%）数量（份）阳性率（%）梁河县44300.00113.2500.00玉溪市41600.0071.6800.00玉龙县85300.0014617.1200.00宜良县49500.0020.4000.00剑川县79400.00475.9200.00洱源县8622.3311.1600.00鹤庆县26741.5083.0000.00保山市40500.0040.9900.00文山市40200.0000.0000.00弥勒县42500.00184.2400.00弥渡县39900.0041.0000.00合计498560.132484.9700.003.1.2三种致病耶尔森菌统计分析结果1.整体分析结果云南省11个地区的三种致病耶尔森氏菌阳性率经SPSS17.0统计分析具有统计学意义（χ2=197.944，P<0.05），表示三种致病耶尔森菌的筛查阳性率不相同。对三种致病耶尔森菌的率分别进行分析：其中0392和Inv阳性率无统计学差异（P>0.05）；foxA阳性菌株分离率（χ2=333.74,P<0.05）具体统计学差异，认为采集样本的11个地区小肠结肠炎耶尔森菌的分离率不尽相同。对于总样本数量4985份，其中鼠有4284份、犬类肛拭子有701份。其中鼠类foxA阳性菌株有225份，foxA阳性菌株分离率为5.21%。犬类肛拭子foxA阳性菌株有23份，foxA阳性菌株分离率为3.28%。统计分析（χ2=4.95，P=0.024）具有统计学差异，即认为鼠类foxA阳性菌株分离率高于犬类肛拭子foxA阳性率。39 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文表33鼠类和犬类foxA阳性菌株分布情况(Table33DistributionoffoxA-positivestrainsinrodentsanddogs)样本数量（份）阳性数（份）分离率（%）鼠类42842255.21犬类701233.282.家鼠和野鼠疫源地分析比较结果家鼠鼠疫疫源地包括：梁河县、宜良县、保山市、弥勒县、弥渡县、玉溪市、文山市；野鼠鼠疫疫源地包括：玉龙县、剑川县、洱源县、鹤庆县。对家鼠鼠疫疫源地和野鼠鼠疫疫源地foxA阳性菌株分离率整体分析结果：χ2=164.51,P<0.05，家鼠鼠疫疫源地和野鼠鼠疫疫源地具有统计学差异，即野鼠鼠疫疫源地的小肠结肠炎耶尔森氏菌的分离阳性率比家鼠鼠疫疫源地的分离阳性率高。见表34。表34云南省家鼠和野鼠鼠疫foxA阳性菌株分布情况(Table34ThedistributionoffoxApositivestrainsofplagueandhousemouseinYunnanProvince)鼠疫疫源地样本数量（份）阳性数（份）分离率（%）家鼠鼠疫疫源地2985461.54野鼠鼠疫疫源地200020210.103.家鼠鼠疫疫源地分析结果家鼠鼠疫疫源地包括：梁河县、宜良县、保山市、弥勒县、弥渡县、玉溪市、文山市；其中家鼠鼠疫疫源地总体有差异（χ2=48.42,P<0.05）。对家鼠疫源地的foxA阳性菌株分离率进行两两比较，梁河分别和宜良县、保山市、文山市、弥渡县(χ2=20.39、11.44、22.02、11.02,P<0.003)，都具有统计学意义,即梁河县的foxA阳性菌株分离率比宜良县、保山市、弥渡县要高。弥勒县分别和宜良县、保山市有统计学意义（χ2=15.78、8.48,P<0.003）即认为弥勒县foxA阳性菌株分离率比宜良县和保山市要高。其中宜良、保山市和弥勒两两比较无统计学意义，梁河县和弥勒县P>0.005无统计学意义。即梁河县和弥勒县的foxA阳性菌株分离率在家鼠鼠疫疫源地中最高。40 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文表35家鼠鼠疫疫源地分离率两两比较情况(Table35Comparisonofpositiverateχ2valuebetweentwoplagueandplaguefoci)梁河宜良县保山市弥勒县玉溪市宜良20.39保山市11.441.14弥勒县0.5315.788.48玉溪市7.073.780.756.60弥渡县11.201.190.073.940.784.野鼠鼠疫疫源地分析结果野鼠鼠疫疫源地包括：玉龙县、剑川县、洱源县、鹤庆县。对野鼠鼠疫疫源地分析（χ2=73.13，P<0.05）有统计学差异。进行两两比较，即玉龙和剑川县比较(χ2=49.83,P<0.008)具有统计学差异,玉龙县和洱源县比较具有统计学差异(χ2=15.06,P<0.008)，玉龙县和鹤庆县比较（χ2=34.19,P<0.008）有统计学意义即玉龙县的foxA阳性菌株分离率比其他三个县的分离率高。表36野鼠鼠鼠疫疫源地foxA阳性菌株分离率两两比较情况(Table36ComparisonoffoxApositiveratebetweentworatplaguefoci)玉龙县剑川县洱源县剑川县49.83洱源县15.064.17鹤庆县34.195.100.885.不同鼠类型分析结果对于总样本数量4985份，其中鼠有4284份、犬类肛拭子有701份。其中鼠类foxA阳性菌株有225株，foxA阳性菌株分离率为5.21%。对不同的鼠类型进行统计分析（χ2=86.20,P<0.05）结果具有统计学意义，即不同鼠类型的foxA阳性菌株分离率有差异。对五种鼠类型进行两两比较：齐氏姬鼠foxA阳性菌株分离率分布和褐家鼠、黄胸鼠、中华姬鼠具有统计学差异（χ2=19.19、38.02、9.91；P<0.005），绒鼠对褐家鼠、黄胸鼠、中华姬鼠有统计学意义（χ2=19.43、37.14、10.16；P<0.005），即绒鼠和齐氏姬鼠的foxA阳性菌41 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文株分离率要高于其他三种鼠的分离率。其中褐家鼠和黄胸鼠主要来自家鼠鼠疫疫源地，齐氏姬鼠、绒鼠和中华姬鼠主要来自野鼠鼠疫疫源地，因此foxA阳性菌株分离率主要分布在野鼠鼠疫疫源地，以齐氏姬鼠和绒鼠为主。表37不同鼠类型foxA阳性菌株分布情况(Table37DistributionoffoxA-positivestrainsindifferentmousetypes)鼠类型鼠数量鼠类foxA阳性菌株数（株）阴性数分离率（%）齐氏姬鼠113710510329.23绒鼠761756869.99褐家鼠30763011.95黄胸鼠10321910131.84中华姬鼠16141572.48其他886168721.58合计428422540595.21注：绒鼠包括大绒鼠和玉龙绒鼠。表38鼠类型foxA阳性菌株分离率两两比较情况(Table38ComparisonofisolationratesofmurinetypefoxApositivestrains)齐氏姬鼠绒鼠褐家鼠黄胸鼠绒鼠0.31褐家鼠19.1919.43黄胸鼠38.0237.140.22中华姬鼠9.9110.160.080.016.不同犬类分析结果犬类样本共采集701份。其中foxA阳性菌株有23株，阳性率为3.28%。其中土狗肛拭子有538份，foxA阳性菌株有15株，分离率为2.79%。哈巴狗肛拭子有104份，foxA阳性菌株有5株，分离率为4.81%。狼犬肛拭子有18份，foxA阳性菌株有1株，分离率为5.56%。见表39。对主要的三种犬类型进行χ2分析，结果显示土狗、哈巴狗和狼犬无统计学差异（P>0.05），即认为在家鼠鼠疫疫源地中，三种类型的犬类foxA阳性菌株分42 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文离率无差异。表39犬类foxA阳性菌株分离率分布情况(Table39DistributionoftheisolationrateofdogfoxApositivestrains)犬类型样本数量（份）阳性数（份）分离率（%）土狗538152.79哈巴狗10454.81狼犬1815.56其他4124.88合计701233.283.1.3玉龙县foxA阳性菌株分离情况分析1.玉龙县采样地区分析结果玉龙县鼠类样本共有853份，采集地点主要是南溪村委会鹿子村和太安乡吉子村汝南化4社，具体采样地点、采样数量和foxA阳性菌株分离率见表40。对七个采样地点总体进行统计分析（χ2=43.76,P<0.05）具有统计学差异，认为玉龙县采样地点的foxA阳性菌株分离率具有差异。表40玉龙县2016.8-2017.10样本来源情况(Table40SampleSourcesof2016.8-2017.10inYuLongCounty)采样地点样本数量（份）阳性数分离率（%）丽江市玉龙县海棠村300丽江市玉龙县太安乡红梅村100丽江玉龙县南溪村委会旦后村412253.66丽江玉龙县南溪村委会旦前村861112.79丽江玉龙县南溪村委会鹿子村3364613.69丽江玉龙县南溪村委会满下村871719.54丽江玉龙县太安乡吉子村汝南化4社2995016.72合计85314617.12对四个foxA阳性地区进行foxA阳性菌株分离率两两比较发现南溪村委会旦后村和太安乡红梅村、旦前村、鹿子村、满下村、太安乡吉子村汝南化4社有统43 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文计学差异（χ2=24.11、39.48、15.31、29.47，P<0.005），即认为南溪村委会旦后村的foxA阳性菌株分离率比其他foxA阳性地区和阳性率高，其他地区两两比较无统计学差异认为阳性率分布无差异，以南溪村委会旦后村foxA阳性菌株分离率最高。2.玉龙县鼠类样本分析结果玉龙县鼠类样本主要分布在玉龙绒鼠、大绒鼠和齐氏姬鼠，总体统计学分析（χ2=31.80，P<0.05）有统计学差异，认为玉龙县不同鼠类型foxA阳性菌株分离率分布有差异，见表41。对其主要的鼠类进行两两分析，结果显示大绒鼠foxA阳性率要高于齐氏姬鼠、大耳姬鼠、玉龙绒鼠（χ2=26.35、3.88、21.58，P<0.05）。表41玉龙县2016.8-2017.10鼠种分布情况(Table41DistributionofRatSpeciesin2016.8-2017.10inYulongCounty)鼠类型样本数量（份）阳性数（份）分离率（%）齐氏姬鼠5208015.38大耳姬鼠15213.33大绒鼠753040.00玉龙绒鼠2083014.42长尾灰麝鼩10220黄胸鼠500其他20211.11合计85314617.11表42鼠类型foxA阳性菌株分离率两两比较情况(Table42ComparisonofisolationratesofmurinetypefoxApositivestrains)齐氏姬鼠大耳姬鼠大绒鼠大耳姬鼠0.047大绒鼠26.353.88玉龙绒鼠0.110.01421.5844 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文3.1.4剑川县样本分析情况1.