牛呼吸系统疾病综合征PCR方法建立及初步应用

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学校代码：：分类号学号：密级：公开硕士学位论文牛呼吸系统疾病综合征方法建立及初步应用研究生：指导教师：侯喜林教授专业领域)：预防兽医学研究方向：传染病的诊断与防制申请学位类别：农学硕士所在学院：动物科技学院中国大庆 Universitycode：：：： 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得黑龙江八一农垦大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名日期：赠年月左日关于论文使用授权的说明本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使用学位论文的规定,即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八一农垦大学可以用不同方式在不同刊物上发表,传播学位论文的全部或部分内容。保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：日期：月日 摘要牛呼吸道合胞体病毒(,牛传染性鼻气管炎病毒牛副流感病毒型,均是主要的原发性呼吸系统疾病病原体,均会引起牛呼吸系统疾病综合征(,,且常呈混合感染。是十分常见的,并具有很高的感染率和死亡率,是困扰养牛业的世界性难题。被美国全国牛场主协会等组织认为是养牛业的头等大病,被欧洲称为三大牛病之一。在我国该病的感染率和发病率也在不断上升,对养牛业造成了严重的经济损失。本研究根据上发表的牛呼吸道合胞体病毒核衣壳蛋白基因序列,牛传染性鼻气管炎病毒保守基因序列和牛副流感病毒型核衣壳蛋白基因序列,设计并合成对特异性引物。优化三重反应条件,建立了种病毒的三重方法,可同时扩增出株株和株大小的特异性片段,而对牛腺病毒型、牛无奖体和正常细胞扩增结果均为阴性。该三重技术能检出的敏感性可达,的敏感性可达和的敏感性可达。用建立的、和三重检测方法,和双重检测方法,单重检测方法,单重检测方法,单重检测方法和病毒分离鉴定方法对临床上的份病料进行。结果显示,三重方法,双重方法和单重方法检测结果符合率为病毒分离鉴定方法阳性检出率较低。表明建立的关于牛呼吸系统疾病综合征的检测方法有一定临床应用价值,可用于对种病毒的同时检测和鉴别诊断。关键词：牛呼吸道合胞体病毒；传染性牛鼻气管炎病毒；牛副流感病毒型；多重聚合酶链式反应 Abstract(Bovinerespiratorysyncytialvirus?BRSV),(Infectionsbovinerhinotracheitisvirus,IBRV),(Bovineparainfluenzavirus3,,,,,,； 目录综述病原学流行病学临床症状诊断综合防治研究目的及意义第二章单重检测方法的建立与初步应用材料方法结果第三章和双重检测方法的建立与初步应用材料方法结果第四章、和三重检测方法的建立与初步应用材料方法结果第五章讨论第六章结论致谢作者简历 第一章综述第一章综述牛呼吸道合胞体病毒(牛传染性鼻气管炎病毒(,牛副流感型病毒,是危害牛类养殖业发展的一类重要病毒性牛呼吸道传染病,每年给养牛业造成了巨大的经济损失,三种疾病均是牛呼吸系统疾病的多发性病毒,且常呈混合感染,被称为牛呼吸系统疾病综合征。目前对种疾病的诊断方法多釆用病原的分离鉴定及常规的血清学检测方法,检测结果尚存在不确定性,不能满足临床诊断及治疗的需要。因此,有必要建立快速的早期诊断和检测方法,以便可以釆取更有效的针对性防治措施,减少这些疾病对养牛业造成的巨大经济损失。病原学的病原学牛呼吸道合胞体病毒(,为单分子负链病毒目(副黏病毒科(肺病毒亚科肺病毒属(的成员⑴。的基本结构与人的呼吸道合胞体病毒(相类似,并且发现它们具有相同的抗原,但有研究结果表明和山羊呼吸道合胞体病毒(的抗原结构是最相似的。牛呼吸道合胞体病是由引起的一种急性、热性牛呼吸道传染病。属于副點病毒科肺病毒属,为负股的单链病毒,是引起牛和其他反当动物急性病毒呼吸道疾病的主要病原之一。该病于年曾有记载,于年首次由患有呼吸道疾病症状的牛体内分离得到。该病毒对渎牛的生长发育也有较大影响,可使肉用牛的增重缓慢和乳用牛的泌乳量明显下降,感染牛的发病率十分高,可达到死亡率在一些病毒爆发地区也可达到以上。,同时也可通过二次感染或病毒携带者在畜群中长期持续存在,使病毒的治疗费用持续增加,给牛类养殖业造成了非常巨大的经济损失近些年来,我国分别从美国、加拿大、日本、澳大利亚等国的高发地区引进了各品种高产牛,但到目前为止并没有被列入到家畜进口检疫范围之内,因此对的研究对我国畜牧业的发展具有深远意义。 第一章综述以基因组转录和复制的模版。基因组的’及末端各有一段前导区域(及尾随区域(。病毒基因的转录从’末端的前导区域开始,按顺序启动和停止转录病毒的种特异性亚基因组转录顺序为’’。基因起始(,和基因终止(,信号两端保守序列作为的转录信号,它们位于基因组的两端转录单位中只有和有部分重叠。控制转录是通过转录梯度(,贴近启动子的基因(其转录梯度是高于下游的(见图。的基因组可转录种之后翻译种蛋白质。非结构蛋白及的存在可作为肺病毒属基因组的标志性特征,以及上文提到的和重叠区域转录后引起的和蛋白的合成■■■■■—‘■—‘：：：一“务▼▼■■■‘一图牛呼吸道合胞体病毒的转录、翻译和复制的基因组经转录为种之后可翻译种蛋白质。种蛋白包括种病毒核壳体蛋白(大聚合酵蛋白、憐蛋白、核衣壳蛋白种跨膜蛋白(小疏水蛋白、附着蛋白、融合蛋白种非结构蛋白(、,种非糖基化基质蛋白(、、以上个蛋白中,、、、为病毒囊膜主要组成成分,、、为核衣壳主要组成成分,位于核衣壳和囊膜之间(见图。 第一章综述图牛呼吸道合胞体病毒示意图的病原学牛传染性鼻气管炎病毒(,又称为牛疱疫病毒型(,是疱疫病毒科(,抱疫病毒亚科(水痘病毒属(的成员。该病毒与喉气管炎病毒(水痘带状疱疫病毒(、马疱疫病毒型(、伪狂犬病病毒(同属于疱疫病毒亚科。