莱姆病、布鲁菌病诊断方法的建立和流行病学调查

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I 分类号：密级：学号：2013109018单位代码：10759石河子大学硕士学位论文莱姆病、布鲁菌病诊断方法的建立和流行病学调查学位申请人牟路萌指导教师王远志副教授申请学位门类级别医学硕士学科、专业名称病原生物学研究方向地方感染性疾病所在学院医学院中国·新疆·石河子2016年11月 EstablishmentofdiagnosticmethodsandEpidemiologicalInvestigationforBrucellosisandLymediseaseADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByMuLumeng(PathogenBiology)DissertationSupervisor:AssociateProf.WangYuan-zhiNovember，2016ShiheziXinjiangChina 课题来源国家科技支撑计划新疆地方常见疾病防治适宜技术研究与应用项目编号：2013BAI05B05国家自然科学基金项目新疆边境地区蜱种分布及蜱传疾病分子流行病学研究项目编号：81560338 V 中文摘要目的：1.在新疆北疆部分地区采集优势蜱种，进行莱姆病螺旋体和布鲁菌分子流行病学调查，初步揭示蜱在莱姆病螺旋体和布鲁菌病原传播中可能起到一定作用；2.选取新疆塔城161、165、167三个团场，对牧场职业人群（牧民、半农半牧、兽医）进行莱姆病和布鲁菌病病原学和血清学调查，研究职业人群这两种疾病的感染情况；3.利用纯化的莱姆病螺旋体BmpA蛋白和布鲁菌VirB5蛋白，制备和筛选相应的单克隆抗体，为后期制备纳米颗粒试剂条奠定基础；方法：1.在新疆北疆部分地区采集寄生蜱和游离蜱，通过采用PCR检测技术来检测蜱中布鲁菌和莱姆病螺旋体的携带情况；2.在新疆塔城161、165、167三个团场中采集牧场职业人群的血样共246份，通过采用病原学和血清学两种方法对布鲁菌和莱姆病螺旋体进行检测，以此得到血样中这两种病原的阳性率；3.对“BmpA”和“VirB5”，分别采用免疫小鼠、细胞融合、挑取克隆、单克隆细胞两次筛选和单克隆细胞亚类鉴定等方法获取单抗细胞株，采用WesternBlot进行单抗筛选，以此获得最优抗体。结果：1.在对新疆北疆各地硬蜱检测中，检测到布鲁菌阳性率在寄生蜱中为7.73%（32/414），游离蜱中未检测到阳性样本，亚洲璃眼蜱中为5.30%（7/132），刻点血蜱中为8.74%（16/183），边缘革蜱中为5.26%（2/38），图兰扇头蜱中为17.50%（7/40）；检测到伯氏疏螺旋体阳性率在寄生蜱中为3.86%（16/414），在游离蜱中为35.07%（47/134），亚洲璃眼蜱中为5.30%（7/132），刻点血蜱中为3.82%（7/183），边缘革蜱中为5.26%（2/38）。2.在对塔城牧场职业人群血样检测中，通过病原学方法和血清学方法检测布鲁菌的阳性率分别为2.03%（5/246）和19.51%（48/246）；通过血清学方法检测莱姆病螺旋体的阳性率为11.38%（28/246），病原学方法未检测到莱姆病疏螺旋体。3.免疫效价检测结果，“BmpA”选择3号组小鼠进行细胞融合实验，“VirB5”选择2号组小鼠进行细胞融合实验。单克隆细胞第一次筛选，“BmpA”和“VirB5”均得到41株阳性杂交瘤细胞株；单克隆细胞第二次筛选，“BmpA”得到12株阳性杂交瘤细胞株，“VirB5”得到6株阳性杂交瘤细胞株；单克隆细胞亚类鉴定，“BmpA”得到12株IgG类型的阳性杂交瘤细胞株，“VirB5”得到6株IgG类型的阳性杂交瘤细胞株；WesternBlot进一步筛选阳性杂交瘤细胞株，“BmpA”的5号细胞株和“VirB5”的19号细胞株获取的抗体与对应蛋白结合更好。结论：1.蜱在家畜水平传播布鲁菌中起到一定作用；亚洲璃眼蜱、刻点血蜱、边缘革蜱有可能是莱姆病螺旋体的媒介生物，该结论扩大了莱姆病螺旋体媒介生物的范围。2.牧场职业人群的血样检测结果显示，莱姆病螺旋体和布鲁菌在牧场职业人群中存在高感染性，尤其是布鲁菌，应加强布病疫区职业人群献血人群的筛查工作。3.本研究制备的“BmpA”和“VirB5”单克隆抗体，对相应蛋白具有良好的特异性与敏感性，为后期组织中检测病原诊断方法的建立奠定了基础。关键词：蜱；莱姆病；布鲁菌病；单克隆抗体；BmpA；VirB5论文类型：A(基础研究)VI AbstractObjective:Firstly,toinvestigatethemolecularprevalenceofBorreliaandBrucellainparasiticandfree-livingticksinseveralCities/CountiesofXinjiangProvince,andfurthertoprovidethetheorybasisforconfirmationdominantticksashostforthesetwobacteria;secondly,tocarryouttheetiologyandserologicalinvestigationoftheLymediseaseandbrucellosisoftheshepherdsinTachengCity,northregionofXinjiangProvince,whichprovidesbasicinformationofthelocalimpactsofthesetwodiseases;andthirdly,toprepareandselectthecorrespondingmonoclonalantibodyusingthepurifiedBorreliaburgdorferiBmpAproteinandBrucellaVirB5proteinforthelaterpreparationofnanoparticlesreagents.Methods:AfterthegenomicDNAextractionwasperformed,thenucleotidesofBorreliaandBrucellaweredetectedfromtickscollectedinseveralCities/CountiesofXinjiangProvince.Atotalof246bloodsamplesfromtheshepherdswereusedtodetecttheinfectiousratesforbothpathogensbybacterialandserologicalmethods.AsforantigensofBorreliaburgdorferiBmpAproteinandBrucellaVirB5protein,monoclonalantibodiesweredevelopedandscreenedafterimmunizingmice,cellfusion,cloning,outscreenofmonoclonalcells,subtypesidentification.ThentheoptimalantibodiesforBmpAandVirB5proteinswerefurtherscreenedwithWesternBlotmethods.Results:TheaveragepositiverateforBrucellanucleotidewas7.73%inparasiticticks.Amongthem,theywererespectively5.30%,8.74%,5.26%and17.50%inHyalommaasiaticum,Haemaphysalispunctata,DermacentormarginatusandRhipicephalusturanicus.TheaveragepositiveratesforBorreliawere3.86%and35.07%inparasiticticksandfree-livingticks,respectively.Amongthem,theywererespectively5.30%,3.82%and5.26%inHy.Asiaticum,Ha.punctataandD.marginatus.Thepositiverateswere2.03%and19.51%in246bloodsmplesbybacterialandserologicalmethods,respectively.Theresultsofantibodytitertestshowed12cellstrainsforBmpAproteinand6cellstrainsforVirB5proteinwerepositivebyWesternBlot.TwooptimalcellstrainforBmpAproteinandVirB5proteinwerefurtherdeterminedbyWesternBlot.Conclusion:Pastureticksmaybeplayacertainroleinthehorizontaltransmissionoflivestockbrucellosis.Hy.asiaticum,Ha.punctateandD.marginatusbecomeasLymediseasecarriers,whichmightexpandthescopeofLymediseasevectors.ThedetectionresultsofthebloodsamplesinshepherdspresentedahighinfectionofBorreliaandBrucella,especiallyforVIII Brucella,shouldstrengthentheoutscreenofblooddonorsinhighprevalentarea.TheoptimalcellstrainsforBmpAproteinandVirB5protein,whichcouldsecretemonoclonalantibodies,wereobtainedinthisstudy.Thefindingswouldlayfoundationsforthelaterarticlepreparationofnanoparticlereagent.Keyword:Tick；Lymedisease；Brucellosis；Monoclonalantibodies；BmpA；VirB5Typeofthesis:A(Basicresearch)IX 目录中文摘要..............................................................................................................................................................VIAbstract.............................................................................................................................................................VIII中英符号表.........................................................................................................................................................XII引言.......................................................................................................................................................................1第一章.....................................................................................................................................................................3北疆各地硬蜱布鲁菌和莱姆病螺旋体的检测......................................................................................................31材料与方法..........................................................................................................................................................32结果......................................................................................................................................................................83讨论....................................................................................................................................................................14第二章...................................................................................................................................................................18新疆塔城布鲁菌病和莱姆病的流行病调查........................................................................................................181材料与方法........................................................................................................................................................192结果....................................................................................................................................................................223讨论....................................................................................................................................................................24第三章...................................................................................................................................................................28莱姆病螺旋体BmpA和布鲁菌VirB5蛋白单克隆抗体的制备......................................................................281材料和方法........................................................................................................................................................292结果....................................................................................................................................................................343讨论....................................................................................................................................................................39结论.....................................................................................................................................................................45创新点...................................................................................................................................................................46文献综述...............................................................................................................................................