激活前扣带皮层κ-阿片受体对缓解大鼠痛情绪作用的研究

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分类号：R338学校代码：10114密级：学号：041510517硕士学位论文激活前扣带皮层κ-阿片受体对缓解大鼠痛情绪作用的研究Studiesofactivatingtheκ-opioidreceptorinACCtoalleviatetheaffectivepaininrats研究生：贾欣指导教师：张宇教授专业名称：生理学研究方向：疼痛及其调制学位类型：学术学位所在学院：基础医学院中国山西二〇一八年六月一日 分类号：R338学校代码：10114密级：学号：041510517激活前扣带皮层κ-阿片受体对缓解大鼠痛情绪作用的研究Studiesofactivatingtheκ-opioidreceptorinACCtoalleviatetheaffectivepaininrats研究生：贾欣指导教师：张宇教授专业名称：生理学研究方向：疼痛及其调制学位类型：学术学位所在学院：基础医学院中国山西二〇一八年六月一日 学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师张宇教授指导下，本人独立完成的研宂成果。文中任何引用他人的成果，均己做出明确标注或得到许可．论文内容未包含法律意义上己属于他人的任何形式的研宄成果，也不包含本人己用于其他学位申请的论文或成果一？与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本文如违反上述声明，愿意承担以下贵任和后果：１、交回学校授予的学位证书；２、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报；３、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道歉；４、本人负贵因论文成果不实产生的法律纠纷。１Ｋ论文作者签名：＼日期：年」月」＾日＿学位论文版权使用授权书本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被査阅和借阅；本人授权山西医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山西医科大学，保密论文在解密后应遵守此规定（）：执：／月论文作者签名曰＞年／Ｂ期婷年Ｈ：：少＇／月／指导教师签名日期存（声明）本的版归山西医，经许可，何单位及任人得揸用权科大所有未任何个不自使学 目录中文摘要................................................................................................................................I英文摘要.............................................................................................................................VI常用缩写词中英文对照表..............................................................................................XIII前言...................................................................................................................................11材料与方法......................................................................................................................41.1实验动物及分组.....................................................................................................41.2实验药品及主要试剂.............................................................................................41.3主要实验装置及仪器.............................................................................................51.4实验方法.................................................................................................................61.5统计分析...............................................................................................................112结果............................................................................................................................122.1大鼠rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以抑制CFA引起的条件性位置回避反应..........................................................................................122.2大鼠rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以抑制CFA引起的神经元放电频率的增加......................................................................................172.3大鼠rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以上调κ-阿片受体的表达水平，下调CFA引起的NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平的增加..........................................................................................243讨论............................................................................................................................273.1κ-阿片受体激动剂本身不会影响CPA反应及rACC脑区神经元的放电活动283.2rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂不影响大鼠的热痛行为............................283.3rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂可以缓解大鼠的痛情绪反应....................283.4激活rACC脑区κ-阿片受体可下调NMDA受体磷酸化水平缓解大鼠的痛情绪反应......................................................................................................................294结论............................................................................................................................31 参考文献.............................................................................................................................32综述.................................................................................................................................36致谢.................................................................................................................................47个人简历.............................................................................................................................48 山西医科大学硕士学位论文激活前扣带皮层κ-阿片受体对缓解大鼠痛情绪作用的研究摘要目的：慢性持续性疼痛作为一种对经济、社会产生重大影响的疾病，一直备受关注。长久以来慢性疼痛给患者带来的不仅是难以忍受的疼痛感受，更为严重的是还会产生影响人们身心健康的负性情绪。与痛感受相比，介导痛情绪的神经传导通路及其产生的中枢机制大为不同。许多临床前研究都表明大脑额叶内侧的前扣带皮层（anteriorcingulatecortex，ACC）参与处理痛情绪，ACC尤其是其吻侧部（rostralACC,rACC）接收来自于内侧丘脑以及皮层区域的痛信号输入，参与了与疼痛相关的负性情绪的形成和调节。动物行为学、电生理学等相关实验研究也表明，前扣带皮层主要参与情感功能，在痛情绪的处理中起重要作用。有实验观察到化学损毁ACC的头端，可抑制福尔马林引起的条件性位置回避反应（conditionedplaceavoidance,CPA）。已知ACC脑区内主要有三类阿片受体：μ-、δ-和κ-阿片受体。我们的前期研究已经证实，激活rACC脑区神经元μ-、δ-阿片受体可以下调rACC脑区NMDA受体的磷酸化水平，抑制由完全弗氏佐剂（completeFreund’sadjuvant,CFA）诱导rACC神经元放电频率的增高，反转C-CPA反应从而缓解痛情绪，但激活κ-阿片受体是否有类似的作用并不清楚，因此本课题就此进行深入探讨。本实验拟以大鼠脚掌注射CFA诱导的条件性位置回避（C-CPA）模型作为痛情绪的测量指标，并在rACC脑区内分别微量注射不同浓度κ-阿片受体激动剂DynorphinA，采用行为学、在体多通道电生理记录技术、蛋白印记技术探讨此实验中激活rACC脑区内κ-阿片受体是否可以缓解痛情绪反应。方法：1．建立炎性疼痛模型I 山西医科大学硕士学位论文本实验选取成年雄性SD（SpragueDawley）大鼠，体重250-270g，左侧后脚掌皮下注射0.08ml完全弗氏佐剂（CFA），建立炎症性疼痛模型。左侧后脚掌皮下注射0.08ml生理盐水（NS）组和足底未注射组作为对照。2．建立C-CPA模型将大鼠随机分为3组：（1）脚掌未注射组；（2）脚掌注射生理盐水（NS）组；（3）脚掌注射CFA实验组；每组6-8只。大鼠通过左侧脚掌皮下注射CFA引起慢性炎症性疼痛，并与可识别和记忆的的环境耦合，建立条件性位置回避（C-CPA）模型，大鼠在痛环境适应前后比较在痛侧停留的时间，并计算回避分数（CPAScore），以此来观察大鼠是否产生了条件性位置回避反应。3．检测热缩足潜伏期（PawWithdrawalLatency，PWL）在左侧脚掌注射CFA的前一天和第二天分别检测各组大鼠的PWL，观察注射CFA以及rACC注射不同浓度的DynorphinA后大鼠热痛行为的变化。4.利用在体多通道电生理技术记录、处理、分析rACC脑区神经元的放电活动。5．通过western-blot检测κ-阿片受体和NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平在所有行为实验完成之后，取大鼠rACC脑区组织，通过western-blot技术检测各组大鼠rACC脑区内κ-阿片受体和NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平。6．实验分组根据左侧脚掌皮下注射CFA/NS，rACC脑区分别注射不同浓度的DynorphinA/NS，将大鼠分为以下12组。12组动物（n=6-8只/组）=2（CFA、NS）×6（五个浓度的κ阿片受体激动剂、NS）结果：1．大鼠rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以抑制CFA引起的条件性位置回避反应（1）给大鼠左后脚掌皮下注射CFA后，大鼠对热的缩足潜伏期（PWL）明显减少，痛模型成功建立。II 山西医科大学硕士学位论文大鼠左侧后脚掌未注射组、注射NS组、CFA组比较，注射CFA组大鼠PWL第三天与第一天的baseline值相比明显减小，有统计学差异（P＜0.05）；注射NS组和未注射组的PWL第三天与第一天的baseline值相比均无差异（P＞0.05）。以上表明给脚掌皮下注射CFA诱导了大鼠的炎性疼痛。（2）CFA皮下注射于大鼠的左侧后脚掌，使得大鼠产生条件性位置回避反应脚掌注射CFA组，大鼠痛环境匹配前后第三天在痛侧停留的时间明显小于第一天（P＜0.05），说明对环境产生厌恶反应。脚掌未注射组和脚掌注射NS组，大鼠痛环境匹配前后第三天在痛侧停留的时间和第一天相比都没有显著性差异（P＞0.05），两组回避分数间没有差别（P＞0.05），结果显示CFA注射于后脚掌使大鼠产生了CPA发应。（3）在rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以抑制CFA引起的条件性位置回避反应在左侧脚掌皮下注射NS，rACC内注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA或NS，即NS+κ-阿片受体激动剂组和NS+NS组，这两组大鼠在脚掌和rACC注射后分别在驻留环境（痛环境）条件化适应，在环境适应后第二天（实验第三天）大鼠在痛侧环境停留的时间与第一天相比都没有统计学差异（P＞0.05），且两组的回避分数之间也无统计学意义（P＞0.05），说明DynorphinA本身不会影响大鼠的CPA反应。在左侧脚掌皮下注射CFA，rACC内分别注射0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μL、5μg/μL、10μg/μL的κ-阿片受体激动剂DynorphinA或NS。各组大鼠脚掌注射CFA并与痛环境匹配后，5μg/μL和10μg/μL的DynorphinA给药组大鼠第三天在痛侧停留的时间与第一天相比均无统计学差异（P＞0.05），而在rACC分别给予NS、0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μLDynorphinA的大鼠第三天在痛侧停留时间均小于第一天，差异具有统计学意义（P＜0.05）。回避分数：CFA+NS组与CFA+5μg/μLDynorphinA回避分数具有统计学差异（P＜0.05）；CFA+NS组与CFA+10μg/μLDynorphinA回避分数也具有统计学差异（P＜0.05），而CFA+5μg/μL和CFA+10μg/μLDynorphinA两组的回避分数之间无统计学差异（P＞0.05），这表明在rACC脑区分别给予5μg/μL和10μg/μL的DynorphinA可抑制大鼠的CPA反应。大鼠左侧足底注射CFA，rACC内分别注射0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μL、5μg/μL、10μg/μL的DynorphinA或NS，各组大鼠PWL值第三天与第一天比均减小，III 山西医科大学硕士学位论文差异具有统计学意义（P＜0.05），说明rACC内注射DynorphinA不影响CFA引起的热痛敏感性的增加。2.大鼠rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以抑制CFA引起的神经元放电频率的增加（1）CFA皮下注射于大鼠的左侧后脚掌后，rACC脑区神经元放电频率增加脚掌注射CFA组，条件匹配后第三天大鼠在痛环境和非痛环境rACC脑区神经元的放电频率相比，在痛环境的放电频率明显高于非痛环境，差异具有统计学意义（P＜0.05）；脚掌注射CFA组大鼠条件匹配后第三天痛侧的rACC脑区神经元放电频率与NS组、Naïve组相比，放电频率都明显增加（P＜0.05），表明CFA注射于大鼠后脚掌使rACC脑区神经元放电频率增加。（2）κ-阿片受体激动剂DynorphinA本身不影响rACC脑区的放电活动左侧后脚掌皮下注射NS，rACC内注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA或NS，即NS+κ-阿片受体激动剂和NS+NS两组，这两组大鼠匹配后第三天痛侧的rACC脑区神经元放电频率分别与非痛侧相比，均无差异（P＞0.05），且两组的痛侧放电频率相比也无差异（P＞0.05），表明激动剂本身不影响rACC脑区的放电活动。（3）κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以抑制CFA引起的神经元放电频率的增加左侧脚掌皮下注射CFA，rACC内分别注射0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μL、5μg/μL、10μg/μL的DynorphinA或NS。CFA+5μg/μLDynorphinA和CFA+10μg/μLDynorphinA组大鼠在痛环境匹配后第三天在痛侧与非痛侧神经元放电频率相比，均无统计学差异（P＞0.05），而CFA+NS、CFA+0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μLDynorphinA组第三天在痛侧与非痛侧神经元放电频率相比，痛侧的放电频率明显高于非痛侧，差异具有统计学意义（P＜0.05）。