基因组为双股分子,长为,其中含量较高可达见图。基因组被和,各,俩方向相反序列相同的重复序列单位分幵,形成一短独特区(,和一个长独特区(,区和其两侧的两个重复序列能够沿轴旋转°,这样就可形成病毒分子的两种异构体。垂雌垂—■图基因组结构 第一章综述的病原学牛副流感病毒型(,属于副粘病毒科副粘病毒亚科副粘病毒属的成员之一,与人副流感病毒型(的抗原具有相关性属于副點病毒科(,呼吸道病毒属(,是引起牛呼吸道综合症(的主要病原之一,也是一类重要的人畜共患病毒为负股单链带有囊膜的病毒,是引发牛和其它反当动物急性病毒性呼吸道疾病的主要病毒之一。年等学者于美国西部某牛场的牛体中分离得到以后,法国、日本、前苏联、澳大利亚、巴拿马、丹麦、加拿大和意大利等国也相继分离出病毒,而目前我国尚没有关于该病毒分离的报道我国尚有许多地区的牛群中患有急性呼吸道疾病的情况非常普遍,这对养牛业的危害十分严重,从发病情况入手,牛副流感型病毒是引起牛呼吸道疾病的主要病原体之一。序列为的基因组排列顺序。各单独基因之间由保守序列相连接,各基因末端均带有与互补的多聚(序列和转录终止序列,在基因的起始端有个核苷酸是保守的：丨。在起始端有半保守的个核苷酸：‘见图。的基因组可翻译种蛋白主要包括蛋白、辅助核衣壳蛋白(蛋白和蛋白)、蛋白、蛋白、蛋白、蛋白、蛋白。 第一章综述、—图牛副流感病毒型示意图副粘病毒在感染过程中,其每一段不同的基因都有相对应的病毒的基因组经多拷贝转录加工后获得这些单独的,还是由于各基因单独转录后的产物,目前尚未可说明。副粘病毒的复制机制遵循负股的复制机制(见图钱徵糊觸聚…二：：《胸；图牛副流感病毒型转录、翻译示意图、 第一章综述流行病学呈现世界性分布,日本、美国、加拿大、比利时、英格兰、瑞士等国家已从病牛体内分离得到该病毒。目前有相关报道证实,亚洲、美洲和欧洲均从病牛体内分离到该病毒。新西兰、北爱尔兰、美国和加拿大在绵羊的体内已经检测到了抗体。最近的一些相关报道证实,在马、猪和山羊血液中也检测到了抗体。然而目前我国尚未有在牛血清内检测到抗体的相关报道。的传染主要通过带毒牛和病牛,感染途径有多重,对于该病毒大多数动物体都具有一定的抵抗力。随着环境的改变,带毒牛体内的病毒可以被激活,而使带毒牛变成病牛。带毒牛中隐性带毒牛是最危险的传染源,具有非常高的危险性。可以通过飞沫、尘埃、空气等媒介体或病牛之间的交配而传播开来,生殖系统与呼吸系统为其主要的传播途径。病毒随鼻汁排出体外,污染饲草、饮水及空气等,使其成为感染媒介。病牛通过咳嗽、打喷噴及剧烈呼吸,将含有病毒的颗粒传播到空气中,经鼻孔、鼻镜、眼睛等呼吸道粘膜组织使易感牛感染。病毒也可通过垂直传播方式从母牛体内传给新生小牛,同时自然交配和人工授精也可传播。牛、人、猪及猴是疾病的易感动物。本病的主要传染源有带毒牛和病牛。本病可通过飞沬经呼吸道感染,也可通过生殖道感染。牛在无其他因素影响时,感染本病毒,只引起轻微的临床症状,或称亚临床症状。但是一旦受到拥挤、气候剧变、饲料突变、长途运输等诱因的影响时,随着病情加重,会伴有典型的临床症状出现。由于在养殖过程中各种诱因的影响,该病很少单纯感染,多是多种微生物混合感染,病型复杂,往往预后不良。目前世界范围内,病传播广泛。在芬兰、丹麦、日本、法国等国家都已分离出该病毒,且在检测牛体内特异性抗体时,大多数牛体内都存在。目前在国内很多地区的牛群中,呼吸道疾病的发生是很普遍的,时刻危害着养牛业的发展,是引起牛病毒性呼吸道疾病的主要病原之一。但目前为止,我国对的研究还很少。 第一章综述临床症状引起的主要临床症状呼吸道合胞体病毒病的潜伏期为自然感染的接牛以流涎、流泪、流鼻汁、喘呜、咳嗽、呼吸急迫、体温升高、精神不振和厌食为主要症状。体温可达到°°,高温稽留至少。症状一般以湿性咳嗽为主,一般病程天左右,严重的可持续个月以上。病程中咳嗽会出现脓性粘液。绝大多数牛会出现呼吸急迫。病重的牛呼吸时会出现喘鸣音,是由于渗出物堵塞气管或气管粘膜肿胀而引起的气管狭窄所造成的。本病的必发症状即流涎,为泡沫状,在牛舍里及口角处都可发现。常见症状为流出大量鼻汁,起初呈水样,之后越发粘稠,或略带有血丝。病重的牛可表现为卧地不起。经检测发现,大部分牛有白血球减少现象,但病程长的牛也可能会出现白血球增多现象,那是由于疾病过程中继发细菌感染所造成。疾病可导致母牛流产,乳牛泌乳量下降。引起的主要临床症状具有广泛的侵袭性,可感染眼结膜、神经系统、生殖系统、呼吸系统等组织器官,因此被感染的牛可出现多种临床症状。在自然感染过程中,感染程度较轻的,表现为体温略有升高或几乎无临床症状产生,感染程度严重的,会侵害咽喉和鼻腔,导致急性的呼吸道炎症。能够引起两种主要的原发性感染,在畜群中普遍存在的是传染性的鼻气管炎,另一种是传染性的脓疱型外阴阴道炎。在临床上分为呼吸道型、生殖感染型、脑膜脑炎型、结膜炎型、流产型。引起的主要临床症状可感染各个年龄段的牛群,病牛出现体温升高,能达到以上,临床症状包括脓性结膜炎、流泪、流粘性鼻汁、产奶量下降、食欲减退和精神不振等临床症状。病程中往往出现湿性咳嗽,张口呼吸,出现呼吸困难、有时伴有腹湾。由于气管内渗出物堵塞或粘膜肿胀导致气管狭窄,肺部有喚音或摩擦音。可导致孕畜流产。但其死亡率较低,在之间。有些病牛也可无症状耐过。 第一章综述诊断的诊断对病的诊断可依据其流行病学特点、典型临床症状和明显的病理变化,对疾病进行初步诊断,但要想确诊还必须采取进一步的实验室诊断。目前对病的实验室诊断主要有多种形式的酶联免疫吸附试验(,补体结合试验(,间接免疫焚光(,病毒中和试验(,病毒的分离鉴定,逆转录聚合酶链式反应(,其中目前较为常用。的诊断我国有相关规定,牛制品的进出口必须进行的检测。这一规定使得快速检测方法的建立得到了快速发展和不断完善。首先样品要经过临床检测来进行初步诊断,再利用更为有效的实验室诊断方法来进行进一步确诊。分子生物学检测方法以其快速、准确等优势,很快取代了一些传统检测方法。近年来,越来越多的学者致力于建立一种高效、快速、准确的分子生物学检测方法用于疾病的诊断。目前,分子生物学方法主要包括聚合酶链式反应(技术)和核酸探针的应用两种方法。