................47综述一布鲁菌病诊断方法和流行病学的研究进展........................................................................................471布鲁菌病流行病学.............................................................................................................................................482布鲁菌病诊断方法研究.....................................................................................................................................483小结....................................................................................................................................................................52综述二莱姆病诊断方法和流行病学的研究进展............................................................................................531莱姆病流行病学................................................................................................................................................532莱姆病诊断方法研究.........................................................................................................................................533小结....................................................................................................................................................................57附录.....................................................................................................................................................................64致谢.....................................................................................................................................................................70X 作者简介...............................................................................................................................................................71导师评阅表...........................................................................................................................72XI 中英符号表英文缩写英文全称中文名称ABTS2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-2,2-联氮-二(3-乙基苯并sulphonate)噻唑-6-磺酸)二铵盐APSAmmoniumpersulfate过硫酸铵B.afzeliiBorreliaafzelii埃式疏螺旋体B.burgdorferiBorreliaburgdorferi伯氏疏螺旋体B.gariniiBorreliagarinii伽式疏螺旋体bpbasepair碱基对BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白DABDiaminobenzidineterahydrochloride二氨基联苯胺DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜DNADeoxyribonucleicacid脱氧核苷酸dNTPdeoxyribonucleosidetrephosphate脱氧核苷三磷酸ELISAEnzyme-linkedImmunosorbentAssay酶联免疫吸附法GenBankGenBank核苷酸序列数据库hhour小时HATHypoxathine,aminopterin,andthymidine黄嘌呤、氨基喋呤与胸苷HTHypoxathineandthymidine次黄嘌呤与胸苷IgImmunoglobulin免疫球蛋白IMDMIscove’sModifiedDubecco’sMedium伊思柯夫改良培养液KDkiloDalton千道尔顿mgMilligram毫克moL/Lmoleperliter摩尔每升mMmillimoleperliter毫摩尔/升µMMicromoleperliter微摩尔每升µgMicrogram微克ngNanogram纳克ODOpticaldensity光密度OMPOutermembraneprotein外膜蛋白PBSPhosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲溶液PBSTPBSplus0.05%(w/v)Tween20PBS洗液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PEGPolyethyleneglycol聚乙二醇pHpHvaluepH值RNaseAribonucleicacidenzyme核糖核酸酶rpmrevolutionperminute转/分钟XII ssecond秒SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠TaqDNAaseTaqDNApolymeraseTaqDNA聚合酶TAEtris-aceticacid-EDTATris-乙酸-EDTATBSTris-HClbufferedsolutionTris盐酸缓冲液TBSTTBSplus0.05%(w/v)Tween20Tris盐酸洗液TEMEDTetramthylenediamineN,N,N,N-四甲基乙二胺TrisTris(Hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷XIII 引言布鲁菌病（Brucellosis）是由布鲁菌侵入机体而引起的慢性细菌性人畜共患病。早在1937年就有前苏联科学家通过研究证实Cholodkovsk血蜱能在实验条件下长期携带布鲁菌，并能将布鲁菌传播给健康的小鼠；随后前苏联科学家的多项研究证实革蜱属、璃眼蜱属、扇头蜱属、血蜱属、软蜱科成员均能携带布鲁菌，并可通过分离、培养得到确认，基于此本研究选取了伊宁市、察布查尔县、塔城市等人口密集区作为蜱的采集点，通过分子生物学技术对采集的蜱携带布鲁菌的情况进行分析。人对布鲁菌普遍易感，人间布鲁菌病传染源主要是染疫的家畜（奶、奶制品、肉类等）及野生动物，人和人之间直接传播仍缺乏可靠证据，但有文献报道人与人之间布鲁菌病可通过血液传播、性传播和胎盘传播。王文静等在新疆南疆喀什地区对献血人群进行了血液核酸检测，发现献血者血液中存在布鲁菌核酸，但当前没有发现北疆相关研究报道。基于此本研究采集新疆塔城161、165和167团场高危人群的全血，采用血清学和病原学两种检测方法对采集的血样进行布鲁菌携带情况的检测，并对两种检测方法的不同结果进行分析。人患布鲁菌病后的主要表现为发热、多汗、全身乏力、骨关节肿大和男性睾丸肿大等，至今尚无彻底根治的方法，给人的生命健康带来极大的威胁。目前，布鲁菌病的诊断方法主要是血清学检测方法，但血清学检测存在细菌交叉反应，临床误诊后很容易错过布鲁菌病的最佳治疗期，从而转变为难以治愈的慢性期；病原学诊断方法主要包括细菌培养法和分子生物技术（PCR），但此类方法存在操作繁琐、检测时间长、专业性强等缺点。因此，研发一种早期快速且能特异诊断的有效方法就非常重要。现今利用单克隆抗体对疾病进行诊断的方法较多，能根据单抗特性对不同感染性疾病做出准确鉴定。布鲁菌VirB5蛋白定位于细菌表面，研究发现该蛋白有较高的免疫原性，基于此本研究通过选用纯化标记的VirB5蛋白免疫小鼠，获得单克隆细胞株，筛选出最优抗体，为后期组织中检测病原诊断方法的建立奠定了基础。莱姆病(Lymedisease)是一种主要由莱姆病螺旋体（伯氏疏螺旋体，Borreliaburgdorferi）引起的人畜共患病，硬蜱为其主要传播媒介。莱姆病螺旋体已被证实可由全沟硬蜱、粒形硬蜱、变异革蜱、森林革蜱、长角血蜱、锐跗硬蜱、嗜群血蜱、中华硬蜱和二棘血蜱等传播，基于此本研究选取了伊宁市、察布查尔县、塔城市等人口密集区作为蜱的采集点，通过分子生物学技术对采集的蜱携带莱姆病螺旋体的情况进行分析。目前，我国20个省（市、自治区）被证实存在莱姆病的自然疫源地，东北、西北和华北等“三北地区”是我国莱姆病的高发区。新疆是莱姆病的重要疫区之一，主要分布在天山以北。近年来很多地区开展了人群莱姆病螺旋体感染率的研究，基于此本研究采集新疆塔城161、165和167团场高危人群的全血，采用血清学和病原学两种检测方法对采集的血样进行莱姆病螺旋体携带情况的检测，并对两种检测方法的不同结果进行分析。感染莱姆病螺旋体的人和动物大多经历莱姆病的多个时期，且各个时期呈现不同的1 临床症状，临床症状表现的差异，使莱姆病极易与其它疾病混淆，为其确诊造成障碍，以至于病情发展至晚期引起更多恶性疾病，严重的危害着公共卫生安全。目前，莱姆病的诊断主要依靠实验室诊断，包括病原学检测和血清学检测。病原学检测主要包括显微镜病原检测、病原分离培养和病原核酸检测，但此类方法存在操作繁琐、检测时间长、专业性强、不适用大量样本筛查等缺点。因此，研发一种早期快速且能特异诊断的有效方法就非常重要。莱姆病螺旋体表面存在有大量脂质蛋白A（BorreliaburgdorferimembranelipoproteinA,BmpA），作为早期诊断抗原能刺激机体产生抗体，基于此本研究通过选用纯化标记的BmpA蛋白免疫小鼠，获得单克隆细胞株，筛选出最优抗体，为后期组织中检测病原诊断方法的建立奠定了基础。2 第一章北疆各地硬蜱布鲁菌和莱姆病螺旋体的检测摘要：对新疆北疆地区优势硬蜱携带布鲁菌和莱姆病螺旋体的情况进行检测。应用5S-23SrRNA序列进行莱姆病螺旋体核酸的巢式PCR检测；应用omp22基因位点对布鲁菌病原进行核酸PCR检测。布鲁菌的阳性率为：在寄生蜱中为7.73%（32/414），游离蜱中未检测到阳性样本；亚洲璃眼蜱中为5.30%（7/132），刻点血蜱中为8.74%（16/183），边缘革蜱中为5.26%（2/38），图兰扇头蜱中为17.50%（7/40）。莱姆病螺旋体的阳性率为：寄生蜱中为3.86%（16/414），游离蜱中为35.07%（47/134）；亚洲璃眼蜱中为5.30%（7/132），刻点血蜱中为3.82%（7/183），边缘革蜱中为5.26%（2/38）。该研究说明蜱在家畜水平传播布鲁菌中起到一定作用；亚洲璃眼蜱、刻点血蜱和边缘革蜱有可能是莱姆病螺旋体的媒介生物，该结论扩大了莱姆病螺旋体媒介生物的范围。关键词：硬蜱；布鲁菌；莱姆病螺旋体蜱是暂时性吸血的节肢动物，可以寄生在多种脊椎动物体表，是人兽共患病病原体[1]的传播媒介和贮存宿主。蜱通过叮咬可给宿主带来直接伤害，通过携带病原体传播疾[2]病给宿主造成间接伤害。蜱通过叮咬可从宿主身上获得多种病原体，现已确认可携带83种病毒、31种细菌、20种立克次体、18种螺旋体、32种原虫、1种衣原体、2种线[3][4,5]虫和1种巴尔通氏体。据统计，全球约有十分之一的蜱携带病原体，每年仅蜱媒疫病就给全球畜牧业造成巨大经济损失。新疆地域辽阔，气候条件复杂，多牧场、林地、荒漠和半荒漠等满足蜱生存的生境条件，是蜱的高密度区，已知蜱种占全国已知蜱类的1/3以上。蜱传播的31种细菌中包[18,19]括莱姆病螺旋体和布鲁菌，其引起的莱姆病和布鲁菌病是蜱传人畜共患传染疾病，对人和动物的健康造成严重威胁。本研究选取了伊宁市、察布查尔县、塔城市等人口密集区作为蜱的采集点，通过分子生物学技术对采集的蜱携带莱姆病螺旋体和布鲁菌的情况进行分析。1材料与方法1.1材料1.1.1样本、菌株于2014年~2015年在新疆北疆地区15个采集点，包括克拉玛依市、昌吉市、奇台3 县、米泉市、吉木萨尔县、木垒哈萨克自治县、阜康市、福海县、石河子市、沙湾县、青河县、裕民县、伊宁市、察布查尔县和阿拉山口市等地采集样本。在前14个采集点，从家畜身上采集到414只寄生蜱；在阿拉山口，用布旗法采集游离蜱134只。采集的蜱放置于阴暗潮湿处饲养，使其保持存活，带回实验室备检。菌株：莱姆病螺旋体参考株购置于美国菌种保藏中心；灭活布鲁菌株由本实验室提供。1.1.2样本处理将采集的硬蜱用高压灭菌蒸馏水反复冲洗，置于5%甘油和70%酒精混合的溶液中保存备用。1.1.3主要试剂DNA提取试剂盒TIANampGenomicDNAKit（DP130227）购自天根生化科技有限公司；PCR所用试剂均购自大连宝生物工程有限公司；DNAMarker购自北京天根生化科技有限公司；琼脂糖购自Sigma公司，其它所用试剂均为分析纯。1.1.4主要仪器设备解剖显微镜（LEICAM165C），微量移液器（德国eppendorf公司）；SW-CJ-2F超净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；TGL-16L型离心机（上海安亭科学仪器厂）；Labofuge4008高速冷冻离心机（德国Heraeu公司）；T-GRADIENTPCR（美国Bio-Rad公司）；微波炉（日本松下公司）；DYY-6B型电泳仪（北京六一仪器厂）；ImageLabVersion3.0凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；YXQ-SG46高压蒸汽灭菌器（上海佳胜实验设备有限公司）；SHH.W21电热恒温水浴箱（北京光明医疗仪器厂）；JA2003N电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；XW-80A涡旋振荡器（上海精密科学仪器有限公司）；隔水式电热恒温培养箱（HIQ-X100）。1.2方法1.2.1形态学初步鉴定[26][27]参照《中国经济昆虫志》和《新疆蜱类志》，对548只蜱进行初步分类后，从中随机对各蜱种选取代表蜱共计51只，用解剖显微镜进一步进行蜱种鉴定及拍摄图片。1.2.2硬蜱组织DNA的提取对获得的所有蜱提取DNA，首先依次用浓度为70%、50%、30%、10%的乙醇溶液在恒温培养振荡器中分别震荡冲洗1小时，再用灭菌水反复冲洗若干遍后晾干。使用4 TIANampGenomicDNAKit，按照试剂盒说明提取蜱组织DNA，具体步骤如下：1）把上述蜱分别放在1.5mL灭菌EP管中做好标记，分别用灭菌后的研磨棒研碎，每管加入200µLBufferGA。2）每个管中加入40µLRNaseA（10mg/mL），漩涡振荡数秒，室温放置5-10分钟，用于降解组织中的RNA。3）每个管中加入20µLProteinaseK与样品彻底混匀，放于56°C水浴中过夜，期间多次颠倒混匀直至组织完全溶解。4）每个管中加入200µLBufferGB后涡旋震荡混均，70°C放置，直至溶液变清亮。5）变清后加入200µL无水乙醇并涡旋震荡混均。6）将5中所得溶液和絮状沉淀都加入到收集管中的吸附柱CB3中，12000rpm离心1分钟，将吸附柱重新放回收集管中，倒掉废液。7）向吸附柱CB3中加入500µLBufferGD，12000rpm离心1分钟，后倒掉离心液体，将吸附柱重新放回收集管中。8）继续加入600µL漂洗液PW，12000rpm离心1分钟，倒掉离心液体，将吸附柱重新放回收集管中。9）重复操作8一遍，再以12000rpm离心2分钟，倒掉离心液体，将吸附柱CB3置于室温放置10分钟，彻底晾干。10）将吸附柱CB3放入新的灭菌离心管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加80µL洗脱缓冲液TE（提前可预热），室温放置5-10分钟，12000rpm离心2分钟收集蜱的DNA，-20°C保存备用。1.2.3寄生蜱分子生物学鉴定[17]在NCBI网站中进行已知蜱线粒体16SrDNA基因的查找，对参考文献中的已知引物进行分析验证，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1-1。表1-116SrDNA基因片段扩增引物Table1-1Primersof16SrDNAsequences扩增片段引物名称引物序列（5’-3’）片段大小（bp）16SFCTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG16SrDNA46016SRCCGGTCTGAACTCAGATCAAGT5 表1-2PCR反应体系Table1-2PCRreactionsysterm反应组分体积（μL）10×PCRbuffer2.4dNTP(10mmol)2senseprimer(20μM)1antisenceprimer(20μM)1模板DNA(约50ng)2TaqDNAase0.6ddH2O16总体积25μL表1-3PCR反应条件Table1-3ReactionparametersofPCR温度（°C）时间（s）94300923054307230724801.2.4布鲁菌病原检测[6]根据本实验室前期设计出的引物序列，送上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1-4。