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单位代码10635学号112014325001733硕士学位论文枇杷主要叶斑病病原真菌鉴定及多样性分析论文作者：张丹华指导教师：梁国鲁研究员吴頔博士学科专业：果树学研究方向：果树资源与遗传育种提交论文日期：2017年4月10日论文答辩日期：2017年5月24日学位授予单位：西南大学中国重庆2017年5月 UniversityCode:10635StudentNumber:112014325001733SouthwestUniversityMasterDissertationIdentificationofpathogenscausingmainleafspotdiseasesonloquatandanalysisoffungaldiversityCandidate：ZHANGDanhuaAdviser：Prof.LIANGGuoluDr.WUDiSpecialty：PomologyDirection：GermplasmResourcesandGeneticBreedingChongqingP.R.ChinaMay,2017 本论文受到以下项目资助重庆市应用开发计划项目（cstc2014yykfB50001）西南大学基本科研业务费专项资金项目（XDJ2016185）中国博士后科学基金面上资助（2016M592621） 独创性声明学位论文题目：枇杷主要叶斑病病原直菌鉴定及多样件分析＿本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果。论文中引用他人己经发表或出版过的研宄成果，文中已加了特别标注。对本研宄及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者：＃签字日期：２〇／１年仄月２７日＾学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研宄生院（筹）可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：Ｗ不保密，□保密期限至年月止）。学位论文作者签名：导师签名：签字日期：＆／７年ｒ月日签字日期：＾凡＆日ｑ 目录目录摘要.................................................................................................................................IAbstract...........................................................................................................................III第1章文献综述............................................................................................................11.1果树真菌病害研究概况.......................................................................................11.2枇杷叶部病害研究现状.......................................................................................21.2.1枇杷灰斑病......................................................................................................31.2.2枇杷轮纹病.....................................................................................................31.2.3枇杷炭疽病......................................................................................................41.2.4枇杷叶尖枯斑病..............................................................................................41.2.5枇杷圆斑病......................................................................................................41.2.6枇杷其他病害..................................................................................................41.3ITS序列分析在果树真菌病害分类鉴定中的应用.............................................91.3.1ITS序列的结构和特征.................................................................................101.3.2ITS序列分析的应用原理和方法.................................................................101.3.3ITS序列在果树真菌病害研究中的应用.....................................................111.4高通量测序技术在微生物群落多样性研究中的应用.....................................13第2章引言..................................................................................................................172.1研究背景与意义.................................................................................................172.2研究内容.............................................................................................................172.3技术路线.............................................................................................................18第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律..................................................193.1材料与方法.........................................................................................................193.1.1主要仪器及设备...........................................................................................193.1.2主要药品及试剂...........................................................................................193.1.3病样采集.......................................................................................................193.1.4病原菌的分离与纯化...................................................................................193.1.5分离菌株的致病性测定...............................................................................203.1.6分离菌株的形态学鉴定...............................................................................203.1.7分离菌株的rDNA-ITS序列分析................................................................203.1.8数据处理.......................................................................................................213.2结果与分析.........................................................................................................21i 西南大学硕士学位论文3.2.1采样地点环境调查........................................................................................213.2.2主要分离菌株鉴定........................................................................................233.2.3重庆地区枇杷主要叶斑病病原菌周年演替规律........................................413.2.4不同地区枇杷主要叶斑病病原菌分布规律................................................443.3讨论......................................................................................................................46第4章枇杷主要叶斑病真菌菌群多样性研究...........................................................494.1材料与方法..........................................................................................................494.1.1主要仪器及设备............................................................................................494.1.2主要药品及试剂............................................................................................494.1.3病样采集........................................................................................................494.1.4病样微生物总DNA提取.............................................................................494.1.5病样真菌群落多样性分析............................................................................504.1.6数据处理........................................................................................................504.2结果与分析..........................................................................................................514.2.1Miseq高通量测序结果统计学分析...........................................................514.2.2枇杷主要叶斑病病样真菌多样性分析........................................................534.2.3重庆地区枇杷叶斑病病样真菌菌群结构年周期变化................................544.2.4不同地区枇杷主要叶斑病病样真菌菌群结构分析....................................614.3讨论.......................................................................................................................66第5章结论及创新点...................................................................................................715.1结论......................................................................................................................715.2创新点..................................................................................................................725.3后续研究计划......................................................................................................72参考文献.........................................................................................................................73发表论文、获奖及科研情况.........................................................................................83致谢.................................................................................................................................85ii 摘要枇杷主要叶斑病病原真菌鉴定及多样性分析果树学硕士研究生：张丹华指导老师：梁国鲁研究员吴頔博士摘要枇杷（EriobotryajaponicaLindl.）是一种起源于中国的亚热带常绿果树，因其果实香甜可口、营养颇丰而受到消费者喜爱。随着枇杷栽培面积的增加，大面积叶部病害的发生成为限制枇杷优质高产的主要因素。枇杷叶斑病种类繁多，生产中由于病斑形态相似，且存在多种病原菌混合致病的现象，故无法通过传统病原鉴定法全面、快速、准确地鉴定其病原菌种类。我国枇杷主要叶斑病有灰斑病、轮纹病、炭疽病、叶尖枯斑病和圆斑病等，本研究以上述5种病害为研究对象，通过结合传统分离鉴定法（包括菌落特征及孢子形态观察、rDNA-ITS序列分析和致病性测定）和Miseq高通量测序技术，以期更为准确地鉴定病原，并明确不同病害微生物多样性的年周期变化及地域分布差异，为枇杷叶斑病的防治奠定基础。主要研究结果如下：1.分别采集重庆地区5种主要叶斑病不同时期（春、夏、秋梢生长时期）的病样进行传统分离培养，病原菌种类鉴定及其分离频率统计结果显示，枇杷叶斑病不是单一致病菌引起，而是由多种病原菌混合导致。可能引起灰斑病的病原菌为Colletotrichum（40.00%）、Alternaria（20.00%）、Phoma（10.00%）、Pestalotiopsis（6.67%）；可能引起轮纹病的病原菌为Leptosphaeriamicroscopica（6.67%），该菌为国内首次报道；可能引起炭疽病的病原菌为Alternaria（19.23%）、Phoma（17.95%）、Pestalotiopsis（15.38%）、Colletotrichum（14.10%）；可能引起叶尖枯斑病的病原菌为Alternaria（23.91%）、Colletotrichum（21.74%）、Phoma（16.30%）；可能引起圆斑病的病原菌为Colletotrichum（40.98%）、Alternaria（18.03%），且同一病害不同时期的病原菌分离频率不同。