剑川县采样地点分析结果剑川样本采集于2016年8月-2017年10月，样本包括鼠样本794份样本，采集地点主要在剑川县金华镇和剑川县沙溪镇石龙村。见表43表43剑川县2016.8-2017.10样本来源情况(Table43SampleSourcesofJianchuanCountyin2016.8-2017.10)采样地点样本数量（份）阳性数（份）分离率（%）剑川县甸南镇10421.9剑川县金华镇31620.63剑川县沙溪镇石龙村2783412.23剑川县羊岑乡新松村2613.84剑川县沙溪镇长乐村70811.43合计794475.92对剑川县采用地点进行统计学分析（χ2=38.37,P<0.05）具有统计学差异即剑川县各个采样地区具有不同的foxA阳性菌株分离率。对五个不同采样地点进行两两分析，剑川县金华镇和剑川县沙溪镇石龙村和剑川县沙溪镇长乐村具有统计学差异（χ2=25.17、26.37,P<0.005）即石龙村和长乐村的foxA阳性菌株分离率要高于金华镇。剑川县羊岑乡新松村和剑川县沙溪镇长乐村具有统计学差异（χ2=8.52,P<0.005)即羊岑乡新松村比沙溪镇长乐村foxA阳性分离率要低。石龙村和岑乡新松村具有统计学差异（χ2=8.13,P<0.005)）即石龙村比岑乡新松村foxA阳性菌株分离率高。剑川县foxA阳性菌株地区主要集中在石龙村和长乐村。2.剑川县鼠类分析结果剑川县采集鼠类样本都主要是齐氏姬鼠和大绒鼠，对剑川鼠类型进行统计学分析，χ2=9.97，P>0.05无统计学差异。认为剑川县小肠结肠炎耶尔森菌阳性率在野鼠种类中分布较均匀，各种鼠类foxA阳性菌株分离率见表格44。45 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文表44剑川县2016.8-2017.10鼠种分布情况(Table44Distributionofratspeciesin2016.8-2017.10inJianchuanCounty)鼠类型样本数量（份）阳性数（份）分离率（%）贝氏树鼩14214.28齐氏姬鼠397256.30中华姬鼠16425.00大绒鼠269155.58褐家鼠1900.00黄胸鼠4112.44其他3800.00合计794475.923.2三种致病耶尔森菌筛查基因确定结果3.2.1三种基因筛查结果对宜良鼠85份和犬类肛拭子99份、弥勒鼠样本327份和狗肛拭子样本98份、丽江鼠类336份样本共1233份样本进行foxA、inv、F1基因筛查，发现F1基因筛查采集样本时，有22份样本出现F1非特异性条带，对临床分离菌45株同样出现非特异性条带。foxA、inv都没出现非特异性条带。表45采集样本基因筛查结果(Table45Collectedsamplegeneticscreeningresults)样本来源样本数量（份）F1+（份）foxA+（份）inv+（份）宜良1841320弥勒4259180弥渡399440丽江3361520临床菌株454500合计138972760注：F1+是指出现非特异性条带的假阳性菌株，foxA+是指foxA检测阳性样本。46 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文3.2.2生化鉴定结果对F1基因筛查结果出现非特异性条带的22份菌株进行生化鉴定。结果如下表：表46鼠样本PCR初筛F1假阳性菌株鉴定情况(Table46IdentificationofF1falsepositivestrainsbyPCRscreeningofmousesamples)序号菌株编号鉴定结果（可能性）备注1YL11布氏柠檬酸杆菌（95%）VITEK2compact鉴定2MD266布氏柠檬酸杆菌（95%）VITEK2compact鉴定3YLG28布氏柠檬酸杆菌（88%）VITEK2compact鉴定4YLG42弗氏柠檬酸杆菌（86%）VITEK2compact鉴定5YLG92杀鲑气单胞菌（99%）VITEK2compact鉴定6LJ191荧光假单孢菌（89%）VITEK2compact鉴定7ML133非脱羧勒菌（99%）VITEK2compact鉴定8YLG30布氏柠檬酸杆菌（91%）VITEK2compact鉴定9YL86大乡间布丘菌（86%）VITEK2compact鉴定10LJ191-1普通变形杆菌（95%）VITEK2compact鉴定11MD29小肠结肠炎耶尔森菌（99%）VITEK2compact鉴定12YLS50缓慢葡萄球菌（94%）VITEK2compact鉴定13YLG29温和气单胞菌（95%）VITEK2compact鉴定14YL86小乡间布丘菌（91%）VITEK2compact鉴定15ML105布氏柠檬酸杆菌（95.9%）Api20E鉴定16ML208-1居泉沙雷菌（86.4%）Api20E鉴定17ML44-1大肠埃希菌（99.7%）Api20E鉴定18ML322肺炎克雷伯菌肺炎亚种2（77.9%）Api20E鉴定19YLG20布氏柠檬酸杆菌（99.6%）Api20E鉴定20MD44小肠结肠炎耶尔森菌（99.8%）Api20E鉴定21YLG32布氏柠檬酸杆菌（99.7%）Api20E鉴定22ML299-1克吕沃尔菌属（68.7%）Api20E鉴定47 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文3.2.3PCR扩增结果共使用111株菌，鼠疫菌40株（云南家鼠型鼠疫菌29株、剑川野鼠型鼠疫菌3株、丽江野鼠型鼠疫菌7株和EV76菌1株）；71株非鼠疫菌菌株（临床分离菌45株、鼠肠道分离菌20株（除两株小肠结肠炎耶尔森菌）、假结核耶尔森氏菌4株、小肠结肠炎耶尔森菌2株）进行F1基因的PCR扩增，结果见表47。71株非鼠疫菌中，13株菌没有出现非特异性条带，分别为白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、光滑假丝酵母菌、无乳链球菌、铅黄杆菌、罗伯特隐球酵母菌、多杀巴斯、流感嗜血杆菌以及4株Y.pst；其他菌株出现400、500、600、700、800、900及1000bp的条带，见表47及图7（大肠杆菌、维罗纳气单胞、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌PCR扩增图为例）。表47试验菌株及行标F1引物PCR扩增出现非特异性条带列表(Table47Listofnon-specificbandsinPCRamplificationofteststrainsandrow-markedF1primers)编菌株数量产物长度编菌株数量产物长度号名称（株）（bp）号名称（株）（bp）1粪产碱菌属1100027变形杆菌2400、10002肺炎链球菌1100028费氏志贺杆菌15003表皮葡萄球菌360029铜绿假单胞菌1无4聚团泛菌21000、50030光滑假丝酵母菌1无5粪肠球菌250031无乳链球菌1无6鲍曼不动杆菌290032铅黄杆菌1无7弗氏柠檬酸杆菌3600、100033枯草芽孢杆菌14008克氏柠檬酸杆菌160034罗伯特隐球酵母1无菌9白色念珠菌1无35多杀巴斯1无10粘质沙雷160036流感嗜血杆菌1无11大肠杆菌350037布氏柠檬酸杆菌7700、100012人葡萄球菌亚种1100038杀鲑气单胞菌1100013摩氏摩根菌1100039荧光假单孢菌1500、70048 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文编菌株数量产物长度编菌株数量产物长度号名称（株）（bp）号名称（株）（bp）14嗜水气单胞2100040非脱羧勒菌1500、80015植生拉乌菌2800、100041乡间布丘菌270016产酸克雷伯菌250042缓慢葡萄球菌1400、50017维罗纳气单胞1600、90043温和气单胞菌1100018热带假丝酵母菌1无44居泉沙雷菌180019沙门伤寒菌170045克吕沃尔菌属150020金黄色葡萄球菌1无46假结核耶尔森氏4无菌21腊样芽孢杆菌1100047小肠结肠炎耶尔21000森氏菌22弗氏/中间耶尔1100048云南家鼠型鼠疫29无森氏菌菌23液化沙雷1100049剑川野鼠鼠疫菌3无24气味沙雷1型160050丽江野鼠鼠疫菌7无25肺炎克雷伯菌1500、90051EV76鼠疫菌1无26产气肠杆菌1500图7F1引物对非鼠疫菌株DNAPCR扩增结果(Figure7PCRamplificationofnon-plaguestrainDNAbyF1primers)(注：mark：100bp，1：粘质沙雷600、2：大肠杆菌500、3：维罗纳气单胞600、900、4：粪肠球菌500、5：鲍曼不动杆菌900，“+”为EV菌DNA，“-”为加纯水无DNA)49 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文3.2.4TA克隆和测序根据出现非特异性条带分子量分布的不同，选择7株菌株进行TA克隆和测序，对测序结果和美国国立图书馆分子生物学数据库网站（NCBI）基因库进行提供的同源性搜索工具（BLAST）中比对，均有出现和F1引物下游相同的碱基序列。7株菌测序片段中上游都有F1引物的下游碱基序列“ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC”、下游有F1引物下游都有反向互补的碱基序列“GCGGTAAACTTGCAGCAGGT”。测序的7株菌分别是鲍曼不动杆菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯、气单胞球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、乡间布丘菌、布氏柠檬酸杆菌（覆盖率分别为98%、98%、76%、93%、90%、95%、98%，相似率分别为99%、98%、96%、92%、91%、80%、99%）。以产气肠杆菌为例（测序结果见附录），BLAST比对中覆盖率和相似率都达到98%，见图8。