表1-4omp22巢式PCR引物序列Table1-4PrimerssequencesfornestedPCRbasedonomp22扩增片段引物名称引物序列（5’-3’）片段大小（bp）omp22outFTgatgggagggaccgacta526omp22outRTggttcttcaggttgttacgcomp22omp22interFCgtcttccaaattcccaagc253omp22interRAagcgggtcacgccataa6 表1-5PCR扩增体系Table1-5PCRreactionsystem反应组分体积（µL）10×PCRbuffer2.4dNTP(10mM)2senseprimer(20μM)1antisenceprimer(20μM)1模板DNA(约50ng)2TaqDNAase0.6ddH2O16总体积25μL将外围PCR产物作为内围引物的模板DNA进行PCR扩增，见表1-5。表1-6PCR反应条件Table1-6ReactionparametersofPCR温度（°C）时间（s）95300944055/5740724072300PCR反应第一轮进行35个循环，第二轮进行38个循环，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。1.2.5莱姆病螺旋体病原检测[7]参考文献引物，送上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1-7。表1-75S-23SrRNA巢式PCR引物序列Table1-7PrimerssequencesfornestedPCRbasedon5S-23SrRNA扩增片段引物名称引物序列（5’-3’）片段大小（bp）rrf-OFCGACCTTCTTCGCCTTAAAGC412rrl-ORTAAGCTGACTAATACTAATTACCCrrf(5S)-rrl(23S)rrf-IFTCCTAGGCATTCACCATA254rrl-IRCTGCGAGTTCGCGGGAGA将第一轮PCR产物作为第二轮引物的模板DNA进行PCR扩增，见表1-8。7 表1-8PCR扩增体系Table1-8PCRreactionsystem反应组分体积（μL）10×PCRbuffer2.4dNTP(10mM)2senseprimer(20μM)1antisenceprimer(20μM)1模板DNA(约50ng)2TaqDNAase0.6ddH2O16总体积25μL表1-9PCR反应条件Table1-9ReactionparametersofPCR温度（°C）时间（s）94300923055／5930723072480PCR反应分别进行35个循环，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。2结果2.1蜱种鉴定结果寄生蜱通过分子生物学鉴定，共获得2亚科4属6种蜱（如图1-1），分别为：璃眼蜱属Hyalomma（1种）：亚洲璃眼蜱Hy.asiaticum。血蜱属Haemaphysalis（2种）：刻点血蜱H.punctate；嗜群血蜱H.concinna。革蜱属Dermacentor（2种）：草原革蜱D.nuttalli；边缘革蜱D.marginatus。扇头蜱属Rhipicephalus（1种）：图兰扇头蜱R.turanicus。a8 bcd图1-1背面和腹面观图（a）亚洲璃眼蜱；（b）边缘革蜱；（c）图兰扇头蜱；（d）刻点血蜱Figure1-1Theventralanddoesalstructure(a):Hy.asiaticum;(b):D.Marginatus;(c):R.turanicus;(d):H.punctata2.2布鲁菌和莱姆病螺旋体的PCR检测结果2.2.1布鲁菌的扩增结果所提取样本通过第一轮巢式PCR扩增布鲁菌基因片段，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可检测到500bp左右的核酸片段，与预期目的片段大小相同（如图1-2）。9 注：M为DNAMarkerI；1为阳性对照；2为阴性对照；3-13为检测样本图1-2布鲁菌omp22基因巢氏PCR扩增产物Figure1-2NestedPCRamplifiedproductsofBrucellaomp222.2.2布鲁菌omp22测序分析上述阳性PCR产物部分测序，在GenBank数据库中进行比对分析，为羊种布鲁菌，提交至GenBank，登录号：KU175591。2.2.3莱姆病螺旋体的扩增结果所提取样本通过巢式PCR扩增莱姆病螺旋体5S-23SrRNA基因片段，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可检测与预期目的片段大小相同（如图1-3）。注：M为DNAMarkerI；10为阴性对照；11为阳性对照；1-9为检测样本图1-3莱姆病螺旋体5S-23SrRNA基因巢氏PCR结果Figure1-3NestedPCRamplifiedresultsof5S-23SrRNA2.2.4莱姆病螺旋体5S-23SrRNA测序分析上述阳性PCR产物部分测序，在GenBank数据库中进行比对分析，为伯氏疏螺旋体，提交至GenBank，登录号：KF547996、KF547997、K547998。10 2.3布鲁菌和莱姆病螺旋体阳性率分析2.3.1布鲁菌阳性率分析从北疆各地采集的548只蜱中，414只寄生蜱来自家畜，134只游离蜱来自艾比湖周边。采用基因测序的方法对所采集的寄生蜱进行蜱种鉴定，分别是亚洲璃眼蜱、刻点血蜱、边缘革蜱、图兰扇头蜱、嗜群血蜱和草原革蜱；未对游离蜱进行蜱种鉴定。在这些蜱中检测到布鲁菌阳性率：寄生蜱中为7.73%（32/414），游离蜱中未检测到阳性样本；亚洲璃眼蜱中为5.30%（7/132），刻点血蜱中为8.74%（16/183），边缘革蜱中为5.26%（2/38），图兰扇头蜱中为17.50%（7/40），嗜群血蜱和草原革蜱中未检测到（如表1-10和表1-11）。11 表1-10不同采集点布鲁菌分子检测结果Table1-10TheresultofbrucellamoleculartestindifferentSamplingsites采集点蜱种宿主样本量阳性量阳性率（%）克拉玛依亚洲璃眼蜱羊430昌吉亚洲璃眼蜱羊40亚洲璃眼蜱羊50奇台刻点血蜱羊1417.14米泉边缘革蜱羊5120亚洲璃眼蜱羊10青河边缘革蜱羊20吉木萨尔图兰扇头蜱羊30亚洲璃眼蜱羊30木垒边缘革蜱羊10亚洲璃眼蜱羊8112.50边缘革蜱羊20阜康刻点血蜱羊70图兰扇头蜱羊10亚洲璃眼蜱羊30刻点血蜱羊1516.67裕民边缘革蜱羊110嗜群血蜱羊10亚洲璃眼蜱羊160福海刻点血蜱羊150草原革蜱羊80伊宁图兰扇头蜱羊36719.44察布查尔县刻点血蜱羊4948.16亚洲璃眼蜱羊49612.24边缘革蜱羊1715.88石河子-沙湾刻点血蜱羊831012.05草原革蜱羊120寄生蜱总计414327.73表1-11不同蜱种布鲁菌分子检测结果Table1-11Theresultofbrucellamoleculartestindifferentticks蜱种样本量阳性数量阳性率（%）亚洲璃眼蜱13275.30刻点血蜱183168.74边缘革蜱3825.26图兰扇头蜱40717.50嗜群血蜱10草原革蜱200合计414327.7312 2.3.2莱姆病螺旋体阳性率分析这548只蜱种检测到莱姆病螺旋体阳性率分别为：寄生蜱中为3.86%（16/414），游离蜱中为35.07%（47/134），亚洲璃眼蜱中为5.30%（7/132），刻点血蜱中为3.82%（7/183），边缘革蜱中为5.26%（2/38），图兰扇蜱、嗜群血蜱和草原革蜱中未检测到（如表1-12和1-13）。表1-12不同采集点莱姆病螺旋体分子检测结果Table1-12TheresultofBorreliaburgdorferimoleculartestindifferentSamplingsites采集点蜱种宿主样本量阳性量阳性率（%）克拉玛依亚洲璃眼蜱羊4349.30昌吉亚洲璃眼蜱羊40亚洲璃眼蜱羊50奇台刻点血蜱羊140米泉边缘革蜱羊50亚洲璃眼蜱羊10青河边缘革蜱羊20吉木萨尔图兰扇头蜱羊30亚洲璃眼蜱羊30木垒边缘革蜱羊10亚洲璃眼蜱羊80边缘革蜱羊20阜康刻点血蜱羊70图兰扇头蜱羊10亚洲璃眼蜱羊30刻点血蜱羊150裕民边缘革蜱羊1119.09嗜群血蜱羊10亚洲璃眼蜱羊160福海刻点血蜱羊150草原革蜱羊80伊宁图兰扇头蜱羊360察布查尔县刻点血蜱羊490亚洲璃眼蜱羊4936.12边缘革蜱羊1715.88石河子-沙湾刻点血蜱羊8378.43草原革蜱羊120寄生蜱总计414163.8613 表1-13不同蜱种莱姆病螺旋体分子检测结果Table1-13TheresultofBorreliaburgdorferimoleculartestindifferentticks蜱种样本量阳性数量阳性率（%）亚洲璃眼蜱13275.30刻点血蜱18373.82边缘革蜱3825.26图兰扇头蜱400嗜群血蜱10草原革蜱200合计414163.863讨论3.1蜱携带布鲁菌情况的分析蜱是专营吸血的体表病媒生物，不仅能通过直接叮咬给人和家畜的健康带来危害，而且还能间接传播多种疾病。近年来，蜱及蜱传病越来越受到人们的关注，人们对蜱及蜱传病的了解和认识有了更进一步的深入。关于蜱虫传播牛羊布鲁菌病研究的功绩属于原苏联的科学家们。1937年，Bopecehckhh做了最早关于蜱传播布鲁菌病的研究：Cholodkovski血蜱能在实验条件下长期携带布鲁菌，并能将布鲁菌传播给健康的小鼠。1940-1950年，前苏联许多科学家做了关于蜱传布鲁菌病的研究，证实：在患有布鲁菌病的牛身上采集的有矩牛蜱，其体内存在布鲁菌；边缘革蜱和拉合尔钝缘蜱体内可分离出布鲁菌，并认为这两种蜱是布鲁菌病的传播媒介；在蜱排泄物中可检测到活[20-24]菌。随后的多项研究证实：革蜱属、璃眼蜱属、扇头蜱属、血蜱属、软蜱科成员均能携带布鲁菌，并可通过分离、培养得到确认。本研究通过对新疆北疆15个采集点的414只寄生蜱和134只游离蜱进行检测发现，寄生蜱携带布鲁菌的阳性率为7.73%，而游离蜱中未检测到阳性样本，这种情况存在两种可能：一方面，这可能与蜱的寄生宿主有关，家畜极容易感染布鲁菌，蜱通过叮咬患病家畜而增加寄生蜱感染并携带病原菌的几率，这与1940年Camcohob研究发现的患布鲁菌病的牛身上的蜱携带布鲁菌相符；另一方面，游离蜱都是采集于阿拉山口，而寄生蜱采集于14个不同地点，游离蜱与寄生蜱携带布鲁菌的情况不同，可能与采集蜱的地域是否是高疫区有关。近年来，国内关于蜱传布鲁菌病的研究较少，然而早期前苏联科学家们已证实：亚洲璃眼蜱、刻点血蜱、嗜群血蜱、边缘革蜱、草原革蜱和扇头蜱属[20]可传播布鲁菌。本次研究同样证实了亚洲璃眼蜱、刻点血蜱和边缘革蜱为布鲁菌的传播媒介，但嗜群血蜱和草原革蜱中未检测到，这有可能与采集样本差距有关。扇头蜱属已证实传播布鲁菌，但尚未有关于图兰扇头蜱携带布鲁菌的研究报道，本次研究检测到图兰扇头蜱携带布鲁菌的阳性率最高17.50%（7/40），这是否说明图兰扇头蜱相对其它蜱种更易于携带布鲁菌？这需要后期做更多的相关实验来证明这一观点。14 3.2蜱携带莱姆病螺旋体情况的分析[8-13]自1987以来，新疆已先后被证实存在多个莱姆病自然疫源地。莱姆病螺旋体以啮齿类动物为宿主，牛、羊、犬、兔、鹿和鼠等动物均可感染莱姆病，通过蜱叮咬传播给人。莱姆病螺旋体已被证实可由全沟硬蜱、粒形硬蜱、变异革蜱、森林革蜱、长角血[14-16]蜱、锐跗硬蜱、嗜群血蜱、中华硬蜱和二棘血蜱等传播。本研究检测到游离蜱携带莱姆病螺旋体的阳性率35.07%（47/134），与杜景云等在[25]阿拉山口检测的游离蜱携带莱姆病螺旋体阳性率（34.87%）一致。游离蜱阳性率明显高于寄生蜱阳性率，这种情况存在两种可能：一种可能是采集地点不同，自然感染能力不同，导致检测结果不同；另一种可能是游离蜱比寄生蜱更容易获得莱姆病螺旋体，这需要后期做更多的相关实验来证明这一点。不同蜱种之间阳性率不同可能与不同蜱种对莱姆病螺旋体的能力不同有关，也可能采集的样本数量差距有关。不同采集点之间阳性率存在差别，这可能是因为采集点是否是高疫区有关。3.3灭蜱的重要性蜱对人和家畜带来的危害极大，蜱叮咬人畜使宿主皮肤损伤，继而引起皮肤炎症、溃疡，甚至继发感染，导致久治不愈；在叮咬过程中，蜱作为传播媒介把从宿主身上获得病原传播给其他宿主，蜱能传播莱姆病、森林脑炎、回归热、斑疹伤寒、布鲁菌病、焦虫病等多种人畜共患病，在布鲁菌病疫区，蜱可能作为媒介参与了牧区家畜水平传播布鲁菌病；蜱大量寄生在家畜和人体表吸血，可引起宿主营养不良，出现贫血、消瘦、发育不良等症状，给人们的健康和财产带来危害。因此，应加强蜱高疫区蜱传疾病（布鲁菌病和莱姆病）的宣传教育，防止蜱虫叮咬，做好灭蜱工作，防止蜱作为传播媒介参与家畜之间布鲁菌病的水平传播。15 参考文献[1]KlompenJSH,BlackIVWC,KeiransJE,etal.Evolutionofticks[J].AnnualReviewofEntomology,1996,41(1):141-61.[2]陈泽,杨晓军,杨晓红,等.中国蜱类地理分布及区系分析[J].四川动物,2008,27(5):820-3.[3]张西臣,赵权.动物寄生虫病学[M].长春：吉林人民出版社,2005:308-311.[4]OliverJH.BiologyandSystematicsofTicks(Acari:Ixodida)[J].AnnualReviewofEcology&Systematics,2003,20(20):397-430.[5]JongejanF,UilenbergG.Theglobalimportanceofticks[J].Parasitology,2004,129(9):3-14.[6]张辉,陈创夫,唐莉娟,等.布鲁氏菌病病原快速诊断方法建立及应用[J].塔里木大学学报,2008,20(3):40-3.[7]张璘.新疆北疆地区蜱种分布及蜱源性病原检测方法的建立[D].石河子:石河子大学硕士学位论文,2014.[8]李松全,王风朝,张启恩,等.新疆天山西部林区莱姆病自然疫源调查[J].人民军医,1990,8:13-5.[9]谢杏初.新疆博乐和沙湾阜康市县山地莱姆病螺旋体的分离及鉴定[J].地方病通报,1991,4:8-11.[10]谢杏初,刘惠君,叶尔肯,等.新疆莱姆病的地理分布及流行情况调查[J].地方病报,1996,11:48-51.[11]于建杉,安磐,马继胜,等.新疆莱姆病自然疫源多种类型存在[J].新疆卫生防疫,1996,14:65-66.[12]华满堂,金兆清,林涛,等.中俄、中哈边境地区莱姆病自然疫源地调查研究[J].解放军预防医学杂志,1999,6:402-4.[13]张大荣,杭恒贵,李群.西藏林芝地区人群莱姆病感染初步调查[J].中国人兽共患病杂志,1997,2:70.[14]万康林,张哲夫,田万春,等.我国19省、市、区莱姆病媒介初步调查[J].中国媒介生物学及控制杂志,1998,9(2):123-5.[15]NiuQL,YinH,LuoJX.ProgressonLymeDiseaseinChina[J].ProgressinVeterinaryMedicine,2009,30:89–93.[16]SunY,XuR,CaoW.Ixodessinensis:competenceasavectortotransmittheLymediseasespirocheteBorreliagarinii[J].VectorBorneZoonoticDis,2003,3(1):39-44.[17]NorrisDE,KlompenJSH,KeiransJE,etal.PopulationgeneticsofIxodesscapularis(Acari:Ixodidae)basedonmitochondrial16Sand12Sgenes[J].JournalofMedicalEntomology,1996,33(1):78-89.[18]WuXB,NaRH,WeiSS,etal.Distributionoftick-bornediseasesinChina[J].Parasites&Vectors,2013,6(1):1-8.[19]鲜升文,陈大林,文兴城,等.嗜群血蜱暴发性疫情的控制[J].中国兽医杂志,2002,38(1):31-2.[20]李肇熙.蜱蟲傳播牛羊布氏桿菌病的作用[J].中国兽医学杂志,1958(4):132-6.[21]TaranIF,PogorelovNA,KulikovaGG,etal.StudyofBrucellaculturesisolatedfrommouse-likfrodentsandtheirectoparasites[J].ZhurnalMikrobiologiiEpidemiologiiIImmunobiologii,1966,43(9):70-4.[22]SidorovVE.OnthepreservationofvaccinalstrainsofBr.abortus19-BAinthetickOrnithodoroslahorensisNeumann[J].ZhMikrobiolEpidemiolImmunobiol,1962,33:130-3.16 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第二章新疆塔城布鲁菌病和莱姆病的流行病调查摘要：选取新疆塔城161、165、167三个团场，采集牧场职业人群（牧民、半农半牧、兽医）的全血共246份进行布鲁菌和莱姆病螺旋体携带情况的调查。采用病原学（PCR检测技术）和血清学（虎红平板凝集/ELISA）两种方法对采集的血样进行检测，以此得到血样中这两种病原的阳性率。布鲁菌通过病原学方法和血清学方法检测到阳性率分别为2.03%（5/246）和19.51%（48/246）；莱姆病螺旋体通过血清学方法检测到阳性率为11.38%（28/246），病原学方法未检测到。本研究说明莱姆病螺旋体和布鲁菌在牧场职业人群中存在高感染性，尤其是布鲁菌，应加强布鲁菌病疫区职业人群中献血人群的筛查工作。关键词：塔城；布鲁菌病；莱姆病布鲁菌病是由布鲁菌引起的人畜共患传染病，是《中华人民共和国传染病防治法》[1][2-3]中规定管理的乙类传染病，全球约有170个国家和地区流行此病。我国的东北、华北和西北地区是布鲁菌病的主要流行区域，发病病例可占全国布鲁菌病病例的90%以[4]上，内蒙古和新疆农牧业发达的地区尤为严重。