等、年将方法用于诊断证实此法有很高的敏感性,比病毒分离培养更省时省力、快速敏感。等年利用基因成功建立的检测方法。等年用树脂吸附法优化病毒的提取方法,增加检测的灵敏度。等年建立了用于鉴别、基因疫苗缺失株的定量检测方法。等年分别建立了检测自然感染和基因缺失疫苗免疫的鉴别诊断方法。的诊断临床上常根据病毒的流行病学情况、主要临诊症状和组织病理变化进行初步诊断,然而确诊还需要进一步的实验室方法才能完成。我国目前对诊断方法的研究较少,大多数诊断方法主要是针对人副流感病毒病。国外用于诊断的方法较多,其中包括病毒的分离鉴定、血清学检测及分子生物学方法等。 第一章综述近年来分子生物学技术得到了不断发展完善,其在敏感性、特异性和准确性上得到了长足进步,其中检测方法是发展较快的一种分子生物学方法。它是用于在体外酶促扩增特定片段的快速方法。目前,国外己有用于检测的突光定量检测方法,经相关实验证明该方法敏感、快速。综合防治牛呼吸道疾病是引起牛群高发病率和高死亡率的主要诱因之一,感染原在其中扮演着重要角色。然而目前,对于这种病毒,引起的病毒性牛呼吸道疾病,尚无有效的治疗方法。畜群特别是幼畜在卫生条件差,伺养密度过大,生活环境骤变,长途运输等恶劣条件下可突然发病。所以在日常伺养管理过程中,应避免各种应激因素的刺激,如生活环境,日常防寒保暖,加强饲养管理等。由于目前尚无有效的治疗方法,所以对于疾病的防治,主要以预防为主。发现病例立即隔离,同时对畜舍全面严格消毒。对病畜采用抗菌素或者擴胺类药物治疗,防止细菌的继发感染。同时采用皮质固醇类药物以防止过敏反应。研究目的及意义牛呼吸系统疾病综合征可引起牛群高感染率、高发病率和死亡率,对于养牛业来说,是一个亟待解决的主要疾病难题。牛呼吸道疾病的研究已经成为目前全球优先的问题。病毒感染在其中扮演重要角色。在兽医领域对于该病的诊断往往依赖于病毒的检测,病毒的分离,免疫荧光试验,酶联免疫吸附试验(对循环抗体的检测或血清抗体中和试验。方法被越来越多的用于牛呼吸系统疾病综合征诊断上,并且已经被证明是优于传统方法。主要的牛呼吸系统疾病综合征病原体包括牛传染性鼻气管炎病毒,牛呼吸道合胞体病毒,牛副流感病毒型。检测这几种病毒的方法很多,但常规检测方法存在耗时长、敏感性差等不足检测方法又需要较多的纯化病毒而且还容易产生假阳性和假阴性反应；血清凝集等方法又缺乏特异性；而方法简便,省时,具有较好的特异性,敏感性又强,正好可以解决这些问题。尤其是在检测培养困难的病原体和抗原复杂的病原体方面更是具有不可替代的优势。而多重技术是在同一个反应体系中,同时扩增一份样本中几个不同勒区域的片段或多份样本,这就更有效的节省了大量时间和大大的提高了扩增效率,适于临床上推广使用。因此,本文利用牛病毒性呼 第一章综述吸道病原株、株和株建立相应的多重诊断方法,为由、和引起的牛呼吸系统疾病综合征的检疫及临床诊断提供技术参考。 第二章单重检测方法的建立与初步应用第二章,单重检测方法的建立与初步应用材料病毒和细胞牛呼吸道合胞体病毒(株)和牛副流感病毒型(株)由曰本动物卫生研究所惠赠；牛传染性鼻气管炎病毒(株)由黑龙江八一农垦大学传染病实验室分离保存；牛肾细胞(和非洲绿猴肾细胞购自中国科学院上海细胞库。主要试剂病毒基因组提取试剂盒购于康为世纪；反转录酶(、酶抑制剂(、购于公司；酶、、、购于公司；培养基、胰蛋白酶购于公司；胎牛血清购于法国二甲基亚砜(购于上海华舜生物公司；水购于江苏省碧云天生物技术研究所；琼脂糖购于哈尔滨宝泰克生物科技有限公司,其它化学试剂为进口或国产分析纯级,引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。主要仪器仪：美国公司产品培养箱：美国公司产品型精密计：上海雷磁仪器厂产品型显微镜：日本公司产品型高速台式离心机：德国公司产品型超低温冰箱：美国公司产品型髙速台式离心机：德国公司产品 第二章单重检测方法的建立与初步应用型稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂产品超速离心机：日本日立公司(产品紫外凝胶成像系统：美国公司产品真空浓缩仪：德国公司产品型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司产品型电子天平：美国奥豪斯仪器(上海)有限公司产品型超净工作台：中国哈尔滨东联电子技术开发公司产品型、型电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司产品方法引物设计根据上发表的个病原的特有基因(的核衣壳蛋白基因序列、的核衣壳蛋白基因序列、的基因序列)用设计软件分别设计一对引物。扩增长度为,为,为。引物由上海生工合成,稀释成保存。引物的序列如下：上游引物：‘；下游引物：‘。上游引物：‘；下游引物：。上游引物：‘‘：下游引物：‘。提取用法分别提取和的,方法如下：将细胞瓶内的病毒液反复冻融次,离心,去沉淀；取病毒上清液约加入充分摇动后静置； 第二章单重检测方法的建立与初步应用加入氯仿,混合均匀后静置,然后°,离心；这时液体分成层,最上层为层,中间为蛋白层,最下层为层,小心吸取层,移入另一离心管中；加入异丙醇到含有的离心管中混匀°至少作用以沉淀,°离心小心吸弃液体；向沉淀加入乙醇混悬沉淀然后°,离心吸弃乙醇,放入真空干燥机,使管内残留的乙醇挥发,但要避免过分干燥加入无人酶的去离子水溶解核酸,保存或直接做反转录。反转录反转录体系中,反转录引物上游)模板,°作用,冰浴再加入,酶抑制剂,°作用离心后加入反转录酶充分混勻后离心,°温浴,°灭活反转录酶,冰浴,保存备用。提取釆用蛋白酶法提取阳性细胞毒基因组。病毒细胞上清,加入等量的消化缓冲液(、：保温,然后加入蛋白酶终浓度为°消化。酷氯仿异戊醇(各抽提一次,上清加入两倍体积的无水乙醇和体积的的°放置离心,弃上清,用乙醇洗涤沉淀,真空干燥后,用灭菌水溶解沉淀,保存备用。单重检测方法的建立为了摸索引物对的反应条件,分别以、的和的 第二章单重检测方法的建立与初步应用为模板,用设计好的引物进行扩增。反应体系为上、下游引物(各斤,模板加至。