2.利用传统分离鉴定法对重庆地区不同时期病原菌的多样性进行分析，从中共分离得到365个菌株，隶属于23个属，主要为子囊菌门Ascomycota（98.08%）和担子菌门Basidiomycota（1.92%），其中高频分离（分离频率＞5%）菌属有：Colletotrichum（24.66%）、Alternaria（20.00%）、Phoma（13.70%）、Pestalotiopsis（11.23%）、Epicoccumnigrum（5.21%）及Fusarium（5.21%）。其中春、夏、秋梢生长时期分离频率最高的菌属不同，分别为Phoma（23.16%）、Alternaria（26.47%）、Colletotrichum（41.79%），表明重庆地区不同时期优势致病菌种类不I 西南大学硕士学位论文同。3.利用传统分离鉴定法对不同地区（重庆、四川、福建）秋梢生长时期5种主要叶斑病病原菌进行分离鉴定，从中共分离获得242个菌株，隶属于16个属，高频分离菌属有Colletotrichum（53.11%）、Pestalotiopsis（12.81%）、Fusarium（10.74%）、Phoma（7.44%）、Alternaria（5.79%）。不同地区病原菌的分离频率存在差异，但菌群种类组成相似，尤其是优势菌属组成，不同地区分离频率最高的均为Colletotrichum，分离频率分别为48.75%、60.53%、51.16%。表明不同地区枇杷叶斑病病原菌多样性差异不明显。4.采集重庆地区不同时期5种主要叶斑病病样，利用Miseq测序平台对病斑真菌多样性进行高通量测序分析。结果显示：（1）病斑真菌主要为Ascomycota（78.33%）和Basidiomycota（19.39%），隶属于260个属，其中24个（如Pestalotiopsis、Colletotrichum、Alternaria）为优势属（相对丰度＞1%），占总菌属相对丰度的88.38%；（2）不同时期病样菌群组成不同，春梢病样共获得147个属，其中优势属13个；夏梢病样共获得162个属，其中优势属16个；秋梢病样共获得157个属，其中优势属16个。三个时期共享菌属有85个，其中8个为优势共享属，其相对丰度之和分别占各自时期总测序量的53.67%、57.31%、78.9%；（3）主坐标分析（PrincipalCo-ordinatesAnalysis，PCoA）显示同一病害不同时期菌群组成及其相对丰度不同，与传统分离结果基本一致。5.利用Miseq测序技术对不同地区秋梢生长时期5种主要叶斑病真菌多样性进行分析，结果显示：（1）病斑真菌隶属于223个属，其中有27个优势属，占总测序量的85.20%；（2）不同地区枇杷主要叶斑病菌群组成不同，重庆地区共测得156个属，其中优势属16个；四川地区共测得135个属，其中优势属14个；福建地区共测得133属，优势属15个。三个地区共享菌属共有75个，其中4个为优势共享属，分别为：Pestalotiopsis、Ascochyta、Colletotrichum及g__k__Fungi（未注释菌属）；（3）福建地区枇杷病害样本与重庆、四川地区差异显著（P<0.05），优势菌属的组成及丰度差异明显，g__f__Glomerellaceae、Chaetospermum、Cladosporium、g__o__Pleosporales四个属的相对丰度差异最明显。综上所述，枇杷叶斑病并不是由单一致病菌引起，而存在混合致病现象。本研究首次将Miseq高通量测序技术应用于枇杷病害病样真菌群落组成及多样性分析，测序结果与传统分离鉴定结果显示，同种病害样本在同一地区不同时期以及不同地区同一时期的菌群组成及相对含量均存在差异，且Miseq测序技术能够获得更为详细、全面的菌群组成信息，说明Miseq高通量测序技术可用于植物病害真菌多样性分析，通过与传统分离鉴定方法相结合，可及时预测并诊断真菌病害，为病害的有效防治提供保障。关键词：枇杷叶斑病；病原真菌鉴定；Miseq高通量测序；真菌多样性II AbstractIdentificationofpathogenscausingmainleafspotdiseasesonloquatandanalysisoffungaldiversityCandidate:ZHANGDanhuaSupervisor：Prof.LIANGGuoluDr.WUDiAbstractLoquat(EriobotryajaponicaLindl.)isasubtropicalevergreenfruittreenativetoChina.Itisfavoredbyconsumersforitstastyandnutritiousfruits.Widespreadloquatleafspotdisease(LLSD)occurrencehaslimitedthedevelopmentofloquatindustrywithincreasingcultivationareas.Additionally,itisdifficulttodistinguishtheexactLLSDaccordingtothesymptomsinfields,becausetherearemanydifferentkindsofLLSDbutthesymptomsonleavesaresimilar.Besides,morethanonepathogenexitinonekindofLLSD.Ithasbeenreportedthatgreyspotdisease,ringspotdisease,anthracnose,tipleafspotdiseaseandroundspotdiseasearemainLLSDsinChina.Inthisstudy,weaimtopreciselyidentifypathogensandanalyzethefungaldiversityofthemainLLSDsthroughouttheyearanddifferentregionsusingcombinedtraditionalmethodsofisolationandidentification(harboringcolonyandsporemorphologicalobservation,rDNA-ITSsequenceanalysisandpathogenicitytest)andMiseqhigh-throughputsequencing.ThisstudywilllaythefoundationforthecontrolofLLSD.Followingwerethemainresultsoftheresearch.1.Toisolatethecausalpathogens,diseasedleaveswerecollectedfromChongqingatdifferentgrowthstages(spring,summerandautumn).Thepathogenswereisolatedusingtraditionalmethodsofisolationandidentification.ItindicatedthatmorethanonepathogencausedLLSDbasedonidentificationandisolationfrequency.ThepathogensofgreyspotdiseasemightbeColletotrichum(40.00%),Alternaria(20.00%),Phoma(10.00%)andPestalotiopsis(6.67%);Leptosphaeriamicroscopica(6.67%)mightcommonlycauseringspotdisease,whichisfirstreportedtocauseringspotdiseaseonloquatinChina;ThepathogenscausinganthracnoseonleavesmightbeAlternaria(19.23%),Phoma(17.95%),Pestalotiopsis(15.38%)andColletotrichum(14.10%);ThepathogensresultingintipleafspotdiseasemightbeAlternaria(23.91%),III 西南大学硕士学位论文Colletotrichum(21.74%)andPhoma(16.30%);Colletotrichum(40.98%)andAlternaria(18.03%)mightcommonlycauseroundspotdiseaseonloquat.Moreover,theisolationfrequencyofoneLLSDwasdifferentatdifferentgrowthstages.2.ToanalyzethefungaldiversityinChongqingatdifferentgrowthstages,totally365isolateswereobtainedbytraditionalmethodsofisolationandidentification.AlltheisolatesbelongedtoAscomycota(98.08%)andBasidiomycota(1.92%).Therewere23generaandColletotrichum(24.66%),Alternaria(20.00%),Phoma(13.70%),Pestalotiopsis(11.23%),Epicoccumnigrum(5.21%)andFusarium(5.21%)werehigh-frequency(isolationfrequency＞5%).TheisolateswithhighestisolationfrequencywhichwerePhoma(23.16%)、Alternaria(26.47%)andColletotrichum(41.79%)weredifferentinspring,summerandautumn.ItshowedthatthekindofpredominantpathogenchangedbythetimeframeinChongqing.3.Thecausalpathogensof5mainLLSDswereisolatedandidentifiedbytraditionalmethodsindifferentregions(Chongqing,SichuanandFujianProvince)ofChina.Intotal,242isolatesbelongingto16generawereobtainedandColletotrichum(53.11%),Pestalotiopsis(12.81%),Fusarium(10.74%),Phoma(7.44%)andAlternaria(5.79%)werehigh-frequencyisolates.Theisolationfrequencyofpathogensshoweddifference,butthekindsofpathogensweresimilarfromdifferentregions,especiallythepredominantgenera.Colletotrichumrankedthefirstinallofthethreeregions,andtheisolationfrequencieswere48.75%,60.53%and51.16%,respectively.ItindicatedthatthefungaldiversityofLLSDindifferentregionswassimilar.4.Diseasedleavesof5mainLLSDsatdifferentgrowthstageswerecollectedinChongqingtostudythefungaldiversityusingMiseqplatform.Themainresultswere(1)260generaweresequencedwhichmainlybelongedtoAscomycota(78.33%)andBasidiomycota(19.39%),24generaofwhichsuchasPestalotiopsis,ColletotrichumandAlternariawerepredominantgenera(relativeabundance＞1%).Therelativeabundanceof24predominantgeneraaccountedfor88.38%ofallthesequencedgenera;(2)ThefungalcompositionofLLSDsatdifferentgrowthstageswasdifferent.147generawereobtainedfromspringshoots,13generaofwhichwerepredominant.162generawereobtainedfromsummershoots,16generaofwhichwerepredominant.157generawereobtainedfromautumnshoots,16generaofwhichwerepredominant.Therewere85sharedgeneraatthreegrowthstages,8generaofwhichwerepredominant.Therelativeabundanceof8predominantgeneraconstituded53.67%,57.31%and78.9%,respectively;(3)PrincipalCo-ordinatesAnalysis(PCoA)showedIV AbstractthatthefungaldiversityandrelativeabundanceofthesameLLSDatdifferentgrowthstagesweredifferent,whichwasbasicallyconsistentwithtraditionalisolationresults.5.Diseasedleavesof5mainLLSDsindifferentregionswerecollectedinautumntocomparethefungaldiversityusingMiseqplatform.Themainresultswere(1)223generaweresequenced,27generaofwhichwerepredominantgenera,accountingfor85.20%ofthetotalsequences;(2)ThefungalcompositionofLLSDsindifferentregionswasdifferent.156generawereobtainedfromChongqingProvinceandtherewere16predominantgenera.135generawereobtainedfromSichuanProvinceandtherewere14predominantgenera.133generawereobtainedfromFujianProvinceandtherewere15predominantgenera.Thethreeregionsshared75generaandonlyPestalotiopsis,Ascochyta,Colletotrichumandg__k__Fungi(notannotated)werepredominant.(3)ThereexitedsignificantdifferencebetweenthesamplesinFujianandtheothertworegions(P<0.05).Thecompositionandabundanceofdominantgeneraweresignificantlydifferent,amongwhichg__f__Glomerellaceae,Chaetospermum,Cladosporiumandg__o__Pleosporalesshowedthemostsignificantdifference.Insummary,theoccurrenceofLLSDwasnotcausedbyasinglepathogen,buttriggeredbymixedpathogens.TheMiseqhigh-throughputsequencingtechnologywasappliedtotheanalysisoffungalcompositionanddiversityforthefirsttimeinthisresearch.BothoftheMiseqsequencingresultsandtraditionalisolationandidentificationresultsshowedthereweredifferencesinthecompositionandrelativecontentofthesameLLSDatdifferentgrowthstagesandindifferentregions.Moreover,moredetailedandcomprehensiveinformationoffungalcommunitycouldbeobtainedbyMiseqsequencing.ItissuggestedthatMiseqhigh-throughputsequencingtechnologycanbeemployedtoanalyzethefungaldiversityofplantdiseases,andcombinedwithtraditionalisolationandidentificationmethods,thediseasescausedbyfungimaybepredictedanddiagnosedtimely,whichcouldguaranteetheeffectivepreventionandcontrolofdiseases.Keywords:Loquatleafspotdiseases(LLSD);Fungalpathogensidentification;Miseqhigh-throughputsequence;FungaldiversityV 第1章文献综述第1章文献综述1.1果树真菌病害研究概况在植物侵染性病害中，70%~80%的病害是由病原真菌引起的。