一起布鲁菌病的调查分析及布鲁菌病检测方法的比较

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分类号S855.1学校代码10129UDC号614.4学号2009201080牛支原体PCR检测方法的建立及流行病学调查一起布鲁菌病的调查分析及布鲁菌病检测方法的比较SurveyandAnalysisofanBrucellosisOutbreakandComparisonofMethodsinDiagnosisforBrucellosis申请人：李慧学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病学指导教师：关平原教授范伟兴教授论文提交日期：二〇一二年五月 摘要布鲁菌是一种不运动的革兰氏阴性的胞内寄生球杆菌，可以在很多真核细胞中存活繁殖。布鲁菌病是由布鲁菌引起的以波浪热或地中海热为特征的高度传播的动物源性疾病，可以感染人以及多种动物。采集中国北方某发生流产的牧场的6577份奶牛血清样品，用虎红平板凝集试验(RoseBengalplatetest,RBPT)、间接酶联免疫吸附试验(indirectenzymelinkedimmunosorbentassay,i-ELISA)、试管凝集试验(standardagglutinationtest,SAT)、竞争酶联免疫吸附试验(competitiveenzymelinkedimmunosorbentassay,c-ELISA)四种方法检测，阳性率为12.56%。采集流产胎儿的肝、脾、肺等12份组织样品进行细菌学试验，结合多重PCR、AMOS-PCR、MLVA确定此次流产为布鲁菌病，分离鉴定布鲁菌为牛种布鲁菌3型。结合背景资料，进一步分析了此次布鲁菌病爆发的原因和特征。用RBPT、i-ELISA、SAT、c-ELISA检测873份奶牛血清，分别检出阳性血清543份、501份、460份、500份，阳性率分别是62.20%、57.39%、52.69%、57.27%。RBPT、SAT与i-ELISA、c-ELISA试剂盒检测结果相比一致率较高,但RBPT有较高的假阳性，SAT有较高的假阴性。在布鲁菌病检疫时可选择特异性好的RBPT抗原进行初筛,阳性结果用i-ELISA或者c-ELISA进行确诊。i-ELISA检测试剂盒在牛种布鲁菌病检测中有着重要作用，尤其适用样品量较大的时候。本试验以c-ELISA为标准，分析比较了Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ三个公司的i-ELISA试剂盒的敏感性和特异性，结果Ⅱ公司的i-ELISA试剂盒敏感性最高。关键词：布鲁菌病；血清学；细菌学；分离鉴定 DiagnosisofanBrucellosisOutbreakandComparisonofMethodsinDiagnosisforBrucellosisAbstractBrucellaisasmallinvasive,non-motile,gram-negativecoccobacillusthatmultipliesandsurviveswithinabroadrangeofeukaryoticcells.Brucellosis,alsoknownasundulantfeverorMediterraneanfever,iscausedbythisgenusofbacteriaandisstilloneofthemajor,highlytransmissible,zoonoticdiseasesaffectingpeopleandanimals4kindsofserologicaltests,asRoseBengalplaneTest(RBPT)、indirectenzymelinkedimmunosorbentassay(i-ELISA)、standardagglutinationtest(SAT)andcompetitiveenzymelinkedimmunosorbentassay(c-ELISA)wereusedtodetect6577serumsamplesfromdairycowsonfarmwhereabortedthatinthenorthofChina.Positiverateofserologicaltestwas12.56％.12relativesamplesoflung,liver,spleenetc.inabortedfetusofdairycowwereselectedtoperformbacteriologydetectionandalsobymultiplexPCR,AMOS-PCR,MLVA.4pathogenicstrainswereisolatedandcultured.ItwasconfirmedasbrucellosisandidentifiedasB.abortusbiovar3.Thecausesandcharacteristicsofbrucellosisoutbreakwereexploredwiththebackgroundinformation.ThenumberofpositivesamplesdetectedbyRBPT、i-ELISA、SAT、c-ELISAwere543、501、460、500,andthepositiveratewere62.20%、57.39%、52.69%、57.27%.TheRBPT,SAT,i-ELISAandc-ELISAindetectingtheinfectedcattle,almostobtainedhighconsistencyrate,butRBPThadhigherfalsepositiverateandSAThadhigherfalsenegativerate.ThedatasuggestedthatRBPTscreeningtestcouldbeusedinthefield,andthepositiveresultsshouldbefurtherconfirmedbyi-ELISAorc-ELISA.Thei-ELISAkitevaluatedinthisstudywasthoughttobeavaluabletoolforthediagnosisofbovinebrucellosis，especiallywherelargenumbersofserumshouldbetestedtoobtainsuchinformation.Thesensitivityandspecificityofi-ELISAkitsfromⅠ,Ⅱ,Ⅲ,threecompanieswereevaluatedcomparedwithc-ELISA.Theresultsshowsthatthei-ELISAkitfromtheⅡcompanyisthemostsensitiveofall.Keywords：brucellosis；serological；bacteriology；isolationandidentificationDirectedby：Prof.GUANPingyuanProf.FANWeiXingApplicantforMasterdegree：LiHui(preventiveveterinaryscience)(CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot010018,China) 目录1引言................................................................11.1布鲁菌病概述...................................................11.2布鲁菌病的病原学...............................................11.2.1形态及染色特性...............................................11.2.2培养及生化特性...............................................11.2.3分型.........................................................11.2.4抗原成分.....................................................11.2.5致病力.......................................................21.2.6抵抗力.......................................................21.3流行病学.......................................................21.3.1易感动物.....................................................21.3.2传染源.......................................................21.3.3传播途径.....................................................31.3.4流行特征.....................................................31.4致病机理.......................................................31.5诊断方法.......................................................31.5.1血清学诊断...................................................31.5.2PCR检测方法..................................................71.6本研究的目的和意义............................................102一起奶牛布鲁菌病的调查分析........................................112.1试验材料......................................................112.1.1菌种........................................................112.1.2主要试剂....................................................112.2饲养发病情况..................................................122.3试验方法......................................................132.3.1血清学检测..................................................132.3.2细菌培养与分离鉴定..........................................152.3.3PCR检测.....................................................162.4试验结果......................................................182.4.1血清学检测结果..............................................182.4.2细菌分离培养................................................18 2.4.3PCR检测结果..................................................202.5讨论...........................................................213四种布鲁菌病血清学检测方法的比较...................................233.1试验材料.......................................................233.1.1主要试剂.....................................................233.1.2主要仪器.....................................................233.1.3血清.........................................................233.2试验方法.......................................................233.3试验结果.......................................................233.4讨论...........................................................244三种i-ELISA试剂盒的比较...........................................254.1试验材料.......................................................254.2试验方法.......................................................254.3试验结果.......................................................255结论...............................................................28致谢...............................................................29参考文献........................................................30作者简介........................................................41 插图和附表清单1.图2-1未知菌的多重PCR鉴定············································202.图2-2未知菌的AMOS-PCR鉴定···········································203.图2-3未知菌的MLVA鉴定···············································214.图2-4未知菌的MLVA鉴定···············································215.图4-1三个公司生产的i-ELISA试剂盒的详细检测结果·······················266.表2-1奶牛引进情况··················································127.表2-2奶牛组成情况··················································128.表2-32009-2010年虎红平板凝集试验检测结果·····························129.表2-4血清学检测结果················································1810.表2-5血清学检测详细结果············································1811.表2-6生化试验检测结果···············································1912.