反应程序为：°预变性,进行个循环°、°、°°延伸,°保存。产物鉴定用电泳缓冲液配成琼脂糖凝胶溶液,微波炉加热使琼脂糖完全溶解之后,加入溴化乙键至终浓度为,稍冷却后灌胶；凝胶完全冷却后,取适量产物和适量体积电泳上样液(溴酌蓝,二甲苯青,鹿糖)混勻,将混合样本加到上样槽中,以的恒压进行电泳。当溴盼蓝电泳至适当的位置后,停止电泳,用长波紫外线灯观察并记录结果,并以凝胶成像系统拍照保存。单重扩增条件的优化为了摸索反应条件,分别以、的和的为模板,对单重反应中的引物浓度、、、和、浓度、、、、和及反应的退火温度°、。、。、。、。、。、。、。、°。、。、。、。、、。、°、和。、°、°、°、°、°等条件进行优化,蹄选各单重扩增的最佳反应体系和程序。结果各单重反应条件的优化结果通过对的条件进行优化最终确定的反应于体系中进行：,上、下游引物各,模板,后加反应条件：°预变性进入循环：°变性°退火 第二章单重检测方法的建立与初步应用°复性,共个循环；最后°延伸。产物于°保存。取反应产物各,加入适量的上样缓冲液,混匀后于琼脂糖凝胶(浓度为中电压下电泳,成像系统(美国,公司)观察并照相。,—‘‘—‘‘—分子量(：牛呼吸道合胞体病毒株；空白对照；：；：图扩增结果通过对的条件进行优化,最终确定的反应于体系中进行：上、下游引物各模板,后加反应条件：°预变性进入循环：：变性,°退火,°复性,共个循环；最后°延伸。产物于°保存。取反应产物各,加入适量的上样缓冲液,混匀后于琼脂糖凝胶(浓度为电压下电泳,成像系统美国,公司)观察并照相。— 第二章单重检测方法的建立与初步应用分子量(：牛传染性鼻气管炎病毒株；空白对照；；：图扩增结果通过对的条件进行优化,最终确定的反应于体系中进行：上、下游引物各模板,后加反应条件：：预变性进入循环：°变性,°退火,°复性,共个循环；最后°延伸。产物于°保存。取反应产物各,加入适量的上样缓冲液,混匀后于琼脂糖凝胶(浓度为中电压下电泳,成像系统美国,公司)观察并照相。————分子量(：副流感病毒型株；空白对照；：；：图广增结果引物浓度及浓度对的影响弓物浓度及浓度对单重反应的影响分别选择了引物个不同浓度及个不同浓度来进行测定,结果表明最佳引物终浓度为,最佳浓度为下图,下图。 第二章,,单重检测方法的建立与初步应用———一分子量(：引物浓度分别为,,,,；：空白对照；：,,,,；图引物浓度的测定结果讓——分子量(：浓度分别为,,,；：空白对照；；,；：图浓度的测定结果引物浓度及浓度对单重反应的影响分别选择了引物个不同浓度及个不同浓度来进行测定,结果表明最佳引物终浓度为,最佳浓度为下图,下图。 第二章,,单重检测方法的建立与初步应用—分子量(：引物浓度分别为,,,,；空白对照；,,,；：图引物浓度的测定结果；？,广,,於：傭”：■」分子量(：浓度分别为,,,；：空白对照；：；：图浓度的测定结果引物浓度及浓度对单重反应的影响分别选择了引物个不同浓度及个不同浓度来进行测定,结果表明最佳引物终浓度为最佳浓度为下图,下图。 第二章单重检测方法的建立与初步应用■。：生,—分子量(：引物浓度分别为,,；：空白对照；：,,,,：图引物浓度的测定结果細——分子量(：浓度分别为,,,,；：空白对照；；,,,；；图浓度的测定结果退火温度对的影响退火温度对单重的影响选择了个温度梯度来研究退火温度对反应的影响,结果在°时能扩增出最理想的目的带(下图。 第二章单重检测方法的建立与初步应用———…———分子量(：退火温度分别为°,°,°,°,。,°°°°；：空白对照；；。,。,°°‘。,。,°°°；：图退火温度的测定结果退火温度对单重的影响选择了个温度梯度来研究退火温度对反应的影响,结果在°时能扩增出最理想的目的带(下图。分子量(：退火温度分别为°,°。,°°；：空白对照；；°。,。,°,°°；：图退火温度的测定结果退火温度对单重的影响 第二章,单重检测方法的建立与初步应用选择了个温度梯度来研究退火温度对反应的影响,结果在°时能扩增出最理想的目的带(下图。—一—分子量(：退火温度分别为°,°,°°‘。’°°°,°；空白对照；；°°°；：图退火温度的测定结果单重反应的特异性单重反应的特异性用的对引物对以下病原体检测,只有扩增出特异性条带,而其他对照组均未扩增出明显条带。(下图雇—■纖淡！：為】分子量(：牛呼吸道合胞体病毒株；牛传染性鼻气管炎病毒株；副流感病毒型株；牛腺病毒型株；空白对照；：；；；；： 第二章单重检测方法的建立与初步应用图特异性实验结果单重反应的特异性用的对引物分别对以下病原体检测,只有扩增出特异性条带,而其他对照组均未扩增出明显条带。(下图、二‘‘电产、。柳分子量(：牛传染性鼻气管炎病毒株；牛呼吸道合胞体病毒株；副流感病毒型株；牛腺病毒型株；空白对照；；；；；图特异性实验结果单重反应的特异性用的对引物分别对以下病原体检测,只有扩增出特异性条带,而其他对照组均未扩增出明显条带。(下图———— 第二章单重检测方法的建立与初步应用分子量(：副流感病毒型株；牛呼吸道合胞体病毒株；牛传染性鼻气管炎病毒株；牛腺病毒型株；空白对照；；；；；；：图特异性实验结果单重反应的敏感性单重反应的敏感性取本实验室分离保存的毒株,株的毒力为、将病毒培养物进行倍梯度稀释,提取各稀释度病毒液的总后反转录,利用建立的单重方法进行扩增。结果显示,的敏感性为下图。—分子量(：稀释度为——；：°图敏感性实验结果单重反应的敏感性取本实验室分离保存的毒株,株的毒力为。将病毒培养物进行倍梯度稀释,分别提取各稀释度病毒液总,利用建立的单重方法进行扩增。结果显示,该单重反应的敏感性为下图。 第二章,,单重检测方法的建立与初步应用—分子量(：稀释倍数；：图敏感性实验结果单重反应的敏感性取本实验室分离保存的毒株,株的毒力为—。将病毒培养物进行倍梯度稀释,提取各稀释度病毒液的总后反转录,利用建立的单重方法进行扩增。结果显示,的敏感性为下图。—一—分子量(：稀释度为；：图敏感性实验结果临床样品检测结果利用建立的单重检测方法,单重检测方法,单重检测方法和病毒分离鉴定方法对临床送检的份病料进行检测,结果(下表 第二章单重检测方法的建立与初步应用单重检测方法检测出阳性感染例,病毒分离鉴定方法检测出阳性感染例。