且CFA+5μg/μL和10μg/μLDynorphinA组痛侧的放电频率与CFA+NS组相比，均明显降低（P＜0.05）。电生理结果显示高浓度的5μg/μL和10μg/μLDynorphinA两组抑制了CFA引起的放电频率的增加。3．大鼠rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以上调κ-阿片受体的表达水平，下调CFA引起的NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平的增加（1）CFA皮下注射于大鼠的左侧后脚掌使得rACC脑区NMDA受体亚基IV 山西医科大学硕士学位论文GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平增加大鼠脚掌注射CFA或NS，rACC内给予NS，以及Naïve组，这三组相比，CFA+NS组rACC内NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平显著升高，有统计学意义（P＜0.05）。表明CFA注射于大鼠后脚掌可使rACC内GluN1、GluN2A、GluN2B亚基的磷酸化水平增高。（2）κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以上调κ-阿片受体的表达水平，下调CFA引起的NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平的增加大鼠脚掌注射CFA，rACC内注射不同浓度的κ-阿片受体激动剂DynorphinA/NS，CFA+5μg/μLDynorphinA组和CFA+10μg/μLDynorphinA组与CFA+NS组相比，rACC脑区内κ-阿片受体表达水平显著增高，具有统计学意义（P＜0.05），NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平降低，也具有统计学意义（P＜0.05），但这两组之间无统计学差异（P＞0.05）。其他浓度组与CFA+NS组相比κ-阿片受体表达水平和NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平均无差异（P＞0.05）。说明高浓度的DynorphinA可以上调κ-阿片受体的表达水平，同时下调CFA诱导的rACC内NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平的增加。结论：大鼠注射CFA后上调rACC脑区NMDA受体GluN1、GluN2A、GluN2B亚基磷酸化水平，增加神经元的放电频率，从而引起大鼠的CPA反应，即产生了痛情绪反应，而在rACC脑区注射一定浓度的DynorphinA后，激活了κ-阿片受体，下调GluN1、GluN2A、GluN2B亚基磷酸化水平，抑制CFA引起的rACC脑区神经元放电频率的增加，从而缓解了这种痛情绪反应。本课题为国家自然科学基金“电针影响前扣带皮层神经元活动缓解痛情绪的作用及机制研究（编号:81371254）”。关键词：痛情绪；前扣带皮层吻侧部（rACC）；多通道在体记录；κ-阿片受体；NMDA受体V 山西医科大学硕士学位论文Studiesofactivatingtheκ-opioidreceptorinACCtoalleviatetheaffectivepaininratsAbstractObjective:Chronicpersistentpainhasattractedattentionasadiseasethathasamajorimpactontheeconomyandsociety.Chronicpainnotonlybringsunbearablepaintopatients,butalsoproducesmorenegativenegativeemotionsthataffectpeople'sphysicalandmentalhealth.Comparedwithpainperception,thenerveconductionpathwaysthatmediatepainemotionsandthecentralmechanismtheyproduceareverydifferent.Alargenumberofpreclinicalstudieshavesuggestedthattheanteriorcingulatecortex(ACC)medialtothefrontallobeofthebrainisinvolvedinthetreatmentofpainmoodandACCreceivessignalsfromthemedialthalamusandcorticalareas,amongwhichrACCregulatesthenegativeemotionsofinflammatorypain.Experimentalstudiesofanimalbehavior,electrophysiologyandotherrelatedexperimentsalsoshowedthattheanteriorcingulatecortexismainlyinvolvedinemotionalfunctionsandplaysanimportantroleinthetreatmentofpainemotionalcomponents.ExperimentalstudieshaveobservedthatchemicallydamagingtheheadofACCcaninhibittheconditionalpositionavoidanceresponse(CPA)causedbyformalin.TherearemainlythreetypesofopioidreceptorsinbrainregionsofACC:μ-opioidreceptor,δ-opioidreceptorandκ-opioidreceptor.Ourpreviousstudieshavedemonstratedthattheactivationofμ-andδ-opioidreceptorsinrACCbrainregioncandown-regulatethephosphorylationofNMDAreceptorsubunitsinrACCbrainregions,reverseincreasedneuronalfiringfrequencyofrACCinducedbycompleteFreund'sadjuvant(CFA),inhibiteCPAresponseandplayaroleinalleviatingpainfulemotionalresponses,butitisnotclearwhethertheactivationofκ-opioidreceptorshasasimilareffecttoμ-andδ-opioidreceptors,sowewillexploreit.Inthisstudy,CPA-inducedConditionedPositionAvoidance(C-CPA)modelwasusedVI 山西医科大学硕士学位论文asameasurementstandardofpainemotioninrats,andthemicroinjectionofdifferentconcentrationsofκ-opioidreceptoragonistDynorphinAwasadministratedinrACCbrainregions..Behaviourtest,invivomultichannelelectrophysiologicalrecordingtechniquesandWesternblottechniquewillbeusedtoexplorewhethertheactivationoftheκ-opioidreceptorintherACCbrainregioncanrelievetheaffectivepaininrats.Methods:1.ToestablishaninflammatorypainmodelAdultmaleSD(SpragueDawley)ratsweighting250-270gwereinjectedwith0.08mlcompleteFreund'sadjuvant(CFA)subcutaneouslyintheleftplantartoestablishaninflammatorypainmodel.Thecontrolgroupwasinjectedwith0.08mlsaline(NS)andnoninjectionoffootintheleft.2.ToobservetheCFA-inducedconditionedplaceavoidance(C-CPA)behavioralresponsesRatswererandomlydividedinto3groups:(1)theNaivegroup;(2)thesaline(NS)-injectedgroup;(3)theCFA-injected(0.08ml)experimentalgroup.(n=6to8/group).CFAwasinjectedinthelefthindpawofratstoproducepersistentinflammatorypain,coupledwitharecognizableandmemoryableenvironmenttoproduceconditionedplaceavoidancereactionmodel.Wecomparedtherats'residencetimeinthepainsideoftheapparatusbeforeandafter“painenvironment”acclimationandcalculatedtheavoidancescore(CPAScore)todeterminewhethertheratsappearedaversionresponses.3.DetectionofPawWithdrawalLatency(PWL)ThePWLofratsineachgroupwasmeasuredonthefirstdayandtheseconddayaftertheinjectionofCFAontheleftpaw,andthechangesofthermalpaininratsaftertheinjectionofCFAandrACCwithdifferentconcentrationsofDynorphinAwereobserved4.Thein-vivomulti-channeltechniquewasusedtorecord,processandanalyzethesignalchangesofrACCneurons.5.Todetecttheexpressionlevelsoftheκ-opioidreceptorandphosphorylationofGluN1/GluN2A/GluN2Bsubunitbywestern-blot.VII 山西医科大学硕士学位论文Afterthecompletionofthebehavioraltest,wedetecttheexpressionlevelofκ-opioidreceptorandphosphorylatedGluN1/GluN2A/GluN2BsubunitintherACCregionofeachgroupbyWestern-blot.6.ExperimentalgroupingAccordingtolefthindpawsubcutaneousinjectionwithCFA/NS,rACCbrainareasareinjecteddifferentconcentrations.Theratsweredividedintothefollowingtwelvegroups.12groupsrats(n=6-8/group)=2(CFA/NS)×6（fivedifferentconcentrationsofκ-opioidreceptoragonist/NS）Results:1.Intracerebralinjectionofkappa-opioidreceptoragonistDynorphinAinratrACCinhibitedCFA-inducedconditionalavoidanceresponse(1)AftersubcutaneousinjectionofCFAintotheleftpaw,rats'thermalpawreflexlatency(PWL)wassignificantlyreducedandthepainmodelwassuccessfullyestablished.InCFAgroup,thePWLonthethirddaywassignificantlylowerthanthatofthefirstday(P<0.05);InNSgroupandnoinjectiongroup,therewasnodifferencebetweenPWLofthethirddayandthebaselinevalueofthefirstday(P>0.05).TheseshowedtheinjectionofCFAintothelefthindpawcausedinflammatorypainresponseinrats.(2)InjectionofCFAsubcutaneouslyontheleftpawcausesCPAresponsesinratsTheCFAgroupshowedthatthetimespentonthepainsidewassignificantlyshorteronthethirddaybeforeandafterthepainenvironmentmatching(P<0.05),whichshowedratproducedaversivereaction.InnoinjectiongroupandtheNSgroup,therewasnosignificantdifferencebetweenthetimeofthethirddayinpain-sideandthatofthefirstdaybeforeandafterthepainenvironmentmatching(P>0.05),atthesametime,therewasnodifferencebetweenthetwoavoidancescores(P>0.05).ThesesuggestedthatinjectionofCFAintheposteriorfootoftheratcouldcauseaCPAresponse.(3)Injectionofκ-opioidreceptoragonistDynorphinAinrACCbraincaninhibiteVIII 山西医科大学硕士学位论文C-CPAresponseTheleftpawsubcutaneousinjectionofNSandrACCinjectionofκ-opioidreceptoragonistDynorphinAorNS,whichwereNS+κ-opioidreceptoragonistgroupandNS+NSgroup.Thesetwogroupsofratswereconditionedandadaptedintheresidentenvironment(painenvironment)afterfootpadinjection.Comparedwiththefirstday,theresidencetimeinpainsideonseconddayafterenvironmentaladaptation(thethirddayoftheexperiment)hadnodifference(P>0.05),andtherewasnosignificantdifferencebetweenthetwogroupsavoidancescores(P>0.05).ThesesuggestedthatinjectionofDynorphinAinrACCitselfdoesnotaffecttheCPAresponseinrats.CFAwasinjectedsubcutaneouslyintheleftpawanddifferentconcentrationsκ-opioidreceptoragonistDynorphinAorNSwereinjectedintotherACC.EachgroupofratswasinjectedwithCFAonthesoleofthefootandmatchedwiththepainenvironment.In5μg/μLand10μg/μLDynorphinAgroups,theresidenttimeinthepainsideonthethirddaybeforeandafterthepainenvironmentmatchingcomparedtothefirstdayhadnosignificantdifference(P>0.05),whileresidenttimeoftheCFA+NS,CFA+0.5μg/μL,1μg/μL,2.5μg/μLgroupsinthepainsideonthethirddaywerelessthanthefirstday,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).TheavoidancescorewassignificantlydifferentbetweenCFA+NSgroupandCFA+5μg/μLDynorphingroup(P<0.05);andCFA+NSgroupandCFA+10μg/μLDynorphingroupavoidancefractionwasalsostatisticallysignificant(P<0.05),whileavoidancescorebothCFA+5μg/μLandCFA+10μg/μLDynorphinAgroupshadnosignificantdifference(P>0.05),Theseshowedthatbothhighconcentrationof5μg/μLand10μg/μLDynorphinAplayedaroleininhibitingCPAresponse.RatsontheleftsideofthefootwereinjectedwithCFA,andrACCwasinjected0.5/1/2.5/5/10μg/μLDynorphinA/NS.PWLvalueineachgroupofratsonthethirddaywerelessthanthatofthefirstday,andallhadsignificantdifferences(P<0.05).ThesesuggestedthatDynorphinAdidnotaffectthethermalpaincausedbyCFA.2.Injectionofκ-opioidreceptoragonistDynorphinAinrACCbraincaninhibitetheCFA-inducedadditioninfiringrateofrACCneuronsIX 山西医科大学硕士学位论文(1)AfterCFAwasinjectedsubcutaneouslyonthelefthindpawofrats,thefrequencyofneuronalfiringintherACCbrainareaincreased.IntheCFAgroup,thedischargefrequencyofneuronsinrACCbrainregionsinpain-sideandnon-pain-sideonthethirddayafterconditioningweredifferent,andthefrequencyofpainsidewassignificantlyhigherthannon-painside.Thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).ThefrequencyofneuronalfiringintherACCbrainareaonthethirddayaftermatchingintheCFAgroupwassignificantlyhigherthanthatintheNSgroupandNaivegroup(P<0.05).ThesesuggeststhatinjectionofCFAintheposteriorfootoftheratcouldincreasethefrequencyofneuronalfiringinrACCbrainregions.