表2-7布鲁菌的分类表················································1913.表3-1609份奶牛血清用4种方法检测的结果································2414.表4-1四种试剂盒检测结···············································2515.表4-2i-ELISAⅠ试剂盒检测结果·········································2616.表4-3i-ELISAⅡ试剂盒检测结果·········································2717.表4-4i-ELISAⅢ试剂盒检测结···········································27 缩略语表RBPT(therosebengalplateagglutinationtest)虎红平板凝集试验SAT(theserumagglutinationtest)试管凝集试验CFT(thecomplementfixationtext)补体结合试验FPA(thefluorescencepolarisationassay)荧光偏振试验iELISA(theindirectenzyme-linkedimmunosorbentassay)间接酶联免疫吸附试验cELISA(thecompetitiveenzyme-linkedimmunosorbentassay)竞争酶联免疫吸附试验MRT(themilkringtest)全乳环状试验EB(Ethidium)溴化乙锭PCR(polymerasechainreaction)聚合酶链式反应HRP(Horseradishperoxidase)辣根过氧化物酶Omp(outermembraneprotein)外膜蛋白LPS(lipopolysaccharide)脂多糖bp(basepair)碱基对Ig(immunoglobulin)免疫球蛋白h(hour)小时mg(milligram)毫克ml(milliliter)毫升μg(microgramme)微克μl(microlitre)微升LB(Luria-bertinimedium)LB培养基OD(opticaldensity)光密度min(minute)分钟s(second)秒mol(mole)摩尔DNA(deoxyribonucleteicacid)脱氧核糖核酸EDTA(ethylenediaminetetraceticacid)乙二胺四乙酸 内蒙古农业大学硕士学位论文11引言1.1布鲁菌病概述布鲁菌病(Bruce11osis)是由布鲁菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患传染病。在《中华人民共和国动物防疫法》中被列为二类动物疫病。人类、多种家畜和野生动物均可感染布鲁菌病，引起的临床症状和病理损伤等非常相似，可以导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题[1,2]。1.2布鲁菌病的病原学1.2.1形态及染色特性布鲁菌属于胞内寄生的，大小为0.5～0.7×0.6～1.5μm的球杆状或短杆状的革兰氏阴性菌[1]，较多见单在，很少成双、短链或小堆状。形态容易受外界环境影[3]响而呈现多态性。布鲁菌无芽孢、荚膜、鞭毛，且无质粒。1.2.2培养及生化特性布鲁菌生长繁殖较慢，对营养要求较高，有的需要5～10天的生长，有的需要长达20～30天的时间，尤其是从机体或外环境中刚分离得到的初代菌。在实验室长期传代保存的菌株，仅需要12～72h的培养就可以获得生长良好的菌落。布鲁菌属于兼性需氧菌，很难在普通培养基上生长，最适生长温度为36℃～37℃，最适pH值为6.6～7.4，并且大多数菌株生长需要5～10％CO2的环境，还需要各种氨基酸、维生素、生物素、菸草酸、泛酸钙等[4,5,10]。布鲁菌的过氧化氢酶反应为阳性，氧化酶通常也为阳性，但沙林鼠种和绵羊附睾种布鲁菌的为阴性。触酶阳性，不水解明胶或浓缩血清，不溶解红细胞，不产生吲哚，不液化明胶，不凝固牛乳，吲哚、甲基红和VP试验阴性，不利用柠檬酸盐，不能从O-硝基酸-B-D-半乳糖苷中释放O-硝基酸。1.2.3分型根据生化反应特点和菌体表面结构的不同将布鲁菌分成了6个不同的种，分别是羊种布鲁菌(B.melitensis)、牛种布鲁菌(B.abortus)、猪种布鲁菌(B.suis)、绵羊种布鲁菌(B.ovis)、沙林鼠种布鲁菌(B.neotomae)和犬种布鲁菌(B.canis)[6,7]。后来有人又从海洋哺乳动物体内分离出了不同于上述菌种的布鲁菌[8]，并且建议将其划分为鲸种布鲁菌和鳍种布鲁菌，但意见尚未统一。1.2.4抗原成分布鲁菌有三种抗原成分，分别是A(流产型)、M(马尔他型)和G(共同抗原)。一般牛种菌主要的抗原成分是A抗原，A:M为20:1；羊种菌主要的抗原成分是M抗原， 2布鲁氏菌病检测方法的比较及一起布鲁氏菌病的诊断M:A为20:1；猪种菌的A:M是2:1。布鲁菌的抗原与伤寒、副伤寒、沙门氏菌、霍乱弧菌、变形杆菌OX19等抗原的某些成份相同。1.2.5致病力布鲁菌致病力与其新陈代谢过程中透明质酸酶、过氧化氢酶、尿素酶、琥珀酸脱氢酶及细胞色素氧化酶等酶系统有关。布鲁菌的毒力与其LPS和外膜蛋白(OMP)有关。S型布鲁菌毒力明显较R型布鲁菌高，R型布鲁菌表面缺乏或缺失S型菌的LPS，所以R型菌多数是低毒或无毒菌[9]。1.2.6抵抗力布鲁菌的抵抗力比较强，在pH7.0和低温情况下可以存活较长的时间，在病畜的分泌物、排泻物、污染的土壤、水及死畜的脏器中可以存活大概1～4个月，在食品中可以生存大概2个月。布鲁菌在自然界容易受气温、湿度、酸碱度的影响，对消毒剂比较敏感。60℃30min、70℃5min，日光下曝晒4h，或者用来苏儿1h之内即杀死该菌[11,12]。1.3流行病学布鲁菌病流行很广泛，几乎遍布世界各地，已经有多个国家和地区存在人畜布鲁菌病的流行[13]。过去在我国的内蒙古、东北、西北等牧区布鲁菌病流行较广，在北方地区也存在散发[14]。我国人畜布鲁菌病疫情从1995年以来出现明显回升趋势，局部地区甚至出现爆发，疫情形势十分严峻[15]。1.3.1易感动物目前已知有包括禽类在内的60多种动物对布鲁菌存在不同程度的易感性。羊种布鲁菌对绵羊、山羊、牛、鹿及人的危害较大；牛种菌对奶牛、水牛、牦牛、马、人的危害较大；猪种菌则对猪、野兔、人等的危害较大，也可以感染牛，但还没有关于流产的报道[27,28]。布鲁菌的致病性受家畜生理状况的影响，如生殖系统发育还不健全的幼畜可以带菌却不会发病；老龄家畜对布鲁菌的易感性较低，成年的尤其是处在妊娠期的家畜对布鲁菌的易感性最高。1.3.2传染源布鲁菌病主要的传染源是发病或者带菌的羊、牛、猪，其次是犬。布鲁菌可以通过脓汁、乳汁、生殖道分泌物或流产的死胎等排出体外，从而使饲料、饮水和周围的环境受到污染。布鲁菌的转移现象存在于各种动物间，如牛、猪等感染布鲁菌 内蒙古农业大学硕士学位论文3可以从羊中获得；人类感染布鲁菌病机会的增加与其密切接触的羊、牛、猪等家畜及其产品等有关；另外，个别地区的鹿和犬也成为人间布鲁菌病的主要传染源[16]。1.3.3传播途径布鲁菌病主要经皮肤黏膜、消化道传播，也可以污染环境后形成气溶胶，通过呼吸道感染，还可以经过交媾、结膜或者吸血昆虫等传播[17]。1.3.4流行特征布鲁菌病多为散发，一年四季均可发病，随母畜产仔季节变化而明显变化。发病率从高到底依次是牧区，农区，城市。在春末夏初的发病高峰季节可以出现点状暴发流行。布鲁菌病的流行强度与布鲁菌种型、气候、牧场管理情况等有关。布鲁菌病的暴发流行通常出现在新疫区，并且病菌的毒力有所增强，急性病例较多。布鲁菌病在人与人之间传播的报道较少。人感染机会在动物流产或分娩时最多。畜牧兽医人员、屠宰工人和皮毛工等职业人的发病率明显较一般人群的高[18]。1.4致病机理布鲁菌可以通过鼻、咽、口腔感染动物，主要是通过黏膜上皮入侵。S型布鲁菌侵入动物机体的黏膜屏障后，通过淋巴管到达局部淋巴结，然后被吞噬细胞所吞噬，寄生于细胞内。若如果布鲁菌没有被吞噬细胞杀灭，那么在淋巴结可以生长繁殖形成感染灶[29]。机体各因素的作用下可以破坏菌体，使布鲁菌死亡，从而释放出内毒素等成份，导致广泛性的组织病理损伤，从而引起各种临床症状，另外，感染灶的病菌一段时期的生长繁殖后可以再次入血，导致疾病反复发作，成为慢性感染。布鲁菌在巨噬细胞内的存活被认为是慢性感染的建立，是细菌逃逸宿主防御的一种细胞内寄生机制。巨噬细胞内的吞噬体对布鲁菌有保护作用，因为巨噬细胞内的吞噬体可以迅速酸化使布鲁菌在其内能够存活和复制[19，30]。1.5诊断方法1.5.1血清学诊断1.5.1.1血清学诊断的基础血清学方法检测布鲁菌抗体一般有相似的免疫基础，主要是通过检测布鲁菌外膜的光滑型脂多糖O抗原(OPS)来检测S型布鲁菌[26]，检测粗糙型脂多糖(RLPS)来确定R型布鲁菌菌种[20,21]。RLPS可用来鉴别小肠耶尔森菌O:9等有交叉反应的细菌[22]。牛感染流产布鲁菌5～15天后首先产生IgM抗体，紧接着产生IgG1，然后是IgG2[23–25]和IgA抗体。IgM抗体的检测是适合感染初期的，因为有其他细菌的抗原与OPS 4布鲁氏菌病检测方法的比较及一起布鲁氏菌病的诊断相似，可能会产生交叉反应[31]，出现假阳性，从而影响检测的特异性。IgG2和IgA抗体产生的较晚，检测这些抗体会降低试验的敏感性。因此最有效的血清学检测的[25]抗体是IgG1。1.5.1.2平板凝集反应检测布鲁菌病的平板凝集反应(Huddleson反应)操作简单、快速、易掌握，适合做筛选性的检查，不适合作确诊的可靠依据。1.5.1.3虎红平板凝集试验诊断布鲁菌病主要用的虎红平板凝集试验(Rosebengalplatetest，RBPT)的敏感性是21～98.3%,特异性是68.8～100%[32]。抗原的来源不同，所用的平板光滑度、清晰度不同等多几方面原因导致了报道的RBPT的敏感性变化范围大。RBPT所用的抗原被酸化，与被检血清作用时能抑制血清中IgM类抗体的凝集活性，提高了IgG1的凝集水平，从而减少了交叉反应，提高了特异性，并且合适的稀释度也可以增加其特异性。RBPT克服了前带反应、抗体封闭、没有凝集抗体三方面问题，可以不和别的方法配合而单独应用，是小型试验室的理想检测方法[33]。RBPT有时会因S19疫苗免疫，交叉反应，发生严重溶血，或者抗原抗体反应超过4min后会出现纤维素的凝集块而导致假阳性结果，尤其可能会产生假阴性反应，主要是因为抗体亲和力低或者滴度低而出现假阴性结果[34,35]。虽然有这些缺点，但与SAT相比，RBPT操作更简便、快速，且易掌握，适用于基层大面积的检疫，所以RBPT仍然是布鲁菌病的参考检测方法[36]。1.5.1.4试管凝集试验试管凝集试验(Standardagglutinationtest，SAT)的敏感性是29.1～98.3%,特异性是99.2～100%[32]，简便易行，适用于实验室检测，一直是许多国家布鲁菌病的常规血清学检测方法，我国也将SAT定为法定检测试验。SAT能有效检测IgG水平，尤其是IgG1，因此SAT具有较高特异性。加EDTA、2-巯基乙醇、或者二硫苏糖醇都可以增加SAT的特异性。因为R型布鲁菌菌体抗原能自动凝集，所以SAT一般不用于检测绵羊副睾种布鲁菌和犬种布鲁菌。SAT有时出现前带现象和封闭现象，易出现假阴性结果，因此常常与其他方法结合应用。采用麦氏比浊仪比浊法可以调整肉眼观察结果带来的误差[37]。1.5.1.5酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)是世界上比较成熟布鲁菌病的检测方法，包括间接酶联免疫吸附试验(Indirectenzymelinked 内蒙古农业大学硕士学位论文5immunosorbentassay，i-ELISA)和竞争酶联免疫吸附试验(Competitiveenzymelinkedimmunosorbentassay，c-ELISA)。1976年，GarinBastuji等首次用ELISA[38]方法检测布鲁菌病，发现ELISA的敏感性比试管凝集反应高出10～100倍。许多学者在此之后相继用ELISA方法检测人、动物是否患有布鲁菌病，研究结果均表明，ELISA方法的敏感性和特异性比传统的SAT、CFT方法都高[39]。把BP26作为包被抗原的i-ELISA方法检测布鲁菌病比SAT方法检测更敏感[41]。二十世纪末，美国科学家Romero等建立的i-ELISA方法用于检测布鲁菌病的特异性抗体，检测结果与PCR方法的符合率高达91％，并且证明了i-ELISA方法的检出率比PCR方法的检出率高[42]。i-ELISA方法不能区分接种牛种布鲁菌S19或羊种Revl疫苗产生的抗体与自然感染产生的抗体[43]。市售较多的i-ELISA试剂盒是以光滑型脂多糖(sLPS)或者O抗原多糖(OPS)为包被抗原的，敏感性等于或高于RBPT方法，[44]但会出现假阳性结果。c-ELISA方法的特异性较强。加拿大科学家NielsenK等利用单克隆抗体M84进一步提高了c-ELISA方法的特异性，优化之后的敏感性达到了100%，特异性达到了99.7%[45]。九十年代末加拿大科学家Nidia建立了一种检测人血清样品的c-ELISA方法，特异性和敏感性均较高[46]。2008年，AMinas等将c-ELISA方法用于绵羊和山羊的检测，其敏感性与RBPT和CFT差异不显著，并且认为c-ELISA方法在羊种布鲁菌的检测中具有很好的应用前景[47]。抗原的选择对于ELISA检测方法的建立非常重要，Cakan等应用商品化的布鲁菌IgGELISA和IgMELISA试剂盒检测人布鲁菌病的试验表明，当IgGELISA和IgMELISA同时应用时，可以提高敏感性[40]。用HRP标记的蛋白A偶合物建立的ELISA方法能用来确定是否经过免疫，或者用来区别野毒感染还是免疫后的阳性血清，敏感性和特异性分别为97.6%，94.6%[48]。此种ELISA方法的依据是蛋白G与牛IgG(包括IgG1和IgG2)反应，蛋白A只特异性的与IgG2反应，且IgG2的水平随感染布鲁菌抗原量的增加递增。2007年NielsenK等建立了通过重组蛋白A/G和HRP形成的共轭物作为二抗的等二代c-ELISA检测方法，用来检测牛布鲁菌的抗体，敏感性和特异性与以前的c-ELISA相当，并且能鉴别是否免疫过牛种布鲁菌S19疫苗株[49]。因为各个实验室的条件不同，所以还没有建立起标准和标准试剂[49]。制作基因缺失的标记疫苗可以区别疫苗免疫和野毒感染，且疫苗效果不受影响。然后以缺失基因为包被抗原建立的ELISA方法就可以用于区分疫苗免疫和野毒感染。例如，研究较多的BP26基因缺失的疫苗，与其配套的BP26作为包被抗原的ELISA方法[50]。1.5.1.6补体结合试验补体结合试验(Complementfixationtext，CFT)是重要的诊断布鲁菌病的方法，是国际贸易中指定的用于牛、羊、绵羊副睾种布鲁菌病的确诊试验。其敏感性是 6布鲁氏菌病检测方法的比较及一起布鲁氏菌病的诊断23.0～97.1%，特异性是30.6～100%[32]，与布鲁菌病的临床表现、病期和牲畜排菌、带菌的一致性较高，并且与抗球蛋白试验、巯基化物的凝集试验的吻合率较高。近年来常用作区别自然感染和人工免疫的有效手段。另外，冷补体结合反应的敏感性高于温补体结合反应，常用于绵羊感染绵羊副睾种布鲁菌病的检测[51-54]。CFT方法操作复杂，需要的试剂较多，因此不适合大面积检疫采用。凝集抗体有出现早、消退早，补体抗体出现晚、消退迟的现象[55]。CFT不能区分S19免疫和野毒感染，也不适合作为猪的个体诊断，因为猪的补体会干扰豚鼠补体而使CFT的敏感性降低49%[56]。RBPT方法与CFT方法结合应用的敏感性很好，但特异性不足，不能区分出假阳性动物[57]。c-ELISA方法和CFT方法配合使用，结果比c-ELISA和RBPT两种方法配合使用的特异性更高[36]。1.5.1.7荧光偏振试验荧光偏振试验(FluorescencePolarisationImmunoassay，FPA)的敏感性是96.1%，特异性是97.9%[58]，是近年发展起来的一种诊断布鲁菌病的方法。用于牛布鲁菌病抗体检测时与i-ELISA的敏感性相当，对经S19疫苗免疫牛的血清抗体检测时特异性可以达到99%，但尚未确定是否存在假阳性的问题[59,60]。