目前已详细报[1]道的病原真菌约有120个属，520个种。植物真菌病害不仅使作物产量下降、品质降低，同时还可分泌有害毒素与代谢物，这些物质会对人畜造成伤害，严重威胁着农产品的安全。在大田作物上，育种者早已对叶部真菌病害加以重视，并[2][3][4]在抗性遗传、抗性机制、抗病品种选育等研究工作中取得突破性进展。与大田作物相比，果树作物相关研究尚处于起步阶段，目前主要集中在病害流行发生[5][6][7][8]规律、病原鉴定、田间防治、抗性评价等方面。香蕉叶斑病是香蕉生产中最为严重的病害之一，主要由香蕉生球腔菌MycosphaerellamusicolaJ.L.MuIder.、斐济球腔菌M.fijiensisMoreIet.和芭蕉球腔[9][10]菌M.eumusae等3种主要病原真菌引起。研究者们从四倍体香蕉抗病品种“Cdcutta4”中发掘出3个独立控制香蕉抗叶斑病基因，其中Bs1是起主要作用的隐性基因，其余两个是受附加基因Bsri修饰的独立等位基因，三个基因具叠加效应且普遍存在，在感病品种中受感病显性基因掩盖故表现为感病。葡萄霜霉病是危害葡萄产业健康发展的重要制约因素，其病原菌为葡萄生单轴霉Plasmopara[11]viticola，该病菌的全基因组测序已经完成，同时大量的葡萄霜霉病菌RXLR（Arg-Xaa-Leu-Arg）效应蛋白被鉴定出来，它们在控制寄主的免疫反应中具有重要作用，这为病原菌的致病机理研究提供了分子依据。葡萄霜霉病的早期预测对[12]于科学防治该病具有重要意义，秦文韬建立了一套完整的葡萄霜霉病菌环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）快速检测体系。利用该体系，可在55min内检测到33fg/μL水平的P.viticola基因组DNA，是常规PCR检测体系灵敏度的100倍，并初步建立了灵敏度为9.4pg/μL的病原菌锁式探针检测法，为准确预测病害的流行与发生奠定了分子基础。MrRPV1基因是首个被成功克隆的葡萄霜霉病抗性基因，该基因编码的抗性蛋白是典型的TIR-NBS-LRR类型，野生的北美葡萄品种Muscadiniarotundifolia早在1889年就[13][14]被发现可以抵抗霜霉病，尹玲对MrRPV1中TIG和LRR结构域的功能和互作蛋白进行了研究，有助于明确霜霉菌致病机理和霜霉病的抗性机理。目前，葡萄种植者在很大程度上依赖化学农药来最大限度地减少霜霉菌对葡萄产量和品质造成的损失，但化学药剂的长期大量使用会使果品质量下降并造成严重的环境污[15]染，同时会威胁到人类的健康，生物防治的方法便应运而生。臧超群从葡萄叶片上分离的细菌中筛选出了对葡萄霜霉菌有较高抑制作用的SY286菌株——苍1 西南大学硕士学位论文白杆菌Ochrobacterumsp.，该菌可产生蛋白酶、嗜铁素和纤维素酶等具有抑菌活性的物质，其发酵原液对田间病害的中期防治效率高达90%，末期为80%以上，且对葡萄植株安全。该菌对葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌、辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌等植物病原真菌也有较好的抑制效果，是一种应用潜力很大的生防菌。苹果炭疽病是苹果生产中的严重病害之一，可造成果树大量落叶、落果，并使储藏[16]期的果实腐烂，造成重大的经济损失。付丹丹采用多基因系统学对我国苹果炭疽病病原菌进行了系统发育分析，同时结合形态学特征，确定我国苹果炭疽病病原菌由7个分类单元构成，并且果园周边具有炭疽病病症的寄主如辣椒、梨、猕[17]猴桃等可作为苹果炭疽病的潜在初侵染源。姜蕾发现在田间自然条件下，苹果炭疽病病原菌在侵入寄主后，会以潜伏侵染的方式寄生于健康叶片中，使健康叶[18]片的带菌率高达14%，来年则作为田间初侵染源为害果树。李娜筛选到离子注入C100-2-5苹果炭疽病菌低毒株和流磁场处理C0.25-1-2低毒株，先侵入寄主后[19]诱发植株产生抗病性，可减轻苹果炭疽病的发生及危害。孙微微等从杜仲内生真菌中筛选出了对苹果炭疽病菌有较强拮抗作用的DZGS07菌株（初步鉴定为[20]Colletotrichum），Soo等则使用生防根基细菌（antagonisticrhizobacteria，ARB）多粘类芽孢杆菌PaenibacilluspolymyxaAPEC128来抑制苹果炭疽病的发生，研究者们越来越关注生防菌在病害防治方面的应用品种。梨黑星病是梨树主要病害之[21]一，病原菌为纳雪黑星病菌Venturianashicola。Abe等通过分析高抗黑星病日本梨品种“Kinchaku”及中国梨品种红梨和蜜梨等后代杂交分离结果，认为F1代表现出的高抗表型是由单一显性基因控制的。抗病育种是减少病害危害的有效途径。[22]徐凌飞等认为通过品种之间的杂交可以获得抗黑星病的后代，以西洋梨为亲本[23][24]的后代不易感染黑星病。刘成及董星光均通过AFLP分子标记技术找到了与[25]梨黑星病抗性基因相关的分子标记，张树军等将AFLP标记转化为了更为迅速简便的SCAR标记，对梨杂交后代黑星病抗性的分子辅助选择有一定的应用价值。这些研究为其他果树作物真菌病害的研究及防治奠定了良好的理论基础。1.2枇杷叶部病害研究现状枇杷（EriobotryajaponicaLindl.）隶属于蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科（Maloideae）枇杷属（Eriobotrya），起源于中国，栽培历史已超过2100年，目[26;27]前在全世界30多个国家均有分布和栽培，主要集中分布于南北纬20°~35°之间，包括中国、西班牙、日本、土耳其、意大利等。我国枇杷的栽培面积和总产量居于世界首位，主要分布于长江以南各省，如福建、浙江、贵州、四川、重[28]庆、台湾等。枇杷易于栽培，适应性强，经济效益高，我国枇杷的栽培面积和范围不断增大，逐渐成为栽培区农村经济发展的支柱产业之一。2 第1章文献综述枇杷叶片中富含三帖酸类、倍半萜类、多酚类、黄酮类等多种化学成分，具[29]有抗炎、止痛、利尿等功效，如枇杷膏是我国传统中药，具有止咳润肺、化痰清热的功效，意大利用枇杷叶治疗糖尿病和皮肤病，并用其乙醇提取物来治疗炎[30]症。因此，枇杷叶片具有重要的开发利用价值。近年来，随着枇杷栽培面积的不断增大，生产栽培上枇杷病害的发生日益严重，尤其是叶部病害，种类很多，[31]常见的有灰斑病、轮纹病、炭疽病、叶尖焦枯病、圆斑病等。这些病害会导致树势早衰、果实产量和品质下降，成为限制枇杷产业快速发展的主要因素。同时，很多种植经营者对枇杷病虫害严重性认识不足，难以鉴别具体种类，对其发生规律和防治技术掌握较少，因而蒙受重大经济损失。探讨经济有效且可持续发展的枇杷病虫害防治方法，已成为保障枇杷产业健康发展的重要研究课题。迄今，在真菌寄主分布数据库（Fungus-HostDistributionsdatabase）关于枇杷寄主的记录有475条，如表1所示（https://nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/fungushost/fungushost.cfm），在全球80多个地区出现过枇杷病害方面的报道，发生地区主要集中在中国、日本、西班牙、意大利、巴基斯坦、土耳其等，其中主要的叶部病害有灰斑病、轮纹病、炭疽病、叶尖枯斑病及圆斑病等。1.2.1枇杷灰斑病枇杷叶片发病时，叶面上病斑为圆形或不规则形，直径4~13mm，中央灰白色，边缘淡棕色或暗褐色，后期病斑相连成大斑，表面着生的黑色小点即为病原菌分生孢子盘。枯斑干燥易破裂。该病四季均可发生，在温暖高湿条件下更易发[32]生，为害严重。Perello等从培养物及分生孢子形态特征、致病性测定等方面将阿根廷枇杷灰斑病致病菌鉴定为Pestalotiopsisguepinii。陈福如报道福建省枇杷[33]灰斑病的致病菌为P.eriobotryfolia，张斌等通过采集病害标本，进行室内镜检[34]等方法，认为贵阳地区枇杷灰斑病的致病菌为P.funerea。Y.Chen等从中国安徽省泾县枇杷灰斑病病样上分离到致病菌，通过形态学观察将其鉴定为Pestalotiopsisspp.，之后使用通用引物ITS1和ITS4扩增出533bp的序列，与Pestalotiopsistheae的序列相似性达99.5%，故将该菌鉴定为P.theae。之后，S.Xiao[35]等使用通用引物ITS4和ITS5扩增安徽省黄山市枇杷灰斑病分离物HS-16的rDNA-ITS区域，将其鉴定为Pestalotiopsismicrospora（KT965676）。日本的相关学者认为P.eriobotryfolia、P.funerea、P.adusta、P.eugeniae、P.longiaristata均[36]可引起枇杷灰斑病。1.2.2枇杷轮纹病病斑生于枇杷叶片上，近圆形，或因叶脉限制呈不规则形，多于叶缘先发病，直径3~11mm，中央灰褐色，边缘暗褐色，具轮纹，上散生小黑点（病原菌分生3 西南大学硕士学位论文孢子器）。病害发生严重时造成枯枝、落叶，影响抽稍。该病病原菌为枇杷壳二孢菌Ascochytaeriobotryae，Voglino（1908）首先在枇杷叶上描述该菌，随后，Bubak[37][38]在1916年也报道过该菌。坦桑尼亚、乌克兰也发现该菌可引起枇杷病害。[39][31]戴芳澜曾在江苏、广西、四川等地的枇杷病样上采集过该菌，之后在福建、[33]贵州等地发现Ascochytaeriobotryae可导致枇杷轮纹病。目前未见该菌分子鉴定方面的报道。1.2.3枇杷炭疽病枇杷炭疽病可危害幼苗、果实及叶片。叶病斑圆形至近圆形，直径3~30mm，多发生于叶缘，病斑赤褐色，后期相连成大斑，着生暗褐色小点（病原菌分生孢[40][41]子盘）。美国加利佛尼亚州及德克萨斯州于19世纪60年代报道过枇杷炭疽[42]病，病原菌为Colletotrichumgloeosporioides，随后在印度也发现该菌。中国、[26]日本的相关学者发现Colletotrichumacutatum也可导致枇杷炭疽病的发生。在[43]澳大利亚，该病致病菌为Colletotrichumsiamense。1.2.4枇杷叶尖枯斑病该病多发生于叶尖，病斑长形或不规则形，枯斑较大呈灰色，其上着生褐色[44]小圆点（分生孢子器）。在新西兰，该病的致病菌为Phomamacrostoma，在印[42][31][33]度，Phomajolyana及Phomaputaminum可引起该病发生。中国福建、贵州[45]等地报道该病致病菌为Phomaeriobatryae，但《真菌鉴定手册》及《中国真菌[46]志》（第十五卷茎点霉属）中并未对枇杷茎点霉进行描述。目前未见该菌分子鉴定方面的报道。1.2.5枇杷圆斑病该病只危害叶片。叶病斑初为褐色小斑点，逐渐扩大成近圆形，病斑中央白色或暗灰色，边缘黑色，后期破裂。分生孢子器以细密小黑点形势散生于叶面。该病病原菌为枇杷叶点霉菌Phyllostictaeriobatryae，早在1959年，我国台湾地区[47][40][48][42]就有该病危害枇杷的报道。据记载，美国佛罗里达州、格鲁吉亚、印度、[26][49][50][51]日本、南非、韩国、乌克兰、委内瑞拉等地都已在枇杷上发现该菌。目前未见该菌分子鉴定方面的报道。1.2.6枇杷其他病害枇杷胡麻叶斑病，又称胡麻色斑点病、胡麻枯斑病等，俗称“苗瘟”，是枇杷苗期主要病害，苗株发病率可达100%，危害严重。该病病斑多为圆形，直径3~9mm。病斑初为棕褐色，逐渐变为灰白色，后期病斑连片成不规则形大病斑，造4 第1章文献综述[52]成枯叶。病斑上散生黑色小点，即为病原菌分生孢子盘。Doidge首先报道了该[41][53]病病原菌为Entomosporiummaculatum，后来美洲（加利佛尼亚、密西西比）、[54][55]澳洲（澳大利亚、新西兰）和南非的一些植物病理学者也证实了这一点。但[56][57][26]在巴拉圭、巴西、日本等地，该病由Entomosporiummespili引起。我国福[58]建省于1979年6月首次在莆田九华农场中的枇杷苗木上发现该病，高日霞、[31]陈福如报道该病病原菌为Entomosporiumeriobotryae。目前未见该菌分子鉴定方面的报道。[59]我国台湾地区早在1979年便发现链格孢菌Alternaria可使枇杷感病，近些[60][61]年来，伊朗、希腊等国家的植物病理学家从分子生物学方面鉴定出了枇杷链格孢叶斑病的致病菌——Alternariaalternata。该病可为害果实及叶片，叶病斑圆形，为棕色坏死斑点，边缘黄绿色，直径2~6mm。随病斑增大变为不规则形或具有同心环状的圆形病斑。感染后期，病斑聚集导致叶片枯萎及脱落。[31]图1-1陈福如等报道的枇杷主要叶斑病病征a.灰斑病；b.轮纹病；c.炭疽病；d.叶尖枯斑病；e.圆斑病；f.胡麻叶斑病。[31]Fig.1-1SymptomsofmainloquatleafspotdiseasesreportedbyChena.greyleafspotdisease;b.ringspotdisease;c.anthracnose;d.tipspotdisease;e.roundspotdisease;f.flaxleafspotdisease.5 西南大学硕士学位论文表1-1世界上报道过的枇杷病原真菌分布概况Table1-1Distributionofloquatfungalpathogensintheworld病原菌分布PathogenDistributionAcrocalymmavagumSpainAlternariaGreece，Florida，Japan，Mexico，Venezuela，Cyprus，ChinaApiosporopsissaccardianaDominicanRepublicArmillariaMexico，California，Japan，SouthAfrica，Tanzania，ZimbabweArmillariellaSouthAfrica，FloridaArthotheliumabnormeSouthAfricaAscochytaeriobotryaeChina，Tanzania，UkraineAuriculariacorneaPhilippinesBartaliniarobillardoidesItalyBotryodiplodiaFlorida，SouthAfricaBotryosphaeriaCalifornia，NewZealand，Florida，Chile，Hawaii，BotrytiscinereaJapan，China，GreeceCapnodiumCalifornia，MyanmarCeratocystisfimbriataChinaCercosporaChina，Florida，TaiwanChalaracylindrospermaChinaChondrostereumpurpureumNewZealandChina，Germany，Italy，Japan，Spain，RepublicofGeorgia，Ukraine，CladosporiumFrance，Japan，CyprusClasterosporiumChina，TaiwanClitocybetabescensFloridaColeopucciniasimplexChina，TaiwanColeopucciniellasimplexJapan，TaiwanColletotrichumJapan，China，Florida，India，Texas，Australia，MexicoConiothyriumsp.Korea，VenezuelaCorticiumsalmonicolorKenya，MauritiusCorynesporaIndia，FloridaCoryneumeriobotryaeItalyCryptostictisPortugalCylindrodendrumalicantinumSpainCytosporaIndiaDactylonectriaSpainDiatrypellafavaceaUkraine6 