(2)κ-opioidreceptoragonistDynorphinAitselfdoesnotaffectthedischargeactivityofrACCbrainregionsTheleftpawsubcutaneousinjectionofNSandrACCinjectionofκ-opioidreceptoragonistDynorphinAorNS,whichwereNS+κ-opioidreceptoragonistgroupandNS+NSgroup.ThedischargefrequencyofneuronsinrACCbrainregionsofpainsideonthethirddayaftermatchingofthetwogroupwascomparedwiththatofnon-painside,andtherewasnodifferenceinthedischargefrequencyofneuronsbetweenpainfulandnon-painfulsideinbothgroups(P>0.05).ThesesuggestedthatinjectionofDynorphinAinrACCitselfdoesnotaffectthefrequencyofneuronalfiringinrACCbrainregions.(3)κ-opioidreceptoragonistDynorphinAinhibiteCFA-InducedincreaseinneuronaldischargefrequencyCFAwasinjectedsubcutaneouslyintheleftpawanddifferentconcentrationsκ-opioidreceptoragonistDynorphinAorNSwereinjectedintotherACC.ThedischargefrequencyofneuronsinthepainsideonthethirddayofCFA+5μg/μLDynorphinandCFA+10μg/μLDynorphinAgroupswerecomparedwiththedischargefrequencyofneuronsinthenon-painsiderACCbrainafterthepainenvironmentmatching,andtherewasnodifferenceinthedischargefrequencyofneuronsbetweenpainfulandnon-painfulsideinbothgroups(P>0.05),whileonthethirddayofCFA+NS,CFA+0.5μg/μL,1μg/μL,and2.5μg/μLDynorphinAgroup,thefrequencyofpainsidewassignificantlyhigherthanthatofnon-painsideoftheneuronsandthedifferencewasstatisticallyX 山西医科大学硕士学位论文significant(P<0.05).ComparedwithCFA+NSgroup,thedischargefrequencyofneuronsinrACCbrainregionsinpain-sideofCFA+5μg/μLDynorphinandCFA+10μg/μLDynorphinAgroupsweresignificantlydecreased(P<0.05).Electrophysiologicalresultsshowedthatbothhighconcentrationof5μg/μLand10μg/μLDynorphinAcouldinhibitetheCFA-inducedadditioninfiringrateofrACCneurons.3.Intracerbralinjectionofκ-opioidreceptoragonistDynorphinAintheratrACCcouldup-regulatetheexpressionofκ-opioidreceptoranddown-regulatetheincreasedphosphorylationlevelsofNMDAreceptorsubunitsGluN1,GluN2A,andGluN2BinrACCbrainregionsbyCFA.r(1)SubcutaneousinjectionofCFAintothelefthindpawofratsincreasedthephosphorylationlevelsofNMDAreceptorsubunitsGluN1,GluN2A,andGluN2BinrACCbrainregions.ComparedwithCFA+NSgroupandNaïvegroup,theexpressionlevelsofGluN1,GluN2A,GluN2BphosphorylationinintherACCofofCFA+NSgroupsignificantlyincreased(P<0.05).ItshowedthatCFAincreasedphosphorylationlevelsofGluN1,GluN2A,GluN2BsubunitsinrACC.(2)Theκ-opioidreceptoragonistDynorphinAupregulatestheexpressionlevelofκ-opioidreceptoranddown-regulatedtheincreasedphosphorylationlevelsofNMDAreceptorsubunitGluN1,GluN2A,GluN2BinducedbyCFAinrACC.RatsontheleftsideofthefootwereinjectedwithCFA,andrACCwasinjecteddifferentconcentrationsDynorphinA.ComparedwithCFA+NSgroup,theexpressionlevelsofofκ-opioidreceptorofCFA+5μg/μLDynorphinAgroupandCFA+10μg/μLDynorphinAgroupweresignificantlyincreased(P<0.05),andthephosphorylationofNMDAreceptorsubunitGluN1,GluN2A,GluN2Bwasdecreased(P<0.05),whiletherewasnodifferencebetweenthetwogroups(P>0.05).ComparedwithCFA+NSgroup,theexpressionofκ-opioidreceptorandphosphorylationofNMDAreceptorsubunitGluN1,GluN2A,GluN2Binotherconcentrationgroupswerenotsignificantlydifferent(P>0.05).Theresultsshowedthathighconcentrationofκ-opioidreceptoragonistDynorphinAupregulatedtheexpressionofκ-opioidreceptoranddown-regulatedtheXI 山西医科大学硕士学位论文increasedphosphorylationlevelsofNMDAreceptorsubunitGluN1,GluN2A,GluN2BinducedbyCFAinrACC.Conclusion：AfterinjectionofCFAinrats,thephosphorylationlevelofNMDAreceptorssubunitsGluN1,GluN2AandGluN2BinbrainregionsofrACCwereup-regulated,andthefrequencyofneuronalfiringwasincreased,whichcausedtheCPAresponseinratsandresultedpainemotionalreactions.Injectionofacertainconcentrationofκ-opioidreceptoragonistDynorphinAinrACCactivatedκ-opioidreceptor,down-regulatedthephosphorylationlevelsofGluN1,GluN2A,andGluN2Bsubunits,andreversedtheincreaseinthefrequencyofneuronalfiringinrACCbrainregionsinducedbyCFA.,whichrelievedthepainemotionalresponse.Keywords:emotional-affectivedimensions;rACC;Multi-channelinvivorecording;κ-opioidreceptor;NMDAreceptorXII 山西医科大学硕士学位论文常用缩写词中英文对照表英文缩写英文名称中文名称ACCAnteriorCingulateCortex前扣带皮层rACCrostralAnteriorCingulateCortex前扣带皮层吻侧部CPAconditionedplaceavoidance条件性位置回避，CFAcompleteFreundsadjuvant完全弗氏佐剂完全弗氏佐剂诱导的条C-CPACFA-inducedconditionedplaceavoidance件性位置回避PWLPawWithdrawalLatency脚掌回缩潜伏期NSNormalSaline生理盐水APActionPotential动作电位MEAsMicro-ElectrodeArrays微电极阵列FPsFieldPotentials场电位DynorphinADynorphinAκ-阿片受体激动剂NMDAN-methyl-D-asparticacidN-甲基-D-天冬氨酸GluN1GluN1subunitofNMDAReceptorNMDA受体1亚基GluN2AGluN2AsubunitofNMDAReceptorNMDA受体2A亚基GluN2BGluN2BsubunitofNMDAReceptorNMDA受体2B亚基XIII 山西医科大学硕士学位论文前言[1]慢性疼痛是一个世界性的医疗难题，它既是与大多数疾病相伴生的临床症状，同时本身也是一种疾病。患者除了遭受疼痛造成的肉体伤害之外，其导致的心理、精[2,3]神伤害和社会并发症也成了一个重大的负担。国际疼痛协会对疼痛的最新定义为“疼痛是一种与组织损伤或潜在的组织损伤相关的感觉、情感、认知和社会维度的痛[4]苦体验。这一定义将疼痛分为感觉、情感、认知和社会四个维度，其中痛感觉主要感受疼痛刺激的性质、位置、强度等，痛情绪则是由伤害性刺激引起的焦虑、恐惧、[5]厌恶等情绪反应。痛情绪可分两个阶段：一是“痛不愉快感”（feelingofunpleasantness），它是对痛刺激的即时反应，又称原发性不愉快（Primaryunpleasantness）；二是继发性不愉快（Secondaryunpleasantness），是一种疼痛长期作用引起的情绪反应，它和接受疼痛刺激时所处的环境、疼痛对将来生活的影响、慢性疼痛引发的焦虑恐惧等密切相关，其涉及疼痛、认知、学习记忆等因素，需[6]要大脑的高级中枢对这些信息进行整合。近年来人们对痛感受的研究取得了一定的进展，但对痛情绪的研究却相对滞后，因此对痛情绪的研究尤为重要。Harkin等采用EysenekandEysenek问卷法对105个肌筋膜疼痛功能障碍（MPD）患者进行研究，分别观察两种相反的性格对痛感觉、痛情绪的影响，结果显示痛感受[7]和痛情绪可能存在分离、并行和序次的神经网络通路。上行传导束有两大系统其一是位于脑干外侧区的，经过新脊丘束、脊颈束和脊髓背侧柱，主要传递痛的感觉分辨信息；另一个是由脑干内侧区上行的，经过旧脊丘束、脊髓中脑束、脊髓臂旁-杏仁[8]束、脊髓臂旁-下丘脑束和脊髓下丘脑束，它们主要传递痛情感信息。研究表明躯体感觉皮质（S1和S2）和岛叶皮层被认为是编码痛感觉，包括性质[9,10,11]（刺痛、灼热痛或心绞痛）、定位和强度等信息，前额区域和边缘系统（ACC，PFC，杏仁核，VTA和伏隔核）编码情绪和动机反应，并且和痛的情感和联系方面是[9,12,13,14]有关联的。对杏仁核的相关研究表明：刺激杏仁核可导致焦虑、恐惧等情感反应，而损毁部分杏仁核则会使性情变得温顺。与痛情绪相关的脑区目前研究比较多[15,16,17,18,19][5,20,21]的是前扣带皮层，尤其是吻侧部。[22]NMDA受体是一种谷氨酸的电压门控离子通道受体，其在初级传入终端可以[23]通过增加神经递质释放来增加痛觉过敏。NMDA受体是由来自不同蛋白家族的亚1 山西医科大学硕士学位论文单位组成的异聚四聚体，现称为GluN1（NR1），GluN2（NR2）和GluN3（NR3）亚[24]基家族。NMDA受体的激活是LTP产生的基础，在前扣带皮层神经元中谷氨酸介导兴奋性突触的传递。有研究提示ACC内兴奋性氨基酸受体尤其是NMDA受体激活对大鼠痛厌恶情绪的产生可能既是充分条件，也是必要条件，福尔马林引起的伤害性刺激显著上调大鼠ACC特别是吻侧ACC（rACC）内GluN2A和GluN2B而非[25]GluN1的表达。在体多通道记录（in-vivomultichannelrecording）是应用于活体动物来研究动物神经活动的一种技术。其方法是将电极植入到动物的大脑，电极后端连接灵敏度高的放大器和记录系统，神经元的放电信号可以在相应的记录软件上观察到。这一技术可以同步记录多个脑区的多个神经元的电活动，建立不同脑区的神经元放电在时间和空[26][27]间上的联系。JohnC.Lilly在1949年对这一方法进行了初步的尝试，将多电极阵列植入到灵长类动物，探寻行为和神经元放电之间的关系。如今这一技术已应用到很多动物身上。这种在体技术与离体实验相比，在体技术可以记录自由活动的动物的放电活动，而且可以根据实验目的长时间多次记录，结果更加准确，具有很大的优势[28]。阿片类药物是临床上被广泛应用的镇痛药物，其通过阿片受体发挥镇痛作用。目[29]前公认的阿片受体主要有μ、δ、κ和ORL等14种亚型，研究最多的是μ，δ和[30]κ亚型。前扣带皮层内分布有大量的阿片受体。其中rACC内主要包含三种不同类[31]型的阿片受体，分别为μ-、δ-和κ-阿片受体，其各自发挥各自的功能。已知阿片肽可激活阿片受体起到镇痛的作用，因此我们推测是否激活rACC内的阿片受体也可以缓解疼痛引起的负性情绪，实验室前期的研究也证实了激活rACC脑区神经元μ-、δ-阿片受体可以通过下调rACC脑区NMDA受体亚基的磷酸化水平，抑制CFA所引起的神经元放电频率的增加，而发挥缓解痛情绪反应的作用，但κ-阿片受体是否有此作用并不清楚，因此本课题将就此展开研究。我们实验室前期证实了CFA与NS按照体积比为1:1混合，皮下注射入大鼠左侧后脚掌后，可以诱导大鼠产生CPA反应，即使大鼠对痛环境产生了厌恶，也使得大鼠的痛行为发生改变，同时也证实了NMDA受体参与大鼠痛情绪的形成。因此，本实验将探究：在CFA诱导的条件位置回避（C-CPA）模型中，激活rACC脑区κ-阿片受体是2 山西医科大学硕士学位论文否可以缓解CFA诱导的痛情绪反应。3 山西医科大学硕士学位论文1材料与方法1.1实验动物及分组体重250-270g的成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，购于北京海淀兴旺实验动物养殖场。大鼠分笼饲养于动物房，每笼4只，动物房室温维持在22±1℃，相对湿度40%-60%，大鼠能够自由进食、进水，12hrs-12hrs昼夜循环光照，大鼠领养回来适应一周后进行实验。分组：根据大鼠左侧后脚掌注射CFA或NS，rACC内给予不同浓度的κ-阿片受体激动剂DynorphinA或NS将大鼠随机分为4个大组，12个小组，每组n=6～8只。第一组：足底注射NS，rACC注射NS；第二组：足底注射NS，rACC注射0.5/1/2.5/5/10μg/μLDynorphinA；第三组：足底注射CFA，rACC注射NS；第四组：足底注射CFA，rACC注射0.5/1/2.5/5/10μg/μLDynorphinA。