FPA的结果排除了主观上的错误。利用从布鲁菌中提取的OPS作为抗原，FPA已经显示出很好的结果，还可以根据敏感性、特异性的需要调节临界值。FPA已用于猪种布鲁菌病的鉴别诊断，可排除与耶尔森氏菌的交叉反应，而且有些还可以区分疫苗免疫产生的抗体。2000年GallD等用FPA检测牛种布鲁菌，并与其它血清学检测方法进行了比较。可以作为布鲁菌病的确诊试验。把毛细管技术用于FPA，称作毛细管免疫荧光偏振试验(FPAc)，敏感性为100%，特异性为99.05%[61]。1.5.1.8滴金免疫测定法滴金免疫测定法(Dot-immunogoldfiltrationassay，D1GFA)，其敏感性95.35%，特异性是98.99%，D1GFA是一项继免疫荧光、免疫酶、放射免疫三大标记技术之后发展起来的免疫标记技术。而且快速、简便，只需要2min，不需要任何仪器设备，结果清晰，显色不褪色，试剂稳定[62]。1.5.1.9其他血清检测方法布鲁菌病的IgM或IgG的侧向层析法(LFA)是一种免疫层析方法简化了的ELISA方法，有很大的应用潜力，敏感性和特异性很高，在流行区域可以简单快速诊断布[63,64]鲁菌病。缺点是判断结果比较主观，试剂费用较高。[65]化学发光法通过反应使供体和受体结合，经过激光激发，在阳性反应中受体 内蒙古农业大学硕士学位论文7形成单态氧转换成光发出，有明确的指标。把布鲁菌基因作为淋巴细胞刺激物的干扰素试验，可以区别猪感染的小肠耶尔森菌O:9，特异性比别的血清学方法高[66,67]。库姆斯试验虽然敏感性，特异性较高，但容易主观读数错误，试验操作技术性也强。免疫捕获试验可以鉴定IgG，IgM，IgA，和封闭的抗体[68]，敏感性为97.29%，特异性为97.08%，明显优于SAT，且操作简单，不存在主观读数的错误，可重复性好[69]。1.5.1.10传统血清学检测方法存在的主要问题有些革兰氏阴菌的LPS结构与布鲁菌相似，易引起交叉反应，产生假阳性结果；避免假阳性结果常用的是降低反应的PH值，热处理血清，增加盐浓度等。另外，抗体浓度低和封闭抗体等多种原因可导致假阴性结果。1.5.2PCR检测方法1.5.2.1PCR检测方法的重要性虽然诊断布鲁菌病的金标准仍然是血液或组织细菌培养，但其需要时间长、技术性强、敏感性低，对实验室有严格的生物安全规定，对人存在一定的危险性。以查抗体为基础的血清学检测与病畜感染或免疫的时间长短有关，并且存在交叉反应。分子技术的不断发展可以快速检测布鲁菌基因型，敏感性和特异性得到不断提高，例如全基因组比较研究，单核苷酸多态性(SNP)研究，多位点可变数串联重复序列研究(VNTR，MLVA)，还有不同的实时PCR方法都有了很大发展。1.5.2.2一对引物的PCR方法二十世纪九十年代以来，PCR检测方法研究进展迅速。1992年BailyGG等设计引物用PCR方法来检测羊种和牛种布鲁菌BCSP31基因[70]。1999年SerpeL等用PCR方法快速检测软质干酪和牛乳样品，省略了纯化布鲁菌的过程[71]。我国唐浏英等设计引物对流产布鲁菌外膜蛋白OMP36基因进行了PCR检测，结果6个布鲁菌种均有阳性扩增，而与布鲁菌抗原关系接近的其它菌种如小肠结肠炎耶尔森氏菌O:9、O:3、嗜肺军团菌L11、大肠杆菌O157等均无扩增[72]。针对rRNA16S～23S之间的区域设计引物进行PCR可以区别海洋种布鲁菌和陆生动物种布鲁菌[73,74]。KeidLB等的试验表明可以用阴道拭子做PCR来确诊母畜感染布鲁菌病，尤其是血液细菌培养或PCR为阴性的动物[75]。邱昌庆等建立的乳牛原乳中布鲁菌外膜蛋白(OMP)25ku基因套式PCR的特异性、灵敏度、可重复性和稳定性均十分理想[76]。有人比较了BCSP31，16SrRNA，OMP-2三种基因的PCR方法的敏感性和特异性，结果用16SrRNA基因进行PCR诊断牛血样不敏感；用BCSP31基因进行的PCR最敏感，经常用于人的布鲁菌病的诊断，并且增加循环次数可以在诊断人血液样品时增加其敏感性，并[77,78]且证明与用OMP2基因进行的PCR方法和ELISA联合使用的敏感性相似。 8布鲁氏菌病检测方法的比较及一起布鲁氏菌病的诊断Leal-Klevezas等对外膜蛋白OMP2设计引物进行PCR，可以检测感染的山羊、奶牛、人的奶样品或血样品，敏感性很好[79]。牛种布鲁菌菌株S19、RB51已经用作牛的疫苗，因此区分疫苗株和野毒株很重要。对序列ery设计引物进行PCR，可以区分S19疫苗株[80]。对wboA基因的特异性扩增可以区别RB51菌株和2308以及别的菌株[81]。CloeckaertA等的研究得出位于IS711序列下游的BP26基因是海洋哺乳动物的特殊标记，用PCR方法可以区别于陆生动物种布鲁菌[82]。有一种PCR是设计引物扩增BP26基因和用BP26下游区IS711作为特异的标志的旁侧序列。以稀有的限制性位点PCR为基础发展起来的可以区分出目前发现的海洋种布鲁菌的特异的PCR方法[83]。1.5.2.3多重PCRImaokaK等对细胞表面蛋白BCSP31和外膜蛋白(OMP2b，OMP2a和OMP31)设计引物进行的PCR方法可以检测出感染的布鲁菌种，区分牛种、羊种、犬种、猪种[84]。AMOSPCR是根据布鲁菌种插入基因IS711的位置不同设计引物，可在24h内鉴定牛种布鲁菌(1、2、4型)，羊种布鲁菌(1、2、3型)，猪种布鲁菌(1型)以及绵羊附睾种布鲁菌，且与传统分型方法结果一致[135]。但AMOSPCR不能区分同一个种的不同亚型。另外，加入3条引物到原始的AMOSPCR中，可以区别疫苗株和野毒株[85]。再加入1条引物，则牛种3b，5，6，9型在电泳结果中都会产生额外的条带[86]。有一种牛种布鲁菌种特异性的PCR可以鉴别出组织样品中牛种1、2、4型三种菌，并且不会受到疫苗株、其他种布鲁菌、或其他细菌的干扰[87]。还有一种PCR是基于OMP2b基因的变化来鉴别出布鲁菌猪种1、2、3型的。但是，一些被此方法检测为猪种1型的菌株，却被AMOS-PCR、OMP31、OMP2基因的PCR方法以及传统的PCR方法检测为2或3型，从而限制了这种方法的应用[88,89]。最近，一种多重PCR已经用于鉴别陆生动物易感的种、海洋种、疫苗株S19、RB51、Rev.1布鲁菌[90]。经过改进了的多重PCR可以区别目前发现了的所有布鲁菌种，可以在一个试验中区分目前已知的布鲁菌株以及生物型[91]。随机扩增多态DNA的PCR方法可以区别布鲁菌种和亚型[92]。最近发展起来的MLVA-15布鲁菌种型鉴定方法[93]操作简便，花费较少，为控制布鲁菌病提供参考，还可以减少实验室感染的危险。1.5.2.4实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR主要的优点是能在短时间内出结果，不需要电泳分析，避免了污染，比常规PCR的敏感性和特异性都更高[94]。感染布鲁菌的细胞，血清样品，血液样品，以及石蜡包埋的组织都可以用实时PCR在30min内完成检测[95-97]。现有的各种实时PCR方法的目的基因不同，因而结果各异。HinicV描述了一种实时PCR[98]可以快速检测并且区别布鲁菌的6个种，特异性很高。设计引物和BCSP31的 内蒙古农业大学硕士学位论文9Taqman探针来检测血清样品的实时定量PCR，敏感度为10fg的布鲁菌DNA，还能用于初次诊断，并且能够区分处于慢性还是活跃状态的布鲁菌病[99]。将16S～23SITS，OMP25和OMP31三个基因片段的实时PCR进行对比，用检测全血和石蜡包埋的组织样品来比较效果，结果16S～23SITS基因的引物和探针的实时PCR的敏感性更高，可以用于人布鲁菌病的临床检测[100]。比较用IS711、BCSP31和PER的引物和TaqMan探针用实时PCR鉴别布鲁菌，结果基于IS711基因的方法更敏感、特异、有效、且重复性很好[101]，可以补充常规检测方法的不足[102]。因为引物和TaqMan探针能够区分4种核苷酸多态性，发展起来4种实时PCR用于鉴别猪种布鲁菌亚型，结果每个猪种布鲁菌亚型等位基因的测线是不同的，但不能区分猪种3型与1型[103]。鉴别布鲁菌种有很多方法是以单核苷酸多态性分析为基础的[104]。这种PCR可以定义主要的布鲁菌种进化分支，根据同源性来快速区分细菌，且敏感性很高[105]。多重实时PCR比普通PCR方法检测更快速，更敏感，与传统分型方法的符合率为100%[107]，可以区别肺外结核病与布鲁菌病的局灶性并发症[106]。用实时PCR和高分辨率的溶解曲线(HRM)分析来鉴别布鲁菌种，与传统方法的符合率超过99%[108]。但这种方法不能区别猪种4型和犬种布鲁菌，以前有文章显示猪种亚型与犬种的基因型相同，所以关于猪种亚型还处于争议中[109,110]。1.5.2.5PCR方法与传统方法的比较到目前为止，已经超过400篇文献是关于PCR检测方法的。Romero等发现PCR方法相比较常规检测方法的敏感性较低[42]，与细菌培养方法相比，PCR方法的敏感性和特异性分别是83%和94%[111]。检测绵羊副睾种布鲁菌感染山羊的试验，证明PCR方法与细菌分离培养结果的一致性达到90%以上[112]。最近也有文章显示PCR检测犬种布鲁菌的最低量是1.4x10(1)CFU/g，与细菌分离培养的敏感性相同[113]。血清PCR相比较血液PCR、血培养、玻片凝集试验的敏感性低[114]。也有试验表明PCR方法比血清学方法和细菌培养的敏感性高[115]。因为血细胞中出现细菌及细菌碎片要比特异性抗体出现的早，所以PCR方法检测布鲁菌病能在短时间内出结果。而且这种方法与细菌感染途径、菌株的毒力无关，因此在早期诊断中具有无可比拟的优越性。PCR方法诊断布鲁菌病在不同的实验室敏感性和特异性都有区别，而且没有样品准备的标准，检测方法和靶基因等都还没有建立起相关的标准[116]。用PCR方法的敏感性低的主要原因是含菌量较少，因此优化DNA的提取方法非常重要。最好的DNA提取试剂盒与差的DNA提取试剂盒提取的DNA量相差两个数量级，所以提取的DNA量少与DNA纯化试剂盒的关系很大[117]。任何抑制DNA样品来源的都可能限制PCR方法的使用。当样品中含有EDTA、RNA酶、DNA酶、血红素、肝素、苯酚、聚胺类、植物多糖类、尿液或者藻酸钙等时，或者样品污染、扩增子移行都可引起假阳性反[118][119]应。PCR方法的敏感性随着血清阳性滴度的增加而增加。所以合适的检测样品， 10布鲁氏菌病检测方法的比较及一起布鲁氏菌病的诊断取样的多少也是PCR检测技术能否用于实验室常规检测的影响因素[120]。所以，PCR方法还不是实验室诊断布鲁菌病的常规方法，主要原因是技术操作、临床样品采集的规范，以及其敏感性和特异性等都需要有详细的标准。1.6本研究的目的和意义布鲁菌病是目前世界上流行最广，危害最大的人畜共患病之一，由于在公共卫生意义上的重要性，一直为人们所关注。它以流产和发热为特征，严重威胁着人和多种动物的健康。全世界200多个国家和地区中有170多个国家和地区存在着人畜间布鲁菌病的流行，全世界布鲁菌病患者约有500～600万人,年新发病人数为50万，每年造成的经济损失可达到数十亿美元[121,122]。各大洲的人间布鲁菌病疫情是：拉丁美洲有16个国家和地区存在布鲁菌病[123]，发病率波动于0.02～5.28/10万；欧洲有29个，发病率为0.04～21.46/10万；亚洲有33个，发病率是0.003～11.90/10万；大洋洲有9个，发病率为0.97～2.51/10万；非洲有36个，其发病率为0.59～10.00/10万[123,124]。有50个国家和地区的绵、山羊存在布鲁菌病的流行，主要分布在非洲和南美洲等国家；101个国家和地区存在牛布鲁菌病，主要分布于非洲、中美洲、南美洲、东南亚以及欧洲南部等；在33个国家和地区的猪中有布鲁菌病，主要分布于美洲、非洲北部和欧洲南部等。世界上畜间以牛种布鲁菌感染牛发生的布鲁菌病为主，占家畜布鲁菌病的1/2以上[123]。布鲁菌病危害的表现有很多方面，如影响人的健康，且严重摧残劳动力；畜牧业的发展也会受到阻滞，因为牛、羊、猪等主要家畜感染布鲁菌病后会发生大量流产、早产、不孕、不育等，使牲畜数量锐减；改善人民的生活也受到很大影响，群众脱贫致富步伐减慢，百姓日常生活需要的畜产品供给不足；贸易发展受到阻碍，进出口贸易每年因我国家畜感染布鲁菌病而影响发展。控制布鲁菌病，急需建立快速、准确的检测方法进而对动物进行普查和扑杀。主要根据疾病流行情况、临床症状和实验室的一系列检查来诊断布鲁菌病：首先观察可疑的患病动物有无布鲁菌病的特征，如流产、胎盘滞留、关节炎或睾丸炎等，然后了解患病动物与传染源是否有过接触史。因为布鲁菌病的临床症状不典型，容易误诊，延误病情，所以需要通过试验室方法确诊[125]。血清学方法是现阶段最常用的检测方法，适合于大规模的检疫；常规的细菌分离培养虽然可以直接查到病原体，但缺点也较多，培养条件相对苛刻，费时费力，操作存在潜在的危险性，敏感性较低(30～90%)[126]。分子生物学检测比较先进，具有快速、安全、花费少等优点，问题是没有确切的参考标准。因为布鲁菌活疫苗的残毒力和毒力恢复的特性，所以在应用中的安全性得不到充分保障，但弱毒菌苗的使用一定程度上控制了布鲁菌病的传播。但目前没有一种传统的检测方法可以区分疫苗免疫和自然感染。我国自行分离致弱，在临床应用中 内蒙古农业大学硕士学位论文11取得很好效果的疫苗株M5-90[127]用常规血清学方法检测不能将其与自然感染相区分，这很不利于我国布鲁菌病防治与净化。我国目前采用的布鲁菌病检测技术包括RBPT、SAT和CFT等，前两种方法都会出现一定的假阳性和假阴性结果。OIE于2000年宣布不主张将SAT方法用于国际贸易[128]，CFT也不能适应现代快速检验检疫的需求[4,129]。FPA、RBPT与i-ELISA3种检测方法均为OIE指定的国际贸易中牛布鲁菌病的检测试验，适于牛布鲁菌病的初筛[35]。因ELISA、FPA有操作简单、结果确实等优点已经被OIE推荐用于布鲁菌病的检测工作中，且在一些发达国家已被广泛用于奶牛布鲁菌病的检测中[130]。为此，为筛选出既符合我国国情又能与国际接轨的检疫方法提供参考，本研究对比了目前布鲁菌病检测常用的几种方法，为布鲁菌病的跟踪检测提供参考。2一起奶牛布鲁菌病的调查分析2.1试验材料2.1.1菌种国际标准牛种1型布鲁菌544A菌株、羊种1型布鲁菌16M菌株、绵羊副睾种布鲁菌、猪种1型布鲁菌1330S菌株均由中国疾病预防控制中心提供。2.1.2主要试剂虎红平板凝集抗原和试管凝集抗原购自中国疾病预防控制中心，批号2010.1，有效期至2012.1。细菌DNA基因组提取试剂盒购自天根生化科技生化公司。OIE标准间接酶联免疫吸附试验试剂盒和竞争酶联免疫吸附试验试剂盒，由加拿大食品检疫署动物疾病研究所OIE布鲁菌病参考实验室提供；肉汤培养基和布氏琼脂均购自北京兰伯瑞有限公司；抗生素购自上海生工生物工程技术服务有限公司。2.1.3主要仪器设备生物安全柜、恒温水浴锅、高速离心机、生化培养箱、倒置光学显微镜、PCR仪、电泳仪、电子天平、凝胶电泳成像系统等由中国疾病预防控制中心提供。2.1.4试验检测样品血清样品采自北方某牧场6577头奶牛(表2-1)，收集流产胎儿的肝、脾组织样品共12份，保存备用。 12布鲁氏菌病检测方法的比较及一起布鲁氏菌病的诊断表2-1奶牛组成情况Table2-1Compositionofcows围产牛产仔牛泌乳牛干奶牛育成牛合计场群数111111832个体数57621495275468865772.2饲养发病情况该牧场是2004年新建的奶牛养殖场，建场后分6批先后从国内外引进奶牛6000头。2008年引进的第四批奶牛1200头，来自国内多个奶牛养殖小区和养殖户。其余5批均引自国外无疫国家(表2-2)。并且从建场到本次检测之前均未曾采取免疫措施。表2-2奶牛引进情况Table2-2Thesituationofcowsintroduction部分组成数量一国内多个奶牛养殖小区和养殖户1200二国外无疫国家4800该牧场实行严格管理和检疫制度，每年用虎红平板凝集试验对布鲁菌病按规程检疫2次。在2009年上半年的例行检测中，从国内引进的牛群中检出8头布鲁菌阳性牛，之后进行了扑杀处理；2009年下半年检出36头阳性牛。2010年上半年的两次检疫中分别检出阳性牛80头、120头，下半年两次检疫分别又检出阳性牛90头、260头(表2-3)。