第1章文献综述DiplocarponmespiliCalifornia，NewZealand，SouthAfricaDiplodiaSpain，Florida，Greece，India，Portugal，UkraineDiscosiaartocreasGreeceDothiorellaSpain，India，Japan，PhilippinesChina，Chile，Florida，Louisiana，Mississippi，NorthCarolina，SouthEntomosporiumAfrica，Australia，Brazil，Japan，NewZealand，ParaguayErythriciumsalmonicolorJapanEutypalataAustralasia，AustraliaFabraeamaculataCalifornia，Greece，Malawi，ZimbabweFusariumFlorida，India，AustraliaFuscoporiagilvaArgentinaRepublicofGeorgia，Japan，Libya，UnitedStates，SouthAfrica，Spain，Ukraine，Armenia，Australia，California，Chile，China，Cyprus，Florida，France，Germany，Greece，Iran，Italy，Jordan，FusicladiumLebanon，Morocco，NewZealand，Ohio，Palestine，Portugal，Russia，Slovenia，Switzerland，Tasmania，Turkey，UnitedKingdom，Uzbekistan，WashingtonFusicoccumaesculiJapanGanodermalucidumArizonaGeotrichumcandidumJapanGloeosporiumArgentina，China，SouthAfricaChina，Florida，Greece，Gulfstates，Japan，Mauritius，Venezuela，GlomerellacingulataZimbabweGymnosporangiumconfusumUkraineHelicobasidiummompaJapanHelminthosporiumsp.MexicoHendersoniaeriobotryaeArgentinaHirneolacorneaPhilippinesHymenochaetetristiusculaPhilippinesHypoxylonsp.CaliforniaIlyonectriarobustaSpainLaestadiamespiliGreeceLambertellajasminiBermudaLasiodiplodiatheobromaeIndia，JapanLeptosphaeriaIndia，Japan，China，BrazilMacrophomaeriobotryaeIndia，JapanMacrophominaphaseolinaVenezuelaMacrosporiumsp.SouthernAfrica7 西南大学硕士学位论文MelanommasordidissimumArgentinaMetasphaeriaeriobotryaePortugalMicrodiplodiaGreece，ChinaMicrothyriumminutissimumJapanMonilinialaxaChinaMicrodiplodiaIndia，Florida，ChinaMycenacitricolorVenezuelaMycosphaerellasp.GreeceNectriacinnabarinaCaliforniaNeofusicoccumSpainNeottiosporaeriobotryaeJapanPenicilliumJapan，PapuaNewGuineaPeniophoranudaUkrainePerenniporiaJapanPestalosphaeriagubaeJapanBermuda，China，Japan，DistrictofColumbia，Australia，Louisiana，PestalotiaTaiwan，Brazil，Florida，RepublicofGeorgia，Myanmar，Turkey，MauritiusPestalotiopsisChina，Japan，Korea，Argentina，Brazil，Turkey，IndiaPeyronellaeanainiensisIndiaPhanerochaetesalmonicolorPapuaNewGuineaPhellinusnoxiusTaiwanPhomaItaly，India，NewZealand，FloridaPhomopsisJapan，China，India，Australia，California，GreeceJapan，China，Florida，RepublicofGeorgia，India，Korea，NorthPhyllostictaCarolina，SouthAfrica，Taiwan，Ukraine，Venezuela，Greece，Italy，UkrainePhymatotrichumomnivorumTexasPhysalosporaobtusaCaliforniaFlorida，California，Chile，Japan，Peru，Taiwan，UnitedStates，PhytophthoraFrance，Italy，Lebanon，Taiwan，MexicoPleosporaItalyPolyporusarculariusJapanProtostromasp.FloridaPseudocercosporaChina，Japan，TaiwanPucciniasp.VenezuelaPyrenochaetasp.MalawiPythiumFlorida，Australia8 第1章文献综述RhizoctoniaFlorida，GreeceRosellinianecatrixJapanSchizophyllumcommuneArmeniaSclerotinialaxaGreeceSclerotiumrolfsiiJapanSeiridiumChina，JapanSeptoriaeriobotryaeDominicanRepublic，Florida，GreeceSpeiropsispedatosporaJapanSpencermartinsiaSpainSphacelomasp.MexicoSphaeropsisChina，FloridaCyprus，Greece，USSR，Florida，Australia，California，Italy，NewSpilocaeaZealand，SouthAfrica，WashingtonSporobolomycesphaffiiChinaStachybotryssp.GhanaStagonosporaeriobotryaePakistanStemphyliumsp.CyprusStilbonectrialateritiaChinaStilbumcinnabarinumChinaSuttoniellaeriobotryaePakistanTaphrinabullataUkraineTrametesversicolorNewZealandTrematosphaerellaeriobotryaeChinaTrematosphaeriaeriobotryaeJapanTrichotheciumroseumJapanTuberculariavulgarisUkraineVenturiaCalifornia，England同时，还有许多次要的叶部病害时有发生（表1-1），但没有受到很多关注。由此可见，枇杷叶部病害的病原菌种类组成在世界各栽培区有很大差别。病原菌的鉴定多依赖其形态学特征，缺少分子鉴定信息。1.3ITS序列分析在果树真菌病害分类鉴定中的应用目前已知的植物病原真菌种类繁多、分布广泛、形态特征复杂，且少数真菌的形态特征和生理生化指标随环境变化而不稳定，故通过传统的真菌菌种鉴定方法，即通过培养后观察菌落形态和镜检特征，或辅以生理、生化及营养实验等表型特征为依据来加以鉴别显得非常困难。传统的鉴定方法还有一个缺点就是其不9 西南大学硕士学位论文仅需要丰富的真菌鉴定工作经验又需要较长的检验时间。近年来，随着现代分子生物学技术的发展，PCR（PolymeraseChainReaction）直接测序法的应用越来越广泛，而利用PCR扩增病原菌核糖体基因转录间隔区（InternalTranscribed[62-64]Spacer，ITS）进行病原真菌鉴定、快速分子检测及病害诊断得到了快速发展。由于这种方法快速、准确和简便，因而越来越受到植物病理学家们的重视。1.3.1ITS序列的结构和特征真核生物核糖体基因转录间隔区ITS，是指位于真菌核糖体DNA（rDNA）上的18S小亚基（SmallRibosomalsubunit，SSU）和28S大亚基（LargeRibosomalSubunit，LSU）基因之间的片段区域。主要包括内转录间隔区1（ITS1）、5.8SrDNA、内转录间隔区2（ITS2），其两侧分别是18SrDNA和28SrDNA（图1），它们以头尾串联的形式形成重复序列，一个基因组内有60~200个拷贝ITS1ITS45’3’18SrDNA5.8SrDNA28SrDNAITS1ITS2图1-2真菌rDNA-ITS结构Fig.1-2StructureofrDNA-ITSsequence1.3.2ITS序列分析的应用原理和方法ITS区域受外界环境因素的影响较小，进化速度很快，因而可以提供较丰富[65]的信息位点和变异位点。ITS序列由于真菌种类的不同而经常发生变异，它弥补了核糖体DNA上其他区域序列（18S、5.8S、28S）的保守性强、分化水平低、进化速度慢等的不足，表现出极大的序列多态性，即使对近缘种、不同属也能根据ITS序列的不同而进行鉴别。ITS1和ITS2是中度保守区域，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显。这种特点使ITS序列分析适合于真菌物种的分子鉴定以及属内种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析，能实质性地反映出属、种间以及菌株间的碱基对差异。此外，真菌的ITS区域长度一般为650～750bp，序列长度适中，利于PCR测序的操作。因而，在核糖体各区域序列中，其作为一个很重要的分子标记，已被广泛应用于物种的属间、属[66;67]内种间及种内群体的系统学研究。真菌rDNA-ITS序列分析用于真菌系统分类及鉴定通常通过多聚酶链式反应（PCR）技术实现。根据这些基因上高度保守区段设计出通用引物，借助PCR技术扩增rDNA的目的片段。决定PCR技术应用效果的主要因素在于所选择的扩增区域变异是否适当，所以首先要选择合适的10 第1章文献综述引物。己经有许多ITS片段的通用引物被设计出来，表1-2是目前扩增真菌ITS序列的9个常用引物。表1-2扩增真菌ITS序列的9个常用引物Table1-2NinecommonlyusedprimersfortheamplificationofITSsequence引物名称序列（5’-3’）位置长度（bp）参考文献PrimerSequence(5’-3’)LocationLength(bp)ReferenceITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGC18S19[68]ITS2GCTGCGTTCTTCATCGATGC5.8S20[68]ITS3GCATCGATGAAGAACGCAGC5.8S20[68]ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC28S20[68]ITS5GGAAGGTAAAAGTCAAGG18S18[68]ITS1-FCTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA18S23[69]ITS4-BCAGGAGACTTGTACACGGTCCAG28S23[69]5.8SCGCTGCGTTCTTCATCG5.8S17[69]5.8SRTCGATGGAAGAACGCAGCG5.8S19[69]1.3.3ITS序列在果树真菌病害研究中的应用目前，在真菌分类鉴定中最常用的分子标记方法主要是限制性片段长度多态性分析（restrictedfragmentlengthpolymorphism，RFLP）、随机扩增多态性分析（randomlyamplifiedpolymorphic，RAPD）及rDNA-ITS序列分析。RFLP技术不仅要求严格操作，而且扩增时经常发生凝胶背景杂乱、假阳性等诸多问题，故这一技术具有一定局限性。RAPD适合于种内菌株亲缘关系、遗传多样性的研究，但对于属内种间及近缘属之间的亲缘关系的研究有一定的局限性。而rDNA-ITS序列分析的方法克服了以上两种方法的局限性，不仅能实质性地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，而且适合于真菌物种的分子鉴定以及属内种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。由于ITS基因序列在真菌种间的高度变异和种内的稳定性，因此为病原物的分子检测提供了理想的靶标序列。目前该方法以其快速、准确和简便的特点得到了植病专家的广泛关注。同时，由于ITS序列易获得，具有广泛适用的通用引物，并且对模板DNA的要求较低，因而成[70][71]为了首选的真菌条码标记序列（fungalbarcodemarker）。Singh等对来自夏威夷、Sasri及瓜德罗普岛等地的甘蔗黑粉菌核酸用ITS序列的通用引物进行PCR扩增得到ITS序列，并分别用其中的ITS1和ITS2区域及全长序列进行分析，构建进化树，发现不同地区黑粉菌的ITS1和ITS2区域分别有96.1%和96.9%的序列相似性，且总共分别有17和21个的碱基变化，说明序列能正常地在属水平上11 西南大学硕士学位论文[72]定义生物，并且能够解决近缘相关物种的关系。商蓓应用通用引物ITS1和ITS4对苹果树常见病害（苹果黑星病菌、斑点落叶病菌、褐斑病菌和白粉病菌）的病原菌共26个菌株进行了PCR扩增和测序，同时对其进行比对筛选，获得了1对特异性引物320A/320B。利用该特异性引物对苹果病原真菌的26个待测菌株及接种苹果黑星病菌的不同阶段的苹果叶片组织进行了PCR分子检测。结果显示，该特异性引物能够检测出待测菌株中的苹果黑星病菌，同时也能从接种苹果黑星病[73]菌的不同阶段的苹果叶片组织中检测到苹果黑星病菌的存在。江晶等根据GenBank中登陆的胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）的ITS序列设计引物CgF1为正向引物，以通用引物ITS4为反向引物，对苹果炭疽菌进行PCR扩增，可以扩增出1232bp的特异性条带；用苹果炭疽病菌接种离体苹果，以接种后发病的病组织总DNA为模板，利用引物CgFI/ITS4进行PCR扩增，同样可以扩增出1232bp的特异性条带，而健康苹果组织DNA中未能扩增出任何条带，[74]表明ITS序列可用于苹果炭疽菌的鉴定和快速检测。王友升等针对采后贮藏过程中发病的桃、李果实中分离到的5株丝状病原真菌进行了研究。用通用引物ITS-4/ITS-5对ITS区域进行PCR扩增，获得了大小为600bp的DNA片段，测序后将结果在GenBank数据库中进行同源序列搜索对比，并且构建系统发育进化树。结果表明：5株分离菌与Moniliniafructicola（FJ515894）ITS序列的同源性皆高达99%；5株菌经鉴定均为褐腐病原菌果生链核盘菌Moniliniafructicola。[75]孙俊采用rDNA-ITS序列分析的方法对辽宁省近年发生的新病害——核桃枝枯病的病原进行了鉴定，将获得的待测菌株rDNA-ITS序列与GenBank中的序列进行同源性比较，发现该菌株与Phomopsissp.（HM595508.1）的同源性达到99%，由此确定辽宁地区新病害核桃枝枯病的病原菌为胡桃楸拟茎点霉Phomopsis[76]juglandina。此外，应用rDNA-ITS序列分析也准确鉴定出了蓝莓炭疽病、火龙[77][78]果腐烂病、香蕉枯萎病等的病原真菌。与传统的真菌形态学鉴定方法相比，rDNA-ITS序列分析可以更加快速、客观地鉴定出病原真菌。但不可否认的是，rDNA-ITS序列分析也存在一定的缺陷，如当物种ITS区域序列可变程度不高，不足以用来区分其种属或组群间的差异时，ITS序列分析并不能对此类真菌进行准确鉴别。此外，ITS序列分析结果还会受到比对使用的基因库完善程度的影响，当基因库中存在的、与待检菌株高度同源序列缺乏时，或者ITS序列上表现出极小的差异性时，rDNA-ITS序列分析的应用能力就会受到一定的限制。此时，应结合传统的真菌形态学鉴定结果（如培养特征、镜检特征等）与ITS序列分析结果，才能对果树病原真菌进行准确鉴定。随着现代分子生物学技术的飞速发展，越来越多的技术被用于真菌的分类鉴定、真菌之间亲缘关系及遗传变异研究中。真菌的分类鉴定也逐渐向分子水平方12 第1章文献综述[79]向发展，形成多学科的综合。目前，应用分子生物学技术己成功鉴别出了一些[80-82]在形态学上难以鉴定的真菌。分子生物学技术的不断进步及其他方法的综合使用，将进一步促进rDNA-ITS序列标记技术在果树真菌分类鉴定中的应用。1.4高通量测序技术在微生物群落多样性研究中的应用微生物生态学是研究微生物群体及其周围生物与非生物环境相互作用规律的[83]学科，而环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究热点。因为环境中绝大部分微生物是不可培养的，传统的微生物纯培养技术及显微镜技术作为鉴定微生物种群的手段有很大的局限性，只能区分[84]环境中微生物总数的0.1%~10%的微生物种类，并且无法获知样品中不同类型微生物种类及它们的相对丰度，易忽略掉难以分离培养的菌株。因此，不依赖于微生物纯培养（culture-independent）的分子生物学方法正被广泛地应用于微生物[85][86]生态学研究中，主要包括：BIOLOG微平板法、磷脂脂肪酸（PLFA）分析[87][88]方法、荧光定位杂交（FISH）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、温度梯度凝[89][90]胶电泳（TGGE）、限制性片段长度多态性（RFLP）分析、末端标记限制性[91][92]片段长度多态性（T-RFLP）分析、单链构象多态性（SSCP）分析、和随机[93][94]扩增多态性（RAPD）分析、实时荧光定量PCR技术（q-PCR）等。