方法样品编号单重一一——单重■重病毒分离鉴定————一—图临床样品检测结果 第三章和双重检测方法的建立与初步应用第三章和双重检测方法的建立与初步应用材料病毒和细胞牛腺病毒型(株)由日本动物卫生研究所惠赠；牛呼吸道合胞体病毒(株),牛副流感病毒型(株),牛无衆体株)和牛传染性鼻气管炎病毒(株)由黑龙江八一农垦大学传染病实验室分离保存；牛肾细胞(和非洲绿猴肾细胞购自中国科学院上海细胞库。主要试剂病毒基因组提取试剂盒购于康为世纪；反转录酶(、酶抑制剂(、购于公司；酶、、、购于公司；培养基、胰蛋白酶购于公司；胎牛血清购于法国；二甲基亚砜(购于上海华舜生物公司；水购于江苏省碧云天生物技术研究所；琼脂糖购于哈尔滨宝泰克生物科技有限公司；其它化学试剂为进口或国产分析纯级,引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。丄主要仪器仪：美国公司产品培养箱：美国公司产品型精密计：上海雷磁仪器厂产品型显微镜：日本公司产品型高速台式离心机：德国公司产品型超低温冰箱：美国公司产品 第三章和双重检测方法的建立与初步应用型高速台式离心机：德国公司产品型稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂产品超速离心机：日本日立公司(产品紫外凝胶成像系统：美国公司产品真空浓缩仪：德国公司产品型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司产品型电子天平：美国奥豪斯仪器(上海)有限公司产品型超净工作台：中国哈尔滨东联电子技术开发公司产品型、型电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司产品方法引物设计根据上发表的个病原的保守基因(的核衣壳蛋白基因序列、的核衣壳蛋白基因序列)用设计软件分别设计一对引物。扩增长度为为。引物由上海生工合成,稀释成,保存。引物的序列如下：上游引物：‘；下游引物：‘上游引物：‘；下游引物：‘提取用法分别提取和的方法如下：将细胞瓶内的病毒液反复冻融次,去沉淀；取病毒上清液约加入充分摇动后静置加入氯仿,混合均匀后静置然后°,离心；这时液体分成层,最上层为层,中间为蛋白层,最下层为 第三章和双重检测方法的建立与初步应用层,小心吸取层,移入另一离心管中；加入异丙醇到含有的离心管中混匀,至少作用以沉淀°离心,小心吸弃液体；向沉淀加入乙醇,混悬沉淀,然后°离心吸弃乙醇,放入真空干燥机使管内残留的乙醇挥发,但要避免过分干燥加入无酶的去离子水溶解核酸,保存或直接做反转录。反转录反转录体系中,反转录引物(上游)模板,作用冰浴再加入,酶抑制剂°作用离心后加入反转录酶充分混匀后离心,°温浴,°灭活反转录酶,冰浴,°保存备用。提取采用蛋白酶法提取阳性细胞毒基因组。病毒细胞上清,加入等量的消化缓冲液(、、°保温然后加入蛋白酶终浓度为°消化。紛氯仿异戊醇各抽提一次,上清加入两倍体积的无水乙醇和体积的的,°放置,离心弃上清,用乙醇洗漆沉淀,真空干燥后,用灭菌水溶解沉淀,°保存备用。双重检测方法的建立将经反转录得到的和混合作为模板,进行扩增。反应体系为,上、下游引物各,和的模板等量混合共叫,力口至。反应程序为：°预变性进行个循环°、°、°延伸,°保存。 第三章和双重检测方法的建立与初步应用产物鉴定用电泳缓冲液配成琼脂糖凝胶溶液,微波炉加热使琼脂糖完全溶解之后,加入漠化乙徒至终浓度为稍冷却后灌胶；凝胶完全冷却后,取适量产物和适量体积电泳上样液(溴紛蓝,二甲苯青,庶糖)混匀,将混合样本加到上样槽中,以的恒压进行电泳。当溴酷蓝电泳至适当的位置后,停止电泳,用长波紫外线灯观察并记录结果,并以凝胶成像系统拍照保存。双重扩增条件旳优化将经反转录得到的和混合作为模板对双重反应中的引物浓度、、、和、浓度、、、、和及反应的退火温度、°、°、。、°、、°和°等条件进行优化,蹄选双重扩增的最佳反应体系和程序。特异性试验按照蛋白酶法分别提取分离株阳性细胞毒和牛无裝体株的按照法分别提取株,株,株和细胞的总,反转录获得,同时用灭菌水进行空白对照,采用优化后的反应体系和反应条件进行特异性试验。敏感性试验将种已知病毒滴度(为和为的病毒培养物分别进行倍稀释,将各稀释度的病毒液按法分别提取总并用优化后的反应条件进行确定其敏感性。特异性,敏感性比较 第三章和双重检测方法的建立与初步应用利用建立的单重检测方法,单重检测方法与双重检测方法进行特异性和敏感性的比较。临床样品的检测利用建立的和双重检测方法对送检的份临床病料进行检测,检测结果与单重检测方法和单重检测方法的检测结果进行比较。结果双重反应条件的优化结果通过对和双重条件进行优化,最终确定双重反应于体系中进行：,上、下游引物(各,模板各,后加叫。反应条件：°预变性进入循环：°变性,退火,°复性,共个循环；最后°延伸。产物于°保存。取反应产物各,加入适量的上样缓冲液,混匀后于琼脂糖凝胶(浓度为中电压下电泳成像系统(美国,公司)观察并照相,可观察到和的条带,大小与预期相符(下图。二分子量(牛呼吸道合胞体病毒株；牛副流感病毒型株；；牛呼吸道合胞体病毒株和牛副流感病毒型株；空白对照 第三章和双重检测方法的建立与初步应用；：；；；：和图双重扩增结果引物浓度及浓度对双重的影响分别选择了个引物个不同浓度及个不同浓度来进行测定,结果表明最佳引物终浓度为,最佳浓度为下图,下图。分子量(：引物浓度分别为,,,,；：空白对照；：,,,,；：图引物浓度的测定结果腿崔鬆集！戮分子量(：浓度分别为,,,,；：空白对照；：,,,,；： 第三章和双重检测方法的建立与初步应用图浓度的测定结果退火温度对双重的影响选择了个温度梯度来研究退火温度对双重的影响,结果在(时能扩增出最理想的目的带(下图。■分子量(：退火温度分别为,,°,°°°°°；：空白对照；：°。,。。,。,。,°；：图退火温度的测定结果双重反应的特异性用和的对引物对以下病原体检测结果显示,只有和扩增出特异性条带,而其他对照组均未扩增出条带(下图。丨：：！