以后检测出来的阳性牛虽然未曾全部扑杀，但阳性阴性牛得到了相对的隔离。表2-32009-2010年虎红平板凝集试验检测结果Table2-3TheresultofRBPTbetween2009and2010时间检测阳性数量(头)2009年上半年8下半年362010年上半年第一次80第二次120下半年第一次90第二次260自2010年1月1日～2011年1月1日，该牧场发生不正常生产828例(包含早产)，在这828例中流产牛454例，占总数的54.8%，早产374例，占总数的45.2%。 内蒙古农业大学硕士学位论文132.3试验方法2.3.1血清学检测对所有血清样品用布鲁菌病检测国家标准方法(见GB/T18646)虎红平板凝集试验(RBPT)和OIE推荐的间接酶联免疫吸附试验(i-ELISA)进行初筛，二者任一阳性样品再根据国标要求以SAT为标准判定为阳性。2.3.1.1虎红平板凝集试验(RBPT)（1）用加样器滴加20μl血清样品于干净的玻璃板上。（2）再滴加20μl抗原与被检血清用加样器混匀。（3）每次试验都应该设阴、阳性血清对照。（4）判定：当阴、阳性对照成立时，方可判定被检血清。受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象的判为阳性(＋)，无凝集现象，呈均匀粉红色的判为阴性(-)。2.3.1.2试管凝集试验(SAT)（1）在试管架边缘标记对应血清的检验编码。（2）第一个试管加1.2ml的稀释液。（3）第2～4个试管内各加500μl的稀释液。（4）在第1个试管内再加入50μl被检血清，并多次吸吹，使之均匀混合，然后弃去250μl该混合液。(5)从第1个试管吸取500μl混合液加入到第2个试管种，多次吹吸，均匀混合。(6)再从第2管混合液中吸取500μl至第3管中，如此倍比稀释至第4管，然后从第4管中弃去混匀液500μl。(7)此时第1到第4管中的血清稀释度分别变为1:25、1:50、1:100和1:200。(8)在已稀释好的各试管血清中加入500μl20倍稀释的抗原，并振摇混合均匀，则血清稀释度依次变为1:50、1:100、1:200和1:400。(9)置37～40℃温箱孵育24h后取出检查并记录试验结果。(10)每次试验均应设阴、阳性、和抗原对照，其中需要注意500μl1:20稀释抗原液加500μl稀释液后是否出现了自凝现象。(11)把各试管上层液体清亮度参照比浊管来判定++++上层液体100%清亮，菌体100%下沉，完全凝集。+++上层液体75%清亮，菌体几乎完全凝集。++液体50%清亮，菌体凝集显著。+液体25%清亮，凝集物有沉淀。－液体均匀混浊，凝集物无沉淀，。1:100稀释度的血清出现“++”以上凝集现象时，判定被检血清是阳性。 14布鲁氏菌病检测方法的比较及一起布鲁氏菌病的诊断2.3.1.3间接酶联免疫吸附试验(i-ELISA)[131,132](1)首先每孔加入95μl的1×稀释液，然后第一列每双孔分别加入5μl的强阳性C++，弱阳性C+，阴性C-对照血清和1×样品稀释液，从第二列起单孔加入5μl的被检血清(即1:20稀释对照血清和被检血清)，加样的顺序不能变。室温(18℃～28℃)下孵育3min(前30S需要轻轻震荡96孔微量板)。(2)每孔加入200μl1×洗涤液，洗涤4次，除去其他未结合的物质，在干净的吸水纸巾上拍打，除去残留的洗涤液；然后每孔加入100μl的1:5000稀释酶标抗抗体，室温(18℃～28℃)下孵育3min(前30S需要轻轻震荡96孔微量板)。(3)参照上一步洗涤96孔微量板后每孔加入100μl稀释好的辣根过氧化物酶结合物(HRP-结合物)，室温(18℃～28℃)孵育2min(前30S需要轻轻震荡96孔微量板)。(4)加入HRP-结合物孵育2min后，再加入100μl的终止液(1.0MH2SO4)阻止酶继续反应，轻轻震荡96孔微量板30秒，在酶标仪450nm波长下读取OD值。结果的计算：(a)计算强阳性C++对照血清的平均OD值。(b)其它对照和样品阳性百分值(P%)=被检样品的OD值/C++的平均OD值×100(c)P%>20%时，被检样品为阳性。为确保试验的有效性，对照的OD值必须在如下范围内：C++0.6～2.5；C+0.2～1.5；C－0.0～0.2；Cc0.0～0.2。2.3.1.4竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)[45](1)将包被好的96孔酶标板快速洗涤4次，在吸水纸上拍干。(2)首先每孔加入50μl的1:400稀释的单克隆抗体，接着每孔加入45μl的1×样品稀释液，然后第一列分别加入5μl的C++，C+，C-对照血清和Cc(1×样品稀释液)各两个孔，从第二列起每个孔加入5μl的被检血清(5μl的血清溶于95μl的液体中，即1:20稀释对照血清和被检血清)。加样的顺序不能变。室温(18℃～28℃)下在振荡器上轻微震荡孵育30min。(3)每孔加入约200μl的1×洗涤液，在干净的吸水纸上拍打除去剩余的洗涤液，重复4次。接着每孔加入100μl的1:5000稀释的酶标抗抗体，26℃孵育30min。(4)参照上一步洗涤96酶标板。接着每孔加入75μl配制好的底物，室温(18℃～28℃)下在振荡器上轻微震荡孵育10min。(5)每孔加入75μl终止液阻止酶继续反应，轻轻振动30S，在酶标仪450nm波长下读取OD值。 内蒙古农业大学硕士学位论文15结果的计算：(a)计算Cc的平均OD值。(b)Cc被认为抑制百分比为0%(即不抑制)，其它对照和样品的抑制百分比(I%)=100－被检样品的OD值/Cc的平均OD值×100(c)I%>30%即认为被检样品为阳性。为确保试验的有效性，对照的OD值必须在如下范围内：C++0.0～0.2；C+0.2～0.6；C－0.6～2.0；Cc0.6～2.0。2.3.2细菌培养与分离鉴定2.3.2.1培养基制备液体培养基：用电子天平称取28g布氏肝汤培养基，溶解于1000ml蒸馏水中，121℃20min灭菌。固体培养基：称取43g布氏琼脂培养基于1000ml蒸馏水中溶解，加热溶化后高压灭菌，倾倒于大试管中，制成斜面的培养基。2.3.2.2细菌分离将组织剪成小块，研磨出汁液，涂于大试管的斜面上，置37℃24～72h后，挑取单菌落在固体培养基表面划线培养24～72h后，挑取单菌落接种于液体培养基中培养至OD600≈0.15[133]。2.3.2.3革兰氏染色法(1)滴一滴生理盐水在载玻片上，挑单个菌落均匀涂于其中，酒精灯火焰固定；(2)滴加草酸铵结晶紫染色1min，接着用自来水缓缓冲洗；(3)加碘液覆盖涂面染色1min，接着用自来水缓缓冲洗；(4)加95%酒精数滴，轻轻摇动30S脱色后水洗；(5)滴加沙黄染色液染色1min后，用自来水冲洗，待其干燥后镜检；(6)观察染色结果，革兰氏阳性菌体均呈紫色，革兰氏阴性菌体均呈红色。布鲁菌呈红色，是革兰氏阴性菌。2.3.2.4H2S试验将普通滤纸片剪成7～8cm长，宽0.8～1.0cm的小条，经灭菌后在10%的醋酸铅水溶液中浸泡24h，取出后放于无菌盘中，置温箱中烤干备用。将待鉴定的48h 16布鲁氏菌病检测方法的比较及一起布鲁氏菌病的诊断布鲁菌培养物用无菌生理盐水洗下，制成10亿/ml菌悬液，用直径2mm的接种环勾取一环菌接种到PH6.8的琼脂斜面培养基上，然后把醋酸铅纸条夹于斜面和试管壁之间，使纸条和斜面呈平行状，以不接触斜面为宜，纸条留在管外1～2cm，然后将其置于37℃下培养，经2、4、6天各观察一次，并记录结果。纸条不变黑的为“-”，变黑的为“+”。2.3.2.5单相特异性血清在玻片上用生理盐水将A、M、R因子血清作1:10稀释，然后用接种环取48h待检的布鲁菌琼脂斜面培养物少许，分别加入A、M和R血清中混匀，在1min～2min内用肉眼观察是否出现凝集现象，出现凝集反应的以“＋”表示，不出现凝集反应的以“－”表示。2.3.2.6噬菌体裂解试验根据需要将培养基平皿划分为4份，平皿边缘分别标记噬菌体Tb、Wb、Bk2、Fi名称，平皿内底层是固体培养基，上面是半固体培养基。取出几个带盖小玻璃管，用吸管吸取约2ml生理盐水分别加入到这几个管中。用一次性塑料接种环挑取半环或一环的培养物伸进小玻璃管内洗下，对照比浊管，至浊度一致。将塑料接种环放入消毒液中浸泡。用经高压过的吸管分别吸取比浊后的菌液滴入2滴(约0.1ml)至半固体培养基内。再吸取噬菌体Tb、Wb、Bk2、Fi，在培养基相应的位置上方滴1滴，静置。放入37℃温箱，1～2h后将平皿倒置、24～48h后观察结果。2.3.2.7染料抑菌试验首先制成含硫堇和复红的半固体培养基，染料含量1:5万和1:10万。将待鉴定的布鲁菌48h～72h培养物用生理盐水制成10亿/ml菌液，用直径2mm接种环勾取分别接种到含不同浓度的燃料培养基内约4～5mm深处，置37℃培养，经2、4、6天各观察一次，有布鲁菌生长时沿接种环穿刺线呈白色玻璃样絮状生长，或在表面形成一层白色菌膜生长，否则判为受抑制。2.3.3PCR检测将分离培养的待鉴定的菌株制成菌悬液1.2ml，然后在75℃水浴锅中灭活30min，接着用细菌DNA基因组提取试剂盒提取细菌DNA分别做多重PCR[134]，AMOS-PCR[135]和MLVA[136]。 内蒙古农业大学硕士学位论文172.3.3.1PCR反应体系及条件AMOSPCR反应体系25μl：成分体积μlMix(2×)12.5AMOS(A)1AMOS(M)1AMOS(O)1AMOS(S)1AMOS(IS711)1三蒸水6.5DNATemplate1试验程序：94℃5min；96℃1min，55℃90S，72℃60S；35个循环。1多重PCR反应体系25μl：成分体积μlMix(2×)12.5各引物0.5三蒸水9DNATemplate1试验程序：96℃4min；94℃40S，56℃50S，72℃3min；30个循环，0.572℃10min。12.5MLVA反应25μl体系：成分体积μlMix(2×)12.5各引物0.5三蒸水10.5DNATemplate1试验程序:96℃5min；95℃30S，60℃30S，70℃1min；30个循环，70℃5min。2.3.3.2琼脂糖凝胶制备及成像用电子天平称取1.5克琼脂糖于100ml1×TAE电泳缓冲液中，在微波炉中溶解，待凝胶稍冷后加入5μl溴化乙锭(10mg/ml)混匀，使溴化乙锭的终浓度为0.5μg/ml。选择合适的梳子制好胶后加上PCR产物，然后放于电泳槽内，用80V电压电泳40min，在凝胶电泳成像系统的紫外光下成像，保存。 18布鲁氏菌病检测方法的比较及一起布鲁氏菌病的诊断2.4试验结果2.4.1血清学检测结果6577份奶牛血清样品中，用RBPT和i-ELISA进行初筛，筛选出1454份二者任一阳性样品，再根据国标要求以SAT结果为标准判定为阳性，检出SAT阳性826份、个体阳性率为12.56％。结果见表2-4。32个奶牛舍中26个检测到阳性样品，群抗体阳性率为81.25％。表2-4血清学检测结果Table2-4TheresultofserologicaltestsRBPTi-ELISAc-ELISASAT检测阳性数阳性率阳性数阳性率阳性数阳性率阳性数阳性率畜种数(头)(%)(头)(%)(头)(%)(头)(%)个体6577126019.16109716.68118317.9982612.56场群3232100.003196.8832100.002681.25表2-5血清学检测详细结果Table2-5ThedetailedresultofserologicaltestsRBPTi-ELISAc-ELISASAT畜种检测阳性数阳性率阳性数阳性率阳性数阳性率阳性数阳性率数(头)(%)(头)(%)(头)(%)(头)(%)围产牛57814.0447.02712.2858.77产仔牛622032.261727.422235.481016.13泌乳牛149561241.9555837.3256337.6647531.77干奶牛2756122.184416.005921.453111.27育成牛468855911.9247410.1153211.353056.51以不同饲养阶段可将本场奶牛划分为围产、产仔、泌乳、干奶、育成牛。总体而言，泌乳牛的布鲁菌病个体阳性率最高(31.77%)，其次为产仔牛(16.13%)，育成牛(6.51%)相对较低。结果见表2-5。2.4.2细菌分离培养从12份组织样品中分离纯化出四株菌株，四株用生化鉴定均为同一菌种同一菌型，结果见表2-6。鉴定结果同公认的布鲁菌分类标准(表2-7)对比，表明四株菌株均属于牛种3型。 内蒙古农业大学硕士学位论文19表2-6生化试验检测结果Table2-6TheresultofBiochemicaltest革兰氏染料抑菌H2S单项特异性血清凝集噬菌体裂解试验染色硫堇碱性复红产生AMRTbWbBk2Fi1-++++--++++2-++++--++++3-++++--++++4-++++--++++表2-7布鲁菌的分类表Table2-7Classificationtableofbrucella染料抑菌单项特异性血清凝集噬菌体裂解试验生物CO2H2S种硫碱性型需要产生AMRTbWbBk2Fi堇复红1±+-++--++++2±+--+--++++3a±++++--++++4±+-±-+-++++牛5--++-+-++++6a-±+++--++++7-±++++-++++9-+++-+-++++1--++-+---+-羊2--+++----+-3--++++---+-1-++(-)＃+---++±2--+-+---++±猪3--+++---++±4--+(-)++--+++5b--+--+--++±沙林鼠种-+--+--±+++绵羊附睾+-+(-)--+----种犬种--+---+---- 20布鲁氏菌病检测方法的比较及一起布鲁氏菌病的诊断2.4.3PCR检测结果从多重PCR检测电泳图谱中可以看出待检菌株为牛种菌，见图2-1，从AMOS-PCR检测电泳图中看出可以排除牛1、2、4型，见图2-2。MLVA方法可以进一步确定为牛种3型，见2-3和2-4，与细菌学检测结果一致。M234567892000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图2-1未知菌的多重PCR鉴定Fig.2-1multiplexPCRidentificationofgenefromanunknownbacteriaM:DNA分子质量标准；2，3、4、5：四株待检菌株，6国际标准牛种1型分离株，7国际标准羊种1型分离株，8国际标准绵羊副睾分离株，9国际标准猪种1型分离株M234567892000bp1000bp750bp500bp250bp250b100bpp100bp图2-2未知菌的AMOS-PCR鉴定Fig.2-2AMOS-PCRidentificationofgenefromanunknownbacteriaM:DNA分子质量标准；2、3、4、5:四株待检菌株;6:国际标准牛种1型分离株;7:国际标准羊种1型分离株:8:国际标准绵羊副睾分离株;9:国际标准猪种1型分离株 内蒙古农业大学硕士学位论文21M12345M12345M12345M12345M图2-3未知菌的MLVA鉴定Fig.2-3MLVAidentificationofgenefromanunknownbacteriaM:DNA分子质量标准；1、2、3、4:四株待检菌株;5:国际标准羊种1型分离M12345M12345M12345M12345M图2-4未知菌的MLVA鉴定Fig.2-4MLVAidentificationofgenefromanunknownbacteriaM:DNA分子质量标准；1、2、3、4:四株待检菌株;5:国际标准羊种1型分离2.5讨论从血清学检测结果可知，整个牧场的布鲁菌病个体阳性率为12.56%、场群阳性率81.25%，不同饲养阶段布鲁菌病阳性率差异明显，泌乳牛的阳性率最高(31.77%)，育成牛的阳性率最低(6.51%)。所以，布鲁菌病是造成该牧场奶牛流产的主要原因。有研究表明，四岁以上奶牛比四岁以下奶牛更易感奶牛布鲁菌病，与混合农业养殖相比，牧场养殖更易流行此病，且大群体较小群体更易流行[137]。从12份病料样品中最后分离培养出四株细菌，分离率为33.33%，生化鉴定配合三种PCR方法最后确定均为牛种3型布鲁菌，所以该牧场流行菌株为牛种3型。