汉族和维吾尔族低龄儿童龋流行病学调查及菌斑微生物的对比研究

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８０．１分类号：Ｒ７密级：公开单位代码：１０７６０学号：１０７６０１１３０６６７＿新疆医科大学ＸｉｎＪｉａｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ博士学位论文ＴＨＥＳＩＳＯＦＤＯＣＴＯＲＤＥＧＲＥＥ学术性学位）（学历教育论文题目：汉族和维吾尔族低龄儿童龋流行病学调查及菌斑微生物的对比研究研究生李艳指导教师赵今教授学科专业名称外科学研究方向龋病防治２０１４－研究起止时间．９２０１７．９所在学院口腔医学院２０１８年９月 论文独创性说明本人申明所呈交的学位论文是在我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地一方外。与我同工，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名來签字日期：ｙ＾ｉ％：务吁－签字日期＞导师签名：：川ｇ／冬公／ｙ关于论文使用授权的说明ａ本人完全了解学校关于保留、使用学位论文的各项规定，“”选择同意／不同意）以下事项：ｌ１．学校有权保留本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，、缩印或扫描等复制手段保存可以采用影印、汇编学位论文；“２．学校有权将本人的学位论文提交至清华大学中国学术期刊（光盘版”）电子杂志社用于出版和编入ＣＮＫＩ《中国知识资源总库》或其他同类数据库。，传播本学位论文的全部或部分内容名＾＞寻学位论文作者签名：签字日期：－７导师签名：３１签字日期：力／？／＾今／广卜 新疆医科大学博士研宄生学位论文导师评阅表研究生姓名李艳学号１０７６０１１３０６６７所在学院口腔医学院导师姓名赵今教授专业外科学研宄方向口腔医学论文题目汉族和维吾尔族低龄儿童龋流行病学及菌斑微生物的对比研究学术评语：该生的博士毕业论文选题符合培养目标，能够达到综合培养目的。论文采用流龋行病学调查及１６ｓＲＮＡ基因高通量测序方法，对比研究汉族和维吾尔族低龄儿童的患病情况、危险因素及菌斑微生物群落结构特征及其在防治后的结构变化。研宄落发现了两民族儿童龋病的分布特点、相关危险因素及不同民族龋特异位点微生物群病之特征及其在龋病防治后的变化，为了解当地儿童龋病流行特征、菌斑微生物与龋间可能的作用关系以及龋病的综合防治提供了综合的实验依据。该生具有良好的理论和专业知识、科研及临床工作能力较强。课题选题以临床实际问题为切入点，一具有定的临床指导意义和难度。课题设计合理，研宄目的明确，实验技术先进，数据客观可靠。论文结构严谨，撰写规范，论文达到了博士学位申请的要求，同意申请答辩。同意该生提交学位论文，并进行论文答辩。指导教师签字：七二／月咖 汉族和维吾尔族低龄儿童龋流行病学及菌斑微生物的对比研究研究生李艳指导教师赵今教授学科专业名称外科学研究方向龋病防治课题来源：《维吾尔族和汉族儿童龋病高危因素流行病学及细菌种属多样性的分子生物学对比研究》国家自然科学基金（项目编号81360167）2018年09月 ComparisonofepidemiologyandplaquemicroorganismsofearlychildhoodcariesbetweenHanandUygurchildrenＡDissertationSubmittedtoXinjiangMedicalUniversityInPartialFullfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofMedicineByLiYanSurgeryDissertationSupervisor:(Prof.ZhaoJin)September,2018 中英文缩略词对照表英文缩写英文全名中文译名ECCEarlyChildhoodCaries低龄儿童龋病SECCSevereEarlyChildhoodCaries重度低龄儿童龋dmftdecayed，missingandfilledteeth乳牙龋失补指数DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸HOMDHumanOralMicrobiomeDatabase人类口腔微生物数据库PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链反应OTUOperationalTaxonomicUnits操作分类单元PCoAPrincipalCo-ordinatesAnalysis主坐标分析LEfSeLinearDiscriminantAnalysisEffectSize线性判别分析 目录摘要..................................................................................................................................1ABSTRACT........................................................................................................................3前言..................................................................................................................................6第一部分新疆3-5岁汉族和维吾尔族低龄儿童龋病流行情况及危险因素调查......91研究内容及方法...................................................................................................101.1研究对象及抽样设计...............................................................................101.2口腔检查...................................................................................................101.3问卷调查....................................................................................................111.4质量控制....................................................................................................111.5统计学分析...............................................................................................122结果.......................................................................................................................123讨论.......................................................................................................................274小结.......................................................................................................................31第二部分汉族和维吾尔族重度低龄儿童龋牙菌斑菌群结构和多样性的对比研究....................................................................................................................331材料与方法...........................................................................................................331.1研究对象...................................................................................................331.2龈上菌斑样本采集...................................................................................341.3牙菌斑基因组DNA提取........................................................................341.4高通量测序...............................................................................................341.5生物信息学分析.......................................................................................351.6统计学处理...............................................................................................352结果.......................................................................................................................363讨论.......................................................................................................................574小结.......................................................................................................................63 第三部分龋病治疗前后汉族和维吾尔族儿童牙菌斑菌群微生物的对比分析........641研究对象与方法...................................................................................................641.1研究对象的处理.......................................................................................641.2龈上菌斑样本采集...................................................................................651.3DNA提取及高通量测序.........................................................................651.4数据分析...................................................................................................651.5统计学处理...............................................................................................652结果.......................................................................................................................653讨论.......................................................................................................................824小结.......................................................................................................................84结论................................................................................................................................85致谢................................................................................................................................87参考文献............................................................................................................................88附录..............................................................................................................................100综述...................................................................................................................................110攻读博士学位期间获得的学术成果...............................................................................118个人简历...........................................................................................................................119导师评阅表......................................................................................................................120 摘要汉族和维吾尔族低龄儿童龋流行病学及菌斑微生物的对比研究研究生：李艳导师：赵今教授摘要目的：对比研究新疆3-5岁汉族和维吾尔族低龄儿童龋患病情况及危险因素，利用高通量测序技术对比分析两民族重度低龄儿童龋菌斑微生物群落结构特征及其在防治后的演替，为当地儿童龋病的综合防控提供参考依据。方法：根据世界卫生组织《口腔健康调查基本方法》和第三次全国口腔健康流行病学调查方案，研究采用多阶段随机分层整群抽样方法，依据新疆维吾尔自治区地域和人口分布统计，分别选择南、北疆人口比重最大的喀什地区和伊犁哈萨克自治州中心城市喀什和伊宁市城乡，共26所幼儿园1727名3~5岁汉族和维吾尔族儿童进行问卷调查和口腔检查。记录患龋率、龋均、充填率及龋齿牙位分布情况，并对社会环境及经济状况、饮食、口腔卫生习惯及口腔保健行为等差异因素进行logistic回归分析。采集重度低龄儿童龋和健康对照组儿童乳磨牙龈上菌斑，利用Illumina高通量测序技术进行微生物群落构成和多样性分析；同时，对重度低龄儿童龋组进行龋齿充填治疗和口腔保健指导，一年后随访，以同位点和方法采集并对比分析菌斑微生物群落的变化及相关关系。应用SPSS21.0软件进行采集数据的统计分析，检验水准α=0.05，P≤0.05认为差异存在统计学意义。结果：1)1727名被调查儿童的低龄儿童龋（ECC）患病率78.2%，重度低龄儿童龋（SECC）患病率41.2%。在民族分布上，汉族儿童ECC及SECC患病率（78.7%，42.6%）和维吾尔族儿童（77.9%，40.1%）差异无统计学意义。但按民族因素分层比较，两民族儿童在不同年龄的ECC和SECC患病率差异均有统计学意义，且5岁年龄组患病率较高；汉族儿童在城乡间的SECC患病率差异有统计学意义，且农村儿童患病率（52.3%）较高；维吾尔族儿童在不同区域的ECC患病率差异有统计学意义，且伊宁市患病率（84.7%）较高。2)乳磨牙和上颌乳中切牙患龋比例最高，且分布有民族差异，其中，维吾尔族儿童乳磨牙患龋率较高，而汉族儿童乳前牙患龋率较高。3)龋齿充填率为1.72%，其中，汉族儿童充填率高于维吾尔族儿童，城市儿童充填率高于农村儿童，差异有统计学意义（P＜0.001）。4)年龄、农村生活、母亲受教育水平低下、母乳喂养、儿童看护者患龋、经常睡前进食以及缺乏口腔专科诊疗等因素是汉族儿童ECC和SECC患病的危险因素。年龄、地域、家庭收入低、儿童看护者患龋、高频率的含糖饮食、经常睡前进食、不刷牙或刷牙年龄较晚以及1 新疆医科大学博士学位论文缺乏口腔专科诊疗等因素是维吾尔族儿童ECC和SECC患病的危险因素。5)研究共获得3219033条优质序列，按照97%的相似性聚类得到18928个OTUs，归属于11个菌门，20个菌纲，30个菌科，58菌目，117菌属和443个菌种。多样性指数结果显示，两民族儿童龈上菌斑菌群的构成及多样性有差异性，健康对照组儿童菌斑微生物多样性高于SECC组儿童。6）物种分类中放线菌属、球杆菌属、嗜血杆菌属、Terrahaemophilus是汉族SECC儿童中丰度较高的优势菌属，而链球菌属和韦荣菌属是维吾尔族SECC儿童中丰度较高的优势菌属。7)多种放线菌和Terrahaemophilusaromaticivorans是汉族儿童SECC组中起主要作用的核心菌种，而殊异韦荣菌、中国链球菌、月神新月形单胞菌和多种放线菌是维吾尔族儿童SECC组中起主要作用的核心菌种。8）重度低龄儿童龋组中，Leptotrichiashahii、多种普氏菌、Alloprevotellatannerae及Selenomonassputigena的丰度在维吾尔族儿童组明显高于汉族儿童；而Actinomycesgerencseriae、Actinomycesjohnsonii、Actinomycesmassiliensis、Neisseriaelongate、Kingellaoralis、Kingelladenitrificans、的丰度在汉族儿童组明显高于维吾尔族儿童。9）龋病防治一年后，龋病儿童菌斑微生物的丰度呈现明显健康趋势的演替，而继发龋儿童的菌群丰度与防治前相近或增高。结论：1）新疆3-5岁汉族和维吾尔族儿童ECC及SECC患病率高，发病年龄早，充填率低；2）汉族和维吾尔族间低龄儿童龋患病率无统计学差异，但相关危险因素对低龄儿童龋的影响存在民族差异性；3）汉族和维吾尔族儿童龈上菌斑菌群的构成及多样性在患龋状态及民族间存在显著性差异；4）良好的龋病防治可以促进菌斑微生物发生健康趋向的演替。关鍵词：低龄儿童龋，危险因素，龈上菌斑，菌群多样性，高通量测序2 AbstractComparisonofepidemiologyandplaquemicroorganismsofearlychildhoodcariesbetweenHanandUygurchildrenPostgraduate:LiYanSupervisor:Prof.ZhaoJinAbstractObjective:TocomparetheprevalenceofearlychildhoodcariesandriskyfactorsbetweenHanandUygurchildrenfromthreetofiveyearsoldinXinjiang,andtoanalyzethecharacteristicsofplaquemicrobialcommunityandtheirsuccessionaftertreatmentinsevereearlychildhoodcairesbyhigh-throughputsequencingtechnology,inordertoprovidereferenceforcomprehensivepreventionandcontrolofdentalcaries.Methods:AccordingtotheBasicMethodofOralHealthSurveyfromworldhealthorganizationandtheThirdNationalOralHealthEpidemiologicalSurveyProgram,amulti-stagerandomstratifiedclustersamplingmethodwasappliedinthisstudy.AccordingtotheregionalandpopulationdistributionstatisticsofXinjiangUygurAutonomousRegion,1727HanandUygurchildrenagedfromthreetofiveyearsoldfrom26kindergartensinKashgarCityandYiningCityasthecentralcityofKashgarareaandYiliKazakhAutonomousPrefecturewiththelargestproportionofpopulationinsouthernandNorthernXinjiang,wereselectedforquestionnairesurveyandoralexamination.Theprevalence,themeandmftvalue,fillingrateanddistributionofdentalcarieswererecorded,andlogisticregressionanalysiswasbasedonvariousoffactorssuchassocialenvironment,economicstatus,diet,oralhygienehabitsandoralhealthbehavior.Supragingivalplaqueofdeciduousmolarswascollectedfromchildrenwithsevereearlychildhoodcairesandhealthycontrols.ThecompositionanddiversityofmicrobialcommunitywereanalyzedbyIlluminahighthroughputsequencingtechnique.Atthesametime,dentalfillingtherapyandoralhealthcareguidancewereprovidedtothechildrenwithsevereearlychildhoodcaires.Follow-upwasconductedoneyearlater.Thechangesofplaquemicrobialcommunityandtheircorrelationwereanalyzedbythesamesiteandmethod.SPSS21.03 新疆医科大学博士学位论文softwarewasusedfordatacollectionandstatisticalanalysis.Alltestsweretwo-tailedwithasignificancelevelof0.05.Results:1）Theprevalenceofearlychildhoodcaires(ECC)was78.2%andtheprevalenceofsevereearlychildhoodcaires(SECC)was41.2%of1727children.TherewasnosignificantdifferenceinethnicdistributionthattheprevalenceofECCandSECCbetweenHanchildren(78.7%,42.6%)andUygurchildren(77.9%,40.1%).Consideringthecomparisonbetweenbothethnicalgroups,differentresultsoftheprevalenceofECCforbothHanandUygurChildrenduringdifferentagedopresentstatisticalevidences.TheprevalenceofECCandSECCinthefive-year-oldgroupwashigher.TheprevalenceofSECCamongHanchildrenlivingurbanwassignificantlyhigherthanthatinruralareas(52.3%).TheprevalenceofECCamongUygurchildrenindifferentregionswassignificantlydifferent,andtheprevalenceofECCinYiningwashigher(84.7%).2）Thecariesrateofdeciduousmolarsandmaxillarycentralincisorswerethehighest,andthereweredifferencesinethnicdistribution.Uygurchildrenhadhighercariesrateofdeciduousmolars,whileHanchildrenhadhighercariesrateofdeciduousanteriorteeth.3）Thefillingrateofdentalcarieswas1.72%.ThefillingrateofHanchildrenwashigherthanthatofUygurchildren,andthatofurbanchildrenwashigherthanthatofruralchildren(P＜0.001).4）Age,urbanlife,loweducationlevelofmothers,breast-feeding,caretakerwithcavities,frequenteatingbeforesleep,andlessdentalspecialisttreatmentwereriskyfactorsofECCandSECCinHanchildren.Age,Yininglife,low-incomefamilies,caretakerwithcavities,frequentpre-sleepeating,high-frequencysugarydiet,lateornon-brushingofteeth,andlessdentalspecialisttreatmentwereriskyfactorsofECCandSECCinUygurchildren.5）Atotalof3219033high-qualitysequencesclusteredinto18928operationaltaxonomicunits(OTUs)at97%,representing443independentspeciesbelongingto117genera,58families,30orders,20classes,and11phyla.Diversityindexshowedthatthecompositionanddiversityofplaquemicrofloraweredifferentbetweenthetwoethnicgroups.ThediversityofplaquemicroflorainoralhealthgroupwashigherthanthatinSECCgroup.6)Actinomyces,Aggregatibacter,HaemophilusandTerrahaemo-philusarethedominantbacteriaofHanchildrenwithSECC.StreptococcusandVeillonellaarethedominantbacteriaofUygurchildrenwithSECC.7）Actinomycesspp.andTerrahaemophilusaromaticivoransarethecorebacteriarelatedtoHanchildrenwithSECC.Veillonelladispar,Streptococcussinensis,SelenomonasdianaeandActinomycesspp.arethecorebacteriarelatedtoUgyurchildrenwithSECC.8)InSECCgroup,theabundanceofLeptotrichiashahii,Prevotellaspp.,Alloprevotellatannerae,SelenomonassputigenainUygurchildrengroupwere4 AbstractsignificantlyhigherthanthatinHanchildrengroup,whiletheabundanceofActinomycesgerencseriae,Actinomycesjohnsonii,Actinomycesmassiliensis,Neisseriaelongate,Kingellaoralis,KingelladenitrificansinHanchildrengroupwassignificantlyhigherthanthatinUygurchildrengroup.9)Oneyearafterthetreatment,theabundancesofmicrobesinchildrenwithSECCshowedanobvioustrendofhealth.Butthefloraabundanceofsecondarycarieschildrenwassimilarormorethanthatofpre-therapy.Conclusion:1)TheprevalenceofECCandSECCamongHanandUygurchildrenageingfromthreetofiveyearsoldinXinjiangishighandthefillingrateislow.2)TherewasnosignificantdifferenceintheprevalenceofECCandSECCbetweenHanandUygurchildren,buttheinfluenceofrelatedriskyfactorsonECCisdifferentamongdifferentethnicalgroups.3)ThecompositionanddiversityofsupragingivalplaqueflorabetweenHanandUygurchildrenhavesignificantdifferencesincariesstatusandethnicgroups.4)Decentoralhygienecontrolandfillingtherapycanleadtoahealthysuccessionofplaquemicroflora.Keyword:Earlychildhoodcaries;Riskyfactors;Microbiomesofdentalplaques;Microbialdiversity;Highthroughputsequencing5 新疆医科大学博士学位论文前言低龄儿童龋（earlychildhoodcaries，ECC）是学龄前儿童最常见和多发的慢性疾病，由于发病早，进展持续，患病率高居儿童疾病首位，是儿童哮喘的5倍，肥胖症[1]的4倍，糖尿病的20。