1.2实验药品及主要试剂完全弗氏佐剂（CFA）sigma公司DynorphinAabcam公司0.9%氯化钠注射液石家庄四药集团注射用青霉素（400万单位）华北制药股份有限公司戊巴比妥钠sigma公司BCA蛋白定量试剂盒武汉博士德生物凝胶配制试剂盒BIO-RAD公司PVDF膜Millipore公司抗NR1抗体abcam公司抗p-NR1抗体Millipore公司抗NR2A抗体lifespan公司抗p-NR2A抗体abcam公司抗NR2B抗体ThermoFisher公司4 山西医科大学硕士学位论文抗p-NR2B抗体abcam公司Anti-κ-OpioidReceptorantibodyabcam公司HRP标记山羊抗兔二抗武汉博士德生物HRP标记山羊抗小鼠二抗武汉博士德生物SuperECLPlus超敏发光液碧云天生物1.3主要实验装置及仪器多通道电极排母、电路板Samtec厂家铬合金丝（0.0013inch）CFW厂家金属焊接丝（0.3mm）山崎厂家固态聚乙二醇Enox厂家电烙烧（HAKKO936）JapanHakkoCorporation冷光源ALPHA-1501ShanghaiLWScientificCo.,Ltd电子微推仪Narishige厂家，JapanNeuroMotive软件Stoelting公司，USAANY-Maze软件Stoelting公司，USA在体多通道记录仪Blackrock公司，USAOfflineSorterPlexonInc公司，USANeuroexplorerBlackrock公司，USA条件位置回避装置自制（见图1）热板刺激仪lifescience颅内给药管自制脑立体定位仪Narishige，Japan恒温加热毯瑞沃德微量泵WPI微量进样器上海高鸽工贸有限公司超声波破碎仪QSONICA，USASPECTRAMAXM2/M2e多功能酶标仪MolecularDevices，USA®电泳槽（Mini-PROTEANTetra）BIO-RAD公司5 山西医科大学硕士学位论文®®TM半干转印槽（Trans-BlotSD/Trans-BlotTurbo）BIO-RAD公司凝胶成像系统（ChemiDocMP）BIO-RAD公司1.4实验方法1.4.1埋置电极手术（1）制作带给药管的微电极阵列1）连接电路板和排母：确保排母完好，用电烙烧熔化金属焊丝一一对应整齐焊接电路板与排母；2）排丝：将切好的镍铬合金丝放于涂有AB胶的电路板上，排放要整齐，共两排，两侧各四根，中间间隔1.2mm,一根参考电极排于一侧；3）穿孔：穿孔前剥掉穿入部分的电极丝的绝缘层，之后将电极丝依次穿入电路板的圆孔内，参考电极与地线分别穿于边缘两侧的圆孔内；4）固定：用电烙烧熔化金属焊丝依次焊接穿入的电极丝与圆孔部位，将暴露的电极丝用融化后的聚乙二醇涂抹固定；5）涂胶：AB胶等比例混合，均匀涂于电路板与排母的连接处，以保证固定和绝缘；6）粘贴给药管：将预先准备好的给药管置于做好的电极的一面，给药管间距1.2mm,AB胶固定，待干后将给药管穿上U型的堵丝备用。（2）埋置电极手术1）麻醉与固定：根据剂量40-50mg/kg抽取1%的戊巴比妥钠注射于大鼠的腹腔进行麻醉，麻醉好后把大鼠固定于脑立体定位仪上。2）定位：用剃毛器剃掉头部手术部位的毛，之后用碘伏消毒局部皮肤，在头部做一正中切口，减掉筋膜和肌肉，暴露Bregma点，根据Paxinos&Watson大鼠脑图谱对埋置电极的位置进行定位：以Bregma点为原点，AP(0.5~4.0mm)、ML(0.5~1.5mm)、DV(2.8mm)，中性笔标记。3）打磨：打磨目标脑区与固定颅钉位置，用颅骨钻打磨，在Bregma点后的两块颅顶骨钻两个颅钉，打磨目标脑区动作轻柔，挑开颅骨和硬脑膜，不可损伤脑实质。4）埋置带给药管的电极：将自制带给药管的电极排母连接Headstage后固定于持物杆上，将持物杆固定于脑立体定位仪上，使得电极丝与颅骨表面垂直，并对准埋置区域，用微推仪以1μm/s的速度下2.8mm，在下电极的过程中观察神经元的放电活动。5）固定电极：自凝牙托粉和牙托水按1:1比例混合后均匀地涂到电极、暴露的6 山西医科大学硕士学位论文颅骨表面将其完全覆盖，待完全凝固后取下Headstage并将大鼠从脑立体定位仪取下，观察大鼠的呼吸，必要时吸痰。6）手术结束后将大鼠放回笼中饲养，一周后进行后续实验。1.4.2建立炎性痛模型配制完全弗氏佐剂（CFA）：CFA原液与0.9%NaCl注射液按照1:1的体积比混合成乳化状态。将大鼠固定于啮齿类动物固定装置上，抽取上述配好的混合液0.08ml皮下注射于大鼠的左侧后脚掌，注射前用酒精棉球消毒注射部位，注射后轻柔注射部位防止CFA外渗，促进其吸收。同时左侧后脚掌注射0.08ml的0.9%NaCl注射液作为对照。1.4.3痛行为检测：检测大鼠的脚掌回缩潜伏期（PWL）使用热板刺激仪进行测定，根据实验目的在脚掌注射CFA的前一天和第二天条件性位置回避（CPA）行为测完后进行。先将大鼠放入热板刺激仪的有机玻璃罩内适应半小时，后取出，将热板升温至50摄氏度，再次将大鼠放入有机玻璃罩内，从大鼠脚掌接触热板开始计时，大鼠出现舔后足或抬起即缩足反应时计时停止，此时间即为大鼠脚掌回缩潜伏期（PWL，PawWithdrawLatency）。每只大鼠测量三次，中间间隔15-20min，之后取三次的平均值。1.4.4痛情绪的检测：通过条件性位置回避实验来反应大鼠的痛情绪反应（1）条件位置回避（CPA）装置介绍[32,33]本实验使用自制的条件性回避装置，如图1所示：由有机玻璃制成的大小为60cm*15cm*25cm的两个无顶无底的框子组成，两个框子中间均有可移动的挡板，这个挡板将框子分为两侧，一侧内壁贴有间隔相同的红色横条纹，框底为3mm*3mm孔径网眼的钢丝，另外一侧内壁贴有间隔相同的蓝色纵条纹，框底为6mm*6mm孔径网眼的钢丝。两个框子视觉上无不同。在蓝色条纹的那一侧的外侧挂一个LED灯，光的亮度不影响另外一侧。同时在靠近蓝色条纹框子那侧1m外放置一个小的台灯。两个框子的上方装有摄像头，从而记录大鼠的整个行为过程，用ANYMAZE软件对大鼠运动过程进行分析，从而得到大鼠在两侧分别停留的时间。在进行条件性位置回避诱导时，随机设置其中一侧为非CFA匹配室即非痛环境，而另一侧则与致痛剂CFA注射进行耦合，称之为CFA匹配室，即痛环境。7 山西医科大学硕士学位论文图1自制CPA装置图（2）CPA的检测分三天进行：第一天：a.称重：选取符合体重的SD雄性大鼠（250-270g），b.测CPA的基础值（baseline）：暗室适应30min，后放入CPA装置自由活动10min，用软件分析大鼠在两侧的停留时间。第二天：暗室适应30min，后与非痛环境耦合30min，左侧后脚掌皮下注射CFA/NS；CFA注射后休息120min，之后置于暗室适应30min，再进行痛环境耦合30min。第三天：同第一天，暗室适应30min，后放入CPA装置自由活动10min，用软件分析大鼠在痛环境和非痛环境的停留时间。大鼠CFA注射与痛环境匹配前后，测定大鼠在痛环境里的停留时间，得到匹配前后痛环境内停留时间之差，即为回避分数。若大鼠匹配前后第三天在痛侧停留时间明显小于第一天，且具有统计学差异，说明CFA成功诱导了大鼠产生条件位置回避。在整个CPA检测的过程中，每次测完都要清理大鼠残留的排泄物，并用75%的酒精擦拭框子的内壁与底部，以防止之前老鼠的气味对待测老鼠的干扰。该方法的流程图如下：8 山西医科大学硕士学位论文图2C-CPA模型的建立及实验流程图1.4.5在大鼠rACC脑区内埋置给药管[34](1)自制双侧给药管选择25G的针头作为给药管的原材料，用刀片将针头的塑料柄切出一个截面，使之与针管平行，同样切割另一个得到同样的截面，将这两个截面吻合相对，使两个针管内径圆心相距1.2-1.4mm,后用胶水粘贴固定，选择不锈钢丝作为内芯，插入针管中，漏出的部分距离针管尖端0.1mm，即制作成双侧给药管。(2)埋置给药管的手术过程与埋置电极手术类似，但rACC下给药管的位置：AP：±2.6mm，ML：±0.6mm，DV：-2.6mm。1.4.6大鼠rACC区给药术后一周大鼠恢复正常后，在大鼠的rACC区内微量注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA。将大鼠固定于啮齿类动物固定装置上，之后轻轻拔掉给药管管内芯，将PE-10管一端连于20ul量程的微量进样器，另一端连接注射内管，注射内管的长度要长于给药管0.1mm。先抽取生理盐水充满整个管道，以排尽空气，之后回抽微量进样器，使管道的前端形成一截空气。之后抽取1μl不同浓度的DynorphinA或NS，用微量注射泵以0.1μL/min的速度泵入rACC区内，泵完药后注射内管要在给药管内停留1~2min，以保证药物充分吸收。另一侧同上方法给药。9 山西医科大学硕士学位论文1.4.7rACC区神经元电活动的观察及数据采集Cerbus128通道神经电生理信号观察，Central软件采集原始神经信号，采集的同时进行高通和低通滤波，保存为动作电位Spike的原始信号数据。应用OfflineSorter软件对记录的原始动作电位信号数据进行神经元分类及去除杂波，使用Neuroexplore软件进行信号分析，针对Spike信号分析其神经元放电频率。1.4.8蛋白免疫印迹（westernblot）（1）蛋白的提取a.将之前取的rACC脑区的组织称重，将RIPA、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂按照与组织重量比为10:0.1:0.1的比例加入组织中，用眼科剪剪碎组织，每个样品的组织剪完，眼科剪都需用三蒸水冲洗，以防眼科剪上残留之前的组织。b.超声波破碎仪彻底震碎组织。c.离心：14000r，30min，取上清。（2）蛋白浓度测定根据BCA蛋白定量试剂盒的说明书进行操作，之后用酶标仪测定蛋白的浓度。（3）蛋白变性加入蛋白裂解液使蛋白的浓度为5μg/μl，按比例加入5×loadingbuffer，100℃煮7min。（4）配制凝胶根据BIO-RAD的免染胶配制方法配制10%的凝胶。（5）上样用微量移液器上样，预染maker和蛋白样品的上样体积为均为10μl。（6）电泳整个电泳的过程中电压为200V,待溴酚蓝电泳至凝胶最下端，停止电泳。电泳完毕后取下凝胶用胶成像仪进行曝光，时间2.5min。观察电泳的结果。（7）转膜剪下5cm×8cm的PVDF膜，先在甲醇中浸泡激活1min，之后把PVDF膜、凝胶、滤纸浸泡入转印液中15min。浸泡完毕后按照滤纸，PVDF膜，凝胶，滤纸的顺序放置在半干转的转印槽内。转膜参数：25V，13min。转膜完成后用凝胶成像仪曝光，观察转膜的效果。（8）封闭将曝光完的膜用1×TBST配制成的0.3%的明胶封闭2小时。（9）孵育一抗将封闭完的膜用1×TBST洗三次，每次5min，用1×TBST稀释目的蛋白的一抗，4℃孵育过夜。（10）孵育二抗用1×TBST洗三次，每次5min，用1×TBST稀释二抗，常温摇床孵育2小时。（11）曝光孵育完二抗的膜用1×TBST洗三次，每次5min，之后进行曝光。10 山西医科大学硕士学位论文（12）蛋白条带定量分析™使用ImageLab5.2（Bio-Rad），应用蛋白总量归一化的方法对曝光结果进行定量分析。1.5统计分析采用SPSS17.0统计分析软件进行分析，计量资料用Mean±SD表示，痛环境匹配前后的停留时间、PWL用配对t检验，两组之间比较用两独立样本t检验，多组之间的比较用单因素方差分析；电生理部分用中位数（上四分位数，下四分位数）表示，同一组前后比较用Wilcoxon符号秩检验，两独立样本比较用Mann-Whitney秩和检验；用GraphPadPrism5.0软件绘制统计图。检验以P＜0.05为差异，具有统计学意义。11 山西医科大学硕士学位论文2结果2.1大鼠rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以抑制CFA引起的条件性位置回避反应2.1.1左侧后脚掌注射CFA可以使大鼠产生CPA反应如图3所示，大鼠脚掌注射CFA组、注射NS组和足底未注射组即Naïve组相比，CFA组大鼠的第三天的PWL值与第一天相比明显减小，即对热痛的敏感性增加。而其余两组第三天的PWL与第一天相比均无差异。说明大鼠足底注射CFA可引起炎性痛反应。图3大鼠脚掌注射CFA后热痛行为发生改变大鼠脚掌未注射Naive组、注射NS组和注射CFA组的热缩足潜伏期（PWL），脚掌注射CFA组*第三天的PWL与第一天比，第三天减小，P＜0.05.如图4D所示，脚掌未注射组（post333.33±134.44sVSpre297.48±62.99s，P＞0.05，n=7）和脚掌注射NS组（post320.74±127.17sVSpre289.06±61.68s，P＞0.05，n=6），大鼠痛环境匹配前后第三天在痛侧停留的时间与第一天相比均无差异；大鼠脚掌注射CFA组（post194.76±78.10sVSpre313.91±29.86s，P＜0.05，n=6），大鼠痛环境匹配前后第三天在痛侧停留的时间明显小于第一天，具有统计学差异，说明对环境产生厌恶反应。如图4E所示,大鼠脚掌注射NS组的回避分数和足底未注射组相比（31.69±83.31sVS0.73±16.75s，P＞0.05，n=7），没有统计学差异。大鼠脚掌注射CFA组的回避分数分别与脚掌注射NS组和足底未注射组相比（注射CFA组-133.1±99.51s12 山西医科大学硕士学位论文VS注射NS组31.69±83.31s，P＜0.05，n=6；注射CFA组-133.1±99.51sVS未注射组0.73±16.75s，P＜0.05，n=7），有统计学差异。CFA皮下注射于大鼠左侧后脚掌可使大鼠产生CPA反应。ABCpain(-)pain(+)pain(-)pain(+)pain(+)pain(-)NaiveNS+NSCFA+NSDE图4左侧后脚掌注射CFA可使大鼠产生CPA反应（A）、（B）、（C）大鼠左侧后脚掌未注射Naïve组、脚掌注射NS或CFA组，各组大鼠痛环境匹配后在条件位置回避装置中停留的行为轨迹图，Naïve组与NS+NS组两侧基本一致，CFA+NS组非痛侧停留时间长（D）Naive组、NS+NS组和CFA+NS组各组大鼠在痛侧停留的时间第三天与第一天**的比较，P＜0.05（E）各组回避分数的比较，P＜0.052.1.2大鼠rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以抑制CFA引起的条件性位置回避反应左侧脚掌皮下注射NS，rACC内注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA或NS，即NS+κ-阿片受体激动剂和NS+NS两组，图5C显示这两组大鼠在痛环境匹配前后第三天在痛侧停留的时间与第一天相比无统计学差异：NS+κ-阿片受体激动剂组（post276.86±33.55sVSpre286.41±64.54s，P＞0.05，n=7）；NS+NS组（post333.33±134.44s13 山西医科大学硕士学位论文VSpre297.48±63.00s，P＞0.05，n=6），图5D显示两组的回避分数之间无统计学意义（-27.82±35.93sVS6.75±24.17s，P＞0.05，n=7）。表明rACC内注射DynorphinA本身不会影响大鼠的CPA反应。ABpain(-)pain(+)pain(-)pain(+)NS+NSNS+DynorphinACD图5κ-阿片受体激动剂DynorphinA本身不影响CPA反应脚掌注射NS后，rACC脑区内注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA/NS，（A）、（B）两组大鼠痛环境匹配后在条件位置回避装置中停留的行为轨迹图，两侧基本一致（C）两组大鼠在痛侧停留时间第一天与第三天的比较，（D）两组回避分数的比较，表1、图6G显示左侧脚掌皮下注射CFA，rACC内分别注射0.5/1/2.5/5/10μg/μL的κ-阿片受体激动剂DynorphinA或NS，CFA+5μg/μL和CFA+10μg/μLDynorphinA组大鼠痛环境匹配前后第三天在痛侧停留的时间与第一天相比均无统计学差异，而CFA+NS、CFA+0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μL组大鼠第三天在痛侧停留的时间均小于第一天，差异具有统计学意义（P＜0.05）。图6H显示了CFA+NS组与CFA+5μg/μLDynorphinA回避分数具有统计学差异（P＜0.05）；CFA+NS组与CFA+10μg/μLDynorphinA组回避分数也具有统计学差异（P＜0.05），而CFA+5μg/μL和CFA+10μg/μLDynorphinA两组的回避分数之间无统计学差异，说明高浓度的两组抑14 山西医科大学硕士学位论文制了CFA所致的条件性位置回避反应。表1CFA+NS、CFA+不同浓度的DynorphinA（μg/μL）痛环境匹配前后CPA的比较（Mean±SD）停留时间CFA+NSCFA+0.5CFA+1CFA+2.5CFA+5CFA+10Day1313.91±29.86307.55±85.67311.22±102.56302.79±58.83284.62±102.25338.20±110.48****Day3194.76±78.10184.73±99.98183.25±95.99238.82±85.26295.70±159.60365.27±151.10**回避分数-117.4±109.28-122.8±105.95-127.9±76.65-63.97±72.7111.08±137.4727.07±58.38*P<0.05ABCpain(+)pain(-)pain(+)pain(-)pain(+)pain(-)CFA+NSCFA+0.5μg/μLDynorphinACFA+1μg/μLDynorphinADEFpain(+)pain(-)pain(+)pain(-)pain(+)pain(-)CFA+2.5μg/μLDynorphinACFA+5μg/μLDynorphinACFA+10μg/μLDynorphinAG15 山西医科大学硕士学位论文H图6不同浓度的κ-阿片受体激动剂DynorphinA对CPA反应的影响脚掌注射CFA后，rACC脑区内注射不同浓度的κ-阿片受体激动剂DynorphinA或NS，（A）、（B）、（C）、（D）、（E）、（F）各组大鼠痛环境匹配后在条件位置回避装置中停留的行为轨迹图，（A）、（B）、（C）、（D）四组痛侧停留时间均减少；（E）、（F）两组大鼠两侧停留时间基本一致（G）各组大鼠**在痛侧停留的时间第三天与第一天的比较，P＜0.05（H）各组回避分数的比较，P＜0.05如表2、图7所示大鼠左侧足底注射CFA，rACC内分别注射0.5/1/2.5/5/10μg/μlDynorphinA/NS，各组第三天的PWL值与第一天相比均减小，都具有显著性差异（P＜0.05）。