布鲁菌的初代分离培养较其他细菌困难，一是因为病料采集的过程中容易污染杂菌，而且杂菌生长较快，布鲁菌生长较慢，所以在布鲁菌还没有生长时容易被其它菌所覆盖，种群优势的原因使布鲁菌很难再生长。二是布鲁菌对营养条件要求较高，不宜满足。三是感染疾病初期容易分菌，慢性型感染时不容易分菌[138]。 22布鲁氏菌病检测方法的比较及一起布鲁氏菌病的诊断多重PCR可以用于鉴定布鲁菌种，对布鲁菌的防治有重要意义，是设计5对引物，采用各种间特异缺失的序列作为鉴定依据进行的混合体系PCR。这种方法不需要进行二次PCR，在几小时内就可完成对布鲁菌的快速鉴定。AMOSPCR是根据IS711基因在布鲁菌种中数量的差异，在不同的布鲁菌种中能够扩增得到不同的片段，所以根据扩增带的大小可以来鉴别种。可以在一天内鉴别出牛种布鲁菌(1、2、4型)，羊种布鲁菌(1、2、3型)，猪种布鲁菌(1型)和绵羊附睾种布鲁菌[135]。AMOSPCR方法的检测结果与传统方法的符合率为100%，并且能准确鉴别牛流产野毒株和疫苗株[139]。所有的布鲁菌种之间基因结构的相似性超过90%[140]，所以用分子学方法有效区分种有一定困难。布鲁菌MLVA方法方法较稳定[141]，是把15个标记分成了两个组，一组8个标记，二组7个标记，由可以辨别的微变化的位点组成，其结果支持传统的布鲁菌分类。另外，与表型分型和分子学分型相比具有一些优点：一，使数据交换变得容易。数据可以通过互联网得到，并且一个简单的文件就可以总结数据，包括每个位点和菌株重复了的片段数[142,143]。二，MLVA方法是以测量DNA扩增子大小为基础的，所以可以应用很多电泳技术，可以是手动的、廉价的电泳仪，也可以用高通量毛细管电泳仪等。MLVA最近已经有临床应用的报道，未来不久很可能成为检测新菌株的常规方法[144]。应用血清学方法可以很快了解布鲁菌病的流行概况，但是为了确定更有效的治疗方案，需要同时进行细菌学试验。本试验生化方法鉴定的结果符合牛种3型特征，但是其操作过程和结果判定上都较容易出错，主观性相对较强。应用多重PCR方法，能鉴定为牛种，AMOSPCR方法可以排除1、2、4型，MLVA方法进一步可以确定是牛种3型，结果与细菌生化鉴定相符。单独应用任何一种方法来鉴定种型都有不足，所以建议配合使用多种方法，综合分析。多重PCR和AMOSPCR配合使用，可以互补彼此的缺点，方便快捷客观，MLVA方法的结果相对更精确。追溯调查发现该牧场近年来曾从国内某布鲁菌病疫区引进一批奶牛，且引入前未进行布鲁菌病检疫、未分离饲养观察即混群混饲，从而导致传染源输入，造成传染源不断扩大，这可能是造成此次布鲁菌流行的主要原因，值得深思。该牧场使用的虎红平板凝集试验(RBPT，敏感性21～98.3%，特异性68.8～100%)[32]会出现一定的假阳性和假阴性结果[145]导致阳性牛的漏杀。假阳性反应的主要原因是发生严重溶血、交叉反应、或者抗原抗体反应超过4min后会出现纤维素的凝集块；假阴性反应尤其可能会产生，主要因为抗体亲和力低或滴度低。另一方面，RBPT不能区分B.abortusS19免疫和野毒感染[35]。所以该牧场虽然检疫了，也有漏检的阳性牛，致使成为整群牛的传染源，布鲁菌病的发生源源不断。但也有研究[33]综合分析认为RBPT可以不和别的方法配合使用，是小型试验室的理想检测方法。以往报道的RBPT的敏感性变化范围大可能由多几方面原因造成的，比如抗原的来源 内蒙古农业大学硕士学位论文23不同，所用的平板光滑度、清晰度不同等，所以用RBPT方法检测布鲁菌病时，所用平板的质量和技术操作等也影响到检测的准确度。3四种布鲁菌病血清学检测方法的比较3.1试验材料3.1.1主要试剂虎红平板凝集抗原和试管凝集抗原购自中国疾病预防控制中心，批号2010.1，有效期至2012.1。OIE标准间接酶联免疫吸附试验试剂盒和竞争酶联免疫吸附试验试剂盒，由加拿大食品检疫署动物疾病研究所OIE布鲁菌病参考实验室提供。3.1.2主要仪器酶标仪，恒温箱等由中国动物卫生与流行病学中心提供。3.1.3血清集中采自北方某牧场未免疫过的873头奶牛。3.2试验方法虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)、间接酶联免疫吸附试验(i-ELISA)和竞争美联免疫吸附试验(c-ELISA)操作方法同第二章。3.3试验结果采用虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)、间接酶联免疫吸附试验(i-ELISA)和竞争美联免疫吸附试验(c-ELISA)分别检测873份奶牛血清样品。结果显示，RBPT、i-ELISA、SAT、c-ELISA分别检出的阳性血清543份、501份、460份、500份，阳性率分别是62.20%、57.39%、52.69%、57.27%。仅RBPT或i-ELISA其中一种方法检测为阳性，其他方法均为阴性的分别为27份、29份，仅SAT或c-ELISA一种方法检测为阳性的血清为0份。RBPT、i-ELISA两种方法均检测为阳性，但SAT、c-ELISA均检测为阴性的血清为7份。RBPT、SAT两种方法均检测为阳性的血清为14份，RBPT、c-ELISA两种方法均检测为阳性的血清为40份，i-ELISA、SAT两种方法均检测为阳性的为7份，i-ELISA、c-ELISA两种方法均检测为阳性的为20份，SAT、c-ELISA两种方法均检测为阳性的为0。RBPT、i-ELISA、SAT三种方法均检测为阳性，但c-ELISA检测为阴性的血清为22份。另外，RBPT、i-ELISA、c-ELISA三种方法均检测为阳性的血清为23份，i-ELISA、c-ELISA、SAT三种方法均检测为阳性的血清为7份，RBPT、SAT、c-ELISA三种方法 24布鲁氏菌病检测方法的比较及一起布鲁氏菌病的诊断均检测为阳性的血清为24份。四种方法均检测为阳性的血清为386份，均为阴性的为267份。结果见表3-1。表3-1873份奶牛血清用4种方法检测的结果Table3-1Theresultof4serologicaltestsfor873serumsamplesfromdairycows检阳检测方阳性测性阳性数(分类统计)法率(%)数数RBPT543＋＋－－－＋＋＋－－－＋＋－＋－62.20i-ELISA501＋－＋－－＋－－＋＋－＋＋＋－－57.39873SAT460＋－－＋－－＋－＋－＋＋－＋＋－52.69c-ELISA500＋－－－＋－－＋－＋＋－＋＋＋－57.27合计38627290071440720022237242673.4讨论检测结果也显示，i-ELISA检测阳性率为57.39%，SAT检测阳性率为52.69%，i-ELISA试验检测结果的阳性率较SAT高很多。与NielsenK的试验结果相符，认为i-ELISA试验的敏感性为91.7%，高于SAT试验[132]。本试验结果RBPT、i-ELISA、c-ELISA三种方法均检测为阳性，而SAT检测为阴性的为23份，相对较高。SAT有时出现前带现象及封闭现象，易出现假阴性，因此常常与其他方法结合应用。有文献显示，SAT与i-ELISA方法配合使用可以更有效的检测人以及动物布鲁菌病[147]。本试验结果RBPT检测结果的阳性率最高，达到了62.20%。另外，只有RBPT检测为阳性，其他三种方法检测为阴性的是7份血清，可以认为是RBPT的假阴性结果较其他方法低，所以RBPT是较好的布鲁菌病的初筛方法。以往报道的RBPT的敏感性变化范围大可能由多几方面原因造成的，如抗原的来源不同，所用的平板光滑度、清晰度不同等。RBPT的假阳性反应的主要原因是发生严重溶血、交叉反应、或者抗原抗体反应超过4min后会出现纤维素的凝集块；假阴性反应尤其可能会产生，主要是抗体亲和力低或者滴度低。虽然有这些缺点，但其相比较SAT方法操作简便、快速、易掌握，适于基层大面积检疫，所以RBPT仍然是诊断布鲁菌的参考检测方法[36]。在用RBPT和SAT进行检疫时,要用OIE推荐的CFT或c-ELISA进行确诊。但由于CFT操作繁琐,需要对多种成分进行标定,费时费力,而且诊断试剂需要专人保管。相比之下ELISA快速、方便,结果客观可靠，在2002年就被国际动物卫生组织(OIE)列为国际贸易指定试验。因此在布鲁菌病检测时，确诊时用c-ELISA比CFT切实可行。 内蒙古农业大学硕士学位论文25综上所述，RBPT和SAT与i-ELISA和c-ELISA试剂盒检测结果相比一致率较高，但RBPT有较高的假阳性，SAT有较高的假阴性。如果应用RBPT或SAT作为检测布鲁菌病的试验方法，在买入动物进行检疫时，可能导致不能检出所有阳性动物，造成疾病流行，或者误杀健康动物，造成不必要的损失。在进行检疫净化时，则导致可能不能完全检出并淘汰所有阳性动物。在布鲁菌病检疫时可选择特异性好的RBPT抗原进行初筛,阳性结果用i-ELISA或c-ELISA进行确诊。4三种i-ELISA试剂盒的比较4.1试验材料从北方某未免疫过的奶牛牧场集中采集血清880份，4℃保存备用。i-ELISA检测试剂盒来自Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ三个公司。酶标仪，恒温箱等仪器由中国动物卫生与流行病学中心提供。4.2试验方法880份奶牛血清用三种i-ELISA试剂盒和c-ELISA试剂盒做检测，认为c-ELISA方法检测结果是真实结果，对比三种i-ELISA试剂盒的敏感性和特异性。试验操作同第二章，每份样品做两次检测求平均值，然后对比分析检测结果。4.3试验结果三种i-ELISA试剂盒检测的阳性血清为450份。但结果存在差异，仅Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ一种试剂盒检测为阳性的分别为15、33、25份。其中Ⅰ，Ⅱ两种试剂盒检测为阳性，而Ⅲ检测为阴性的血清为61份；Ⅱ，Ⅲ两种试剂盒检测为阳性，而Ⅰ检测为阴性的血清为23份；Ⅰ，Ⅲ两种试剂盒检测为阳性，而Ⅱ检测为阴性的血清为7份。结果见图4-1。三个公司i-ELISA试剂盒检测结果的一致率为81.36%。Ⅰ、Ⅱ公司试剂盒检测结果的一致率是91.14%，Ⅰ、Ⅲ的一致率为85.91%，Ⅱ、Ⅲ为85.68%。表4-1四种试剂盒检测结果Table4-1Theresultsofdetectionwith4i-ELISAkits检测方法检测数阳性数阳性率(%)i-ELISAⅠ53360.57i-ELISAⅡ56764.43880i-ELISAⅢ50557.39c-ELISA50056.82 26布鲁氏菌病检测方法的比较及一起布鲁氏菌病的诊断图4-1三个公司生产的i-ELISA试剂盒的详细检测结果Fig.4-1Thedetailedresultsofi-ELISAkitsfromthreecompanies图4-1进一步展示检其中数字均表示检出的阳性数，圆分别表示三个公司的检测试剂盒，其中数字均表示检出的阳性数，交叉部分表示共同检出的阳性数。因为总数均是880份，阴性数=880-检出的阳性数。三个公司i-ELISA试剂盒检测均为阴性数=880-15-7-61-450-33-23-25=266三个公司i-ELISA试剂盒检测结果的一致率=(450+266)÷880×100%=81.36%Ⅰ，Ⅱ公司试剂盒检测结果的一致率=(61+450+266+25)÷880×100%=91.14%Ⅰ，Ⅲ公司试剂盒检测结果的一致率=(7+450+266+33)÷880×100%=85.91%Ⅱ，Ⅲ公司试剂盒检测结果的一致率=(15+450+266+23)÷880×100%=85.68%如果认为c-ELISA方法检测结果为真实结果，那么Ⅰ公司生产的i-ELISA试剂盒的敏感性Se=449/500×100%=89.8%，特异性Sp=296/380×100%=77.89%，见表4-2。Ⅱ公司生产的i-ELISA试剂盒的敏感性Se=473/500×100%=94.6%，特异性Sp=286/380×100%=75.26%，见表4-3。Ⅲ公司生产的i-ELISA试剂盒的敏感性是Se=435/500×100%=87%，特异性Sp=310/380×100%=81.58%，见表4-4。表4-2i-ELISAⅠ试剂盒检测结果Table4-2Theresultsofdetectionwithi-ELISAⅠ真实状态+-总计+44984533检测结果-51296347总计500380 内蒙古农业大学硕士学位论文27表4-3i-ELISAⅡ试剂盒检测结果Table4-3Theresultsofdetectionwithi-ELISAⅡ真实状态+-总计+47394567检测结果-27286313总计500380表4-4i-ELISAⅢ试剂盒检测结果Table4-4Theresultsofdetectionwithi-ELISAⅢ真实状态+-总计+43570505检测结果-65310375总计5003804.4讨论ELISA方法具有敏感性高、特异性强、操作简便、检测快速、重复性好、高通量、[148]无辐射、成本较低等优点，已得到广泛应用。i-ELISA作为血清学诊断的常用方法，其中抗原包被浓度和最佳血清稀释度的选择是试验成功的关键；i-ELISA结果的判定方法有很多，如P/N法，终点法和单稀释法等，关于应用i-ELISA法检测人和其他动物布氏杆菌病的敏感性问题的报道很多，众多的研究结果都证明i-ELISA的敏感性高于凝集反应[149-151]。i-ELISA检测试剂盒在牛种布鲁菌病诊断中发挥着重要作用，尤其适用血清样品量较大的时候。传统的诊断方法太费时，但i-ELISA试剂盒诊断快速，简单，敏感，特异[146]。以c-ELISA方法检测结果为真实结果，Ⅱ公司的i-ELISA的试剂盒敏感性相对最高，达到了94.6%，特异性较低。Ⅲ公司的i-ELISA的试剂盒敏感性最低，为87%，特异性相对较高。假阳性动物的扑杀给养殖户带来很大的损失，真阳性动物的漏杀给布鲁菌病的传播提供了新的传染源，造成新的危害。因此，检测方法需要能区别疫苗接种还是自然感染，而且需要特异性强、灵敏性高，能够区别感染的不同时期。但目前还没有这样的检测方法得到推广应用[59]。我们应综合考虑到自身拥有的条件和检测所需要达到的灵敏度来选择合适的检测方法，而提高灵敏度和去除假阳性是检测方法发展的趋势。通过对三个公司i-ELISA试剂盒检测效果的对比分析，为以后布鲁菌病的检测、防控提供参考。 28布鲁氏菌病检测方法的比较及一起布鲁氏菌病的诊断5结论(1)跟踪调查了一起奶牛布鲁菌病的诊治过程，确定该牧场6577份奶牛血清样品中，检出SAT阳性826份、个体阳性率为12.56％。32个奶牛舍中26个检测到阳性样品，群抗体阳性率为81.25％。(2)从有布鲁氏菌病流行的某牧场取12份病料，分离出4株菌株，应用细菌生化试验，多重PCR，AMOSPCR，MLVA三种PCR方法最后证实此次流行菌株为牛种3型。(3)RBPT、SAT与i-ELISA、c-ELISA试剂盒检测结果相比一致率较高，但RBPT有较高的假阳性，SAT有较高的假阴性。在布鲁菌病检疫时可选择特异性好的RBPT抗原进行初筛,阳性结果用i-ELISA或者c-ELISA进行确诊。(4)以c-ELISA方法检测结果为真实结果，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ三个公司的i-ELISA试剂盒比较，以Ⅱ公司的i-ELISA检测试剂盒敏感性最高。 内蒙古农业大学硕士学位论文29致谢首先我要向我的两位导师-内蒙古农业大学兽医学院的关平原教授和中国动物卫生和流行病学中心的范伟兴教授表示衷心的感谢。感谢两位恩师在学业和生活上对我的悉心栽培。导师的严谨细致，一丝不苟的作风、对教学和科研的孜孜不倦的敬业精神一直是我学习榜样。感谢范伟兴老师给我提供良好的试验条件，感谢关平原老师对我的关爱，不辞辛苦的指导我的课题，指导我完成毕业论文。期间我犯了很多错误，无论是生活上还是学习上，在此非常感谢老师们给我指点迷津，让我能不断调整自己，改变自己，完善自己。感谢内蒙古农业大学传染病组的李大伟，徐华敏等和中国动物卫生和流行病学中心的王凯宬，狄栋栋，莫莎等，他们的关怀和帮助使我得以顺利地完成硕士的工作。感谢父母给予我的包容，给予我不断的支持。硕士研究生学习的三年是我收获颇丰的三年，这三年我思想深度，行为方式等均得到改善，这三年是对我未来道路影响深远的三年，所有的艰辛都已经过去，剩下的是各方面能力上的提升。