但是，这些技术都存在很多不足之处，如DGGE等分子指纹图谱技术，在结果中通常只含有数十条条带，只能反映样品中少数优势菌群的信息。同时，由于分辨率误差，部分电泳条带中可能包含多种16SrDNA序列，要获知电泳图谱中具体的菌种信息，还需对每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，操作繁琐；而且，这些方法无法对样品中的微生物做到绝对定量。长期以来，由于技术限制问题，人们对微生物群落结构和多样性的认识还不[95]够全面，对微生物功能及代谢机理方面了解的更少。随着基因芯片、高通量测序等新技术的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。基因芯片以DNA杂交为基础，通过固定在芯片上的探针来获得微生物多样性的信息，但是这种方法只能验证已知菌群，却无法探索未知，而且由信号强弱判断微生物相对丰度也相对不够准确。新一代测序技术（next-generationsequencingtechnology）的成熟和普及，为微生物分子生态学的研究注入了新的力量，使人们能够对环境微生物进行深度测序，并灵敏地探测出微生物群落结构随外界环境改变而发生的细微变化，对于人们研究环境与微生物之间的关系、环境治理策略、微生物资源利用以及人类医疗健康都有着重要的理论和实际意义。第二代测序技术以Roche公司的454、ABI公司的SOLiD（supportedoligoligationdetection）和Illumina公司的Solexa技术为代表。以上测序平台以数据产13 西南大学硕士学位论文出通量高为最大特点，同时具有低成本及流程自动化的优势，为深入研究微生物群落结构提供了新的技术支持。454平台读长最长，目前可达1000bp，适合对未知基因组进行从头测序；SOLiD读长最短，为60~75bp，但测序精度高，适合SNP检测；IlluminaGenomeAnalyzer及HiSeq2500的最大读长为100bp，而Miseq可实现300bp×2的测序长度，而且测序成本低，具有很高的性价比。以上高通量平台测序方法虽各有特点，但它们的测序原理类似，核心思想均为边合成边测序（SequencingbySynthesis，SBS），当生成新的DNA互补链时，或加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物发出荧光，亦或直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号。之后通过捕捉光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。目前在微生物群落结构及多样性分析中最具应用潜力的平台为IlluminaMiseq，该技术具有以下特点：（1）读长及通量优势：读长优势可得到更准确拼装结果，通量高，PE250高达9G通量，PE300高达15G通量。（2）样本制备便捷，试验周期短：DNA模板浓度最低50ng，在短时间（几个小时）内自动化操作即可完成全部样品的制备工作。（3）具有最完整的整合功能：可独立完成簇生成、双向测序及数据分析等工作。（4）数据产出均一性好：对每个样品的DNA量进行严格的定量，提高了数据产出的均一性。MiSeq高通量测序平台集中了IlluminaHiSeq2500和Roche454的优点：相对于Hiseq平台，具有更长的读长，可以使拼装结果更加准确和完整；相对于454平台，具有更高的数据量产出，加大了测序的覆盖度和深度，使测得的变异信息更加准确。Miseq不仅可实现对多样品的多个可变区同时测序，而且在测序的速度通量上都有进一步的提升，是应用于基因组测序和分子生态研究的最佳平台，目前该平台已在微生物多样性群落结构研究方面受到了广大学者的认可。该技术可以同时检测样品中的优势物种、稀有物种及一些未知物种，并客观地还原样品本身的菌群组成结构及相对丰度，并充分发挥大数据量优势，能够检测出丰度低至万分之一的痕量菌。土壤结构复杂，其中聚生着数目庞大的微生物，在土壤有机质的循环和转化[96]过程中扮演着重要角色，对土壤结构及肥力有很大的影响。Schmidt等发现IlluminaMiSeq测序所得数据能够覆盖大多数真菌谱系中完整的ITS1区域，比454方法更适用于评估环境真菌群落多样性。虽然在数据读取的过程中存在大量的数据损失（78.6%），但是由于初始序列数量很大，所以并不会影响分析的准确性。同时，为了全面进行评估（在使用单一引物对的情况下），最好将3次重复的PCR产物（52℃退火温度）及在不同退火温度（52℃、55℃、58℃）下得到的PCR产物混合检测。Schmidt等利用该技术研究了位于德国Flörsheim的一个草甸横断面的16个土壤样品中的真菌群落多样性，结果显示，在生成的3320个OTU中，14 第1章文献综述相对丰度最高的生物类群为子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota、球囊菌门Glomeromycota，并且土壤真菌群落存在空间分布差异，群落相似度随地理距离增加而略有下降。土壤微生物与周围环境的关系一直是研究的热点，比如采矿活动中的重金属泄漏会影响周围土壤的菌群结构及多样性，更会危害人类健康，[97]Hong等收集了北京潮河流域重金属重污染、重度污染、无污染三个地区的土壤样品，通过Miseq高通量测序分析发现，重金属污染地区微生物多样性显著高于非污染区，随污染程度加重优势菌属种类会发生变化。值得注意的是，在硫杆菌属Thiobacillus,假单胞菌属Pseudomonas,节杆菌属Arthrobacter,微鞘藻属Microcoleus、鞘丝藻属Leptolyngbya及产黄杆菌属Rhodanobacter中发现了一些对重金属具有潜在抗性的细菌，对维持土壤生态平衡有重要作用，并且可用于金[98]属污染土壤的生物修复。活性污泥系统中的微生物是去除污染物的主体，其稳定运行有赖于微生物群[99][100]落结构和多样性。闻韵等利用Miseq技术分析了序批式反应器（SBR）中活性污泥中微生物群落在1年内的动态变化规律，结果表明，所有样品中含量最高的为变形菌门Proteobacteria，细菌群落组成随时间变化明显，在所测得的385个属的细菌中，有42个共享菌属，有54个属的细菌只存在于3个以下样品中，并且[101]溶解氧（DO）及温度对菌群结构及多样性有较大的影响。闫来洪等使用同样的测序技术对来自于污水处理厂及实验室人工模拟装置中的5种不同活性污泥中的微生物组成和多样性进行了分析，比较发现，不同活性污泥中的优势细菌组成相似，但相对丰度差异较大，正常污泥中浮霉状菌Planctomycetes的含量约是污泥泡沫中的2倍，但是放线菌Actinobacteria却是后者中含量的一半；硝化螺旋菌（Nitrospirae）在废水处理中具有重要的作用，该菌在正常污泥中的含量是泡沫中的5倍，说明环境条件可影响微生物的组成及相对丰度。不同处理条件下，活性污泥中微生物群落的特有菌属是不同的，具有明显的地域分布性，人工模拟处理装置中的微生物多样性明显低于污水处理厂，所以不适合模拟实际中的污水处理过程。这些研究将为以后活性污泥微生物群落结构研究奠定一定的基础。随着Miseq测序技术的不断成熟，该技术被应用在越来越多与人们日常生活[102]息息相关的领域内。Wu等使用MiSeq技术分析了常规处理及综合处理净化策略下饮用水系统（DWDSs）生物膜细菌群落的组成和多样性，研究显示，变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门Bacteroidetes、放线菌门Actinobacteria、硝化螺旋菌门Nitrospirae及蓝藻菌门Cyanobacteria是DWDS生物膜细菌群落的主要成分。在不同DWDS生物膜中，虽然占优势地位的均为Proteobacteria，但是Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria在每个样品中的相对丰度却是不同的，说明不同样品细菌群落组成变化很大。不15 西南大学硕士学位论文同的饮用水净化策略可以改变DWDS生物膜细菌群落组成及多样性。此外，Pearson相关分析表明，放线菌与自来水中总碱度和溶解的有机碳水平呈正相关，[103]而Firmicutes与亚硝酸盐氮显著正相关。葛英亮等采用Miseq测序法研究了臭氧-生物活性炭（O3-BAC）净水处理过程中各单元出水中微生物多样性及丰度，所测得的细菌隶属于38个门，522个属，共享菌属135个，其中相对丰度较小的细菌经臭氧处理后含量大幅增加，丰度较高的细菌则迅速下降，整体上菌群结构变化复杂，具有高度多样性，净水处理后细菌多样性增加，分布更均匀，所以后期消毒工艺需改进，据此可有目的性地完善饮用水消毒工艺，保障饮水安全。[104]Piotrowska-Cyplik等通过Miseq技术来评估真空包装火腿中微需氧和厌氧的特定腐败菌（specificspoilageorganisms，SSOs）多样性，切好的熟火腿中的细菌主要分属于放线菌门Actinobacteria、变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes及拟杆菌门Bacteroidetes。4℃有利于乳酸杆菌科Lactobacillaceae、肠杆菌科Lactobacillaceae及微球菌科Micrococcaceae等嗜温、嗜冷细菌的生长。同时还观察到了高丰度的热杀索丝菌Brochothrixthermosphacta以及新型耐寒梭菌Clostridiumspp.。这些微生物的生长导致产品的pH值和感官特性发生了变化。[105]Gao等对中国京津冀（BTH）区域内中6个城市中收集的PM2.5样品进行了Miseq高通量测序，结果显示，Proteobacteria、Cyanobacteria、Actinobacteria及Firmicutes时其中的优势菌门，同时观察到18种常见的潜在病原菌，但它们的相对丰度较低（仅为3.61%），以肠球菌Enterococcusfaecium和大肠杆菌Escherichiacoli为代表，植物和土壤是PM2.5中细菌的主要来源。大气污染物是PM2.5种细菌群落结构变化的主要原因，其次为气象条件及PM2.5中的化学成分。该研究加深了人们对京津冀地区PM2.5中细菌群落组成及多样性的认识。[106]吴水芸对肥胖小鼠和正常对照小鼠的肠道粪便进行了Miseq高通量测序，发现二者粪便中的细菌组成种类和数量差异明显，肥胖小鼠肠道细菌的分布均匀度比正常小鼠差，且S24-7（norank）及拟杆菌属Bacteroides的含量明显减少，但脱硫弧菌属Desulfovibrio增多，其肠道微生态发生了明显改变。迄今，未见Miseq高通量技术用于植物病害样品菌群组成及多样性的分析中。16 第2章引言第2章引言2.1研究背景与意义枇杷（Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl）属蔷薇科（Rosaceae）枇杷属（Eriobotrya）植物，起源于我国，其果实成熟于春末夏初，填补了我国水果淡季市场。枇杷叶具有清热化痰、止咳等药用价值，因此受到消费者喜爱。随着枇杷栽培面积的增加，生产栽培上的病害发生成为限制枇杷优质高产的主要因素。叶片是植物光合作用的重要器官，也是病虫害最常发生的部位。此外，叶部病害的部分病原菌还可为害根、枝、花和果实，严重时会造成大量落叶、落果和树势早衰。近年来我国枇杷的栽培面积不断增加，但是种植者在生产上对枇杷病害种类的认识及防治经验普遍缺乏，造成了由于病害发生严重而减产的不良后果。枇杷叶斑病种类繁多，由于病斑形态相似，且存在多种病原菌混合致病的现象，故无法通过传统病原鉴定法全面、快速、准确地鉴定其病原菌种类。本研究以常见且危害严重的枇杷灰斑病、轮纹病、炭疽病、叶尖枯斑病和圆斑病病样为研究对象，通过传统分离鉴定法对病原菌进行准确鉴定，并结合Miseq高通量测序技术对重庆地区不同时期（春梢、夏梢、秋梢生长时期）及不同地区（重庆、福建和四川）同一时期枇杷主要叶斑病病样真菌群落组成及多样性进行分析，以期为枇杷叶斑病的防治提供资料参考。2.2研究内容1.在重庆地区枇杷春梢、夏梢、秋梢生长时期，采集5种枇杷叶斑病病样，采用传统的分离鉴定方法，包括菌落特征及孢子形态观察、rDNA-ITS序列分析和致病性测定等，对分离得到的真菌进行鉴定。同时进行Miseq高通量测序，分析不同时期枇杷病样的真菌群落组成及多样性。综合上述分析结果，以期明确重庆地区枇杷主要叶斑病病原菌种类及周年演替规律。2.在枇杷秋梢生长时期，采集不同枇杷主产区（重庆、四川、福建）5种枇杷叶斑病病样，结合传统分离鉴定结果及Miseq高通量测序结果，比较并研究不同地区枇杷叶斑病病原真菌的多样性及区域特异性。17 西南大学硕士学位论文2.3技术路线18 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律3.1材料与方法3.1.1主要仪器及设备高温高压灭菌锅、电热恒温培养箱（上海齐欣）、荧光显微镜（OlmpusBX34）、高通量组织研磨仪（CoyoteG200）、台式冷冻离心机（Sigma3K15）、C1000TouchPCR仪（BIO-RAD）、VeritiPCR仪（ABI）、超净工作台SA-1600-ZJZ（上海稼丰园艺用品有限公司）、恒温水浴锅（Shellab）、普通电泳系统（BIO-RAD）、凝胶成像系统GelDocTmXR+imagingsystem（BIO-RAD）、核酸蛋白检测仪Nanodrop2000（ThermoScientific）、-80℃超低温冰箱、1.5mL离心管、2mL离心管、一次性无菌培养皿（直径90mm）等。3.1.2主要药品及试剂马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potatodextroseager，PDA）：马铃薯浸粉3.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂14.0g/L，121℃高温高压灭菌后冷却至50℃左右加入100μg/mL链霉素（streptomycin）。燕麦琼脂培养基（oatmealager，OA）：燕麦60g/L，琼脂12.5g/L，燕麦加水煮沸30min，过滤后加入琼脂，补足至1000mL，121℃高温高压灭菌后冷却至50℃左右加入100μg/mL链霉素（streptomycin）。DNA提取液[Tris-HCl0.2mol/L（pH7.5），NaCl0.5mol/L，EDTA0.01mol/L，SDS10g/L]、无菌水、无水乙醇、70%乙醇、75%乙醇、1%升汞、氯仿/异戊醇（24:1）、Tris-饱和酚、氯仿、10mg/LRNAse、TBE缓冲液等。3.1.3病样采集为研究重庆地区枇杷主要叶斑病病原菌周年变化规律，分别于春梢、夏梢、秋梢生长时期采集疑似枇杷灰斑病、轮纹病、炭疽病、叶尖枯斑病及圆斑病等5种病害病样。另于2016年9月枇杷秋梢生长时期采集枇杷主产区重庆、四川、福建地区枇杷叶部5种病害病样，以观察不同地区枇杷主要叶斑病发生及变化规律。每种病害采集病样5份以上，分别装入干净的自封袋中并做好标记，置于冰盒中运送回实验室后，立即进行分离。3.1.4病原菌的分离与纯化将采集到的5类典型枇杷叶斑病分别进行拍照、描述及标号。采用常规组织分离法进行病原菌的分离。将病样清洗干净后，在超净工作台上使用无菌剪刀从19 西南大学硕士学位论文发病部位剪下病健交界处组织（4mm╳4mm），用70%酒精浸泡10s，1%升汞处理1~2min，最后用无菌水冲洗3遍，沥干后转入PDA平板培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。3d后采用琼脂平板稀释纯化法对所分离到的靶标菌进行转皿纯化培养。纯化的菌种于4℃保存备用。3.1.5分离菌株的致病性测定[107]根据柯赫氏法则，采集长势一致的健康枇杷嫩叶（接种品种为华白1号），用70%的酒精进行表面消毒处理后，用无菌水冲洗干净。在叶脉两侧选4点并用针刺伤（叶背面10针刺伤，均匀分布在5mm范围内）；将分离纯化后的病原菌转至PDA平板培养基上，于25℃暗处培养7d后，用无菌水冲洗出孢子，配制5成浓度为1×10个/mL的孢子悬浮液。用无菌注射器将孢悬液注射于叶片针刺部位，每个处理4片叶子，3次重复，以无菌水作对照，放置于铺有湿润滤纸的白色瓷盘内，上覆保鲜膜保湿，于25℃温室中培养、观察。待叶片发病后，从发病部位的病健交界处分离病原菌，与原接种菌株进行比较。3.1.6分离菌株的形态学鉴定将纯化的病原真菌转接至PDA培养基上，待菌落长满整个平板后，用无菌针或镊子挑取少量菌体培养物，置于滴有一滴无菌水的干净载玻片上，盖上盖玻片后进行镜检。或采用插片法，让菌物的菌丝体长在盖玻片上，待长满后取下盖玻片观察菌丝、孢子形态特征等。或采用无菌水冲洗菌落表面，获得孢子悬浮液以进行观察。随机挑选30个孢子进行测量记载，并用OlmpusBX34荧光显微镜拍照，参考《真菌鉴定手册》及《中国真菌志》判定其可能种类。同时统计获得菌株的分离率。