图8产气肠杆菌在NCBI中BLAST结果(Figure8BLASTresultsofEnterobacteraerogenesinNCBI)50 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文3.2.5新设计染色体目标基因0392引物验证由于用行标F1做引物会扩增出非特异性条带，加上TA克隆和测序结果显示行标F1引物下游序列不适应筛选所有的菌株，因此选取鼠疫菌染色体YPO0392上的标识基因重新设计0392基因引物。新设计的0392引物筛查非鼠疫菌均没有出现非特异性条带，以大肠杆菌、维罗纳气单胞、粘质沙雷、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌为例，见图9。对于40株鼠疫菌，以0392为引物PCR扩增均能扩增出特异性条带，见图10图90392为引物对非鼠疫菌菌株PCR扩增结果(Figure9PCRamplificationresultsof0392primerpairsagainstY.pestisstrains)（注：mark：100bp，1：粘质沙雷、2：大肠杆菌、3：维罗纳气单胞、4：粪肠球菌、5：鲍曼不动杆菌，“+”为EV菌DNA，“-”为加纯水无DNA）图100392为引物对鼠疫菌株DNAPCR扩增结果(Figure10PCRamplificationresultsof0392primersagainstplaguestrainDNA)（注：mark：100bp，1：鼠疫菌、丽江分离；2：鼠疫菌、剑川分离；3：鼠疫菌、临沧分离；4：鼠疫菌、文山分离，“+”为EV菌DNA，“-”为加纯水无DNA）51 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文4讨论4.1小肠结肠炎耶尔森菌地区分布情况本次研究采集野鼠疫源地和家鼠疫源地共11个地区，其中野鼠疫源地的小肠结肠炎耶尔森菌的阳性率要高于家鼠鼠疫疫源地，其原因可能是野鼠活动范围广泛，较易接触到被带菌鼠污染的食物，野鼠的土壤环境、水生环境都较家鼠环境复杂，为小肠结肠炎耶尔森菌的传播提供了有利的条件，使野鼠鼠疫疫源地的小肠结肠炎耶尔森菌检出率高于家鼠鼠疫疫源地。其中野鼠疫源地中以剑川县和玉龙县小肠结肠炎耶尔森菌阳性率较高，主要原因是剑川县和玉龙县位于云贵高原与青藏高原交界处，海拔差高，平均气温低，所处地理位置特殊，毗邻金沙江、怒江和澜沧江[40]，生物多样性复杂，鼠种分布广泛，鼠种迁移便捷，微生物也分布较多从而给小肠结肠炎耶尔森菌的繁殖和传播创造了良好的自然条件，导致小肠结肠炎耶尔森氏菌的携带率高于其他地区。剑川县小肠结肠炎耶尔森菌阳性率最高地区是石龙村，石龙村作为滇西纵谷自然疫源地鼠疫疫区，在1981-2002年共发生12次鼠疫流行，鼠疫流行间隔期为1-3年[24,41]，该地一直进行鼠疫监测，2017年又检出鼠疫耶尔森菌，而小肠结肠炎耶尔森菌检出率一直较高。玉龙县小肠结肠炎耶尔森菌阳性率最高地区是南溪村委会旦后村，玉龙县的黄山镇南溪村也是鼠疫监测的常规监测点属于老疫区[42]，检出率高。对于家鼠鼠疫疫源地以梁河县和弥勒县的foxA阳性菌株分离率在家最高，梁河县位于德宏州，德宏州是最为典型的家鼠疫源地之一，弥勒县灌木植被和水源丰富和梁河县有其优势鼠种有由家鼠逐渐向野鼠转变的趋势即自然属性增强可导致小肠结肠炎耶尔森菌阳性率增高。所以对于小肠结肠炎耶尔森菌监测中，野鼠鼠疫疫源地存在比较高的危险性特别是剑川县和玉龙县，应该加强监测力度，防治小肠结肠炎耶尔森菌病的流行。4.2小肠结肠炎耶尔森菌的宿主分布情况在云南鼠疫疫源地发现的主要啮齿动物共2科6属13种，主要是：大绒鼠、玉龙绒鼠、齐氏姬鼠、大耳姬鼠、中华姬鼠、黄胸鼠、大足鼠、长尾攀鼠等[40]。此次研究中以齐氏姬鼠、大绒鼠、褐家鼠，黄胸鼠、中华姬鼠的小肠结肠炎耶尔森菌阳性率较高，其中野鼠鼠疫疫源地的鼠种齐氏姬鼠、大绒鼠、中华姬鼠的分52 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文离率要高于家鼠鼠疫疫源地的鼠种褐家鼠和黄胸鼠，即野鼠鼠疫疫源地的鼠作为小肠结肠炎耶尔森菌的宿主主要分布在齐氏姬鼠、大绒鼠、中华姬鼠中。对于剑川县和玉龙县的鼠种检测小肠结肠炎耶尔森菌鼠中主要分布在齐氏姬鼠、大绒鼠、中华姬鼠、大耳姬鼠和玉龙绒鼠中，剑川县小肠结肠炎耶尔森菌在宿主的分布较均匀，可能是野鼠鼠疫疫源地的水生坏境、土壤环境、媒介和其他地理环境较为复杂和相似，导致各种野鼠携带小肠结肠炎耶尔森菌没有差异，分离率分布较均匀。玉龙县大绒鼠foxA阳性率要高于齐氏姬鼠、大耳姬鼠、玉龙绒鼠，因为玉龙县以大绒鼠和齐氏姬鼠为优势鼠种。其中玉龙绒鼠分布在3000m以上海拔梯度区域内，环境湿度较大，农作物、经济作物种类较多，食物来源丰富；地域相对空旷、平坦，植被以云南中山松、低矮灌丛为主，利于鼠类生存、繁殖活动，特殊的地理环境导致玉龙绒鼠成为玉龙县特殊鼠种，并与其他野鼠疫源地山区的监测点还是以齐氏姬鼠和大绒鼠为主有区别。可见玉龙县鼠类构成与周边其他区域不同,也与剑川疫源地不同，与相关研究结果一致[43]。猪、犬是小肠结肠炎耶尔森菌的主要储存宿主和传染源[44-49]，小肠结肠炎耶尔森菌有嗜淋巴组织的特性[50]，经粪-口途径传播，其中在舌咽部检出率较高，其次是肠内容物，肛门拭子相对其他部位较少有关[51-52]。本次调查中云南省家鼠鼠疫疫源地的犬类foxA分离率比国内其他地方低，其检测阳性率高于家鼠鼠疫疫源地鼠，原因可能是云南地处高原地区，平均海报高，不适合大批量的生猪养殖从而缺乏小肠结肠炎耶尔森菌的重要宿主和传染源，导致犬类和鼠类的标本分离率不高，老鼠获得范围较犬类广，感染小肠结肠炎耶尔森菌的机会较犬类大，导致阳性率较鼠类高，又因为犬类都是从家鼠鼠疫疫源地采集，犬类小肠结肠炎耶尔森菌感染率要低于野鼠鼠疫疫源地。本次实验结果可得到野鼠鼠疫疫源地的鼠类检出率相比家鼠鼠疫疫源地较高，以齐氏姬鼠、大绒鼠、中华姬鼠为主，其中玉龙县鼠类构成较为特殊为齐氏姬鼠、大绒鼠和玉龙绒鼠。因此我们应该加大对这几种鼠的监测力度，预防和控制小肠结肠炎耶尔森菌的感染。4.3三种致病耶尔森氏菌的检测基因选择目前用于检测耶尔森氏菌的方法包括血凝试验、胶体金试验、ELISA和PCR4种[53]。2008年修订的鼠疫诊断标准（WS279-2008）增加了鼠疫PCR诊断技术，53 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文鼠疫耶尔森氏菌PCR检测以荚膜蛋白F1和血浆酶原活化因子pla毒力基因为靶序列,以F1基因为靶标的PCR检测鼠疫菌方法已被广泛应用[54-56]，并被公认为最可靠、快速的方法。鼠疫菌株通常含有三种质粒，分别是9.5kb的pPCP1，110kb的pMT1，70kb的pCD1[57]，而F1荚膜抗原编码基因（caf1）位于鼠疫菌pMT1质粒上，是鼠疫菌抗吞噬的主要抗原[58-59]。且由于质粒是一种不稳定的遗传物质，在实验室传代中可能会丢失,导致漏诊和误诊的情况而出现假阴性结果[60]。同样，国内有同行在用PCR方法检测宿主动物体内鼠疫菌F1抗原基因时也发现存在有非特异性条带的结果，但其并未究明其成因[61]。本研究发现了类似非特异性条带的情况，并通过测序及基因比对的方法，发现其成因在于行标F1下游序列与一些非鼠疫菌的序列存在同源，这能解释为什么行标F1下游引物会扩增出分子量不同的非特异性条带。根据周冬生利用鼠疫菌全基因组DNA芯片，发现了28条鼠疫菌独有基因即是鼠疫菌的标识DNA序列，其中YPO0392就是相对所有鼠疫菌基因稳定且不易丢失的片段，他用YPO0392上的基因设计引物，证明该染色体上的基因具有特异性，可用于鼠疫耶尔森氏菌的检定[62-63]。董珊珊应用实时荧光定量PCR建立鼠疫特异基因诊断技术中也证明YPO0392检测鼠疫菌时其敏感性和特异性都较好[64]。美国Radnedge等[65]用比较基因组学的方法发现的一段鼠疫耶尔森氏菌特异的染色体序列3a（GenBank编号AF350075），该引物设计的PCR方法在美国现已推广到基层实验室。国内学者也以该染色体上的基因为靶序列设计引物，发现这段序列进行PCR检测鼠疫耶尔森氏菌时灵敏度较高，可作为鼠疫菌良好靶序列[66-67]。对于疫源地现场标本，若鼠疫菌培养结果为阴性而抗原检测阳性时，进行PCR检测尤为关键，能给鼠疫疫情判定提供依据[68]。疫源地现场标本所含生物体较为复杂，往往鼠疫耶尔森氏菌DNA可能被众多来自其它生物的核酸所污染，而F1引物能与其他DNA模板发生非特异扩增，为了提高检测的准确性，考虑使用稳定性更好的染色体上的特异基因（如YPO0392）进行PCR来早期诊断鼠疫菌，提高早期诊断的准确性。小肠结肠耶尔森氏菌PCR筛查的目的基因以foxA（铁草胺菌素受体蛋白基因），认为是小肠结肠炎耶尔森菌一个保守基因可用于小肠结肠炎耶尔森菌的种的鉴定[69]，但是在该基因同时存在于一些耶尔森菌以及其他含有该蛋白基因的细54 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文菌中，用该基因可筛选出所有小肠结肠炎耶尔森菌，经生化鉴定耶尔森菌属分离率大约在70%左右[70]。使用foxA基因进行小肠结肠炎耶尔森氏菌PCR的初步筛查不会产生非特异性条带，景怀奇[71]也证明foxA蛋白基因序列具有保守性，能特异性鉴定和诊断小肠结肠炎耶尔森菌，较小肠结肠炎耶尔森菌其他基因保守性较高。因此可用foxA基因对小肠结肠炎耶尔森菌的种的鉴定。Inv（侵袭素基因）是假结核耶尔森氏菌PCR筛查基因，是位于假结核耶尔森菌染色体上的基因，主要介导细菌进入细胞，是经结核耶尔森苗重要的毒力标志之一[72-73]。inv与小肠结肠炎耶尔森菌的ail基因的作用近似，所有的从人或感染动物分离的假结核耶尔森菌均携带inv基因。在使用inv基因对假结核耶尔森菌PCR早期检测无非特异性条带出现，可用inv毒力基因作为假结核耶尔森菌早期筛查的目的基因。4.4鼠疫耶尔森菌的保存机制探讨对于鼠疫菌如何在自然界延续存在，以及以何种机制引起动物间的间歇性流行，一直是业界研究的重要问题。鼠疫菌的保存机制的学说主要概括起来有：宿主动物、蚤（蜱等）保存学说；鼠疫菌自身突变保存学说；蚤-宿主-蚤保存学说；土壤保存学说；鸟类及非生物因素保存学说；其他耶尔森氏菌突变保存学说[74-83]。此研究在对鹤庆县和洱源县PCR初筛时，出现F1和0392阳性条带，但是最后未分离到菌株。出现鼠肠道初筛阳性但未分离出鼠疫耶尔森菌的结果可做三方面考虑：一是鼠疫耶尔森菌在野鼠疫源地鹤庆县进行PCR筛查有阳性，而检测出阳性样本正是在鼠脏器中分离出鼠疫耶尔森菌的样本，所以考虑是不是老鼠已经全身性感染或者在采集样本时发生交叉污染。导致老鼠肠道也存在鼠疫菌，所以提取肠道及其内容物的DNA会夹杂着鼠疫菌的DNA，导致PCR出现假阳性结果。