低龄儿童龋对儿童身体健康的危害重于成人，它不仅可以造成牙齿损坏、疼痛、炎症感染、乳牙滞留等口腔局部问题，还会引起儿童口颌面部[2-5]发育不良、营养吸收障碍，严重影响儿童的生长发育和身心健康。由于儿童配合[6]能力弱，治疗耗时、费用较高且病损容易再进展，乳牙龋的治疗常被忽视或延误。高患病率和低充填率已使低龄儿童龋成为全球范围内一个重大的公共卫生问题。口腔微生物、饮食、遗传、行为习惯和家庭社会经济状况等多种因素与低龄儿童龋密[7-8]切相关。由于经济水平、地域和种族习惯等差异，世界各国及不同地区低龄儿童龋的患病率存在很大差异。口腔流行病学资料显示，欧、美等发达国家儿童龋病患[9-10][11-12]病率较低，而亚洲等发展中国家儿童患龋率仍处于较高水平。龋病的分布也[13]不均衡，75%的低龄儿童龋发生于8%的儿童，且以低社会经济人群的儿童为重[14-15]，由此可见儿童龋病存在患龋高风险的人群。2015年第四次全国口腔健康流行[16]病学调查报告显示，在过去10年间，我国3-5岁儿童患龋水平呈明显上升趋势，患病率处于非常高的水平，其中，3岁年龄组达到50.8%，5岁年龄组高达71.9%，龋均4.24，而因龋充填牙仅占4.1%，95.8%的龋坏牙还没有得到治疗，儿童乳牙龋的防治是我国亟待解决的严重的公共卫生问题。西部是我国龋病高发地，也是少数民族的主要聚居地。新疆位于西部边陲，幅员辽阔，是以汉族和维吾尔族为主体的多民族聚居地区，特有的区域、文化和生活习惯对当地儿童口腔健康状况有着不同程度的影响。目前，有关新疆汉族和维吾尔族儿童低龄儿童龋系统的流行病学调查鲜有报道，了解两民族低龄儿童龋的患病情况及相关社会与行为等危险因素，掌握儿童龋病高危因素的流行病学特征，对当地儿童龋病风险评估和综合防治工作有着重要的现实意义。在龋病相关危险因素中，口腔微生物的存在是龋病发生的先决条件和主要病因[17]，因此，对口腔微生物菌群结构及特征的研究一直是龋病病因学研究的焦点。随着口腔微生态学的深入研究，龋病生态病因学说被越来越多的学者所接受。该学说认为，牙菌斑生物膜是由以细菌为主的微生物群落与其环境共同构成的功能性生态系统。生物膜中微生物的组成是动态变化的，正常情况下，各种微生物在牙菌斑中共栖、竞争和拮抗，并在种群和数量或功能上保持一个动态平衡的微生态系。但局部环境因素的改变，如碳水化合物的摄入、pH值降低等，会转变菌斑生物膜内的菌群比例及代谢产物，引起牙菌斑生物膜生态失调，使正常细菌演替成为条件致病菌6 前言[18]引发龋病。这种平衡的菌斑微生态系统不是微生物简单叠加的结果，而是通过黏[19-20]附、定植、相互协调形成的具有高度分化结构的群落。群落间存在共聚、互养、相互拮抗作用以及由此产生的新陈代谢等相互关系，这些复杂的相互关系在菌斑生[21]物膜形成以及维持和影响菌斑微生态平衡中起着重要作用。由此可见，在复杂的牙菌斑生物膜群落中，整个群落的行为是由微生物群落的相互作用决定，而非任何一种细菌单独引起。这种以群落和微生物生态为基础的病原理论为理解菌斑微生物与低龄儿童龋的关系提供了新的视角。口腔微生物种群复杂，对其结构及多样性的认识很大程度上依赖于研究手段。[22]目前，人类口腔中已发现700多种菌种或亚型，其中约35%尚不能被培养。由于多数微生物不能在实验室环境下生长，以传统培养技术为基础的研究结果可能具有严重偏差，限制了致龋细菌的发现和对菌斑微生物构成的整体认识，所得研究数据无[23]法详尽阐述口腔微生物群落的结构及多样性。近年来，随着现代分子生物技术的快速发展，基于16SrRNA基因的高通量测序技术（High-throughputsequencing）成为[24-25]获取口腔微生物物种全基因序列信息和多样性研究的最新手段和技术。该技术可以一次对数百万个DNA分子进行大规模平行测序，样品中DNA被测序的次数反映[26]其DNA丰度，这使得准确定量特征序列、有效进行微生物的分型鉴定成为可能。高通量测序技术又称下一代测序技术（next-generationsequencing，NGS），也称第二代测序技术或者深度测序。该技术根据发展历史、测序原理和技术不同主要分为三种类型：合成测序（如Roche454焦磷酸测序、Illumina、IonTorrent系统）、连接测序（SOLiD，PolonatorG.007system）和单分子测序（Helicos,PacificBioSciences）。目前应用于口腔微生态研究的高通量测序平台主要为Roche公司基于焦磷酸测序原理的454测序仪（GSJunior,GSFLXsequencer），和Illumina公司基于合成测序原理的Solexa基因组测序仪（GenomeAnalyzerIIx,HiSeq2000/MiSeq）和ABI公司基于连接技术的SOLiD测序仪。其中，代表平台Roche454焦磷酸测序仪和IlluminaSolexa基因组测序仪已广泛应用于人类口腔微生物群落多样性，以及微生物与口腔疾病相关性[24,27,28]的研究中。[29]2008年，Keijser等应用454焦磷酸测序技术对98个健康成人牙菌斑样本进行检测，在97%的分类水平上，检出22门，318属，10000种微生物表型，远远超出了传统[30]培养和检测技术定义的微生物种类。2009年，Zaura等应用454焦磷酸测序技术检测3名正常高加索人口腔5个位点的微生物组，发现了88-104属或以上的高级分类群，[31]以及超过500种的物种表型。2011年，Crielaard等应用454焦磷酸测序技术对乳牙列期、混合牙列期早期和末期及恒牙列期，4个不同发育阶段口腔唾液菌群进行分析，检出8门，113个菌属及以上的高水平分类群，发现牙齿的萌出使口腔微生态发生了显著变化，但是微生物物种在不同发育阶段仍会保持相对的恒定。年龄的生物性改7 新疆医科大学博士学位论文[27]变会驱使菌群微生物逐渐成熟。2015年，Holgerson等采用454焦磷酸测序和人类口腔菌群识别芯片技术对3个月新生儿至3岁口腔粘膜及唾液菌群进行纵向观测，结果共检出7门，72属，342种不同菌种，发现口腔菌种丰度和分类多样性随着年龄增长[32]明显增加，3岁儿童的口腔微生物中出现与龋病相关的菌群。2017年，Richards等应用IlluminaMiSeq测序平台对55名不同龋损状态儿童龈上菌斑的特异位点进行纵向观测，检出84属，408种菌种，微生物群落的组成在不同龋活性状态下显著不同，且随着疾病的进展发生着稳定的演替。至今，由美国国立卫生研究院牙颅颌面研究所启动的人类口腔微生物组数据库（HumanOralMicrobiomeDatabase,HOMD）已经记录了13门，619个分类物种，其中65%的菌种可以在实验室培养，数据库对口腔细菌[33]的类型、新陈代谢情况及致病能力等进行了详细的记录。另外，四川大学华西口腔医学院针对中国人相关微生物群新建的中国口腔微生物库（OralMicrobiomeBank[34]ofChina，OMBC），也记录了来自中国人群的289株细菌和720份临床样本以及实验室和临床信息。以往研究结果展示了口腔微生物群落在个体生长发育过程中和不同龋损状态及定植位点呈现的动态变化及空间种群特异特征，但是，种族因素和龋防治措施对口腔微生物菌群特征的影响尚鲜为报道。本研究拟采用Illumina高通量测序平台对比分析维吾尔族和汉族儿童不同龋敏感状态及龋齿防治前后牙菌斑生物膜的菌群结构、多样性及菌群演替，以期为了解牙菌斑生物膜与儿童龋病的关系提供新的视角，同时也为当地儿童龋病的防治提供理论依据和微生物标准的实验数据。本研究主要包括三部分：1、对新疆3-5岁汉族和维吾尔族儿童低龄儿童龋流行情况和相关危险因素进行横断面调查，对比分析两民族儿童低龄儿童龋患病情况及其相关社会和行为危险因素，以期为当地儿童龋病的综合防控提供参考依据。2、以汉族和维吾尔族重度低龄儿童龋为研究对象，采集患龋率最高的乳磨牙颊面及邻面龈上菌斑样本，利用IlluminaMiSeq高通量测序技术进行微生物群落构成和多样性对比分析，以期获得两民族儿童龋好发牙位微生物群落特征及其多样性的相关资料。3、对患龋组儿童进行龋洞充填治疗和口腔健康指导，一年后以同样测序方法分析相同位点龈上菌斑样本的菌群结构及多样性变化，以了解给予健康防治措施后患龋儿童菌斑微生物构成的演替及菌群间的相互关系，为儿童龋病防治提供微生物标准的实验数据。8 第一部分第一部分新疆3-5岁汉族和维吾尔族低龄儿童龋流行情况及危险因素调查低龄儿童龋（earlychildhoodcaries，ECC）是学龄前儿童最常见和多发的慢性疾病，由于不良喂养习惯是常见的病因，ECC曾有奶瓶龋、喂养龋、奶瓶综合征、猛[35]性龋等多个不同命名。为加强儿童龋病横断面流行病学调查可比性，1999年美国儿童牙科协会（AmericanAcademyofPediatricDentistry,AAPD）推出核心流行病学概念，将ECC定义为：年龄≤71个月儿童乳牙列出现任意一个或多个乳牙龋坏（包括已形成龋洞及白垩色龋损），或因龋造成牙齿缺失，或因龋充填的牙。并定义重度低龄儿童龋（severeearlychildhoodcaries，SECC）为至少出现以下一种情况：1）3岁以下儿童乳牙出现任意光滑面的龋坏；2）3~5岁儿童上颌乳前牙出现1个或多个龋坏，或因龋失牙，或因龋充填的牙；3）3~4岁儿童dmft≥4，4~5岁儿童dmft≥5，5岁儿童[36]dmft≥6。可见，ECC的定义不是依据受累牙的个数，而是患者的年龄和对应此年龄特点的患牙位置。回顾不同国家和地域低龄儿童龋的流行病学调查发现，低龄儿[37][38][39]童龋的患病率在发达国家普遍较低，如：英国28%，美国23%，德国31.6%，[40][41][42]而发展中国家仍处于较高水平，如：中国66%，印度63%，巴西53.9%等。其中，发展中国家低社会经济家庭的儿童，发达国家低收入家庭、低社会经济状况的移民、原住民族及少数民族儿童ECC患龋率最为严重，可能是ECC的高易感人群[43-46]。[47]ECC的形成是由口腔微生物、社会和行为等多种因素相互作用决定的。在低龄儿童生长发育期，儿童口腔的微生态环境特点、社会经济状况、饮食习惯、口腔卫生及保健行为等各种因素均存在阶段特异性，与ECC的发生发展密切相关。其中，低社会经济状况，饮水氟化物缺乏，母亲因素（受教育程度低，龋齿，缺乏口腔健康知识），不良的饮食和口腔卫生行为以及口腔专科治疗的缺乏等社会和行为因素被[48-51]认为是ECC发生发展的主要危险因素。但是，作为慢性感染性疾病，如果治疗及时得当，ECC在大多数情况下是可以被预防、控制和治愈的。ECC的防治不仅是[52]牙医的职责更是家庭和整体社会的责任。因此，充分了解和评估ECC患病情况及其相关社会和行为因素对有效制定儿童口腔健康防治策略至关重要。新疆地处西北边陲，是中国地域最大的省级行政区和少数民族聚居地。常住人口2264.3万，有47个民族成分，其中，主体民族维吾尔族人口1074.4万（47.4%）、汉族人口860万（38%）共占总人口的85.4%。作为边疆地区，新疆的社会经济发展和医疗卫生体系分布不均衡且较为滞后。有关学龄前儿童的口腔健康调查及预防项目9 新疆医科大学博士学位论文开展很少，特别是南、北疆偏远地区口腔医疗机构和工作人员缺乏，学龄前儿童ECC高发但却鲜有客观的流行病学调查资料。本研究旨在对新疆3-5岁汉族和维吾尔族儿童ECC流行情况和相关危险因素进行横断面调查和对比分析，以期为当地学龄前儿童龋病的综合防控提供参考依据。1研究内容及方法1.1研究对象及抽样设计本研究为国家自然科学基金项目，经新疆医科大学第一临床医学院伦理委员会审核批准（伦理审批号：20130216-103）。调查进行时间为2013年3月至2015年5月。调查采用多阶段分层整群抽样方法，第一阶段，根据新疆维吾尔自治区地域和人口[53]分布统计，分别选择南、北疆人口比重最大的两个地州：喀什地区和伊犁哈萨克自治州的中心城市喀什市和伊宁市。第二阶段，根据行政区域划分对两市幼儿园进行城乡分层抽样，喀什市随机抽取城市幼儿园4所，农村幼儿园6所；伊宁市随机抽取城市幼儿园8所，农村幼儿园8所，共26所幼儿园。第三阶段，整群抽样每所幼儿园小班、中班及大班3～5岁儿童。根据课题组前期乌鲁木齐3-5岁儿童ECC流调患龋[54]率58.9%，拟定阳性估计率P，允许误差d=0.1P，显著性水平α=0.05，双侧检验22t=1.96≈2，估算每年龄组最小样本量n=（t×P×Q）/d=279人。纳入标准：①3-5岁维吾尔族和汉族儿童；②当地常住人口（当地居住6月以上者）；③无全身系统性疾病；④儿童家长同意并配合本次研究。1.2口腔检查1.2.1检查内容及方法检查儿童乳牙列的龋、失、补牙数。检查前对检查者进行统一培训，并在幼儿园随机抽取20名儿童进行检查者自身及检查者间的标准一致性检验，Kappa值达0.8。受检儿童在幼儿园保健室接受口腔检查，清水漱口后，由2名严格培训后的口腔专业人员在充足的自然光线下，面对面用专用平面口镜和5号探针对全口乳牙列进行检查。1.2.2诊断标准[55]根据WHO（1997）龋病诊断标准中的乳牙龋失补指数（dmft）评价龋损状况。（1）无龋（A）：将无任何龋坏，也无任何永久/暂时性充填物的健康牙记为无龋牙。龋洞未形成及出现类似早期龋的情况，诊断不清，不作为龋齿记录。以下情况不诊断为龋齿：①白垩色的斑点；②牙冠上出现粗糙或变色的斑点，未探及软化；③釉质表面点隙裂沟染色，但肉眼未见釉质下潜行性破坏，探针未探及沟底或沟壁存在软化；④中、重度氟斑牙在牙釉质上形成的硬的、颜色较暗的凹陷缺损；⑤牙釉质表面的磨损；⑥釉质矿化不全。10 新疆医科大学博士学位论文（2）龋齿（B）：位于牙齿光滑面或点隙窝沟处明显的釉质破坏、或形成明显龋洞、或可明确探及洞底或洞壁软化灶的病损记为龋齿。经探诊证实咬合面、颊舌面存在的龋损。有暂时充填物的牙齿记为龋齿。已行窝沟封闭伴龋损的牙按龋记录。可疑龋不能记为龋齿。（3）已充填有龋（C）：牙齿存在一个或多个永久性充填物且伴有一个或多个部位的龋损者记为已充填有龋。无需区分龋损是原发性或继发性龋。（4）已充填无龋（D）：牙齿存在一个或多个永久性充填物且无任何部位的龋坏记为已充填无龋。（5）因龋缺失（E）：因龋而拔除的牙。（6）因其它原因缺失（X）：因先天缺失，或外伤等丧失的乳牙。（7）多生牙不列入检查范围，融合牙按2颗牙齿进行记录。1.3问卷调查[56]参考第三次全国口腔健康流行病学抽样调查要求，结合本次研究目的设计调查问卷表，内容包括：人口社会信息（地域、性别、年龄、民族、居住地、胎龄、家庭人口、父母受教育水平、家庭年收入、看护人是否患龋），饮食习惯（喂养方式、含糖食品摄入频次、睡前进食），口腔卫生习惯（开始刷牙年龄、每日刷牙频次、父母辅助刷牙、含氟牙膏使用）及口腔保健情况（口腔专科诊疗、父母接受口腔健康指导）等ECC和SECC相关的影响信息。调查问卷采用维、汉双语设计，由幼儿园老师统一向受检儿童家长发放，家长填写完毕后次日统一回收。发放前安排维吾尔族口腔专业人员给予详细讲解及填写指导。所有受检儿童家长均签署书面知情同意。1.4质量控制1.4.1调查前准备统一流行病学抽样调查方法及检查内容，使用统一的龋病诊断标准及检查工具，对所有调查者进行统一培训，并进行调查者自身及调查者间的标准一致性检验，以保证调查结果的合理性和标准性。1.4.2调查的组织与实施调查前召开家长会，安排维吾尔族双语调查人员对幼教老师及儿童家长详细讲解调查的目的、内容及调查项目的填写要求，针对家长的具体问题耐心答疑指导，获得家长的知情同意。调查问卷采用维、汉双语设计，现场向受检儿童家长发放，家长填写完毕后次日由幼儿园老师统一回收。调查自愿参加，受检儿童家长均须签署书面知情同意。口腔检查数据由检查者本人记录，助手复核错漏项目，及时补正。1.4.3数据核对调查后，由2名课题组成员进行数据的检查、核对和录入，录入后随机抽取20%量表或检测结果进行复核，检查2人输入结果的一致性，录入无误后进行统计分析。11 新疆医科大学博士学位论文1.5统计学分析采用SPSS21.0软件进行统计分析。用患龋率和龋均表示ECC和SECC患病情况。充填率、牙位分布比较采用均数、百分比和Pearson卡方检验。按照民族因素进行分层，分别探讨不同特征、饮食习惯、口腔卫生习惯的儿童患ECC和SECC的差异，采用卡方检验进行分析，若不满足条件，则采用确切概率法进行分析。分别以是否患ECC和SECC为因变量，以单因素分析中有统计学差异的变量为自变量，建立二分类Logistic回归分析模型，分析儿童患ECC和SECC的影响因素。检验水准α=0.05，P≤0.05认为差异存在统计学意义。2结果2.1调查基本情况本研究调查3-5岁汉族和维吾尔族儿童共计1857人，最终纳入检查并提交有效问卷的儿童1727人，应答率93%。剔除人员中33%拒绝参加，50.0%因病缺勤，17.0%问卷信息不完整。调查儿童的平均年龄为4.19±0.72岁，其中汉族儿童有718人，占41.6%，维吾尔族儿童有1009人，占58.4%。不同民族儿童一般特征的分布情况见表1.1。表1.1研究对象的分布情况（%）Table1.1DistributionofStudyPopulation（%）变量汉族维吾尔族合计性别男387（53.9）512（50.7）899（52.1）女331（46.1）497（49.3）828（47.9）年龄（岁）3125（17.4）182（18.0）307（17.8）4339（47.2）441（43.7）780（45.2）5254（35.4）386（38.3）640（37.1）地域喀什223（31.1）670（66.4）893（51.7）伊宁495（68.9）339（33.6）834（48.3）地区城市607（84.5）307（30.4）914（52.9）农村111（15.5）702（69.6）813（47.1）合计718（41.6）1009（58.4）1727（100）12 新疆医科大学博士学位论文2.2两民族儿童在不同性别、年龄、地域及城乡的ECC患龋情况1727名被调查儿童中ECC患龋儿童共1351人，患龋率78.2%，龋均5.61±3.56。其中，汉族儿童565例，ECC患龋率78.7%，龋均5.80±3.716；维吾尔族儿童786例，ECC患龋率77.9%，龋均5.47±3.433。两民族儿童在不同性别、年龄、地域及城乡的ECC患龋率及龋均，详见表1.2。表1.2汉族和维吾尔儿童ECC患龋情况Table1.2TheprevalenceofECCinHanandUygurchildren受检人数患龋人数患龋率%龋均变量汉族维吾尔族汉族维吾尔族汉族维吾尔族汉族维吾尔族性别男38751231140480.478.95.76±3.6855.40±3.306女33149725438276.776.95.85±3.7615.54±3.565年龄（岁）31251828411467.262.64.68±3.6284.41±2.920433944127134179.977.35.86±3.5505.25±3.400525438621033182.785.86.17±3.8876.06±3.524地域喀什22367016949975.874.55.86±3.7355.61±3.467伊宁49533939628780.084.75.773.7125.223.365地区城市60730747023977.477.95.71±3.7745.15±3.251农村1117029554785.677.96.25±3.3965.61±3.503合计718100956578678.777.95.80±3.7165.47±3.433注：ECC患龋率=(患龋人数/受检人数)×100%2.3两民族儿童在不同性别、年龄、地域及城乡的SECC患龋情况两民族SECC患龋儿童共711人，患龋率41.2%，龋均8.17±3.94。其中，汉族儿童306例，SECC患龋率42.6%，龋均8.36±3.156；维吾尔族儿童405例，SECC患龋率40.1%，龋均8.04±2.768。两民族儿童在不同性别、年龄、地域及城乡的SECC患龋率及龋均，详见表1.3。13 新疆医科大学博士学位论文表1.3汉族和维吾尔儿童SECC患龋情况Table1.3TheprevalenceofSECCinHanandUygurchildren受检人数患龋人数患龋率%龋均变量汉族维吾尔族汉族维吾尔族汉族维吾尔族汉族维吾尔族性别男38751217121044.241.08.20±3.1917.89±2.563女33149713519540.839.28.56±3.1128.19±2.971年龄（岁）3125182436134.433.57.19±3.4866.56±2.320433944115716946.338.38.10±2.9808.01±2.636525438610617541.745.39.22±3.0778.58±2.855地域喀什2236708526538.139.68.75±3.0598.16±2.699伊宁49533922114044.641.38.20±3.1877.81±2.889地区城市60730724811040.935.88.38±3.2577.85±2.779农村1117025829552.342.08.28±2.7078.11±2.765合计718100930640542.640.18.36±3.1568.04±2.768注：SECC患龋率=(患龋人数/受检人数)×100%2.4两民族儿童ECC及SECC的单因素分析2.4.1两民族儿童ECC及SECC的社会环境及经济状况比较按民族因素进行分层，分别比较两民族儿童不同社会环境及经济状况间ECC患龋率的差异，结果显示：汉族儿童ECC患龋率在不同年龄、看护者患龋情况、母亲文化程度间的差异均存在统计学意义（P＜0.05），其中，5岁年龄组（患龋率82.7%）、看护者患龋（患龋率88.9%）及母亲小学及以下文化（患龋率88.5%）的儿童ECC患龋率较高。维吾尔族儿童ECC患龋率在不同年龄、地域、看护者患龋情况、父亲文化程度、母亲文化程度及家庭收入间ECC患龋率的差异均存在统计学意义（P＜0.05），其中，5岁年龄组（患龋率85.8%）、伊宁市（患龋率84.7%）、看护者患龋（患龋率85.1%）、父亲小学及以下文化（患龋率91.9%）、母亲小学及以下文化（患龋率89.6%）、家庭收入在0-2,999元（患龋率95.0%）的儿童ECC患龋率较高，详见表14 新疆医科大学博士学位论文1.4。表1.4汉族和维吾尔儿童ECC的社会环境及经济状况比较Table1.4ComparisonofthesocioeconomicstatusofECCinHanandUygurchildren汉族维吾尔族变量PPECCNon-ECCECCNon-ECC性别男311(55.0)76(49.7)404(51.4)108(48.4)1.3980.2370.6130.434女254(45.0)77(50.3)382(48.6)115(51.6)年龄（岁）384(14.9)41(26.8)114(14.5)68(30.5)4271(48.0)68(44.4)12.5660.002341(43.4)100(44.8)38.531<0.0015210(37.2)44(28.8)331(42.1)55(24.7)地区城市470(83.2)137(89.5)239(30.4)68(30.5)3.7220.0540.0010.980农村95(16.8)16(10.5)547(69.6)155(69.5)地域喀什市169(29.9)54(35.3)499(63.5)171(76.7)1.6290.20213.558<0.001伊宁市396(70.1)99(64.7)287(36.5)52(23.3)胎龄足月491(86.9)137(89.5)680(86.5)203(91.0)早产44(7.8)13(8.5)3.1100.21186(10.9)17(7.6)3.3750.185过期妊娠30(5.3)3(2.0)20(2.5)3(1.3)独生子女否294(52.0)75(49.0)707(89.9)196(87.9)0.4380.5080.7820.377是271(48.0)78(51.0)79(10.1)27(12.1)看护者患龋否437(77.3)137(89.5)592(75.3)189(84.8)11.1720.0018.8420.003是128(22.7)16(10.5)194(24.7)34(15.2)父亲文化程度文盲/小学31(5.5)7(4.6)125(15.9)11(4.9)初中127(22.5)41(26.8)1.8620.602327(41.6)85(38.1)23.975<0.001高中/中专237(41.9)57(37.3)213(27.1)81(36.3)15 新疆医科大学博士学位论文汉族维吾尔族变量PPECCNon-ECCECCNon-ECC大专及以上170(30.1)48(31.4)121(15.4)46(20.6)母亲文化程度文盲/小学23(4.1)3(2.0)198(25.2)23(10.3)初中154(27.3)41(26.8)331(42.1)75(33.6)7.8170.05050.843<0.001高中/中专226(40.0)49(32.0)156(19.8)89(39.9)大专及以上162(28.7)60(39.2)101(12.8)36(16.1)家庭年收入（元）0-2,99911(1.9)2(1.3)266(33.8)14(6.3)3,000-7,999105(18.6)30(19.6)274(34.9)34(15.2)0.6150.893165.695<0.0018,000-19,999110(19.5)27(17.6)84(10.7)47(21.1)>20,000339(60.0)94(61.4)162(20.6)128(57.4)不同社会环境及经济状况因素在SECC患龋率的比较中发现，汉族儿童SECC患龋率在不同地区、看护者患龋情况、父亲文化程度及母亲文化程度间的差异均存在统计学意义（P＜0.05），且在农村（患龋率52.3%）、看护者患龋（患龋率55.6%）、父亲高中文化（患龋率49.0%）、母亲小学及以下文化（患龋率53.8%）的儿童SECC患龋率较高。维吾尔族儿童SECC患龋率在不同年龄、看护者患龋情况、父亲文化程度、母亲文化程度、家庭收入间SECC患病率的差异均存在统计学意义（P＜0.05），且在5岁年龄组（患龋率45.3%）、看护者患龋（患龋率52.6%）、父亲小学及以下文化（患龋率52.2%）、母亲小学及以下文化（患龋率48.0%）、家庭收入在0-2,999元（患龋率53.2%）的儿童SECC患龋率较高，详见表1.5。表1.5汉族和维吾尔儿童SECC的社环境及会经济状况比较Table1.5ComparisonofthesocioeconomicstatusofSECCinHanandUygurchildren汉族维吾尔族变量PPSECCNon-SECCSECCNon-SECC性别男171(55.9)216(52.4)210(51.9)302(50.0)0.8440.3580.3330.564女135(44.1)196(47.6)195(48.1)302(50.0)年龄（岁）343(14.1)82(19.9)61(15.1)121(20.0)5.4260.0668.2680.0164157(51.3)182(44.2)169(41.7)272(45.0)16 新疆医科大学博士学位论文汉族维吾尔族变量PPSECCNon-SECCSECCNon-SECC5106(34.6)148(35.9)175(43.2)211(34.9)地区城市248(81.0)359(87.1)110(27.2)197(32.6)4.9830.0263.4080.065农村58(19.0)53(12.9)295(72.8)407(67.4)地域喀什市85(27.8)138(33.5)265(65.4)405(67.1)2.6810.1020.2860.593伊宁市221(72.2)274(66.5)140(34.6)199(32.9)胎龄足月266(86.9)362(87.9)355(87.7)528(87.4)早产20(6.5)37(9.0)5.7060.05842(10.4)61(10.1)0.2940.863过期妊娠20(6.5)13(3.2)8(2.0)15(2.5)独生子女否163(53.3)206(50.0)361(89.1)542(89.7)0.7510.3860.0930.761是143(46.7)206(50.0)44(10.9)62(10.3)看护者患龋否226(73.9)348(84.5)285(70.4)496(82.1)12.328<0.00119.133<0.001是80(26.1)64(15.5)120(29.6)108(17.9)父亲文化程度文盲/小学16(5.2)22(5.3)71(17.5)65(10.8)初中65(21.2)103(25.0)179(44.2)233(38.6)8.5898.58918.938<0.001高中/中专144(47.1)150(36.4)103(25.4)191(31.6)大专及以上81(26.5)137(33.3)52(12.8)115(19.0)母亲文化程度文盲/小学14(4.6)12(2.9)106(26.2)115(19.0)初中84(27.5)111(26.9)177(43.7)229(37.9)16.031<0.00118.419<0.001高中/中专136(44.4)139(33.7)77(19.0)168(27.8)大专及以上72(23.5)150(36.4)45(11.1)92(15.2)家庭年收入（元）0-2,9997(2.3)6(1.5)149(36.8)131(21.7)3,000-7,99952(17.0)83(20.1)151(37.3)157(26.0)1.7910.61770.649<0.0018,000-19,99958(19.0)79(19.2)31(7.7)100(16.6)>20,000189(61.8)244(59.2)74(18.3)216(35.8)17 新疆医科大学博士学位论文2.4.2两民族儿童ECC及SECC的饮食习惯比较两民族儿童不同饮食习惯间ECC患龋率的差异结果显示：汉族儿童ECC患龋率在睡前进食频率间的差异存在统计学意义（P=0.018），且在经常睡前进食儿童的ECC患龋率较高（患龋率87.8%）。维吾尔族儿童中，ECC患病率在不同含糖食品摄入频率和睡前进食频率间的差异均存在统计学意义（P＜0.001），其中，含糖食品摄入频率≥2次/天（患龋率94.4%）、睡前经常进食（患龋率99.0%）儿童的ECC患龋率较高，详见表1.6。