3.1.7分离菌株的rDNA-ITS序列分析从培养皿中刮取适量菌丝放入1.5mL灭菌离心管中，使用CoyoteG200高通量组织研磨仪研磨菌丝至粉末，加入500μL70℃预热的DNA提取液混匀，冰上放置10min；加入500μL氯仿/异戊醇（24:1），充分涡旋后，于Sigma3K15台式冷冻离心机上12000rpm离心10min，取上清液（约400μL）转入另一干净的1.5mL离心管中；加入200μLTris-饱和酚，涡旋2min后再加入200μL氯仿混合均匀（涡旋），13000rpm离心10min，取上清液（约300μL）；加入300μL氯仿/异戊醇（24:1），充分涡旋，13000rpm离心10min，取上清液（约200μL）于1.5mL离心管中，加入预冷的无水乙醇500μL，置于-80℃下沉淀30min以上；6000rpm离心1min弃去上清液，加入300μL75%乙醇洗涤2次，6000rpm离心1min弃去上清液后于室温晾干沉淀，加入200μLddH2O，再加入2μLRNase20 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律（10mg/L），37℃放置30min以上，除去RNA污染。所提DNA于-20℃保存备用。采用ITS通用引物对ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[由英潍捷基（上海）有限公司合成]进行PCR扩增（表3-1）。反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸30s，30cycles；最后72℃补充延伸10min。PCR产物用1.1%的琼脂糖电泳检测后，在凝胶成像仪上进行观察并拍照，之后送至英潍捷基（上海）有限公司进行测序。将所得序列与NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）核酸数据库进行同源性比对，使用MEGA5.05中邻位加入法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树。表3-1PCR扩增反应的试剂浓度及用量Table3-1AgentsandtheirconcentrationsforPCR试剂与浓度用量（μL）AgentsandtheirconcentrationsVolume10×PCRBuffer4MgCl2(25mmol/L)3.2dNTP(2.5mmol/L)4TaqDNAenzyme(5U/μL)0.4引物ITS1(10mmol/L)2引物ITS4(10mmol/L)2TemplateDNA1ddH2O23.4合计403.1.8数据处理使用Excel2010处理数据；使用MeV软件进行热图分析；使用MEGA5.05构建系统发育树。3.2结果与分析3.2.1采样地点环境调查[31;108]枇杷主要叶斑病发病时期见表3-2。枇杷一般抽生春（2~4月）、夏（4月中旬至6月中旬）、秋（8~10月）、冬（11~12月）四季梢，但冬梢常因气温的[30]高低变化而生长缓慢，翌春回温时继续延伸成为春梢，重庆地区一般不抽生冬梢，具体采样信息见表3-3。21 西南大学硕士学位论文重庆、四川、福建为枇杷主产区，2016年9份气温高且湿度大，是枇杷病害的发病高峰期，不同地区叶斑病病样对应的枇杷品种信息见表3-4，采样信息见表3-5。表3-2枇杷主要叶斑病发病时期Table3-2Occurrenceperiodofloquatleafspotdiseases(LLSD)病害名称发病时期NameOccurrenceperiod灰斑病一年四季均可发生，5月上旬至9月下旬为发病高峰期轮纹病高温多雨季节发病严重，夏梢新叶易发生此病炭疽病高温多雨季节发病严重，夏梢新叶易发生此病叶尖枯斑病4月上旬为病害始发期，6~7月中旬为发病高峰期圆斑病每年4月上旬为病害始发期，5月上旬至7月中旬、9月上旬至10月下旬为发病的两个高峰期表3-3重庆地区不同时期采样信息Table3-3SamplinginformationatdifferentgrowthstagesofloquatinChongqing春梢生长时期夏梢生长时期秋梢生长时期SpringshootsSummershootsAutumnshoots2月3月4月上旬4月下旬5月6月8月9月10月温度（℃）172225263234353232相对湿度（%）485458545860595743表3-4不同地区枇杷病样对应枇杷品种Table3-4LoquatvarietiesindifferentregionscorrespondingtodifferentLLSDs病害名称重庆地区四川地区福建地区NameChongqingSichuanFujian灰斑病华白1号、金华1号大五星沙锅甜和软枣枇杷轮纹病华白1号、金华1号大五星阡中2号、东湖早、软条白沙、上海白沙炭疽病华白1号、金华1号大五星阡中2号叶尖枯斑病华白1号、金华1号大五星三联2号圆斑病华白1号、金华1号大五星多倍体19号22 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律表3-5不同地区采样信息（2016年9月，秋梢生长时期）Table3-5Samplinginformationindifferentregions（September2016）温度（℃）相对湿度（%）采样地区采样地点北纬东经TemperatureRelativehumidityLocationSiteNorthernlatitudeEastlongitude(℃)(%)105实验基地西南大学枇杷种重庆市质资源圃29°49′36.60″106°25′29.14″3257北碚区歇马镇重庆市枇杷工程技术研究中心山泉镇美满村四川省成都陈建果园30°33′33.29″104°16′20.33″2854市龙泉驿柏合镇工农村邹兵果园福建省枇杷国家种质26°04′38.26″119°17′30.05″2966福州市资源圃3.2.2主要分离菌株鉴定从枇杷主要叶斑病中共分离到527个菌株，结合形态学观察和ITS序列分析鉴定出31个属。高频分离代表菌株（表3-5）的相关信息如下：表3-5高频分离代表菌株的编号、片段长度及基因登录号Table3-5Number,fragmentlengthandAccessionNo.ofrepresentativehigh-frequencyisolates真菌名菌株编号片段长度（bp）序列号NameNumberFragmentlength(bp)AccessionNo.ColletotrichumgloeosporioidesCQYB-1536KY790597AlternariaalternateCQYB-24575KY397985Phomasp.CQYB-6545KY790596Pestalotiopsissp.CQYB-9507--EpicoccumnigrumCQYB-8502KY303832FusariumsolaniCQYB-12573KY745778LeptosphaeriamicroscopicaLWB592KX357381BotrytiscinereaCQYB-10534MF170674CladosporiumsilenesCQYB-11501MF170675ColletotrichumacutatumCQYB-13575MF170676GuignardiamangiferaeCQYB-14644MF170677注：--表示未得到序列号。Note:--IndicatesthattheAccessionNo.hasnotbeenobtained.23 西南大学硕士学位论文（1）胶胞炭疽菌Colletotrichumgloeosporioidesa.菌落及孢子形态特征菌株CQYB-1在PDA培养基上菌落呈圆形生长，平铺，边缘整齐，基内菌丝及气生菌丝均较发达，菌丝灰白色。培养7d后，菌落中央涌出橘黄色黏孢子团（图3-1-c）。菌落背面呈灰黑色（图3-1-d）。菌丝有隔具分枝，分生孢子梗无色，分生孢子单孢，无色，椭圆形、圆柱形或棍棒状，两端钝圆，内含油滴（图3-1-e），大小为9.2~17.7μm×4.6~7.7μm（n=30）。初步将菌株CQYB-1鉴定为胶胞炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。图3-1菌株CQYB-1回接症状及形态特征a.对照叶片；b.回接症状；c.菌落正面；d.菌落反面；e.分生孢子（标尺=20μm）。Fig.3-1ThepathogenicityandmorphologyofstrainCQYB-1a.Control;b.injuredinoculationbyconidiophoressuspension;c.obversesideofCQYB-1colony;d.reversesideofCQYB-1colony;e.conidiaofCQYB-1(scale=20μm).b.rDNA-ITS序列分析按N-J法构建系统发育树，菌株CQYB-1与两株Colletotrichumgloeosporioides（KF053200及KF053200）聚在一支，自展率为94%（图3-2），结合供试菌株的形态学特征以及致病性测定结果，将该菌株鉴定为胶胞炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。24 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律图3-2基于rDNA-ITS序列构建的菌株CQYB-1系统发育树Fig.3-2PhylogenetictreeofstrainCQYB-1basedonthesequencesofrDNA-ITSregionc.致病性测定使用孢子悬浮液造伤接种健康枇杷叶片，3d后开始发病（图3-1-b），病斑呈褐色，逐渐扩展为圆形，后期病斑扩大相连为大块病斑，与田间发病情况基本一致。从病叶的典型病斑处再次分离病原菌，从中获得了与原接种菌株形态基本一致的病原菌，以无菌水为对照的叶片则没有发病（图3-1-a）。根据柯赫氏法则，证明菌株CQYB-1为枇杷叶斑病致病菌。（2）链格孢菌Alternariaalternatea.菌落及孢子形态特征菌株CQYB-24在PDA培养基上生长旺盛，菌落呈灰白色（图3-3-c），背面则为黑褐色（图3-3-d），边缘整齐，等径生长呈同心圆形，与PDA培养基结合疏松。气生菌丝发达，呈绒状，紧密交错。分生孢子梗单生，具分生孢子，呈链状（图3-3-f），褐色，表面光滑，具横膈膜1~5个，纵、斜隔膜0~3个，直或微弯，倒棒状，分隔处不缢缩或略缢缩，分生孢子大小为19.0~38.1μm×7.1~14.3μm（n=30），多数分生孢子具柱状假喙，少数具真喙，浅褐色（图3-3-e）。分生孢子[109]梗直立，具隔膜，淡褐色至褐色。参照《中国真菌志》第十六卷链格孢属进行菌种形态学鉴定，结果表明，其形态学特征与链格孢属（Alternaria）基本相符。25 西南大学硕士学位论文图3-3菌株CQYB-24回接症状及形态特征a.对照叶片；b.回接症状；c.菌落正面；d.菌落反面；e.分生孢子（标尺=20μm）；f.分生孢子链（标尺=20μm）。Fig.3-3ThepathogenicityandmorphologyofstrainCQYB-24a.Control;b.injuredinoculationbyconidiophoressuspension;c.obversesideofCQYB-24colony;d.reversesideofCQYB-24colony;f.conidiaofCQYB-24(scale=20μm);e.chainsofconidia(scale=20μm).b.rDNA-ITS序列分析以链格孢相似属Stemphyliumsp.为组外对照，按N-J法构建系统发育树，CQYB-24菌株与NCBI中同源性很高的四株A.alternata聚在了一支，而外群菌株Stemphyliumsp.则处在系统发育树的外围（图3-4）。结合供试菌株的形态学特征以及致病性测定结果，将该菌株鉴定为链格孢菌（Alternariaalternata）。图3-4基于rDNA-ITS序列构建的菌株CQYB-24系统发育树Fig.3-4PhylogenetictreeofstrainCQYB-24basedonthesequencesofrDNA-ITSregion26 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律c.致病性测定室内接种的健康枇杷叶片3d后开始发病（图3-3-a），病斑呈棕褐色，与田间病症相似，随着发病时间增长，病斑也显示出逐渐增大的趋势，10d后，病斑基本蔓延至整片叶片。对接种发病的枇杷叶片进行再次分离，获得了与接种菌株形态上一致的培养物，以无菌水接种的叶片未见任何病症（图3-3-b），完成了柯赫氏法则验证，证明此菌为枇杷叶斑病的病原菌。（3）茎点霉菌Phomasp.a.菌落及孢子形态特征菌株CQYB-6在PDA培养基上生长旺盛，菌落初为棕色，后逐渐变为黑褐色（图3-5-c），菌丝絮状生长，菌落背面黑色（图3-5-d）。分生孢子椭圆形或卵圆形，单孢，无色，大小为4.6~7.7μm×2.3~4.6μm（n=30），内含1~2个油球（图3-5-e）。初步将其鉴定为茎点霉菌Phomasp.。图3-5菌株CQYB-6回接症状及形态特征a.对照叶片；b.回接症状；c.菌落正面；d.菌落反面；e.分生孢子（标尺=20μm）。Fig.3-5ThepathogenicityandmorphologyofstrainCQYB-6a.Control;b.injuredinoculationbyconidiophoressuspension;c.obversesideofCQYB-6colony;d.reversesideofCQYB-6colony;e.conidiaofCQYB-6(scale=20μm).b.rDNA-ITS序列分析测序菌株CQYB-6与茎点霉属真菌聚在一支，而其近似属Phyllosticta、Cercospora、Sphaeropsis、Coniothyrium位于其他分支（图3-6），目前Genbank数据库中并未收录Phomaeriobatryae的序列信息，该菌尚不能根据分子生物学特征鉴定到种。结合供试菌株的形态学特征以及致病性测定结果，将该菌株鉴定为Phomasp.。27 西南大学硕士学位论文图3-6基于rDNA-ITS序列构建的菌株CQYB-6系统发育树Fig.3-6PhylogenetictreeofstrainCQYB-6basedonthesequencesofrDNA-ITSregionc.致病性测定枇杷叶片接种孢子悬浮液后，4d后发病（图3-5-b），病斑棕褐色，局部出现坏死症状。接种无菌水叶片未发病（图3-5-a）。对发病叶片进行组织分离，获得了与菌株CQYB-6形态上一致的培养物，根据柯赫氏法则可知，Phomasp.是枇杷叶斑病病原菌。（4）拟盘多毛孢菌Pestalotiopsissp.a.菌落及孢子形态特征菌株CQYB-9在PDA培养基上呈同心纹状生长，菌落棉白色，气生菌丝发达，呈絮状或绒毛状，边缘整齐（图3-7-c）。培养7d后，菌落上会出现黑色粒点，即为分生孢子盘。菌落背面呈草黄色（图3-7-d）。菌丝无色、无隔，分生孢子纺锤形，直或微弯，大小为18.5~26.2μm×6.2~7.7μm（n=30），由5个细胞组成，上两个细胞棕褐色至黑褐色，顶胞透明，其上着生2~3根纤毛，下有1根脚毛。具4个隔膜，隔膜处黑色素沉积明显（图3-7-e）。初步将其鉴定为Pestalotiopsissp.。28 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律图3-7菌株CQYB-9回接症状及形态特征a.对照叶片；b.回接症状；c.菌落正面；d.菌落反面；e.分生孢子（标尺=20μm）。Fig.3-7ThepathogenicityandmorphologyofstrainCQYB-9a.Control;b.injuredinoculationbyconidiophoressuspension;c.obversesideofCQYB-9colony;d.reversesideofCQYB-9colony;e.conidiaofCQYB-9(scale=20μm).b.rDNA-ITS序列分析菌株CQYB-9与拟盘多毛孢属真菌聚在一支，其他近似属位于另一分支（图3-8），目前Genbank数据库中并未收录Pestalotiopsiseriobatryae的序列信息，该菌尚不能根据分子生物学特征鉴定到种。结合供试菌株的形态学特征以及致病性测定结果，将该菌株鉴定为Pestalotiopsissp.。29 西南大学硕士学位论文图3-8基于rDNA-ITS序列构建的菌株CQYB-9系统发育树Fig.3-8PhylogenetictreeofstrainCQYB-9basedonthesequencesofrDNA-ITSregionc.致病性测定将菌株CQYB-9的孢悬浮液接种到健康叶片上，3d后发病（图3-7-b），病斑圆形或不规则形，对照叶片无病症（图3-7-a）。再从接种发病的叶片上重新分离病原菌，得到了与原接菌种形态一致的培养物，根据柯赫氏法则，确定该菌为枇杷叶斑病致病菌。（5）黑附球菌Epicoccumnigruma.菌落及孢子形态特征该菌株在PDA培养基上为分泌红橙色可扩散色素的絮状菌落（图3-9-c），背面同为橙红色（图3-9-d）。菌落表面呈砖格状或小瘤，气生菌丝发达，生长后期菌落表面出现红黑色小液滴，即为分生孢子团。分生孢子黑色，从分生孢子梗顶端膨大处生出，呈梨形或亚球形（图3-9-e），大小23.8~28.6μm×9.5~14.3μm（n=30），初步鉴定为黑附球菌Epicoccumnigrum。30 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律图3-9菌株CQYB-8回接症状及形态特征a.对照叶片；b.回接症状；c.菌落正面；d.菌落反面；e.分生孢子（标尺=20μm）。