再次感谢内蒙古农业大学，感谢各位老师，各位同学，感谢父母，谢谢你们！ 30一起布鲁氏菌病的诊断与布鲁氏菌病检测方法的比较参考文献1OfficeInternationaldesEpizooties.ManualofStandardsforDiagnosticTestsandVaccines.ListAandBDiseasesofMammals,BirdsandBees[M].4thed.Paris:FoodandAgriculturalOrganizationoftheUnitedNations,1996:51-582YinJiming,ShangDeqiu.BrucellaDNApolymorphism[J].ChineseJournalofControlofEndemicDiseases,2002.17(6):341-3463ManturBG,AmarnathSK,shindeRS.Reviewofclinicalandlaboratoryfeaturesofhumanbrucellosis[J].IndianJournalofMedicalMicrobiology,2007,25(3):188-2024WangLi,MaGuo-zhu.TheresearchfordiagnosingbrucellosispatientswithPCRtechnology[J].ChineseJournalofControlofEndemicDiseases,2004,19(2):65-675白文彬,于康震.动物传染病诊断学[M].北京:中国农业出版社,2002,621-6276世界动物卫生组织.哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册[M].第5版农业部畜牧兽医局/中国动物卫生与流行病学中心译,北京:中国农业科学技术出版社,2004:3647丁家波,毛开荣,程君生等.布氏杆菌病疫苗的应用和研究现状[J].微生物学报,2006,46(5):856-8598EwaltDR,PayeurJB,MartinBM,etal.IsolationofBrucellaspeciesfromcetaceans,sealsandanotter[J].VetRec,1996,138(24):583-5869韩文瑜,冯书章.现代分子病原细菌学[M],吉林人民出版社,2003,357-37710白文彬,于康震主编.物传染病诊断学[M].中国农业出版社,2002.621-62711陆承平.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社,200112尚德秋.布鲁氏菌病流行病学研究现况[J].中华流行病学杂志,1998,19(2):107-11013张卓然,倪语星.临床微生物学和微生物检验[M].第3版.北京:人民卫生出版社,2003,184-18614周正任.医学微生物学[M].第6版.北京:人民卫生出版社,2003,209-21015BrickerBJ.PCRasadiagnostictoolforbrucellosis[J].VetMicrobiol,2002,90(1-4):435-44616尚德秋,李元凯.我国犬种菌布鲁氏菌病的调查研究[J].中华流行病学杂志,1989,10(1):2417范泽.家畜传染病学[M],中国科学文化出版社,2004,ll018钟苡芳,陈彪,赵国荣等.温泉县畜间布氏菌病防制研究[J].新疆畜牧业,1992,1:3l-3419KohlerS,TeyssierJ,CloeckaertA,etal.ParticipationofthemolecularchaperoneDnaKinintracellulargrowthofBrucellasuiswithinU937derivedphagocytes[J].MolMicrobiol,1996,20(4):701-71220BlascoJM.Brucellaovis.AnimalBrucellosis[M].CRCPress,BocaRatonFL.1990:351-378 内蒙古农业大学硕士学位论文3121CarmichaelLE.Brucellacanis.AnimalBrucellosis[M].CRCPress,BocaRatonFL.1990:335-35022NielsenK,SmithP,YuW,etal.SalmonellaentericaSerotypeUrbanainterfereswithbrucellosisserology[J].JImmunoassayImmunochem,2007,28(3):289-9623BehKJ.DistributionofBrucellaantibodyamongimmunoglobulinclassesandalowmolecularweightantibodyfractioninserumandwheyofcattle[J].Res.Vet,1973,14(3):381–38424BehKJ.QuantitativedistributionofBrucellaantibodyamongstimmunoglobulinclassesinvaccinatedandinfectedcattle[J].Res.Vet,1974,17(1):1–425AllanG,ChappelR,WilliamsonP,etal.Aquantitativecomparisonofthesensitivityofserologicaltestsforbovinebrucellosistodifferentantibodyclasses[J].Hyg,1976,76(2):287–29826NielsenK,GallD.Fluorescencepolarizationassayforthediagnosisofbrucellosis:areview[J].ImmunoassayImmunochem.2001,22(3):183–20127毛开荣.动物布鲁氏菌病防治研究进展[J].中国兽药杂志,2003,37(9):37-4028NielsenK,KellyL,GallD,etal.Comparisonofenzymeimmunoassaysforthediagnosisofbovinebrucellosis[J].Prev.Vet.Med,1996,26(1):17-3229AlDahoukS,FlechePL,JacquesIetal.EvaluationofbrucellaMLVAtypingforhumanbrucellosis[J].MicrobiolMethods2007,69(1):137–4530柳建新,陈创夫,王远志.布鲁氏菌致病及免疫机制研究进展[J].动物医学进展,2004,25(3):62-6531徐卫民,施世锋,杨洋等.浙江省首例布氏菌病调查[J].中国地方病防治杂志,2005,20(3):170-17132NielsenK.Diagnosisofbrucellosisbyserology[J].VeterinaryMicrobiology,2002,90(1-4):447-45933RamonD,AuroraC,JavierA,etal.TheRoseBengalTestinHumanBrucellosis:ANeglectedTestfortheDiagnosisofaNeglectedDisease[J].PLoSNeglTropDis,2011,5(4):95034OIE.Bovinebrucellosis/OIETerrestrialManual2009[M].2009,1-2435OIE.ManualofStandardsforDiagnosticTestsandVaccines-Bovinebrucellosis[M].OIE,Paris.2008,624-65936RaulC,MainarJ,PilarM,etal.SpecificitydependencebetweenserologicaltestsfordiagnosingbovinebrucellosisinBrucella-freefarmsshowingfalsepositiveserologicalreactionsduetoYersiniaenterocoliticaO:9[J].Can.Vet,2005,46(10):913-916 32一起布鲁氏菌病的诊断与布鲁氏菌病检测方法的比较37陈慧燕.麦氏比浊仪检测布鲁氏菌病-特异性血清学SAT探讨[J].中国卫生检验杂志,2009,19(6):132338Garin-BastujiB,BlascoJM,GrayonM,etal.Brueellamelitensisinfectioninsheep:presentandfuture[J].VetRes,1998,29(3-4):255-27439雷连成,陈伟.布鲁氏菌鉴定和检测方法研究进展[J].动物医学进展,2002,23(2):22-2440CakanG,BezirciFB,KackaA,etal.Assessmentofdiagnosticenzyme-linkedimmunosorbentassaykitandserologicalmarkersinhumanbrucellosis[J].JInfectDis,2008,61(5):366-37041唐利燕,陈创夫,王远志等.布鲁氏菌bp26基因的原核表达及BP26-间接ELISA方法的初步建立[J].石河子大学学报,2009,27(4):43842RomeroC,PardoGM,GrilloMJ,etal.EvaluationofPCRandindirectenzyme-linkedimmunosorbentassayonmilksamplesfordiagnosisofBrucellosisindairycattle[J].JClinMicrobiol,1995,33(12):3198-320043NielsenK,CherwonogrodskyJ,DuncanR,etal.EnzymeimmunoassayforthedifferentiationofantibodyresponseofBrucellaabonusinfectedandvaccinatedcattle[J].JVetRes,1989,50(1):5-944WrightPF,TounkaraK,LelentaM,etal.Internationalreferencestandards:antibodystandardsfortheindirectenzymelinkedimmunosorbentassay[J].RevSciTech,1997,16(3):824-83245NielsenK,KellyL,GallD,etal.Improvedcompetitiveenzymeimmunoassayfordiagnosisofbovinebrucellosis[J].VetImmunolImmunopathol,1995,46(3):285-29146NidiaEL,LuisF,SandraMA,etal.CompetitiveenzymeimmunoassayfordiagnosisofhumanBrucellosis[J].JClinMicrobiol,1999,37(10):3245-324847AnastasiosM,AthanasiaS,GeorgiosC,etal.ValidationofacompetitiveELISAfordiagnosisofBrucellamelitensisinfectioninsheepandgoats.VetJ.2008,177(3):411-41748AnaC,PajuabaAM,DeiseA,etal.EvaluationofIndirectEnzyme-LinkedImmunosorbentAssaysandIgGAvidityAssaysUsingaProteinA-PeroxidaseConjugateforSerologicalDistinctionbetweenBrucellaabortusS19-Vaccinatedand-InfectedCows[J].ClinVaccineImmunol,2010,17(4):588-59549NielsenK,SmithP,YuWL,etal.Validationofasecondgenerationcompetitiveenzymeimmunoassay(cELISA)forthediagnosisofbrucellosisinvariousspeciesofdomesticanimals[J].Vet.Immunol.2008,125(3-4):246-250 内蒙古农业大学硕士学位论文3350LiuWX,HuS,QiaoZJ,etal.Expression,purification,andimprovedantigenicspecificityofatruncatedrecombinantbp26proteinofBrucellamelitensisM5-90:apotentialantigenfordifferentialserodiagnosisofbrucellosisinsheepandgoats[J].BiotechnolApplBiochem,2011,58(1):32-3851MyersD,JonesL,Varela-DiazVM.StudiesofantigensforcomplementfixationandgeldiffusiontestsinthediagnosisofinfectionscausedbyBrucellaovisandotherBrucella[J].ApplMicrobiol,1972,23(5):894-90252BURGESSGW,NORRISMJ.Evaluationofthecoldcomplementfixationtestfordiagnosisofovinebrucellosis[J].AustVetJ,1982,59(1):479-48053SearsonJE.SensitivityandspecificityoftwomicrotitrecomplementfixationtestsforthediagnosisofBrucellaovisinfectioninrams[J].Aust.Vet.J,1982,58(1):5-754MarinCM,JiminezdeBaguesMP,BlascoJM,etal.ComparisonofthreeserologicaltestsforBrucellaovisinfectionoframsusingdifferentantigenicextracts[J].Vet.Rec,1989,125(20):504-50855于桂芳,温富勇,王国良等.奶牛布病试管凝集试验与补体结合试验结果差异分析[J].中国动物检疫,2006,23(12):34-3556RogersRJ,CookDR,KettererPJ,etal.AnevaluationofthreeserologicaltestsforantibodytoBrucellosisinpigs[J].AustVetJ,1989,66(3):77-8057MunozP,MarinCM,MonrealD,etal.EfficacyofseveralserologicaltestsandantigensfordiagnosisofcattlebrucellosisinthepresenceoffalsepositiveserologicalresultsduetoYersiniaenterocoliticaO:9[J].ClinDiagnLabImmunol2005,12(1):141-15158LuceroNE,EscobarGI,AyalaSM,etal.Fluorescencepolarizationassayfordiagnosisofhumanbrucellosis[J].JMedMicrobial,2003,52(10):883-88759McgivenJA,TukerJD,PerrettLL,etal.ValidationofFPAandcELISAforthedetectionofantibodiestoBrucellaabortusincattleseraandcomparisontoSAT,CFTandiELISA[J].JImmunolMethods,2003,278(1-2):171-17860NielsenK,GallD,JolleyM,etal.AhomogeneousfluorescencepolarizationassayfordetectionofantibodytoBrucellaabortus[J].JImmunolMethods,1996,195(1-2):161-16861SanchezVA,UrdanetaFM,RubioFE,etal.DevelopmentandevaluationofaserologicalprotocoloffluorescencepolarizationforthepreliminarystudyofBrucellasppantibodiesinhumans[J].InvestClin,2011,52(1):48-5762徐卫民,朱明东,王衡等.