二是肠道菌群较为复杂，且其他耶尔森菌对鼠疫耶尔森菌营养竞争，而未分离到鼠疫菌。三是洱源县出现初筛阳性样本考虑是因为实验室的DNA交叉污染而导致出现假阳性结果。但是我们实验室在对云南野鼠疫源地宿主动物致病耶尔森氏菌监测时，于2014年从正常鼠肠道样本中检出一株鼠疫菌，而从鼠的脾脏、肝脏中没有分离到鼠疫菌，PCR结果也是阴性。也不排除检出鼠疫菌保存在肠道的偶然性，但是这两次结果的发现足以让我们考虑鼠疫菌在流行静息期内和微弱间断流行期55 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文间是否也能保存在宿主动物肠道中，只有后续大量样本和实验数据才能证明。4.5三种致病耶尔森氏菌分布关系耶尔森氏菌属包含18个菌种，对人致病的菌种有鼠疫耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌3种，目前关于这3种菌在鼠间是否存在拮抗或替代关系，是研究鼠疫耶尔森菌较为突出的问题。在2016-2017年期间我们此研究中小肠结肠炎耶尔森菌在野鼠疫源地和家鼠疫源地均有检出，且野鼠疫源地的小肠结肠炎耶尔森菌是剑川县和玉龙县检出率比其他地区高，但是对比2014年4月至2015年4月玉龙县foxA阳性菌株分离率为19.56%，而本次研究玉龙县foxA阳性菌株分离率为17.12%，比之前分离率下降。对于野鼠疫源地剑川县在2013年5月至2014年10月分离率为7.16%，而本次实验的分离率为5.92%，相比之前也有所下降，此次研究的家鼠鼠疫疫源地梁河县小肠结肠炎的分离率较2013至2014年也有所下降。在2016-2017年期间，云南省在西双版纳景洪市、丽江玉龙县和古城区、鹤庆县、剑川县四个地区均有检测到鼠疫菌，检测出鼠疫耶尔森菌的样本均没有检测出假结核耶尔森菌和小肠结肠炎耶尔森菌，且小肠结肠炎耶尔森菌在野鼠鼠疫疫源地和家鼠鼠疫疫源地的检出率下降，因此考虑是不是小肠结肠炎耶尔森菌对鼠疫耶尔森菌存在拮抗作用，导致小肠结肠炎的阳性率下降，而鼠疫耶尔森菌的阳性率上升。也有研究报道鼠疫耶尔森菌、假结核耶尔森菌和小肠结肠炎耶尔森菌都具有共同抗原，分布于致病性质粒上,被致病性耶尔森菌感染的动物就会获得免疫,当再次暴露在其他种类致病性耶尔森菌污染的环境中都不会发生感染[84-86]，这就说明小肠结肠炎耶尔森菌的携带率下降而鼠疫耶尔森菌携带率上升的原因。如果3种菌之间拮抗或替代现象确实存在，则有利于我们根据小肠结肠炎耶尔森菌携带率的情况而对鼠疫耶尔森菌爆发的潜在危险性进行评估，但是由于相互关系的机制复杂性和质粒上共同抗原的拮抗学不一定准确，所以其具体关系仍需进一步研究。56 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文5结论1.云南省野鼠鼠疫疫源地小肠结肠炎耶尔森菌鼠类标本总体分离率高于家鼠鼠疫疫源地。2.在初筛疫源地现场标本或者处理鼠疫疫情时，使用鼠疫菌染色体上的特异基因如YPO0392上基因比在质粒上的F1基因进行PCR中更具说服力。3.在对疫源地的三种致病耶尔森菌监测中，可采用0392、foxA、inv三种目标基因进行组合筛查三种致病耶尔森菌。57 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文参考文献[1]黄英,景怀琦.耶尔森菌侵袭性研究进展.中国人兽共患病学报,2010,25(7)669-672.[2]PerryRD,FetherstonJD.Yersiniapestis-EtiologicAgentofPlague[J].ClinMicrobiolRev,1997,10(1):35-66.[3]ZietzBP,DunkelbergH.ThehistoryoftheplagueandtheresearchonthecausativeagentYersiniapestis[J].IntJHygEnvironHealth,2004,207(2):165-178.[4]孟庆云.“人见死鼠如见虎”-鼠疫的三次世界性大流行[J].中国中医基础医学志,2003,9(8):42-44.[5]周东生,杨瑞馥.鼠疫研究进展与展望[J].解放军医学杂志,2010,35(10):1176-1182.[6]WHO.Humanplaguein2000and2001[R].WklyEpidemiolRec,2003,78(16):129-136.[7]WHO.Plague,Algeria[R].WldyEpidemiolRee,2003,78(29):253-260.[8]李书宝,戴绘.世界鼠疫疫情态势及研究进展[J].中国地方病志,2000.15(1):21-26.[9]WorldHealthOrganization:Weeklyepidemiologicalrecord.2016(91):89-105.[10]丛显斌,张春华.世界鼠疫自然疫源地分布及人间鼠疫流行概况[J].中国地方病学杂志,2009,28(4):357-360.[11]耿贯一.流行病学[M].北京:人民卫生出版社,1998:936.[12]ZhouD,HanY,YangR.MolecuLarandphysiologicalinsightsintoplaguetransmission.viruLenceandetiology[J].MicrobesInfect,2006,8(1):273-284.[13]张志凯,俞东征.我国鼠疫的现状与预防控制[J].传染病信息,2005,18(1):9-10.[14]董兴齐,宋志忠.中国南方家鼠鼠疫形势与防治对策建议[J].中国媒介生物学及控制杂志2004,15(4).[15]方喜业.中国鼠疫自然疫源地[M].北京:人民卫生出版社,1990:25-28.[16]邵奎东,丛显斌,吕景生,等.中国鼠疫防治概述.[J].中国地方病防治杂志.2013,28(6):416-419.[17]张贵军,邵奎东,段天一,等.全国2014年鼠疫监测结果[J].中国地方病防治杂志,2015,30增刊:7-8.58 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云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文[71]景怀琦,李继耀,肖玉春,等.O:3和O:9小肠结肠炎耶尔森菌主要毒力基因分布调查[J].中国媒介生物学及控制杂志,2004,15(04):317-319.[72]MartinsCH,FalcaoDP.ExperimentalkineticsofinfectioninducedbyYersiniapseudotubercμLosisisolatedfromstockanimals[J].MemInstOswaldoCruz.2004,99(6):621-626.[73]NaganoT,KiyoharaT,SuzukiK,etal.IdentificationofpathogenicstrainswithinserogroupsofYersiniapseudotuberculosisandthepresenceofnon-pathogenicstrainsisolatedfromanimalsandtheenvironment[J].JVetMedSci.1997,59(3):153-158.[74]李继连,杜国义,史献明,等.鼠疫耶尔森菌在自然疫源地保存机制的研究进展[J].中国媒介生物学及控制杂志,2010,21(4):399-401.[75]杨华源,梁秋光,曾敏,等.广东省鼠疫静息期鼠形动物耶尔森氏菌调查[J].中国地方病防治杂志,2005,20(3):159-160.[76]徐成,房静,孙启庭,等.蚤与鼠疫菌之间的生物学关系[J].中国地方病防治杂志,2002,17(6):347-348.[77]祁腾,杨孔,杨艾琳.鼠疫在自然界延续生存的生态学机制[J].现代预防医学,2014,41(17):3227-3229.[78]WilliamsSK,SchotthoeferAM,MontenieriJA,etal.Effectsoflow-temperaturefleamaintenanceonthetransmissionofYersiniapestisbyOropsyllamontana[J].VectorBorneZoonoticDis,2013,13(7):468-478.[79]宋志忠.鼠疫杆菌在自然界保存机制的研究动态[J].中华传染病杂志,2004,22(2):139-141.[80]宋志忠,顾峰,杨桂荣,等.植物在鼠疫菌保存和传播中的某些作用[J].地方病通报,2001,16(4):1-4.[81]张涛,冯志勇,姚丹丹.鼠疫杆菌进化与分型[J].中国人兽共患病学报,2010,26(12):1167-1169.[82]杜国义,史献明,刘合智,等.河北省鄂尔多斯高原型鼠疫菌毒力试验[J].地方病通报,2007,22(2):14-15.[83]李伟,海荣,俞东征,张志凯,蔡虹,张建华.应用荧光定量PCR检测环境样品中鼠疫耶尔森菌[J].中国媒介生物学及控制杂志,2005,16(4):301-304.63 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文[84]谷爱娣,樊振亚.3种对人致病性耶尔森氏菌生物学特性及流行病学意义[J].中国地方病防治杂志,2001,16(4):218-222.[85]YangHY,LiangQG,ZengM,etal.EpidamiologialsurveyonY.enterocoliticaandY.pseudotubercoulosisofplaguestaticphaseinGuangdong[J].ChinJCtrlEndemDis,2009,24(5):341-342.[86]FuKushimaH,HaoQ,WuK,etal.Yersiniaenterocolitica09aspossiblebarrieragainstYersiniapestisinnaturalplaguefociinNingxia,china.CurrMicrobiol2001,42:1-7.64 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文附录附录1：测序结果测序的7株菌分别是鲍曼不动杆菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯、气单胞球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、乡间布丘菌、布氏柠檬酸杆菌，分别在NCBI进行BASLT比对，其覆盖率分别为98%、98%、76%、93%、90%、95%、98%，相似率分别为99%、98%、96%、92%、91%、80%、99%。