表明rACC内注射DynorphinA不影响CFA引起的热痛行为。表2CFA+NS、CFA+不同浓度的DynorphinA（μg/μL）痛环境匹配前后PWL的比较（Mean±SD）PWLCFA+NSCFA+0.5CFA+1CFA+2.5CFA+5CFA+10Day112.23±3.1410.62±2.6113.19±1.7612.00±3.3811.91±3.5214.06±3.90******Day35.53±1.997.77±2.9610.96±2.2410.40±3.639.73±3.538.85±2.96*P<0.0516 山西医科大学硕士学位论文图7κ-阿片受体激动剂DynorphinA不改变CFA引起的热痛行为脚掌注射CFA后，rACC脑区内注射不同浓度的κ-阿片受体激动剂DynorphinA各组大鼠PWL的*第一天与第三天的比较，P＜0.052.2大鼠rACC脑区内注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以抑制CFA引起的神经元放电频率的增加2.2.1CFA皮下注射于大鼠的左侧后脚掌后，rACC脑区神经元放电频率增加脚掌注射CFA组，共记录到54个放电神经元，其中有36个兴奋性明显增加，占66.7%，9个抑制，占16.7%，无变化的有7个，占13.0%；脚掌注射NS组，无明显变化的有68个，占70.1%，兴奋的有28个，占18.6%，抑制的有11个，占11.3%，说明CFA诱导rACC脑区神经元放电活动增加。如表3和图9所示，CFA组、NS组和脚掌无注射组三组在痛环境匹配后痛侧与非痛侧的rACC脑区神经元放电频率相比，CFA组痛侧的放电频率明显大于非痛侧，差异具有统计学意义（P＜0.05），其他两组痛侧与非痛侧无差异（P＞0.05），且三组的痛侧相比，CFA组明显大于其他两组，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明CFA诱导大鼠神经元放电频率增加。表3Naïve组、NS+NS组、CFA+NS组痛侧与非痛侧的放电活动分析组别痛侧非痛侧Naive0.8625(0.4225,1.9208)1.3817(0.4342,3.1092)NS+NS0.7967(0.2038,1.8367)1.3450(0.4229,2.9000)*CFA+NS5.9578(2.5788,6.5129)0.0167(0.0033,0.7296)*P<0.0517 山西医科大学硕士学位论文图8Central采集原始神经信号软件、OfflineSorter神经元处理及分类软件以及Neuroexplore信号处理与分析软件图ABpain(+)pain(-)pain(+)pain(-)18 山西医科大学硕士学位论文Cpain(+)pain(-)DNaiveNS+NSCFA+NS图9注射CFA诱导大鼠放电活动增加19 山西医科大学硕士学位论文（A）（B）（C）Naïve组、脚掌注射NS或CFA组痛环境匹配后痛侧与非痛侧rACC脑区神经元放电频率的比较，统计图上方为放电频率光栅图，Naïve组与NS组痛环境匹配后痛侧与非痛侧神经*元放电的光栅图两侧基本一致，CFA组痛侧的光栅图密集，P＜0.05（D）各组痛侧放电频率的*比较，统计图上方为各组痛侧的放电频率光栅图，P＜0.05.2.2.2κ-阿片受体激动剂DynorphinA本身不影响rACC脑区的放电活动左侧脚掌皮下注射NS，rACC内注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA或NS，即NS+κ-阿片受体激动剂和NS+NS两组，图10显示两组在痛环境匹配后痛侧与非痛侧rACC脑区神经元放电频率的比较，NS+DynorphinA组（pain(+)1.3125(0.4721，2.0425)imp/sVSpain(-)1.9167(0.8271，3.1596)imp/s，P＞0.05，n=83）；NS+NS组（pain(+)0.7967(0.2038，1.8367)imp/sVSpain(-)1.3450(0.4229，2.9000)imp/s,P＞0.05,n=97），痛侧与非痛侧均无差异，且两组的痛侧之比也无差异，显示rACC内注射DynorphinA本身不会影响大鼠rACC脑区的神经元放电活动。ABpain(+)pain(-)pain(+)pain(-)20 山西医科大学硕士学位论文CNS+NSNS+DynorphinA图10κ-阿片受体激动剂DynorphinA本身不影响rACC脑区神经元的放电活动（A）、（B）分别为NS+NS、NS+DynorphinA两组大鼠痛环境匹配后痛侧与非痛侧rACC脑区神经元放电频率的比较，统计图上方为放电频率光栅图，两组痛环境匹配后痛侧与非痛侧神经元放电的光栅图两侧基本一致，（C）两组大鼠痛侧的放电频率比较，统计图上方为各组痛侧的放电频率光栅图2.2.3κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以抑制CFA引起的神经元放电频率的增加表4、图11显示各组在痛环境匹配后第三天痛侧与非痛侧rACC脑区神经元的放电频率的比较，CFA+5μg/μL和CFA+10μg/μLDynorphinA组第三天痛侧与非痛侧神经元放电频率相比均无统计学差异（P＞0.05），而CFA+NS、CFA+0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μLDynorphinA组第三天在痛侧与非痛侧神经元放电频率相比，痛侧明显高于非痛侧，差异具有统计学意义（P＜0.05）。且CFA+5μg/μL和10μg/μLDynorphinA组痛侧的放电频率与CFA+NS组相比，均明显减小，差异具有统计学意义（P＜0.05）。电生理结果显示高浓度的5μg/μL和10μg/μLDynorphinA两组起到了抑制CFA引起的rACC脑区神经元放电频率的增加的作用。21 山西医科大学硕士学位论文表4CFA+NS、CFA+不同浓度的DynorphinA（μg/μL）组痛侧与非痛侧放电活动分析(单位：imp/s)组别痛侧非痛侧*CFA+NS5.9578(2.5788,6.5129)0.0167(0.0033,0.7296)*CFA+0.53.5940(1.5383,4.9506)0.1167(0.0067,0.6577)*CFA+14.0637(2.96531,6.9996)0.0717(0.0042,0.5811)*CFA+2.53.0300(1.0239，5.0250)0.1000(0.0083,1.0720)CFA+51.1818(0.54049,2.3302)1.0767(0.6400,1.6633)CFA+100.9208(0.4171，2.28252)1.2367(0.27870,3.1371)*P<0.05Apain(+)pain(-)pain(+)pain(-)CFA+NSCFA+0.5μg/μLDynorphinApain(+)pain(-)pain(+)pain(-)CFA+1μg/μLDynorphinACFA+2.5μg/μLDynorphinApain(+)pain(pain-)pain(+)pain(-)CFA+5μg/μLDynorphinACFA+10μg/μLDynorphinA22 山西医科大学硕士学位论文BCFA+NSCFA+0.5μg/μLDynorphinACFA+1μg/μLDynorphinACFA+2.5μg/μLDynorphinACFA+5μg/μLDynorphinACFA+10μg/μLDynorphinA图11不同浓度的κ-阿片受体激动剂DynorphinA对神经元放电活动的影响23 山西医科大学硕士学位论文（A）各组大鼠痛环境匹配后痛侧与非痛侧rACC脑区神经元放电频率的比较，统计图上方为放电频率光栅图，CFA+NS组、CFA+0.5/1/2.5μg/μLDynorphinA组痛环境匹配后痛侧的光栅图密集，CFA+5/10μg/μLDynorphinA组痛环境匹配后痛侧与非痛侧神经元放电的光栅图两侧基本*一致,P＜0.05（B）各组大鼠痛侧的放电频率比较，统计图上方为各组痛侧的放电频率光栅图，*P＜0.052.3大鼠rACC脑区内注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以上调κ-阿片受体的表达水平，下调CFA引起的NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平的增加2.3.1CFA皮下注射于大鼠的左侧后脚掌使得rACC脑区NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平增加如图12A左图所示为各组大鼠rACC内全蛋白的表达；右图显示左侧后脚掌注射CFA或NS，rACC脑区注射不同浓度的κ-阿片受体激动剂或NS后各组大鼠的rACC内κ阿片受体的表达和GluN1、GluN2A和GluN2B亚基及各自磷酸化水平；图12B、C、D所示为大鼠脚掌注射CFA或NS，rACC内注射NS，Naïve组，三组相比CFA+NS组rACC内NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、和GluN2B的磷酸化水平显著升高，有统计学意义（P＜0.05）。说明CFA上调大鼠rACC内GluN1、GluN2A和GluN2B亚基的磷酸化水平。2.3.2κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以上调κ-阿片受体的表达水平，下调CFA引起的NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平的增加图12E、F、G、H所示分别为各组大鼠rACC内κ-阿片受体、GluN1、GluN2A、GluN2B表达水平情况，CFA+5μg/μLDynorphinA组和CFA+10μg/μLDynorphinA组与CFA+NS组相比，rACC脑区内κ-阿片受体表达水平显著增加，具有统计学意义（P＜0.05），NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平降低，也具有统计学意义（P＜0.05），但这两组之间无差异（P＞0.05）。其他浓度组与CFA+NS组相比，κ-阿片受体表达水平和NMDA受体亚基GluN1、GluN2A和GluN2B的磷酸化水平无差异（P＞0.05）。说明高浓度的κ-阿片受体激动剂DynorphinA可以上调κ-阿片受体的表达水平，同时下调CFA诱导的rACC内NMDA受体亚基GluN1、24 山西医科大学硕士学位论文GluN2A和GluN2B的磷酸化水平的增加，这与之前的行为及电生理的结果一致，进而说明5μg/μL或10μg/μL的κ-阿片受体激动剂DynorphinA通过激活κ-阿片受体，下调NMDA受体GluN1、GluN2A和GluN2B亚基磷酸化水平，抑制CFA引起的rACC脑区神经元放电频率的增加，反转了CPA反应从而缓解痛情绪反应。25 山西医科大学硕士学位论文图12大鼠左侧后脚掌注射CFA，rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂后rACC脑区κ-阿片受体表达水平及GluN1、GluN2A、GluN2B磷酸化水平(A)各组大鼠rACC内κ-阿片受体、GluN1、GluN2A、GluN2B亚基和全蛋白的表达水平；(B)、*(C)、(D)CFA+NS组与Naive、NS+NS组相比，GluN1、GluN2A、GluN2B磷酸化水平均显著增加，P＜0.05，(E)CFA+5μg/μL组和CFA+10μg/μL组分别与CFA+NS组相比，rACC脑区内κ-阿片受体表达水平显著增加，（F）、（G）、（H）CFA+5μg/μL组和CFA+10μg/μL组分别与CFA+NS*组相比，rACC脑区内NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平显著降低，P＜0.0526 山西医科大学硕士学位论文3讨论[35]疼痛对人们产生的负性情绪的影响远比疼痛本身更为严重。人们对痛感觉的研究在多个方面都取得了进展，但对痛情绪的研究却相对较慢。流行病学研究表明，慢性疼痛患者常伴随着焦虑、抑郁等负性情绪，其中，多部位疼痛、慢性头痛、背颈痛等会出现风险较高的情绪反应，且同时出现抑郁和焦虑等厌恶情绪几率也大大增加[36]，因此对痛情绪机制的研究显得尤为迫切。和临床研究相反，在动物实验中很难去评价痛情绪。最近，各种各样的方法已经被应用评价持续性疼痛。在这些方法中，[37]条件性位置回避（CPA）能够去评价大鼠的痛情绪。在此基础上我们实验室通过使用自制的CPA装置来检测大鼠的痛情绪，由于CPA能检测到与痛直接相关的情绪改变，并且没有进一步的伤害性刺激，因此越来越多的研究者认同这一行为学实验方[33]案。在本实验中，我们给大鼠左侧后脚掌皮下注射CFA，引起其慢性持续性炎性痛反应，通过与相应匹配室环境的耦合，从而成功诱导出条件性位置回避（CPA），[38,39]即C-CPA反应。ACC是脊髓上中枢边缘系统中的重要结构之一，通过扣带输出到丘脑前核和边缘系统的其他部分，与皮层及皮层下结构中的核团有着广泛的纤维联系，调节多种生理功能，是大脑的一个参与疼痛处理的关键性区域，多种感觉中负性情绪都可以激活[40]ACC。研究发现逃避有害热刺激时ACC神经元活动增加，并直接对有害刺激做出[41]反应或预测有害刺激，但对非有害刺激则无反应。临床研究发现，切除ACC及周围皮层组织可以缓解慢性疼痛病人的抑郁、焦虑等负性情绪，但不影响他们对伤害性刺激的定位强度等痛感觉的辨别。人类脑功能成像及电生理结果显示ACC神经元不[42]仅对伤害性刺激本身发生反应，也可以被伤害性暗示激活。有实验证实ACC而不[43]是杏仁复合体特异地参与痛相关回避行为。目前，ACC是研究最多的一个与痛情绪相关的脑区，尤其是吻侧部。阿片类药物目前被广泛的应用于临床上镇痛。有研究发现，正常人和慢性病病人ACC内都存在有大量的阿片受体结合位点。在神经病理性痛模型中，ACC内给予低剂量的吗啡，在不影响机械痛刺激的情况下，可以缓解动物的痛情绪反应。这表明在ACC处阿片受体参与了痛情绪的相关反应。镇痛药通过作用于阿片受体从而起到镇痛作用。前扣带皮层吻侧部与痛情绪密切相关，其神经元的细胞膜上分布有大量阿片27 山西医科大学硕士学位论文受体，包括μ-阿片受体、δ-阿片受体和κ-阿片受体。因此我们推断激活前扣带皮层吻侧部的阿片受体可以缓解痛情绪。实验室前期的研究结果也证实了这一结论：即激活rACC脑区神经元μ、δ-阿片受体可以通过下调rACC脑区NMDA受体亚基的磷酸化水平，抑制CFA所引起的放电频率的增加，反转CPA反应而发挥缓解痛情绪反应的作用，因此我们推测是否激活rACC脑区的κ-阿片受体同样也是通过类似的机制来缓解痛情绪反应。3.1κ-阿片受体激动剂本身不会影响CPA反应及rACC脑区神经元放电活动在本研究中，大鼠左侧后脚掌注射NS，rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂或者NS，之后检测两组大鼠的痛情绪发应，即CPA反应，可以观察到两组大鼠在痛环境匹配前后第三天在痛侧停留的时间与第一天无差别，两组的回避分数也无显著性差异，同时两组大鼠痛环境匹配后痛侧与非痛侧rACC脑区神经元放电频率相比无差异，两组痛侧之比也无差异，说明了κ-阿片受体激动剂本身不会影响CPA反应及神经元放电活动。3.2rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂不影响大鼠的热痛行为研究发现疼痛主要分为两种成分：痛感觉和痛情绪，这两种成分是通过不同的传[44]导通路发挥作用的。那么κ-阿片受体激动剂对痛情绪和痛感觉的影响是否一样呢？是否既可以缓解痛情绪又可以缓解痛感觉呢？首先我们根据实验目的在实验的第一天检测大鼠的热缩足潜伏期（PWL），第二天先在非痛环境适应，左侧后脚掌注射CFA，半个小时后在rACC脑区分别微量注射0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μL、5μg/μL、10μg/μL的κ-阿片受体激动剂DynorphinA或NS，之后再与疼痛环境耦合，第三天，同第一天测量各组大鼠的PWL。结果发现各组大鼠第三天PWL值均小于第一天，即可得出κ-阿片受体激动剂并没有缓解大鼠的痛感觉，这与在神经病理性痛模型中，ACC[45]内给予低剂量的吗啡，在不影响机械痛刺激的情况下，可以缓解动物的痛情绪反应结果是一致的，从而进一步证实了痛感觉和痛情绪是通过不同的传导通路发挥作用。3.3rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂可以缓解大鼠的痛情绪反应28 山西医科大学硕士学位论文首先我们根据实验目的在实验的第一天检测大鼠的CPA反应，第二天先在非痛环境适应，左侧后脚掌注射CFA，半个小时后在rACC脑区分别微量注射0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μL、5μg/μL和10μg/μL的κ-阿片受体激动剂DynorphinA或NS，之后再与疼痛环境耦合，第三天，同第一天测量各组大鼠的CPA反应。结果显示不同浓度的κ-阿片受体激动剂DynorphinA对痛情绪的影响不同，高浓度的5μg/μl和10μg/μl的κ-阿片受体激动剂DynorphinA注射入rACC脑区痛环境匹配前后第三天在痛侧停留的时间与第一天在痛侧停留的时间无统计学差异，两组的回避分数与CFA+NS组相比有统计学意义，但这两个浓度间的回避分数无差异，电生理结果也表明高浓度的5μg/μL和10μg/μL的κ-阿片受体激动剂DynorphinA注射入rACC脑区两组大鼠痛环境匹配后痛侧与非痛侧rACC脑区神经元放电频率相比无差异，与CFA+NS组相比，两组痛侧放电频率均明显减小，这一结果显示了低浓度的0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μLDynorphinA没有反转CPA反应同样也没有改变CFA所致的放电频率的增加，而5μg/μL和10μg/μLDynorphinA则反转了CPA反应和抑制了CFA所致的放电频率的增加。3.4激活rACC脑区κ-阿片受体可下调NMDA受体磷酸化水平缓解大鼠的痛情绪反应有研究表明，在rACC中，NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B表达量[46,47,48,49]很高。