快速检测布鲁氏菌抗体的滴金免疫测定法的建立及应用[J].中国卫生检验杂志,2006,16(1):18 34一起布鲁氏菌病的诊断与布鲁氏菌病检测方法的比较63HasanjaniRMR,SoleimaniAminMJ,AbdoelTH,etal.ApplicationofarapidandsimpleBrucella-specificIgMandIgGantibodytestfortheserodiagnosisofbrucellosisinahospitalinIran[J].TransRSocTropMedHyg.2005,99(10):744-75064HasanI,TuranB,OmerE,etal.UseoftheBrucellaIgMandIgGflowassaysintheserodiagnosisofhumanbrucellosisinanareaendemicforbrucellosis[J].AmJTropMedHyg.2004,70(6):688-69465ThompsonI,McGivenJ,SawyerJ,etal.Competitiveelectrochemiluminescencewashandno-washimmunoassaysfordetectionofserumantibodiestosmoothBrucellastrains[J].ClinVaccineImmunol.2009,16(5):765-77166RiberU,JungersenG.CellmediatedimmuneresponsesdifferentiateinfectionswithBrucellasuisfromserotypeO:9inpigs[J].VetImmunolImmunopathol,2007,116(1-2):13-2567ThirwallR,CommanderN,BrewS,etal.Improvingthespecificityofimmunodiagnosisforporcinebrucellosis[J].VetResCommun.2008,32(3):209-21368MehmetO,BahadirF.AComparisonofImmuncaptureAgglutinationandELISAMethodsinSero-logicalDiagnosisofBrucellosis[J].InternationalJournalofMedicalSciences,2011,8(5):428-43269ManturBG,AmarnathSK,ParandeAM,etal.Comparisonofanovelimmunocaptureassaywithstandardserologicalmethodsinthediagnosisofbrucellosis[J].ClinLab,2011,57(5-6):333-34170BailyGG,KrahnJB,DrasarBS,etal.DetectionofBrucellamelitensisandBrucellaabortusbyDNAamplification[J].JTropMedHyg,1992,95(4):271-27571SerpeL,GalloP,FidanzaN,etal.Single-stepmethodforrapiddetectionofBrucellaspp.insoftcheesebygene-specificpolymerasechainreaction[J].DairyRes1999,66(2):313-31772唐浏英,尚德秋,李元凯等.应用分子生物学技术检测布氏菌抗原的研究:聚合酶链反应检测布氏菌抗原的研究[J].中国地方病防治杂志,1995,10(4):199-20173RijpensNP,JannesG,VanAsbroeckM,etal.DirectdetectionofBrucellaspp.inrawmilkbyPCRandreversehybridizationwith16S-23SrRNAspacerprobes[J].ApplEnvironMicrobiol,1996,62(5):1683-168874BrickerBJ,EwaltDR,MacMillanAP,etal.MolecularcharacterizationofBrucellastrainsisolatedfrommarinemammals[J].JClinMicrobio,2000,38(3):1258-126275KeidLB,SoaresRM,VasconcellosSA,etal.ApolymerasechainreactionfordetectionofBrucellacanisinvaginalswabsofnaturallyinfectedbitches[J].Theriogenology,2007,68(9):1260-1270 内蒙古农业大学硕士学位论文3576邱昌庆,曹小安,杨春华等.乳牛布鲁氏菌病病原DNA快速检测技术的研究[J].中国兽医科技,2005,35(2):85-8977MukherjeeF,JainJ,PatelV,etal.Multiplegenus-specificmarkersinPCRassaysimprovethespecificityandsensitivityofdiagnosisofbrucellosisinfieldanimals[J].JMedMicrobiol,2007,56(10):1309-131678BaddourMM,AlkhalifaDH.EvaluationofthreepolymerasechainreactiontechniquesfordetectionofBrucellaDNAinperipheralhumanblood[J].CanJMicrobiol,2008,54(5):352-35779Leal-KlevezasDS,Martinez-VazquezIO,Lopez-MerinoA,etal.Single-stepPCRfordetectionofBrucellaspp.Frombloodandmilkofinfectedanimals[J].JClinMicrobiol,1995,33(12):3087-309080SangariFJ,AgueroJ.IdentificationofBrucellaabortusB19vaccinestrainbythedetectionofDNApolymorphismattheerylocus[J].Vaccine,1994,12(5):435-43881VemulapalliR,McQuistonJR,SchurigGG,etal.IdentificationofanIS711elementinterruptingthewboAgeneofBrucellaabortusvaccinestrainRB51andaPCRassaytodistinguishstrainRB51fromotherBrucellaspeciesandstrains[J].ClinDiagnLabImmunol,1999,6(5):760-76482CloeckaertA,GrayonM,GrepinetO.AnIS711elementdownstreamofthebp26geneisaspecificmarkerofbrucellaspp.Isolatedfrommarinemammals[J].ClinDiagnLabImmunol,2000,7(5):835-83983CloeckaertA,GrayonM,GrepinetO,etal.ClassificationofBrucellastrainsisolatedfrommarinemammalsbyinfrequentrestrictionsite-PCRanddevelopmentofspecificPCRidentificationtests[J].MicrobesInfect,2003,5(7):593-60284ImaokaK,KimuraM,SuzukiM,etal.SimultaneousdetectionofthegenusBrucellabycombinatorialPCR[J].InfectDis,2007,60(2-3):137-13985EwaltDR,BrickerBJ.ValidationoftheabbreviatedBrucellaAMOSPCRasarapidscreeningmethodfordifferentiationofBrucellaabortusfieldstrainisolatesandthevaccinestrains,19andRB51[J].JClinMicrobiol,2000,38(8):3085-308686OcampoSosaAA,AgueroBalbinJ,Garcia-LoboJM.DevelopmentofanewPCRassaytoidentifyBrucellaabortusbiovars5,6and9andthenewsubgroup3bofbiovar3[J].VetMicrobiol,2005,110(1-2):41-5187BrickerBJ,EwaltDR,OlsenSC,etal.EvaluationoftheBrucellaabortusspecies-specificpolymerasechainreactionassay,animprovedversionoftheBrucellaAMOSpolymerasechainreactionassayforcattle[J].JVetDiagnInvest,2003,15(4):374-378 36一起布鲁氏菌病的诊断与布鲁氏菌病检测方法的比较88Ferrao-BeckL,CardosoR,MunozPM,etal.DevelopmentofamultiplexPCRassayforpolymorphismanalysisofBrucellasuisbiovarscausingbrucellosisinswine[J].VetMicrobiol,2006,115(1-3):269-27789ReesRK,GravesM,CatonN,etal.SingletubeidentificationandstraintypingofBrucellamelitensisbymultiplexPCR[J].JMicrobiolMethods,2009,78(1):66-7090Lopez-GoniI,Garcia-YoldiD,MarinCM,etal.EvaluationofamultiplexPCRassay(Bruceladder)formoleculartypingofallBrucellaspecies,includingthevaccinestrains[J].JClinMicrobiol,2008,46(10):3484-348791Mayer-SchollA,DraegerA,GollnerC,etal.AdvancementofamultiplexPCRforthedifferentiationofallcurrentlydescribedBrucellaspecies[J].JMicrobiolMethods,2010,80(1):112-11492HuberB,ScholzHC,LuceroN,etal.DevelopmentofaPCRassayfortypingandsubtypingofBrucellaspecies[J].JMedMicrobiol,2009,299(8):563-57393LeFlecheP,JacquesI,GrayonM,etal.EvaluationandselectionoftandemrepeatlociforaBrucellaMLVAtypingassay[J].BMCMicrobiol,2006,6:994Al-AjlanHH,IbrahimAS,Al-SalamahAA.ComparisonofdifferentPCRmethodsfordetectionofBrucellaspp.inhumanbloodsamples[J].PolJMicrobiol,2011,60(1):27-3395RedkarR,RoseS,BrickerB,etal.Real-timedetectionofBrucellaabortus,BrucellamelitensisandBrucellasuis[J].MolCellProbes,2001,15(1):43-5296Queipo-OrtunoMI,ColmeneroJD,RegueraJM,etal.RapiddiagnosisofhumanbrucellosisbySYBRGreenI-basedreal-timePCRassayandmeltingcurveanalysisinserumsamples[J].ClinMicrobiolInfect,2005,11(9):713-71897KattarMM,ZallouaPA,ArajGF,etal.Developmentandevaluationofreal-timepolymerasechainreactionassaysonwholebloodandparaffin-embeddedtissuesforrapiddiagnosisofhumanbrucellosis[J].DiagnMicrobiolInfectDis,2007,59(1):23-3298HinicV,BrodardI,ThomannA,etal.NovelidentificationanddifferentiationofBrucellamelitensis,B.abortus,B.suis,B.ovis,B.canis,andB.neotomaesuitableforbothconventionalandreal-timePCRsystems[J].MicrobiolMethods,2008,75(2):375-37899Queipo-OrtunoMI,ColmeneroJD,BravoMJ,etal.Usefulnessofaquantitativereal-timePCRassayusingserumsamplestodiscriminatebetweeninactive,serologicallypositiveandactivehumanbrucellosis[J].ClinMicrobiolInfect,2008,14(12):1128-1134 