7株菌测序结果如下：1.鲍曼不动杆菌（约900bp）TACCTGCTGCAAGTTTACCGCCTAAGCACACACCACCGTCTTTTTTGTTTGGAATGTGAGCGATTTCATCACCAAAGAACCAAAGAACAGAGTTTGTTGCAGATTTACGAGATGAACCTGTACCAACAACGTCACCAACATAAGCAACTTGGTTGCCTTTAGCAATGAGTTCTTTAATTTGGCTTAATGGACCAACTTCACCTGGTTTTTCAGGGTTGGTACCATCACGCTCATTTTTCAACATTGCATTTGCATGCAATGGGATGTCTGGACGGCTCCATGCGTCTTGAGCTGGAGACAAGTCATCAGTGTTTGTTTCACCTGTTACTTTGAACACAGTGATTTTGATTTCTTCTGGTACATCTTTACGACTAGTGAACCATTCAGCATCAGCCCAAGATTGTAAAACAGCTTTTGCATTTGCATTGCCAGCTTTAGCTTTATCAGCTACGTCATGGAACGCATCAAATACAAGTAATGTTTTTTTCGAAGCTTCAGCAGCTAAGCTACCTAATTCAGCATCATCCAGAAGCTCAACTAAAGGCGCTACGTTATAGCCACCAAGCATCGTACCTAGTAAATAAACTGCACGTTCTTTAGAAACTAGCGGAGATGTCGCTTCGCCTTTTGCAATCGCTGCCAAGAAAGCTGCTTTTACGTAAGCTGCTTGGTCAACACCTGCAGGAACACGGTTTTCAAGCAAATCAACCAAGAATGCTTCTTCACCTGCCGGTGGGTTTTTTAATAACTCAACAAGTTGAGCAGTTTGAGCATCATCAAGTGGCTTCGGTGGGACTCCGAGTGCGGCACGTTCAGCAACGTGTTGGCGGTAAACTTGCAGCAGGTA2.产气肠杆菌（约500bp）TACCTGCTGCAAGTTTACCGCCTCCAGCATCATTTCGCTTTGGCGAACCGGCTTTTTCAGGTTGTAGCCGAGGATCACCTGTTCGAGGGTCAACGGTAATTTATTAAACCGCGTCTCGAGGGCAAAACTCACCGCGTTATTGATGGCCGCCGCCGCGAGTTCAGTAGCTGGCTCGCCGATCCCCTTCGCCCCCAGAGGCCCGGCGATATCCGGGTTTTCTACGCCGATAATCGTCATCGGCGGAACATCTTTCATCGTCGGCAGCAGGTAGCTGTCGAAGTTTTCCGATTTGACCTGGCCATTTTCAATGTTGAAGTCTTCCAGCAGCGCGTAGCCAAAACCCTGCGCCACCCCACCATAAACCTGGCCTTCAAAACCCACCGGGTTGAGTACCCGGCCCACGTCATGGGCGGCGGTAAACTTGCAGCAGGTA3.气单胞球菌（约1000bp）TACCTGCTGCAAGTTTACCGCCGCGTCAAATTGCGCCCCGATTGCCGCAGGTTCACCACCTCCCGCCTCAAGAGCCGCACAGTGGTTGGCAAATTCGGTCAACCCAAGCGCCAGCGCACTCCCCTTGAACTTGTGCGCCAGCTGACGTTGCTCACTTCCCTCCCCCTGAGCCAACTTATCCACCAACACCCGCCCTTGCGAC65 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文TCAAACAGCGCGACCAGCTGGCGGATCCGCGCCATGCCGAGCAGGGGCAGATCGGCATCCAGCACCGGATTGGCCCACTCGGGCTGGTTAGTCGAGGACGCGGCTGCAGATAATTGCACCTGTGGCTCGATAGAGGCCCCTTCTTGCCGAAACAGCTGATCGATGGAATTCGCCAGCACCGCCAGCCGCACCGGCTTGCCGACAAAATCGACAAACCCGGCGGCAAGGCAGTGGCGGATATCCTCCGGATACATCTGGGCCGAGATGGCGATGGCGGGCAGCGGCCGTTCATGCATCTCCTCACTGATGGCGGCCAGATCCTCGCGCAGAGTCATGCCGTCCATATCGGGCAGATTGATATCGAGCAGCGCCAGCTCGAAGGGGCGCTCGGTCACCAGCGCCAGTGCACTGCGACCGTCCTCCGCCAGGGTGACGCGATGGCCGAGGCGGGTCAGCATGCCGTGCGCCACCAGCCGATTGATCTCGTTATCCTCCACCAGCAGGATGTCGCGGGATTGGCCAAAGGTGCAGCGGTTGCGCCTCGGCAGGCAGCTGGGCACTCGAACGCTGCAACGGCAAACTGAAGTTGAATTCACACCCCTTGTCCGGCTCGCTGGCAAGGATCAGCTCGCCCCCCATGGCGGCCACCAGCTTGCGGCTGATCGCCAGCCCCAGCCCGGGTGCCGCCCTGATGGGCCTATATCACGCTTGCCGCTGGCGAACGCCTCAAACACGTCTCTTGCTCATCGGCCGGGAATGCCGGGACCGGTATCGCGCACCACGAGCGATGCAGGCTCGACGCAAGTCCTGACGAACAAGGGGCGCCACGTTCAAGCTATCTGCTACGGGCGGTACTGCAGCAGTAAGGTCAGTCCTGCAGAATCTCCAATTCACCACTTGCGGGC4.肺炎克雷伯菌（约500bp和900bp）TACCTGCTGCAAGTTTACCGCCAGTGGCGTGGACACGATCCGCAGATTGAACCGATGCTGGAAAACCGCGGGCTGAGCTAGCCGAGCGTTTTGACGAGTAGAAGAAGACCGGGCGCAGCGCCCGGTTTTTTATCCAATTTTTTCTTCTCCAAAATCTCTCCAAAACTTTTCCCCAAAATAAATCTTTAAATTTTGTTAAATTTCCATGAGGGTACGGCCCAATTTTTCACGTAGCTACCGACAGTGACCGCCGGCACGTCCAGGCGCCCGGGCGGGAATGGTCACGCTCTGGGTATTGTCGAGGCAGAGCTGGCGCCGTTCCTGGCTGGCAATGGCGGCAGCGAGTACCAGGCTAAACCGCGCCCGATCGATAAGCCCGCCCACACAATCCTGAAAGAGTCGCGCGCCTGTGTCGTCGCTCCGGTTATCGCCAGGCAGTTCGGCGCCAGCATCGGACACCGTGCCGACGAACCAAGCGCAACAATCACCGCGGGCGGTGGCGGTAAACTTGCAGCAGGTATACCTGCTGCAAGTTTACCGCCCGTGAGGCGCTGGCGCGCGGCGAGATTGTGCAGGTTTTACCGGAGTGGGAGTTTATCAGCAGCTATTCCGGCCAGCTGTGGCTACTGTGGTCGGGCAATAAGCATATGCCCGCCAGAATGCGGGCGATGATTGATTATCTTAGCGAGAAGATGCAGCCGGCTTCAGGCAGCACAGCCATAGTGCGACGATCAAAAACCATGGAATAATAAGGCACAGGGCGAACCACCATCCTGAACGACCGATATCGTGCATCCTGCGGCAGCCAACGGCCAGCAGCGGGACAATCATCAGCAGTAACAGAATACCGCTGAGCGGCACAGCGAAAAAAATGAACATGCCGTACTCAGAGTTATGCTGCACCGCCAAAAACCAGGTCGCCAGCGGCAAGGCAAGAATCAACAGGTTGATGAGCAAAAAAGACCAAAACTCCTGCCTGCTGGCCACTCCGCTAAAATCGAGGCCCTTTTTCCATCCGTTAAAATACGCTTGTCCATTCGTCATTTTTCTCTCCCTGTTCATAGCCCAATCCAGTATTGGCTGCGTACCGGAGAGATTACGCCAGAATAACCCATCGTGCGATAGCGTAAAGCAGCAAGAATTTTGAACGTGAGTTATTTTATCTCGACTATAAATAAAAC66 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文GGGGATGATATATCATCCCCGCTTATTCATCTTGACGATGAATATCATTTAATGTTGGTGGGTTGTTAAGTGTAATTTATTATAATTAATTAAGCTCCCCGCTTTAATAATCTCCCGCTCTGATGCGGTTAATCCCTCCATATAAAGCGAGATCTCTTTGACGGGATGCTGAGGGCTAATCACGAAAGGCGGTAAACTTGCAGCAGGTA5.