Fig.3-9ThepathogenicityandmorphologyofstrainCQYB-8a.Control;b.injuredinoculationbyconidiophoressuspension;c.obversesideofCQYB-8colony;d.reversesideofCQYB-8colony;e.conidiaofCQYB-8(scale=20μm).b.rDNA-ITS序列分析菌株CQYB-8与Epicoccumnigrum聚在一支，自展率为99%（图3-10），结合该菌株的形态学特征及ITS序列鉴定结果，将该菌株鉴定为黑附球菌Epicoccumnigrum。图3-10基于rDNA-ITS序列构建的菌株CQYB-8系统发育树Fig.3-10PhylogenetictreeofstrainCQYB-8basedonthesequencesofrDNA-ITSregion31 西南大学硕士学位论文c.致病性测定接种Epicoccumnigrum孢悬液后，枇杷叶片于7d后开始出现病症（图3-9-b），造伤处呈深棕色，向外扩展为近圆形病斑，发病部位叶片褪绿呈黄棕色，局部病斑出现坏死。从发病处再次分离病原菌，获得了与原接种形态基本一致的菌株，以无菌水为对照的叶片没有发病（图3-9-a），完成了柯赫氏法则验证，证明该菌为枇杷叶斑病的致病菌。（6）腐皮镰刀菌Fusariumsolania.菌落及孢子形态特征菌株CQYB-12在PDA培养基上菌丝茂盛，棉絮状，黄白色，后期分泌红色色素，使培养基变为暗红色图（3-11-c），菌落背面呈红色（图3-11-d）。分生孢子镰刀状，具3~4个隔，具有尖的、锥形的或弯曲的顶端细胞以及发育良好的足细胞（3-11-e），大小2.67~6.25μm×10.19~47.33μm（n=30），与菌株F.cf.solani[110](USMFSSC-K600T)形态相似，初步将其鉴定为F.solani。图3-11菌株CQYB-12形态特征及回接症状a.对照叶片；b.回接症状；c.菌落正面；d.菌落反面；e.分生孢子（标尺=20μm）。Fig.3-11ThepathogenicityandmorphologyofstrainCQYB-12a.Control;b.injuredinoculationbyconidiophoressuspension;c.obversesideofCQYB-12colony;d.reversesideofCQYB-12colony;e.conidiaofCQYB-12(scale=20μm).b.rDNA-ITS序列分析菌株CQYB-12与F.solani（FJ886799、KM458800、KR364604）聚在了一起（图3-12）。结合菌株CQYB-12的形态学特征及ITS序列鉴定结果，将该菌株鉴定为F.solani。32 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律图3-12基于rDNA-ITS序列构建的菌株CQYB-12系统发育树Fig.3-12PhylogenetictreeofstrainCQYB-12basedonthesequencesofrDNA-ITSregionc.致病性测定使用孢悬浮液接种枇杷叶片5d后，叶片上出现棕色坏死病斑（图3-11-b），无菌水对照组则未出现病症（图3-11-a），将病健交界处的叶片进行组织分离，得到了与菌株CQYB-12形态一致的分离物，完成了柯赫氏法则验证，说明该菌为枇杷叶斑病致病菌。（7）小球腔菌Leptosphaeriamicroscopicaa.菌落及孢子形态特征菌株LWB在PDA培养基上菌丝呈灰白色，菌落生长后期颜色变为深灰色，略具同心轮纹，呈黑灰色，边缘乳白色（图3-13-d）。该菌在OA培养基上产孢，子囊孢子梭形，两端稍弯曲，黄棕色，具有3~4个横向隔膜，内含多个油滴，大小为28.8~40.0µm×0.3~0.5µm(n=30)（图3-13-g）。分生孢子于分生孢子梗顶端长出，单孢，透明，大小为4.2~9.2µm×1.9~4.2µm(n=30)（图3-13-f）。菌株[111]LWB的形态学特征与引起甘蔗叶斑病的病原菌Leptosphaeriasp.相似，初步将其鉴定为Leptosphaeriasp.。33 西南大学硕士学位论文图3-13菌株LWB形态特征及回接症状a.对照叶片；b.回接7d症状；c.回接15d症状；d.菌落正面；e.菌落反面；f.分生孢子（标尺=10μm）；g.子囊孢子（标尺=20μm）。Fig.3-13ThepathogenicityandmorphologyofstrainLWBa.Control;b.injuredinoculationbyconidiophoressuspensionin7days;c.injuredinoculationin15days;d.obversesideofLWBcolony;e.reversesideofLWBcolony;f.conidiaofLWB(scale=10μm);g.ascosporesofLWB(scale=20μm).b.rDNA-ITS序列分析按照N-J法构建系统发育树，菌株LWB与L.microscopica（FN386274、AF455486、U04234）聚在一起，自展率为100%（图3-14）。结合上述形态学及ITS序列分析结果，将菌株LWB鉴定为L.microscopica。图3-14基于rDNA-ITS序列构建的菌株LWB系统发育树Fig.3-14PhylogenetictreeofstrainLWBbasedonthesequencesofrDNA-ITSregionc.致病性测定34 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律使用无菌注射器将L.microscopica的孢子悬浮液接种于健康枇杷叶片，7d后叶片上出现圆形棕色病斑（图3-13-b），15d后病斑发展成为棕色轮纹状病斑（图3-13-c），20d后整张叶片发病，注射无菌水的对照组叶片则未发病（图3-13-a）。从接种发病的叶片上重新进行组织分离，获得了与与原接菌种形态一致的分离物，完成了柯赫氏法则验证，证明菌株LWB（L.microscopica）为疑似枇杷轮纹病致病菌。（8）葡萄孢菌Botrytiscinereaa.菌落及孢子形态特征菌株CQYB-10在PDA培养基上菌丝呈灰色，菌落生长后期逐渐变为深灰色，菌丝生长旺盛（图3-15-c），生长后期在菌落背面可见黑棕色球状体，即为菌核（图3-15-d）。分生孢子椭圆形或卵圆形，单孢，无色，大小为6.2~15.4µm×6.0~10.8µm(n=30)（图3-15-e、3-15-f），初步将其鉴定为Botrytiscinerea。图3-15菌株CQYB-10形态特征及回接症状a.对照叶片；b.回接症状；c.菌落正面；d.菌落反面；e.分生孢子（标尺=50μm）；f.分生孢子（标尺=20μm）。Fig.3-15ThepathogenicityandmorphologyofstrainCQYB-10a.Control;b.injuredinoculationbyconidiophoressuspension;c.obversesideofCQYB-10colony;d.reversesideofCQYB-10colony;e.conidiaofCQYB-10(scale=50μm);f.conidiaofCQYB-10(scale=20μm).b.rDNA-ITS序列分析按照N-J法构建系统发育树，菌株CQYB-10与Botrytiscinerea（KJ937046及KR909190）聚在一起，自展率为63%（图3-16）。结合上述形态学及ITS序列分析结果，将菌株CQYB-10鉴定为Botrytiscinerea。35 西南大学硕士学位论文图3-16基于rDNA-ITS序列构建的菌株CQYB-10系统发育树Fig.3-16PhylogenetictreeofstrainCQYB-10basedonthesequencesofrDNA-ITSregionc.致病性测定接种Botrytiscinerea孢悬液后，枇杷叶片于5d后开始出现病症（图3-15-b），病斑呈深棕色，向外扩展为近圆形或不规则形病斑。从发病处再次分离病原菌，获得了与原接种形态基本一致的菌株，以无菌水为对照的叶片没有发病（图3-15-a），完成了柯赫氏法则验证，证明该菌为枇杷叶斑病的致病菌。（9）枝孢属Cladosporiumsilenesa.菌落及孢子形态特征该菌株在PDA培养基上呈圆形生长，边缘整齐，中央菌丝灰色，边缘菌丝深褐色（图3-17-c），菌丝有隔具有分支，背面呈棕黑色（图3-17-d）。分生孢子无色，呈圆形、卵圆形或纺锤形，部分孢子内含一个隔或油滴（图3-17-e、3-17-f），大小3.1~10.0μm×3.1~4.6μm（n=30），初步鉴定为枝孢属Cladosporiumsilenes。36 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律图3-17菌株CQYB-11回接症状及形态特征a.对照叶片；b.回接症状；c.菌落正面；d.菌落反面；e.分生孢子（标尺=50μm）；f.分生孢子（标尺=20μm）。Fig.3-17ThepathogenicityandmorphologyofstrainCQYB-11a.Control;b.injuredinoculationbyconidiophoressuspension;c.obversesideofCQYB-11colony;d.reversesideofCQYB-11colony;e.conidiaofCQYB-11(scale=50μm);f.conidiaofCQYB-11(scale=20μm).b.rDNA-ITS序列分析菌株CQYB-11与C.silenes聚在一支，自展率为65%（图3-118），结合该菌株的形态学特征及ITS序列鉴定结果，将该菌株鉴定为Cladosporiumsilenes。图3-18基于rDNA-ITS序列构建的菌株CQYB-11系统发育树Fig.3-18PhylogenetictreeofstrainCQYB-11basedonthesequencesofrDNA-ITSregionc.致病性测定接种C.silenes孢悬液后，枇杷叶片于5d后开始出现病症（图3-17-b），病斑不规则，呈黑棕色，局部出现坏死。从发病处再次分离病原菌，获得了与原接种形态基本一致的菌株，以无菌水为对照的叶片没有发病（图3-17-a），完成了柯37 西南大学硕士学位论文赫氏法则验证，证明该菌为枇杷叶斑病的致病菌。（10）尖孢炭疽菌Colletotrichumacutatuma.菌落及孢子形态特征菌株CQYB-13在PDA培养基上菌落呈圆形生长，平铺，边缘整齐，菌丝灰白色，呈棉絮状。培养7d后，菌落中涌出橘红色黏孢子团（图3-19-c）。菌落背面呈橘红色（图3-19-d）。菌丝有隔具分枝，分生孢子梗无色，分生孢子单孢，无色，纺锤形，有些孢子含有一个隔（图3-1-e），大小9.4~18.8μm×3.1~6.3μm（n=30），初步鉴定为尖孢炭疽菌Colletotrichumacutatum。图3-19菌株CQYB-13回接症状及形态特征a.对照叶片；b.回接症状；c.菌落正面；d.菌落反面；e.分生孢子（标尺=50μm）。Fig.3-19ThepathogenicityandmorphologyofstrainCQYB-13a.Control;b.injuredinoculationbyconidiophoressuspension;c.obversesideofCQYB-13colony;d.reversesideofCQYB-13colony;e.conidiaofCQYB-13(scale=50μm).b.rDNA-ITS序列分析菌株CQYB-13与C.acutatum（AB443950）聚在一支，自展率为99%（图3-18），结合该菌株的形态学特征及ITS序列鉴定结果，将该菌株鉴定为尖孢炭疽菌Colletotrichumacutatum。38 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律图3-20基于rDNA-ITS序列构建的菌株CQYB-13系统发育树Fig.3-20PhylogenetictreeofstrainCQYB-13basedonthesequencesofrDNA-ITSregionc.致病性测定接种C.acutatums孢悬液后，枇杷叶片于4d后开始出现病症（图3-17-b），病斑呈棕褐色，向外扩展为近圆形病斑，局部病斑出现坏死。从发病处再次分离病原菌，获得了与原接种形态基本一致的菌株，以无菌水为对照的叶片没有发病（图3-17-a），完成了柯赫氏法则验证，证明该菌为枇杷叶斑病的致病菌。（11）芒果球座菌Guignardiamangiferaea.菌落及孢子形态特征该菌株在PDA培养基上菌落平滑，边缘呈锯齿状，边缘刚长出的菌落呈乳白色，菌落中央逐渐凹陷，后期菌落表面会出现灰白色，气生菌丝不发达（图3-21-c），生长速度较慢，背面成黑色（图3-21-d）。子囊孢子无色，呈圆形或梨形，内含油滴（图3-21-e、3-21-f），大小为7.7~15.4μm×7.7~13.9μm（n=30），初步鉴定为Guignardiamangiferae。39 西南大学硕士学位论文图3-21菌株CQYB-14回接症状及形态特征a.对照叶片；b.回接症状；c.菌落正面；d.菌落反面；e.子囊孢子（标尺=50μm）；f.子囊孢子（标尺=20μm）。Fig.3-21ThepathogenicityandmorphologyofstrainCQYB-14a.Control;b.injuredinoculationbyascosporessuspension;c.obversesideofCQYB-14colony;d.reversesideofCQYB-14colony;e.ascosporeofCQYB-14(scale=50μm);f.ascosporeofCQYB-14(scale=20μm).b.rDNA-ITS序列分析菌株CQYB-14与G.mangiferae聚在一支（图3-22），结合该菌株的形态学特征及ITS序列鉴定结果，将该菌株鉴定为Guignardiamangiferae。图3-22基于rDNA-ITS序列构建的菌株CQYB-13系统发育树Fig.3-22PhylogenetictreeofstrainCQYB-13basedonthesequencesofrDNA-ITSregionc.致病性测定接种G.mangiferae孢悬液后，枇杷叶片于7d后开始出现病症（图3-22-b），病斑呈黑褐色，局部病斑出现坏死。从发病处再次分离病原菌，获得了与原接种40 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律形态基本一致的菌株，以无菌水为对照的叶片没有发病（图3-22-a），完成了柯赫氏法则验证，证明菌株CQYB-14为枇杷叶斑病的致病菌。3.2.3重庆地区枇杷主要叶斑病病原菌周年演替规律从重庆地区5种枇杷叶斑病病样中共分离得到365个菌株，分属于子囊菌门Ascomycota（98.08%）和担子菌门Basidiomycota（1.92%），隶属于23个属，其中分离频率最高的为炭疽病属Colletotrichum（24.66%），其次为链格孢属Alternaria（20.00%）、茎点霉属Phoma（13.70%）、拟盘多毛孢属Pestalotiopsis（11.23%）、黑附球菌Epicoccumnigrum（5.21%）、镰刀菌属Fusarium（5.21%），其他属如枝孢属Cladosporium、拟茎点霉属Phomopsis、小球腔菌属Leptosphaeria等的分离频率较低（<5%）。高频分离菌株在不同病害种类上的年周期变化规律如图3-15。图3-23重庆地区枇杷主要叶斑病高频分离菌株年周期变化HB、LW、TJ、YJK、YB分别代表疑似枇杷灰斑病、轮纹病、炭疽病、叶尖枯斑病、圆斑病病样，下同。HB春梢代表疑似枇杷灰斑病春梢病样。Fig.3-23Annualshiftsofhigh-frequencyisolatesofmainLLSDsinChongqingHB,LW,TJ,YJK,YB,representsuspectedloquatgrayleafspotdisease,ringspotdisease,anthracnose,tipspotdisease,roundspotdisease,respectively.HBspringshootsrepresentsloquatleaveswithgrayleafspotcollectedinspring.春梢病样分离获得95个菌株，分属于14个属，分离频率最高的为Phoma（23.16%）；夏梢病样分离获得136个菌株，分属于14个属，分离频率最高的为Alternaria（26.47%）；秋梢病样分离获得134个菌株，分属于16个属，分离频率最高的为Colletotrichum（41.79%）。三组样品中相同的菌属有9种（图3-16），分别为Phoma、Epicoccum、Alternaria、Colletotrichum、Pestalotiopsis、Pleosporales、41 西南大学硕士学位论文Leptosphaeria、Guignardia、Diaporthe，分离频率之和分别为82.11%、84.56%、88.06%。春梢病样中独有的菌属有Botrytis、皮司霉属Pithomyces、白囊耙齿菌Irpexlacteus，夏梢病样中为Mycoleptodiscus、Acremonium，秋梢病样中包括Botryosphaeria、UnculturedCeratobasidium、Clonostachys、Chaetomium、Magnaporthe、Neofusicoccum。