近几年随着人民生活水平的提高，畜[5,6]牧业的发展和牲畜的交易频繁，新疆塔城地区人间布鲁菌病疫情呈逐年上升趋势，给当地人民身体健康和畜牧业发展带来直接或间接威胁。为了解和掌握塔城地区高危人群布鲁菌病流行现状和疫情动态，遏制人间布鲁菌病发病率的上升趋势，本研究采集新疆塔城161、165和167团场高危人群的全血，采用血清学和病原学两种检测方法对采集的血样进行布鲁菌携带情况的检测，并对两种检测方法的不同结果进行分析。莱姆病是一种引起人和动物多系统和器官损伤的人畜共患病，由硬蜱作为其传播媒[7]介通过叮咬传播给人类。我国自1986年黑龙江省海林县林区发现首例莱姆病患者以来，随着对莱姆病研究的深入，29个省（市、自治区）已有确诊病例，20个省（市、[8,9]自治区）被证实存在莱姆病的自然疫源地，东北、西北和华北等“三北地区”是我国[13][14]莱姆病的高发区。新疆是莱姆病的重疫区，主要分布在天山以北。近年来很多地区[10-12]开展了人群莱姆病螺旋体感染率的研究，本研究采集新疆塔城161、165和167团场高危人群的全血，采用血清学和病原学两种检测方法对采集的血样进行莱姆病螺旋体携带情况的检测，并对两种检测方法的不同结果进行分析。18 1材料与方法1.1材料1.1.1样本采集于2015年9月在新疆北疆塔城采集点，采集三个团场牧场职业人群（牧民，半农半牧，兽医）的全血共246份，储存在采血管中带回实验室（见附录）。1.1.2标本处理将采集的牧场职业人群的血样信息做好详细统计，为下一步DNA提取做准备。1.1.3主要试剂DNA提取试剂盒TIANampGenomicDNAKit（DP060530）购自天根生化科技有限公司；PCR所用试剂均购自大连宝生物工程有限公司；DNAMarker购自北京天根生化科技有限公司；琼脂糖购自Sigma公司；虎红平板凝集抗原购自北京赛诺利康生物技术有限公司；标准阳性血清和阴性血清由本实验室提供，其它所用试剂均为分析纯。1.1.4主要仪器设备微量移液器（德国eppendorf公司）；SW-CJ-2F超净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；TGL-16L型离心机（上海安亭科学仪器厂）；Labofuge4008高速冷冻离心机（德国Heraeu公司）；T-GRADIENTPCR（美国Bio-Rad公司）；微波炉（日本松下公司）；DYY-6B型电泳仪（北京六一仪器厂）；ImageLabVersion3.0凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；YXQ-SG46高压蒸汽灭菌器（上海佳胜实验设备有限公司）；SHH.W21电热恒温水浴箱（北京光明医疗仪器厂）；JA2003N电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；XW-80A涡旋振荡器（上海精密科学仪器有限公司）；隔水式电热恒温培养箱（HIQ-X100）。1.2方法1.2.1分离血液采集的血样，3000rpm离心15分钟，离心后把血清和血细胞标记好，分开储存。1.2.2血液DNA的提取对获得的所有血沉提取DNA，首先依次从每管血沉中用移液器吸取200µL到1.5mL19 灭菌EP管中做好标记。使用TIANampBloodDNAKit，按照试剂盒说明提取血液DNA，具体步骤如下：1）把上述标记的EP管中加入3倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀后10000rpm离心1分钟，细胞核沉淀，倒掉上清，向离心收集到的细胞核沉淀中加200µL缓冲液GS，震荡至彻底混匀。2）每管中加入4µLRNaseA（100mg/mL），振荡15s，室温放置5分钟，用于去除组织中的RNA。3）每管中加入20µLProteinaseK，混匀。4）每管中加入200µLBufferGB，56°C放置10分钟，期间颠倒混匀数次，直至溶液变清亮。5）每管中加入200µL无水乙醇，充分颠倒混匀。6）将上一步骤所得溶液和絮状沉淀都加入到收集管中的吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。7）向CB3中加入500µLBufferGD，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。8）向CB3中加入700µL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。9）向CB3中加入500µL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。10）将CB3放回收集管中，再以12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。11）将CB3转入新的1.5mL灭菌离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100µL洗脱缓冲液TB（提前可预热），室温放置5分钟，12000rpm离心2分钟收集血液的DNA，-20°C保存备用。1.2.3布鲁菌和莱姆病螺旋体的病原检测1.2.3.1布鲁菌病原检测[15]参考文献引物，送上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表2-1。表2-1omp22巢式PCR引物序列Table2-1PrimerssequencesfornestedPCRbasedonomp22扩增片段引物名称引物序列（5’-3’）片段大小（bp）omp22outFTgatgggagggaccgacta526omp22outRTggttcttcaggttgttacgcomp22omp22interFCgtcttccaaattcccaagc253omp22interRAagcgggtcacgccataa20 表2-2PCR扩增体系Table2-2PCRreactionsystem反应组分体积（μL）10×PCRbuffer2.4dNTP(10mM)2senseprimer(20μM)1antisenceprimer(20μM)1模板DNA(约50ng)2TaqDNAase0.6ddH2O16总体积25μL将外围PCR产物作为内围引物的模板DNA进行PCR扩增，见表2-2和表2-3。表2-3PCR反应条件Table2-3ReactionparametersofPCR温度（°C）时间（s）95300944055/5740724072300PCR反应第一轮进行35个循环，第二轮进行38个循环，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。1.2.3.2莱姆病螺旋体病原检测[16]参考文献引物，送上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表2-4。表2-45S-23SrRNA巢式PCR引物序列Table2-4PrimerssequencesfornestedPCRbasedon5S-23SrRNA扩增片段引物名称引物序列（5’-3’）片段大小（bp）rrf-OFCGACCTTCTTCGCCTTAAAGC412rrl-ORTAAGCTGACTAATACTAATTACCCrrf(5S)-rrl(23S)rrf-IFTCCTAGGCATTCACCATA254rrl-IRCTGCGAGTTCGCGGGAGA21 表2-5PCR扩增体系Table2-5PCRreactionsystem反应组分体积（μL）10×PCRbuffer2.4dNTP(10mM)2senseprimer(20μM)1antisenceprimer(20μM)1模板DNA(约50ng)2TaqDNAase0.6ddH2O16总体积25μL将外围PCR产物作为内围引物的模板DNA进行PCR扩增，见表2-5和表2-6。表2-6PCR反应条件Table2-6ReactionparametersofPCR温度（°C）时间（s）94300923055／5930723072480PCR反应分别进行35个循环，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。1.2.4布鲁菌和莱姆病螺旋体的血清学检测1.2.4.1布鲁菌虎红平板凝集试验（RBPT）1）实验前将血清和抗原在室温放置30-60分钟。2）将被检测血清编号在玻璃板上标记好，然后加对应被检血清0.03mL。3）滴加虎红平板凝集抗原0.03mL至被检测血清中。4）混合血清和抗原，在5分钟内观察结果。5）每次试验设阴性血清、阳性血清对照。1.2.4.2莱姆病螺旋体血清学IgGELISA检测标准方法和相关试剂均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。2结果2.1布鲁菌的病原学和血清学检测结果246份血样中，布鲁菌病原学方法检测结果显示：平均阳性率为2.03%（5/246），22 161团场的阳性率为3.19%（3/94），167团场为3.17%（2/63），165团场中未检测到阳性样本；血清学方法检测结果为：平均阳性率为19.51%（48/246），161团场为30.85%（29/94），165团场为11.24%（10/89），167团场为14.29%（9/63）（如表2-7）。表2-7不同采集点布鲁菌检测结果Table2-7TheresultofbrucellatestindifferentSamplingsites血清学检测病原学检测监测地点调查数血检数阳性数阳性率（%）阳性数阳性率（%）161团场94942930.8533.19165团场89891011.240--167团场6363914.2923.17合计2462464819.5152.03布鲁菌血清学方法RBPT结果如图2-1。注：1为阴性对照；3为阳性对照；2为检测样本图2-1虎红平板试验Figure2-1RoseBengalPlateTest2.2莱姆病螺旋体的病原学和血清学检测结果246份血样中，莱姆病螺旋体病原学方法未检测到阳性样本；血清学方法检测结果为：平均阳性率为11.38%（28/246），161团场为3.19%（3/94），165团场为17.98%（16/89），167团场为14.29%（9/63）（如表2-8）。23 表2-8不同采集点莱姆病螺旋体分子检测结果Table2-8TheresultofBorreliaburgdorferitestindifferentSamplingsites血清学检测病原学检测监测地点调查数血检数阳性阳性率（%）阳性数阳性率（%）161团场949433.190--165团场89891617.980--167团场6363914.290--合计2462462811.380--3讨论3.1血样检测布鲁菌的分析布鲁菌侵入宿主后，主要循淋巴管侵入局部淋巴结生长繁殖，如未被消灭则在此大量繁殖成为原发病灶，当病灶内病原菌繁殖到一定数量后，冲破淋巴屏障进入血液引起菌血症。菌血症引起宿主产生一系列的症状，如发热、多汗、全身乏力、骨关节[17]肿大和男性睾丸肿大等，是一种人兽共患传染性细菌病。据官方统计中国新发病例占全球新发病例的十分之一左右。在我国调查的76种危害人类健康的疾病中，布鲁菌病位居第七位。在中国西北部的新疆维吾尔自治区布鲁菌病发病率持续上升，新疆已多次被证实是布鲁菌病高发区，牧场职业人群（牧民、半农半牧、兽医）接触带病家畜的机会较多，因此更容易感染布鲁菌病。本研究246份血样中，布鲁菌病原学方法检测结果显示：平均阳性率为2.03%（5/246），161团场的阳性率为3.19%（3/94），167团场为3.17%（2/63），165团场中未检测到阳性样本；血清学方法检测结果为：平均阳性率为19.51%（48/246），161团场为30.85%（29/94），165团场为11.24%（10/89），167团场为14.29%（9/63）。塔城职业人群血清检测阳性率19.51%与甘肃省靖远县对高危人群血清学检测结果[22]（20.76%）接近，说明塔城牧区布鲁菌疫情也可能处于活跃期。血清检测结果与病原学检测结果趋势一致：161团阳性率最高，167团其次，165团最低。急性菌血症期布鲁菌存在于患者血液中，随着病情发展进入到身体的靶器官，非菌血症时期检测不到血液中的病原菌，这可能是血液PCR与血清学检测结果不同的原因。人对布鲁菌普遍易感，人间布鲁菌病传染源主要是染疫的家畜（奶、奶制品、肉类等）及野生动物，人和人之间直接传播仍缺乏可靠证据。但有文献报道人与人之间布鲁[23-25]菌病可通过血液和性传播，也有文献报道布鲁菌病可通过输血传播和胎盘传播[27-34]。王文静等在新疆南疆喀什地区对献血人群进行了血液核酸检测，发现献血者血液[26]中存在布鲁菌核酸，表明在布鲁菌病高疫区输血存在感染风险。目前，全国各地对人的血液筛查只包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和艾滋病毒等的核酸检测。因此，应加强牧民、半农半牧、兽医等职业人群布鲁菌病的血清学诊断；在布鲁菌高流行地区，应24 加强献血人群的筛查，防止菌血症时期布鲁菌病通过人与人之间传播。PCR检测质量的控制是一个系统工程，总体上涉及三个方面：一是试验仪器；二是[35]试验试剂与耗材；三是人员操作。任何一个方面出现问题，都会影响PCR检测质量。在本实验中，实验仪器质量已通过实验室质量认证，并且定期进行仪器的校验；在阴阳性对照样品检测结果成立的前提下进行实验；该操作者已经过技能训练，并熟悉PCR检测过程；实验室分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区都是独立区，并且定期对实验室、移液器进行清洗、消毒。3.2血样检测莱姆病螺旋体的分析莱姆病螺旋体侵入人体可引起发热、乏力、肌痛、恶心、呕吐、结膜炎、虹膜炎和皮肤游走性红斑等一些列症状，国内外学者已相继从莱姆病病人的皮损组织、淋巴结、血液、脑脊液、关节滑液、皮肤灌洗液、耳廓活检标本以及多种宿主动物脏器中分离培养到莱姆病螺旋体。新疆已多次被证实是莱姆病的高发区，谢杏初等人在1987年开展针对新疆各个地区莱姆病发病情况的调查，曾先后证实玛纳斯县、新源县、伊犁、博[14]乐、沙湾、阜康、阿勒泰、焉耆县等地存在自然疫源地，主要分布在天山以北。新[18]疆塔城蜱种丰富，银盾革蜱属于其优势蜱种，且银盾革蜱已被证实携带莱姆病螺旋[19]体。牧场职业人群（牧民、半农半牧、兽医）受蜱叮咬的机会机会较多，因此更容易感染莱姆病螺旋体。本研究检测了塔城161、165和167三个团场牧民、半农半牧和兽医等人的血样，对塔城职业人群感染莱姆病螺旋体做进一步研究。本研究对塔城161、165和167三个团牧场职业人群的血样进行莱姆病螺旋体检测，PCR检测方法在三个团中均未检测到阳性样本，血清学检测结果为：平均阳性率为11.38%（28/246）、161团场为3.19%（3/94）、165团场为17.98%（16/89）、167团场为14.29%（9/63）。急性菌血症期莱姆病螺旋体存在于患者血液中，随着病情发展进入到身体的靶器官，非菌血症时期检测不到血液中的病原菌，这可能是血液PCR与血清学结果不同的原因。1997年全国20个省（市、自治区）的随机抽样调查发现，中国[20]人群莱姆病血清学抗体阳性率为5.06%。近年来不少地区开展了人群感染率研究，其[21]中新疆乌鲁木齐南山人群平均感染率为16.14%。田桢等对新疆5577名油田职工的调[14]查显示，感染750例，平均感染率达13.45%。塔城职业人群（牧民、兽医、半农半牧）平均感染率（11.38%）高于全国人群平均水平（5.06%），低于乌鲁木齐南山人群平均水平（16.14），说明该人群也存在较高的莱姆病螺旋体感染率。目前，莱姆病尚未列入我国疾病监测范畴，三十几个省（市、自治区）虽已相继开展莱姆病的流行病学和血清学调查，疫源地虽不断被发现，但目前还未制定该病相关的有效防控措施和技术法规，防控能力尤显不足，国内莱姆病发病率呈上升趋势。我国政府应提高对莱姆病的重视，把莱姆病防治工作纳入传染病防治总体规划，加强牧民、兽医和半农半牧等职业人群的血清学调查。25 参考文献[1]ManturBG,AmarnathSK,ShindeRS.ReviewofclinicalandlaboratoryfeaturesofhumanBrucellosis[J].OpenJournalofVeterinaryMedicine,2015,05(6):133-7.[2]CorbelMJ.Brucellosis:anoverview[J].EmergingInfectiousDiseases,1997,3(2):213–21.[3]PappasG,AkritidisN,BosilkovskiM,etal.Brucellosis[J].NewEnglandJournalofMedicine,2005,352(22):2325-36.[4]木合塔尔•艾山,邰新平,李全.2011年新疆人间布鲁氏菌病疫情分析[J].疾病预防控制通报,2012,27(2):24-6.[5]阿达来提·托留汉,何霞,卡米西·努尔沙德克,等.2008～2012年新疆塔城地区布鲁氏菌病疫情分析[J].疾病预防控制通报,2013,28(5):63-4.[6]阿达来提·托留汉.新疆塔城地区布鲁氏菌病疫情形势分析[J].疾病预防控制通报,2014,29(6):46-7.[7]仝彩玲,李培英,周金林.莱姆病诊断技术研究进展[J].中国动物传染病学报,2009,3(17):76.[8]艾承绪,温玉欣,张永国,等.黑龙江省海林县林区莱姆病的流行病学调查[J].中国公共卫生，1987,6:82-5.[9]WuXB,NaRH,WeiSS,etal.Distributionoftick-bornediseasesinChina[J].Parasites&Vectors,2013,6(1):1-8.[10]谷存国,曹兴华,贾月萍,等.小兴安岭部分林区莱姆病血清流行病学调查[J].现代预防医学,2014,41(6).[11]杜燕华,赵嘉咏,卢星,等.河南省莱姆病血清流行病学初步调查[J].现代预防医学,2012,39(14).[12]谢春燕,刘晓青,胡国良.莱姆病的流行病学研究进展[J].现代预防医学,2015,42(9):1559-61.[13]艾承绪,温玉欣,张永国,等.黑龙江海林地区发现一种新的蜱传螺旋体病—莱姆病[J].中国公共卫生(基础版),1987,2(6):6-8.[14]谢杏初,刘惠君,叶尔肯,等.新疆莱姆病的地理分布及流行情况调查[J].地方病通报,1996，11(3):48-50.[15]张辉,陈创夫,唐莉娟,等.布鲁氏菌病病原快速诊断方法建立及应用[J].塔里木大学学报，2008,20(3):40-3.