小肠结肠炎耶尔森菌（约1000bp）TACCTGCTGCAAGTTTACCGCCGCTCAATTGGGCGGCCTCTGTTGCACGGGTCTGGCCGGTGCCGTTCTCGTCATTATCAGCGGCCAGCAATAGCAGTGCATCCGGGTAGTGGGTACGCAACTGTTGCGCCAGCGCAGACAGATTGTTAGCACTGAGCGCAACACAAACACTTTCCCCGGTCAGGTGATGCACCGTTAGGCCAGTAGCATAGCCCTCGGTCAGCCAGATAACGGTATTATCCTGTCCGGCTAAGAAATGACAGGCCGCTTTCACCTGCCCCCCGGCCAGTGTGCGCTTGTCACCGTTGGCGTTAATCAACTGGATGTTGACTACCTCACCGGTGTTGTCGGTCAGGGGAAATAACAGGTCGCCGGGTTGATAGGTAATACCGCCCACATGCAACGATTGACCGTGTAATGTCAGCGTCTCCAGTTCTGGCCAGCCTTTGGCGGTCAGATAGGCATTCTCGGTCTGTAGTCTTGCTGCTGTCAGCAGTTGTTAGCCTGTTCTGCGGCCCGCTGCCGTGCTTGCGCTTTCTCCTGCACTTCCTGTCCGGCATTGTGTGCCGGTAATGGCGGGTTCGATGGTTCGCCTAACACCTCGGCCACTTTGCAGGCGGCTTCCTTGGTCGTGACCGCCAGCGCCTTTTCAACTAGATTCAGGCCATCGCCGCTGCCGCACTGGTTACAAAACCATGTGCCACGCCCTTGCAGGTTATCAAAGCGGAAACGGTCTTTACCGCCACACATCGGGCAGGGCTGCGCCCGGGCCGCCAGCAGTGATATGAATACCAAGAACGGGGAGCAATACCGGGCCACTGGCCGGTGGCTGCCACGTGAGGTTTTGAAACGCTTATAGTGTCATTCTTGTCTTCTCCTCAGTGCAGGGTGGTTTGACTGGTGGTGGTTATTCTGCGCTTGCACAAGCTCATCATCATTTTTGCCCTAATACTGTCAGGCCGCGGCGGAGCCAGCAAATATCGCTGTTACATGTCACTGAACATGGTAACAGGCATATCATACGATTCTGCTGTGCTGGCCAAAGTAGCTCATATCATCGCATCGCATGATCATCACGAGTACAGTCACGTGAACGCAGATCAGTAGCATGTCTACCACGG6.乡间布丘菌（约700bp）TACCTGCTGCAAGTTTACCGCCGACTTCGTCTTTATTCATCATCAAGTCCTCATCGTTAGGTTGTGAATAGCGAGAGTGCCATGTCCAGACACATGCTGTTTTTGCTGGACGTGAGAATAAGTGTAGTCAGGGATTCTGGGTTTTATTTACTATTCGGAATTTTTAACCATCCGCTCAGGCAAACCAGGTTCCATTACGCCAGTGACGCCGCCAGATAAAGGCCAGGGAAAGCCCACGCAACGCGAGAAAAACGGTTAACGCCAGCCACAAACCATGATTTCCCAGCAACGGTAAAGCCAGTAGCGTTAATGCGAACCCTGCTGCGGCAACGGCCATACTGTTGCGCATTTCTGCAGCTCGTGTCGCTCCAATAAACATACCGTCGAGCAGATAACACCACACCCCCACCAGCGGCAAAACCACCTGCCAGAAAAGATAGCGATCGGTCAACTGTTGGATTTGCGGCAGCGAGGTCAGCAGCGCAACAATCTGCTCGCCAAACAGGGCATAAACCAGCGAAAACAGAATAGCCACAATACCGGACTGTCGACAGGCCGCCCGCCAGACATCAAGCAACTGGCTGCCATCCCTTGCCCCATAGGCCTGACCCGAATGCGCTTCCACGGCATAGGCAAATCCATCCAGCGCGTAGGCGGTAAACTTGCAGCAGGTA7.布氏柠檬酸杆菌（约700bp）67 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文TACCTGCTGCAAGTTTACCGCCGACTTCGTCTTTATTCATCATCAAGTCCTCATCGTTAGGTTGTGAATAGCGAGAGTGCCATGTCCAGACACATGCTGTTTTTGCTGGACGTGAGAATAAGTGTAGTCAGGGATTCTGGGTTTTATTTACTATTCGGAATTTTTAACCATCCGCTCAGGCAAACCAGGTTCCATTACGCCAGTGACGCCGCCAGATAAAGGCCAGGGAAAGCCCACGCAACGCGAGGAAAACGGTTAACGCCAGCCACAAACCATGATTTCCCAGCAACGGTAAAGCCAGTAGCGTTAATGCGAACCCTGCTGCGGCAACGGCCATACTGTTGCGCATTTCTGCAGCTCGTGTCGCTCCAATAAACATACCGTCGAGCAGATAACACCACACCCCCACCAGCGGCAAAACCACCTGCCAGAGAAGATAGCGATCGGCCAACTGTTGGATTTGCGGCAGCGAGGTCAGCAGCGCAACAATCTGCTCGCCAAACAGGGCATAAACCAGCGAAAACAGAATAGCCACAATACCGGACTGTCGACAGGCCGCCCGCCAGACATCAAGCAACTGGCTGCCATCCCTTGCCCCATAGGCCTGACCCGAATGCGCTTCCACGGCATAGGCAAATCCATCCAGCGCGTAGGCGGTAAACTTGCAGCAGGTA附录2：研究生期间发表论文1.张艳,王鹏,宋志忠.鼠疫菌在其疫源地保存机制的几种学说[J].中华地方病学杂志,2017,26(6):456-459.2.张艳,郭英,董珊珊,等.caf1基因为靶标的鼠疫检测PCR法的改进[J].中华地方病学杂志,2018,37(3):203-206.68 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文综述鼠疫菌在其疫源地中保存机制的几种学说张艳王鹏宋志忠671000大理，大理大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室（张艳）；671000大理，云南省地方病防治所云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室（王鹏）；650000昆明，云南省疾病预防控制中心（宋志忠）通信作者：宋志忠[摘要]在鼠疫自然疫源地中，鼠疫菌与其宿主动物和媒介生物在一定地理景观内以及特定区域的生物群落中构成了相互依赖又相互制约的生态系统。根据相关学者的研究，鼠疫菌的保存机制主要概括起来有：宿主、蚤（蜱等）保存学说；鼠疫菌自身突变保存学说；蚤—宿主—蚤保存学说；土壤保存学说；鸟类及非生物因素保存学说；其他耶尔森氏菌突变保存学说。[关键词]保存机制；鼠疫耶尔森氏菌；研究进展基金项目：省重点实验室建设和认定（2015DG026），云南省中青年学术和技术带头人后备人才培养项目(2014HB037)MechanismsofpersistenceofYersiniapestisinthefociZhangYan,WangPeng,SongZhizhong.DepartmentofEpidemiologyandHealthStatistics,SchoolofPublicHealthDaliUniversity,Dali671000,China(ZhangY);YunnanProvinicalKeyLaboratoryforZoonosisControlandPrevention,YunnanInstituteforEendmicforDiseasesControlandPrevention,Dali671000,China(WangP);YunnanProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention,Kunming650000(SongZZ).Correspondingauther:SongZhizhong,Email：song1208@126.com[Abstract]YersiniapestisandhostanimalsandvectororganismsinaparticμLarareawithinacertaingeographicallandscape,andbiologicalcommunitiesintheformofinterdependenceandmutualrestrictionofecologicalsystemintheplaguenaturalfociofplague.Withtherelevantresearch,thepreservationofyersiniapestismechanismmainlyincluding:Animalandfleas(tick)preservationtheory,Yersiniapestisownmutationpreservationtheory,Fleas-host-fleaspreservationtheory,theoryofsoilpreservation,thebirdsandabioticfactorsofpreservationtheory,theoryofothertheyersiniapreservationtheoryandsoon.[Keywords]Mechanismofpersistence;Yersiniapestis;ResearchproceedingsFoudprograms:PlatformContructionandidentifiedProjectofYunnanKeyLaboratory(2015DG026);YunnanProvinicalTrainingProgramofYoungAcademicandTechnicalLeader(2014HB037)鼠疫在自然生态系统中长期存在，属于甲类传染病，具有病死率高、传染性强的特点，是人畜共患的自然疫源性疾病。世界范围内，曾发生过3次鼠疫大流行，导致至少一亿六千万人死亡[1]，近20多年鼠疫在动物与人间的疫情持续活跃，69 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文世界卫生组织（WHO）已将其列为重新抬头的传染病[2]。1981～2012年，中国9个省(自治区)159个县(市、旗)发生人间鼠疫病例937人，死亡124人[3]，2013年至今，甘肃、云南等地相继发生人间鼠疫，因此疫情形势在中国也依然严重，鼠疫仍是中国值得关注的公共卫生问题。鼠疫的病原菌为鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌），在鼠疫自然疫源地中，鼠疫菌与其宿主动物和媒介生物在一定地理景观内以及特定区域的生物群落中构成了相互依赖又相互制约的生态系统[4]，在其生态系统中，不同年份、不同季节会出现动物鼠疫的发生、流行与静息，甚至有的鼠疫自然疫源地在静息多年后暴发动物鼠疫流行。对于鼠疫菌如何在自然界延续存在，以及以何种机制引起动物间的间歇性流行，目前已经成为鼠疫研究的重要方向。