表1.6汉族和维吾尔儿童ECC的饮食习惯比较Table1.6ComparisonofdietarybehaviorsofECCinHanandUygurchildren汉族维吾尔族变量PPECCNon-ECCECCNon-ECC喂养习惯母乳喂养282(49.9)85(55.6)365(46.4)100(44.8)混合喂养231(40.9)54(35.3)1.6990.428378(48.1)112(50.2)0.3520.838人工喂养52(9.2)14(9.2)43(5.5)11(4.9)含糖食品摄入频率>1次/天122(21.6)28(18.3)234(29.8)14(6.3)1次/天115(20.4)30(19.6)284(36.1)54(24.2)1.3110.727119.303<0.001＜1次/天250(44.2)75(49.0)209(26.6)93(41.7)不吃78(13.8)20(13.1)59(7.5)62(27.8)睡前进食经常36(6.4)5(3.3)97(12.3)1(0.4)有时373(66.0)89(58.2)8.0060.018522(66.4)136(61.0)46.858<0.001否156(27.6)59(38.6)167(21.2)86(38.6)两民族儿童不同饮食习惯间SECC患龋率的差异结果显示：汉族儿童SECC患龋率在不同喂养习惯间的差异存在统计学意义（P=0.004），且在母乳喂养（患龋率57.2%）儿童的SECC患龋率较高。维吾尔族儿童SECC患龋率在不同含糖食品摄入频率、睡前进食频率间ECC患病率的差异均存在统计学意义，且在含糖食品摄入频率≥2次/天（患龋率61.7%）、睡前经常进食（患龋率64.3%）的儿童SECC患龋率较18 新疆医科大学博士学位论文高，详见表1.7。表1.7汉族和维吾尔儿童SECC的饮食习惯比较Table1.7ComparisonofdietarybehaviorsofSECCinHanandUygurchildren汉族维吾尔族变量PPSECCNon-SECCSECCNon-SECC喂养习惯母乳喂养175(57.2)192(46.6)179(44.2)286(47.4)混合喂养113(36.9)172(41.7)11.2340.004202(49.9)288(47.7)1.1800.554人工喂养18(5.9)48(11.7)24(5.9)30(5.0)含糖食品摄入频率>1次/天62(20.3)88(21.4)153(37.8)95(15.7)1次/天63(20.6)82(19.9)134(33.1)204(33.8)1.5410.67382.213<0.001＜1次/天134(43.8)191(46.4)97(24.0)205(33.9)不吃47(15.4)51(12.4)21(5.2)100(16.6)睡前进食经常20(6.5)21(5.1)63(15.6)35(5.8)有时204(66.7)258(62.6)2.8470.241268(66.2)390(64.6)36.364<0.001否82(26.8)133(32.3)74(18.3)179(29.6)2.4.3两民族儿童ECC及SECC的口腔卫生习惯及保健的比较两民族儿童不同口腔卫生习惯及保健间ECC患龋率差异比较结果显示，汉族儿童ECC患龋率在是否进行过牙体治疗的差异存在统计学意义（P＜0.001），且进行过牙体治疗（患龋率86.7%）的儿童ECC患龋率较高。在维吾尔族儿童中，ECC患龋率在不同的开始刷牙年龄、每日刷牙频率、父母是否帮助刷牙、是否进行过牙体治疗间的差异均存在统计学意义（P＜0.001），且在从不刷牙（患龋率89.9%）、每日不刷牙（患龋率90.1%）、父母未帮助刷牙（患龋率82.4%）、进行过牙体治疗（患龋率88.7%）的儿童ECC患龋率较高，详见表1.8。19 新疆医科大学博士学位论文表1.8汉族和维吾尔儿童ECC口腔卫生习惯及保健的比较Table1.8ComparisonofOralhygienebehaviorsanddentalhealthcareofECCinHanandUygurchildren汉族维吾尔族变量PPECCNon-ECCECCNon-ECC开始刷牙年龄＜3岁387(68.5)108(70.6)207(26.3)116(52.0)4岁96(17.0)30(19.6)152(19.3)52(23.3)3.3460.34170.163<0.0015岁21(3.7)2(1.3)126(16.0)21(9.4)不刷牙61(10.8)13(8.5)301(38.3)34(15.2)每日刷牙频率>1次/天381(67.4)97(63.4)284(36.1)114(51.1)1次/天161(28.5)49(32.0)0.8810.644292(37.2)86(38.6)30.229<0.001不刷牙23(4.1)7(4.6)210(26.7)23(10.3)父母帮助刷牙否373(66.0)102(66.7)548(69.7)117(52.5)0.0230.88023.015<0.001是192(34.0)51(33.3)238(30.3)106(47.5)使用含氟牙膏否480(85.0)126(82.4)734(93.4)208(93.3)0.6200.4310.0030.953是85(15.0)27(17.6)52(6.6)15(6.7)进行过牙体治疗否343(60.7)119(77.8)597(76.0)199(89.2)15.291<0.00118.406<0.001是222(39.3)34(22.2)189(24.0)24(10.8)父母接受过口腔健康指导否366(64.8)105(68.6)587(74.8)167(74.9)0.7900.3740.0010.973是199(35.2)48(31.4)198(25.2)56(25.1)两民族儿童不同口腔卫生习惯及保健间SECC患龋率差异比较结果显示，汉族儿童SECC患龋率在是否进行过牙体治疗的差异存在统计学意义（P＜0.001），且进行过牙体治疗（患龋率53.9%）的儿童SECC患龋率较高。在维吾尔族儿童中，SECC20 新疆医科大学博士学位论文患龋率在不同的开始刷牙年龄、每日刷牙频率、父母是否帮助刷牙、是否进行过牙体治疗、父母是否接受过口腔健康指导间SECC患龋率的差异均存在统计学意义（P＜0.001），其中，从不刷牙（患龋率49.3%）、每日不刷牙（患龋率50.2%）、父母未帮助刷牙（患龋率44.7%）、进行过牙体治疗（患龋率59.2%）的儿童SECC患龋率较高，详见表1.9。表1.9汉族和维吾尔儿童SECC口腔卫生习惯及保健的比较Table1.9ComparisonofOralhygienebehaviorsanddentalhealthcareofSECCinHanandUygurchildren汉族维吾尔族变量PPSECCNon-SECCSECCNon-SECC开始刷牙年龄＜3岁218(71.2)277(67.2)104(25.7)219(36.3)4岁53(17.3)73(17.7)77(19.0)127(21.0)3.8200.28220.546<0.0015岁11(3.6)12(2.9)59(14.6)88(14.6)不刷牙24(7.8)50(12.1)165(40.7)170(28.1)每日刷牙频率>1次/天210(68.6)268(65.0)134(33.1)264(43.7)1次/天89(29.1)121(29.4)4.9050.086154(38.0)224(37.1)16.837<0.001不刷牙7(2.3)23(5.6)117(28.9)116(19.2)父母帮助刷牙否197(64.4)278(67.5)297(73.3)368(60.9)0.7520.38616.607<0.001是109(35.6)134(32.5)108(26.7)236(39.1)使用含氟牙膏否260(85.0)346(84.0)375(92.6)567(93.9)0.1300.719.6420.423是46(15.0)66(16.0)30(7.4)37(6.1)进行过牙体治疗否168(54.9)294(71.4)279(68.9)517(85.6)20.729<0.00140.634<0.001是138(45.1)118(28.6)126(31.1)87(14.4)父母接受过口腔健康指导否205(67.0)266(64.6)316(78.2)438(72.5)0.4600.4984.1750.041是101(33.0)146(35.4)88(21.8)166(27.5)21 新疆医科大学博士学位论文2.5低龄儿童龋相关因素的Logistic回归分析2.5.1低龄儿童龋相关的变量及赋值将是否患ECC和SECC定义为二分类因变量，按民族因素进行分层，将单因素分析中有统计学意义的变量作为自变量纳入回归分析。回归分析中各自变量的赋值情况见表1.10。表1.10变量及赋值Table1.10Themeaningofthevariablesandtheassignmentmean变量赋值年龄3岁=（0,0），4岁=（1,0），5岁=（0,1）地域0=喀什市，1=伊宁市地区0=城市，1=农村看护者患龋0=否，1=是喂养习惯母乳喂养=（0,0），混合喂养=（1,0），人工喂养=（0,1）父亲文化程度0=文盲/小学，1=初中，2=高中/中专，3=大专/本科及以上母亲文化程度0=文盲/小学，1=初中，2=高中/中专，3=大专/本科及以上家庭年收入0=0-2，999，1=3，000-7，999，2=8，000-19，999，3=>20，000含糖食品的摄入频率0=>1次/天，1=1次/天，2=＜1次/天，3=不吃睡前进食0=经常，1=有时，2=否开始刷牙年龄0=＜3岁，1=4岁，2=5岁，3=不刷牙每日刷牙频率0=>1次/天，1=1次/天，2=不刷牙父母辅助儿童刷牙0=否，1=是进行过牙体治疗0=否，1=是父母接受过口腔健康指导0=否，1=是2.5.2ECC相关危险因素的Logistic回归分析在汉族儿童中，以年龄、看护者患龋、母亲文化程度、睡前进食、进行过牙体治疗为自变量，是否患ECC为因变量作Logistic回归分析，结果显示：4岁与3岁儿童相比，患ECC的危险性增加；5岁儿童与3岁儿童相比，患ECC的危险性增加。患龋看护者照顾的儿童ECC患病危险较高。母亲文化程度越低、睡前进食的频率越高，发生ECC的可能性越高。另外，进行过牙体治疗的儿童患ECC的可能性更高，详见表1.11。22 新疆医科大学博士学位论文表1.11汉族儿童ECC相关危险因素的Logistic回归分析Table1.11RiskindicatorsforECCofHanchildreninmultivariateanalysis95%CI2变量回归系数标准误S.E.WaldχP值OR值下限上限常量0.2500.5090.2410.6231.284年龄9.9710.007年龄10.6480.2427.1920.0071.9121.1913.070年龄20.7740.2618.8050.0032.1691.3013.618看护人患龋0.7660.2897.0400.0082.1511.2223.789母亲文化程度-0.2240.1123.9820.0460.7990.6410.996睡前进食0.4590.1737.0030.0081.5821.1262.222进行过牙科治疗0.8710.22015.716<0.0012.3891.5533.674在维吾尔族儿童中，以年龄、地域、看护者患龋、父亲文化程度、母亲文化程度、含糖食品的摄入频率、睡前进食、开始刷牙年龄、每日刷牙频率、父母辅助儿童刷牙、进行过牙体治疗为自变量，是否患ECC为因变量作Logistic回归分析，结果显示，随着年龄的增长，4岁、5岁儿童与3岁儿童相比，患ECC的危险性增加。伊宁市儿童患ECC的危险性高于喀什市儿童。患龋看护者照顾的儿童患ECC的危险性增高。家庭年收入越低、含糖食品摄入频率越高、睡前进食越频繁、开始刷牙年龄越晚或不刷牙、进行过牙体治疗的儿童患ECC的可能性越高，详见表1.12。表1.12维吾尔族儿童ECC相关危险因素的Logistic回归分析Table1.12RiskindicatorsforECCofUygurchildreninmultivariateanalysis95%CI2变量回归系数标准误S.E.WaldχP值OR值下限上限常量-1.2290.7202.9180.0880.292年龄17.722＜0.001年龄10.8580.24312.495＜0.0012.3571.4653.793年龄21.0820.27415.570＜0.0012.9491.7235.047地域1.2090.22628.591＜0.0013.3502.1515.218看护人患龋0.5540.2534.8050.0281.7401.0602.855家庭年收入-0.7470.10451.376＜0.0010.4740.3860.581含糖食品摄入频率0.6950.11238.244＜0.0012.0031.6072.496睡前进食0.6010.18710.3290.0011.8241.2642.630开始刷牙年龄-0.3410.10410.6910.0010.7110.5800.872进行过牙科治疗1.0180.27613.588＜0.0012.7671.6114.75423 新疆医科大学博士学位论文2.5.3SECC相关危险因素的Logistic回归分析在汉族儿童中，以地区、看护者患龋、父亲文化程度、母亲文化程度、喂养习惯、进行过牙体治疗为自变量，是否患SECC为因变量作Logistic回归分析，结果显示，农村地区儿童患SECC的危险性高于城市儿童。看护者患龋照顾的儿童患SECC危险高于看护着未患龋的儿童。母亲文化程度越高，儿童患SECC的可能性越低。与母乳喂养的儿童相比，混合喂养与人工喂养的儿童患SECC的危险性降低。进行过牙体治疗的儿童患SECC的可能性更高，详见表1.13。表1.13汉族儿童SECC相关危险因素的Logistic回归分析Table1.13RiskindicatorsforSECCofHanchildreninmultivariateanalysis95%CI2变量回归系数标准误S.E.WaldχP值OR值下限上限常量-0.5010.4361.3210.250.606地区0.4780.2174.8580.0281.6141.0542.469看护人患龋0.6190.19510.0920.0011.8571.2682.721母亲文化程度-0.3040.1206.4820.0110.7380.5840.932喂养方式8.8460.012喂养方式1-0.3650.1654.8870.0270.6940.5020.959喂养方式2-0.7530.3095.9440.0150.4710.2570.863进行过牙科治疗0.7360.16519.911＜0.0012.0871.5112.883在维吾尔族儿童中，以年龄、看护者患龋、父亲文化程度、母亲文化程度、家庭收入、含糖食品的摄入频率、睡前进食、开始刷牙年龄、每日刷牙频率、父母辅助儿童刷牙、进行过牙体治疗、父母接受过口腔健康指导为自变量，是否患SECC为因变量作Logistic回归分析，结果显示，看护者患龋照顾的儿童患SECC危险高于看护着未患龋的儿童。家庭年收入越低、含糖食品摄入频率越高、睡前进食越频繁、进行过牙体治疗和父母接受过口腔健康指导的儿童患SECC的可能性越大，详见表1.14。24 新疆医科大学博士学位论文表1.14维吾尔族儿童SECC相关危险因素的Logistic回归分析Table1.14RiskindicatorsforSECCofUygurchildreninmultivariateanalysis95%CI2变量回归系数标准误S.E.WaldχP值OR值下限上限常量-1.5950.5169.5600.0020.203看护人患龋0.7380.17018.806<0.0012.0911.4982.918家庭年收入-0.3530.07820.443<0.0010.7030.6030.819含糖食品摄入频率0.4050.08224.645<0.0011.5001.2781.760睡前进食0.3610.1347.2600.0071.4341.1031.864进行过牙科治疗1.0650.17935.498<0.0012.9012.0434.1172.5两民族儿童低龄儿童龋牙位分布情况1727名汉族和维吾尔族儿童低龄儿童龋分布见表1.15。低龄儿童龋在下颌乳磨牙，上颌乳中切牙以及上颌乳磨牙中分布最高，较少累及的是下颌乳侧切牙及乳尖牙。与汉族儿童相比，维吾尔族儿童乳磨牙患龋比例较高，而汉族儿童乳前牙患龋比例较高，见图1.1。表1.15汉族和维吾尔族儿童低龄儿童龋的牙位分布Table1.15ThedistributionofECCexperienceinHanandUygurchildren牙位55545352516162636465汉族2531764912832532112942175266维吾尔族3912524413830930413937260389牙位75747372718182838485汉族382282251718201622292412维吾尔族56340515132325171438450425 新疆医科大学博士学位论文图1.1汉族和维吾尔族儿童低龄儿童龋的牙位分布Figure1.1ThedistributionofECCexperienceinHanandUygurchildren2.6两民族儿童龋齿的充填情况两民族受检儿童的总龋齿数为7576颗，充填牙数130颗，充填率为1.72%。其中3岁组儿童充填率0.56%，4岁组儿童充填率1.51%，5岁组儿童充填率2.24%，汉族儿童充填率3.17%，维吾尔族儿童充填率0.6%；城市儿童充填率2.54%，农村儿童充填率0.75%，喀什市儿童充填率0.08%，伊宁市儿童为2.26%，差异均有统计学意义，见表1.16。26 新疆医科大学博士学位论文表1.16儿童龋齿充填率Table1.16Thefillingrateofdentalcaries2变量患龋牙数未充填牙数充填牙数充填率(%)χP值年龄（岁）389689150.56433773326511.5113.3570.001533033229742.24民族汉族327731731043.1772.760<0.001维吾尔族42994273260.60地区城市39133815982.5443.992<0.001农村36633641220.75地域喀什37913761300.7938.463<0.001伊宁378536851002.26合计757675761301.72注：充填率=（充填牙数/患龋牙数）×100%3讨论研究发现新疆3-5岁年龄组汉族和维吾尔族儿童ECC患病率（78.2%）明显高于[57]2015年全国3-5岁年龄组儿童平均患病率（62.5%）。其中，5岁年龄组儿童ECC患病率84.5%，不仅高于邻省和全国的调查结果，如青海71.4%，内蒙古73.8%，甘[58][57]肃55.8%，全国5岁年龄组71.9%，而且明显高于相邻发展中国家的报道，包[59][60][61]括巴基斯坦43.7%，印度58.6%和尼泊尔52%。上述研究中，仅巴基斯坦报道了SECC患病率为13%，本次调查两民族SECC患病率41.2%是其3倍，与印度[62]北部SECC（44.1%）的报道相近。患龋儿童的龋均较高，ECC龋均为5.61±3.56，SECC龋均为8.17±2.94，但龋齿充填率很低仅为1.72%，明显低于全国3-5岁组龋齿充填率（3.1%）。其中，3岁年龄组（0.56%），维吾尔族儿童（0.60%），农村儿童（0.75%）和喀什儿童（0.79%）的龋齿充填率低于1%。两民族儿童的高患龋率和低治疗率可能源于当地社会经济状况、不适宜的口腔医疗体系、有限的卫生人力资源27 新疆医科大学博士学位论文[53]及口腔健康教育等多种社会因素的影响。根据2014年新疆统计局的调查数据，当地政府卫生经费支出为160.91万元，仅占财政总经费的4.6%，而口腔健康经费更为低下。尽管没有准确的统计数据，但可知新疆90%以上的口腔诊疗费用并未纳入基本医疗保险，口腔诊疗经费主要由患者自己承担。而同年，新疆城镇居民家庭人均年收入为13585元，农村家庭人均年收入为7296元，大多数低收入家庭无力支付牙齿治疗的费用，这可能是当地儿童患龋率高和充填率低的原因之一。另外，新疆注册口腔执业医师及助理执业医师的人数共计2573，与当地总人口的比率仅为1：8800，[63]远低于大多数发达国家的平均值1：2000。执业牙医，尤其是儿童口腔专业人员的短缺，也是当地儿童龋病缺乏治疗的另一个重要原因。此外，两地政府、医疗卫生机构及组织极少开展公众口腔健康教育活动，口腔卫生保健，尤其是儿童口腔健康维护仍是大众健康教育的盲区。学校及幼儿园尚未实施任何安全有效的公共防龋措施，这些局限的社会因素加剧了当地低龄儿童龋的发生和发展。新疆3-5岁年龄组低龄儿童龋的综合防治仍是一个亟待解决的严重公共健康问题。[44,50,51,63,64,65]根据已有公认的或尚存争议的相关因素报道，社会环境、经济状况、饮食和行为因素是与低龄儿童龋相关的重要影响因素。本次调查中，较低的社会环境及经济状况（地区、父母亲文化程度低、家庭年收入低、儿童看护者患龋），不良饮食习惯（高频率的含糖饮食、经常睡前进食），不良口腔卫生保健行为（刷牙年龄较晚），以及缺乏口腔专科诊疗是影响两民族儿童ECC和SECC患病的危险因素。作为低龄儿童龋社会因素分析的变量，社会经济状况，包括父母文化程度、家庭收[66]入水平、职业等是低龄儿童龋患病率的重要影响因素。许多研究表明，低龄儿童龋的分布具有低社会经济群体的倾向，社会经济状况低的家庭，低龄儿童龋的患病[67-69]率明显较高。针对欧洲、非洲、亚洲、中东和北美洲低龄儿童龋流行病学情况[70][71]的综述显示，全球社会弱势群体的低龄儿童龋患病率高达70%。Junior等针对巴西东南部3-4岁儿童低龄儿童龋患病情况的横断面调查发现，患龋儿童中约80%来自无收入和低收入家庭，社会经济状况低下是巴西儿童低龄儿童龋发病的危险因[72]素之一。国内研究者对赣州市城市与农村学龄前女童的口腔健康状况进行流行病学调查发现，农村3-5岁低龄儿童龋患病率明显高于城市女童，农村学龄前女童的健康水平也明显差于城市学龄前女童。低龄儿童患龋率与营养不良水平呈正比，即营养不良的儿童其龋齿患病率高于健康女童。收入及文化程度低的家庭对生活质量的要求较低，家长对口腔健康状况缺乏关注，不能为儿童提供适宜的口腔专科检查及治疗，难以保证儿童饮食营养平衡，甚至贫困家庭的生活环境不利于儿童的健康[66,73]发育。家长，特别是母亲的教育会直接或间接影响儿童口腔健康行为的形成和[74,75]对口腔保健的信念和态度。母亲和看护者在培养孩子的牙齿健康行为，包括刷牙、牙齿护理和饮食习惯方面起着至关重要的作用。文化程度低的父母缺乏对口腔28 新疆医科大学博士学位论文健康知识的认知和行为指导能力，自身口腔卫生维护欠佳，健康观念淡薄，指导儿童建立口腔健康行为的能力较弱，儿童容易糖摄入量高，刷牙年龄晚或方法不正确，[76-77][78]患龋率高。Kim应用社会-心理-行为的联合概念模式论证了较低的社会经济状况、种族差异和低下的受教育水平会影响母亲的心理健康，导致其不正常的育儿行为，使儿童陷入患低龄儿童龋的危险。部分流行病学调查结果还发现了低龄儿童龋[79]的患病率存在地域以及民族群体分布的差异性。唐红萍等通过对云南省15个特有少数民族1-6岁儿童乳牙龋病进行流行病学调查，结果发现不同民族低龄儿童龋在民族间、地区间的分布差异具有统计学意义。其中，傈族的乳牙患龋率最高（53％），拉祜族最低（13.4%）；不同地区以玉溪市最高（56.1%），普洱市最低（13.4%）。美[80]国联邦疾病控制和预防中心针对2-5岁低龄儿童龋的调查显示，墨西哥裔美国儿童的低龄儿童患龋率（55.4%）高于黑人儿童（43.4%）和非西班牙裔白人儿童（38.6%）。上述研究说明不同地区、不同民族背景等社会环境因素可能对儿童口腔健康有着不同程度的影响。本次调查的结果显示，新疆3-5岁年龄组儿童ECC和SECC总体患病率在汉族（78.7%）和维吾尔族（77.9%）间差异无统计学意义，但按民族因素分层进行龋相关因素分析发现，社会环境及经济状况在两民族儿童中的分布及对两民族低龄儿童龋患病率的影响存在异同。与以往研究结果相一致的是，本次调查中生活于农村，看护者患龋，母亲文化程度及收入较低家庭的汉族与维吾尔族儿童，ECC及SECC的患病率均较高。其中，母亲文化程度低是汉族儿童ECC及SECC的危险因素，家庭收入低是维吾尔族儿童ECC及SECC的危险因素，看护者患龋是两民族儿童ECC及SECC的共同危险因素。地区和社会经济状况在两民族低龄儿童龋的分布和影响上有所不同。汉族患ECC和SECC的儿童主要分布在伊宁市，城市居住，年收入较高的家庭，而维吾尔族患ECC和SECC的儿童主要分布在喀什市、农村居住、年收入较低的家庭。其中，两民族儿童ECC和SECC患龋率在伊宁市均高于喀什市，但维吾尔族儿童在伊宁市的ECC患龋率增高显著，患龋风险性更高，而汉族儿童在两市的患龋率差异无统计学意义。在农村生活的儿童中，汉族儿童患SECC的危险性高于城市儿童，而维吾尔族儿童在城乡的患龋率差异无统计学意义。家庭低收入是影响维吾尔族儿童患ECC和SECC的危险因素，但在汉族儿童中患龋率的差异无统计学意义。两民族低龄儿童龋在地区分布上的差异可能与不同的区域水氟含量及民族饮食文化相关。氟是人体所需的微量元素之一，适宜的氟浓度可以促进牙釉质的[81]再矿化，抑制口腔致龋菌的代谢、生长及产酸，对龋病预防有重要的作用。人体[82]氟的主要来源是饮水，针对饮用水氟含量与居民龋均数据的相关性分析显示，当水氟浓度在安全范围内时，龋均与饮用水氟浓度之间存在负相关关系，即适度饮水氟化可以有效降低龋均，饮水氟浓度在0.8～1.2mg/L之间时，其人群患龋率最低；29 新疆医科大学博士学位论文当饮用水氟浓度低于安全临界点时，随着水氟浓度的升高，各年龄组龋均都呈现下降的趋势，但超过安全临界点时，龋均将与饮用水氟浓度呈正相关关系，不仅可以导致氟中毒的现象，龋病的发病率也会上升。我国较适宜的饮水氟浓度为0.7-1.0[83]mg/L。新疆喀什地处新疆西南部高氟地区，通过改水降氟处理后，喀什市饮水氟[84]化物含量均值为0.6mg/L；而伊宁市位于新疆西北部，城市饮水氟化物含量均值[85]为0.28mg/L，为低氟地区（＜0.3mg/L），较低的饮水氟浓度可能是伊宁市儿童ECC患龋率明显高于喀什市儿童的原因。另外，喀什地区维吾尔族喜饮高氟的地方性药茶或砖茶，其茶氟含量均值为1.36mg/L，特殊的饮食习惯可能也是维吾尔族儿童呈现出地区性差异的原因。年龄也是两民族3-5岁儿童ECC患病共同的危险因素。研究发现，随着年龄的增长两民族儿童患ECC的危险性增加。3-5岁是乳牙患龋率的快速上升期，也是儿童建立良好自我口腔保健行为和意识的关键期。这一阶段儿童的饮食、口腔卫生习[86]惯及预防性口腔健康检查等行为因素与ECC患病密切相关。相关研究已发现，含糖饮食的摄入量及摄入频率的增加是ECC患病的一个主要危险因素，随着年龄的增长，儿童ECC的患病率与糖摄入量的增加显著相关。在喜食碳水化合物、甜食或碳酸甜饮，习惯含奶瓶入睡或奶瓶喂养时间过长等高风险的致龋状态下，乳牙龋坏的[87,88]发生和严重程度会随着暴露时间的增长而不断增加。本次调查中，经常睡前进食是两民族儿童ECC及SECC患病共有的危险因素。而维吾尔族患龋儿童在含糖食品摄入高频率的分布居多，其ECC及SECC患病的危险亦明显增加。另外，一项系统评价显示母乳喂养超过1岁或习惯夜间喂养与ECC患病率的高发密切相关。而早期督导和帮助儿童有效刷牙，控制菌斑，建立良好的口腔卫生习惯则是儿童防龋的[89]最佳方法。本次调查中，汉族母乳喂养的儿童患SECC的危险性高于混合喂养与人工喂养的儿童。而维吾尔族儿童由于日常不刷牙或刷牙年龄较晚的者居多，ECC及SECC患病率和患病危险亦明显增加。预防性口腔专科检查及治疗是儿童ECC及SECC的保护因素，其对口腔健康促[90]进和疾病预防的直接作用从根本上优于修复性治疗。目前，未被治疗的乳牙龋坏[91]仍是全球最为常见的状况。本次调查中，新疆3-5岁儿童龋齿充填率仅为1.72%，其中维吾尔族儿童龋齿充填率仅为0.6%。在已接受过口腔专科治疗的儿童中预防性检查者仅为5.2%，绝大部分儿童是因牙齿疼痛、肿胀、外伤等原因就诊。家长通常不知道儿童牙齿已龋坏，很多家长认为乳牙龋坏不严重，以后会被替换不需要治疗。被调查的大部分家长，特别是少数民族家长由于语言的障碍对儿童乳牙的重要性和口腔保健知识的了解甚为匮乏。多数患龋儿童的父母是在儿童进行牙体治疗时首次接受口腔健康的相关指导，因此本次调查结果中，进行过牙体治疗及父母接受过口30 新疆医科大学博士学位论文腔健康指导的儿童与ECC患病率呈正相关。这一现象也说明当地儿童家长缺少口腔预防性检查的意识和教育，儿童龋病的治疗有很高的症状趋使性，医疗机构及牙科[51,92]医生在龋病预防策略中没有起到充分的作用。这也是导致低龄儿童龋患病率高，治疗率低的原因之一。家长和看护者是低龄儿童口腔卫生保健的主要承担者，目前两地家长及幼儿园教师对儿童口腔卫生保健意识薄弱、防护知识欠缺，因此，加强家长和幼儿园老师对儿童口腔卫生保健的认知和监督能力是当地低龄儿童口腔预防保健的重点。建议地方政府及口腔健康机构应尽早组织开展学龄前儿童乳牙龋病的群体防治工作，并重点加强家长及幼教机构的口腔健康教育培训，充分利用大众媒体、网络平台组织多种形式和多民族语言的口腔健康教育活动，出版多民族语言的宣教资料，以增强各族民众对口腔健康的意识和保健能力。在牙位分布上，新疆3-5岁儿童乳牙龋损左右对称，患龋率最高的是下颌第二乳磨牙，其次是下颌第一乳磨牙、上颌第二乳磨牙、上颌乳中切牙和上颌第一乳磨牙，较少累及的是下颌乳侧切牙和乳尖牙。在民族分布差异上，维吾尔族儿童乳磨牙患龋率较高，而汉族儿童乳前牙患龋率较高。本研究中龋齿好发牙位的分布情况与儿[93]童龋病发展的普遍规律相一致。上颌乳中切牙萌出时间早，在口腔中暴露时间长，不当喂养及未有效刷牙等不良习惯易增加其不洁区的患龋率。汉族儿童睡前奶瓶进食者较多，可能是中切牙患龋率较高的原因。另外，两民族儿童龋齿牙位分布的差异也可能与不同民族儿童口腔菌群构成及多样性的差异相关，有待进一步进行口腔菌群微生物的对比研究。以上结果提示，3-5岁儿童防龋重点牙位是上、下颌乳磨牙[94]和上颌乳中切牙，建议早期采用窝沟封闭联合局部涂氟等综合措施进行有效预防。[95]牙齿萌出后，使用小剂量的氟化物牙膏帮助儿童正确刷牙是有效的家庭防龋方法。作为一项横断面调查，本结果反映了两民族低龄儿童龋相关社会及行为等因素的病因线索，但尚不能就此得出因果关系的结论，各种相关因素与两民族儿童ECC及SECC的关系仍需进行长期的纵向观察和宿主口腔菌群多样性的分析，以期获得更全面的了解。另外，调查问卷的资料是通过家长的回忆得出，存在回忆偏倚及报告偏倚。今后课题组预在此研究基础上继续完善疆内各地区不同民族儿童ECC的流行病学调查数据和资料，为全疆学龄前儿童龋病的群体防治提供更为全面的参考依据。4小结新疆3-5岁汉族和维吾尔族儿童ECC及SECC患病率高，发病年龄早，充填率低。两民族间低龄儿童龋患病率无统计学差异，但相关因素对低龄儿童龋的影响存在民族差异性。低龄儿童龋在儿童乳磨牙和上颌乳中切牙中分布最高，且存在民族31 新疆医科大学博士学位论文分布差异，其中，维吾尔族儿童乳磨牙患龋率较高，而汉族儿童乳前牙患龋率较高。年龄、农村生活、母亲受教育水平低下、母乳喂养、儿童看护者患龋、经常睡前进食以及缺乏口腔专科诊疗等因素是汉族儿童ECC和SECC患病的危险因素。