[16]张璘.新疆北疆地区蜱种分布及蜱源性病原检测方法的建立[D].石河子:石河子大学硕士学位论文,2014.[17]SousaKC,AndréMR,HerreraHM,etal.Molecularandserologicaldetectionoftick-bornepathogensindogsfromanareaendemicforLeishmaniainfantuminMatoGrossodoSul,Brazil[J].RevistaBrasileiraDeParasitologiaVeterinária,2013,22(4):525-31.[18]张艳艳,阿德力·克坦,达木,等.塔城地区硬蜱种类调查与群落分析[J].石河子大学学报,2013,31(4):457-62.[19]石胜刚,张芳,刘增加.西北新疆等4省区蜱感染莱姆疏螺旋体的分子流行病学调查[J].中国人兽共患病学报,2011,27(5):461-3.[20]张哲夫,万康林,张金声,等.我国莱姆病的流行病学和病原学研究[J].中华流行病学杂志,1997,18(1):8-11.[21]谭毓绘,刘勇,孙荷,等.新疆乌鲁木齐南山莱姆病自然疫源地监测分析[J].中国媒介生物学及控制杂志,2011,22(2):141-3.[22]杨树博,高维义,魏久生,等.甘肃省靖远县布鲁氏菌病高危人群血清学检测结果分析[J].疾病26 预防控制通报,2015,30(6):36-9.[23]Al-DahoukS,NeubauerH,HenselA,etal.Changingepidemiologyofhumanbrucellosis,Germany,1962-2005[J].EmergingInfectiousDiseases,2007,13(12):1895-900.[24]ManturBG,MangalgiS,MulimaniM.Brucellamelitensis--asexuallytransmissibleagent?[J].Lancet,1996,347(9017):1763.[25]RubenB,BandJD,WongP,etal.Person-to-persontransmissionofBrucellamelitensis[J].Lancet,1991,337(337):14-5.[26]WangW,LiaoQ,WuX,etal.Potentialriskofbloodtransfusion-transmittedbrucellosisinanendemicareaofChina[J].Transfusion,2014,55(3):586-92.[27]SpinkWW,AndersonD.Brucellastudiesonbankbloodinageneralhospital.A.Agglutinins;B.SurvivalofBrucella[J].JournalofLaboratory&ClinicalMedicine,1950,35(3):440-5.[28]WoodEE.BrucellosisasaHazardofBloodTransfusion[J].BritishMedicalJournal,1955,1(4904):27-8.[29]BecerragarcíaA.Brucellosisandsyphilistransmittedbytransfusion[J].GacetaMédicaDeMéxico,1971,101(6):699-701.[30]EconomidouJ,KalafatasP,VatopoulouT,etal.Brucellosisintwothalassaemicpatientsinfectedbybloodtransfusionsfromthesamedonor[J].ActaHaematologica,1976,55(4):244-9.[31]PérezBR,SantarelliMT.Analysisofanationalserologicalsurveyfordiseasestransmittedbybloodtransfusion[J].Medicina,1993,53(6):491-6.[32]MartínezcansecoJ,HernándezramosI,MacíashernándezAE,etal.Unjustifieddisposaloftransfusionbloodbecauseofantibodiesagainstbrucella[J].Revistadeinvestigaciónclínica;organodelHospitaldeEnfermedadesdelaNutrición,1996,48(4):297-300.[33]AlkharfyTM.Neonatalbrucellosisandbloodtransfusion:casereportandreviewoftheliterature[J].AnnalsofTropicalPaediatricsInternationalChildHealth,2001,21(4):349-52.[34]DoganayM,AygenB,EşelD.Brucellosisduetobloodtransfusion[J].TheJournalofhospitalinfection,2001,49(2):151-2.[35]蔡旭,张太明,陆永明,等.病理科PCR实验室的质量管理与控制[J].临床与实验病理学杂志,2011,27(4):419-20.27 第三章莱姆病螺旋体BmpA和布鲁菌VirB5蛋白单克隆抗体的制备摘要：使用已纯化的莱姆螺旋体BmpA蛋白和布鲁菌VirB5蛋白分别免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）融合，分别以BmpA蛋白和VirB5蛋白作为筛选抗原，经过三次亚克隆后筛选：BmpA得到1#、3#、5#、8#、12#、15#、17#、18#、25#、30#、38#和40#十二株单克隆抗体细胞株；VirB5得到2#、12#、19#、25#、31#和40#六株单克隆抗体细胞株。亚类鉴定结果表明：BmpA中1#、8#、17#、18#、25#和40#为IgG1亚型，3#、5#、12#和38#为IgG2a亚型，15#和30#为IgG2b亚型；VirB5中2#为IgG2b亚型，12#、19#、25#、31#和40#为IgG1亚型。使用WesternBlot对其进行抗原结合特性分析，BmpA5#能够与纯化蛋白BmpA较好的结合，VirB519#能够与纯化蛋白较好的结合。这两种单克隆抗体的制备分别为莱姆病和布鲁菌病病原诊断方法的建立提供了一种备选材料。关键词：BmpA；VirB5；单克隆抗体布鲁菌是一种寄生在细胞内的不运动革兰氏阴性菌，可以寄生于多种家畜体内。其中羊、牛、猪和犬种布鲁菌可引起人患病。布鲁菌引起的最常见的人畜共患传染病—布[1,2]鲁菌病，已被《中华人民共和国传染病防治法》列为乙类传染病。目前，布鲁菌病的病原学诊断主要包括细菌培养法和分子生物技术（PCR）法，但是存在操作繁琐、检测时间长、价格高、专业性强、出现假阳性或假阴性等缺点而不适合基层布鲁菌病的病原学诊断。现今利用单克隆抗体对疾病进行诊断的方法较多，能根据单抗特性对不同感染性疾病做出准确鉴定。布鲁菌VirB5蛋白定位于细菌表面，研究发现该蛋白有较高的免疫原性，基于此本研究通过选用纯化标记的VirB5蛋白免疫小鼠，获得单克隆细胞株，筛选出最优抗体，为后期组织中检测病原诊断方法的建立奠定了基础。莱姆病螺旋体（Borreliaburgdorferi，Bb）由原生质柱、内外两层膜、细胞壁以及鞭毛组成。目前，莱姆病螺旋体有12个基因种，其中B.burgdorferi、B.garinii和B.afzelii[3]具有致病性。若干不同基因型的莱姆病螺旋体侵入宿主可引起莱姆病，该病是一种自[4,5]然疫源性人兽共患病，蜱可作为传播媒介。此病在全球分布广泛，在美国有“第二艾滋病”之称，已成为全球性的公共卫生问题，世界卫生组织把莱姆病列入重点防治研究[6][7,8]对象。黑龙江和吉林两省是我国最早发现此病的省份，至今我国已在多个省、市、[9]区内发现此病的自然疫源地。莱姆病螺旋体的感染率较高，平均可达5.06%，在该病[10]的主要疫区，每年新发病例多于万例。目前，尚无快速有效的病原学诊断方法。莱姆病螺旋体表面存在有大量脂质蛋白A（BorreliaburgdorferimembranelipoproteinA,BmpA），作为抗原能刺激机体产生抗体且与莱姆病螺旋体的致病性有关，又是莱姆病28 螺旋体的主要免疫原，基于此本研究通过选用纯化标记的BmpA蛋白免疫小鼠，获得单克隆细胞株，筛选出最优抗体，为后期组织中检测病原诊断方法的建立奠定了基础。1材料和方法1.1实验材料1.1.1实验动物、细胞及免疫蛋白小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）购自上海强耀生物技术公司；SPF级雌性BALB/c小鼠购自上海强耀生物技术公司；莱姆病螺旋体纯化蛋白BmpA和布鲁菌纯化蛋白VirB5均由本实验室提供；His标签BmpA蛋白和pET-32a-His(+)-VirB5-G/BL21（DE3）均由上海强耀生物技术公司构建和保存。1.1.2主要试剂IMDM培养基、IMDM完全培养基（含15%血清）购自英潍捷基（上海）贸易有限公司；2.2%甲基纤维素、HAT、HT、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、TMB和二甲基亚砜（DMSO）均购自Sigma公司；胎牛血清购自维森特生物技术（南京）有限公司；聚乙二醇（PEG1500）购自Roche公司；辣根过氧化氢酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；单克隆抗体亚类鉴定中辣根过氧化氢酶（HRP）标记的各类二抗均购自北京欣博盛生物科技有限公司；SDS、Tris、TEMED和甘氨酸均购自Amerseco公司；PBS缓冲液和DAB底物显色液购自北京天根生化科技有限公司；NC膜（0.45微摩尔）和WesternBlot膜再生液购自北京索莱宝科技有限公司；Tween-20、KCl、Na2HPO4·H2O、NaCl和KH2PO4均购自国药集团化学试剂有限公司；丙烯酰胺、N,N'-亚甲双丙烯酰胺、APS、1MTris-HCl(pH8.0)和琼脂粉均购自VETEC公司。1.1.3主要实验器材细胞培养板（美国康宁公司）；离心管（美国康宁公司）；冻存管（美国康宁公司）；微量移液器（德国eppendorf公司）；SW-CJ-2F超净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；TGL-16L型离心机（上海安亭科学仪器厂）；Labofuge4008高速冷冻离心机（德国Heraeu公司）；T-GRADIENTPCR（美国Bio-Rad公司）；微波炉（日本松下公司）；DYY-6B型电泳仪（北京六一仪器厂）；ImageLabVersion3.0凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；YXQ-SG46高压蒸汽灭菌器（上海佳胜实验设备有限公司）；SHH.W21电热恒温水浴箱（北京光明医疗仪器厂）；JA2003N电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；XW-80A涡旋振荡器（上海精密科学仪器有限公司）；CO2细胞培养箱（美国ThermoScientific）；隔水式电热恒温培养箱（HIQ-X100）。29 1.1.4溶液配制1.1.4.1单克隆细胞筛选1）包被液：碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，调pH至9.6。2）封闭液：PBS中加入5%的牛奶。3）洗液（PBST）：PBS加0.05%吐温。4）显色液：1%A液和10%B液（A液：1%TMB加入DMSO；B液：0.1%H2O2加入柠檬酸缓冲液）。1.1.4.2单克隆细胞亚类鉴定1）封闭液：PBS中加入2%BSA和3%蔗糖。2）显色液：0.2mLA液和10µL30%H2O2加到10mLB液（A液：15mg/mLABTS加到H2O中；B液：柠檬酸缓冲液，pH4.0）。1.1.4.3WesternBlot1）30%丙烯酰胺：称取290g丙烯酰胺，10gN,N'-亚甲双丙烯酰胺溶于600mL双蒸水中，充分搅拌，使其溶解，然后用ddH2O定容至1L，用0.22µm的滤膜过滤，置于棕色瓶中4℃储存备用。2）1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)：称取181.7gTris加入800mL双蒸水，溶解后，用HCl将pH调至8.8，最后用ddH2O定容至1L，高压灭菌后置于棕色瓶中4°C储存备用。3）1mol/LTris-HCl(pH6.8)：称取121.1gTris加入800mL双蒸水，溶解后，用HCl将pH调至6.8，最后用ddH2O定容至1L，高压灭菌后置于棕色瓶中4°C储存备用。4）10%APS：称取1gAPS加入10mL双蒸水，充分搅拌，使其溶解，0.22µm的滤膜过滤，分装到10个EP管中，-20℃保存。5）膜转移缓冲液：称取5.8gTris，2.9g甘氨酸和0.37gSDS加入600mL双蒸水，混匀定容至800mL，加入200mL甲醇，混匀后分装到2个棕色瓶子中，室温保存。6）TBST：称取8.8gNaCl和量取20mLTris-HCl(pH8.0)加入800mL双蒸水，混匀后加入0.5mL吐温（Tween-20），充分混匀后加双蒸水定容至1L，4°C储存备用。7）封底胶（1%琼脂糖凝胶）：称取0.3gAgar，量取30mL1×TAE，两者混匀后，微波炉内加热2分钟，倒入胶槽中冷却使用。8）5%浓缩胶：量取4.1mL单蒸水、1.0mL30%丙烯酰胺、0.75mLTris-HCl（pH6.8）、0.06mL10%SDS、0.06mL10%APS和0.006mLTEMED，以上试剂混匀后，倒入胶槽内冷却后使用。9）12%分离胶：量取9.9mL单蒸水、12.0mL30%丙烯酰胺、7.5mLTris-HCl（pH8.8）、0.3mL10%SDS、0.3mL10%APS和0.012mLTEMED，以上试剂混匀后，倒入胶槽内冷却后使用。10）5×电泳缓冲液：称取15.1gTris、94.0g甘氨酸和5.0gSDS加入800mL双蒸水，搅拌溶解后，加双蒸水定容至1L，室温保存。实验中所用为1×电泳缓冲液。30 1.2实验方法1.2.1对小鼠进行免疫选择4只6～8周龄SPF级雌性BALB/c鼠，免疫前眼眶静脉采血，分离血清作为阴性血清，-20°C保存备用。初次免疫：用纯化的莱姆病螺旋体BmpA蛋白按60µg/只进行皮下注射，两周后加强免疫3次。加强免疫程序：用BmpA蛋白按30µg/只的剂量加强免疫3次，间隔两周。第三次加强免疫两周后，眼眶静脉取血用ELISA方法测定血清抗体效价，当抗体效价达到要求后，于细胞融合前3天（与第4次加强免疫相隔2周以上），采用腹腔注射再加强免疫一次。三天后，无菌取脾进行融合。VirB5蛋白操作方法同BmpA蛋白。1.2.2免疫小鼠血清抗体效价检测1）分离血清：将免疫小鼠眼眶静脉丛采集的血液置于4°C过夜，第二天3000rpm离心15分钟后收集上清，将上清转移至一个新的EP管中，-20°C保存备用；2）蛋白包被：将纯化的BmpA蛋白作为包被抗原，使用碳酸盐包被液将包被抗原稀释至终浓度为2µg/mL，100µL/孔，4°C包被过夜；3）封闭：使用PBST洗涤微孔板三次，每次5分钟；拍干后每孔加入300µL2%的脱脂奶粉，37°C封闭2h；PBST洗涤三次，每次5分钟，拍干后置于-20°C备用；4）加入待检血清：将四免后的待检小鼠血清用PBST溶液从200倍开始2倍系列倍比稀释，100µL/孔，同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照，37°C孵育1h；PBST洗涤三次，每次5分钟，拍干；5）加入二抗：每孔加入1：5000倍稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG100µL，37°C孵育1h；PBST洗涤三次，每次5分钟，拍干；6）显色与读数：每孔加入显色液100μL，37°C避光孵育15分钟；然后每孔加入显色终止液50µL，使用酶标仪测定OD450nm值；7）结果判定：判定标准如下：（样品孔OD450nm—空白对照孔OD450nm）/（阴性对照孔OD450nm—空白对照孔OD450nm）≥2.1判定为阳性。血清抗体效价为判定结果阳性孔的最大血清稀释度。VirB5蛋白免疫小鼠血清抗体效价检测方法同BmpA蛋白。1.2.3杂交瘤细胞株的建立1.2.3.1饲养细胞的制备在融合前一天，取一只正常雌性BALB/c鼠，拉颈处死，75%酒精消毒5分钟，甩干后移入超净工作台内，固定于经紫外消毒的泡沫板上，用灭菌眼科剪、弯头镊子剪开皮肤（不可损伤腹膜），经钝性剥离使腹膜充分暴露。用10mL一次性注射器吸满无血31 清IMDM培养液注入小鼠腹腔，固定注射器不动，用镊子夹取酒精棉轻揉小鼠腹部，再用注射器抽出腹腔内的培养液，打到15mL无菌离心管中，1500rpm离心5分钟，再6用含20%血清的HAT培养液重悬，注入灭菌平皿中，将上述培养液细胞密度调整至10个/mL，将细胞悬液混匀后加入2-4块96孔细胞培养板，每孔100μL，置37°C、5%CO2培养箱中培养。1.2.3.2SP2/0骨髓瘤细胞的制备在融合前两周将在液氮中冻存的SP2/0骨髓瘤细胞取出复苏，连续传代调整细胞至最佳生长状态。选择形态饱满、生长旺盛的SP2/0细胞用IMDM完全培养基进行扩大培养。融合当天，取刚好处于对数生长期，形态良好的SP2/0细胞，800rpm离心10分钟后弃去上清，用IMDM不完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，重复以上步骤洗涤细胞2次后将细胞重悬，记数后备用。1.2.3.3免疫脾细胞的制备细胞融合前三天冲击免疫血清抗体效价符合融合要求的BALB/c小鼠，融合当天眼球摘除放血，分离血清作阳性血清对照。将小鼠按1.2.3.1进行消毒和剥离皮肤，无菌取出脾脏，放入已盛有IMDM不完全培养基的平皿中反复清洗，剥离结缔组织。取出脾脏移入盛有20mLIMDM不完全培养基的和细胞筛无菌平皿中，用眼科剪子将脾脏剪碎，再用10mL注射器活塞研磨脾脏，直到将脾脏研磨碎。将脾细胞悬液转至50mL无菌离心管中，1500rpm离心5分钟后弃上清，细胞沉淀用IMDM不完全培养基离心洗涤一次，然后将细胞重悬，计数后4°C备用。