1.鼠疫的自然疫源性巴甫洛夫斯基[5]在自然疫源性学说中指出鼠疫作为自然疫源性疾病，不仅在地球上早已形成而且分布广。伍连德[6]认为鼠疫在中亚、西亚出现的时间要追溯到太古时代，并认为这些地方是鼠疫起源地。纪树立推测鼠疫已达到5000万年[7]。俞东征[8]等指出中国鼠疫菌的起源和进化经历了十分长远的年代。全球范围内鼠疫自然疫源地主要分布于北纬60°至南纬35°之间的广阔地域，遍布欧洲、亚洲、非洲和美洲。鼠疫疫源地分布有明显的地域性，呈岛状，分布在草原、荒漠、森林、湿地等各种地貌景观中，且“经久不衰”[9]。在中国，鼠疫的自然疫源地分布广、范围大。中国鼠疫自然疫源地位于北纬21°～47°、东经73°～126°之间的广袤领域之内，占总国土面积约15%[10]，且自然疫源面积达99.3万平方公里、分布遍及于19个省区[11]，目前新的鼠疫自然疫源地和染疫动物不断被发现，部分省（区）鼠疫疫源地疫情回升[12]。依据自然疫源地的宿主、媒介以及相关病原体的性状、地理位置、景观特征等，纪树立等把中国的鼠疫疫源地划分为天山森林草原灰旱獭长尾黄鼠自然疫源地型、帕米尔高原南天山高寒草原长尾旱獭灰旱獭自然疫源地型、青藏高原高寒草甸草原高寒草原喜马拉雅旱獭自然疫源地型、蒙古高原典型草原西伯利亚旱獭达乌尔黄鼠自然疫源地型、察哈尔丘陵松辽平原典型草原达乌尔黄鼠自然疫源地型、甘宁黄土高原荒漠草原阿拉善黄鼠自然疫源地型、蒙古高原荒漠草原长爪沙鼠自然疫源地型、蒙古高原荒漠草原布氏田鼠自然疫源地型、滇西南横断山三江并流纵谷玉龙绒鼠高山姬鼠自然疫源地型、滇闽粤川平原居民区农田黄胸鼠自然70 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文疫源地型共10个[7]。其后，刘振才等又确立了青藏高原高寒草甸草原青海田鼠自然疫源地型第11个鼠疫疫源地的类型[13]，2005年由新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心首次证实的准噶尔盆地荒漠大沙鼠自然疫源地型是中国第12个鼠疫疫源地类型。2006年又发现和证实了云南丽江存在鼠疫疫源地，疑是中国第13个新的鼠疫疫源地[14]。2.鼠疫菌在疫源地中的保存机制鼠疫菌为什么在自然界传播并长期循环？其在自然界的保存机制众说纷纭，根据相关学者的研究，鼠疫菌的保存机制主要概括起来有：宿主动物、蚤（蜱等）保存学说；鼠疫菌自身突变保存学说；蚤—宿主—蚤保存学说；土壤保存学说；鸟类及非生物因素保存学说；其他耶尔森氏菌突变保存学说。2.1宿主动物、蚤（蜱等）保存学说自20世纪60年代以来，学者普遍认为自然疫源地的宿主在保菌中起着决定性作用，形成了以动物保菌学说[15]。各国学者也都提出来相似的微弱流行理论[18]，认为鼠疫菌在流行或微弱流行期间保存于贮存宿主、流行宿主和后补宿主中。即在流行静息期或者间断流行期间不容易被检测出来的且容易被人忽视的鼠疫菌常常保存在鼠疫自然疫区内的好发地段中的宿主动物体内，特别保存在具有一定抗性和免疫体的宿主动物及其媒介（蚤、蜱）等宿主体内。因此，检测手段的改进，在鼠疫流行静息期内和微弱间断流行期间控制鼠疫的流行和根除鼠疫具有重要的现实意义。传统认为在感染鼠疫的宿主中，鼠疫菌会保存在其脾脏、肝脏、骨骼。中国学者李伟等[16]从感染鼠疫的动物脾、肝脏、能检出鼠疫菌也证明此观点。但是我们实验室在对云南野鼠疫源地宿主动物致病耶尔森氏菌监测时，于2014年10月从正常鼠肠道样本中检出一株鼠疫菌，而从鼠的脾脏、肝脏中没有分离到鼠疫菌，PCR结果也是阴性。并不排除检出鼠疫菌保存在肠道的偶然性，但是这一发现足以让我们考虑鼠疫菌在流行静息期内和微弱间断流行期间是否也能保存在宿主动物肠道中，只有后续大量样本和实验数据才能证明。2.2鼠疫菌自身突变保存学说鼠疫菌在自然界中都会发生不同程度的变异这是毋庸置疑的，且也能够根据鼠疫菌在各个鼠疫疫源地中的变异类型进行鼠疫菌的分型[2]。有学者认为鼠疫菌在流行静息期是以两种形式保存，分别为典型和非典型变异形式[17]。典型变异是指鼠疫菌对不良生存条件以某种所谓“休眠”状态状态存在，是鼠疫菌对不适环境71 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文如气候、植被、人口数量、地理环境变化时的一种适应，处于这种状态的鼠疫菌不产生芽孢、缺失了繁殖能力，在营养培养基上也不能生长，其功能与杆菌或梭菌芽孢相似，以很低的代谢功能在不利生态条件下生存，保存其毒力，当适宜条件时返祖为生长型鼠疫菌，并释放毒力。显然，这种“休眠”状态验证鼠疫菌的突变保存机制。并有研究显示在动物鼠疫流行期间，流行末期的鼠疫菌毒力明显弱于初期分离的鼠疫菌毒力[18]，其毒力的变化从“活跃”到“静息”状态的转变，都是鼠疫菌适应不良环境的突变。非典型变异是指在流行静息期或者间断流行期间不容易被检测出来的且容易被人忽视的鼠疫菌。总而言之无论鼠疫菌在自然界以何种形式存在，一旦有适宜的条件，鼠疫菌就会产生突变并重新恢复其毒力而引起鼠疫在宿主之间传播而引起流行。2.3蚤—宿主—蚤保存学说在鼠疫的研究上人们往往侧重于研究鼠疫的发生和宿主的关系，而忽视了传播媒介在鼠疫传播过程中的重要作用。有学者[19]认为鼠疫作为一种自然疫源性疾病，其传播媒介（如蚤类、蜱类）在动物鼠疫的流行和在自然界保存过程中能维持鼠疫自然疫源地生态系统中各生物间的动态平衡至关重要的作用。有相关实验证明啮齿动物如达乌尔黄鼠、旱獭等体外寄生蚤可以带菌1年以上[2]。高密度的传播媒介（蚤类、蜱类）不仅能保证鼠疫菌在宿主之间广泛的传播，而且由于其传播媒介的高丰富度，对宿主能有效的抑制其体内免疫反应，增加了其易感性，且宿主的免疫力降低有利于鼠疫菌在宿主体内高密度繁殖，进而增加了传播媒介（蚤、蜱等）感染其他宿主的概率。有研究证明在低温环境下鼠疫菌可以在蚤、蜱或者宿主（鼠）的胃肠道保存来适应不良的外界环境，并保持到环境适应进入活跃状态进行传播[20]。当感染鼠疫菌的蚤类再去叮咬其他宿主形成“蚤—宿主—蚤”的恶性循环传播方式，形成动物间鼠疫流行[21]。2.4土壤保存学说在自然界中小肠结肠炎耶尔森菌、假单胞菌、李斯特菌、类丹毒、霍乱弧菌等都发现存在这种土壤保存现象，认为它们可从土壤原生物体内分离到能保持繁殖能力及毒力的抗性菌。我国著名学者刘云鹏曾多次指出鼠疫菌保存在红土地中，可能是因为红土地含铁元素的原因适合鼠疫菌生长。根据纪树立[4]相关记载，1964年在伊朗鼠疫疫源地现场发现，感染鼠疫的自毙沙鼠的鼠尸能污染其洞内土壤，并证明鼠疫菌可在洞内土壤中存活11个月。李伟等[16]对土壤保存鼠疫菌72 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文也进行了相关的研究，通过纯化和比较不同种从土壤和脏器中鼠疫菌，结果显示能从土壤中检测到底限为每克土壤中104拷贝的鼠疫菌存在，此些研究都为土壤保存学说提供了重要依据。2.5鸟类及非生物因素保存学说有学者认为鸟类的迁徙可以把鼠疫菌从一块疫源地带到另外疫源地，受感染的鸟类的粪便或者蚤类的叮咬感染其他宿主动物而造成动物间鼠疫流行。该学说还没有得到证实，暂时还只是一种假说。国内学者也进行了关于非生物因素保存学说的研究，如宋志忠提出鼠疫菌在自然界以植物根系正常菌群的形式保存在根系环境中[22-23]，验证了鼠疫菌保存在植物中的可能性。认为当自然界发生某些变化时(自然气候、地球物理化学等变化),鼠疫杆菌可以通过根而进入植物地上部分,啮齿类动物通过取食带菌植物而感染,造成动物间鼠疫流行。2.6其他耶尔森氏菌突变保存学说鼠疫菌可以由小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核菌(包括从沙门氏伤寒杆菌中获取的一些全身致病性基因等)、以及获取其他的病毒和细菌获取了大量基因演变而来已经被业内公认[24]。鼠疫菌与假结核菌染色体间具有高度的相似性，当外界条件合适，鼠疫菌可由假结核菌进行基因突变演变而来，从而在感染宿主动物引起动物间流行，成为鼠疫菌另外一种保存方式。另外三种致病耶尔森氏菌是否存在某种关系，影响鼠疫菌的存在和保存，可以带来探究鼠疫菌保存机制的新思路。3.小结鼠疫耶尔森氏菌在自然界的保存及鼠疫的发生机制问题，是一个世界性难题，至今仍未有任何一种学说被业内所公认，留给我们探索的路还很长。作为一种古老的自然疫源性疾病，从生态学中去寻找鼠疫菌存在的微生态系统，探讨鼠疫菌是否保存在其微生环境(动物宿主的巢穴土壤及某些植物根系、宿主动物、昆虫媒介等)中是一个值得进一步探索的方向，只有弄清楚鼠疫菌以何种形式存在，我们才能在根源处消灭鼠疫菌。同时我们可以发展最新的检测技术，提高鼠疫菌的阳性检出率，并为非典型鼠疫菌的寻找提供技术支撑。73 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文参考文献[1]PerryRD,FetherstonJD.Yersiniapestis-EtiologicAgentofPlague[J].ClinMicrobiolRev,1997,10(1):35-66.[2]周东生,杨瑞馥.鼠疫研究进展与展望[J].解放军医学杂志,2010,35(10):1176-1182.ZhouDS,YangRF.ProgressAndProspectofResearchWorkonPlague[J].MedicalJournalOfChinesePeople'sLiberationArmy,2010,35(10):1176-1182.[3]邵奎东,丛显斌,吕景生,等.中国鼠疫防治概述.[J].中国地方病防治杂志.2013,28(6):416-419.邵奎东,丛显斌,吕景生,徐成,鞠成.中国鼠疫防治概述.[J].中国地方病防治杂志.2013,28(6):416-419.ShaoKD,CongXB,LVJS,XUC,JUC.SummaryofThePlaguePreventionAndControlinChina.[J].ChineseJournalofControlofEndemicDiseases.2013,28(6):416-419.[4]方喜业,王光明.鼠疫[J].生物学通报.2006:41(9):1-4.DOI:10.3969/j.issn.0006-3193.2006.09.001.FangXY,WangGM.Theplague[J].BulletinOfBiology.2006:41(9):1-4.DOI:10.3969/j.issn.0006-3193.2006.09.001.