年龄、地域、家庭收入低、儿童看护者患龋、高频率的含糖饮食、经常睡前进食、不刷牙或刷牙年龄较晚以及缺乏口腔专科诊疗等因素是维吾尔族儿童ECC和SECC患病的危险因素。32 新疆医科大学博士学位论文第二部分汉族和维吾尔族重度低龄儿童龋牙菌斑菌群结构和多样性的对比研究低龄婴幼儿龋是一种以细菌为主的多因素感染性疾病。除了社会环境、经济状况、饮食和行为等相关危险因素的共同作用以外，菌斑微生物的存在是龋病发生、发展的先决条件和关键因素。外界因素可能通过影响宿主口腔微生态的平衡，成为龋病发生的危险因素。因此，对菌斑微生物菌群结构及特征的研究一直是探索龋病[96]病因及机制研究关注的焦点。基于16SrRNA基因二代测序技术在现代口腔微生态研究的应用和发展，为我们获取口腔微生物物种全基因序列信息和多样性研究提供了最新手段和技术。以往同类研究通过该技术探讨了不同成长阶段患龋儿童菌斑微[27][97][98]生物群落的特点（乳牙萌出期，乳牙列期，混合牙列期），双胞胎儿童不同患[99][100]龋状态下菌斑微生物的特点，龋病在不同进展阶段菌斑微生物的多样性，以及[101]重度低龄儿童龋治疗前后的菌群变化等。这些研究结果显示了不同状态下患龋和无龋儿童牙菌斑菌群构成和丰度存在的差异，以及菌斑微生物群落中存在的核心菌[102]群，核心微生物组在不同个体的不同口腔生态位点具有强烈的生境特异性，它们[103]可能是龋病潜在的生物标志物。因此，更全面地了解不同个体的菌斑微生物群组成和多样性，对认知低龄儿童龋的病因及进展有着深远的影响。本次流行病学调查结果显示，3-5岁汉族和维吾尔族低龄儿童龋及重度低龄儿童龋患病率均较高，属于龋高风险人群；地区、饮食、口腔卫生习惯等相关危险因素对两民族儿童ECC及SECC患病率的影响有所不同，另外，龋齿牙位分布的比例也存在民族间差异。研究此类具有地域和民族性特点的龋高危人群口腔微生物群落结构及多样性，综合分析宿主、口腔微生物与龋病的关系，有利于为当地低龄儿童龋的病因探索及综合防治提供实验依据。本研究以汉族和维吾尔族重度低龄儿童龋为研究对象，选取患龋比例最高的乳磨牙颊面及邻面位点龈上菌斑采集样本，利用IlluminaMiSeq高通量测序技术进行微生物群落构成和多样性分析，以期获得不同民族重度低龄儿童龋特菌斑微生物群落特征及其与龋病之间关系的相关实验资料。1材料与方法1.1研究对象根据美国儿童牙科学会推荐的重度低龄儿童龋（Severeearly-childhoodcaries，[104]SECC）定义标准，在喀什市2所公立幼儿园筛选4-5岁汉族和维吾尔族SECC儿33 新疆医科大学博士学位论文童各15名（其中4岁儿童dmft≥5，或5岁儿童dmft≥6），无龋儿童各15名（dmft=0）。纳入标准：全身健康无系统性疾病；无口腔粘膜和牙周疾病；无牙釉质或牙本质矿化不全；未佩戴正畸矫治器及附件；取样前2周未接受抗生素治疗，或氟化物涂布等龋病防治治疗。由一名牙科医生通过视诊及探诊对全口乳牙列进行检查。依据[55]WHO（1997）龋病诊断标准记录乳牙龋失补牙指数（dmftindex）。受试者未被采用X线影像检查。研究经新疆医科大学第一临床医学院伦理委员会审核批准（20131212-02），所有被纳入儿童的监护人在样本采集前均已了解本研究的目的、计划及采样流程，并签署知情同意书。1.2龈上菌斑样本采集取样当日早晨不刷牙，样本采集于早饭后2小时，采样前要求儿童清水漱口。用无菌刮匙刮取乳磨牙颊面及邻面位点的龈上牙菌斑，立即置入装有1ml磷酸盐缓冲液的1.5ml无菌冻存管中，编号标记，并迅速冻存于-4°C转运箱内，送至佰美基因国家微检测系统工程技术研究中心（NationalEngineeringResearchCenterforMiniaturizedDetectionSystems）进行基因组DNA提取及测序分析。1.3牙菌斑基因组DNA提取室温下解冻样本，12000rpm/min离心10min，去净上清液，收集菌斑沉淀用于DNA提取。使用QIAampDNAMiniKit（Qiagen，Hilden，GER）试剂盒，根据标准流程提取细菌基因组DNA。使用分光光度仪NanoDropND-2000（ThermoFisherScientific，USA）和1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的纯度、浓度及完整性。检测合格的DNA进行后续测序实验。1.4高通量测序采用16SrRNA通用引物序列（341F5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG，805R5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTA[98]TAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC）进行样本16SrRNA基因V3-V4区PCR扩增。反应体系20µl：1×reactionbuffer，2mMMg2+，0.2mMdNTP，0.1µM上下游引物，1UTaqpolymerase（Pyrobest,Takara,Japan），2µl模板DNA（10ng/ul），加无菌双蒸水至反应总体系。扩增反应条件：95℃预变性2min，35个循环（94℃20sec，55℃40sec，72℃60sec）后，72℃延伸2min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，应用AgencourtAMPureXP（BeckmanCoulter，Inc，USA）磁珠法，纯化回收目的DNA片段。添加样本特异性标签序列扩增引物（F：NexteraXTIndexPrimer1，R：NexteraXTIndexPrimer2）（Illumina，Inc，SanDiego，CA）扩增。反应体系20µl：1×reactionbuffer，0.3mMdNTP，0.25µMindexprimer，1UDNApolymerase（NEB，Q5TM，USA），1µl模板DNA（10ng/ul），加无菌双蒸水至反应总体系。反应条件：98℃预变性30sec，11个循环（98℃10sec，65℃30sec，72℃34 新疆医科大学博士学位论文30sec）后，72℃延伸5min。再次纯化回收扩增产物，利用SYBR®PremixExTaq™（Qiagen）体系进行文库构建，构建好的文库经定量检测后，杂交到MiSeqBenchtopSequencer（Illumina，Inc，SanDiego，CA）测序平台进行双端测序分析。1.5生物信息学分析1.5.1序列质量控制应用QIIME（QuantitativeInsightsIntoMicrobialEcology）软件包（Version1.8.0）[105]对原始序列数据进行去杂及拼接处理，根据barcode标签序列对拼接后的样本进行有效序列识别，去除低质量碱基序列，包括：平均质量＜Q20（即碱基准确率为99%）的碱基序列、片段长度＜200bp的序列、总碱基错配率高于1的序列，以及模[106]糊碱基序列。应用USEARCH软件去除嵌合体序列。1.5.2OUT聚类及注释按97%的相似度将所获得的优质序列进行可操作分类单元（OperationalTaxonomicUnite，OTU）聚类，并统计各样本包含的OTU种类及每个OTU中含有的序列比例。然后，通过BLAST分类算法将所筛选的OTU代表序列与人类口腔微[107]生物组数据库（HumanOralMicrobiomeDatabase，HOMD）比对和分类注释。物种分类水平包括6级，分别为门（Phylum）、纲（class）、目（order）、科（family）、属（genus）、种（species）水平，并对每个样本中所存在的物种单元分类进行序列丰度的统计。1.5.3数据分析测序深度和αlpha多样性分析：通过OTU稀释性曲线（Rarefactioncurves）、丰度分布曲线（RankAbundance）、丰度指数（Chao1index）、多样性指数（ShannonWienerindex、Simpsonindex）和测序深度指数（Good’scoverageindex）比较汉族和维吾尔族儿童牙菌斑样本取样的合理性及菌群多样性。Beta多样性分析：利用各样本序列间的进化关系及丰度信息来计算样本间距离，反映样本组间是否具有显著的微生物群落差异。本研究通过基于WeightedUnifrac距离矩阵的组间比较和主坐标分析（principalco-ordinatesanalysis，PCoA）比较汉族和维吾尔族儿童4组菌斑样本菌群构成的相似性。物种丰度分析：在门、属、种不同分类水平进行汉族和维吾尔族儿童牙菌斑微生物构成及差异的比较，应用线性判别分析（LinearDiscriminantAnalysisEffectSize，LEfSe）进行两民族儿童牙菌斑微生态中核心微生物菌群（即各组中样本100%均存在的物种）丰度的差异性比较，相对丰度＞0.1%的物种均被纳入。1.6统计学处理计量资料及多样性指数的比较采用t检验，组间菌群丰度的差异性比较采用方差分析的SNK和LSD法，检验效能α=0.05。以上统计分析均通过SPSS21.0统计软件35 新疆医科大学博士学位论文[97]完成。LEfSe分析首先采用非参数Kruskal-Wallis秩和检验，检测各组特定分类水平下丰度差异显著的物种，再用Wilcoxon秩和检验进行差异分析；然后再采用线性判别分析（LDA）估算各组差异显著物种的丰度对差异效果的影响力，设定LEfSe的α值为0.05，LDA阈值为0.2。2结果2.1样本资料及测序数据分析研究共采集4-5岁汉族和维吾尔族儿童乳磨牙颊面及邻面位点龈上菌斑样本60份。其中，汉族儿童健康对照组（CFH组）、汉族儿童SECC组（SCH组）、维吾尔族儿童健康对照组（CFU组）、维吾尔族儿童SECC组（SCU组）各15份。其中，SECC组儿童dmft指数最高值为10，最低值为5，龋均6.5±1.46。各组研究对象的年龄和性别分布未见显著性差异，详见表2.1。高通量测序分析结果显示，60个样本共获得3622965条有效序列，序列长度主要分布于440-479bp之间，平均长度约为460bp（图2.1）。3219033条优质序列通过质量控制，范围31056从到75343，约占总序列数的88.9%。按照97%的相似性对各样本优质序列进行OUT聚类，共得到18928个OTUs，样本平均OTUs为3114，范围从1425到4339。其中，汉族儿童菌斑样本共有16173个OTUs（CFH组：12943个OTUs，SCH组：11963个OTUs），维吾尔族儿童菌斑样本中有17417个OTUs（CFU组：14209个OTUs，SCU组：13235个OTUs）。组间比较可见，优质序列数各组差异无统计学意义；分类的OTU数量在CFU组与SCU组（P=0.027）、CFU组与CFH组（P=0.044）的差异均有统计学意义（表2.2）。图2.1优质序列长度分布图Figure2.1Thedistributionofcleansequenceslength36 新疆医科大学博士学位论文表2.1样本基本信息和序列信息统计表Table2.1InformationandsequencingdataofsampleSampleSexAge（month）dmftRawreadsnumCleanreadsnumOTUsnumCFU1female51064905582883840CFU2male59057519515322970CFU3female51057763510972610CFU4female53066439587973930CFU5male52062244561813535CFU6male54060743542583658CFU7female53070148627464193CFU8male54064242578143486CFU9female52056856505592515CFU10male54056339504002571CFU11male47057258519013529CFU12female57062981566044014CFU13male64063758577593295CFU14female56062550558513707CFU15male50063602566163451SCU1female54564341572052899SCU2male55553143472443059SCU3male53551012445792892SCU4male57567359604703806SCU5female48563979536372461SCU6female56754089480192630SCU7male57555268499743476SCU8male51864019565002412SCU9male48851719447223085SCU10female51756553500353843SCU11female48565112584313844SCU12female49535513310562521SCU13female60868628611093660SCU14female6065755450210254937 新疆医科大学博士学位论文SampleSexAge（month）dmftRawreadsnumCleanreadsnumOTUsnumSCU15male48659478528572896CFH1female48057164508083144CFH2female51063011557832249CFH3male54053937486182971CFH4male55054843492513011CFH5female51063319567123645CFH6male56065209573093492CFH7male57048575424452265CFH8female53065861592443380CFH9male57041251367571591CFH10female54075010672913015CFH11male57061518548613177CFH12female56062891560313003CFH13female51058495523232879CFH14female55052721471553367CFH15male51062545559043725SCH1male56856512498682846SCH2female54967570590622209SCH3male55857852514113339SCH4female581072935644922714SCH5female51656121493712933SCH6female54563300547122068SCH7female53666696592282928SCH8male57585041753432945SCH9male48658797521373266SCH10male57760855540113751SCH11male48762245556603004SCH12male51962682562102590SCH13female52662906560192974SCH14male51749883440692654SCH15male5465810650497142538 新疆医科大学博士学位论文表2.2汉族和维吾尔族健康及重度低龄龋儿童优质序列和OTUs的比较Table2.2ComparisonofcleanandOTUsofhealthandSECCinHanandUygursIndex/GroupCFUSCUCFHSCHP1P2P3P4Cleanreads558715169753052557900.0760.1990.3210.156Mean(SEM)(975.27)(2209.74)(1909.48)(2448.27)OTUs35173069309527760.0270.0440.1330.152Mean(SEM)(137.50)(175.50)(148.32)(129.94)注：P1值为CFU组与SCU组的比较；P2值为CFU组与CFH组的比较；P3值为CFH组与SCH组的比较；P4值为SCU组与SCH组的比较。2.2多样性分析2.2.1稀释性曲线（Rarefactioncurves）稀释性曲线可以用来比较物种丰度和说明测序深度是否合理。一般采用对优化序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建曲线。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多数据量对发现新的OTU的边际贡献很小；反之则表明样本中还存在较多未被测序检测到的物种，继续增加测序数据量还可能发现较多新的OTU。图2.2是4组样本在97%相似性水平下的稀疏曲线，每条曲线代表一组样本，以不同颜色标记。图中横轴为样本随机抽取的测序数据量，纵轴为基于该测序量构建的OTU数量。随着测序深度的增加，OTU的数量也相应增加。稀释曲线显示维吾尔族儿童健康对照组和SECC组的物种丰度最高且相似，而汉族儿童SECC组的样本丰度相对最低。各组样本的曲线尚未趋向平坦，说明在当前测序深度下，菌斑微生物菌群的多样性尚未达到完全饱和，加大测序深度能够进一步增加物种的丰富程度。图2-2样本稀释曲线Figure2-2Rarefactioncurves39 新疆医科大学博士学位论文2.2.2丰度分布曲线（RankAbundance）Rank-abundance曲线可用来解释物种的丰度和均匀度。构建方法是统计单一样品中每一个OTU所含的序列数，将OTU按丰度（所含有的序列条数）由大到小等级排序，再以OTU等级为横坐标，以每个等级的OTU中所含的序列数（也可用该等级OTU中序列数的相对百分含量）为纵坐标做图。在水平方向，物种的丰度由曲线的宽度来反映，物种的丰度越高，曲线在横轴上的范围越大；曲线的形状（平滑程度）反映了样品中物种的均度，曲线越平缓，物种分布越均匀，反之，则表示样本中优势菌群占比较高，物种分布均匀性较低。图2.3中4组样本的Rank-abundance曲线均趋于平坦，且横轴曲线趋于较宽，说明各组样本物种的组成较为丰富，均匀程度也较高。图2.3样本丰度分布曲线Figure2.3RankAbundancecurve2.2.3αlpha多样性分析本研究选取的αlpha多样性评估指数包括：Chao1，Simpson，Shannon，Good'scoverage。用于评估的OTU相似水平为97%。Chao1是计算菌群丰度的指数，指数越大，说明群落丰度越高。Simpson、Shannon是计算菌群多样性的指数，Simpson指数值越大，说明群落多样性越低；而Shannon值越大，说明群落多样性越高。Good'scoverage是测序深度指数，表示各样品文库的覆盖率，其数值越高，说明样本中序列没有被测出的概率越低，可以反映测序结果是否代表样本的真实情况。4组样本的多样性指数对比分析结果见表2.3。40 新疆医科大学博士学位论文表2.3αlpha多样性指数的分析Table2.3TheanalysisofalphadiversityindexIndex/GroupCFUSCUCFHSCHP1P2P3P4Chao165935709575152630.020.0470.2910.291Mean(SEM)(274.65)(293.0)(306.46)(278.31)Shannon6.3856.1376.2505.8770.0120.0910.0110.085Mean(SEM)(0.05)(0.09)(0.05)(0.10)Simpson0.0050.0070.0060.0100.0050.0820.0340.143Mean(SEM)(0.00)(0.00)(0.00)(0.00)Good'scoverage0.9700.9710.9730.9750.4930.0730.2110.065Mean(SEM)(0.00)(0.00)(0.00)(0.00)注：P1值为CFU组与SCU组的比较；P2值为CFU组与CFH组的比较；P3值为CFH组与SCH组的比较；P4值为SCU组与SCH组的比较。Chao1指数（图2.4A）Shannon指数（图2.4B），Simpson指数（图2.4C），Good'scoverage指数（图2.4D）的结果表明，丰度指数Chao1在CFU组分别高于SCU组（P=0.02）和CFH组（P=0.047），差异有统计学意义；多样性指数Shannon和Simpson在CFU组高于SCU组（P=0.012,P=0.005），同时，在CFH组高于SCH组（P=0.011,P=0.034），差异均有统计学意义；提示维吾尔族健康对照组丰度最高，而且两民族口腔健康组儿童菌斑菌群的多样性均高于SECC组。测序深度指数Good'scoverage的覆盖率估计值均在95%以上，且4组间无统计学差异，表明目前各组的测序深度相一致，且能够满足菌斑菌群多样性的研究。AB41 新疆医科大学博士学位论文CD图2.4汉族和维吾尔族儿童样本多样性指数的对比（A.Chao1指数B.Shannon指数C.Simpson指数D.Coverage指数）Figure2.4ComparisonofdiversityestimationinHanandUygurschildren（A.Chao1indexB.ShannonindexC.SimpsonindexD.Coverageindex）2.2.4Beta多样性分析主坐标分析（principalco-ordinatesanalysis，PCoA）是基于距离矩阵寻找主坐标的降维分析，可通过提取数据中最主要的元素和结构，观察个体或群体在物种数量和种类上的差异。本研究基于加权距离矩阵Weightedunifrac对两民族4组样本的OTU组成进行主坐标分析。图中一个点代表一个样品，不同颜色代表不同分组。PC1和PC2为距离矩阵中最主要的坐标，其值代表特征向量解释变异的大小。样品间群落组成越相似，散点间的距离就越接近。图2.5结果显示，两民族4组样本的总体分布趋于分离，提示汉族和维吾尔族儿童健康对照组与SECC组的牙菌斑菌群结构存在差异性。图2.5基于加权距离矩阵Weightedunifrac的PCoA分析图Figure2.5PCoAbasedontheweightedUniFracdistances42 新疆医科大学博士学位论文基于加权距离矩阵Weightedunifrac进行4组样本之间的两两比较。图2.6结果显示，SCH组内的样本间距离较远、差异较大，而CFH和CFU组内样本间的相似性较好，4组样本之间差异均有统计学意义（P＜0.05），其中，CFH组和CFU组之间差异较小。图2.64组样本加权距离矩阵的比较（*p<0.05,**p<0.01）Figure2.6ComparisonoftheweightedUniFracdistanceoffourgroups(*p<0.05,**p<0.01）2.3菌群构成分析2.3.1物种注释通过HOMD比对分析，4组样本的18928种OTU在97%相似水平被分类为11个菌门，20个菌纲，30个菌科，58菌目，117菌属和443个菌种，见表2.4。表2.460个样本微生物检出分类的数量关系Table2.4Thequantitativerelationofmicrobialclassificationof60samplesPhylum（门）Class（纲）Order（目）Family（科）Genus（属）Specis（种）Firmicutes（厚壁菌门）341752138Fusobacteria（梭杆菌门）112231Proteobacteria（变形菌门）512182969Bacteroidetes（拟杆菌门）3361197Actinobacteria（放线菌门）1361151TM7（候选菌门）112511Spirochaetae（螺旋菌门）111132SR111113GN0222223Synergistetes（互养菌门）11226Tenericutes（柔膜菌门）1111243 新疆医科大学博士学位论文2.3.2汉族和维吾尔族儿童口腔健康及重度低龄龋菌斑菌群构成的对比分析2.3.2.1菌门水平的构成及差异两民族4组样本共检出11个菌门，其中优势序列（相关丰度>1%）主要分属于6个菌门（约占总序列的99.5%），按丰度大小，汉族儿童组依次排列为：厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes），候选菌门（TM7）。而维吾尔族儿童组依次排列为：厚壁菌门（Firmicutes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、候选菌门（TM7）（图2.7，2.8）。另外，螺旋体菌门（Spirochaetes）、SR1、GN02、互养菌门（Synergistetes）和柔膜菌门（Tenericutes）在4组样本中亦有较低丰度的检出（0.447%-0.004%）。图2.7菌门水平的物种分布Figure2.7Distributionofthedifferentbacteriaatthephylumlevel图2.8优势菌门的分布Figure2.8Distributionofdominantphylum44 新疆医科大学博士学位论文差异分析结果可见，厚壁菌门（Firmicutes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）和SR1等5个菌门的丰度在汉族和维吾尔族儿童各组间差异有统计学意义（P＜0.05）。在龋病相关分布上，优势菌门中，梭杆菌门（Fusobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和SR1的丰度在两民族儿童健康对照组均高于SECC组（P＜0.05）；放线菌门（Actinobacteria）的丰度在两民族儿童SECC组均高于健康对照组（P＜0.05），差异有统计学意义；厚壁菌门（Firmicutes）的丰度在维吾尔族儿童SECC组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001），在汉族儿童SECC组也高于健康对照组，但差异无统计学意义（P=0.398）。变形菌门（Proteobacteria）和TM7菌门的丰度在两民族各组样本中未见显著差异（P>0.05）。另外，低丰度的GN02菌门的丰度在维吾尔族儿童健康对照组高于SECC组（P=0.026），螺旋体菌门（Spirochaetes）的丰度在汉族儿童健康对照组高于SECC组（P=0.001），差异均有统计学意义（图2.9）。图2.9菌门水平菌群的差异比较Figure2.9Comparisonofthemicrobialvariationsatthephylumlevel在民族差异性上，健康对照组中，厚壁菌门（Firmicutes）的丰度在汉族儿童高于维吾尔族儿童，差异有统计学意义（P=0.01）；SECC组中，各菌门在汉族与维吾尔族儿童间差异无统计学意义（图2.10）。45 新疆医科大学博士学位论文图2.10菌门水平汉族和维吾尔族SECC组菌群的差异比较Figure2.10ComparisonofthemicrobialvariationsofSECCinHanandUyguratthephylumlevel2.3.2.2菌属水平的构成及差异菌属水平上，两民族儿童4组菌斑样本共检出117个菌属，其中，丰度>1%的优势菌属共有19个（约占总序列的89.1%），汉族儿童组检出18个（占90.6%），按丰度依次排列为：链球菌属（Streptococcus），纤毛菌属（Leptotrichia），二氧化碳嗜纤维菌属（Capnocytophaga），奈瑟菌属（Neisseria），棒状杆菌属（Corynebacterium），韦荣菌属（Veillonella），梭杆菌属（Fusobacterium），放线菌属（Actinomyces），劳特罗普氏菌属（Lautropia），普氏菌属（Prevotella），新月形单胞菌属（Selenomonas），TM7-[G-1]，罗斯菌属（Rothia），卟啉单胞菌属（Porphyromonas），弯曲菌属（Campylobacter），球杆菌属（Aggregatibacter），嗜血杆菌属（Haemophilus），Terrahaemophilus。维吾尔族儿童组检出19个（占88.6%）按丰度依次排列为：纤毛菌属（Leptotrichia）、链球菌属（Streptococcus）、梭杆菌属（Fusobacterium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、奈瑟菌属（Neisseria）、二氧化碳嗜纤维菌属（Capnocytophaga）、普氏菌属（Prevotella）、韦荣菌属（Veillonella）、放线菌属（Actinomyces）、劳特罗普氏菌属（Lautropia）、新月形单胞菌属（Selenomonas）、卟啉单胞菌属(Porphyromonas）、TM7-[G-1]、罗氏菌属（Rothia）、弯曲菌属（Campylobacter）、球杆菌属（Aggregatibacter），嗜血杆菌属（Haemophilus），Terrahaemophilus，乳杆菌属（Lactobacillus）（图2.11，2.12）。46 新疆医科大学博士学位论文图2.11菌属水平的物种分布（相关丰度>0.1%）Figure2.11Distributionofthedifferentbacteriaatthegenuslevel（relativeabundant>0.1%）图2.12优势菌属的分布Figure2.12Distributionofdominantgenus菌属水平的差异比较可见，龋病相关分布上，优势菌属中，纤毛菌属（Leptotrichia）、奈瑟菌属（Neisseria），劳特罗普氏菌属（Lautropia），新月形单胞菌属（Selenomonas），TM7-[G-1]，罗斯菌属（Rothia）和弯曲菌属（Campylobacter）7个优势菌属在两民族4组样本中差异无统计学意义（P>0.05）。隶属拟杆菌门的梭杆菌属（Fusobacterium）和卟啉单胞菌属（Porphyromonas）的丰度在两民族儿童健康对照组均高于SECC组，差异有统计学意义（P＜0.01）。棒状杆菌属47 新疆医科大学博士学位论文（Corynebacterium）的丰度在两民族SECC组均高于健康对照组，差异接近统计学意义（汉族P=0.059，维吾尔族P=0.054）。汉族儿童中，放线菌属（Actinomyces），球杆菌属（Aggregatibacter），嗜血杆菌属（Haemophilus），Terrahaemophilus等4个菌属的丰度在SECC组高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而链球菌属（Streptococcus），二氧化碳嗜纤维菌属（Capnocytophaga），韦荣球菌属（Veillonella）3个优势菌属的丰度在健康对照与SECC组中差异无统计学意义（P>0.05）。维吾尔族儿童中，链球菌属（Streptococcus）和韦荣菌属（Veillonella）的丰度在SECC组高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；二氧化碳嗜纤维菌属（Capnocytophaga）的丰度在健康对照组高于SECC组，差异有统计学意义（P=0.03）；而放线菌属（Actinomyces），球杆菌属（Aggregatibacter），嗜血杆菌属（Haemophilus），Terrahaemophilus等4个优势菌属的丰度在健康对照与SECC组中差异无统计学意义（P>0.05）。