1.2.3.4细胞融合1）取含20%胎牛血清的HAT选择培养基、IMDM不完全培养基和PEG1500分别放入37°C水浴中预温；2）SP2/0骨髓瘤细胞与免疫鼠脾细胞按细胞数量1：2－1：5混合于50mL离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用手指弹击管底，使细胞松散；3）将含有两种细胞的离心管置于37°C水浴，取1mL37°C预热的PEG1500在1分钟内缓慢滴入，边滴边转动离心管，温水中静置1分钟；然后2分钟内缓慢加入37°C预热的IMDM不完全培养液2mL，边滴边转动离心管，静置15s；接着2分钟内缓慢加入8mLIMDM不完全培养液，边滴边转动离心管，静置15s；最后补加不完全IMDM培养液至30mL轻轻搅动离心管使PEG1500彻底稀释。1000rpm离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀轻悬于含20%胎牛血清的HAT选择培养液中，混合均匀后加入到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μL，饱和湿度、5%CO2、37°C培养箱中培养。4）每天观察并记录细胞的生长状况，融合后的细胞每3天更换一次培养基，用HAT选择培养基半量换液。1.2.4阳性杂交瘤细胞的筛选融合后第3、第6天用HAT选择培养基进行半量换液，第9、第12天用HT选择培32 养基半量换液，第15天后用普通的完全培养基。待杂交瘤细胞长满孔底1/3-1/2时，从每孔中吸取上清液100μL直接加入抗原包被的微量反应板，ELISA步骤见1.2.2。检测结果为阳性的孔及时进行扩大培养和亚克隆，并随时注意冻存。1.2.5阳性杂交瘤细胞的克隆化选择检测为阳性的孔，将孔中的杂交瘤细胞集落轻轻吹起形成细胞悬液，细胞计数。取上述细胞悬液，用含20%胎牛血清的HT培养液稀释到10～20个细胞/1mL，按100μL/孔将细胞悬液加至预先铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中培养。适时换液、筛选与克隆化，同时将每次克隆化剩余细胞进行扩大培养冻存。经过3次克隆化，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。1.2.6杂交瘤细胞的冻存用IMDM培养基将生长旺盛、形态良好的杂交瘤细胞吹打、分散均匀，1000rpm离心3分钟，收集细胞，用细胞冻存液将细胞重悬，混匀后分装于2mL细胞冻存管中，每管1mL左右，做好标记；将冻存管先于4°C放置1-2h，再移至-70°C过夜，第二天移入液氮罐中长期保存，并做好记录。1.2.7杂交瘤细胞的复苏自液氮罐中取出一支冻存管，迅速放入37°C水浴中，不断摇动使其迅速融化后，移至超净工作台，无菌开启冻存管，将细胞悬液悬浮于IMDM完全培养基中，1000rpm离心3分钟，弃上清；用IMDM完全培养基重悬细胞，移入细胞培养瓶中，放入37°C5%CO2细胞培养箱中培养。1.2.8单克隆抗体的鉴定1.2.8.1单克隆抗体的亚类鉴定采用ELISA方法对所得到的单克隆抗体进行亚类鉴定。1）将收集的杂交瘤细胞上清加入到以纯化蛋白（BmpA、VirB5）作为包被抗原的ELISA板中，每孔100µL，37°C孵育1h；2）PBST洗涤3次，每次5分钟，拍干；3）每孔加入100µL1：1000（κ、λ）或1：2000（IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA）倍稀释的HRP标记的羊抗鼠各亚型抗体，37°C孵育1h；4）PBST洗涤3次，每次5分钟，拍干；5）每孔加50µL底物溶液，室温显色10-20分钟；6）每孔加入100µL终止液（2MH2SO4），测定OD（450nm，630nm）值。1.2.8.2Western-Blot检测单克隆抗体的抗原结合性33 将纯化的蛋白（BmpA、VirB5）进行SDS-PAGE，然后将蛋白从SDS-PAGE电泳凝胶上电转至硝酸纤维素（NC）膜，具体步骤是：根据蛋白预染Marker割胶，将SDS-PAGE胶和NC膜一同浸泡在膜转移缓冲液中平衡10分钟；从电转仪的阴极依次按照转膜纸—SDS-PAGE胶—NC膜—转膜纸的顺序排好，清除气泡，以200毫安恒流转膜，转膜时间根据目的片段大小设定；转膜后将NC膜用TBST洗涤3次，每次10分钟，然后浸泡在5%的脱脂奶粉中，室温封闭1h；封闭后将NC膜用TBST洗涤3次，每次10分钟，以单克隆抗体细胞的培养上清为一抗，用1×TBST按1：1000稀释，4°C孵育过夜；用TBST洗膜3次，每次10分钟，然后加入1：5000倍稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，37°C孵育1h；TBST洗膜3次，每次10分钟，DAB显色，待出现明显的条带时，用去离子水终止反应，观察结果。1.2.9杂交瘤细胞的抗体稳定性检测将定株之后的杂交瘤细胞进行培养，收集细胞培养上清，间接ELISA测定其亲和常数，根据间接ELISA检测结果评价单克隆抗体的稳定性。1.2.10单克隆抗体腹水制备及纯化在接种分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞前1周，选取3~5只8-12周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL灭菌液体石蜡；将阳性杂交瘤细胞从细胞培养瓶吹下、分散均匀，1000rpm离心5分钟，用PBS缓冲液重悬细胞，洗涤2次，细胞计数，将细胞密度调至62×10个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL细胞悬液。接种后每天观察小鼠状态，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水；3000rpm离心10分钟，取上清分装、标记，测定腹水效价，保存于-70°C备用。根据亚类鉴定结果，以辛酸-硫酸铵方法和ProteinA亲和层析柱进行纯化，并以SDS-PAGE检验其纯度。2结果2.1免疫小鼠血清抗体效价测定第三次加强免疫两周后，眼眶静脉丛采血分离血清，间接ELISA检测免疫小鼠的血清抗体效价。BmpA蛋白免疫的四只小鼠检测结果均符合细胞融合的抗体效价要求（见表3-1），选择血清抗体效价高的3号小鼠制备脾细胞，细胞融合前三天进行冲击免疫；VirB5蛋白免疫的四只小鼠检测结果均符合细胞融合的抗体效价要求（见表3-2），选择血清抗体效价高的2号小鼠制备脾细胞，细胞融合前三天进行冲击免疫34 表3-1BmpA四免后小鼠血清效价Table3-1TheserumafterthefourthimmunizationbyBmpA稀释倍数200400800160032006400128002560051200102400空白阴性BmPA#11.6691.6721.6691.5521.4181.2680.9540.6960.4460.2880.0310.051BmPA#21.6141.5711.5611.4451.3511.2311.050.750.5190.3420.0190.043BmPA#31.6921.6691.6361.5491.4431.3331.1460.850.6040.2230.0180.043BmPA#41.6611.6331.6191.581.4761.2951.0840.8120.5110.3210.0360.066表3-2VirB5四免后小鼠血清效价Table3-2TheserumafterthefourthimmunizationbyVirB5稀释倍数200400800160032006400128002560051200102400空白阴性VirB5#11.4151.411.4461.371.3711.341.2671.1321.0280.790.0280.02VirB5#21.5171.4641.4911.4771.3981.3281.2551.080.8670.6140.0280.026VirB5#31.4981.4521.4781.4181.4171.3481.2631.0910.8970.680.0370.039VirB5#41.5091.481.4551.461.4341.3381.221.0940.8920.6620.0360.0252.2杂交瘤细胞株的建立根据间接ELISA方法进行筛选，亚克隆效价高的阳性孔，经过三次亚克隆后获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。BmpA得到1#、3#、5#、8#、12#、15#、17#、18#、25#、30#、38#和40#十二株单克隆抗体细胞株；VirB5得到2#、12#、19#、25#、31#和40#六株单克隆抗体细胞株。2.3单克隆细胞亚类鉴定结果分别培养上述十八株单克隆抗体细胞并收集培养上清，通过间接ELISA方法对其进行亚类鉴定。亚类鉴定结果表明：BmpA中1#、8#、17#、18#、25#和40#为IgG1亚型，3#、5#、12#和38#为IgG2a亚型，15#和30#为IgG2b亚型；VirB5中2#为IgG2b亚型，12#、19#、25#、31#和40#为IgG1亚型。鉴定结果见表3-3和表3-4。35 表3-3BmpA阳性杂交瘤细胞株Table3-3BmpApositivehybridoma编号细胞株编号针对免疫原的OD亚类11#1.421G123#0.88G2a35#1.505G2a48#0.819G1512#1.316G2a615#1.282G2b717#0.928G1818#0.853G1925#1.033G11030#0.925G2b1138#1.17G2a1240#1.062G1表3-4VirB5杂交瘤细胞株Table3-4VirB5positivehybridoma细胞株编号针对免疫原的OD值针对标签的OD值亚型2#0.4680.098G2b12#0.7080.032G119#0.7720.013G125#0.7260.017G131#0.9250.016G140#0.7510.028G1阴0.0320.032空0.0330.032阳1.1161.1822.4Western-Blot检测单克隆抗体的抗原结合性Western-Blot结果显示：BmpA所得十二株单克隆抗体细胞株，有10株可与对应蛋白发生反应，2株不与纯化蛋白反应，其中5#与纯化蛋白结合最好，NC膜条带显色明显如图3-1所示；VirB5所得六株单克隆抗体细胞株，4株可与对应的纯化蛋白发生反应，2株不反应，其中19#与纯化蛋白结合最好，NC膜条带显色明显如图3-2所示。36 注：M为蛋白Marker；1#、5#和25#为单克隆抗体细胞株图3-1BmpAWesternBlot结果Figure3-1BmpAWesternBlottestresults注：M为蛋白Marker；19#为单克隆抗体细胞株图3-2VirB5WesternBlot结果Figure3-2VirB5WesternBlottestresults2.5单克隆抗体腹水效价的测定及其纯化1）将BmpA5#和VirB519#株单克隆抗体细胞株接种小鼠腹腔，一周后收集腹水，以间接ELISA方法检测其效价，效价结果见表3-5。表3-5单克隆抗体细胞腹水的效价测定Table3-5DeterminationofAscites’TiterofMonoclonalAntibodies单抗细胞株BmpA5#VirB519#效价1:256001:512002）分别采用辛酸-硫酸铵方法和以ProteinA亲和层析对所得腹水进行纯化，将纯化后的单克隆抗体进行WesternBlot，对纯化效果进行分析（见图3-3）。37 注：M为蛋白Marker；1为VirB519#纯化后的抗体；2为BmpA5#纯化后的抗体图3-3单抗纯化后的WesternBlot结果Figure3-3WesternBlottestresultsofpurifiedMAbs2.6单克隆抗体的稳定性将BmpA5#和VirB519#株杂交瘤细胞的培养上清进行间接ELISA检测，结果显示抗体效价基本稳定，表明这两株杂交瘤细胞能够稳定分泌单克隆抗体，结果见表3-6。表3-6杂交瘤细胞分泌抗体的亲和常数Table3-6Theaffinityconstantofhybridomacells稀释倍数20040080016003200640012800BmPA5#1.1611.091.0561.020.9730.9080.838稀释倍数2560051200102400204800空白稀释度亲和常数BmPA5#0.7010.5820.440.3210.019158332.98371.8E+10稀释倍数20040080016003200640012800VirB519#1.0550.8940.7250.5920.3310.2470.128稀释倍数2560051200102400204800空白稀释度亲和常数VirB519#0.0780.0620.0490.0380.0471202.417831.6E+08注：亲和常数≈150000×A/抗体浓度，A代表上平台的1/2OD值所对应的抗体稀释倍数38 3讨论[11]人类最早杂交瘤技术由Kohler和Milstein建立，1975年他们第一次成功地制备了单克隆抗体(McAh)，此后单克隆抗体被广泛应用于药物学、病毒学、基础医学和临床医学等各个领域，为感染性疾病的研究、诊断和治疗提供很大帮助。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系；特定分子的抗体可用于分离、分析及纯化该特定分子抗原；单克隆抗体试剂还可用于临床诊断和治疗。现利用单克隆抗体对疾病进行诊断的方法较多，可根据单抗特性鉴定病原体，对不同感染性疾病做出准[12]确鉴定。将病原体的抗原分离后同骨髓瘤细胞杂交融合建立相应的杂交瘤细胞株来分泌单抗，可以同病原体发生特异性的抗原-抗体反应，通过ELISA试验或免疫荧光试验对疾病进行诊断。目前，市场上制备的单克隆抗体多数是鼠源性的，制备一般是抗原免疫小鼠，从其身上获取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后对单个细胞进行克隆，筛选出能分泌单克隆抗体的克隆细胞，制备过程如图3-4。图3-4小鼠单抗制备流程图Figure3-4Mousemonoclonalantibodyprocessforpreparation3.1布鲁菌单克隆抗体布鲁菌病由兼性胞内寄生的布鲁菌引起，以前也称为马尔他热（Maltafever），因[13,14]其引起的症状也叫波浪热，是一种人兽共患传染性细菌病。布鲁菌感染家畜后可引39 [15]起母畜流产和不孕，对全世界畜牧业造成极大损失，尤其是发展中国家。布鲁菌随流产的胎畜和羊水排出大量的病原体，阴性感染动物也可经乳汁、粪、尿等长期排菌。当人类接触该分泌物或被其污染的畜产品后，经皮肤、黏膜、眼结膜、消化道、呼吸道等多种途径而感染。由于布鲁菌病患者临床表现无特异性，临床误诊后很容易错过布鲁菌病最佳治疗期。随着布鲁菌病疫情愈演愈烈，发病人数越来越多。目前，因尚无有效的治疗方法，导致慢性患者的人数不断增加。因此，布鲁菌病早期诊断和治疗非常重要。目前，用于血清检测布鲁菌病的方法有平板凝集试验（PAT）、血清试管凝集试验（SAT）、补体结合试验（CFT）、沉淀实验，分子生物学检测方法有PCR技术、基因检测技术、荧光探针分析法等。这些检测方法都有各自的缺点和局限性，如传统的血清学方法敏感性较低，而且易与耶尔森氏菌O:9、大肠杆菌O:157、沙门氏菌O45-2（D群）等细菌产生交叉反应，而分子生物学方法则在基层不实用。医院对布鲁菌病患者病原学诊断存在不足，布鲁菌培养周期长，培养环境要求比较高，操作专业性较强，基层医院不具备培养条件，不能从病原上诊断布鲁菌病。对此，根据单抗的优势，王艳等建立了羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株，[16,17]丘金浪等对马耳他布鲁菌膜间质蛋白BP26抗原表位做了筛查与鉴定。有研究表明：OMP31是布鲁菌的重要外膜蛋白，是犬种布鲁菌（B.canis）和猪种布鲁菌（B.suis）[18]的种特异性标志蛋白，几乎所有布鲁菌均有表达，但牛种布鲁菌（B.abortus）天然缺[19,20]乏编码该蛋白的基因；BP26蛋白是布鲁菌的一种具有强免疫原性周质蛋白，同样不是存在于所有的布鲁菌。布鲁菌VirB5蛋白属于布鲁菌的表面蛋白，可能作为一种潜[21]在的独立标记物，帮助细菌识别宿主，促使宿主和细菌之间相互作用，且有研究发现[22]该蛋白有较高的免疫原性。因此，根据此蛋白可以制备出对应抗体，对疾病早期菌血症时期的诊断提供帮助。本研究利用已纯化的蛋白VirB5免疫小鼠，获得阳性单克隆杂交瘤细胞5株，进一步筛选出单克隆抗体1株。该抗体能快速与病原菌特异性结合，为后期血液、关节液、乳汁、粪、尿等液体中检测病原诊断方法的建立奠定了基础。该病原诊断方法能对患者菌血症期快速做出准确诊断，让患者得到及时治疗以达到早诊断早治疗的目的。3.2莱姆病螺旋体单克隆抗体莱姆病是由莱姆病螺旋体引起的，硬蜱是该病原菌的传播载体。国内外学者已相继从莱姆病病人的皮损组织、淋巴结、血液、脑脊液、关节滑液、皮肤灌洗液、耳廓活检标本以及多种宿主动物脏器中分离培养到莱姆病螺旋体。莱姆病与其他传染病相比，临床表现无特异性，可引起发热、皮疹、头痛、恶心等症状。早期蜱叮咬处皮肤可出现红色丘疹或斑疹，继而出现心脏损害、神经症状及关节炎等，侵犯关节可致畸形，侵犯心脏严重时可致死。后期症状多为肢体伤残、视力下降、心肌损伤，极易误诊为其它疾病。近年来有许多相关研究报道：莱姆病被误诊为格林巴利综合症、脊髓型颈椎病、风湿病、[23-28]皮肤病及其他疾病等。目前，实验室诊断方法在一定程度上具有快速、准确的优点，40 但也存在着操作复杂、检测费用昂贵、对仪器设备要求高等缺点，基层医院不具备相关条件。因此研究一种适用于普通医院的确诊方法迫在眉睫，而确诊最主要的指标就是找到病原菌。莱姆病螺旋体表面蛋白BmpA作为抗原能刺激机体产生抗体且与莱姆病螺旋体的致病性有关，迄今为止莱姆病螺旋体共发现6种主要的外膜蛋白。在莱姆病研究早期，研究者发现莱姆病患者的血清中产生能与分子量为39kDa的螺旋体抗原结合的抗体，[29]该抗原因此被称为P39，抗体识别P39被认为是感染莱姆病螺旋体后特定的诊断方式[35-39][30]。该抗原蛋白质随后被定义为BmpA（伯氏疏螺旋体外膜蛋白A）。有研究报道，莱姆病螺旋体B31株的基因序列能编码105种脂蛋白，bmp基因位于染色体上391932至396563之间，排列顺序为bmpD-bmpC-bmpA-bmpB。