『’補；分子量(牛呼吸道合胞体病毒株和副流感病毒型株；：牛传染性鼻气管炎病毒株；牛腺病毒型株； 第三章和双重检测方法的建立与初步应用：牛无裝体株；细胞；空白对照；禾口,,,；图特异性实验结果双重反应的敏感性本实验室分离保存的毒株,株的毒力为,株的毒力为。将各病毒培养物进行倍梯度稀释,取稀释病毒提取总反转录后进行双重扩增。结果显示,该方法对的敏感性可达,对的敏感性可达下图。—分子量(：稀释倍数：空白对照；：；：图敏感性实验结果特异性,敏感性比较特异性实验结果表明,和双重检测方法,单重检测方法和单重检测方法对,,均具有良好的特异性。敏感性试验结果比较(下表 第三章和双重检测方法的建立与初步应用方法病毒双重反应单重—单重表敏感性结果比较临床样品检测结果利用建立的和双重检测方法对临床上的份病料进行检测,结果(下表阳性感染有份,与单重检测方法和单重检测方法的检测结果作比较,总体符合率为。方法样品编号双重方法一一——单重一单重表临床样品检测结果 第四章、、三重检测方法的建立与初步应用第四章、和三重检测方法的建立与初步应用材料病毒和细胞牛腺病毒型(株)由日本动物卫生研究所惠赠；牛呼吸道合胞体病毒(株,牛副流感病毒型(株,牛无衆体株)和牛传染性鼻气管炎病毒(株)由黒龙江八一农垦大学传染病实验室分离保存；牛肾细胞(和非洲绿猴肾细胞(购自中国科学院上海细胞库。主要试剂病毒基因组提取试剂盒购于康为世纪；反转录酶(、酶抑制剂(、购于公司；酶、、购于公司；培养基、胰蛋白酶购于公司；胎牛血清购于法国二甲基亚砜(购于上海华舜生物公司；购于江苏省碧云天生物技术研究所；琼脂糖购于哈尔滨宝泰克生物科技有限公司；其它化学试剂为进口或国产分析纯级,引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。主要仪器仪：美国公司产品培养箱：美国公司产品型精密计：上海雷磁仪器厂产品型显微镜：日本公司产品型高速台式离心机：德国公司产品型超低温冰箱：美国公司产品 第四章、、三重检测方法的建立与初步应用型高速台式离心机：德国公司产品型稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂产品超速离心机：日本日立公司(产品紫外凝胶成像系统：美国公司产品真空浓缩仪：德国公司产品型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司产品型电子天平：美国奥豪斯仪器(上海)有限公司产品型超净工作台：中国哈尔滨东联电子技术开发公司产品型、型电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司产品方法引物设计根据上发表的个病原的保守基因(的核衣壳蛋白基因序列、的核衣壳蛋白基因序列、的基因序列)用设计软件分别设计一对引物。扩增长度为,为,为。引物由上海生工合成,稀释成,保存。引物的序列如下：上游引物：‘；下游引物：‘。上游弓物：‘；下游引物：‘。上游引物：‘；下游引物：‘。提取用法分别提取和的,方法如下：将细胞瓶内的病毒液反复冻融次,离心去沉淀；取病毒上清液约,加入充分摇动后静置；加入氯仿混合均匀后静置,然后°离心 第四章、、三重检测方法的建立与初步应用；这时液体分成层,最上层为层,中间为蛋白层,最下层为层,小心吸取层,移入另一离心管中；加入异丙醇到含有的离心管中混勻,°至少作用以沉淀,°,离心,小心吸弃液体；向沉淀加入乙醇,混悬沉淀,然后°离心吸弃乙醇,放入真空干燥机,使管内残留的乙醇挥发,但要避免过分干燥加入无酶的去离子水溶解核酸,保存或直接做反转录。反转录反转录体系中,反转录引物(上游)模板作用,冰浴再加入酶抑制剂°作用离心后加入反转录酶,充分混匀后离心,°温浴°灭活反转录酶,冰浴°保存备用。提取采用蛋白酶法提取阳性细胞毒基因组。病毒细胞上清,加入等量的消化缓冲液(、、°保温,然后加入蛋白酶终浓度为°消化。紛氯仿异戊醇各抽提一次,上清加入两倍体积的无水乙醇和体积的的,°放置,离心,弃上清,用乙醇洗涤沉淀,真空干燥后,用灭菌水溶解沉淀,保存备用。三重检测方法的建立将和的和的混合后作为模板进行扩增。反应体系为上、下游引物(各,模板,,加 第四章、、三重检测方法的建立与初步应用至。。反应程序为：°预变性,进行个循环°、。、°,°延伸,°保存。产物鉴定用电泳缓冲液配成琼脂糖凝胶溶液,微波炉加热使琼脂糖完全溶解之后,加入溴化乙锭(至终浓度为,稍冷却后灌胶；凝胶完全冷却后,取适量产物和适量体积电泳上样液(溴般蓝,二甲苯青,鹿糖)混勻,将混合样本加到上样槽中,以的恒压进行电泳。当溴酌蓝电泳至适当的位置后,停止电泳,用长波紫外线灯观察并记录结果,并以凝胶成像系统拍照保存。三重彳广增条件的优化将和的及的混合后作为模板,对三重反应中的引物浓度、、、和、浓度、、、、和及反应的退火温度、°°、°、°、°、、和°等条件进行优化,蹄选三重扩增的最佳反应体系和程序。特异性试验按照蛋白酶法分别提取分离株和牛无衆体(株)的按照法分别提取株,株,株和细胞的总,反转录获得同时用灭菌水进行空白对照,采用优化后的多重反应体系和反应条件进行特异性试敏感性试验将种已知病毒滴度(为、为和为的病毒培养物分别进行倍稀释,将株和株各稀释度的病毒液按法分别提取总 第四章、、三重检测方法的建立与初步应用经反转录为,与按蛋白酶法分别提取各稀释度的分离株的总等体积混合,采用优化后的多重反应体系和反应条件进行敏感性试验。特异性,敏感性的比较利用建立的单重检测方法’单重检测方法,单重检测方法与三重检测方法进行特异性和敏感性的比较。临床样品的检测利用建立的、和三重检测方法对送检的份临床病料进行检测,检测结果与单重检测方法,单重检测方法和单重检测方法的检测结果进行比较。结果三重反应条件的优化结果通过对三重条件进行优化,最终确定三重反应于体系中进行：上、下游引物(叩各模板后加。反应条件：°预变性进入循环：°变性,(°退火°复性,共个循环；最后延伸。产物于°保存。取反应产物各,加入适量的上样缓冲液,混匀后于琼脂糖凝胶(浓度为中电压下电泳,成像系统(美国,公司)观察并照相。(下图。 