低丰度菌属中，拟杆菌门的坦纳菌属（Tannerella）和Bacteroidales_[G-2]菌属的丰度在两民族儿童健康对照组均高于SECC组，差异有统计学意义（P＜0.05）。另外，在汉族儿童中，Lachnoanaerobaculum和密螺旋菌属（Treponema）的丰度在健康对照组均高于SECC组，差异有统计学意义（P＜0.01）。维吾尔族儿童中，隶属厚壁菌门的颗粒链菌属（Granulicatella）在SECC组的丰度高于健康对照组，差异有统计学意义（P=0.034）；乳杆菌属（Lactobacillus）的丰度在SECC组高于健康对照组（P=0.001）；金氏菌属（Kingella），孪生球菌属（Gemella），伯杰菌属（Bergeyella），艾肯菌属（Eikenella）和Ottowia等5个菌属的丰度在健康对照组均高于SECC组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2.13）。图2.13菌属水平物种的差异比较Figure2.13Comparisonofthemicrobialvariationsatthegenuslevel.48 新疆医科大学博士学位论文在民族差异性上，健康对照组中，优势链球菌属（Streptococcus）的丰度在汉族儿童组高于维吾尔族儿童组，差异有统计学意义（P=0.017）；低丰度的Olsenella菌属在汉族儿童组高于维吾尔族儿童组，差异有统计学意义（P=0.025）；Clostridiales[F-2][G-1]菌属的丰度在维吾尔族儿童组高于汉族儿童组，差异有统计学意义（P=0.04）。SECC组中，优势普氏菌属（Prevotella）的丰度在维吾尔族儿童组高于汉族儿童组，差异有统计学意义（P=0.023）；低丰度的拟普雷沃菌属（Alloprevotella）在维吾尔族儿童组高于汉族儿童组，差异有统计学意义（P=0.022），Abiotrophia在维吾尔族儿童组亦高于汉族儿童组，差异接近统计学意义（P=0.052）；金氏菌属（Kingella）在汉族儿童组高于维吾尔族儿童组，差异有统计学意义（P=0.029）（图2.14）。图2.14菌属水平汉族和维吾尔族SECC组菌群的差异比较Figure2.14ComparisonofthemicrobialvariationsofSECCinHanandUyguratthegenuslevel2.3.2.3菌种水平的构成及差异菌种水平上，两民族儿童4组菌斑样本共检出443个菌种，其中，汉族儿童组丰度>1%的优势菌种共29个（约占总比例的62.9%），按丰度依次排列为：马氏棒状杆菌（Corynebacteriummatruchotii）、口腔链球菌（Streptococcusoralis）、殊异韦荣球菌（Veillonelladispar）、奇异劳特罗普氏菌（Lautropiamirabilis）、粘液奈瑟菌（Neisseriamucosa）、内氏放线菌（Actinomycesnaeslundii）、中国链球菌（Streptococcussinensis）、生痰二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophagasputigena）、血链球菌（Streptococcussanguinis）、Leptotrichiawadei、Neisseriapharyngis、普氏菌（Prevotellasp.oraltaxon317）、Rothiaaeria、Leptotrichiasp.oraltaxon225、49 新疆医科大学博士学位论文Fusobacteriumsp.oraltaxon203、颗粒二氧化碳噬纤维菌（Capnocytophagagranulosa）、Leptotrichiashahii、Leptotrichiahofstadii、Porphyromonassp.oraltaxon279、TM7[G-1]sp.oraltaxon346、Fusobacteriumnucleatumssvincentiioraltaxon200、Terrahaemophilusaromaticivorans、副流感嗜血杆菌（Haemophilusparainfluenzae）、Fusobacteriumnucleatumsspolymorphumoraltaxon202、Corynebacteriumdurum、Capnocytophagasp.oraltaxon326、有害月形单胞菌（Selenomonasnoxia）、小韦荣菌（Veillonellaparvula）、港型纤毛菌（Leptotrichiahongkongensis）。维吾尔族儿童组丰度>1%的优势菌种共28个（约占总比例的58.5%），按丰度依次排列为：马氏棒状杆菌（Corynebacteriummatruchotii）、口腔链球菌（Streptococcusoralis）、殊异韦荣球菌（Veillonelladispar）、奇异劳特罗普氏菌（Lautropiamirabilis）、粘液奈瑟菌（Neisseriamucosa）、Leptotrichiawadei、中国链球菌（Streptococcussinensis）、Leptotrichiashahii、Neisseriapharyngis、普氏菌（Prevotellasp.oraltaxon317）、内氏放线菌（Actinomycesnaeslundii）、生痰二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophagasputigena）、Fusobacteriumsp.oraltaxon203、Leptotrichiasp.oraltaxon225、Leptotrichiahofstadii、血链球菌（Streptococcussanguinis）、Porphyromonassp.oraltaxon279、Fusobacteriumnucleatumssanimalisoraltaxon420、颗粒二氧化碳噬纤维菌（Capnocytophagagranulosa）、Fusobacteriumnucleatumsspolymorphumoraltaxon202、Fusobacteriumnucleatumssvincentiioraltaxon200、Rothiaaeria、有害月形单胞菌（Selenomonasnoxia）、副流感嗜血杆菌（Haemophilusparainfluenzae）、Terrahaemophilusaromaticivorans、港型纤毛菌（Leptotrichiahongkongensis）、Capnocytophagasp.oraltaxon326、Leptotrichiasp.oraltaxon498。（图2.15，2.16）图2.15菌种水平的物种分布（相关丰度>0.1%）Figure2.15Distributionofthedifferentbacteriaatthespecieslevel（relativeabundant>0.1%）50 新疆医科大学博士学位论文图2.16优势菌种的分布Figure2.16Distributionofdominantspeices菌种水平的差异比较可见，马氏棒状杆菌（Corynebacteriummatruchotii）、粘液奈瑟菌（Neisseriamucosa）、生痰二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophagasputigena）、Leptotrichiawadei、Neisseriapharyngis、Prevotellasp.oraltaxon317、Leptotrichiasp.oraltaxon225、颗粒二氧化碳噬纤维菌（Capnocytophagagranulosa）、TM7[G-1]sp.oraltaxon346、小韦荣菌（Veillonellaparvula）和Corynebacteriumdurum等优势菌种在两民族4组样本中差异无统计学意义。龋病相关分布上，优势菌种中，殊异韦荣球菌（Veillonelladispar）的丰度在两民族儿童SECC组均高于健康对照组儿童，差异有统计学意义（P<0.05）；而Fusobacteriumsp.oraltaxon203、Porphyromonassp.oraltaxon279、Fusobacteriumnucleatumssvincentiioraltaxon200、Fusobacteriumnucleatumsspolymorphumoraltaxon202、Fusobacteriumnucleatumssanimalisoraltaxon420的丰度在两民族儿童健康对照组均高于SECC组儿童，差异有统计学意义（P<0.05）。另外，在汉族儿童中，内氏放线菌（Actinomycesnaeslundii）、Terrahaemophilusaromaticivorans和副流感嗜血杆菌（Haemophilusparainfluenzae）的丰度在SECC组高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；有害月形单胞菌（Selenomonasnoxia）和港型纤毛菌（Leptotrichiahongkongensis）的丰度对照在健康组均高于SECC组，差异有统计学意义（P<0.05）。在维吾尔族儿童中，口腔链球菌（Streptococcusoralis）、中国口腔链球菌（Streptococcussinensis）和血链球菌（Streptococcussanguinis）的丰度在SECC组高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；而Leptotrichiahofstadii和Capnocytophagasp.oraltaxon326的丰度在健康对照组均高于SECC组，差异有统计学意义（P<0.05）。低丰度菌种51 新疆医科大学博士学位论文中，月神新月形单胞菌（Selenomonasdianae）、龋齿韦荣球菌（Veillonelladenticariosi）、约翰森放线菌（Actinomycesjohnsonii）的丰度在两民族儿童SECC组均高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；而Capnocytophagaleadbetteri、Fusobacteriumperiodonticum、Bacteroidales[G-2]sp.oraltaxon274、Porphyromonascatoniae、Tannerellasp.oraltaxon286、Fusobacteriumnucleatumssnucleatumoraltaxon698、Fusobacteriumsp.oraltaxon370、Capnocytophagasp.oraltaxon902、Fusobacteriumnaviforme、Tannerellasp.oraltaxon808、Capnocytophagasp.oraltaxon332、Porphyromonassp.oraltaxon275、Tannerellasp.oraltaxon916、Bergeyellasp.oraltaxon907、Porphyromonassp.oraltaxon277、Bergeyellasp.oraltaxon900、Porphyromonassp.oraltaxon284和Moryellasp.oraltaxon910的丰度在两民族儿童健康对照组均高于SECC组，差异有统计学意义（P<0.05）。在汉族儿童中，Aggregatibactersegnis、Actinomycesoris、Aggregatibactersp.oraltaxon458、Actinomycessp.oraltaxon175、Actinomycessp.oraltaxon177、Actinomycessp.oraltaxon170的丰度在SECC组高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。维吾尔族儿童中，而泛口腔链球菌（Streptococcusperoris）、非典型韦荣菌（Veillonellaatypica）、Leptotrichiasp.oraltaxon221和Streptococcussp.oraltaxon057的丰度在SECC组高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。另外，在低丰度菌种中，Lactobacilluspanis、卷曲乳杆菌（Lactobacilluscrispatus）、Olsenellasporaltaxon809、副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）在两民族儿童健康对照组均无检出；格氏乳杆菌（Lactobacillusgasseri）在维吾尔族儿童健康对照组无检出；鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）和Lactobacilluscoleohominis仅在维吾尔族儿童SECC组中有检出；而Moraxellacatarrhalis在汉族儿童SECC组无检出（图2.17）。52 新疆医科大学博士学位论文图2.17菌种水平的差异物种Figure2.17Thedifferentbacteriaatthespecieslevel在民族性差异上，健康对照组中，优势菌种中国口腔链球菌（Streptococcussinensis）和血链球菌（Streptococcussanguinis）的丰度在汉族儿童组高于维吾尔族儿童组，差异有统计学意义（P<0.01）；低丰度菌种Actinomycesmassiliensis、泛口腔链球菌（Streptococcusperoris）、Streptococcussp.oraltaxon074、Streptococcussp.oraltaxon057的丰度在汉族儿童组高于维吾尔族儿童组，差异有统计学意义（P<0.05）。而低丰度菌种Clostridiales[F-2][G-1]sp.oraltaxon075、Leptotrichiasp.oraltaxon53 新疆医科大学博士学位论文879、Alloprevotellasp.oraltaxon912、Alloprevotellasp.oraltaxon914、Bergeyellasp.oraltaxon900、SR1_[G-1]sp.oraltaxon345在维吾尔族儿童组高于汉族儿童组，差异有统计学意义（P<0.05）。SECC组中，优势菌种Leptotrichiashahii的丰度在维吾尔族儿童高于汉族儿童组，差异有统计学意义（P=0.029）；低丰度菌种Actinomycesgerencseriae、Actinomycesjohnsonii、Actinomycesmassiliensis、Neisseriaelongate、Kingelladenitrificans、Kingellaoralis的丰度在汉族儿童组高于维吾尔族儿童组，差异有统计学意义（P<0.05）；而低丰度菌种Prevotellaintermedia、Prevotellapleuritidis、Prevotellasp.oraltaxon472、Prevotellamaculosa、Alloprevotellatannerae、Selenomonassp.oraltaxon442、Selenomonassputigena的丰度在维吾尔族儿童组高于汉族儿童组，差异有统计学意（P<0.05）（图2.18）。图2.18菌种水平汉族和维吾尔族SECC组菌群的差异比较Figure2.18ComparisonofthemicrobialvariationsofSECCinHanandUyguratthespecieslevel2.3.3两民族儿童菌斑核心菌群的分布及差异比较两民族4组样本中共有275种OTU构成核心微生物组，并归类至5个菌门、30个菌属、87个菌种。其中包括：厚壁菌门：链球菌属（Streptococcus）、韦荣球菌属（Veillonella）、新月形单胞菌属（Selenomonas）、孪生球菌属（Gemella）、营养缺陷菌属（Abiotrophia）、颗粒链菌属（Granulicatell）、肠球菌属（Enterococcus）、梭状54 新疆医科大学博士学位论文芽胞杆菌属（Clostridiales[F-2][G-1]）及Lachnoanaerobaculum菌属，梭杆菌门：纤毛菌属（Leptotrichia）、梭杆菌属（Fusobacterium），拟杆菌门：二氧化碳嗜纤维菌属（Capnocytophaga）、普氏菌属（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、坦纳菌属（Tannerella）、伯杰菌属（Bergeyella），放线菌门：棒杆菌属（Corynebacterium）、放线菌属(Actinomyces)、罗氏菌属(Rothia），变形菌门：奈瑟菌属(Neisseria)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、弯曲菌属(Campylobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、金氏菌属(Kingella)、心杆菌属（Cardiobacterium）、球杆菌属（Aggregatibacter）、Terrahaemophilus菌属、Ottowia菌属及艾肯菌属（Eikenella）。本研究采用LEfSe分析（LDAEffectSize）核心菌群在各组间的分布差异。LEfSe分析步骤主要分为三步：1、利用Kruskal-Wallis秩和检验检测所有特征物种，通过检测不同组间物种丰度，获得显著性差异物种；2、利用Wilcoxon秩和检验检测所获得的显著性差异物种的所有亚种是否趋于同一分类级别；3、对生成的向量集建立一个线性判别分析（LDA）模型，最终得到特定分类水平下的差异物种列表及其影响力。LEfSe结果以进化分枝树图展示各分类水平中存在组间差异的微生物群落或物种。图中由内至外的圆环代表门、纲、目、科、属水平的分类级别，不同分类级别上的每一个小节点代表一个分类，节点直径大小与相对丰度呈正比。圆环上的不同颜色表示不同的分组，不同颜色的节点代表该分组中起重要作用的物种分类，黄色节点代表无显著性差异的类群。图中LDAscore表示不同组间显著差异物种的影响程度。柱状图的长短代表LDAscore（默认分值为2.0），其大于预设值时，各组间存在显著差异物种。由图2.19可见，隶属放线菌门的Actinomycesnaeslundi、Actinomycesjohnsonii、Actinomycessp.oraltaxon175、口腔放线菌（Actinomycesoris）和隶属变形菌门的Terrahaemophilusaromaticivorans是汉族儿童SECC组中起主要作用的核心菌种；而隶属变形菌门心杆菌（人类心杆菌（Cardiobacteriumhominis）、Cardiobacteriumvalvulum），梭杆菌门的纤毛菌（Leptotrichiasp.oraltaxon462、Leptotrichiasp.oraltaxon498、Leptotrichiahofstadii、Leptotrichiahongkongensis、Leptotrichiashahii、Leptotrichiawadei）和梭杆菌（Fusobacteriumnucleatumssnucleatumoraltaxon698、Fusobacteriumnaviforme、Fusobacteriumnucleatumssanimalisoraltaxon420、Fusobacteriumnucleatumsspolymorphumoraltaxon202、Fusobacteriumnucleatumssvincentiioraltaxon200），拟杆菌门的二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophagasp.oraltaxon326、Capnocytophagaleadbetteri、Capnocytophagasp.oraltaxon902、Capnocytophagasp.oraltaxon412、Capnocytophagasp.oraltaxon332）、坦纳菌（Tannerellasp.oraltaxon286）、普氏菌（Prevotellahisticola、Prevotellasp.oraltaxon314）和卟啉单胞菌（Porphyromonassp.oraltaxon279），以及厚壁菌门的Lachnoanaerobaculumsaburreum是汉族儿童健康对照组中起主要作用的核心菌55 新疆医科大学博士学位论文种。图2.19汉族儿童核心菌群的LEfSe分析Figure2.19LEfSeanalysisofcoreflorainHanchildren由图2.20可见，隶属厚壁菌门的韦荣菌（殊异韦荣菌（Veillonelladispar）、Veillonelladenticariosi）、中国链球菌（Streptococcussinensis）、月神新月形单胞菌（Selenomonasdianae），放线菌门的多种放线菌（Actinomycesspp.）是维吾尔族儿童SECC组中起主要作用的核心菌种；隶属变形菌门心杆菌（人类心杆菌（Cardiobacteriumhominis）、Cardiobacteriumvalvulum），梭杆菌门的纤毛菌（Leptotrichiasp.oraltaxon498、Leptotrichiasp.oraltaxon392）和梭杆菌（Fusobacteriumspp.），拟杆菌门的二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophagaspp.）和卟啉单胞菌（Porphyromonassp.oraltaxon279），变形菌门的Kingelladenitrificans、纤细弯曲菌（Campylobactergracilis）、奈瑟菌（Neisseriaelongate、Neisseriasp.oraltaxon020）、坦纳菌（Tannerellasp.oraltaxon286）、Eikenellacorrodens和Lautropiamirabilis，以及厚壁菌门的寡发酵链球菌（Streptococcusoligofermentans）、麻疹孪生球菌（Gemellamorbilorum）、溶血孪生球菌（Gemellahaemolysans）及新月形单胞菌（Selenomonasnoxia）是维吾尔族儿童健康对照组中起主要作用的核心菌种。56 新疆医科大学博士学位论文图2.20维吾尔族儿童核心菌群的LEfSe分析Figure2.20LEfSeanalysisofcoreflorainUygurschildren3讨论作为龋病病因四联因素的主要致病因素，口腔微生物一直是龋病学研究的重点。从上世纪采用传统分离培养方法为基础的特异性病原菌研究，到现代以基因和高通量测序技术为手段的龋病微生态研究，人们对于龋病病因的认识已从一种或个别几[108]种关键致龋菌研究的“非特异性病因学说”和“特异性病因学说”，提升到了对口腔[18]微生态整体分析的“生态病因学说”。该学说认为在复杂的口腔微生态中，正常微生物群落与宿主生态环境间保持着维系口腔健康的动态平衡。而龋病的发生是常驻微生物菌群之间及微生物菌群与宿主之间的微生态平衡因宿主、正常微生物菌群或外界理化环境的变化被打破，导致口腔微生态失调造成的。而整个菌群的复杂行为不是单一菌种决定的，群落才是口腔微生物的基本组成单位和致病方式。DNA测序技术和生物信息学的不断进展，让人们了解复杂的口腔微生态构成和多样性成为可能。目前已应用于口腔微生物研究的，以DNA为基础的现代生物学技术主要包括16SrRNA测序技术、变性梯度凝胶电泳和末端限制性片段长度多态性、高通量指纹技术和宏基因组测序技术等，其中，16SrRNA基因是原核生物核糖体亚基的组成部57 新疆医科大学博士学位论文分之一，突变率较小，分子大小也较适中，常作为细菌系统分类学研究的标志物，因此基于16SrRNA的测序技术得到了广泛的应用。因为16SrRNA基因序列较长，通常有1500bp，而测序平台对序列的读长有所限制，所以只能选择可变区域来测序。16SrRNA包含V1-V9九个可变区，不同可变区所提供的生物学信息存在一定的差异[19]会影响微生物物种鉴定的特异性。以往同类研究结果认为V3、V3-V4、V4-V5可[109]变区提供的种系分类信息准确度高，在口腔微生物研究中最为常用。MiSeq的合[110]成测序原理是Solexa测序技术，它是基于焦磷酸测序的单分子阵列测试，采用边合成边测序的技术，可在一个反应中同时加入4种荧光标记核苷，通过“去阻断—延伸—激发荧光—切割荧光基团—去阻断”循环的方法依次读取目的DNA上的碱基排列顺序。该平台读取片段多，所需样本量少，高通量、高精确性，在兼容性、操作性和成本方面有着较大的优势，应用范围几乎囊括了目前基因组学研究的所有方面。但其读取片段较短，双端测序扩展的长度约500bp，可覆盖区域为V1-V4，因此，我们选择V3-V4区进行分析。[103]微生态菌群失调主要表现为特定生境核心微生物群组成和数目的异常，但是[111-114]人类口腔中不同生态位点定植的微生物群落有所不同，而且口腔微生物群落的定植会随着年龄的增长、牙列的变化发生动态变化。以往研究发现常见的口腔微生物定居位点包括颊粘膜、硬软腭、角化牙龈、腭扁桃体、唾液、龈上及龈下菌斑、[115]咽喉及舌背等，其中，牙菌斑具有更多的生物多样性和特异性寡核苷酸表型，是[116]最特异的位点。此外，口腔微生物在不同发育阶段的定植也不相同。其中，无牙期儿童口腔菌群数量少、种类简单，微生物群以需氧菌和兼性厌氧菌为主。乳牙的萌出使口腔解剖结构发生了变化，口腔滞留区的增加，牙面、龈沟、咬合面的窝沟点隙、相邻牙间等多个生态点和生态位的出现，给口腔微生物提供了更多复杂的定植生境，使婴幼儿口腔微生物的组成和数量明显增多，特别是兼性厌氧和厌氧菌的[117]定植和生长。Corby等研究发现，缓症链球菌、口腔链球菌和唾液链球菌是乳牙列期儿童口腔唾液及口腔软组织表面的优势菌，而龈上菌斑中放线菌属的检出远高于唾液和软组织表面。乳牙列期口腔生态基本处于平衡状态，口腔微生物以需氧菌和兼性厌氧菌为主，数量和组成基本稳定。但全身健康状况、口腔卫生习惯、食物种类和家庭社会经济地位可能会对其产生影响。而混合牙列期，随着牙齿及牙面数目的增多以及牙列的暂时性拥挤，导致儿童口腔滞留区增多，厌氧菌检出呈现上升趋势，并出现一些牙周致病菌。另外，牙齿的不同部位因结构特点不同，也形成了适宜不同微生物定植的微生态区，包括光滑面、邻面、点隙窝沟和根面微生态区，其生化构成和定植的微生物存在相异特点。因此，选择不同微生态特点及位点的口腔微生物与龋病相关性研究的临床意义不同。目前与龋病相关的研究包括口腔不同[117-118]发育时段，检测位点多为多牙面汇集的龈上菌斑或唾液样本，但有关不同民族58 新疆医科大学博士学位论文间低龄儿童龋的对比鲜有报道。本研究以龋病高发的4-5岁汉族和维吾尔族重度低龄龋儿童为研究对象，选择乳牙列期患龋率最高的乳磨牙颊面及邻面龈上菌斑的特定位点采样，有利于获得反映种族和患龋儿童微生物群落构成及多样性的真实信息。本研究采用IlluminaMiSeq高通量测序平台，基于16SrRNA基因V3-V4可变区进行两民族儿童健康对照组和重度低龄儿童龋龈上菌斑样本测序，共获得3622965条优质序列，约占总序列数的89.6%。按照97%的相似性聚类得到18928种OTU，被分类为11个菌门，20个菌纲，30个菌科，58菌目，117菌属和443个菌种。在不同分类水平的检出结果中，优势菌及低丰度物种均有大量检出。Alpha多样性指数结果显示，维吾尔族儿童组的丰度指数和多样性指数均高于汉族儿童，同时，两民族儿童健康对照组的菌群多样性指数显著高于重度低龄龋组。基于加权UniFrac距离矩阵的Beta多样性分析结果显示，两民族4组样本的菌群构成存在差异，菌斑微生物群落在健康对照组内及两民族之间均较为相似，但在重度低龄儿童龋组的民族间，以及龋病组与健康对照组之间却差异明显。结果提示重度低龄儿童龋的菌斑微生物多样性低于口腔健康状态，而菌斑微生物的构成及多样性在两民族间存在差异。同[119]类研究中，黄慧针对低龄儿童龋微生物菌群多样性研究的综述结果显示，无龋儿童的菌群多样性和复杂性均高于重度低龄龋儿童，龋病可能与微生物多样性的降低[34]相关。Gross等从龋坏不同阶段对与低龄儿童龋和口腔健康相关的微生物菌群进行横断面和纵向对比分析，发现与口腔健康儿童相比，患龋儿童微生物菌群多样性降低，而且随着龋病的进展，许多物种含量呈现较低水平甚至消失，这一结果支持“生态病因学说”，证实了龋病是由正常微生物群落生态破坏导致的结果。本研究中龋相关菌群多样性的结果与上述研究一致。另外，种族可能会对口腔微生物菌群产生直[120][121]接或间接的影响。Mason等分析了非西班牙裔黑人、非西班牙裔白人、中国人和拉丁人4个种族192名成人受试者的牙菌斑和唾液样本，发现口腔微生物群落具[122]有明显的族裔特异性。李志艳等采用IlluminaMiSeq高通量测序技术对比分析青海汉族和藏族成人高龋患者口腔唾液微生物菌群多样性，发现汉族龋患者唾液微生物的多样性与丰度明显高于藏族。关于不同民族之间儿童菌群多样性的研究鲜有报道，本研究中维吾尔族儿童菌斑菌群多样性高于汉族儿童，存在民族差异性。物种分类结果显示，与重度低龄儿童龋相关的菌群分类中，放线菌门和厚壁菌门的丰度在两民族重度低龄儿童龋组均明显高于健康对照组，但厚壁菌门在汉族儿童组中差异无统计学意义。隶属厚壁菌门的优势殊异韦荣球菌和低丰度的Veillonelladenticariosi、月神新月形单胞菌，以及隶属放线菌门的约翰森放线菌是两民族重度低龄儿童龋共同相关的菌种。隶属放线菌门的放线菌属和隶属变形菌门的球杆菌属、嗜血杆菌属、Terrahaemophilus等4个优势菌属，以及其分类下的内氏放线菌、副流感嗜血杆菌、Terrahaemophilusaromaticivorans3个优势菌种，Aggregatibactersegnis、59 新疆医科大学博士学位论文Actinomycesoris、Aggregatibactersp.oraltaxon458、Actinomycessp.oraltaxon175、Actinomycessp.oraltaxon177、Actinomycessp.oraltaxon170等低丰度菌种与汉族重度低龄儿童龋相关；而隶属厚壁菌门的优势链球菌属、韦荣菌属和低丰度的颗粒链菌属、乳杆菌属，及其分类下的口腔链球菌、中国口腔链球菌、血链球菌3个优势菌种和泛口腔链球菌、非典型韦荣菌、Leptotrichiasp.oraltaxon221、Streptococcussp.oraltaxon057及6种乳杆菌等低丰度菌种与维吾尔族重度低龄儿童龋相关。隶属厚壁菌门的优势殊异韦荣球菌和低丰度的Veillonelladenticariosi、月神新月形单胞菌，以及隶属放线菌门的约翰森放线菌是两民族重度低龄儿童龋共同相关的菌种。而隶属梭杆菌门的梭杆菌属、卟啉单胞菌属和低丰度的隶属拟杆菌门的坦纳菌属和Bacteroidales_[G-2]菌属等菌种是两民族儿童口腔健康的相关菌种。另外，重度低龄儿童龋组的对比发现，两民族乳磨牙菌斑微生物的丰度分布存在民族性差异。