GluN2A和GluN2B亚基对rACC中LTP的形成起关键作用。研究提示ACC内兴奋性氨基酸受体尤其是NMDA受体激活对大鼠痛厌恶情绪的产生可能既是充分条件，也是必要条件，封闭GluN1的甘氨酸位点可以抑制F-CPA反应[42,50,51]。福尔马林引起的伤害性刺激显著上调大鼠ACC特别是吻侧ACC(rACC)内GluN2A和GluN2B而非GluN1的表达。我们近期的研究也证实，NMDA受体的拮抗剂可反转大鼠的C-CPA反应，NMDA受体的磷酸化水平与大鼠的痛情绪反应呈正相关（资料正在整理中，尚未发表）。本研究结果显示，与对照组大鼠相比，足底注射CFA大鼠，其rACC内GluN1、GluN2A、GluN2B亚基的磷酸化水平增高；而在大鼠足底注射CFA后，rACC脑区分别注射0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μL、5μg/μL、10μg/μL的κ-阿片受体激动剂DynorphinA或NS后，与CFA+NS组相比，CFA+5μg/μL、CFA+10μg/μL的DynorphinA组大鼠的rACC内κ-阿片受体表达量增高，而GluN1、GluN2A、GluN2B亚基的磷酸化水平却降低。由此可断定，DynorphinA激29 山西医科大学硕士学位论文活大鼠rACC内κ-阿片受体后，可通过下调GluN1、GluN2A、GluN2B亚基的磷酸化水平，反转了C-CPA反应，从而缓解了痛情绪。蛋白检测的结果与行为检测和电生理学的结果一致。由此可知CFA诱发的伤害性刺激上调rACC脑区NMDA受体GluN1、GluN2A、GluN2B亚基磷酸化水平，增加了神经元的放电频率，引起大鼠的CPA反应，即产生了痛情绪反应，而在rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂DynorphinA后，激活了κ-阿片受体，下调了GluN1、GluN2A、GluN2B亚基的磷酸化水平，抑制CFA引起的rACC脑区神经元放电频率的增加从而缓解了痛情绪反应。30 山西医科大学硕士学位论文4结论大鼠注射CFA后上调rACC脑区NMDA受体GluN1、GluN2A、GluN2B亚基磷酸化水平，增加神经元的放电频率，从而引起大鼠的CPA反应，即产生了痛情绪反应，而在rACC脑区注射一定浓度的DynorphinA后，激活了κ-阿片受体，下调GluN1、GluN2A、GluN2B亚基磷酸化水平，抑制CFA引起的rACC脑区神经元放电频率的增加，从而缓解了这种痛情绪反应。31 山西医科大学硕士学位论文参考文献[1]TsangA,Von-KorffM,LeeS,AlonsoJ,KaramE,AngermeyerMC,BorgesGL,BrometEJ,DemytteneareK,deGirolamoG,deGraafR,GurejeO,LepineJP,HaroJM,LevinsonD,OakleyBrowneMA,Posada-VillaJ,SeedatS,WatanabeM.Commonchronicpainconditionsindevelopedanddevelopingcountries:Genderandagedifferencesandcomorbiditywithdepression-anxietydisorders[J].JournalofPain,2008,9(10):883-891.[2]BairMJ,WuJ,DamushTM,SutherlandJM,KroenkeK.Associationofdepressionandanxietyaloneandincombinationwithchronicmusculoskeletalpaininprimarycarepatients[J].PsychosomaticMedicine,2008,70(8):890.[3]GurejeO.Comorbidityofpainandanxietydisorders[J].Currentpsychiatryreports,2008,10(4):318-322.[4]WilliamsAC,CraigKD.Updatingthedefinitionofpain[J].Pain,2016,157(11):2420.[5]张玉秋.痛情绪和相关记忆产生的神经机制[J].自然科学进展，2005,15(12):1409-1415[6]温存,邵晓梅,方剑乔,房军帆,杜俊英.前扣带皮层PKMζ在慢性痛伴发痛情绪中的作用研究进展[J].中国疼痛医学杂志,2017,23(5):366-370.[7]HarkinesSW,PriceDD,BraithJ.Effectsofextraversionandneuroticismonexperimentalpain,clinicalpain,andillnessbehavior[J].Pain,1989,36(2):209-218.[8]AlmeidaTF,RoizenblattS,TufikS.Afferentpainpathways:aneuroanatomicalreview[J].BrainResearch,2004,1000(2):40-56.[9]LeknesS,TraceyI.Acommonneurobiologyforpainandpleasure[J].NatureReviewsNeuroscience,2008,9(4):314.[10]HolstegeG.Theperiaqueductalgraycontrolsbrainstememotionalmotorsystemsincludingrespiration[J].ProgBrainRes.2014,209(209):379–405.[11]Craig,AD.Anewviewofpainasahomeostaticemotion[J].TrendsinNeurosciences,2003,26(6):303-307.[12]LiangM,MourauxA,HuL,LannettiGD.Primarysensorycorticescontaindistinguishablespatialpatternsofactivityforeachsense[J].NatureCommunications,2013,4(3):1979.[13]BeckerS,GandhiW,SchweinhardtP.Cerebralinteractionsofpainandrewardandtheirrelevanceforchronicpain[J].NeuroscienceLetters,2012,520(2):182.[14]BushnellMC,ČekoM,LowLA.Cognitiveandemotionalcontrolofpainanditsdisruptioninchronicpain[J].NatureReviewsNeuroscience,2013,14(7):502-11.[15]张玉秋.Involvementoftheanteriorcingulatecortexinpain-relatednegativeemotion[C]中国生理学会全国会员代表大会暨生理学学术大会.2014.[16]王华.大鼠前扣带皮层内去抑制的初步探索:痛情绪调控的可能机制[J].神经所:总,2006.[17]高永静,赵志奇,张玉秋.大鼠吻侧前扣带皮层的传入投射纤维联系——荧光金逆行追踪32 山西医科大学硕士学位论文法研究[J].神经解剖学杂志,2005,21(4):355-359.[18]王锦琰,罗非,韩济生.前扣带回在痛感知中的作用[J].中国疼痛医学杂志,2004,10(2):113-116.[19]GuL,UhelskiML,AnandS,Romero-OrteqaM,KimYT,FuchsPN,MohantySK.Paininhibitionbyoptogeneticactivationofspecificanteriorcingulatecorticalneurons.[J].PlosOne,2015,10(2):e0117746.[20]张玉秋,纪如荣.痛情绪和相关记忆机制的研究进展（英文）[J].NeuroscienceBulletin,2005(01):10-18.[21]任文华,郭继东,曹红,纪如荣,赵志奇,张玉秋.大鼠前扣带皮层吻侧(rACC)NMDA受体甘氨酸位点的激活是痛厌恶情绪产生的必要条件[C]//中国神经心理学学术会议.2005.[22]PaolettiP,BelloneC,ZhouQ.NMDAreceptorsubunitdiversity:impactonreceptorproperties,synapticplasticityanddisease[J].NatureReviewsNeuroscience,2013,14(6):383-400.[23]ChenW,WalwynW,EnnesHS,KimH,McRobertsJA.BDNFreleasedduringneuropathicpainpotentiatesNMDAreceptorsinprimaryafferentterminals[J].EuropeanJournalofNeuroscience,2014,39(9):1439.[24]NozakiC,VergnanoAM,FilliolD,OuagazzalAM,LeGoffA,CarvalhoS,ReissD,Gaveriaux-RuffC,NeytonJ,PaolettiP,KiefferBL.Zincalleviatespainthroughhigh-affinitybindingtotheNMDAreceptorNR2Asubunit[J].NatureNeuroscience,2011,14(8):1017.[25]唐雨龙,张玉秋.前扣带皮层NMDA受体-MAPK-CREB通路参与痛厌恶情绪的分子机制[J].生理学报,2017,69(05):637-646.[26]王锦琰,罗非,韩济生.中枢神经元放电的在体多通道同步记录技术[J].生理科学进展,2003,34(4):356-358.[27]HarlowHF,WoolseyCN.Biologicalandbiochemicalbasesofbehavior[M]//Biologicalandbiochemicalbasesofbehavior/.TheUniversityofWisconsinPress,1958:347.[28]FanD,RichD,HoltzmanT,RutherP,DalleyJW,LopezA,RossiMA,BarterJW,MezaDS,HerwikS,HolzhammerT,MorizioJ,YinHH.AWirelessMulti-ChannelRecordingSystemforFreelyBehavingMiceandRats[J].PlosOne,2011,6(7):e22033.[29]ThompsonGL,CanalsM,PooleDP.BiologicalredundancyofendogenousGPCRligandsinthegutandthepotentialforendogenousfunctionalselectivity[J].FrontiersinPharmacology,2014,5(5):262.[30]GorkaSM,FitzgeraldDA,DeWH,AngstadtM,PhanKL.OpioidModulationofResting-StateAnteriorCingulateFunctionalConnectivity[J].JournalofPsychopharmacology,2014,28(12):1115-1124.[31]ZadinaJE,HacklerL,GeLJ,KastinAJ.Apotentandselectiveendogenousagonistforthe|[micro]|-opiatereceptor[J].Nature,1997,386(6624):499.[32]张肖怡,兰坤,冯晓璞,宋瑞瑞,张策,张宇.痛情绪反应量化方法的探索[J].中国医学创新,2014(18):45-48.33 山西医科大学硕士学位论文[33]ZhangY,MengXZ,LiAH,XinJJ,BermanBrianM,LaoLX,Ming,ZhangRX.Electroacupuncturealleviatesaffectivepaininaninflammatorypainratmodel[J].EuropeanJournalofPain,2012,16(2):170-181.[34]冯晓璞,兰坤,张肖怡,宋瑞瑞,王锐,张宇.自制双管套管在大鼠前扣带回皮层置管给药的方法[J].中国医学创新,2014(18):42-45.[35]汪伟伟,刘菊,蒋雪丽,张森,方博文,刘伟,黄宏平,汪萌芽.不同伤害性刺激致大鼠痛感觉与痛情绪的比较[J].生命科学研究,2014,18(5):411-417.[36]ScottKM,BruffaertsR,TsangA,OrmelJ,AngermeyerMC,BrometE,deGirolamoG,deGraafR,GurejeO,HaroJM,HeY,KesslerRC,MneimnehZN,OakleyBrowneMA,Posada-VillaJ,SteinDJ,TakeshimaT,VonKorffM.Depressionanxietyrelationshipswithchronicphysicalconditions[J].JournalofAffectiveDisorders,2007,103(1-3):113-120.[37]KingT,VeraportocarreroL,GutierrezT,VanderahTW,DussorG,LaiJ,FieldsHL,PorrecaF.Unmaskingthetonic-aversivestateinneuropathicpain[J].NatureNeuroscience,2009,12(11):1364.[38]侯苗苗,杨洋,李振华,王媛,秦霞,王锐,张策,张宇.电针刺激环跳穴缓解大鼠炎症性疼痛的方法[J].中国医学创新,2015(19):22-24.[39]秦国华.前扣带皮层δ-阿片受体介导电针缓解痛情绪的行为-电生理学观察.2017.[40]朱翔.小鼠前扣带皮层CXCL13及受体CXCR5在神经病理性疼痛中的作用研究[D].苏州大学,2017.[41]ZhangZJ,CaoDL,ZhangX,etal.Chemokinecontributiontoneuropathicpain:RespectiveinductionofCXCL1andCXCR2inspinalcordastrocytesandneurons[J].Pain,2013,154(10):2185.[42]任文华.大鼠前扣带皮层吻侧部NMDA受体在痛厌恶情绪形成中的作用[D].复旦大学,2007.[43]GaoYJ,RenWH,ZhangYQ,ZhaoZQ.Contributionsoftheanteriorcingulatecortexandamygdalatopain-andfear-conditionedplaceavoidanceinrats.[J].Pain,2004,110(1):343-353.[44]Rojas-CorralesMO,BerrocosoE,Gibert-RaholaJ,MicóJA.Antidepressant-likeeffectsoftramadolandothercentralanalgesicswithactivityonmonoaminesreuptake,inhelplessrats[J].LifeSciences,2002,72(2):143-152.[45]LagraizeSC,BorzanJ,YuanBP,FuchsPN.Selectiveregulationofpainaffectfollowingactivationoftheopioidanteriorcingulatecortexsystem[J].ExperimentalNeurology,2006,197(1):22-30.[46]WeiF,WangGD,KerchnerGA,KimSJ,XuHM,ChenZF,ZhuoM.GeneticenhancementofinflammatorypainbyforebrainNR2Boverexpression[J].NatNeurosci,2001,4(2):164-169.[47]PetraliaRS,YokotaniN,WentholdRJ.LightandelectronmicroscopedistributionoftheNMDAreceptorsubunitNMDAR1intheratnervoussystemusingaselectiveanti-peptide34 山西医科大学硕士学位论文antibody[J].JNeurosci,1994,14(2):667-696.[48]ZavitsanouK,WardPB,HuangXF.Selectivealterationsinionotropicglutamatereceptorsintheanteriorcingulatecortexinschizophrenia[J].Neuropsychopharmacology,2002,27(5):826-833.[49]DanyszW,ParsonsCG.GlycineandN-methyl-D-aspartatereceptors:physiologicalsignificanceandpossibletherapeuticapplications[J].PharmacolRev,1998,50(4):597-664.[50]MonyerH,BurnashevN,LaurieDJ,SakmannB,SeeburgPH.DevelopmentalandregionalexpressionintheratbrainandfunctionalpropertiesoffourNMDAreceptors[J].Neuron,1994,12(3):529-540.[51]RenWH,GuoJD,CaoH,WangH,WangPF,ShaH,JiRR,ZhaoZQ,ZhangYQ.IsendogenousD-serineintherostralanteriorcingulatecortexnecessaryforpain-relatednegativeaffect?[J].JournalofNeurochemistry,2006,96(6):1636-1647.35 山西医科大学硕士学位论文综述在慢性疼痛中的正性情绪和大脑的奖赏回路摘要：慢性疼痛一直以来都是困扰人们的难题，它不仅影响了人们的日常生活，还给社会经济带来了很大的负担。