[5]LitvinVIU,KorenbergEJ.Naturalfociofdiseases:thedevelopmentoftheconceptatthecloseofthecentary[J].Parazitologiia,1999,33(3):179-191.[6]傅杰青.东方乎,西方乎?关于黑死病的地理起源问题[J].地方病译丛,1979,04:11-20.FuJQ.TheQuestionsaboutTheGeographicalOriginofTheBlackDeathOnTheEastorWest?[J].EndemicTranslations,1979,04:11-20.[7]纪树立.鼠疫[M].北京:人民卫生出版社,1988:2-62.JISL.Theplague[M].Beijing:People'sMedicalPublishingHouse,1988:2-62.[8]俞东征,海荣.中国鼠疫菌的遗传特征及其与鼠疫自然疫源地关系[J].中国人兽共患病杂志,2004,20(9):28-30.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2004.z1.023.YuDZ,HaiIR.GeneticCharacteristicsofYersiniaPestisofChinaandItsRelationshipwithThePlagueNaturalfoci[J].ChineseJournalOfZoonoses,2004,20(9):28-30.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2004.z1.023.[9]耿贯一.流行病学[M].2版.北京:人民卫生出版社,1998:936.GengGY.Epidemiology[M].Version2.Beijing:People'sMedicalPublishingHouse,1998:936.[10]ZhouD.HanY.YangR.MolecμLarand-PhysiologicalInsightsintoPlagueTransmission.VirμLenceandEtiology[J].MicrobesInfect,2006,8(1):273-284.DOI:10.1016/j.micinf.2005.06.006.[11]张志凯,俞东征.我国鼠疫的现状与预防控制[J].传染病信息,2005,18(1):8-10.DOI:10.3969/j.issn.1007-8134.2005.01.004.ZhangZK,YuDZ.StatusofplagueanditspreventionandtreatmentinChina[J].InfectiousDiseaseInformation,2005,18(1):8-10.DOI:10.3969/j.issn.1007-8134.2005.01.004.[12]张贵军,邵奎东,段天一,等.全国2014年鼠疫监测结果[J].中国地方病防治杂志,2015,30增刊:7-8.ZhangGJ,ShaoKD,DuanTY,etal.Theplaguemonitoringdatain2014[J].ChineseJournalOfControlOfEndemicDiseases,2015,30(TheplaguesurveillanceSupplement):7-8.[13]刘振才,海荣,李富中,等.青藏高原青海田鼠鼠疫自然疫源地的发现与研究[J].中国地方病防治杂志,2001,16(6):321-327.DOI:10.3969/j.issn.1001-1889.2001.06.00174 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文刘振才,海荣,李富中,李超,丛显斌,高崇华,汪立茂,魏柏青,陈洪舰,陈虹,于晓涛,李存香,石映祥,光荣,李光清,吴国康,严冬丽,李敏,曹淑兰,张券华,魏建春,蔡虹.青藏高原青海田鼠鼠疫自然疫源地的发现与研究[J].中国地方病防治杂志,2001,16(6):321-327.DOI:10.3969/j.issn.1001-1889.2001.06.001LiuZC,HaiR,LiFZ,etal.ThediscoveryandstudyofMicrotusfuscusNaturePlagueFociinQinghai-TibetPlateau[J].ChineseJournalOfControlOfEndemicDiseases,2001,16(6):321-327.DOI:10.3969/j.issn.1001-1889.2001.06.001[14]WangP,LiW,ZhangZK,etal.CharactersofYμLongYersiniapestisstrainsfromYunnanProvince[J].China.IntJClinExpMed,2016;9(3):6394-6402.WangP,LiW,ZhangZK,GuoY,ShiLY,YeR,CuiZG,YangGC,DongSS,SongZZ.CharactersofYulongYersiniapestisstrainsfromYunnanProvince[J].ChinaIntJClinExpMed2016;9(3):6394-6402.[15]杨华源,梁秋光,曾敏,等.广东省鼠疫静息期鼠形动物耶尔森氏菌调查[J].中国地方病防治杂志,2005,20(3):159-160.DOI:10.3969/j.issn.1001-1889.2005.03.012.杨华源,梁秋光,曾敏,黄济英,潘珠,杨柳,刘小华.广东省鼠疫静息期鼠形动物耶尔森氏菌调查[J].中国地方病防治杂志,2005,20(3):159-160.DOI:10.3969/j.issn.1001-1889.2005.03.012.YangHY,LiangQG,ZengM,etal.SurveyonRodentandS.murinusYersiniaofPlagueStaticPhaseinGuangdong[J].ChineseJournalOfControlOfEndemicDiseases,2005.20(3):159-160.DOI:10.3969/j.issn.1001-1889.2005.03.012.[16]李伟,海荣,俞东征,等.应用荧光定量PCR检测环境样品中鼠疫耶尔森菌[J].中国媒介生物学及控制杂志,2005,16(4):301-304.DOI:10.3969/j.issn.1003-4692.2005.04.023.李伟,海荣,俞东征,张志凯,蔡虹,张建华.应用荧光定量PCR检测环境样品中鼠疫耶尔森菌[J].中国媒介生物学及控制杂志,2005,16(4):301-304.DOI:10.3969/j.issn.1003-4692.2005.04.023LiW,HaiR,YuDZ,etal.DetectionofYersiniapestisfromMiceTissuesandSoilbyReal-timeFluorescencePolymeraseChainReaction[J].ChineseJournalOfControlOfEndemicDiseases,2005,16(4):301-304.DOI:10.3969/j.issn.1003-4692.2005.04.023[17]李继连,杜国义,史献明,等.鼠疫耶尔森菌在自然疫源地保存机制的研究进展[J].中国媒介生物学及控制杂志,2010.8,21(4):399-401.LiJL,DuGY,ShiXM,SongDX.MechanismsofPersistenceofYersiniaPestisinTheNaturalFoci[J].ChineseJournalOfVectorBiologyAndConctrol,2010.8,21(4):399-401.[18]杜国义,史献明,刘合智,等.河北省鄂尔多斯高原型鼠疫菌毒力试验[J].地方病通报,2007,22(2):34-37.DOI:10.3969/j.issn.1000-3711.2007.02.006.杜国义,史献明,刘合智,李玉贵,白万翔,张月枝,白晓英,王桂琴,白雪薇,王海峰,胡乐乐,杨顺林.河北省鄂尔多斯高原型鼠疫菌毒力试验[J].地方病通报,2007,22(2):34-37.DOI:10.3969/j.issn.1000-3711.2007.02.006.DuGY,ShiXM,LiuHZ,LiYG,BaiIWX,ZhangYZ,BaiXY,WangGG,BaiIXW,WangHF,HuLL,YangSL.VirulenceTestofYersiniaPestisfromOrdosPlagueNaturalFociinHebei[J].EndemicDiseaseBulletin,2007,22(2):34-37.DOI:10.3969/j.issn.1000-3711.2007.02.006.[19]徐成,房静,孙启庭,等.蚤与鼠疫菌之间的生物学关系[J].中国地方病防治杂志,2002,17(6):347-348.DOI:10.3969/j.issn.1001-1889.2002.06.010.徐成,房静,孙启庭,孙鑫广,张铁军.蚤与鼠疫菌之间的生物学关系[J].中国地方病防治75 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云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义大理大学硕士学位论文致谢三年漫长而又短暂的时光给我的人生留下了浓墨重彩的一笔，毕业之际，心存感恩，在此向为我提供无微不至关怀和帮助的老师和同学表达谢意。首先，感谢我的导师宋志忠教授给予了我悉心指导和殷切教诲，宋老师为人真诚，待人亲切、一丝不苟的工作态度，积极向上的人生观念都是我终生学习的的榜样。其次感谢我的指导老师王鹏副教授，在生活和学习上都给予我很大帮助。王老师是一位执着追求、思维敏锐、严谨教学的亦师亦友的好老师。同时感谢云南省地方病防治所提供的学习和完成课题平台，感谢中心实验室石丽媛老师、郭英老师、董珊珊老师、钟佑宏师兄及中心实验室的各位老师，在本人研究生课程中的细心指导、教育和帮助。感谢大理大学公共卫生学院的各位老师，感谢你们三年以来给予我的帮助和理解。感谢中国CDC传染病所的李伟老师给予的热心协作与帮助。感谢在我的研究生的学习和生活中给予的关心和帮助15级流统的全体同学。最后，感谢答辩组老师的悉心指导及宝贵意见。77
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