第四章、、三重检测方法的建立与初步应用——分子量(：牛传染性鼻气管炎病毒株；牛呼吸道合胞体病毒株；副流感病毒型株；牛呼吸道合胞体病毒株和副流感病毒型株牛呼吸道合胞体病毒株、牛传染性鼻气管炎病毒株和副流感病毒型株空白对照；：；：；：；和；：、和：图多重扩増结果引物浓度及浓度对三重的影响分别选择了引物个不同浓度及个不同浓度来进行测定,结果表明最佳引物终浓度为,最佳浓度为下图下图。‘‘,■一⑴。。。————分子量(：引物浓度分别为,,,,；：空白对照；：,,；：图引物浓度的测定结果 第四章、、三重检测方法的建立与初步应用————分子量(：浓度分别为,,；：空白对照；；,；图浓度的测定结果退火温度对三重的影响选择了个温度梯度来研究退火温度对多重的影响,结果在°时扩增最理想的目的带(下图。——————分子量(：°°,°°；：空白对照；。,。；：图退火温度的测定结果三重反应的特异性用、和的对引物分别对以下病原体检测结果显示, 第四章、、三重检测方法的建立与初步应用只有、和扩增出特异性条带,而其他对照组均未扩增出明显条带(下图。——分子量(：牛呼吸道合胞体病毒株、牛传染性鼻气管炎病毒株和副流感病毒型株；牛腺病毒型株；牛无柴体株；细胞；空白对照；；、和,；；图特异性实验结果三重反应的敏感性取本实验室分离保存的毒株,株的毒力为株的毒力为‘,株的毒力为将各病毒培养物进行倍梯度稀释,株分别取稀释病毒提取总,株和株分别取稀释病毒提取总后反转录,迸行多重扩增。结果显示,该方法对的敏感性可达的敏感性可达而对的敏感性可达图。———————分子量(：稀释倍数——空白对照 第四章、、三重检测方法的建立与初步应用；：；图敏感性实验结果特异性,敏感性的比较特异性实验结果表明：和三重检测方法,单重检测方法,单重检测方法和单重检测方法对,均具有良好的特异性。敏感性试验结果比较(下表方法病毒三重方法】单重——单重—°—单重—表敏感性结果比较 第四章、、三重检测方法的建立与初步应用临床样品检测结果利用建立的,和三重检测方法对临床上的份病料进行检测,结果(下表阳性感染有份,结果与单重检测方法,单重检测方法和单重检测方法的检测结果作比较,总体符合率为。方法样品编号三重方法一—单重一一一一单重单重表临床样品检测结果 第五章讨论第五章讨论牛呼吸系统疾病综合征(是危害全球养牛业的主要疾病。牛传染性鼻气管炎病毒(牛副流感病毒型(,、牛呼吸道合胞体病毒(是主要的牛呼吸系统疾病综合征(感染原。这些主要的呼吸道病毒可以造成牛的免疫系统受到抑制,并且损害牛的呼吸道上皮细胞,从而更加容易引起继发感染,导致的发生。本文建立了种主要的牛病毒性呼吸道病原,相应疾病的单重、双重、三重实验室诊断技术,为防控提供定期检疫及临床诊断的技术参考。目前的不仅仅是单一病原作用的结果,往往是多种病原混合感染造成严重的。针对混合感染的多重检测技术主要有多重、固相芯片、液相芯片、多重胶体金检测技术等。方法可以针对不同的序列进行快速、准确的诊断,在国内外得到了广泛应用。本研究建立的单、双重方法或三重方法能在一次反应中对病料中的多个病原体进行检测,方法特异、敏感、快速、简便,具有广阔的应用前景。在进行多重的研究中,引物的设计至关重要本研究所设计的引物含量相近,这就保证了在相同的退火温度下所需要的目的片段都能得到有效扩增。另外,利用对引物进行了同源性和二级结构等分析,以避免引物之间形成复杂的二级结构及引物二聚体而影响扩增结果的判定。多重反应在同一反应管中可以同时检测分析多种目的序列,既节约了实验样本和试剂,而且使操作更加简便,省时省力,但应注意多重反应加样时易存在污染,造成假阳性结果。因此应该先配制各种试剂的混合液,然后再分装到各个反应管中。多重技术涉及了多对引物,随着引物对数的增加,也增加了得到错配扩增产物的机会,因此,需要根据实验的要求、目的以及所设计的引物等因素,对反应条件进行优化,对多重中的各种影响因素进行组合、调整,以寻找到一个最优的扩增条件,从而可以进行高度特异性的多重。在进行多重反应中,设计循环参数时要注意两个原则：一是退火温度 第五章讨论要足够高,因为多重技术是扩增体系中加入了多对引物同时进行扩增,这样就会由于错配而产生一些非特异性的扩增产物,提高退火温度,可以有效地减少非特异性扩增产物的生成；二是循环参数要尽量少,以利于检测扩增产物。多重在一个反应体系中同时扩增多个片段,其扩增效率并不是完全相同的,循环参数的增加,会使聚合酶的消耗增加,再加上每对引物相对退火效率不同,就会使扩增产物混乱,所以,循环次数不宜过多〖】。在单重检测方法与病毒分离鉴定方法对临床样品的检测结果中,我们发现单重方法阳性检出率要高于病毒分离鉴定方法,且试验周期上要远少于病毒分离鉴定方法,病毒分离鉴定方法从细胞的培养、接毒、接毒细胞的传代培养到细胞出现明显病变需要几周时间,而方法只需要几小时即可得到检测结果,节省了检测时间。在临床上对于疾病的快速诊断是非常重要的。在单重检测方法与双重检测方法、三重检测方法对临床样品的检测结果及特异性、敏感性的比较中,我们发现随着体系中引物和模板的增加,方法的特异性并没有受到影响,任然具有良好的特异性。然而,随着体系中引物和模板的增加,方法的敏感性降低了。但这并没有影响对临床样品的检测,这点从临床样品检测结果中我们可以看出,三种方法对临床样品的检测结果符合率为。在临床样品检测过程我们发现,三重方法可同时检测三种病原,而单重和双重方法均需要做重复试验或补充实验。这样增加了检测时间,增多了操作步骤,提高了检测成本。所以三重方法更适用于临床中对于疾病的诊断。检测牛呼吸道疾病病原体的方法很多,方法相对于其它方法来说具有敏感性高,特异性好,安全不散毒等优点,而本研究所建立的多重检测方法,与单重方法相比较而言,可同时扩增多个病原体核酸,有效的节约了大量时间和提高了扩增效率,适合临床上推广应用。对临床样品的检测表明,双重或三重方法均可从病料中成功检测到病原体核酸,证明本方法可用于临床病例的检测与诊断,为有效治疗、预防和控制我国的牛呼吸道疾病提供了一种新的途径,以及为、等病诊断试剂盒的组装和临床应用打下基础。随着分子生物学的迅猛发展,新标记物及新试剂的发明,将会对传染病诊断 第五章讨论技术给予新的理论指导。