慢性疼痛通常会引起一些负性情绪如焦虑、抑郁和快感消失。基于疼痛和快乐的交叉神经通路目前还不能被很好的理解。我们从最近的人类和动物研究中发现疼痛的厌恶成分是由处理奖赏和动机相互重叠的大脑区域编码的。我们的发现表明了在慢性疼痛中奖赏/动机通路的解剖结构和功能会发生改变。从而我们为疼痛的缓解是一种奖赏性的行为，同时激活了大脑的奖赏/动机通路这一概念提出了支持性的证据。在疼痛环境下，对这一奖赏通路的进一步研究能够为痛情绪及与之相伴随的症状的治疗提供一个新的治疗方法。关键词:慢性疼痛；奖赏通路；情绪；阿片；多巴胺；动机[1]慢性疼痛在全世界是一个迫切的医疗问题。在美国大约有1亿的人遭受疼痛，[2]在医疗保健成本和生产力损失方面每年花费将近$5600–6350亿元。慢性痛病人除了遭受本身的疼痛之外，由疼痛引发的心理和社会并发症也给病人造成了重大的负担[3,4]。慢性疼痛可能是由多种原因引起的，如慢性进行性疾病，导致痛性神经病变的糖尿病就是一个例子，或者由损伤或手术引起。外科手术如腹股沟疝修复或剖腹产手[5]术与将近10%的慢性疼痛病人的发病率相关。然而，开胸手术和截肢术也使得慢性[6]疼痛的风险增加了将近50%。外科手术或损伤引起的疼痛一般都是从急性期发展到[6]慢性疼痛的过程，从而使与疼痛相关的负性情绪不仅增加了生理上的痛的敏感性，而且还增加了抑郁、焦虑、快感消失、睡眠紊乱、决策异常，甚至是自杀倾向等这些[7,8]并发症的发生率。疼痛是流行的并且影响病人的生活，慢性疼痛和并发的情感性精神障碍仍然管理[9,10]不善，目前对它的治疗往往是不足的。因此了解慢性疼痛的情感方面，伴发的情绪影响的潜在重叠机制是发展新的治疗方法的关键因素。疼痛从根本上来说是厌恶[11,12,13][14]。疼痛的厌恶（不愉快）提供了生理上的学习信号以避免未来的有害刺激[15]以及做出躲避组织损伤刺激的行为反应。疼痛也被认为是一种稳态情绪，会引起自[15]主反应及与其他厌恶状态如饥饿、痒、渴等类似的强烈的动机需求。和这个概念一36 山西医科大学硕士学位论文[16,17]致，疼痛的缓解也像其他厌恶状态的缓解一样，是一种奖赏性的行为。对苍蝇、啮齿动物和人类的研究表明与急性伤害性刺激终止相关的信号将会获得一个积极的[18]动机性评价，同时也将会支持条件性偏爱。莱克内斯和同事们已经发现了人类的疼痛、缓解、奖赏之间的关系，而且还总结出了疼痛的缓解伴随着一种短暂的疼痛性刺[19]激终止后的愉快的情绪。这项新兴的研究为编码痛情绪的大脑通路、痛的缓解以及这些通路在慢性疼痛状态下是如何改变的提供了一个新的理解。一、大脑对疼痛的处理1.被伤害性刺激激活的区域和疼痛的信号神经影像学技术和计算机分析最新的研究进展促使研究者无创性的去评价受试者和病人的大脑功能，增加了我们对痛感觉通路的理解。神经影像学研究已经引导我们对急性伤害性刺激激活的大脑区域进行辨别，这些区域有初级躯体感觉皮质（S1）、次级躯体感觉皮质（S2），前扣带皮层（ACC），前额叶皮质（PFC），岛叶皮层（IC），[20,21,15,22]杏仁核，丘脑，小脑，导水管周围灰质区域（PAG），的中脑边缘回路（Figure1）。躯体感觉皮质（S1和S2）和岛叶皮层被认为是编码痛感觉，包括性质（刺痛、灼热[21,23,15]痛或心绞痛），定位和强度。前额区域和边缘系统（ACC，PFC，杏仁核，VTA[21,22,24,15]和伏隔核）编码情绪和动机反应，并且和痛的情感和联系方面是有关联的。中脑PAG是下调伤害性感受的主要的调控系统，同时也主导其他自主的和情感的行[25]为。研究强调了这些脑的区域并不是选择性地或者唯一被伤害性的刺激激活的或者只限于痛感觉，例如中脑边缘的奖赏通路众所周知是被本能地奖赏和奖赏性药物激活的。然而与认知、情感、动机和感觉相关的神经功能区域和痛感受、增加的痛经历在[23,26]功能上是有联系的。这些区域的相互作用也为通过情绪和动机信号改变疼痛的经历和感受提供了一种方法。韦杰和他的同事已经发现了志愿者对伤害性感受所引起的[27]大脑的激活确定了一个明显的痛的神经信号。二、慢性疼痛的大脑功能的改变1.疼痛的迁延37 山西医科大学硕士学位论文大多数疼痛在短时间内可以得到缓解，而有些疼痛超过了正常愈合的合理时间则发展为慢性疼痛。这些慢性疼痛与急性疼痛在机制、症状和对治疗的反应上是不同的。神经影像学研究已经表明了慢性痛会改变大脑的程序。因此慢性痛可能伴随着大脑结[28,29,30,31]构特征、功能联系和这些区域激活的改变。重要的是，这些适应性的变化在大脑的情感和奖赏性通路中被观察到，从而为慢性疼痛病人伴发的情感紊乱高的发病率提供了一个可能的解释。一个最近的神经影像学研究跟踪亚急性背部疼痛病人一年[30]以观察是否大脑的改变能够反映病人发展成了持续性的后背疼痛或者将会恢复。作者发现情感和奖赏通路中的适应改变可以作为发展为慢性疼痛的预测。特殊的是，在第一次回访的时候（痛的慢性化发生之前）持续性后背疼痛的病人中间PFC和伏隔核之间要比后背疼痛恢复的病人有更强的功能联系，暗示出这个功能联系可能是用来[30]预测下背部疼痛的慢性化。因为PFC在处理痛的情感和痛厌恶的发展方面是有关联的，这个结果暗示了动机/奖赏通路的功能联系能改变痛感受的处理。由相同的实[31]验者做的之后的研究即将早期、急性/亚急性和晚期的后背疼痛组的脑激活模式与[32]“疼痛”、“情绪”相关的元分析概率图进行了比较。早期后背疼痛组脑的激活仅限于与急性“痛”相关的区域（Figure1），而发展为慢性下背部疼痛后，这些区域和激活的[31]模式展示了那些处理情绪的区域包括杏仁核和中间PFC在内有着广泛的重叠。从而得出，与那些亚急性和疼痛恢复组相比，慢性痛病人趋向于通过情绪相关的通路再到更广泛的区域来处理疼痛。综上，这些研究展示了奖赏通路和动机发展通路之间的联系可能有利于预测痛的慢性化。慢性疼痛病人的奖赏/动机通路和情感通路的解剖和功能的重组可能解释了病人经常经历的情感紊乱。2.慢性痛病人的奖赏通路的中断主要由VTA，NAc和PFC组成的中央-皮质-边缘动机/评价回路对有动机的和寻求奖赏的行为是关键的。来自于VTA内的多巴胺能神经元在NAc区释放的多巴胺和奖赏性行为的暗示是有关联的。所以，NAc在动机偏爱行为中扮演着重要的角色（如吃、喝、繁殖等自然奖赏），这些途径可能被本质上具有奖赏性和导致成瘾的药物占[33]据。最近的研究表明中脑边缘奖赏途径的功能障碍或改变能够导致慢性痛的病理改[34,35]变。例如，一个影像学研究，给正常的志愿者注射高渗性的生理盐水引起的疼痛[28,36]和与内源性镇痛系统的多巴胺的激活相关的基底神经节释放的多巴胺的量有关。38 山西医科大学硕士学位论文[28]和健康的受试者相反，伤害性的刺激并没有引起纤维肌痛病人的多巴胺的释放。更[37]重要的是纤维肌痛病人在痛感受和痛缓解期间VTA的激活是减少的。因此，基于小样本的受试者，这些发现展示了在纤维肌痛病人中，多巴胺信号发生了下调。奖赏通路功能的障碍也已经在其他的慢性疼痛症状中被描述，例如灼口综合征、非典型面[38]部疼痛。所以奖赏通路的中断会引起慢性疼痛病人异常的奖赏处理，然而，需要更进一步的研究来证明这个理论。三、大脑中疼痛缓解的可能机制1.奖赏通路的激活若干的研究表明中脑边缘的动机/奖赏通路的激活有助于痛感受和痛的缓解。与中脑边缘通路的奖赏学习和奖赏预测这一作用一致，由西摩和他的同事做的神经影像学研究发现缓解疼痛的期望与杏仁核和中脑内的神经元激活有关。更重要的是，疼痛[39]缓解引起的快感是与伏隔核内神经元的不断激活有关。在一个BOLD成像实验中，受试者为健康的志愿者，伤害的热刺激开始的时候，，NAc内神经元的激活是减少的，[40]而停止的时候神经元的激活增加。同样，在随后的一个实验中，健康的志愿者在伤[29]害性热刺激停止的时候NAc的激活增加，而慢性痛患者在伤害性热刺激停止的时[29]候NAc的激活是减少的。而且持续性后背痛的慢性痛患者在急性伤害性刺激期间激活也是减少的，从而暗示出在刺激终止所引起的激活的减少反映了当病人注意到自己持续性后背疼痛的时候产生厌恶。这些结果表明在慢性痛、持续性疼痛的状态下疼痛刺激终止的时候NAc神经元激活发生了改变。而人类神经影像学研究表明了中脑边缘奖赏通路参与疼痛的缓解，奖赏通路对于痛情绪缓解的直接神经化学证据有待于进一步的确认。动物实验和临床研究不同，动物实验很难去评价动物的痛情绪。最近，各种各样的方法已经被应用评价进行性疼痛[42][43]。在这些方法中，条件性位置偏爱（CPP）范式能够去评价大鼠的痛情绪。因为进行性的疼痛使人产生强烈的寻求缓解疼痛的动机，在CPP范式中动机行为能够被[43]用来作为非言语动物痛厌恶调节的评价。对人类进行性疼痛有效的临床治疗在CPP[43,44,45]范式中也是有效的，对人类无效的在CPP范式中也无效。使用CPP范式对大[21,46]鼠的研究与把疼痛的缓解作为一种奖赏性行为的人类的心理学研究是一致的。39 山西医科大学硕士学位论文对疼痛治疗而不是本身的奖赏行为而使得疼痛缓解，导致了中脑边缘奖赏通路激活，这在许多痛模型实验中被观察到。纳芙拉蒂洛娃和他的同事们展示了由术后疼痛（腘窝利多卡因注射引起外周神经阻滞）引起的CPP通常伴随着腹侧被盖区多巴胺[44]能神经元的激活和NAc外壳内多巴胺释放量的增加。在动物模型中由于将炎症介质应用于硬脑膜导致偏头痛，抗偏头痛药物诱导CPP以及增加NAc外壳多巴胺释放[47]。这些缓解疼痛的措施能够通过在NAc中应用药物阻断多巴胺能信号传导而被取消。因此，人类神经影像学和临床前体内研究表明疼痛厌恶的缓解在中脑边缘奖励系统的多巴胺能神经元的激活中反映出来。2.扣带皮层内阿片通路对痛厌恶缓解的作用[19]在人类成像研究中，前扣带皮质（ACC）在急性伤害性的刺激后广泛的被报[48]道，ACC激活的强度和与主观不愉快相关。ACC的激活被认为和情绪、认知过程[49,15][50]、安慰剂引起的止痛过程有关。用阿片样物质的放射性示踪剂进行正电子发射断层扫描（PET）成像表明ACC中内源性阿片样物质在减少情绪中起着主要作用[51,52,53][54,55]。此外，阿片样镇痛药似乎主要在ACC内作用以调节疼痛的影响。其他[24,56]前额叶皮层区域也涉及慢性疼痛的治疗以及缓解疼痛的过程。在动物疼痛模型中LaGraize等人已经表明，吗啡注射入神经病理性疼痛的大鼠的ACC区选择性地减少反复诱发机械刺激引起的疼痛的情感/动机而不改变脚掌回缩[54]潜伏期。[57]我们另外显示在ACC区应用吗啡仅促进了损伤组鼠的NAc区的多巴胺释放。我们已经证明非阿片类疼痛缓解治疗需要ACC阿片样物质信号，以缓解疼痛影响和激活奖赏通路。虽然ACC中的阿片样物质阻断阻止了CPP和多巴胺的释放，它对诱发刺激的行为阈值没有影响。同样，全身应用吗啡对行为阈值也无影响，但能使神经病理性损伤而非假手术组大鼠产生CPP和促进NAc多巴胺的释放。吗啡的这种抗厌恶情绪的作用可以被ACC内阿片样物质受体的阻断剂来阻滞。这些发现为依赖于ACC内阿片样物质通路和NAc中下游的多巴胺信号的疼痛缓解提供了神经基础。因[57]此，内源性ACC内的阿片样物质回路可能对于痛缓解的这种奖赏行为是必须的。40 山西医科大学硕士学位论文结论神经影像学确定了处理疼痛和情绪的脑电路，以及可能反映了慢性疼痛患者疼痛迁延和情感障碍的机制。多项研究表明参与情感学习和动机的脑区对疼痛的情感处理及其缓解起着至关重要的作用。此外，临床和临床前数据表明，急性和慢性疼痛情绪[41,29,44]成分的缓解通过奖赏回路的激活反映出来。这些见解不仅有助于阐明慢性疼痛的病理基础，还可以作为一种方法去开发新的治疗慢性疼痛的疗法。治疗慢性疼痛新药的发展由于缺乏合适的生物标志物而受到阻碍。最近，神经成像技术的结果提出了[58]针对疼痛的生物标志物的可能性。对于急性疼痛，Wager等人显示热痛引起的特殊[27]的脑区激活能够通过应用瑞芬太尼而被减弱。此外，哈里斯和他的同事表明纤维肌[59]痛患者脑功能的异常改变可以用两周的普瑞巴林来治疗。这些结果表明功能脑成像技术可能成为一个替代终点来补充视觉的模拟量表。虽然神经影像学和在体研究技术在脊髓上通路已经被使用，使我们了解一些关于疼痛和情感处理的重要机制，但基于疼痛的迁延和缓解的精确机制，仍有待阐明。同时需要进一步的努力去探寻针对介导慢性疼痛的脊髓上通路的新疗法。研究测量疼痛的实用方法及其调制还有神经成像将在推进新的机制性疗法中发挥重要作用。41 山西医科大学硕士学位论文参考文献[1]TsangA,VonKorffM,LeeS,AlonsoJ,KaramE,AngermeyerM,BorgesG,BrometE,DemytteneareK,deGirolamoG,deGraafR,GurejeO,LepineJ-P,HaroJ,LevinsonD,OakleyBrowneM,Posada-VillaJ,SeedatS,WatanabeM.Commonchronicpainconditionsindevelopedanddevelopingcountries:genderandagedifferencesandcomorbiditywithdepression-anxietydisorders[J].JPain.2008,9(10):883–891.[2]InstituteofMedicineCommitteeonAdvancingPainResearchC,Education.RelievingPaininAmerica:ABlueprintforTransformingPrevention,Care,Education,andResearch.NationalAcademiesPress(US).2011[3]BairM,WuJ,DamushT,SutherlandJ,KroenkeK.Associationofdepressionandanxietyaloneandincombinationwithchronicmusculoskeletalpaininprimarycarepatients[J].PsychosomaticMedicine,2008,70(8):890.[4]GurejeO.Comorbidityofpainandanxietydisorders[J].CurrentPsychiatryReports,2008,10(4):318-22.[5]KehletH,JensenTS,WoolfCJ.Persistentpostsurgicalpain:riskfactorsandprevention[J].Lancet.2006,367（9522）:1618–1625.[6]BorsookD,EdwardsR,ElmanI,BecerraL,LevineJ.Painandanalgesia:Thevalueofsaliencecircuits[J].ProgressinNeurobiology,2013,104(5)::93–105.[7]ApkarianAV,SosaY,SontyS,LevyRM,HardenRN,ParrishTB,GitelmanDR.Chronicbackpainisassociatedwithdecreasedprefrontalandthalamicgraymatterdensity[J].JNeurosci.2004,24(46):10410–10415.[8]ElmanI,BorsookD,VolkowN.Painandsuicidality:insightsfromrewardandaddictionneuroscience[J].ProgNeurobiol.2013,109(10):1–27.[9]BackonjaMM,IrvingG,ArgoffC.Rationalmultidrugtherapyinthetreatmentofneuropathicpain[J].CurrPainHeadacheRep.2006,10(1):34–38.[10]FinnerupNB,SindrupSH,JensenTS.Theevidenceforpharmacologicaltreatmentofneuropathicpain[J].Pain.2010,150(3):573–581.[11]PriceDD,HarkinsSW.Theaffective-motivationaldimensionofpain[J].APSJournal.1992,1(4):229–239.[12]FieldsHL.Pain:anunpleasanttopic.Pain[J].1999,Suppl6(Suppl6):S61–S69.[13]PriceDD.Psychologicalandneuralmechanismsoftheaffectivedimensionofpain[J].Science.2000,288(5472):1769–1772.[14]JohansenJP,FieldsHL.Glutamatergicactivationofanteriorcingulatecortexproducesanaversiveteachingsignal[J].NatNeurosci.2004,7(4):398–403.[15]BushnellMC,CekoM,LowLA.Cognitiveandemotionalcontrolofpainanditsdisruptioninchronicpain[J].NatRevNeurosci.2013,14(7):502–511.42 山西医科大学硕士学位论文[16]CraigAD.Anewviewofpainasahomeostaticemotion[J].TrendsNeurosci.2003,26(6):303–307.[17]DentonDA,McKinleyMJ,FarrellM,EganGF.Theroleofprimordialemotionsintheevolutionaryoriginofconsciousness[J].ConsciousCogn.2009,18(2):500–514.[18]GerberB,YaraliA,DiegelmannS,WotjakCT,PauliP,FendtM.Pain-relieflearninginflies,rats,andman:basicresearchandappliedperspectives[J].Learning&Memory.2014,21(4):232–252.[19]LeknesS,BrooksJC,WiechK,TraceyI.Painreliefasanopponentprocess:apsychophysicalinvestigation[J].EurJNeurosci.2008,28(4):794–801.[20]ApkarianAV,BushnellMC,TreedeRD,ZubietaJK.Humanbrainmechanismsofpainperceptionandregulationinhealthanddisease[J].EurJPain.2005,9(4):463–484.