隶属放线菌门的戈氏放线菌、Actinomycesjohnsonii、Actinomycesmassiliensis；金氏菌属Kingelladenitrificans、Kingellaoralis和Neisseriaelongate在汉族儿童的丰度明显高于维吾尔族儿童。而普氏菌属及其隶属的Prevotellaintermedia、Prevotellapleuritidis、Prevotellasp.oraltaxon472、Prevotellamaculosa和隶属拟普雷沃菌属的Alloprevotellatannerae、Leptotrichiashahii、Selenomonassp.oraltaxon442、Selenomonassputigena在维吾尔族儿童组的丰度明显高于汉族儿童。[95]以往有关低龄儿童龋微生物菌群的研究报道各有异同。Ma等采用人类口腔微生物芯片技术对比分析40名3-4岁重度低龄儿童龋和无龋儿童的唾液和牙菌斑菌群微生物，发现链球菌属、卟啉单胞菌属和放线菌属与重度低龄儿童龋有很强的相关[97]性。Jiang等用454焦磷酸测序方法分析40名3-6岁重度低龄儿童龋和无龋儿童的牙菌斑菌群微生物，结果发现链球菌属、颗粒链菌属和放线菌属的丰度在重度龋儿童牙菌斑中显著增加，可能是菌群中的核心菌属，此结果提示龋病的发生可能源自[28]致龋菌群结构的转变，而并非存在特殊致龋菌。Xu等采用454焦磷酸测序方法对19名重度低龄儿童龋和无龋儿童的牙菌斑菌群微生物进行对比分析，认为链球菌属、韦荣球菌属是与龋病相关的菌属，而纤毛菌属、新月单胞菌属、梭杆菌属、二氧化[99]碳噬纤维菌属和卟啉单胞菌属是与无龋相关的菌属。Zhang等对20名3-6岁双胞胎低龄儿童龋进行高通量测序分析，推测韦荣球菌属、放线菌属、棒状杆菌属可能是与龋病相关的菌属，而梭杆菌属、金氏菌属及纤毛菌属可能是与口腔健康相关的[123]菌属。Ling等采用454焦磷酸测序方法对60名3-6岁有龋儿童和无龋儿童口腔牙菌斑和唾液的微生物菌群构成及多样性进行对比分析，发现有龋儿童口腔微生态多样性明显下降，龈上菌斑中链球菌属、韦荣球菌属、放线菌属、颗粒链菌属、纤毛菌属和卟啉单胞菌属以及表兄链球菌、中间链球菌、阴道乳杆菌、发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、衣氏放线菌、棒状杆菌属等含量较高，这些细菌相互作用，逐渐破坏生60 新疆医科大学博士学位论文[124]态平衡，最终导致龋病发生。Jiang等采用454焦磷酸测序方法对60名3-7岁儿童不同龋损阶段口腔微生物菌群多样性进行对比分析，发现微生物种群随着龋坏状态的不同而有所不同，与牙齿健康相关的有二氧化碳噬纤维菌属、梭杆菌属、卟啉单胞菌属、乏氧菌属、新月单胞菌属、福塞斯坦纳菌属、艾肯氏菌属、密螺旋体菌属、放线棒菌属等13个菌属，而短小杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、Olsenella、Scardovia、Shuttleworthia和链球菌属在牙本质龋中明显增加，放线菌属和棒状杆菌属在龋白斑中有很高水平的检出。在这些不同的研究报道中，链球菌属、韦荣菌属、放线菌属、颗粒链菌属及棒状杆菌属是低龄儿童龋中检出较高的优势菌属。其中，链球菌属是儿童口腔中检出[32,95]率最高的优势菌属，也是与低龄儿童龋密切相关的核心菌属。链球菌属种类较[125]复杂，既有大量与口腔健康相关的益生菌，也有公认的致龋菌。其中澳大利亚链球菌、中间链球菌、唾液链球菌、寡发酵链球菌、前庭链球菌、戈氏链球菌等对口腔健康有积极影响的菌种，在维持宿主生态平衡中起着重要作用。本研究中上述链球菌种的检出与之相同，在各组间丰度均衡。而变异链球菌（Streptococcusmutans）和表兄链球菌（Streptococcussobrinus）是链球菌属中公认的主要致龋菌，具有很强[34]的产酸和耐酸能力，以及协同致龋能力。变异链球菌在重度龋儿童菌斑中常有较[126-127][128-130]高的检出率，但也有未检出的报道。现代口腔微生态学研究认为变异链球菌的存在可能并不是龋病发生的必要条件，而是龋病进展的辅助危险因素。本研究中变异链球菌非优势菌种，患龋组中有1个样本没有检出，在两民族重度低龄儿童龋组的丰度均高于健康组，但差异无统计学意义，结果提示变异链球菌与两民族重度低龄儿童龋的关系与现代微生态研究的结论相吻合。表兄链球菌在本次研究中未有检出，这可能与不同人群或检测方法不同有关。口腔链球菌（Streptococcusoralis）被认为是儿童乳牙列期的优势菌种，以往报道在健康组的出现频率较高，被认为是[131][132]口腔有益菌，但也有与重度低龄儿童龋相关的报道。血链球菌（Streptococcussanguinis）是牙面早期定植菌之一，被认为是与牙齿萌出有关的有益菌，可能会与变[133]异链球菌竞争在牙齿表面的定植位点，在龋齿中具有拮抗作用。本研究发现口腔链球菌、血链球菌、中国链球菌和低丰度的泛口腔链球菌在汉族儿童菌斑中的检出无显著差异，但在维吾尔族重度低龄儿童龋的丰度却明显高于健康对照组儿童。另外，在民族分布差异上，汉族健康对照组的丰度明显高于维吾尔族儿童。这种差异性的表现提示上述链球菌种与两民族重度低龄儿童龋的关系可能存在族裔特异性，最新的NGS技术有望会为与低龄儿童龋及健康相关的链球菌种提供一个基因分型全[134]貌。[135-138]韦荣菌属也是与低龄儿童龋显著相关的优势菌属，研究显示，韦荣球菌与变异链球菌有共生关系，它可以利用变异链球菌或其他菌种的终末产物作为能量来61 新疆医科大学博士学位论文源产生更多的酸，加速龋坏。还可以潜在影响PH值，其菌数随PH值的降低而增加，因依赖乳酸为营养源，该菌可作为产酸的早期预警指标。口腔常见菌种是小韦荣菌，其次是殊异韦荣菌和非典型韦荣球菌，其中小韦荣菌可利用变异链球菌产生的乳酸[18]被认为是牙菌斑中的有益菌。本研究中殊异韦荣菌、非典型韦荣球菌、Veillonelladenticariosi在两民族重度低龄儿童龋组的含量均明显增高，而小韦荣菌是两民族儿童菌斑样本中无显著差异的优势菌种。[139]放线菌属是儿童口腔的常见菌属，也是低龄儿童龋的优势菌属。但是目前关于放[140]线菌与低龄儿童龋关系的研究，结果不一。Luo等研究中放线菌属在有龋和无龋[96]组未见显著差异。但Ma等在重度低龄儿童龋唾液样本中检出的放线菌属明显高[124]于无龋组，Jiang等的研究发现放线菌属在儿童龋齿早期阶段有很高的平均水平，提示其在龋齿早期形成阶段起着重要的作用。本研究中，内氏放线菌、约翰森放线菌和口腔放线菌等多种放线菌在两民族族重度低龄儿童龋组的丰度均明显高于健康对照组；但在重度低龄儿童龋组的民族间对比中，汉族儿童组的丰度明显高于维吾尔族，提示放线菌与重度低龄儿童龋显著相关，并可能存在民族分布的差异。另外，[31]乳杆菌是耐酸性很强的产酸耐酸菌，曾被认为是重要的致龋菌。但乳杆菌的黏附力弱，需要依附变形链球菌或其他产酸菌形成龋坏，在低龄儿童龋早期几乎没有检出，它是微生物演替过程中的后期菌种，在龋病进展晚期呈主导地位，因此对乳杆[33,126]菌属的筛查对龋病的诊断有很高的特异性。本次研究中两民族菌斑样本，尤其是维吾尔族重度低龄儿童龋组中检出了6种低丰度的乳杆菌（Lactobacillusspp.），这些乳杆菌只存在于疾病组的部分样本中，健康对照组中几乎没有被检出，该结果提示两民族重度低龄儿童龋的发生发展，除多种产酸耐酸菌的共同作用外，可能也存在特异性致龋菌的相关作用。口腔微生态研究表明菌斑微生物菌群中存在共同表达的核心微生物种。本次研究在两民族儿童4组菌斑样本中共检出87个核心菌种，其中，隶属放线菌门的内氏放线菌、Actinomycesjohnsonii、Actinomycessp.oraltaxon175、口腔放线菌和隶属变形菌门的Terrahaemophilusaromaticivorans是汉族重度低龄儿童龋中起主要作用的核心菌种；隶属厚壁菌门的韦荣菌（殊异韦荣菌、Veillonelladenticariosi）、中国链球菌、月神新月形单胞菌，放线菌门的多种放线菌种是维吾尔族重度低龄儿童龋中起主要作用的核心菌种。而多种梭杆菌、卟啉单胞菌、二氧化碳噬纤维菌、坦纳菌种及伯杰菌种等菌种是在两民族儿童口腔健康组中均起主要作用的核心菌属。另外，普氏菌种、月形单胞菌种、密螺旋菌种、TM7[G-1]spp.及Catonellamorbi是与汉族儿童口腔健康相关的菌种，而奇异劳特罗普氏菌（Lautropiamirabilis）、孪生球菌种（Gemellaspp.）、弯曲菌种（Campylobacterspp.）则是与维吾尔族健康儿童相关的菌种。研究结果发现，汉族和维吾尔族儿童菌斑微生物群落中存在着多种与重度低龄62 新疆医科大学博士学位论文儿童龋及口腔健康相关的菌群，其中与口腔健康相关的益生菌和常驻菌物种丰富，检出比例较高，而与重度低龄儿童龋相关的菌种在两民族间表达有所不同，提示两民族儿童菌斑微生态的稳定倾向于口腔常驻菌的平衡，与重度低龄儿童龋相关的菌种存在族裔特异性。这些菌群将是我们后续研究的重点范畴。它们相互之间及其与龋病间的相互作用和影响机制需进一步研究证明。另外，本研究未涉及菌斑微生物的基因及功能研究，有待在后续进一步研究探讨。4小结本研究率先利用高通量测序的方法对4-5岁汉族和维吾尔族健康对照组和重度低龄儿童龋儿童乳磨牙龈上菌斑微生物的构成和多样性进行了对比分析。研究发现汉族和维吾尔族儿童龈上菌斑菌群的构成及多样性有差异性，健康对照组儿童菌斑微生物多样性高于重度低龄儿童龋组。物种分类中放线菌属、球杆菌属、嗜血杆菌属、Terrahaemophilus是汉族重度低龄儿童龋儿童中含量较高的优势菌属，而链球菌属和韦荣菌属是维吾尔族重度低龄儿童龋儿童中含量较高的优势菌属。多种放线菌和Terrahaemophilusaromaticivorans是汉族儿童重度低龄儿童龋组中起主要作用的核心菌种，而殊异韦荣菌、中国链球菌、月神新月形单胞菌和多种放线菌是维吾尔族儿童重度低龄儿童龋组中起主要作用的核心菌种。重度低龄儿童龋组中，Leptotrichiashahii、多种普氏菌、Alloprevotellatannerae及Selenomonassputigena的丰度在维吾尔族儿童组明显高于汉族儿童；而Actinomycesgerencseriae、Actinomycesjohnsonii、Actinomycesmassiliensis、Neisseriaelongate、Kingellaoralis、Kingelladenitrificans的丰度在汉族儿童组明显高于维吾尔族儿童。本研究展示了汉族和维吾尔族低龄儿童龋龈上菌斑菌群结构及多样性在民族间和龋病与口腔健康之间的相似性和差异性，然而宿主和环境对口腔微生物菌群的演变存在影响，对于改变宿主致龋因素后菌群结构会发生怎样的改变，菌群之间以及菌群与龋病状态的相互关联还知之甚少，我们将在后续研究中进一步分析。63 新疆医科大学博士学位论文第三部分龋病治疗前后汉族和维吾尔族儿童牙菌斑菌群微生物的对比分析龋病在牙齿硬组织上的慢性进行破坏也是一个口腔微生态失衡的生物学过程。牙菌斑生物膜中的细菌通过发酵膳食中的碳水化合物产酸，导致牙齿脱矿和再矿化平衡破坏。重复的酸化作用会破坏口腔pH稳态，导致产酸及耐酸菌的组成和数量发生变化，产酸和耐酸能力增强，使牙齿硬组织中晶体溶解、钙磷等离子流失，造成[141-144]牙齿脱矿或龋洞形成。而与膳食碳水化合物利用率和pH值变化相关的口腔环境可以干扰微生物代谢活性，从而改变环境并诱导微生物产生更多的致病微生物[145]。因此，菌斑生物膜内菌群结构和生化活性的改变是龋病病因中的决定因素。能够影响菌斑生态失衡的因素主要来自宿主、微生物和外环境。宿主因素是龋病的四联因素之一，可能影响菌斑微生态平衡的宿主因素主要包括高糖食物的摄入、口腔卫生状况不良、龋齿等口腔疾病、遗传、生理发育阶段等因素，这些因素通过影响口腔内环境而打破菌斑生物膜的稳定性。反之，控制不良因素，给予龋洞充填、药物治疗和改善口腔卫生状况等有效防龋措施也可以缓解或重新建立新的口腔生态平衡。3-5岁是儿童乳牙列口腔微生态的平衡期，口腔微生物的数量和组成基本稳定。但是饮食、口腔卫生习惯及家庭经济社会地位等因素容易影响儿童口腔微生态的平衡，诱导龋病发生。课题组龋病流行病学调查发现，喀什和伊宁市3-5岁维吾尔族和汉族儿童患龋率高，充填率低，缺乏口腔维护和龋病防治，是容易患龋的高风险人群。针对该群体的前期菌群微生物检测结果显示，两民族患龋儿童和口腔健康儿童菌斑微生物的构成及多样性存在显著差异，并存在与龋病相关的共同的核心菌群，因此，本研究的主要目的是了解龋病防治措施对儿童菌斑菌群微生物可能产生的影响，以及核心菌群间演变的相关关系，以期为儿童龋病防治提供微生物标准的实验数据。1研究对象与方法1.1研究对象的处理对两民族30名重度儿童低龄龋组的受试儿童进行龋齿充填治疗。应用高速涡轮机去净龋坏，其中对2颗深龋去龋后穿髓的乳齿给予根管治疗，所有龋洞均采用富士7充填。给受试儿童统一发放儿童保健牙刷和高露洁儿童含氟牙膏，并于治疗后64 新疆医科大学博士学位论文和半年随访对儿童及家长进行口腔卫生指导和口腔健康教育。1.2龈上菌斑样本采集一年后回访，采集受试儿童同位点龈上牙菌斑。取样当日早晨不刷牙，样本采集于早饭后2小时，采样前要求儿童清水漱口。用无菌刮匙刮取乳磨牙颊面及邻面位点的龈上牙菌斑，立即置入装有1ml磷酸盐缓冲液的1.5ml无菌冻存管中，编号标记，并迅速冻存于-4°C转运箱内，送至佰美基因国家微检测系统工程技术研究中心（NationalEngineeringResearchCenterforMiniaturizedDetectionSystems）进行基因组DNA提取及测序分析。1.3DNA提取及高通量测序同2.2.3-2.2.4。1.4数据分析测序深度和αlpha多样性分析：通过OTU稀释性曲线（Rarefactioncurves）、丰度分布曲线（RankAbundance）、丰度指数（Chao1index）、多样性指数（ShannonWienerindex、Simpsonindex）和测序深度指数（Goodscoverageindex）比较汉族和维吾尔族重度低龄儿童龋治疗后样本取样的合理性，以及其与健康对照组和治疗前菌群多样性差异。Beta多样性分析：通过基于WeightedUnifrac距离矩阵的组间比较和主坐标分析（principalco-ordinatesanalysis，PCoA）分别比较汉族和维吾尔族重度低龄儿童龋治疗前、后菌斑样本菌群构成的相似性。物种丰度分析：在门、属、种不同分类水平进行汉族和维吾尔族重度低龄儿童龋治疗前、后微生物菌群构成的差异比较。物种相关性分析：根据差异物种的相对丰度，进行相关性分析。数据相关性分析采用秩相关系数（Spearman’srankcorrelation）和置换检验(Permutationtest)。当秩相关系数|r|>o.4，同时置换检验P＜0.01时，认为两个物种之间存在相关性。1.5统计学处理计量资料及多样性指数比较采用t检验，计数资料采用卡方检验，组间菌群丰度的差异性比较采用方差分析，检验效能α=0.05。相关性分析采用SpearmanRank相关检验。以上统计分析均通过SPSS21.0统计软件完成。2结果2.1样本资料及测序数据分析重度低龄儿童龋组的30名儿童防治后均随访采样，研究共采集汉族和维吾尔族重度低龄儿童龋组治疗后的乳磨牙颊面及邻面龈上菌斑样本30份。其中，维吾尔65 新疆医科大学博士学位论文SECC治疗后组（SCUT组）和汉族SECC治疗后组（SCHT组）各15份。30名重度低龄龋儿童口腔菌斑指数、牙龈指数、每日刷牙频次、每日含糖食品的摄入频次及父母辅助刷牙在治疗后均得到明显改善。所充填龋齿，除1名维吾尔族儿童（龋坏牙位54，55）和2名汉族儿童（龋坏牙位55，74）出现继发龋坏外，其余儿童牙齿及充填物未见异常（表3.1）。表3.1SECC组治疗前后的比较Table3.1ComparisonofphylotypecoverageanddiversityestimationofHanandUygurs汉族SECC组维吾尔族SECC组变量治疗前治疗后P值治疗前治疗后P值a菌斑指数(SEM)2.47(0.22)1.07(0.15)<0.0012.47(0.22)1.13(0.17)<0.001a牙龈指数(SEM)1.0(0.19)0.07(0.07)<0.0010.8(0.17)0.13(0.09)0.001b每日刷牙频次00（0.0%）0（0.0%）4（26.7%）0（0.0%）<0.001<0.001111（73.3%）0（0.0%）8（53.3%）0（0.0%）24（26.7%）15（100%）3（20.0%）15（100%）b每日含糖食品摄入频次01（6.7%）7（46.7%）0（0%）5（33.3%）0.001<0.00115（33.3%）8（53.3%）7（46.7%）10（66.7%）29（60.0%）0（0.0%）8（53.3%）0（0.0%）b父母辅助刷牙09（60.0%）0（0.0%）0.00113（86.7%）0（0.0%）<0.00116（40.0%）15（100%）2（13.3%）15（100%）注：a.采用t检验；b.采用卡方检验高通量测序结果显示，SCUT组共获得867767条有效序列，其中775449条优质序列通过质量控制，范围31241从到61590，约占总序列数的89.4%。按照97%的相似性对各样本优质序列进行OUT聚类，共得到38787个OTUs，样本平均OTUs为2586，范围从1773到3132。SCHT组共获得941501条有效序列，836855条优质序列通过质量控制，范围44268从到75943，约占总序列数的88.9%。按照97%的相似性对各样本优质序列进行OUT聚类，共得到36720个OTUs，样本平均OTUs为2448，范围从1446到3150。组间比较可见，优质序列数和分类的OUT数量在两民族龋病治疗前后组的样本间未见显著性差异（表3.2）。2.2多样性分析2.2.1αlpha多样性分析66 新疆医科大学博士学位论文我们分别进行了汉族和维吾尔族儿童健康对照组与重度低龄儿童龋组治疗前、后组的多样性指数比较，结果显示汉族和维吾尔族儿童龈上菌斑的多样性指数在对照组明显高于患龋组，而治疗后组间无显著差异。（表3.2）表3.2汉族和维吾尔族分类和多样性指数的比较Table3.2ComparisonofphylotypecoverageanddiversityestimationofHanandUygursIndex/GroupCFUSCUSCUTP1P2P3CFHSCHSCHTP1P2P3Cleanreads5587151697573930.0760.5340.0695259855409588190.3020.0530.279OTUs2722242625860.0360.3700.3092793252924480.1790.0660.658Chao13744337235590.0330.2790.2734885460342570.4470.0940.351Shannon6.2025.9646.0860.0210.2480.2246.1185.7695.7920.0110.0170.856Simpson0.0060.0080.0070.0290.1680.3960.0060.0110.010.0280.0720.672Good'scoverage0.9830.9830.9850.6990.130.060.9770.9780.9820.3480.0090.083P1是CFU组与SCU组的t检验比较；P2是CFU组与SCUT组比较；P3是SCU组与SCUT组比较；稀释性曲线（Rarefactioncurves）（图3.1A，B），丰度分布曲线（RankAbundance）（图3.1C，D）的结果表明，两民族重度低龄儿童龋治疗后组的样本，在物种的组成丰富度及均匀度上均较好，与治疗前样本无明显差异。ABCD图3.1样本稀释曲线和丰度分布曲线A.维吾尔族稀释曲线B.汉族稀释曲线C.维吾尔族丰度分布曲线D.汉族丰度分布曲线Figure3.1RarefactioncurvesandRankabundancecurve.（A.RarefactioncurvesofUygursB.RankabundancecurveofHanC.RarefactioncurvesofUygursD.RankabundancecurveofHan）67 新疆医科大学博士学位论文Chao1指数（图3.2A，B）和Shannon指数（图3.2C，D）的组间比较结果显示，两民族儿童各组样本中，健对照组菌斑微生物菌群多样性最高，重度低龄儿童龋组最低；治疗后汉族重度低龄儿童龋组与健康对照组之间的菌群多样性，差异有统计学意义（P＜0.01），而维吾尔族儿童患龋组治疗前、后的菌群多样性无显著差异。ABCD图3.2汉族和维吾尔族儿童多样性指数的对比（A.维吾尔族组Chao1指数B.汉族组Chao1指数C.维吾尔族组Shannon指数D.汉族组Shannon指数）Figure3.2ComparisonofdiversityestimationinHanandUygurschildren（A.Chao1indexofUygursB.Chao1indexofHanC.ShannonindexofUygursD.ShannonindexofHan）2.2.2Beta多样性分析基于WeightedUnifrac距离矩阵的主坐标分析结果显示，汉族组内健康对照与重度低龄儿童龋治疗前、后组样本的分布较为集中，未见明显差异（图3.3A）。而维吾尔族组内各样本的分布呈现离散趋势，健康对照组与重度低龄儿童龋组差异明显，而龋病治疗后组样本的分布介于健康与患龋组之间，提示患龋组治疗后的菌群出现向健康组聚集的趋势（图3.3B）。68 新疆医科大学博士学位论文AB图3.3基于加权距离矩阵Weightedunifrac的PCoA分析A.汉族组的PCoA分析图B.维吾尔族组样本的PCoA分析图Figure3.3PCoAbasedontheweightedUniFracdistances.A.PCoAofHansampleB.PCoAofUygurssample基于加权UniFrac距离矩阵值分别进行汉族和维吾尔族各组样本之间的两两比较。图3.4结果显示，汉族重度低龄儿童龋组在治疗前、后组内菌群成分相似，组间的差异无统计学意义（P>0.05），但两组与健康对照组之间的差异均有统计学意义（P＜0.01）。而维吾尔族儿童各组中，重度低龄儿童龋治疗后组内的微生物菌群成分处于健康与龋病组之间的过渡状态，健康对照组、重度低龄儿童龋治疗前与治疗后3组样本之间的差异均有统计学意义（P＜0.01）。图3.4汉族和维吾尔族儿童各组样本加权距离矩阵的比较（A.汉族儿童组B.维吾尔族儿童组，*代表p<0.05,**代表p<0.01）Figure3.4ComparisonoftheweightedUniFracdistanceofgroupsinHanandUygurschildren（A.GroupofHanchildrenB.GroupofUygurschildren.‘‘*’’indicatestaxawithp<0.05,‘‘**’’indicatestaxawithp<0.01）69 新疆医科大学博士学位论文2.2.3菌群结构的差异性分析2.2.3.1汉族患龋儿童治疗前、后各分类水平构成的差异性比较在菌门水平，SECC治疗后组的构成与治疗前无差异。优势菌门按丰度排列依次为：厚壁菌门（Firmicutes），变形菌门（Proteobacteria），梭状菌门（Fusobacteria），放线菌门（Actinobacteria），拟杆菌门（Bacteroidetes），候选菌门（TM7）（图3.5）。图3.5汉族儿童组菌门水平的菌群分布Figure3.5DistributionofthedifferentbacteriaatthephylalevelinHanchildren但梭状菌门（Fusobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）以及低丰度SR1菌门的丰度在SECC治疗后组与健康对照组之间的差异无统计学意义（P>0.05），拟杆菌门（Bacteroidetes）（治疗前P<0.01，治疗后P<0.001）和低丰度螺旋体菌门（Spirochaetes）（治疗前P<0.001，治疗后P=0.024）菌门的丰度在重度低龄儿童龋治疗后组与健康对照组间，差异有统计学意义，但与治疗前呈反向变化（图3.6）。图3.6汉族儿童菌门水平菌群的差异比较Figure3.6ComparisonofthemicrobialvariationsofHanchildrenatthePhylumlevel70 新疆医科大学博士学位论文菌属水平上，SECC治疗后组的16个优势菌属（约占总序列的92.7%）按丰度依次排列为：纤毛菌属（Leptotrichia）、链球菌属（Streptococcus）、奈瑟菌属（Neisseria）、放线菌属（Actinomyces）、二氧化碳嗜纤维菌属（Capnocytophaga）、韦荣菌属（Veillonella）、梭杆菌属（Fusobacterium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、劳特罗普氏菌属（Lautropia）、新月形单胞菌属（Selenomonas）、普氏菌属（Prevotella）、TM7-[G-1]、金氏菌属（Kingella）、Aggregatibacter、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、罗氏菌属（Rothia），弯曲菌属（Campylobacter）、Cardiobacterium（图3.7）。图3.7汉族儿童组菌属水平的菌群分布Figure3.7DistributionofthedifferentbacteriaatthegenuslevelinHanchildren其中，梭杆菌属（Fusobacterium）、放线菌属（Actinomyces）、Aggregatibacte、金氏菌属（Kingella）以及低丰度的嗜血杆菌属（Haemophilus）、Lachnoanaerobaculum、坦纳菌属（Tannerella）、Terrahaemophilus、Johnsonella、Lachnospiraceae_[G-3]、SR1_[G-1]、Eubacterium_[XI][G-7]、Peptostreptococcus、TM7_[G-5]等菌属的丰度在重度低龄儿童龋治疗后组与健康对照组之间的差异无统计学意义。纤毛菌属（Leptotrichia）、Moryella、Oribacterium菌属在SECC组治疗前、后的差异有统计学意义（P＜0.05）。普氏菌属（Prevotella）（治疗前P=0.094，治疗后P=0.042）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）（治疗前P=0.002，治疗后P=0.019）和低丰度的拟普雷沃氏菌属（Alloprevotella）（治疗前P=0.062，治疗后P=0.028）、密螺旋菌属（Treponema）（治疗前P<0.001，治疗后P=0.024）的丰度在重度低龄儿童龋治疗后组与健康对照组间差异有统计学意义，但与治疗前呈反向变化（图3.8）。71 新疆医科大学博士学位论文图3.8汉族儿童菌属水平菌群的差异比较Figure3.8ComparisonofthemicrobialvariationsofHanchildrenatthegenuslevel菌种水平上，重度低龄儿童龋治疗后组丰度>1%的优势菌种共26个（约占总序列的59.7%），按丰度依次排列为Neisseriapharyngis、殊异韦荣球菌（Veillonelladispar），马氏棒状杆菌（Corynebacteriummatruchotii）、Leptotrichiashahii、奇异劳特罗普氏菌（Lautropiamirabilis）、寡发酵链球菌（Streptococcusoligofermentans）、口腔链球菌（Streptococcusoralis），血链球菌（Streptococcussanguinis）、颊纤毛菌（Leptotrichiabuccalis）、Fusobacteriumnucleatumsspolymorphumoraltaxon202、口腔放线菌（Actinomycesoris）、港型纤毛菌（Leptotrichiahongkongensis）、生痰二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophagasputigena）、Actinomycesgerencseriae、Actinomycessp.oraltaxon848、Leptotrichiasp.oraltaxon462、Aggregatibactersegnis、Kingellaoralis、Fusobacteriumnucleatumssvincentiioraltaxon200、粘液奈瑟菌（Neisseriamucosa）、Porphyromonassp.oraltaxon279、Leptotrichiasp.oraltaxon498、Leptotrichiahofstadii、Veillonellaparvula、TM7[G-1]sp.oraltaxon347（图3.9）。72 新疆医科大学博士学位论文图3.9维吾尔族儿童组菌种水平的菌群分布Figure3.9DistributionofthedifferentbacteriaatthespecieslevelinUygurschildren其中，口腔放线菌（Actinomycesoris）、Fusobacteriumnucleatumsspolymorphumoraltaxon202、Fusobacteriumnucleatumssvincentiioraltaxon200、Aggregatibactersegnis以及低丰度的Prevotellaoris、Treponemaspp.、Selenomonasspp.、Porphyromonasspp.、Tannerellaspp.、Aggregatibacterspp.、Haemophilusspp.、Lachnoanaerobaculumspp.、Bergeyellaspp.等菌种丰度在重度低龄儿童龋治疗后组与健康对照组之间的差异已无统计学意义。一些低丰度的菌种Catonellamorbi、Streptococcuspneumoniae、Prevotellasaccharolytica、Campylobactershowae等在重度低龄儿童龋治疗后组与健康对照组间的差异性较治疗前明显增加。Leptotrichiahongkongensis、Campylobactershowae、Prevotellaoris等菌种的丰度在重度低龄儿童龋治疗后组与健康对照组间差异仍有统计学意义，但与治疗前差异呈反向变化（图3.10）。73 新疆医科大学博士学位论文图3.10汉族儿童菌种水平菌群的差异比较Figure3.10ComparisonofthemicrobialvariationsofHanchildrenatthespecieslevel2.2.3.2维吾尔族患龋儿童治疗前后各分类水平构成的差异性比较在菌门水平，龋病治疗后组的构成及丰度与治疗前无显著差异性（P>0.05）。优势菌门依次为：梭状菌门（Fusobacteria），厚壁菌门（Firmicutes），变形菌门（Proteobacteria），拟杆菌门（Bacteroidetes），放线菌门（Actinobacteria），候选菌门（TM7）（图3.11）。