核酸检测技术具有灵敏度高、特异性强、快速、准确等优点,已经成为实验室诊断的主要技术,目前已经发展为既可定性又可定量的分子生物学检测技术下一步是如何建立准确度高、特异性强的多重核酸检测技术。技术、胶体金技术以其使用方便,快速,特异性较高,可大批量检测样本等优点逐步成为主要的血清学诊断技术,在未来临床诊断中有很好的应用前景。针对我国目前动物传染病种类多,棍合感染严重的问题,开发新一代多重检测技术是今后传染病诊断技术的发展方向。 第六章结论第六章结论成功建立呼吸道合胞体病毒单重检测方法,该方法最低可检测到个；的呼吸道合胞体病毒乂。成功建立牛传染性鼻气管炎病毒单重检测方法,该方法最低可检测到个的牛传染性鼻气管炎病毒。成功建立牛副流感病毒型单重检测方法,该方法最低可检测到个叫的牛副流感病毒型。成功建立牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒型的双重检测方法,该方法最低可以检测到个丁：的牛呼吸道合胞体病毒和个的牛副流感病毒。成功建立牛呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒型的三重检测方法,该方法最低可以检测到个的牛呼吸道合胞体病毒、个的牛传染性鼻气管炎病毒和个；的牛副流感病毒。 参考文献参考文献,,’,,,,,： 参考文献冯军科,薛飞,朱远茂,等。牛呼吸道合胞体病毒研究进展。中国奶牛。,,,,,,,,,,】,,—。,, 参考文献费恩阁,李德昌,丁壮,等动物疫病学北京：中国农业出版社,：殷震,刘景华动物病毒学第版北京：科学出版社,,,,费恩阁,李德昌,丁壮,等动物疫病学北京：中国农业出版社,：孙凌志,陈庆勋,包盛,等牛传染性鼻气管炎的诊断与综合疗法中国动物检疫,,：李伟截短基因的表达及诊断方法的建立吉林：吉林大学,林万明,杨瑞馥技术操作和应用指南北京：人民军医出版社,,,, 参考文献,,,,,,,何建凡程小雯,吕星等荧光定量快速检测人副流感病毒型的研究现代预防医学,曲光刚,沈志强,管宇,等、双重检测方法的建立及其应用中国动物检疫,,：卢圣栋现代分子生物学实验技术北京：高等教育出版杜,刘建柱,崔玉东,李鹏,等多重检测猪瘟病毒、猪细小病毒、 猪伪狂犬病病毒中国兽医学报,,：,张俭伟,赵宏坤,杨少华,等。牛轮状病毒与病毒性腹泻病毒的双重检测方法的建立家畜生态学报,：王延华主编理论与技术(第二版)北京：科学出版社 致谢致谢在此论文完成之际,回顾年来的学习和研究经历,向所有给予我关心、支持和帮助的老师、领导、同学、朋友和亲人表示深深的谢意。感谢我的导师侯喜林教授,感谢他给了我这样一个学习和研究的机会,感谢他多年来对我的辛勤培养和不懈教诲。侯喜林教授严谨的治学态度、敏锐的学术思维以及勤勉敬业的工作精神都值得我去学习。年来,在导师的言传身教下,我不仅顺利完成学业,而且在其他许多方面都受益匪浅。导师不仅是我学业上的导师,也是我其他方面的榜样。在此,寥寥数语难以表达我对导师的感激之情,惟有以今后更努力的工作来做表达。感谢预防兽医学教研室王春仁、朱战波、杨玉英、闻晓波、冉旭华、常巧呈等老师在我论文的完成过程中,给以我无私的帮助和巨大的精神鼓励！感谢动物科技学院杨焕民院长、武瑞书记、倪宏波副院长对我的关心和帮助！感谢黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院崔玉东院长、余丽芸副院长在我学习和生活方面的无私帮助和谆谆教导！感谢黑龙江八一农垦大学预防兽医学教研室邵红老师、周玉龙老师在实验过程中给于无私帮助以及在生活上的关心和鼓励！感谢我的同学林红丽、王宇鹏、郑旭、田思勤、娄艳、苗艳、高佳斌、陈为宏；师妹栾云艳对我的支持与帮助；和大家一起度过的快乐生活是我永远难忘的记忆和宝贵的精神财富！最后感谢我的父母和我的亲人们对我继续求学的理解和支持！王嵩年月 附录附录配制量：加去离子水定容至经高压蒸汽灭菌(°,分装成每瓶于°保存。配制量：去离子水加至过滤除菌或高压除菌(°分装成每瓶,于°保存。胰蛋白酶一消化液配制量：胰蛋白酶(加至过滤除菌,分装小瓶(每瓶于°保存。双抗配制量：青霉素链霉素生理盐水加至过滤除菌。分装小瓶(每瓶。于°保存。谷氨醜胺(倍浓度)配制量：谷氨酰胺 mm去离子水加至过滤除菌,分装小瓶(每瓶于°保存。基础液配制量：按说明书：袋干粉培养基加去离子水至,过滤除菌,分装,于°保存。营养液配制量：基础液谷氣酰胺(犊牛血清双抗适量调值至维持液配制量：基础液谷氨酰胺(双抗适量调值至引物的稀释贮存液浓度：使用液浓度：质量数值分子量喊基数碱,乙酸,配制量：配制方法：称取碱,量取乙酸(和定容至。液体培养基(蛋白胨,酵母提取物, 附录配制量：配制方法：称取蛋白胨、酵母抽提物、加去离子水将培养基定容至旋涡振荡器溶解后,滴加约吣,调节值至高温高压灭菌,°保存。固体培养基蛋白胨,酵母提取物,琼脂)配制量：配制方法：称取蛋白胨、酵母抽提物、、琼脂粉加去离子水将培养基定容至,旋涡振荡器溶解后,滴加约叫,调节值至高温高压灭菌,°保存。氨节溶液(,配制量：配制方法：称量置于离心管中,加入灭菌水,充分混合溶解后,定容至,用过滤膜过滤除菌,小份分装(份)后,一°保存。注：实验中以的终浓度添加于生长培养基,即加入的氨苄溶液。配制量：配制方法：称量高纯度的置于烧杯中,加入约的去离子水,°加热熔解,滴加数滴浓盐酸调节值至,将溶液定容至,室温保存。 作者简历作者简历个人情况姓名：王嵩性别：男民族：汉籍贯：山东专业：预防兽医学教育背景东北农业大学动物医学学院动物医学专业获农学学士学位黑龙江八一农垦大学动物科学技术学院预防兽医学专业获农学硕士学位发表文章《牛呼吸道合胞体病毒、传染性牛鼻气管炎病毒和牛副流感病毒型三重方法的建立及初步应用》收录期刊：中国兽医杂志《和双重检测方法的建立及初步应用》收录期刊：黑龙江八一农垦大学学报《和双重检测方法的建立及初步应用》收录期刊黑龙江八一农垦大学学报《干酪乳杆菌表明展示株蛋白》收录期刊：黑龙江八一农垦大学学报《表达鸡传染性法氏囊病毒蛋白的干酪乳杆菌免疫保护效力》收录期刊：生物工程学报