BmpA是位于螺旋体外膜表面[26][32]的膜脂蛋白，并且属于bmp基因家族编码Bmp蛋白家族成员，因此其是莱姆病螺[33,34]旋体的主要免疫原。根据这一特性BmpA可以作为宿主莱姆病诊断的主要抗原。大量研究结果显示BmpA蛋白具有良好的特异性，基于实验室已构建的莱姆重组蛋白BmpA，所以本研究利用该蛋白在诊断中的应用进行了进一步的研究。本研究根据纯化蛋白BmpA免疫小鼠，获得阳性单克隆杂交瘤细胞12株，进一步筛选出单克隆抗体1株。实验过程中该抗体能快速与病原菌特异性结合，为后期皮损组织、淋巴结、血液、脑脊液、关节滑液、皮肤灌洗液、耳廓活检标本中检测病原菌奠定了基础，莱姆病患者达到早诊断早治疗的目的。41 参考文献[1]刘锴,金宁一,王兴龙.布鲁菌病的治疗进展[J].传染病信息,2007,20(1):30-2.[2]冯羡菊,夏胜利,罗予.39例布鲁菌感染血培养临床特点分析[J].中国人兽共患病学报,2010,26(9):881-2.[3]BarantonG,PosticD,GironsIS,etal．DelineationofBorreliaburgdorferisensustricto，Borreliagariniisp.novandgroupVS461associatedwithLymeborreliosis[J].IntJSystBacteriol,1992,42(3):378-88．[4]LiverisD,WormserGP,NowakowskiJ,eta1.MoleculartypingofBorreliaburgdorferifromlymediseasepatientsbyPCRrestrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis[J].JClinMicrobiol,1996,34(4):1306-9．[5]KlausK,MiekP,SjoerdGTR,eta1.DifferentialtransmissionofthegenospeciesofBorreliaburgdorferisensulatobygamebirdandsmallrodentinEngland[J].ApplEnvironMicrobiol,1998,64(7):1167-74．[6]孙毅,许荣满,郭天宇,等.莱姆病传播生态学研究进展[J].中国人兽共患病杂志,2002,18(5)：90-3.[7]艾承绪,温玉欣,张永国,等.黑龙江省海林县林区莱姆病的流行病学调查[J].中国公共卫生，1987,6:82-5.[8]张哲夫,张金声,朱桂凤,等.我国东北林区莱姆病的调查[J].中华流行病学杂志,1989,10:261-4.[9]万康林,张哲夫,张金声,等.中国20个省、区、市动物莱姆病初步调查研究[J].中国媒介生物学及控制杂志,1998,9(5):366-70.[10]张哲夫,万康林,张金声,等.我国莱姆病的流行病学和病原学研究[J].中华流行病学杂志,1997,18:8-11.[11]KohlerG,MilsteinC.Continuouscultureoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity[J].Nature.1975,256(5517):495-7.[12]GroothuIS,JessiER.Preventionofrespiratorysyncytialvirusinfectionsinhighriskinfantsbymonoclonalantibody(palivizumab)[J].PediatricsInternational,2002,44(3):235-41.[13]Kahl-McDonagh,MM,FichtTA.EvaluationofprotectionaffordedbyBrucellaAbortusandBrucellamelitensisunmarkeddeletionmutantsexhibitingdifferentratesofclearanceinBALB/cMice[J].Infectionandimmunity,2006,74(7):4048-57.[14]GolshaniM,RafatiS,SiadatSD,etal.ImprovedimmunogenicityandprotectiveefficacyofadivalentDNAvaccineencodingBrucellaL7/L12-truncatedOmp31fusionproteinbyaDNAprimingandproteinboostingregimen[J].Molecularimmunology,2015,66(2):384-91.[15]LalouxG,DegheltM,BarsyMD,etal.IdentificationoftheEssential,Brucellamelitensis,PorinOmp2basaSuppressorofBax-InducedCellDeathinYeastinaGenome-WideScreening[J].PlosOne,2012,5(10):e13274.[16]王艳.稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立[D].郑州:河南农业大学硕士学位论文,2011.[17]丘金浪.马耳他布鲁氏菌膜间质蛋白BP26抗原表位筛查与鉴定[D].广州:南方医科大学硕士学位论文,2012.[18]JacquesI,VergerJM,LaroucauK,etal.ImmunologicalresponsesandprotectiveefficacyagainstBrucellamelitensisinducedbybp26andomp31B.melitensisRev.1deletionmutantsinsheep[J].42 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文献综述综述一布鲁菌病诊断方法和流行病学的研究进展布鲁菌病（Brucellasis）是一种由布鲁菌侵入机体后引起变态反应性的人畜共患病，位于二类传染病之首。布鲁菌现有6个种19个生物型，分别有羊种布鲁菌（B.melitensis）生物型1-3、牛种布鲁菌（B.abortus）生物型1-9、猪种布鲁菌（B.suis）生物型1-5、绵羊附睾种布鲁菌（B.ovis）、沙林鼠种布鲁菌（B.neotomae）以及犬种[6]布鲁菌（B.canis）。人感染布鲁菌后引发脑膜炎、关节炎、心内膜炎等，且慢性病例[1]尚无法根治；全球200多个国家中约有170个国家和地区盛行该病，且每年的新发病[2-3]例达到50万人。近年来，布鲁菌病的人畜疫情在世界范围内均出现了回升势头，并呈持续增长态势，且愈演愈烈。我国布鲁菌病疫情形势严峻，尤其是2000年以后，新[4-5]发病例每年平均递增率为28.8%，成为报告发病数上升速度最快的传染病。布鲁菌病的主要流行区在病例上主要集中于我国的“三北”地区，即东北、华北和西北地区，占全国布鲁菌病病例的90%以上，尤以内蒙古、新疆严重。全国的布鲁菌病疫情形势仍比较严峻，不仅严重的威胁着人们健康和公共安全，而且影响着动物性产品的贸易，尤其影响着畜牧业的发展。目前，针对该病的诊断国内外学者相继建立了许多方法，虽然有些方法颇有成效，但存在着价格高、操作繁琐、专业性强等缺点而不适合基层布鲁菌病的准确诊断。47 1布鲁菌病流行病学[101]布鲁菌病几乎遍及世界上各个国家。在我国，内蒙古牧区、东北牧区及西北牧[102]区等地流行布鲁菌病。解放前在牧业地区较为流行，但在北方农区也有发生，且较[103]散。新疆从20世纪50—80年代，一直为国内主要疫区之一。据不完全统计，新疆80余县、市及生产建设兵团13个师局布鲁氏菌病均有不同程度的流行。解放后我国专[104]门成立了防制机构，通过净化，发病率有所下降。但近几年，由于活畜流通较大，[105]个别地区又有回升的趋势。目前已知的布鲁菌宿主可以寄生在家畜，家禽，野生动[106]物等60种动物身上，主要寄生动物为羊，牛和猪。患有布鲁菌病牲畜及带菌动物是本病的主要传染源，主要以同种动物为载体，相互之间传染，引起健康牲畜带菌或发病[107]，最后波及到人类。据了解，该病在与其他动物之间也会有转移现象，即羊种菌可[108]能会转移到牛、猪或者相反。在我国羊、牛及猪的饲养数量非常大，且与人类接触[109]较为频发，从而增加了人类感染的机会。布鲁菌病主要是通过消化道感染，通过食用被该菌污染的饲料、畜产品、水、生乳及内脏；皮肤黏膜也是感染途径之一，是通过接触感染。在直接接触受感染的动物或其粪便、阴道分泌物或流产胎儿等过程中，也可[110]以感染该病；也可通过呼吸道感染；另外，通过结膜及吸血昆虫等进行传播。动物的易感性随着性成熟，感染率最高，随着年龄越老感染率降低，公畜感染率高于母畜。在实际生产中，布鲁菌病疫区中的幼畜感染率低，大部分生产母畜在头胎流产后，发生流产的概率低。一年四季中，布鲁菌病均可发病，但多发生于母畜怀孕季节。在发病高峰季节，该病的流行区可呈点状暴发流行。人类患布鲁菌病与职业有很大的关系，一般从事兽医畜牧、畜产品加工、屠宰、皮革加工等工作人员得该病的明显高于其[111]他人群。2布鲁菌病诊断方法研究2.1病原学诊断2.1.1布鲁菌的分离培养布鲁菌的病原学诊断主要是从疑似患者的血液或者组织中分离培养布鲁菌来确诊。作为布鲁菌病传统的诊断方法，细菌的分离培养是一项极其重要的技术。而布鲁菌对于生长条件要求极高，所以普通培养基无法进行布鲁菌的培养，它的生长繁殖较为缓慢，在不同的生长环境中，生长速度也有不同，有时初代分离需要1-2周，有时甚至需要一个月左右，在初次分离时，不同种不同生物型所需要的生长条件要求不同。得到布鲁菌分离株后，需要通过生化试验来鉴别布鲁菌的种型。鉴别布鲁菌的种型时，一般根据布鲁菌的生化、血清学特征或是裂解细菌的裂解谱、药敏试验等很多传统方法来鉴别布鲁48 菌的种型。布鲁菌不同种或者生物型之间存在抗原性差别较小，在实验过程中极易污染环境，并且分型过程操作复杂。因此，这种检测方法不适用于基层临床布鲁菌病的检测。2.1.2分子生物学诊断2.1.2.1PCR及其衍生技术聚合酶链式反应（PCR）技术是1986年由美国Mullis等发明的一种用于检测DNA的方法。一些发达国家因PCR技术检测病原时敏感性高、特异性强等优势，而被作为[7]检测布鲁菌病原的手段。我国于20世纪末，从国外引进了PCR技术并用于布鲁菌病[8,10][9]的流行病学调查和诊断，并作为一种特定的检测方法。1999年金红等建立了IS6501锚定PCR法，不但可鉴别不同毒株和生物型的布鲁菌，而且可区别疫苗株与野毒株。然而，对于布鲁菌的检测传统的PCR方法虽然简单有效，不同的布鲁菌的检测依赖于有不同的引物，从而增加了实验的操作复杂性。实时定量PCR是一种核酸定量的检测技术，KattarMM等人从杂交种水平探针和引物16S-23SITS，omp25和omp31等三个不同基因位点开发了实时定量PCR诊断方[11]法，证明实时定量PCR具有潜在的实验室诊断价值。多重PCR技术可以一次识别多[12][13]种病原体，也可以鉴定布鲁菌之间的不同生物型。但实时定量PCR和多重PCR都[14]存在对操作设备、操作流程和操作人员要求高等缺点，因此不适用于基层。巢式PCR是通过两对引物扩增序列，首先由外围引物扩增模板产生第一轮产物，[15]然后用内围引物扩增第一轮产物，所得第二轮产物为目的片段。半巢式PCR具有两[16]种不同的对PCR引物，但内围引物与外围引物有一个引物相同。巢式PCR或半巢式PCR识别范围有限，而且容易引起假阳性。[17]Fekete等研制出随机引物聚合酶链反应（AP-PCR）可区分25种不同布鲁菌菌株。1994年，AMOS-PCR方法利用从引起感染的疫苗株作为基础通过PCR扩增的数量和大[18,19]小进行菌株鉴定。1996年，Tcherneva等报道REP-PCR方法作为布鲁菌的一种诊[20]断方法流行起来。PCR-RFLPs显示可区分布鲁菌的物种、生物型，并且可以作为用[21]于诊断、流行病学、生物分类和进化研究的工具。此外，多基因组可变数目串联重[22]复测定（MLVA）被人们用来研究布鲁菌分离株的分子流行病学表征。PCR方法已被成功地用于识别所有布鲁氏物种和大部分的生物型，成为了一个改进传统分子基因分[23,24]型的方法。使用Bruce-ladder多重PCR检测方法可以区分所有的经典布鲁菌物种[25]。PCR及其衍生技术作为检测布鲁菌的诊断方法，具有速度快、安全、灵敏、特异[26][27]等优点，但需要与血清学方法或细菌分离培养的方法进行互补。并且该类技术存在许多缺点，如成本较高，质量控制和质量保证的问题，PCR对于临床样品在常规实[28,29]验室检测的可行性有待商榷。2.1.2.2核酸探针技术[30][31]Mater等制备地高辛标记探针用以鉴定布鲁菌属，在我国，王希良等研究者构49 建了pBC4重组质粒，经KpnI和BamHI双酶切回收牛布鲁菌544ADNA片段，其碱[32]基对长度为224bp，之后又建立了斑点免疫印迹试验。2000年，Fernanderz等以牛种布鲁菌16SrDNA做探针，对全部的布鲁菌菌种、变种以及9株临床分离株进行了杂交检测，实验结果证明了在布鲁菌检测鉴定中16SrDNA全菌杂交技术价值匪浅。2.1.2.3环介导等温扩增技术DNA环介导的恒温扩增(Loop-MediatedIsothermalAmplification,LAMP)反应，是分子生物学领域中的一个新概念，它可以在恒温(60～65℃)条件下，30～60分钟内将只9有几个拷贝的靶核酸扩增到10水平，与传统的PCR技术相比，LAMP技术的特异性、[33][34]灵敏性都较高。2010年，我国潘文等构建了新型可视化LAMP，应用的是布鲁菌种特异的omp25基因，对布鲁菌S19株、S2株、M5株，这3株布鲁菌的弱毒疫苗进行了检测，扩增结果全部显示阳性，这种新型可视化LAMP还可用于对布鲁菌污染的乳制3[35]品的检测，敏感性达到5.2×10CFU。林国珍等建立了检测动物血液、人类血液、乳制品中布鲁菌DNA的新型LAMP。以高度重复的omp25基因序列为基础的LAMP能够检测出9fg/mL布鲁菌DNA，敏感性较高，比巢式PCR高出10倍。可视化LAMP的建立，使得布鲁菌病在检测时，结果可直接可以通过肉眼观察，不会产生主观因素的影响，较适用于基层对布鲁菌病的检测，而且可以广泛推广。2.2免疫学诊断技术2.2.1血清凝集实验对于布鲁菌病的诊断血清凝集试验是最广泛使用的方法之一。它是一种标准且高度[36,37]敏感的方法。传统的布鲁菌血清凝集实验包括试管凝集试验（Standardtubeagglutinationtest,SAT）、平板凝集实验、全乳环状试验（ABRT）、抗人免疫球蛋白试验（Coomb’s）、虎红平板凝集试验（RBPT）和缓冲平板凝集试验（BBAT）。虎红平板凝集试验因其简便、快速、成本低、结果可靠且具有较高的特异性，而被广泛的用于[38,39]布鲁菌病的流行病学调查及初筛。在国外猪种布鲁菌病的检疫中，RBPT与SAT[40]的符合率达到99.44%。我国也将RBPT用于人布鲁菌病的初级筛选试验，若虎红平[41]板凝集为阳性者，再进行SAT/CFT进行确诊，若两者都为阳性者即可确诊为阳性。在一项研究中酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）的敏感[42]性为81.3％，SAT的敏感性为93.7％，已有多项研究证实SAT的灵敏度可以高达[43,44]100％。尽管血清凝集试验灵敏度很高，但它也存在一些限制会出现假阳性或者假[44-47]阴性的结果。当血清凝集试验用于诊断布鲁菌病时，出现假阳性反应是因为与沙门氏菌，耶尔森氏菌，霍乱弧菌，Francisellatularencis或大肠杆菌O：157发生交叉反应，[48-51]将血清常规稀释1/320可避免假阳性反应的发生。50 2.2.2补体结合试验补体结合试验（Complementifixationtest,CFT）比SAT、虎红平板凝集试验[52]（Rose-bengalplateagglutinationtest,RBPT）的特异性和敏感性更高。世界动物卫生组织（OfficeInternationalDesEpizooties,OIE）公认CFT是布鲁菌病的确诊性实验，在临床诊断中具有较高的应用价值。针对布鲁菌慢性病时，检测结果会出现RBPT的结果呈阴性，但是CFT的检测结果为阳性，除了慢性的布鲁菌病，而且在检测并没有进行人工免疫的犊牛时，或者在犊牛经过人工免疫成长为成年牛时，CFT都显示出其更为精[53]准的优势。但其检测技术主要应用于牛种、羊种以及绵羊附睾种布鲁菌病的诊断，[54,55]并不适用于多种布鲁菌病的检测，尤其是对猪种布鲁菌病的个体诊断，还有发生溶血的样品，也不能用CFT进行检测，容易产生误差，再加上CFT对实验要求较高，[56]而且操作复杂，因此CFT在基层检疫中很难适用。我国靖吉强等改进了CFT，他将低速离心技术应用于CFT中，经过改进后主观因素对实验结果的影响明显降低。2.2.3酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA）分为两种：间接ELISA（iELISA）和竞争ELISA（cELISA），其中iELISA所用的包被抗原主要是光滑型布鲁菌菌体脂多糖（S-LPS）。[57]Kittelberger指出iELISA敏感性高，优于上述其他血清学方法，但是其不能区别S19疫苗株和野毒株感染。因此，只把间接ELISA用作普查方法而不是用作家畜免疫的检[58]测方法。为了解决在布鲁菌病诊断方面的问题，国外研究者Nielsen等应用牛种布鲁菌S1119S-LPS的O糖链（OPS）特异性抗原不和蛋白A/G结合的单克隆抗体。1996年，WeynantsV等制备了2株辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，并用制备的单克隆抗体检测牛血清，结果显示制备的单克隆抗体在实验中较敏感，未出现假阴性结果，并且[59]可以区分人工免疫和自然感染。cELISA的检测结果敏感性与iELISA相近，但却比缓冲平板凝集试验（Bufferedplateagglutinationtest,BPAT）敏感。并且cELISA在检测出现假阳性样品或者未免疫布鲁菌疫苗的动物时，特异性≥iELISA。因此在2004年，OIE[60]将cELISA指定为诊断和清除牛布鲁菌病的推荐方法。2.2.4胶体金标记免疫层析技术胶体金免疫层析技术（Goldimmumofiltraitionassay,）是在20世纪80年代初期[61]兴起的一种新型免疫学分析技术。