74 新疆医科大学博士学位论文图3.11维吾尔族儿童组菌门水平的菌群分布Figure3.11DistributionofthedifferentbacteriaatthephylumlevelinUygurschildren但梭状菌门、拟杆菌门、放线菌门以及低丰度GN02菌门的丰度在重度低龄儿童龋治疗后组与健康对照组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。厚壁菌门（治疗前P＜0.001，治疗后P=0.003）和SR1（治疗前P=0.011，治疗后P=0.027）菌门的丰度在重度低龄儿童龋治疗后组与对照健康组间，差异仍有统计学意义，但与治疗前呈反向变化（图3.12）。图3.12维吾尔族儿童菌门水平菌群的差异比较Figure3.12ComparisonofthemicrobialvariationsofUygurschildrenatthePhylumlevel菌属水平上，重度低龄儿童龋治疗后组的丰度较治疗前有所不同，16个优势菌75 新疆医科大学博士学位论文属（约占总序列的85.6%）依次排列为：纤毛菌属（Leptotrichia）、链球菌属（Streptococcus）、二氧化碳嗜纤维菌属（Capnocytophaga）、奈瑟菌属（Neisseria）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、梭杆菌属（Fusobacterium）、普氏菌属（Prevotella）、韦荣菌属（Veillonella）、放线菌属（Actinomyces），劳特罗普氏菌属（Lautropia），新月形单胞菌属（Selenomonas），TM7-[G-1]、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、罗氏菌属（Rothia）、弯曲菌属（Campylobacter）、嗜血杆菌属（Haemophilus）（图3.13）。图3.13维吾尔族儿童组菌属水平的菌群分布Figure3.13DistributionofthedifferentbacteriaatthegenuslevelinUygurschildren其中，韦荣菌属（Veillonella）、二氧化碳嗜纤维菌属（Capnocytophaga）以及低丰度的Megasphaera、金氏菌属（Kingella）、坦纳菌属（Tannerella）、孪生球菌属（Gemella）、伯杰菌属（Bergeyella）、颗粒链菌属（Granulicatella）、Ottowia在重度低龄儿童龋治疗后组与健康对照组之间丰度差异的显著性消失，其中孪生球菌属（Gemella）、二氧化碳嗜纤维菌属（Capnocytophaga）、Megasphaera、韦荣菌属（Veillonella）、金氏菌属（Kingella）的丰度在重度低龄儿童龋组治疗前、后的比较中，差异有统计学意义（P＜0.05）。梭杆菌属（Fusobacterium）（治疗前P＜0.001，治疗后2=0.007）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）（治疗前P=0.003，治疗后P=0.009）、链球菌属（Streptococcus）（治疗前P=0.014，治疗后P=0.027）和低丰度的SR1_[G-1]（治疗前P=0.011，治疗后P=0.027）菌门的丰度在重度低龄儿童龋治疗后组与健康对照组间，差异仍有统计学意义，但与治疗前呈反向变化（图3.14）。76 新疆医科大学博士学位论文图3.14维吾尔族儿童菌属水平菌群的差异比较Figure3.14ComparisonofthemicrobialvariationsofUygurschildrenatthegenuslevel菌种水平上，重度低龄儿童龋治疗后组丰度>1%的优势菌种共26个（约占总序列的59.1%），按丰度依次排列为口腔链球菌（Streptococcusoralis），马氏棒状杆菌（Corynebacteriummatruchotii）、Leptotrichiashahii、奇异劳特罗普氏菌（Lautropiamirabilis）、血链球菌（Streptococcussanguinis）、Neisseriapharyngis、Fusobacteriumnucleatumssanimalisoraltaxon420、小韦荣菌（Veillonellaparvula）、Fusobacteriumnucleatumsspolymorphumoraltaxon202、普氏菌（Prevotellasp.oraltaxon317）、殊异韦荣球菌（Veillonelladispar），生痰二氧化碳嗜纤维菌（Capnocytophagasputigena）、Capnocytophagaleadbetteri、Leptotrichiahofstadii、Corynebacteriumdiphtheriae、Haemophilusparainfluenzae、Rothiaaeria、粘液奈瑟菌（Neisseriamucosa）、奈瑟菌（Neisseriasp.oraltaxon016）、颊纤毛菌（Leptotrichiabuccalis）、Actinomycessp.oraltaxon171、Selenomonassp.oraltaxon140、颗粒二氧化碳噬纤维菌（Capnocytophagagranulosa）、内氏放线菌（Actinomycesnaeslundii）及Leptotrichiasp.oraltaxon392（图3.15）。77 新疆医科大学博士学位论文图3.15维吾尔族儿童组菌种水平的菌群分布Figure3.15DistributionofthedifferentbacteriaatthespecieslevelinUygurschildren其中，Veillonellaparvula、Veillonelladispar、Capnocytophagaleadbetteri、Streptococcussanguinis、Leptotrichiabuccalis以及低丰度的Veillonellaatypica、Megasphaeramicronuciformis、Haemophilusinfluenza、Porphyromonasspp.、Capnocytophagaspp.、Gemellaspp.、Kingellaspp.以及Tannerellaspp.等菌种的丰度在重度低龄儿童龋治疗后组与健康对照组之间差异显著性消失。Fusobacteriumnucleatumssanimalisoraltaxon420、Fusobacteriumnucleatumsspolymorphumoraltaxon202与健康对照组间的差异性较治疗前缩小。Capnocytophagaspp.、Veillonellaspp.、Gemellaspp.、Campylobacterspp.、Megasphaeramicronuciformis、Haemophilusinfluenza等菌种在重度低龄儿童龋组治疗前后的差异，均有统计学意义（P＜0.05）（图3.16）。78 新疆医科大学博士学位论文图3.16维吾尔族儿童菌种水平菌群的差异比较Figure3.16ComparisonofthemicrobialvariationsofUygurschildrenatthespecieslevel2.2.3.3治疗后两民族继发龋儿童菌种构成的变化龋病防治后1名维吾尔族儿童（龋坏牙位54，55）和2名汉族儿童（龋坏牙位55，74）出现继发龋坏外。菌种检出结果显示，继发龋样本内与SECC相关菌种的丰度分布与治疗前组丰度的均值相近或增高，详见表3.3。79 新疆医科大学博士学位论文表3.3继发龋样本中与SECC相关菌种的丰度分布Table3.3DistributionofSECC-relatedbacteriaabundanceinsecondarycariessamples继发龋继发龋治疗后治疗前汉族儿童SECC相关菌种样本1样本2均值均值Veillonelladenticariosi0.00467400.00326380.00396890.0039689Veillonelladispar0.09116400.06779870.07948140.0794814Aggregatibactersegnis0.04104610.03905520.04005070.0400507Aggregatibacterparaphrophilus0.00195460.00163980.00179720.0017972Terrahaemophilusaromaticivorans0.00735090.00689020.00712060.0071206Haemophilusparainfluenzae0.01506300.01209340.01357820.0135782Selenomonasdianae0.00807330.00636990.00722160.0072216Actinomycesjohnsonii0.00029740.00023650.00026700.0002670Actinomycesnaeslundii0.00601250.00696910.00649080.0064908继发龋治疗后治疗前维吾尔族儿童SECC相关菌种样本1均值均值Veillonelladispar0.06044830.01967020.0323555Veillonellaparvula0.08815210.02684370.0470770Veillonellaatypica0.00121890.00052270.0009065Streptococcussanguinis0.07676890.03233470.0393230Streptococcusoralis0.11333540.06856030.0659752Streptococcusperoris0.00706540.00432080.0041633Selenomonasdianae0.00004130.00028110.0002329Veillonelladenticariosi0.00274770.00026410.0002347Actinomycesjohnsonii0.00406980.00156020.00217512.2.4两民族儿童菌斑内差异菌种的相关分析根据两民族儿童各组内差异菌种的相对丰度，进行菌种间作用的相关分析。图中红色连线代表正相关，绿色联线代表负相关。圆的大小代表菌种丰度的高低，线的粗细代表相关度的大小。从图3.17中可看出，梭杆菌种（Fusobacteriumspp.）、坦纳菌种（Tannerellaspp.）和卟啉单胞菌（Porphyromonasspp.）3个健康对照组的核心菌群在汉族儿童菌斑微生物中正相关关系。密螺旋菌（Treponemaspp.）、Bacteroidales[G-2]spp.、普氏菌（Prevotellaspp.）、新月形单胞菌（Selenomonasspp.）、Veillonellaceae[G-1]sp.oraltaxon155、Catonellamorbi、Alloprevotellatannerae、80 新疆医科大学博士学位论文Alloprevotellarava、Peptostreptococcusstomatis及Streptococcuspneumoniae等健康对照组检出较高的菌种与它们相互间均呈现正相关关系。而重度低龄儿童龋组表达的差异性菌种主要为Actinomycesoris、Terrahaemophilusaromaticivorans、Aggregatibacteparaphrophilus、Aggregatibactersp.oraltaxon898及Haemophilusparainfluenzae它们与健康对照组菌群间呈现显著负相关性，其中Terrahaemophilusaromaticivorans、Aggregatibacteparaphrophilus、Aggregatibactersp.oraltaxon898及Haemophilusparainfluenzae4个菌种相互间呈现极强的正相关性，但它们与口腔放线菌（Actinomycesoris）间未见相关关系。图3.17汉族菌斑微生物差异菌种的相关性分析Figure3.17CorrelationanalysisofdifferentialplaquemicroorganismsinHanchildren从图3.18中可看出，治疗前后维吾尔族儿童牙菌斑内的差异微生物种以梭杆菌（Fusobacteriumspp.）、卟啉单胞菌（Porphyromonasspp.）、二氧化碳噬纤维菌（Capnocytophagaspp.）、坦纳菌（Tannerellaspp.）及伯杰菌（Bergeyellaspp.）等健康对照组的核心菌种为主，相互间呈现较强的正相关关系。与其呈正相关关系的低丰度Neisseriaelongata、Haemophilusinfluenzae、Kingellaoralis、Kingelladenitrificans、Kingellasp.oraltaxon012与Capnocytophagaspp.菌种间呈现出极强的正相关性。重度低龄儿童龋组表达的差异性物种相对较少，其中高丰度的韦荣菌（Veillonellaparvula、Veillonelladispar、Veillonellaatypica）和Megasphaeramicronuciformis等4个菌种间呈现出极强的正相关关系，并于Streptococcussanguinis和Streptococcusgordonii相互间呈正相关，它们与健康对照组的相关菌种均呈显著负相关。81 新疆医科大学博士学位论文图3.18维吾尔族菌斑微生物差异菌种的相关性分析Figure3.18CorrelationanalysisofdifferentialplaquemicroorganismsinUygurschildren3讨论本研究中我们对重度低龄儿童龋组的儿童进行了龋洞充填治疗和口腔保健指导。儿童家长的配合度和依从性较好，分别在治疗时和半年后接受了口腔健康教育和儿童口腔保健指导，并按要求对患儿进行了每周一次的辅助刷牙。30名重度低龄儿童龋儿童均于1年后进行了随访采样，取样部位、测序和生物信息的分析方法及机构一致。临床调查显示，30名重度低龄龋儿童口腔菌斑指数、牙龈指数、每日刷牙频次、每日含糖食品的摄入频次及父母辅助刷牙在治疗后均得到明显改善，除3名儿童新发龋坏以外，其他儿童的充填物完好，未见继发及新发龋坏。研究发现汉族和维吾尔族重度龋儿童牙菌斑微生物菌群中，与口腔健康儿童存在差异的微生物物种丰度在龋病防治一年后出现了明显健康趋势的演替。其中，汉族儿童菌斑中梭杆菌属、Aggregatibacte、金氏菌属、放线菌属以及低丰度的SR1[G-1]、Johnsonella、Eubacterium[XI][G-7]、TM7[G-5]、嗜血杆菌属、Oribacterium、Moryella、Peptostreptococcus、坦纳菌属等在龋病治疗后与健康对照组之间丰度差异的显著性消失，其中Moryella、Oribacterium在重度低龄儿童龋组治疗前、后丰度变化显著。而卟啉单胞菌属和密螺旋菌属与健康对照组间的差异性也较治疗前缩小。维吾尔族儿童菌斑样本中，优势韦荣菌属，二氧化碳嗜纤维菌属和低丰度的Megasphaera、孪生球菌属、金氏菌属、伯杰菌属、坦纳菌属、颗粒链菌属、Ottowia在龋病治疗后与健康对照组之间丰度差异的显著性消失，其中孪生球菌属、二氧化82 新疆医科大学博士学位论文碳嗜纤维菌属、韦荣菌属、金氏菌属及Megasphaera在重度低龄儿童龋组治疗前后的丰度变化明显。另外，梭杆菌属、卟啉单胞菌属、链球菌属和低丰度的SR1_[G-1]与健康对照组间的差异性较治疗前缩小。多样性指数结果显示，治疗后汉族儿童重度低龄儿童龋组与健康对照组之间的物种多样性仍存在显著差异，而维吾尔族重度低龄儿童龋组治疗前后的菌群多样性无显著差异。本研究发现两民族儿童在重度低龄儿童龋组与对照健康组之间存在差异性的属种较多，且不尽相同，但各种微生物群落经治疗干预一年后，在重度低龄儿童龋与健康对照组物种多样性的差异减小，物种丰度均呈现出明显的健康趋向的变化，说明有效的口腔卫生控制配合龋洞充填治疗可以缓解口腔微生态的失衡，促进菌斑微生物保持稳定。而继发龋损儿童的菌群丰度与防治前相近或增高。[132]Tao等研究发现，无龋儿童口腔微生物多样性明显高于SECC儿童龋病可能与微生物多样性降低相关。从健康到龋发生，菌斑微生物膜结构发生着群体化和致龋化的转变：某些致龋菌如变异链球菌、放线菌、小韦荣球菌、乳酸杆菌、普雷沃菌、口腔链球菌和中间葡萄球菌在患龋后的检出量增多，而与健康相关的细菌如血链球菌和拟杆菌等的检出量在患龋后则明显减少。龋性强的细菌可更好地适应不断变化的菌斑生物膜环境，成为优势细菌，加上龋损处可为致龋菌提供更多的附着点，[146]故致龋菌数目进一步增加，非致龋菌数目减少，从而微生物多样性降低。Klinke等对50名1~5岁的SECC儿童进行的为期1年的术后随访中发现，治疗后变异链球菌、乳杆菌和白色假丝酵母菌的数量明显降低，然而这种降低并不稳定，致龋菌的比例会随着时间呈线性增长，34%的患儿在1年内出现继发龋，而术前白色假丝酵母菌检出数目较多的儿童发生的继发龋率较高。儿童口腔微生物群落的纵向变化与龋发生相关。乳牙列有龋儿童进入恒牙列后其患龋风险远大于无龋儿童，所以乳牙列的患[147]龋状态可作为预测恒牙列患龋风险的指证之一。国内学者陈希对用免疫制剂和Duraphat®干预的患龋儿童唾液微中的链球菌数量进行追踪，结果发现2年的追踪中Duraphat®仅是在某一时间段对某种链球菌有明显抑制作用，而且仅在第一个月对[28]总链球菌数有抑制作用，随后出现回升，甚至超过对照组。Tanner用16SrRNA微阵列和PCR方法对85名2-6岁儿童的菌斑进行分析，其中53名重度低龄儿童龋给予治疗后监测12个月，并评估基线和随访微生物群与治疗后继发龋的相关性。结果发现与重度低龄儿童龋相关的变异链球菌在未出现继发龋的儿童菌斑中无检出，另外Streptococcusmitis、Campylobactergracilis、Campylobacterconcisus、Capnocytophagaspecies及Selenomonastaxa在菌群中的比例均有所下降；而Propionibacteriumpropionicum、Lautropiamirabilis及3种Capnocytophaga菌种在菌群中的比例有所增加，研究说明成功的治疗可以使菌斑微生物群落发生变化。以83 新疆医科大学博士学位论文[148-149]往的研究表明，人体不同部位的微生物群落可以保持数月甚至数年的稳定性，[150-151]但它们在短时间内也可能高度变化。个体之间和不同口腔部位之间菌群的组成差异很大。目前，菌斑微生物群被认为在“寡核苷酸表型水平”上有高度个体化，以群落稳定性为特征，但群落成员的相对丰度在不同个体之间和一定时间内存在多变[152]性。本研究未发现在龋病的演变中有“龋特异性”细菌存在，但观察到有丰度显著差异的“龋相关性”菌种在两民族儿童中发挥着各自不同的作用。从菌群相关分析的结果可以看出，非典型韦荣球菌、殊异韦荣球菌、Megasphaeramicronuciformis和链球菌种与龋病相关的主要菌群在治疗前、后重度低龄儿童龋菌斑中发挥着较强的协同作用，共同与健康对照组菌群相互拮抗。放线菌种、Aggregatibactespp、Terrahaemophilusaromaticivorans及Haemophilusparainfluenzae是汉族儿童龋病相关的主要菌群，其中Terrahaemophilusaromaticivorans、Aggregatibactespp.和Haemophilusparainfluenzae3种菌群相互间形成极强的正相关性，但它们与放线菌种间无协同作用。两组菌群分别与健康菌群间形成负相关的拮抗作用。此次研究通过两民族不同组间差异物种的相关分析，在菌群构成及丰度层面发现了一些两民族儿童菌斑微生物在民族和不同龋敏感状态下的异同。但是，菌群间的相互作用是一个复杂的系统网络，菌斑微生物群落中不同成员在参与健康和龋病间的相互功能作用，以及饮食等环境因素对疾病的影响还需要我们今后进行深入的表型和功能研究，以确定特定物种与龋病之间的作用机制。4小结本研究对汉族和维吾尔族重度低龄儿童龋进行口腔健康维护和龋齿充填治疗，利用高通量测序对治疗前后患龋儿童的龈上菌斑微生物构成及丰度变化，以及差异菌种间的相关关系进行分析。结果发现两民族重度低龄儿童龋组在治疗干预一年后与健康对照组微生物菌群多样性的差异减小，微生物物种丰度呈现出明显健康趋向的演替，而继发龋损儿童的菌群丰度与防治前相近或增高。两民族儿童菌斑微生物在龋病治疗后的演替过程中未发现有“龋特异性”细菌出现，但与龋病相关的菌种存在丰度的显著差异和相互间不同的菌群相关关系。84 结论结论新疆3-5岁汉族和维吾尔族儿童患病率高，充填率低是龋病高风险人群。研究两民族儿童龋病高危因素和口腔微生物群落结构多样性的差异及防治后的演变，综合分析宿主、口腔微生物与龋病的关系，有利于为当地低龄儿童龋的综合防控提供实验参考依据。本研究采用多阶段、随机、分层、整群抽样方法对喀什和伊宁市3~5岁汉族和维吾尔族两儿童进行口腔检查和问卷调查。对社会经济状况、饮食、口腔卫生习惯及口腔保健行为等差异因素进行logistic回归分析；首次采用基于16sRNA基因高通量测序技术，从微生物群落整体层面，对汉族和维吾尔族儿童龈上菌斑微生物群落构成和多样性进行对比分析；同时，对重度低龄儿童龋组儿童进行龋齿充填治疗和口腔保健指导，并于一年后随访以同位点及方法采集和对比分析龈上菌斑内微生物群落的变化及相关关系，研究结果发现：1、新疆3-5岁汉族和维吾尔族儿童低龄儿童龋患病率高，发病年龄早，充填率低，仍然是一个需要亟待解决的严重的公共健康问题。2、低龄儿童龋及重度低龄儿童龋患病率在两民族儿童间差异无统计学意义，但按民族因素分层比较，两民族儿童5岁年龄组ECC患病率（汉族82.7%，维吾尔族85.8%）均较高，汉族儿童农村SECC患病率（52.3%）较高，维吾尔族儿童5岁年龄组SECC患病率（45.3%）及伊宁市ECC患病率（84.7%）较高，差异均有统计学意义。3、年龄、农村生活、母亲受教育水平低下、母乳喂养、儿童看护者患龋、经常睡前进食以及缺乏口腔专科诊疗等因素是汉族儿童ECC和SECC患病的危险因素。年龄、地域、家庭收入低、儿童看护者患龋、高频率的含糖饮食、经常睡前进食、不刷牙或刷牙年龄较晚以及缺乏口腔专科诊疗等因素是维吾尔族儿童ECC和SECC患病的危险因素。4、两民族儿童龈上菌斑菌群的构成及多样性在民族间和患龋状态下均存在差异性。其中维吾尔族儿童龈上菌斑多样性高于汉族，口腔健康儿童菌斑微生物群落多样性高于患龋儿童；干预治疗后维吾尔族重度低龄儿童龋菌斑微生物多样性增高，汉族患龋儿童仍低于口腔健康儿童，差异有统计学意义。5、物种分类显示，放线菌属、球杆菌属、嗜血杆菌属、Terrahaemophilus是汉族SECC儿童中含量较高的优势菌属，而链球菌属和韦荣菌属是维吾尔族SECC儿童中含量较高的优势菌属。两民族SECC儿童组中，普氏菌属、拟普雷沃菌属和Abiotrophia在维吾尔族儿童组的含量明显高于汉族儿童；而金氏菌属在汉族儿童组明显高于维吾尔族儿童。6、两民族儿童菌斑中存在共同的核心菌种，但其丰度有着差异性的表达，其中85 新疆医科大学博士学位论文多种放线菌和Terrahaemophilusaromaticivorans是汉族儿童SECC组中起主要作用的核心菌种，而殊异韦荣菌、中国链球菌、月神新月形单胞菌和多种放线菌是维吾尔族儿童SECC组中起主要作用的核心菌种。9）龋病防治一年后，龋病儿童菌斑微生物的丰度呈现明显健康趋势的演替，而新发龋损儿童的菌群构成及丰度与防治前相近。7、良好的龋病防治可以促进菌斑微生物发生健康趋向的演替，而继发龋损儿童的菌群的丰度与防治前相近或增高。此变化过程与龋相关的菌种存在丰度的显著差异和相互间不同的菌群相关关系。8、本研究对新疆3-5岁汉族和维吾尔族儿童低龄儿童龋的流行病学、危险因素及牙菌斑菌群结构和多样性的差异及防治后的演变进行了对比分析，发现了两民族低龄儿童龋的分布特点、相关危险因素及龋好发牙位微生物群落特征及其在龋病防治后的演替，为了解当地低龄儿童龋流行特征、菌斑微生物与龋病之间可能的作用关系以及龋病的综合防治提供了综合的实验依据。86 致谢致谢五年博士生生活即将结束，站在人生的转折点上，所有的奋斗和辛劳都化为难忘的回忆，心生怀念，心存感激。此时此刻，我最想对我身边支持和鼓励我的家人，老师和朋友道声感谢，因为有你们，我才能顺利走过这段最重要而难忘的人生里程。衷心感谢新疆医科大学口腔医学院的培养，在这里我增长了知识，开阔了视野，也丰富了内心世界。衷心感谢我的导师赵今教授，感谢赵老师多年来对我的鼓励，在科研上的全力支持、在专业上的无私传授，以及在学习和生活上无微不至的关怀。我的每一个进步都与导师倾注的心血、操劳和教诲密不可分。赵老师心宽思远，博学宇闻，她严谨精益的工作作风以及为口腔医学事业奉献的精神是我终生学习的榜样。衷心感谢喀什市和伊宁市教育局领导及幼儿园老师们在流行病学调查中给与我们的热诚帮助。衷心感谢喀什市第一人民医院口腔科和检验科的同仁们在样本收集和口腔防治中给予我们的热忱帮助。衷心感谢新疆医科大学第一附属医院实验室的陈邦党副研究员、王慧、刘芬等老师在样本预处理过程中给予我的指导和帮助。衷心感谢在流行病学调查、防治及实验室期间阿依努尔、张婉婷、林静、候鑫杉、刘媛、李培森、于倩、马婷等师弟师妹们在资料收集、实验及论文撰写过程中给予我的无私帮助。衷心感谢新疆医科大学第五附医院院领导及门诊部所有同仁给予我的支持和帮助。衷心感谢我的爱人在我攻读博士期间对我的鼓励、包容和关爱！感谢亲人们一直以来对我的理解和支持！感谢答辩委员会的各位老师！最后，再次感谢一直支持我、理解我、给予我无限关爱的老师、同学、家人和朋友，感谢你们一路的陪伴！87 新疆医科大学博士学位论文参考文献[1]BenjaminRM.Oralhealth:thesilentepidemic[J].PublicHealthRep,2010,125(2):158-159.[2]MerrickJ,ChongA,ParkerE,etal.ReducingdiseaseburdenandhealthinequalitiesarisingfromchronicdiseaseamongIndigenouschildren:anearlychildhoodcariesintervention[J].BMCPublicHealth,2012,12:3.[3]LemosLV,MyakiSI,WalterLR,etal.Oralhealthpromotioninearlychildhood:ageofjoiningpreventiveprogramandbehavioralaspects[J].Einstein,2014,12(1):6-10.[4]ŠačićL,MarkovićN,MuratbegovićAA,etal.TheprevalenceandseverityofearlychildhoodcariesinpreschoolchildrenintheFederationofBosniaandHerzegovina[J].ActaMedicaAcademica,2016,45(1):19-25.[5]NaiduR,NunnJ,FordeM.OralhealthcareofpreschoolchildreninTrinidad:aqualitativestudyofparentsandcaregivers[J].BMCOralHealth,2012,12:27.[6]U.S.DepartmentofHealthandHumanServices.Preventionofdentalcariesinchildrenyoungerthan5yearsold:systematicreviewtoupdatetheU.S.PreventiveServicesTaskForceRecommendation[J].AHRQPublication,2014,ReportNo:12-05170-EF-1.[7]ChaffeeBW,ChengA.GlobalResearchTrendsonEarly-LifeFeedingPracticesandEarlyChildhoodCaries:aSystematicReview[J].OralDis,2014:675658.[8]NobileCG,FortunatoL,BiancoA,etal.PatternandseverityofearlychildhoodcariesinSouthernItaly:apreschool-basedcross-sectionalstudy[J].BMCPublicHealth,2014,14:206.[9]DoğanD,DülgergilCT,MutluayAT,etal.Prevalenceofcariesamongpreschool-agedchildreninacentralAnatolianpopulation[J].NatSciBiolMed,2013,4(2):325-329.[10]NunnME,DietrichT,SinghHK,etal.PrevalenceofearlychildhoodcariesamongveryyoungurbanbostonchildrencomparedwithUSchildren[J].PublicHealthDentistry,2009,3(69):156-162.[11]FolayanMO,KolawoleKA,OziegbeEO,etal.PrevalenceandearlychildhoodcariesriskindicatorsinpreschoolchildreninsuburbanNigeria[J].BMCOralHealth,2015,15:72.88 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参考文献[152]UtterDR,MarkWelchJL,BorisyGG.Individuality,stability,andvariabilityoftheplaquemicrobiome[J].FrontMicrobiol,2016,7:564.99 新疆医科大学博士学位论文附录附录1：知情同意书尊敬的家长：我们将邀请您的孩子参加一项《新疆维吾尔族和汉族儿童龋病高危因素及致龋细菌分子检测技术及防治方法研究》。在您决定是否参加这项研究之前，请尽可能仔细阅读以下内容，如果您愿意，您可以请您的医生给予解释，帮助您做出决定是否孩子参加本研究。一、研究目的我们衷心地希望您的孩子能参与该项研究。本研究为自治区科技支撑项目。本研究的目的是调查喀什地区喀什市3-5岁维、汉民族儿童的龋病患病情况，了解其发病的相关因素，探讨新疆喀什地区喀什市两民族及其它城市儿童乳牙患龋率和口腔卫生行为方面的差异，对研究少数民族儿童口腔疾病的防治工作提供科学依据。本研究已经得到新疆医科大学第一临床医学院伦理委员会审核，同意进行该项研究。此项研究是遵从赫尔辛基宣言原则，符合医学伦理规范。本研究本着自愿参加的原则，您的孩子有权在研究的任何阶段退出，这将不会影响您的孩子今后的检查及治疗。二、检查（研究）内容本研究将在新疆医科大学第一附属医院口腔科进行，预计有800-1000名受试者自愿参加。本研究由新疆医科大学一附院专门培训的医生及研究生得到家长同意后在所选幼儿园对受试者（包括汉族儿童和维吾尔族儿童）进行口腔体格检查并取高龋儿童和无龋儿童的唾液，对其进行细菌培养和检测，对两种民族儿童龋病的发病率及危险因素互相做对照研究，弥补新疆儿童口腔健康方面的缺陷。