内蒙古农业大学硕士学位论文37100KattarMM,ZallouaPA,ArajGF,etal.Developmentandevaluationofreal-timepolymerasechainreactionassaysonwholebloodandparaffin-embeddedtissuesforrapiddiagnosisofhumanbrucellosis[J].DiagnMicrobiolInfectDis,2007,59(1):23-32101BounaadjaL,AlbertD,ChenaisB,etal.Real-timePCRforidentificationofBrucellaspp:acomparativestudyofIS711,bcsp31andpertargetgenes[J].VetMicrobiol,2009,137(1-2):156-164102VladimiraH,IsabelleB,AndreasT,etal.IS711-basedreal-timePCRassayasatoolfordetectionofBrucellaspp.inwildboarsandcomparisonwithbacterialisolationandserology[J].BMCVeterinaryResearch,2009,5:22103FretinD,WhatmoreAM,AlDahoukS,etal.Brucellasuisidentificationandbiovartypingbyreal-timePCR[J].VetMicrobiol,2008,131(3-4):376-385104ScottJC,KoylassMS,StubberfieldMR,etal.MultiplexassaybasedonsinglenucleotidepolymorphismsforrapididentificationofBrucellaisolatesatthespecieslevel[J].ApplEnvironMicrobiol,2007,73(22):7331-7337105FosterJT,OkinakaRT,SvenssonR,etal.Real-timePCRassaysofsingle-nucleotidepolymorphismsdefiningthemajorBrucellaclades[J].JClinMicrobiol,2008,46(1):296-301106Queipo-OrtunoMI,JuanD,BermudezP,etal.Colmenero.RapidDifferentialDiagnosisbetweenExtrapulmonaryTuberculosisandFocalComplicationsofBrucellosisUsingaMultiplexReal-TimePCRAssay[J].PLoSONE,4(2):e4526107CerekciA,KilicS,BayraktarM,etal.Comparisonofconventionalmethodsandreal-timemultiplexpolymerasechainreactionforidentificationandtypingofBrucellaisolatesofhumanorigin[J].MikrobiyolBul,2011,45(3):392-400108JonasM,Winchell,BernardJ.etal.RapidIdentificationandDiscriminationofBrucellaIsolatesbyUseofReal-TimePCRandHigh-ResolutionMeltAnalysis[J].JClinMicrobiol,2010,48(3):697-702109HuynhLY,ErtMNV,HadfieldT,etal.Multiplelocusvariablenumbertandemrepeat(VNTR)analysis(MLVA)ofBrucellaspp.Identifiesspecies-specificmarkersandinsightsintophylogeneticrelationships[M].HumanaPress,Totowa,NJ.2008,47-54110WhatmoreAM,PerrettLL,MacmillanAP.CharacterizationofthegeneticdiversityofBrucellabymultilocussequencing[J].BMCMicrobiol.2007,7:34111BuyukcangazE,SenA,CarliKT,etal.ComparisonofdirectcultureversusPCRforthedetectionofBrucellainabortedfetusesofcattleandsheepinTurkey[J].VetRec,2011,168(16):430 38一起布鲁氏菌病的诊断与布鲁氏菌病检测方法的比较112XavierMN,SilvaTM,CostaEA,etal.Developmentandevaluationofaspecies-specificPCRassayforthedetectionofBrucellaovisinfectioninrams[J].VetMicrobiol,2010,145(1-2):158-164113ArasZ,UcanUS.DetectionofBrucellacanisfrominguinallymphnodesofnaturallyinfecteddogsbyPCR[J].Theriogenology,2010,74(4):658-662114KeidLB,SoaresRM,VasconcellosSA,etal.ComparisonofaPCRassayinwholebloodandserumspecimensforcaninebrucellosisdiagnosis[J].VetRec,2010,167(3):96-99115Leal-KlevezasDS,Martinez-VazquezIO,Garcia-CantuJ,etal.UseofpolymerasechainreactiontodetectBrucellaabortusbiovar1ininfectedgoats[J].VetMicrobiol,2000,75(1):91-97116NavarroE,CasaoMA,SoleraJ.DiagnosisofhumanbrucellosisusingPCR[J].ExpertRevMolDiagn,2004,4(1):115-123117TomasoH,KattarM,EickhoffM,etal.ComparisonofcommercialDNApreparationkitsforthedetectionofBrucellaintissueusingquantitativereal-timePCR[J].BMCInfectDis,2010,10:100118WiedbraukDL,WernerJC,DrevonAM.InhibitionofPCRbyaqueousandvitreousfluids[J].ClinMicrobiol,1995,33(10):2643-2646119ElKholyAA,GomaaHE,ElAnanyMG,etal.DiagnosisofhumanbrucellosisinEgyptbypolymerasechainreaction[J].EastMediterrHealthJ,2009,15(5):1068-1074120MotiYG,JatinderPSG,AnilKA,etal.PolymeraseChainReaction(PCR)AssayforRapidDiagnosisandItsRoleinPreventionofHumanBrucellosisinPunjab,India[J].IntJPrevMed.2011,2(3):170-177121HaerryTE,GehringWJ.IntronofthemouseHoxa-7genecontainsconservedhomedomainbindingsitesthatcanfunctionasanenhancerelementinDrosophila[J].ProcNatlAcadSciUSA,1996,93(24):13884-13891122尚德秋,布氏杆菌病研究进展[J].中国地方病防治杂志,2004,19(4):204-212123尚德秋.布鲁氏菌病流行病学及分子生物学研究进展[J].中国地方病防治杂志,1996,11(6):339124MadkourMM.Brucellosis[M].London:Butterworths,1989125杨向新,杜伟,杜志强.骨关节布氏杆菌病3例分析[J].临床军医杂志,2007,35(2):315126GotuzzoE,CellilloC.Brucella.In:GorbachSL,BartlettJG,BlacklowNR,eds.InfectiousDiseases;2ndEdition[M].Philadelph-ia:WBSaundersCo.1992,1513-1521127尚德秋.中国布鲁氏菌病防治科研50年[J].中华流行病学杂志,2000,21:55-57128范伟兴,钟旗,何倩倪等.几种布鲁氏菌病血清学诊断方法的比较研究[J].中国动物检疫,2006,23(06):31-33 内蒙古农业大学硕士学位论文39129RichtzenhainLJ,CortezA,HeinemannMB,etal.AmultiplexPCRforthedetectionofBrucellaspp.AndLeptopiraspp.DNAfromabortedbovinefetuses[J].VetMicrobiol,2002,87(2):139-147130JimenezMP,MarinC,BlascoJM.Effectofantibiotictherapyandstrain19vaccinationonthespreadofBrucellamelitensiswithinaninfecteddairyherd[J].PrevVetMed,1991,11(1):17-24131NielsenK,KellyL,GallD,etal.Comparisonofenzymeimmunoassaysforthediagnosisofbovinebrucellosis[J].PrevVetMed,1996,26(1):17-32132NielsenK,GallD,SmithP,etal.ComparisonofserologicaltestsforthedetectionofovineandcaprineantibodytoBrucellamelitensis[J].RevSciTech,2004,23(3):979-987133HamdyME,AminAS.DetectionofBrucellaspeciesinthemilkofinfectedcattle,sheep,goatsandcamelsbyPCR[J].TheVeterinaryJournal,2002,163(3):299-305134刘国栋,崔步云,刘荣臻等.布鲁氏菌多重聚合酶链式反应鉴定研究[J].疾病监测,2008,23(5):271-273135姜海,崔步云,赵鸿雁等.AMOS-PCR对布鲁氏菌种型鉴定的应用[J].中国人兽共患病学报,2009,25(2):107-109136PhilippeLF,IsabelleJ,MaggyG,etal.EvaluationandselectionoftandemrepeatlociforaBrucellaMLVAtypingassay[J].BMCMicrobiology,2006,6(9):1-9137MegersaB,BiffaD,NiguseF,etal.CattlebrucellosisintraditionallivestockhusbandrypracticeinSouthernandEasternEthiopia,anditszoonoticimplication[J].ActaVeterinariaScandinavica,2011,53:24138ArizaJ,PigrauC,CanasC,etal.Currentunderstandingandmanagementofchronichepatosplenicsuppurativebrucellosis[J].ClinInfectDis,2001,32(7):1024-1033139EwalDR,BriekerBJ.ValidationoftheabbreviatedBrueellaAMOSPCRasarapidscreeningmethodfordifferentiationofBrucellaabortusfieldstrainisolatesandthevaccinestrains,19andRB51[J].JClinMicrobiol,2000,38(8):3085-3086140VergerJM,GrimontF,GrimontPAD,etal.Brucella,amonospecificgenusasshownbydeoxyribonucleicacidhybridization[J].IntJSystBacteriol,1985,35(3):292-295141CloeckaertA,GrayonM,GrepinetO.IdentificationofBrucellamelitensisvaccinestrainRev.1byPCR-RFLPbasedonamutationintherpsLgene[J].Vaccine,2002,20(19-20):2546-2550142DenoeudF,VergnaudG.Identificationofpolymorphictandemrepeatsbydirectcomparisonofgenomesequencefromdifferentbacterialstrains:aWeb-basedresource[J].BMCBioinformatics,2004,5:4143TheMLVAWebServicehttp://bacterial-genotyping.igmors.upsud.fr 40一起布鲁氏菌病的诊断与布鲁氏菌病检测方法的比较144AlDahoukS,HagenRM,NocklerK,etal.Failureofashort-termantibiotictherapyforhumanbrucellosisusingciprofloxacin.AstudyoninvitrosusceptibilityofBrucellastrains[J].Chemotherapy,2005,51(6):352-356145范伟兴,钟旗,何倩倪等.几种布鲁氏菌病血清学诊断方法的比较研究[J].中国动物检疫,2006,23(6):31-33146张国祥,李建强,王英珍等.应用酶联SPA免疫吸附试验(ELISA)检测奶山羊布氏杆菌病[J].西北农业大学学报,1986,14(1):25-30147GrushinaT,AtshabarB,SyzdykovM,etal.Universalindirectenzyme-linkedimmunosorbentassayformonitoringofhumanandanimalbrucellosisinKazakhstan[J].Vaccine,2010,28(5):46-48148刘钟瀚,李健,廖耘等.成都地区汉族献血者ABO、Rh红细胞血型的分布[J].中国输血杂志,2005,18(5):415-416149谢昕,段希武,戚汉君.应用酶标记免疫吸附试验(ELISA)检测牛布氏杆菌病试验[J].中国兽医杂志,1981,7(4):8150黄海波.生物素-亲和素免疫酶标法检测绵羊布氏杆菌抗体的研究[J].中国兽医科技,1987,10:325151FranciscoAU,AlejandraEC,SusanaE,etal.EvaluationofanindirectELISAforthediagnosisofbovinebrucellosis[J].JVETDiagnInvest,1995,7(4):473-475 内蒙古农业大学硕士学位论文41作者简介李慧，女，汉族，1988年5月出生于山西省长治市，2009年毕业于山西农业大学动物医学专业，获农学学士学位。2009年考入内蒙古农业大学兽医学院就读动物传染病学专业，师从关平原教授。攻读硕士期间发表论文情况：李慧,范伟兴,关平原.布鲁菌病血清学检测方法的比较.畜牧与饲料科学（基础科学版）,2012,33(3):21-22. 42一起布鲁氏菌病的诊断与布鲁氏菌病检测方法的比较 内蒙古农业大学硕士学位论文43