[21]LeknesS,TraceyI.Acommonneurobiologyforpainandpleasure[J].NaturereviewsNeuroscience.2008,9(4):314–320.[22]LiangM,MourauxA,HuL,IannettiG.Primarysensorycorticescontaindistinguishablespatialpatternsofactivityforeachsense[J].Naturecommunications.2013,4(3):1979.[23]TraceyI.Gettingthepainyouexpect:mechanismsofplacebo,noceboandreappraisaleffectsinhumans[J].Naturemedicine.2010,16(11):1277–1283.[24]BeckerS,GandhiW,SchweinhardtP.Cerebralinteractionsofpainandrewardandtheirrelevanceforchronicpain[J].NeuroscienceLetters,2012,520(2):182-7.[25]HolstegeG.Theperiaqueductalgraycontrolsbrainstememotionalmotorsystemsincludingrespiration[J].ProgBrainRes.2014,209(209):379–405.[26]TraceyI,JohnsE.Thepainmatrix:reloadedorrebornasweimagetonicpainusingarterialspinlabelling[J].Pain.2010,148(3):359–360.[27]WagerT,AtlasL,LindquistM,RoyM,WooC-W,KrossE.AnfMRI-basedneurologicsignatureofphysicalpain[J].NEnglJMed.2013,368(15):1388–1397.[28]WoodP,SchweinhardtP,JaegerE,DagherA,HakyemezH,RabinerE,BushnellM,ChizhB.Fibromyalgiapatientsshowanabnormaldopamineresponsetopain.[J].EuropeanJournalofNeuroscience,2007,25(12):3576.[29]BalikiM,GehaP,FieldsH,ApkarianA.Predictingvalueofpainandanalgesia:nucleusaccumbensresponsetonoxiousstimulichangesinthepresenceofchronicpain.Neuron[J].2010,66(1):149–160.[30]BalikiM,PetreB,TorbeyS,HerrmannK,HuangL,SchnitzerT,FieldsH,ApkarianA.Corticostriatalfunctionalconnectivitypredictstransitiontochronicbackpain[J].NatNeurosci.2012,15(8):1117–1119.[31]HashmiJ,BalikiM,HuangL,BariaA,TorbeyS,HermannK,SchnitzerT,ApkarianA.Shapeshiftingpain:chronificationofbackpainshiftsbrainrepresentationfromnociceptivetoemotionalcircuits[J].Brain.2013;136(9):2751–2768.[32]YarkoniT,PoldrackRA,NicholsTE,VanEssenDC,WagerTD.Large-scaleautomated43 山西医科大学硕士学位论文synthesisofhumanfunctionalneuroimagingdata[J].NatMethods.2011,8(8):665–670.[33]WiseRA.Dopamine,learningandmotivation[J].NatRevNeurosci.2004,5(6):483–494.[34]FarmerMA,BalikiMN,ApkarianAV.Adynamicnetworkperspectiveofchronicpain[J].NeurosciLett.2012,520(2):197–203.[35]NavratilovaE,PorrecaF.Rewardandmotivationinpainandpainrelief[J].NatNeurosci.2014,17(10):1304–1312.[36]WoodPB,PattersonJC2nd,SunderlandJJ,TainterKH,GlabusMF,LilienDL.Reducedpresynapticdopamineactivityinfibromyalgiasyndromedemonstratedwithpositronemissiontomography:apilotstudy[J].JPain.2007b,8(1):51–58.[37]LoggiaM,BernaC,KimJ,CahalanC,GollubR,WasanA,HarrisR,EdwardsR,NapadowV.Disruptedbraincircuitryforpain-relatedreward/punishmentinfibromyalgia.[J].Arthritis&Rheumatology,2014,66(1):203-212.[38]JarchoJ,MayerE,JiangZ,FeierN,LondonE.Pain,affectivesymptoms,andcognitivedeficitsinpatientswithcerebraldopaminedysfunction[J].Pain.2012,153:744–754.[39]SeymourB,O'DohertyJP,KoltzenburgM,WiechK,FrackowiakR,FristonK,DolanR.Opponentappetitive-aversiveneuralprocessesunderliepredictivelearningofpainrelief[J].NatNeurosci.2005,8(9):1234–1240.[40]LeknesS,LeeM,BernaC,AnderssonJ,TraceyI.Reliefasareward:hedonicandneuralresponsestosafetyfrompain[J].PLoSOne.2011,6(4):e17870.[41]BecerraL,BorsookD.Signalvalenceinthenucleusaccumbenstopainonsetandoffset[J].EuropeanJournalofPain,2008,12(7):866-869.[42]WhitesideGT,PomonisJD,KennedyJD.Anindustryperspectiveontheroleandutilityofanimalmodelsofpainindrugdiscovery[J].NeuroscienceLetters,2013,557PtA(6):65.[43]KingT;Vera-PortocarreroL;GutierrezT;VanderahTW;DussorG;LaiJ;FieldsHL;PorrecaF.Unmaskingthetonic-aversivestateinneuropathicpain[J].NatureNeuroscience,2009,12(11):1364.[44]avratilovaE,XieJ,OkunA,QuC,EydeN,CiS,OssipovM,KingT,FieldsH,PorrecaF.Painreliefproducesnegativereinforcementthroughactivationofmesolimbicreward-valuationcircuitry[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2012,109(50):20709-20713.[45]NavratilovaE,XieJ,KingT,PorrecaF.Evaluationofrewardfrompainrelief[J].AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences,2013,1282(1):1.[46]NavratilovaE,AtcherleyC,PorrecaF.BrainCircuitsEncodingRewardfromPainRelief[J].TrendsinNeurosciences,2015,38(11):741-750.[47]DeFeliceM,EydeN,DodickD,DussorG,OssipovM,FieldsH,PorrecaF.Capturingtheaversivestateofcephalicpainpreclinically[J].AnnalsofNeurology,2013,74(2):257–265.[48]RainvilleP,DuncanGH,PriceDD,CarrierB,BushnellMC.Painaffectencodedinhumananteriorcingulatebutnotsomatosensorycortex.[J].Science,1997,277(5328):968.44 山西医科大学硕士学位论文[49]VillemureC,BushnellMC.MoodInfluencesSupraspinalPainProcessingSeparatelyfromAttention[J].JournalofNeuroscience,2009,29(3):705-715.[50]WagerTD,RillingJK,SmithEE,SokolikA,CaseyKL,DavidsonRJ,KosslynSM,RoseRM,CohenJD.Placebo-inducedchangesinFMRIintheanticipationandexperienceofpain[J].Science,2004,303(5661):1162-1167.[51]ZubietaJK,SmithYR,BuellerJA,XuY,KilbournMR,JewettDM,MeyerCR,KoeppeRA,StohlerCS.Regionalmuopioidreceptorregulationofsensoryandaffectivedimensionsofpain[J].Science.2001,293(5528):311–315.[52]WagerTD,ScottDJ,ZubietaJK.Placeboeffectsonhumanmu-opioidactivityduringpain[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2007,104(26):11056-11061.[53]ZubietaJK,StohlerCS.Neurobiologicalmechanismsofplaceboresponses.[J].AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences,2009,1156(1):198.[54]LaGraizeSC,BorzanJ,PengYB,FuchsPN.Selectiveregulationofpainaffectfollowingactivationoftheopioidanteriorcingulatecortexsystem.[J].ExperimentalNeurology,2006,197(1):22.[55]OertelBG,PreibischC,WallenhorstT,HummelT,GeisslingerG,LanfermannH,LotschJ.Differentialopioidactiononsensoryandaffectivecerebralpainprocessing[J].ClinPharmacolTher.2008,83(4):577–588.[56]DenkF,McMahonSB,TraceyI.Painvulnerability:aneurobiologicalperspective[J].NatNeurosci.2014,17(2):192–200.[57]NavratilovaE,XieJY,MeskeD,QuC,MorimuraK,OkunA,ArakawaN,OssipovM,FieldsHL,PorrecaF.RequiredforReliefofPain[J].JournalofNeuroscience,2015,35(18):7264-7271.[58]BorsookD,BecerraL,HargreavesR.Biomarkersforchronicpainandanalgesia.Part1:theneed,reality,challenges,andsolutions[J].DiscoveryMedicine,2011,11(58):197-207.[59]HarrisRE,NapadowV,HugginsJP,PauerL,KimJ,HampsonJ,SundgrenPC,FoersterB,PetrouM,Schmidt-WilckeT,ClauwDJ.Pregabalinrectifiesaberrantbrainchemistry,connectivity,andfunctionalresponseinchronicpainpatients.[J].Anesthesiology,2013,119(6):1453-1464.45 山西医科大学硕士学位论文图1：420例fMRI研究的Neurosynth荟萃分析报告疼痛的结果图像显示最常见的疼痛刺激激活的脑区，包括初级和次级体躯体感觉皮质（S1，S2），岛状皮质（IC），前扣带皮质（ACC）和导管周围灰色区域（PAG）。图2：条件性位置偏爱（CPP）范例CPP可用于啮齿动物，以揭示持续疼痛的存在和由缓解疼痛引起的奖赏。CPP盒通常由两个分隔室组成，这两个室有不同的感官线索，并通过中间室连接。在条件适应前一天，动物被放入CPP盒中，并可以进入所有的房间，每个房间停留的时间都可以被记录以确保在条件适应前没有偏爱。在条件适应期间，动物学会将一个配对室与对照药物关联起来，而把另外一个室与治疗疼痛的药物关联起来。在测试当天，把动物放置在无药物的CPP盒子中，可以自由进出每个房间，记录在每个房间停留的时间。在以前药物配对的房间中停留的时间增加表明对疼痛药物的治疗产生了偏爱。46 山西医科大学硕士学位论文致谢研究生三年在课题组这个大家庭里，无论在学习还是生活上，我都学到了很多东西，自身素质得到了很大的提高。衷心感谢我的导师张宇教授在实验中对我的悉心指导，他工作一丝不苟，科研上严谨求实，从而使我能够更好地掌握专业知识和实验技能，顺利完成实验。同时感谢老师在生活上给予的帮助和支持，祝您工作顺利。衷心感谢乔健天教授、赵荣瑞教授、吴博威教授等老一辈生理学着，他们为我们现在的实验环境奠定了基础，他们的精神值得我们学习和发扬。感谢张策教授、祁金顺教授和生理学系这个温暖的大家庭为我提供了学习和发展自我的环境。衷心感谢课题组的李建国老师、赵欣老师、杨小荣老师、殷丽天老师、尹艺儒老师、高丽娟老师对我实验和生活中的帮助，祝愿老师们身体健康，工作顺利。感谢王锐师兄，李艳丽师姐，郝利军师兄，吴淑芬师姐，马洋师姐，秦国华师姐等，谢谢你们教会我实验技术，感谢你们对我实验和生活的帮助，希望你们一帆风顺。感谢代洁琼，刘小艳，董元坤，庞亚娜，李恩惠等同学在实验中对我的帮助，感谢杜振莹、关晓雅、高洁、黄燕云等师妹给予我的意见和帮助，希望大家前途似锦，快乐过好每一天。最后，我还要特别感谢我的家人，感谢你们对我的无微不至的关心和支持。本课题承蒙国家自然科学基金“电针影响前扣带皮层神经元活动缓解痛情绪的作用及机制研究（编号：81371254）”资助，特此致谢。47 山西医科大学硕士学位论文个人简历一、基本情况贾欣，女，1992年2月生，汉族，山西省临汾市曲沃县人。专业：生理学，主要研究方向：疼痛及其调制。二、学习工作经历（从大学起）2010年9月-2015年7月，长治医学院，护理学专业，学士2015年9月-2018年7月，山西医科大学，生理学专业，硕士三、研究成果（一）科研项目[1]国家自然科学基金:电针影响前扣带皮层神经元活动缓解痛情绪的作用及机制研究（编号:81371254）,2014年1月—2017年12月,研究经费（70万），在研，参与；[2]教育部科学技术研究项目：前扣带皮层阿片受体参与电针缓解痛情绪机制，2014年1月—2017年12月，在研，参与。（二）发表文章第一作者文章贾欣，代洁琼，乔巧玉，赵欣，王志华，关晓雅，杜振莹，张宇.不同浓度完全弗氏佐剂（CFA）影响大鼠疼痛行为的观察[J]2018（已被中国医学创新杂志录用）其他作者文章[1]秦国华，马洋，赵欣，王志华，贾欣，代洁琼，陈建鸣，张策，张宇.不同频率电针刺激缓解大鼠痛情绪的行为观察[J].中国医学创新,2017,14(14):48 山西医科大学硕士学位论文001-004.（中文期刊）.[2]马洋，秦国华，王锐，赵欣，王志华，代洁琼，贾欣，陈建鸣，李建国，张策，张宇.CFA诱导的大鼠条件位置逃避模型的观察[J].中国医学创新,2017,14(29):005-008.(中文期刊).[3]代洁琼，贾欣，乔巧玉，王志华，赵欣，杜振莹，关晓雅，张宇.利用微透析技术在大鼠脑内的取样方法[J]2018（已被中国医学创新杂志录用）（三）获得专利[1]张宇；王媛；秦霞；赵欣；王锐；秦国华；马洋；贾欣；代洁琼；陈建鸣；陈晋源；张策，一种精确脑组织取材，山西医科大学，中国，ZL201521067384.5，2016年05月18日；[2]张宇；秦霞；王媛；王锐；马洋；秦国华；代洁琼；贾欣；代洁琼；李建国；赵欣；陈晋源；陈建鸣；张策，一种带双侧给药管的多通道电极，山西医科大学，中国，ZL201620084408.6.2016年07月13日。（四）会议中国神经科学学会第十二届全国学术会议，2017年10月12-15日，天津49