每个儿童的口腔检查需要1-2分钟。从检查，做基础实验，统计数据大约需要半年的时间。如果参加研究将需要做以下工作：A.在您的孩子入选研究前将接受以下检查以确定您是否可以参加研究，医生将询问、记录您孩子的病史，对您的孩子进行口腔体格检查，您的孩子需要配合医生留唾液样本。B.若您的孩子通过以上检查不合格，将需按医师的建议和治疗计划进行治疗，保证让孩子得到良好的口腔发育条件。100 附录三、风险本研究基本没有治疗风险，需要取患儿少量唾液检测口腔微生物及唾液流速流量。有可能因为孩子年龄小而引起他们的恐惧，需要你们跟他们做思想工作。您的孩子需要进行全面的口腔健康检查，这个过程需要您填写龋病相关因素问卷调查表，可能给您造成麻烦或带来不方便。如果在检查期间您的孩子出现任何不适，不管是否与研究有关，均应及时通知医生，他/她将对此作出判断并给与适当的医疗处理。四、获益患儿所做的口腔微生物检测以及唾液流速流量的测定的费用均由课题经费支出，我们在为您的孩子进行口腔检查及口腔卫生宣教的同时，会给您的孩子提供全面的口腔诊疗计划，如需要治疗的话，您可以到当地医疗机构进行治疗，自己将承担所需做的治疗费用。您可随时了解与本研究有关的信息资料，如果您有与本研究有关的问题，或有关于本项研究参加者权益方面的问题您可以联系我们。五、保密性尊重受试者及其家属的隐私，未经家属同意，除了已授权的研究人员之外，在任何时候不向其他人透露受试者的检查信息和检查结果。所采集的检查结果及资料仅用于科学研究。六、联系如果您对本研究的设计、过程和结果等有任何疑问，希望您与我们联系，电话：0991-4361216，我们将尽力回答您的疑问。感谢您的信任和支持！如果您是少数民族患者，将有通晓本民族语言医师为您解答疑问。本人（或直系亲属）已了解本研究的目的、内容、意义和风险，自愿参加本项研究。患者签名：年月日联系电话：患者直系亲属签名：年月日联系电话：医生（研究者）签名：年月日联系电话：101 新疆医科大学博士学位论文附录2口腔健康检查表基本信息：姓名：受检者编号：户口类型：□（1城市，2农村）性别：□（1=男，2=女）民族：□（1=汉族2=维吾尔族3其他）出生日期：检查者编号：□□检查日期：口腔检查：55555666665432112345龋齿上左龋齿龋齿右下龋齿88888777775432112345检查记录标准A无龋0B有龋1C已充填有龋1D已充填无龋0E因龋缺失1-因其它原因失牙牙龈出血指数计分标准F窝沟封闭0无G非龋全冠1有-未萌牙9不作记录W牙外伤X缺失牙N不作记录出血指数：102 附录牙结石指数（CI）软垢指数（DI）555165555165857175857175牙结石指数计分标准软垢指数计分标准（检查55、65、51、71的唇/颊面，75（检查55、65、51、71的唇/颊面，75及85的舌面记分为受检牙面记分之和的平及85的舌面记分为受检牙面记分之和的平均值）均值）0=无牙结石0=牙面无软垢1=龈上牙石覆盖牙面不超过1/31=软垢占牙面1/3及以下2=龈上牙石覆盖牙面1/3-1/2或牙颈部2=软垢占牙面1/3-2/3有散在龈下结石3=软垢占牙面2/3以上3=龈上结石超过牙面2/3或牙颈部结石连续而厚釉质情况：氟牙症四环素牙釉质发育不全氟牙症0=正常1=异常四环素牙0=正常1=异常釉质发育不全0=正常1=异常103 新疆医科大学博士学位论文错牙合畸形：1．磨牙关系：中性远中尖对尖完全远中近中尖对尖完全远中2．前牙覆盖：0-3mm3-5mm5-8mm>8mm3．前牙覆牙合：＜1/2>1/23/4全部覆盖4．前牙开牙合：＜3mm3-5mm>5mm5．前牙反牙合：反牙合位反覆盖mm6．拥挤：是否7．面部：唇腭裂外伤其他8．TMJ：无异常张口受限张口偏歪其他9．诊断：正常牙合安氏Ⅰ类错牙合安氏Ⅱ类错牙合安氏Ⅲ类错牙合104 附录附录3儿童口腔健康调查问卷亲爱的家长您好！这份答卷将有助于我们今后制定儿童口腔保健计划，因此希望您能认真阅读并填写好每一项内容，非常感谢您的配合！调查日期：被调查者编号：被调查者ID号：儿童姓名：性别：民族：1.男性；2.女性出生年月日：1．您是孩子的什么人？1）爸爸2）妈妈3）祖父/外祖父、祖母/外祖母4）亲戚2．孩子有几个兄弟姐妹？（请填数字）3．您孩子出生时的体重是克4．胎龄1）足月2）早产3）过期妊娠5．孩子母亲怀孕期间是否吸烟？1）是2）否6．孩子母亲怀孕期间父亲是否吸烟？1）是2）否7．孩子母亲怀孕期间是否有过精神压力？（如丧亲，家庭暴力等）1）有2）没有8．孩子的日常生活主要由谁来照顾？（只选一个答案）1）爸爸2）妈妈3）祖父/外祖父、祖母/外祖母4）亲戚5）保姆6）其他人员：9．孩子看护者是否患龋1）是2）否10．孩子出生后４个月内喂养的方式？（只选一个答案）1）完全母乳2）母乳喂养为主3）完全人工喂养105 新疆医科大学博士学位论文4）人工喂养为主5）母乳喂养和人工喂养各半11．您的孩子平时进食以下食品或饮料的频率如何?（每小题填一个答案填写）1>1次/天21次/天3＜1次/天4从不1）可乐/雪碧等碳酸饮料2）饼干/蛋糕/面包等甜点心3）糖果/巧克力4）新鲜水果5）糖水6）橙汁/苹果汁等果汁（不包括鲜榨果汁）7）牛奶/酸奶/奶粉12．您孩子在刷牙漱口后、睡前吃甜点或喝甜饮料吗？（只选一个答案）1）经常2）偶尔3）从不13．孩子是否有含奶瓶睡觉的习惯？（只选一个答案）1）经常2）偶尔3）从不14．是否有过夜间喂养习惯？1）有2）没有15．您孩子从几岁开始刷牙？（只选一个答案）1）半岁2）1岁3）2岁4）3岁5）4岁6）5岁7）从不刷牙或偶尔16．您孩子每天刷几次牙？（只选一个答案）1）1次以上2）1次3）不是每天刷4）从不刷牙17．对于孩子刷牙，您采取过以下措施吗？（每小题均选一个答案填写）1每天2每周3偶尔4从没做过1）帮助孩子刷牙2）检查孩子刷牙效果18．您听说过含氟牙膏吗？（只选一个答案）1）听说过2）没听说过19．您孩子现在用的是含氟牙膏吗？（只选一个答案）1）是2）不是3）不知道4）不用牙膏20．您认为使用含氟牙膏对牙齿有什么影响？（只选一个答案）1）有好处2）没用处3）有坏处4）不知道21．您孩子最近一次刷牙用的牙膏品牌是（请填写牙膏品牌）属于下列哪种牙膏（只选一个答案，由访谈员选择）1）刷牙不用牙膏2）不知道牙膏品牌3）不含氟化物及药物的普通牙膏4）含氟牙膏5）含中草药牙6）非中草药的药物牙膏7）不确定牙膏种类106 附录22．在过去的12个月内，您孩子是否有过牙痛或不适？（只选一个答案）1）从来没有2）有时候3）经常4）不清楚23．在过去的12月内，您的孩子是否因牙齿问题影响到咀嚼食物？（只选一个答案）1）从来没有2）有时候3）经常4）不清楚24．您上一次带孩子看牙距现在多长时间？1）从来没有2）2年以上3）6-12个月4）不到6个月25．您的孩子没看过牙的原因有哪一些？（可选多个答案）1）孩子的牙没问题2）孩子牙齿坏的不严重3）乳牙要替换，不需要看4）经济困难5）看牙不方便6）孩子害怕看牙7）没有时间带孩子去8）害怕传染病9）附近没有牙医10）很难找到信的过的牙医11）挂号太难12）其它26．您最近一次带孩子看牙的主要原因是什么？（只选一个答案）1）牙外伤2）急性牙疼3）慢性牙疼4）咨询5）定期检查6）接受预防性措施涂氟等7）牙齿排列不齐27．您的孩子上一次看牙，医生给做了什么治疗?1）拔牙2）补牙3）牙周治疗4）粘膜治疗5）正畸治疗6）检查牙齿7）乳牙窝沟封闭8）定期检查等预防措施9）其他治疗28．您孩子3岁以前是否有过以下疾病（可以选多个答案）1）肺炎/气管炎/哮喘2）心肌炎3）佝偻病（软骨病）4）高烧5）痢疾/腹泻6）肝炎7）贫血8）肾炎29．您的孩子是否有先天性唇腭裂？1）有2）没有30．您对您孩子的口腔健康及全身健康评价如何？（每小题均选一个答案填写）1很好2较好3一般4较差5很差1）口腔健康………2）全身健康………31．您对您孩子的牙齿外观是否满意?1）满意2）不满意107 新疆医科大学博士学位论文32．您是否同意下面的说法（每小题均选一个答案填写）（1同意，2不同意，3不知道）1）牙齿的好坏是天生的，和自己的保护关系不大口腔健康对自己的生活很重要母亲牙齿不好会影响孩子的牙齿33．您认为下面的说法对吗？（每小题均选一个答案）（1正确，2不正确，3不知道）1）乳牙坏了不用治疗2）窝沟封闭能预防儿童龋齿34．孩子母亲怀孕前是否进行过口腔保健指导？1）是2）否35．您的口腔保健知识是通过以下哪些途径获得的？（可以选多个答案）1）电视/广播2）报刊/杂志/科普读物3）家人/朋友4）医院宣传栏5）口腔医护人员6）社区健康教育活动7）孩子从幼儿园带回的知识8）孕妇学校9）以上都没有36．您更愿意从哪些途径获取口腔保健知识（可以选多个答案）1）电视/广播2）报刊/杂志/科普读物3）家人/朋友4）医院宣传栏5）口腔医护人员6）社区健康教育活动7）孩子从幼儿园带回的知识8）孕妇学校37．孩子母亲获得最高学历是什么？（只选一个答案）1）文盲2）小学3）初中4）高中、中专5）大专6）本科7）硕士及以上38．孩子父亲获得的最高学历是什么？（只选一个答案）1）文盲2）小学3）初中4）高中、中专5）大专6）本科7）硕士及以上39．您的职业是什么？（只选一个答案）1）行政管理人员2）专业技术人员3）办事员4）商业、服务业工作人员5）农、林、牧、渔、水利业生产人员6）生产、运输设备的人员7）军人8）其他从业人员9）无业40．您的家庭在过去一年内的总收入是：元41．您自评在当地的收入处于当地的何种水平：（只选一个答案）1）好2）中3）差十分感谢您的合作！108 附录附录4口腔健康检查回执单小朋友的家长您好，我们是新疆医科大学第一附属医院的医生，感谢您和小朋友对我们口腔健康检查项目的大力支持，检查结果见下表所示。我们给您的诊疗意见为：1．定期口腔检查，至少每年检查一次，以便及时发现异常及时处理。2．养成良好的口腔卫生习惯，做到饭后漱口，早晨和晚上都刷牙，每次刷牙时间不少于2-3分钟。牙刷和牙膏要选用儿童专用的产品，牙刷要2-3个月后更换一次。3．窝沟封闭：窝沟封闭的最佳年龄：3-4岁做乳牙封；6-7岁做第一恒磨牙封闭；12-13岁做前磨牙及第二恒磨牙的窝沟封闭。4．目前您的小朋友需要进行口腔治疗，请到正规医院的口腔科接受治疗。要做到以上几点并不难，关键在于要持之以恒。愿小朋友们都拥有健康而美丽的牙齿。牙列状况：55545352516162636465龋齿上左龋齿龋齿右下龋齿85848382817172737475A无龋F窝沟封闭B有龋G非龋全冠C已充填有龋X未萌牙D已充填无龋W牙外伤E因龋缺失N不作记录X因其它原因失牙治疗计划及建议：109 新疆医科大学博士学位论文综述高通量测序在口腔微生态与儿童龋病研究中的应用李艳综述赵今审校龋病是最常见的儿童慢性感染性疾病，其患病率高居儿童疾病首位，是患病率[1]第二位的儿童哮喘病的5倍。龋病对儿童身体健康的危害超过成人，这种危害不仅[2]可以导致乳牙的缺损、炎症、滞留，影响恒牙正常替换，还可以引起儿童口颌面部[3]发育不良、营养吸收障碍，并形成远隔器官病灶，导致严重的感染甚至致命，已成[4]为全球重大的公共健康问题之一。龋病发生、发展是微生物、饮食、遗传、行为习[5-6]惯和家庭社会经济状况等多种因素共同作用的结果。其中，微生物的存在和生态[7]失调是龋病发生、发展的先决条件和关键因素。口腔是人体最大的微生物栖息地之一，正常情况下，各种微生物在口腔不同部位共栖、竞争和拮抗，并在种群、数量或功能上保持一个动态平衡的微生态系。但局部、全身和（或）食物因素的改变，可引起口腔生态失调，使正常细菌演替成为条件致病菌引发龋病。口腔微生物种群复杂，对其多样性的认识很大程度上依赖于研究手段，目前，人类口腔中已发现700多种常见的口腔菌种，其中约有280种细菌已经从口腔中分离培养并命名，但只有[8]不到1/2的菌种可以在目前的培养条件下培养。采用常规的培养方法对口腔微生物多样性的研究多集中在口腔微生物种属组成多样性和表型多样性方面。由于绝大多数的微生物不能在实验室环境下生长，以培养技术为基础的研究结果可能具有严重[9]偏差。基于16SrRNA基因的高通量测序技术的发展是促进口腔微生物组学研究的[10]重要革新，该方法一次可对数百万个DNA分子进行大规模平行测序（massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS），样品中DNA被测序的次数反映其DNA丰度，使高通量测序技术具有理想的定量功能，是目前获取口腔微生物物种全基因组序列信息和多样性研究的最新手段和技术。本文将对高通量测序技术及其在儿童口腔微生态和儿童龋病研究中的应用做一综述。1高通量测序技术1.1高通量测序技术的分类高通量测序技术（High-throughputsequencing）又称下一代测序技术（next-[11]generationsequencing，NGS），也称第二代测序技术或者深度测序。该方法根据发展历史、测序原理和技术不同主要分为三种类型：合成测序（如Roche454焦磷酸测序、Illumina、IonTorrent系统）、连接测序（SOLiD，PolonatorG.007system）和单分110 综述子测序（Helicos，PacificBioSciences）。目前应用于口腔微生态研究的高通量测序平台主要为Roche公司基于焦磷酸测序原理的454测序仪（GSJunior，GSFLXsequencer），Illumina公司基于合成测序原理的Solexa基因组测序仪（GenomeAnalyzer[12]IIx，HiSeq2000/MiSeq）和ABI公司基于连接技术的SOLiD测序仪。1.2高通量测序技术的原理及优缺点[13]454焦磷酸测序的原理是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用，将PCR反应每一个碱基（dNTP）的延伸与一次荧光信号的释放偶联起来，通过记录荧光信号的有、无和强度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术读长可达400bp，准确且灵敏度高，在大基因组从头测序（denovo）、转录组分析、基因组结构分析等领域有着广泛的应用，但是费用较高，可出现同聚物错误导致的[14]误差。Solexa测序技术是基于焦磷酸测序的单分子阵列测试，采用边合成边测序（Sequencing-by-Synthesis，SBS）的技术，可在一个反应中同时加入4种荧光标记核苷，通过“去阻断—延伸—激发荧光—切割荧光基团—去阻断”这样一个循环的方法来依次读取目的DNA上的碱基排列顺序。该平台读取片段多，所需样本量少，高通量、高精确性，在兼容性、操作性和成本方面有着较大的优势，应用范围几乎囊括了目前基因组学研究的所有方面，例如基因组从头测序、重测序、基因组结构分析、转录组测序、表达谱分析、小RNA及非编码RNA测序、表观遗传学研究等。但其读取片段较短，后续序列拼接的计算量和难度均较大增加。SOLiD（Sequencing[15]byOligonucleotideLigationandDetection）原理是用连接法测序，获得基于“双碱基编码原理”的颜色编码序列，随后的数据分析比较原始序列和转换成的颜色编码的参照序列，最后将SOLiD颜色序列定位到参照序列上，同时校正测序错误。SOLiD平台系统灵活，完善的磁珠编码系统可以进行样品合并，分割测序区域，对每个碱基读取两次，有非常高的准确性，特别是对潜在SNP位点的检测。但其读长受连接反应的轮数限制，后续拼接工作较复杂。2儿童口腔微生态系2.1口腔微生态系的概念各种微生物在口腔不同生态区共栖、竞争和拮抗，并在种群及数量甚或功能上[16]保持一个动态平衡的自稳状态，共同组成口腔微生态系。由于解剖结构和理化性质的差异，人类口腔可划分为唾液、口腔软组织、牙齿及义齿等不同的生态区。口腔正常微生物群定植的种类和数量会随着不同发育时期口腔生态区的变化而随之变化。2.2不同发育期儿童口腔微生态特点根据口腔微生态环境变化特点，儿童的口腔微生态环境经历了无牙期、乳牙萌111 新疆医科大学博士学位论文出期、乳牙列期、混合牙列期和年轻恒牙列期。不同发育阶段口腔微生物的定植也不相同。其中，无牙期儿童口腔菌群数量少、种类简单，微生物群以需氧菌和兼性厌氧菌为主。各种链球菌是早期定植的微生物，唾液链球菌（S.salivarius）和缓症链球菌（S.mitis）在新生儿口腔中最早检出，并随着月龄的增长成为乳牙萌出前婴儿口腔的优势菌。韦荣球菌（Veillonellaspp.）是这一时期检出最多，同时也是最早定植人类口腔的厌氧菌。而乳牙的萌出使口腔解剖结构发生了变化，口腔滞留区的增加，牙面、龈沟、咬合面的窝沟点隙、相邻牙间等多个生态点和生态位的出现，给口腔微生物提供了更多复杂的定植生境，使婴幼儿口腔微生物的组成和数量明显[17]增多，特别是兼性厌氧和厌氧菌的定植和生长。Crielaard等研究发现，此期血链球菌（S.sanguinis）、变异链球菌（S.mutans）、放线菌（Actinomyces）和乳酸杆菌（Lactobacillus）开始定植和增加。其中，血链球菌在婴儿口腔早期定植的“感染窗口期”为出生后9个月，变异链球菌的定植为出生后19~31个月，血链球菌的早期定植[18]将影响其后定植的变异链球菌水平及其在牙面上的黏附。Holgerson等采用454焦磷酸测序和人类口腔菌群识别芯片技术对新生儿及其成长至3个月和3岁的口腔菌群进行纵向观测分析，发现菌群丰度和菌种多样性在出生后随着年龄明显增加，链球菌属（Streptococcus），韦荣球菌属（Veillonella）和孪生球菌属（Gemella）是3个月至3岁儿童口腔的核心菌属，乳杆菌属在儿童3个月时比例显著增高，其中，格氏乳杆菌（L.gasseri）为优势菌属，该研究印证了前期同类研究的结果。乳牙列期口腔生态基本处于平衡状态，口腔微生物以需氧菌和兼性厌氧菌为主，数量和组成基本稳定，但会受到全身健康状况、口腔卫生习惯、食物种类和家庭社[19]会经济地位的影响。Corby等研究发现，缓症链球菌、口腔链球菌（S.oralis）和唾液链球菌是乳牙列期儿童口腔唾液及口腔软组织表面的优势菌，而龈上菌斑中放线菌属的检出远高于唾液和软组织表面，具核梭杆菌（F.nucleatum）则在舌背样本中检出较高。4岁左右随着生理间隙的出现，乳牙邻面和被磨耗的咬合面点隙裂沟成为易清洁区，厌氧菌检出下降，需氧和兼性厌氧菌的比例有一定升高。混合牙列期，随着牙齿及牙面数目的增多及牙列的暂时性拥挤，厌氧菌检出呈现上升趋势。牙齿光滑面以黏附性强的需氧菌为主，邻面及点隙裂沟部位变异链球[20]菌、血链球菌、放线菌及韦荣球菌等兼性厌氧菌和厌氧菌的检出率较高。此时期无龋儿童口腔微生物以甲型溶血性链球菌、副血链球菌（S.parasanguinis）及韦荣球[21]菌等检出率较高，而龋活跃儿童以放线菌、变异链球菌和乳杆菌为主。另外，混合牙列期的暂时性牙列拥挤也可能导致口腔中出现一些牙周致病菌，如牙龈卟啉单胞菌、中间型普雷沃菌或螺旋体的检出增加，这些牙周致病菌在健康儿童口腔中是[22]暂时存在，到年轻恒牙列期后才会稳定。年轻恒牙列期的口腔微生态特点：出于一个相对稳定和持续的峰顶群落期。唾112 综述液中的微生物数量比乳牙列期明显增加，厌氧菌的大量定植和数量增加是此期口腔[23]菌群的主要特点。口腔微生物群种类逐渐增加，普雷沃菌、梭杆菌、卟啉单胞菌、二氧化碳嗜纤维菌、消化链球菌及优杆菌为常被检出的厌氧菌，青春期龈炎的高发病率可能与这些菌的增加密切相关。另外，韦荣菌属、假丝酵母菌和螺旋体的检出[17]亦逐渐增加。健康儿童口腔中链球菌属占了较大比例。Crielaard等研究乳恒牙列口腔微生物的菌群构成发现，韦荣菌属和普氏沃菌属的定植随儿童年龄的增长而增加。3高通量测序技术在儿童口腔微生态与龋病研究中的应用现代分子生物研究结果已表明，微生物群落改变是导致口腔多种感染性疾病的[]关键因素24。龋病并不是由变异链球菌或其他任何一种细菌单独引起，而是牙菌斑生物膜中各种产酸菌相互作用的结果，这种以群落和微生物生态为基础的病原理论说明微生物群落中的每个个体均参与了疾病的发生、发展过程，无论是高丰度成员[16]或是低丰度成员都可能是群落行为表现中的关键物种。因此，全面认识口腔微生态菌群构成多样性和演替对龋病的研究至关重要。3.1儿童龋不同敏感状态的菌群多样性[25]Ling等采用454焦磷酸测序方法对60名3-6岁有龋儿童和无龋儿童口腔牙菌斑和唾液的微生物菌群多样性进行对比分析，结果发现有龋儿童口腔微生态多样性明显下降，龈上菌斑中链球菌属、韦荣球菌属、放线菌属、颗粒链菌属、纤毛菌属和硫单胞菌属以及表兄链球菌、中间链球菌、阴道乳杆菌、发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、衣氏放射菌、棒状杆菌属等含量较高，这些细菌相互作用，逐渐破坏生态平衡，[26]最终导致龋病发生。Papaioannou等对3-5岁有龋和无龋儿童龈上菌斑的分析中，发现大量维持口腔微生态与致龋菌抗衡的有益菌，其中，轻唾链球菌和弯曲杆菌属仅在健康儿童中出现，且链球菌属中血链球菌、缓症链球菌和口腔链球菌在健康组[27]中出现频率较高，而二氧化碳嗜纤维菌和普雷沃菌则在龋病组中含量下降。Jiang等用焦磷酸测序方法分析重度低龄儿童龋的牙菌斑菌群微生物，结果发现链球菌属、颗粒链菌属和放线菌属的丰度在重度龋儿童牙菌斑中显著增加，可能是菌群中的核心菌属，此结果提示龋病的发生可能源自致龋菌群结构的转变，而并非存在特殊致龋菌。[28]Tanner等对2-6岁重度龋儿童治疗前后口腔菌群的分析发现，重度龋儿童牙菌斑中Slackiaexigua、副血链球菌和普氏杆菌的检出率明显高于无龋儿童。治疗6-12月后未再新发龋齿的儿童菌斑中，变异链球菌、缓症链球菌、纤细弯曲菌、简明弯曲菌、二氧化碳噬纤维菌和月形单胞菌属含量明显下降，而丙酸丙酸杆菌、奇异劳特罗普氏菌和二氧化碳嗜纤维菌检出率明显增高。而再次发生龋坏的儿童，其菌斑113 新疆医科大学博士学位论文微生物的构成则与治疗前无显著变化。3.2儿童龋不同进展阶段的菌群多样性[29]研究发现龋坏进展的不同阶段，口腔菌群亦有不同。Jiang等采用454焦磷酸测序方法对60名3-7岁不同龋损发展阶段儿童口腔微生物菌群多样性进行对比分析，结果发现微生物种群的不同依赖于龋坏的状态，牙本质龋中菌群的多样性低于釉质光滑面龋和龋白斑。与健康牙齿相关的有二氧化碳噬纤维菌属、梭杆菌属、普啉单胞菌属、乏氧菌属、从毛单胞菌属、福塞斯坦纳菌属、艾肯氏菌属、密螺旋体菌属、放线棒菌属等13个菌属，而短小杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、Olsenella、Scardovia、Shuttleworthia和链球菌属则在牙本质龋中明显增加。另外，放线菌属和棒状杆菌属在龋白斑中有很高水平的检出，而黄杆菌属、奈瑟菌属、伯杰菌属和德克斯氏菌属[30]则在患龋儿童的光滑牙面上检出较高。Gross等对龋病进展过程中无龋牙面、白斑、龋洞以及龋坏进展和静止期各阶段菌斑内菌群进行检测，发现变异链球菌在很多样本中是优势菌，但不是全部。含量很低或没有变异链球菌的龋坏组中唾液链球菌、表兄链球菌和副血链球菌与龋患有显著相关性。在没有变异链球菌和其它产酸菌种时，韦荣球菌可以预测未来龋患。患龋儿童口腔中的微生物菌群多样性低于健康儿[31]童。Richards等通过研究儿童牙菌斑微生物从健康釉质表面向釉质龋、牙本质龋发展过程中的菌群演变，发现与无龋牙表面菌斑和活跃性牙釉质龋的釉质病损样本不同，活跃性牙本质龋的牙本质病损样本中微生物菌群存在显著特异性。众所周知的产酸耐酸菌，例如，变异链球菌、Scardoviawiggsiae、Parascardoviadenticolens和唾液乳酸杆菌在活跃性牙本质龋的牙本质病损样本中均有显著差异的检出。相反，血链球菌和已明确的奈瑟球菌及纤毛杆菌在无龋牙釉质菌斑样本中的检出明显高于患龋组样本。作为龋病活跃性早期指标的小韦荣球菌、殊异韦荣球菌在无龋釉质向牙本质龋发展过程中的检出较高且比例呈递增趋势。另外，有较强糖分解能力的纤毛菌种498与呈现相似检出结果。但是，与无龋儿童健康牙表面菌群微生物相比，活跃性牙本质龋健康牙表面的微生物菌群却与釉质龋损样本更为相似。这些不同位点菌群结构的变化揭示了菌群微生物间更多样的内在联系，作为菌斑生物膜系统的组成部分，任何一个菌群微生物结构的改变都可能对其他菌群造成影响，甚至破坏微生态平衡导致疾病形成。3.3儿童龋不同发育阶段的菌群多样性[18]Holgerson等采用454焦磷酸测序和人类口腔菌群识别芯片技术对新生儿及其成长至3个月和3岁不同发育阶段的口腔菌群进行观测分析，发现3个月时口腔微生物菌群除了乳杆菌属外没有和龋病进展相关的菌群。而3岁时菌群多样性增加，[32]放线菌属、奇异菌属、杆菌属和链球菌属成为与龋病相关的主要菌种。Xu等采用454焦磷酸测序方法对19名第二乳磨牙未萌出期的有龋儿童和无龋儿童口腔牙菌斑114 综述菌群多样性进行对比分析，结果显示有龋和无龋儿童口腔菌群的种类及丰度不同。纤毛菌属、链球菌属、放线菌属、普氏菌属、普啉单胞菌属、奈瑟菌属和韦荣菌属占据了该阶段研究儿童口腔菌群的大部分比例，其中，链球菌属在所有样本中均有检出，但在患龋儿童中的比例高于无龋儿童。链球菌属和韦荣菌属与龋病相关，纤毛菌属、月形单胞菌属、二氧化碳噬纤维菌属、梭杆菌属、普啉单胞菌属与无龋儿[17]童更为关联，奈瑟菌属和普氏菌属介于二者之间。Crielaard对乳牙列期、混合牙列期早期和末期，以及年轻恒牙列期，4个不同发育阶段儿童口腔菌群的焦磷酸测序分析发现，尽管牙齿的萌出使口腔生态发生了显著变化，但是口腔微生物物种仍保持着相对的稳定。厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门在不同牙列期均为优势菌门。乳牙列中变形菌门（丙型变形菌纲，莫拉式菌科）的比例高于拟杆菌门，而在其他牙列期，两菌门的丰度相近。相对年长儿童，假单胞菌目、莫拉式菌科、肠杆菌科等与益生菌无关联的一些菌群，在低龄儿童口腔中比例相对较高。另外，拟杆菌门（尤其是普氏菌属）、韦荣球菌科、螺旋菌门及TM7随着年龄的增长增加，而颗粒链菌属则与之相反，反映出年龄的生物性改变会驱使菌群微生物的成熟。参考文献[1]BenjaminRM.Oralhealth:thesilentepidemic[J].PublicHealthRep,2010,125(2):158-159.[2]MerrickJ,ChongA,ParkerE,etal.ReducingdiseaseburdenandhealthinequalitiesarisingfromchronicdiseaseamongIndigenouschildren:anearlychildhoodcariesintervention[J].BMCPublicHealth,2012,12:323.[3]CasamassimoPS,ThikkurissyS,EdelsteinBL,etal.Beyondthedmft:thehumanandeconomiccostofearlychildhoodcaries[J].JAmDentAssoc,2009,140:650-657.[4]KanasiE,DewhirstFE,ChalmersNI,etal.Clonalanalysisofthemicrobiotaofsevereearlychildhoodcaries[J].CariesRes,2010,44:485-497.[5]KimSeowW.Enviromental,maternal,andchildfactorswhichcontributetoearlychildhoodcaries:aunifyingconceptualmodel[J].IntPaediarDent,2012,22:157-168.[6]RogerChou,AmyC,BernadetteZ,etal.Preventingdentalcariesinchildren<5years:systematicreviewupdatingUSPSTFrecommendation[J].Pediatrics,2013,132(2):332-350.[7]MaC,ChenF,ZhangY,etal.Comparisonoforalmicrobialprofilesbetween115 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新疆医科大学博士学位论文攻读博士学位期间获得的学术成果1论著[1]YanLi,JibiekeWulaerhan,YuanLiu,AyinuerAbudureyimu,JinZhao.PrevalenceofsevereearlychildhoodcariesandassociatedsocioeconomicandbehavioralfactorsinXinjiang,China:across-sectionalstudy.BmcOralHealth,2017,17:144.[2]WantingZhang,YanLi,JingLin,AynurAbduryim;JinZhao.CariogenicityofCandidaalbicansofdistinctgenotypesin3-5-year-oldUygurchildreninKashgar,China.BmcOralHealth,2018,18:203.[3]张婉婷,李艳,阿依努尔.阿不都热衣木,赵今.喀什市3-5岁维吾尔族儿童婴幼儿龋相关因素的主成分分析,口腔医学研究杂志,2016,32(4):365-369.[4]张婉婷,李艳*,刘媛,赵今.喀什市3-5岁维吾尔族､汉族儿童患龋情况及风险性评估.中国微生态杂志,2016,9(28):1044-1048.[5]李培森,梁秋娟,李艳*.老年2型糖尿病患者糖化血红蛋白水平与牙周指数的相关性研究.中华老年口腔医学杂志,2017,15(6):344-348.[6]李培森,李贺,李艳*.2型糖尿病患者血清学指标与慢性牙周炎进行性表现的相关性.口腔疾病防治,2018,7(26):456-459.[7]李艳,于倩,孙玉亮,赵今.22例维吾尔族上颌第一磨牙根管系统的三维影像分析.牙体牙髓牙周病学杂志,2016,26(1):703-706.2项目[1]国家自然科学基金项目，新疆维吾尔族和汉族儿童龋病高危因素流行病学及细菌种属多样性的分子生物学对比研究（81360167），2014/01-2017/12，参加[2]新疆研究生科研创新项目，喀什市低龄儿童龋病患病调查及风险性评（XJGRI2015076）2015/01-2015/07，主持[3]新疆维吾尔自治区科技厅自然科学基金项目，2型糖尿病患者牙周病患病情况调查及PRECEDE分析（2015211C168）2015/01-2017/12，主持118 个人简历个人简历李艳，共产党员，副主任医师，讲师，新疆医科大学口腔临床硕士生导师。现任新疆口腔医学会牙体牙髓专委会常务委员和中华口腔医学会老年口腔专业委员会委员。1994年参加工作以来一直从事牙体牙髓、牙周及儿童口腔疾病的临床、教学及科研工作。2009年获得新疆医科大学口腔医学硕士学位，2013年攻读新疆医科大学口腔医学博士学位。导师：赵今教授。研究方向：龋病防治。本人在学位期间较好地完成了博士研究生的学位课程及培养方案中要求的相关培养环节。在导师的指导下，申请并完成了新疆维吾尔自治区科技厅自然科学基金项目和新疆研究生科研创新项目各一项，发表论文7篇，获得2014及2015年度自治区学业三等奖学金。学业期间的科研工作表明该生已具有良好的科研素质和临床工作能力。论文完成以后，在同行专家中进行了评阅，认为她的科研工作达到了博士研究生所具备的水平，具备答辩资格。导师对她的基础理论、专业知识、外语水平、科研能力、学术作风和论文情况做出了综合评语，同意申请论文答辩。119