GICA主要原理（如图1-1）是通过渗透作用，利用包被的特异性抗体捕获待检测液体，从而在观察区域显示出标记性信号。胶体金免疫层析试纸条结构由支撑板、膜、吸水垫、结合垫、样品垫5部分组成（如图1-2）。51 图1-1胶体金免疫层析法原理Figure1-1TheprincipleofGoldImmune-chromatograpHicAssay图1-2免疫层析试纸条的组成结构Figure1-2ThestructureandcompositionofImmune-chromatograpHicstrips[62]2013年李红叶文献中证实GICA与RBPT、SAT有很好的临床符合性。检测数据显示，GICA与RBPT的总符合率达到97.17%，没有统计学显著性差异；GICA与SAT的总符合率达到97.95%，没有显著性差异。说明布鲁菌抗体GICA可以在临床医院或是疾控中心得到应用，为布鲁菌病的诊断提供了新的方法。3小结布鲁菌病是一种由布鲁菌引起的全球性人畜共患传染病，给人类的健康和财产带来很大危害。临床上通过患者的发病史、临床表现、体格检查及必要的实验室诊断来确诊。随着布鲁菌研究的深入，其他快速、准确、新型的诊断技术也已经发展起来，有利于临床实验室对该疾病的监测，然而，这些新方法有待进一步的研究，评估和完善。52 综述二莱姆病诊断方法和流行病学的研究进展莱姆病（Lymedisease）是一种主要由硬蜱传播各种不同基因型的伯氏疏螺旋体[63](Borreliaburgdorferi，Bb)引起人和动物多系统和器官损伤的人畜共患病。人感染后主[64]要引起慢性游走性红斑、莱姆病性脑炎、关节炎、慢性肢皮炎和心肌炎等临床症状。感染后期可造成人的运动功能障碍甚至死亡。1莱姆病流行病学[65]莱姆病是1977年Steere在美国首次发现的一种自然疫源性疾病。莱姆病是1982年才确定其病原体为伯氏疏螺旋体。目前，世界上已有70多个国家报告发现此病，估[66]计年发病人数在30万人左右，且有不断增长的趋势。在美国，莱姆病已成为最常见[67]的虫媒传染病，且有“第二艾滋病”之称。我国于1986年首次在黑龙江海林县林区发[68]现该病。后证实莱姆病在我国分布相当广泛，大兴安岭、小兴安岭、长白山、天山、[69]燕山、阿尔泰山等山林地区存在人群感染。其感染率平均可达5.06%。由于蜱叮咬机会的不同，不同地理环境的居民其患病率分布在1％-4.5％之间。在莱姆病的主要疫区，[112]每年至少有上万新发病例。新疆是莱姆病的重疫区，谢杏初等人在1987年开展针对新疆各个地区莱姆病发病情况的调查，曾先后证实玛纳斯县、新源县、伊犁、博乐、沙湾、阜康、阿勒泰、焉耆[70]县等地存在自然疫源地，主要分布在天山以北。新疆莱姆病平均感染率高达[71]35.49%。谭毓绘等对新疆莱姆病2000至2004年的监测报告表明：由于较高的蜱叮咬率，疫区地的武警官兵血清抗莱姆病螺旋体抗体阳性率高达46.43%，而疫区的林业工人和其他人群感染率亦高达31%-39%。而且对于非疫源地的野外工作者阳性率也较[113]高；孙恒松等1998至2003年于巴音郭楞蒙古自治州的焉耆和博湖两县的河南油田新疆石油探区发现莱姆病感染，总感染率为13.03%，高于全国人群感染水平。2莱姆病诊断方法研究2.1病原学检测2.1.1病原体检测法病原体检测包括直接检测和分离培养检测。直接检测法是通过获取感染宿主的组织或肠道等直接进行涂片，在显微镜暗视野下进行观察；该方法需要操作人员具有丰富的[73]检测经验，且易出现漏检，与其他诊断方法相比，直接检查的检出率相对较低。分53 [72]离培养法是通过把样本接种于BSKⅡ、BSK-H或KellyPreac-Mursic培养基中培养，[74]分离培养一般采用王昭孝等改进的方法进行，是莱姆病检测的金标准，但是如果伯氏疏螺旋体的样品数量少，会导致螺旋体生长缓慢，在普遍情况中很难分离培养到螺旋[73]体，且分离率低、耗时较长、敏感性差。因此病原体的直接检测在临床应用中受到了限制。2.1.2分子生物学检测莱姆病分子水平的检测主要集中在以聚合酶链反应（PCR）技术为基础的方法上，该方法快速方便、灵敏度高、特异性强，所需样品少，可在感染早期相应抗体未出现时[75]检测出病原体，弥补了分离培养、直接镜检和血清学诊断方法的不足。PCR主要扩[76]增周浆鞭毛蛋白编码基因序列、外膜蛋白特异序列、16srDNA和5s-23srDNA片段。PCR检测游走性红斑、慢性萎缩性肢皮炎病人的皮肤组织及关节炎病人的关节滑液灵[78]敏性较高，但是在检测血液样品是敏感度较低。目前用于检测莱姆病的PCR方法有标准PCR、巢氏PCR和荧光定量PCR，荧光定量PCR可大大提高检测的灵敏性，疑[78,79]似患者和动物的各种组织、体液均可用定量PCR进行检测。由于PCR检测目的基因选择的多样性以及对结果的影响，再加CSF、血液及尿液样本检出率低，致使PCR法检测莱姆病在临床实验室的应用受到限制。2.2血清学检测2.2.1酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA普遍用于莱姆病的血清抗体检测，通常情况下，ELISA检测使用莱姆病螺旋体全细胞超声裂解产物作为抗原来分别检测IgM，IgG或IgA抗体，或者进行抗体联[80,81]合检测。目前，重组抗原、合成的多肽类抗原以及联合抗原的使用使ELISA检测[80,82,83]的敏感性和特异性有所提高，并且适用于莱姆病不同阶段的检测。有研究表明，VlsE来源合成的C6缩氨酸抗原适用于急性期和恢复期血清抗体的诊断，具有较高的敏感度和特异性，在疾病的早期和晚期，灵敏度分别为75%和100%，其特异性可达到90%-99%。不仅如此，VlsE抗原除了C6区域外，其它的免疫显性表位同样可提高检[83-85]测的灵敏度。ELISA检测的优点在于操作简便，可进行定量分析，自动化程度高。不足在于[80]ELISA检测缺乏标准化。对于慢性游走性红斑患者，血清学检测灵敏度低并且可能[83,86]出现假阳性结果，因此不推荐用于莱姆病慢性游走性红斑病人的常规性诊断。2.2.2间接免疫荧光试验IFA是检测莱姆病螺旋体常用的方法，是将培养的螺旋体固定到玻片上，与稀释的54 待测血清混合，向其中加入用异硫氰酸荧光素标记的抗人IgG或IgM，使用荧光显微镜对抗体进行检测。通常待测血清抗体效价IgM1:128或IgG1:256时可确诊为莱姆病。但由于该方法需要荧光显微镜和训练有素的工作人员，且主观性强，以致IFA在临床莱姆病的诊断应用中受到了限制。后来，该方法改进为变异的荧光抗体试验（FIAX），[80]利用自动化系统读取荧光的强弱，在当时适用于临床莱姆病的诊断。2.2.3蛋白质印迹法在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来的免疫印迹试验（Westernblottest,WB）是一项检测蛋白质的技术，它将SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的高特异性相结合，用于莱姆病螺旋体的检测。但是由于伯氏疏螺旋体种[80,87]内及种间抗原的多样性，其抗原的选择直接影响莱姆病螺旋体的检测。比较全细胞抗原，重组抗原的选择可使WB检测的灵敏度从63.8%增加到86.1%，并且易于标准化，[84]但其检测的特异性不会改变。在神经莱姆病早期，重组抗原和联合抗原的使用使IgG[83,87]抗体检测的敏感性从68.8%增加到91.7%。WB存在视觉评分、条带强度的主观评价（这可能导致WB结果的假阳性）、成本高、同一临床表现的莱姆病患者的抗体反应不同以及抗原的来源和制备缺乏标准化等缺点，且莱姆病同其他感染性疾病及非感染性疾病存在共同抗原，易出现假阳性。单克隆抗体的使用以及条带强度曲线的制定或许可以使这些问题得到解决。2.2.4胶体金免疫层析法(GICA)抗体标记的金纳米颗粒在生物互作领域中引起了极大的兴趣，抗体标记的金纳米颗粒可用于给药、基因遗传、组织细胞分析用的生物探针，尤其是对一些特殊抗原的检测，[88]如：乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）。抗原-抗体复合物在生物化学和生物学中是一种基本现象，而且绝大部分生物检测都是基于抗原-抗体复合物反应对[89][90]。2001年，Maria首次应用莱姆病螺旋体的重组抗原建立了胶体金免疫层析检测方法，选择3个不同的测试点共120（100份阴性，20份阳性）份人血清样本，快速试验结果的整体的一致性是97%(97/100)；并且阳性样品的灵敏性和阴性样品的特异性与商业ELISA的灵敏性一致。2.2.5免疫渗滤试验免疫渗滤试验是以碳酸纤维素膜为固相载体，将已知抗原或抗体作为探针包被在碳酸纤维素膜上，加入待测样本通过微孔膜的毛细作用，待测样本在渗滤的同时，与NC膜上相应探针快速结合，以胶体金标记物进行显色反应后，就形成了肉眼可见的红色斑[91][92]点，从而达到检测目的的快速免疫检测技术。早在20世纪80年代，Spielberg等就建立了用于检测HIV的免疫渗滤技术。免疫渗滤技术随着纳米金等技术的发展被55 用于多种病原微生物的检测，如：HIV、肝炎病毒（HepatitisAvirus,HAV）、梅毒螺[93-100]旋体（Treponemapallidum,TP）等。根据反应原理以及操作简便的优势，免疫渗滤技术作为一种检测技术存在一定的优势，应用前景宽广。2.3联合检测莱姆病通常通过典型的临床表现进行诊断和治疗，而实验室检测技术对非典型临床表现病人的确诊有很大帮助。为了提供患者一个客观的病原体感染的证据，通常采用多种检测方法来提高诊断的敏感性。莱姆病游走性红斑患者没有单一的诊断方法是可行的，需进行多种方法的联合检测。56 3小结莱姆病是一种由硬蜱传播的全球性人畜共患疾病，可以引起多系统、多脏器的损害，严重者终生致残甚至死亡。临床上通过患者的发病史、蜱接触史、临床表现、体格检查及必要的实验室诊断来确诊。随着莱姆病螺旋体研究的深入，其他快速、准确、新型的诊断技术也已经发展起来，有利于临床实验室对该疾病的监测，然而，这些新方法有待进一步的研究，评估和完善。57 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43女38半农半牧16144男42半农半牧161+45男57半农半牧161++46女46半农半牧16147女62半农半牧161+48男47牧民16149男50牧民16150女43牧民161+51女45牧民16152男43半农半牧16153男46牧民161+54男40牧民16155女46半农半牧16156男42半农半牧16157男50半农半牧161+58男46牧民161+59女38半农半牧16160女44半农半牧16161男46牧民16162男36半农半牧161+63男44牧民16164女43半农半牧16165男43半农半牧16166男55牧民16167男36牧民161+68男63半农半牧16169男49牧民16170女48牧民161+71男37牧民161++72女37半农半牧16173男39牧民16174男43半农半牧16175男50牧民161+76男45牧民161+77女45牧民161+78男36牧民16179男37半农半牧161+80女31半农半牧16181男49半农半牧161+82男45半农半牧16183男46牧民16184男59半农半牧161+85女53牧民161++86男44半农半牧161+87男27半农半牧16188男51牧民16189男50牧民161+90女37牧民16165 91男39半农半牧16192男58半农半牧16193男34牧民16194男56半农半牧16195女37牧民16596女63半农半牧165+97女44半农半牧16598女49牧民16599女48牧民165100男49半农半牧165+101男47牧民165+102女42半农半牧165103女39半农半牧165104女39半农半牧165105男52牧民165106男47半农半牧165107女45半农半牧165+108男49牧民165+109男49半农半牧165+110男49牧民165111男58半农半牧165+112女48牧民165113男42半农半牧165114女44牧民165115男48牧民165+116男53牧民165117女49半农半牧165118女39半农半牧165119女45牧民165+120男47半农半牧165121女45半农半牧165122男48牧民165123男24牧民165124男44半农半牧165125男50牧民165126女50牧民165127男43牧民165++128女43牧民165+129男51半农半牧165+130女48牧民165131男50半农半牧165+132女43牧民165133男47半农半牧165+134男46牧民165135女45牧民165136男61半农半牧165+137女43牧民165+138女42半农半牧16566 139男41牧民165140女38半农半牧165141男30牧民165142女31牧民165+143女45牧民165144男52半农半牧165145女40半农半牧165+146女43半农半牧165+147男40牧民165+148男45半农半牧165149女44牧民165150男32半农半牧165151男35牧民165152男32半农半牧165+153女52牧民165+154女45半农半牧165155男55半农半牧165156女47牧民165+157女52牧民165158女48半农半牧165159女47半农半牧165160女48牧民165161女43半农半牧165162女47半农半牧165163女41半农半牧165164男40牧民165165男48牧民165166女48半农半牧165167女46牧民165168女44牧民165169男44半农半牧165170女30半农半牧165171男38牧民165172男34半农半牧165173女44半农半牧165174女37半农半牧165175男38牧民165+176男17半农半牧165177女46半农半牧165178女60半农半牧165+179女49牧民165180女39半农半牧165181男48半农半牧165182男29半农半牧165183女30牧民165184男54牧民167185男41牧民167186男49半农半牧167+67 187男52半农半牧167188男53牧民167189男45牧民167+190男69牧民167+191女45半农半牧167+192女58半农半牧167193男50牧民167++194男42半农半牧167195男45牧民167196男40牧民167197男46半农半牧167198男50牧民167+199女48半农半牧167+200女25半农半牧167+201男40牧民167202男44牧民167203女47半农半牧167204男40牧民167205女50牧民167206男48牧民167+207男48牧民167208女48牧民167209男43牧民167210男40牧民167++211女47牧民167212女47牧民167213女41半农半牧167214女40牧民167214女45牧民167216男49半农半牧167217女38牧民167218男49牧民167219女47牧民167+220女56半农半牧167221女52半农半牧167222女50半农半牧167223男44牧民167+224男36半农半牧167225男50半农半牧167226女48牧民167227男27牧民167+228男23牧民167++229男51牧民167230女40半农半牧167+231女40兽医167232女46牧民167233女38半农半牧167234女39半农半牧16768 235男45半农半牧167236男38牧民167237男47牧民167++238男43牧民167239男45半农半牧167240男44半农半牧167241男57半农半牧167242男47牧民167243男44牧民167244男45牧民167245女52半农半牧167246男48牧民16769 致谢本文是在导师王远志副教授的悉心指导下完成的。导师在科学上敏锐的洞察力，在科研中不断开拓创新的智慧是这项研究顺利完成的主要保障。从论文的选题、实验方案的设计、资料的收集和整理、论文的撰写与修改都倾注了老师辛勤的汗水和心血。导师严谨的治学态度，渊博的专业知识、执着的科研精神，严谨求真的学术风范是我学习的楷模，使我受益终身。三年来，导师在学业上给予的谆谆教诲，在生活中给予的热情关怀，令我难以忘怀。至此论文完成之际，谨向辛勤的恩师致以最诚挚的谢意。感谢张万江教授、陈雪玲教授、袁俐教授、李永祥教授、曹旭东副教授、姜素华副教授以及本教研室的其他老师，对我学术上的指导及生活中的关心与帮助。感谢师姐杜景云，师妹赵姗姗、郭利萍，师弟王安东、李红雨和本教研室的其他同学在实验及论文过程中给予的无私帮助。感谢病原生物学与免疫学实验室所有师弟师妹们，你们的帮助和鼓励，使我愉快的度过了三年难以忘怀的研究生生活。感谢家人和朋友对我的支持与鼓励，因为他们的鼓励和无私的帮助，才使我能够集中精力投入到课题研究中。最后，再次感谢所有关心、帮助我的老师、同学、家人和朋友！牟路萌2016年11月70 作者简介牟路萌，女，生于1989年9月，籍贯山东。2012年毕业于济宁医学院临床专业。2013年9月进入石河子大学医学院，从事地方性感染免疫研究。在学期间主要参与的研究项目1.参与国家科技支撑项目中新疆地区常见疾病防治适宜技术研究与应用（No.2013BAI05B05)的部分研究工作。2.参与国家自然科学基金项目(No.81560338)的基础研究的部分研究工作。在学期间发表的文章1.牟路萌，张亚丽，王丽娜，等.合成七肽在牛种布鲁氏菌RB51株侵染人单核细胞系THP-1过程中对MAPK通路的影响[J].中国病原生物学杂志,2016,11(2):103-6.2.WangYuanzhi,MuLumeng,etal.Abroad-rangesurveyofticksfromlivestockinNorthernXinjiang:changesintickdistributionandtheisolationofBorreliaburgdorferisensustricto[J].ParasitVectors.2015Sep4;8:449.doi:10.1186/s13071-015-1021-0.3.GuoLiping,MuLumeng,etal.RickettsiaraoultiiinHaemaphysaliserinaceifrommarbledpolecats,China-Kazakhstanborder[J].ParasitVectors.2015Sep17;8:461.doi:10.1186/s13071-015-1065-171 7272