可见，不同生长时期优势致病菌种类不同，秋梢病样中的真菌多样性明显多于春梢和夏梢，三个时期共有菌属的分离频率很高，占据绝对优势。图3-24重庆地区不同时期枇杷主要叶斑病分离真菌多样性分析Fig.3-24AnalysisoffungaldiversityofmainLLSDsatdifferentgrowthstagesinChongqing近年来重庆市枇杷叶斑病日趋严重，病原菌种类组成复杂，通常同一生长时期多种病害会同时发生，且出现多种致病菌混合致病的现象。通过对重庆地区不同病害病原菌进行分离与鉴定（图3-17），结果显示：从疑似枇杷灰斑病病样上共分离得60个菌株，Colletotrichum分离频率最高为40.00%，其次为Alternaria（20.00%）、Phoma（10.00%），Pestalotiopsis及Epicoccumnigrum均为6.67%，Fusarium及Phyllosticta均为5.00%，其他菌如Ceriporialacerata、Botrytiscinerea[31;32;35;108]的分离频率较低（<5%）。前人报道的灰斑病致病菌为Pestalotiopsis，分离频率仅为6.67%。由分离频率结果可推测，重庆地区枇杷灰斑病可能不是单一致病菌Pestalotiopsis引起，可能由可能由上述优势菌群（分离频率>5%）混合侵染导致。从疑似枇杷轮纹病病样上共分离得74个菌株，其中分离频率最高的为Alternaria（17.57%），Pestalotiopsis与Phoma的分离频率均为16.22%，Colletotrichum为13.51%、Phomopsis为6.67%、Cladosporium为5.41%，室内离体致病性测定结果显示，上述病原菌的离体致病性测定结果均与轮纹病病症不符。42 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律[31;108;112]之前报道的枇杷轮纹病致病菌为枇杷壳二孢菌Ascochytaeriobotryae，但在本试验中并未分离到该菌。但是本试验中分离得到的另一致病菌Leptosphaeriamicroscopica，虽然分离频率不高（仅为6.76%），但在其离体与活体致病性测定中，发病叶片均表现出与田间轮纹病相似的病症。由此推测，重庆地区枇杷轮纹病的致病菌可能为Leptosphaeriamicroscopica。从疑似枇杷炭疽病病样上共分离得78个菌株，其中分离频率最高的为Alternaria（19.23%），其次为Phoma（17.95%）、Pestalotiopsis（15.38%），Colletotrichum（14.10%），Epicoccumnigrum、Fusarium、Cladosporium均为6.41%，Phomopsis及Pleosporales为5.41%，其他菌如Phyllosticta、Leptosphaeria、Ceriporialacerata分离频率较低（<5%）。前人报道中，枇杷炭疽病的致病菌为[31;108]Colletotrichum，由分离频率结果可推测，重庆地区枇杷炭疽病可能不是单一致病菌Colletotrichum引起，可能由上述优势菌群（分离频率>5%）混合侵染导致。从疑似枇杷叶尖焦枯病病样上共分离得92个菌株，其中分离频率最高的为Alternaria（23.91%），其次为Colletotrichum（21.74%），Phoma（16.30%）、Pestalotiopsis（8.70%）、Epicoccumnigrum（7.61%），其他属如Cladosporium、Phomopsis分离频率较低（<5%）。前人报道中，枇杷叶尖枯斑病的致病菌为[31;108]Phoma，由分离频率结果可推测，重庆地区枇杷叶尖枯斑病可能不是单一致病菌Phoma引起，可能由上述优势菌群（分离频率>5%）混合侵染导致。从疑似枇杷圆斑病病样上共分离得61个菌株，其中分离频率最高的为Colletotrichum（40.98%），其次为Alternaria（18.03%）、Pestalotiopsis（8.20%）、Fusarium（6.56%），其他属如Phoma、Cladosporium分离频率较低（<5%）。前人[31;108]报道枇杷圆斑病的致病菌为枇杷叶点霉菌Phyllostictaeriobatryae，但本试验中并未从枇杷圆斑病病样中分离到该菌。由分离频率结果可推测，重庆地区枇杷圆斑病可能由上述优势菌群（分离频率>5%）混合侵染导致。43 西南大学硕士学位论文图3-25重庆地区枇杷主要叶斑病病原菌分布热图Fig.3-25HeatmapofpathogensisolatedfrommainLLSDsinChongqing3.2.4不同地区枇杷主要叶斑病病原菌分布规律重庆、四川、福建三个地区在枇杷秋梢生长时期的病样分离结果中，共分离得到242个菌株，主要分属于子囊菌门Ascomycota（97.94%）和担子菌门Basidiomycota（1.65%），还有0.41%的unculturedfungus，隶属于16个属，其中优势属为Colletotrichum（53.11%）、Pestalotiopsis（12.81%）、Fusarium（10.74%）、Phoma（7.44%）、Alternaria（5.79%），其他属分离频率较低（<5%）。不同地区、不同枇杷叶斑病高频菌株具体分布情况见图3-18。图3-26不同地区枇杷主要叶斑病高频分离菌株对比CQ、SC、FJ分别代表重庆、四川、福建，下同。CQHB代表重庆地区疑似枇杷灰斑病病样。Fig.3-26Comparisonofhigh-frequencyisolatesofmainLLSDsindifferentregionsCQ,SC,FJ,representChongqing,Sichuan,FujianProvince,respectively.CQHBrepresentsloquatleaveswithgreyleafspotcollectedinChongqing.44 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律重庆地区分离得到80个菌株，隶属于10个属；四川地区得到76个菌株，隶属于9个属；福建地区得到86个菌株，隶属于9个属。重庆、四川、福建共有5个相同的属（图3-19），分别为：Colletotrichum、Pestalotiopsis、Fusarium、Phoma及Diaporthe，菌属的分离频率之和分别为：80.00%、90.79%、93.02%。其中分离频率最高的均为Colletotrichum，分离频率分别为48.75%、60.53%、51.16%，其次为Pestalotiopsis、Fusarium、Phoma、Diaporthe。重庆地区特有的属有Pleosporales、UnculturedCeratobasidium、Neofusicoccum，四川地区有烟管菌属Bjerkandera、Botrytiscinerea、Unculturedfungus，福建地区有二孢属Lasiodiplodia、Gibellulopsis、Cylindrobasidium。由此说明不同地区枇杷病样分离菌株的种类组成虽是不同的，但是共有菌属的分离频率很高，占据绝对优势。值得注意的是，在本次采样期间，各地区枇杷灰斑病发病不严重，可以采集的病样很少，从三个地区采集的灰斑病病样上均未分离到Pestalotiopsis，分离频率最高的均为Colletotrichum，分离频率分别为80.00%、73.68%、61.90%。重庆地区疑似枇杷轮纹病病样中分离频率最高的是Colletotrichum及Alternaria，均为23.08%，四川及福建地区分离频率最高的均为Colletotrichum，分离频率分别为50.00%、34.78%。重庆地区疑似炭疽病病样中Pestalotiopsis的分离频率最高，为33.33%，四川及福建地区分离频率最高的均为Colletotrichum，分离频率分别为60.00%、50.00%。重庆、四川、福建地区疑似枇杷叶尖枯斑病病样中分离频率最高的均为Colletotrichum，分离频率分别为44.44%、64.71%、70.59%；疑似枇杷叶尖枯斑病病样中分离频率最高的也为Colletotrichum，分离频率分别为60.00%、50.00%、36.36%。说明Colletotrichum在枇杷秋梢生长时期的发病过程中扮演重要角色。45 西南大学硕士学位论文图3-27不同地区枇杷主要叶斑病分离真菌多样性分析Fig.3-27AnalysisoffungaldiversityofmainLLSDsindifferentregions3.3讨论枇杷病原种类多，引起的病害种类也较多，我国是枇杷的起源地，记载的枇[113]杷真菌病害有42种。本研究中从枇杷主产区重庆、四川、福建等地的主要叶斑病（灰斑病、轮纹病、炭疽病、叶尖枯斑病及圆斑病）病样中共分离获得527个菌株，结合形态学观察和ITS序列分析共鉴定出31个属。其中，Leptosphaeriamicroscopica（KX357381）、Epicoccumnigrum（KY303832）、Fusariumsolani（KY745778）为国内首次报道的枇杷病原菌，Alternariaalternate（KY397985）为重庆首次报道，由此可见枇杷病害病原种类在不断增加。迄今，对于枇杷病害病原的研究中，未见混合致病的相关研究报道，但在本试验的结果中，从一种病害病斑上往往分离到多种致病菌，可能存在多种致病菌[114]混合致病的现象。W.Chen等通过对英国胡桃木茎溃疡病病样中分离频率最高的Fusariumsolani（74.5%）进行柯赫氏法则验证，证明了Fusariumsolani导致[114]该病的致病菌，在本研究推测的混合致病模型中，将分离频率大于5%的菌株[31;32;35;108]定义为高频分离菌株。枇杷灰斑病的致病菌为Pestalotiopsis，本研究中从疑似灰斑病病样中分离得到的菌株中，Colletotrichum、Alternaria、Phoma的分离频率均高于Pestalotiopsis，其他高频分离菌株包括Epicoccumnigrum、Fusarium及Phyllosticta，推测以上优势致病菌混合作用引起枇杷灰斑病。Phoma可引起枇[31;108]杷叶尖枯斑病，本研究从疑似叶尖枯斑病病样中分离的菌株中，Phoma的分离频率次于Alternaria及Colletotrichum，其他高频分离菌株包括Pestalotiopsis及Epicoccumnigrum，推测以上优势致病菌混合作用导致枇杷叶尖枯斑病。枇杷[31;108]圆斑病的致病菌为枇杷叶点霉菌Phyllostictaeriobotryae，作者在重庆地区所46 第3章枇杷主要叶斑病病原菌种类及其演替规律有枇杷叶片病样中共分离得到8株Phyllosticta真菌，但无一株来自于疑似圆斑病病样，据本试验结果，Colletotrichum、Alternaria、Pestalotiopsis、Fusarium为圆斑病病样高频分离菌株，可能混合感染引起枇杷圆斑病。高频分离菌株在侵染过程中是否有先后顺序，抑或是同时感染并无定论，需做进一步研究。[31;108;112]陈福如、张斌、任明国认为枇杷轮纹病致病菌为Ascochytaeriobotryae，但作者在重庆地区的枇杷轮纹病病样中并未分离到该菌，本研究通过病原菌的分离培养、致病性测定及ITS序列分析，将重庆地区枇杷轮纹病的致病菌鉴定为[115][31]Leptosphaeriamicroscopica。郑少泉及陈福如等报道枇杷花腐病的病原菌为[116]BotrytiscinereaPers.，肖宇等通过对重庆市九龙坡区枇杷花腐病发生及发展的整个动态过程进行研究后认为该病的致病菌为拟盘多毛孢菌Pestalotiaeriobofolia[117]Desm，灰葡萄孢菌是在发病后期腐生上去的。瞿付娟等通过调查研究，认为重庆发生的枇杷花腐病分为干腐型和湿腐型，致病菌分别为Pestalotiopsis[31]eriobotrifolia（Guba）ChenetCao和BotrytiscinereaPers.。陈福如曾报道福建[118]省枇杷果实心腐病的病原菌为奇异根串珠霉Thielaviopsisparadoxa，而林雄杰等通过分离培养病原菌并进行ITS测序，将该病致病菌鉴定为Colletotrichumacutatum，由此说明之前部分枇杷病害病原菌的鉴定可能存在一定的误差。Alternaria是极为常见的一类分生孢子真菌，分布广泛，在全世界已描述的近500个链格孢种级分类单位中，95%以上可兼性寄生在植物上，引起多种植物病[109]害，给农业生产造成重大损失。此外，Alternaria对多变的基质和环境条件具有很强的适应能力，可以迅速抢占其他病原物造成的植物枯死病斑。作者在分离疑似枇杷灰斑病、炭疽病、轮纹病的过程中均分离到了Alternaria，说明了其强大的侵染能力。而且Alternaria易侵染植物的衰弱、衰老组织或受伤部位，加剧植物组织死亡。A.alternara是其中常见的致病种，有多种植物致病型，每种致病型可分泌不同的寄主选择性毒素（host-selectivetoxins，HST），如链格孢梨致病型[119][120]可产生AK毒素、链格孢苹果致病型可产生AM毒素等，这些毒素不仅会引发植物病害，而且还会对人体及动物的健康造成一定的危害，还具有致癌、致[121]畸、致突变等作用。今后可将Alternaria真菌作为枇杷病害重点防治对象之一。掌握枇杷主要叶斑病病原菌周年演替规律，是开展枇杷田间病害防治的重要依据。然而，至今未曾有关于枇杷叶斑病病原菌周年演替规律的研究报道。作者经调查，基本掌握了重庆地区枇杷主要叶斑病病原菌在田间的周年演替规律：春梢、夏梢、秋梢生长时期，枇杷病叶病原菌种类组成类似，但优势致病菌不同，分别为Phoma（23.16%）、Alternaria（26.47%）、Colletotrichum（41.79%），这对合理防控枇杷叶斑病有一定的指导作用。在秋梢生长时期（枇杷病害高发时期），重庆、四川、福建地区枇杷叶斑病主47 西南大学硕士学位论文要病原菌均为Colletotrichum，重庆地区的次要病原菌为Pestalotiopsis及Alternaria，四川地区为Phoma，福建地区为Pestalotiopsis及Fusarium。不同地区病原菌的分离频率虽有所不同，但是种类组成相似。由此说明枇杷叶斑病病原菌的区域性分布差异不明显。[122]枇杷叶斑病的有效防治主要依赖于抗病品种的选育。目前，福建地区已鉴定出4份对枇杷叶斑病高抗的种质资源，分别为卓南1号、塘头3号、木罗枇杷[123]和栎叶枇杷；贵阳地区的高抗种质有96-3-1、贵蜜、金杯、硬枝、密枝和洛阳[124]青等；重庆地区筛选出的高抗型资源有11份：PLL、A348、D36、B352、B355、A313、I315、新白一号84、A330、常绿4号及常绿5号。这些种质资源可用于枇杷抗病育种中。同时，在新的抗病品种繁育过程中，跟踪优势病原菌的变化有利于科学管理病害。对于局部出现的新病害，需要进一步监测及防治，以防扩散，引起不必要的损失。48 第4章枇杷主要叶斑病真菌菌群多样性研究第4章枇杷主要叶斑病真菌菌群多样性研究在第3章中作者对重庆地区枇杷年生长周期内以及不同地区枇杷主要叶斑病病原菌进行了分离鉴定，发现一种病斑上可分离得到多种真菌（致病菌），说明了枇杷病叶中生活着丰富的真菌类群，这些真菌相互作用造成枇杷病害的发生。但是多数真菌存在不可培养的缺点，为全面分析枇杷病样的真菌群落组成及多样性，作者以第3章中枇杷病样为材料，对其真菌多样性进行了Miseq高通量测序分析。4.1材料与方法4.1.1主要仪器及设备见3.1.1。4.1.2主要药品及试剂无水乙醇、异丙醇、β-巯基乙醇、E.Z.N.A.○R土壤微生物总DNA提取试剂盒等。4.1.3病样采集采样地点信息见3.1.3.1。每个样品采集10片以上病叶用于Miseq高通量测序，将采集好的叶片分别装于干净的自封袋中，并做好标记，放置于冰盒（最好用干冰）中运送回实验室后，立即剪下病斑，储存于-80℃超低温冰箱中备用。4.1.4病样微生物总DNA提取枇杷病样微生物总DNA提取按照E.Z.N.A○R土壤微生物总DNA提取试剂盒说明书进行，稍作改进，具体如下：（1）准确称量0.5g枇杷病叶样品，使用CoyoteG200高通量组织研磨仪研磨菌丝至粉末。（2）加入1mLSLX-Mlus缓冲液，在涡旋机上充分涡旋3~5min以溶解细胞。（3）加入100μLDS缓冲液，涡旋，充分混匀。（4）将离心管放在70℃水浴锅中孵育10min，水浴过程中颠倒离心管数次以充分混合样品。室温下，13000×g离心3min。（5）取800μL上清液，转移至一个新的2mL离心管中。（6）加入270μLP2缓冲液，涡旋，充分混匀。冰上孵育5min。（7）4℃下，13000×g离心5min。随后小心地将上清液转移至一个新的2mL49 西南大学硕士学位论文离心管中。（8）向离心管中加入上一步上清液0.7倍体积的异丙醇。上下颠倒离心管30min以充分混匀。4℃下，13000×g离心10min。（9）使用微量移液器小心地吸出上清液，注意不要损坏DNA。倒置离心管于干净的吸水纸上，放置1min以排出管中液体。（10）使用微量移液器加入200μL裂解液，涡旋10s。之后在70℃水浴锅中水浴20min，使DNA充分溶解。（12）加入100μLHTR试剂，充分涡旋后，室温放置2min。之后将上清液转移至新的2mL离心管中。（13）加入与上述上清液等量的XP1缓冲液，充分混匀后转入HiBind○RDNA过滤柱中，室温下，10000×g离心1min。（14）倒掉滤液后，重复步骤（13）。（15）将HiBind○RDNA过滤柱插入新的2mL收集管中，加入700μLSPW洗涤缓冲液，室温下，10000×g离心1min。（16）倒掉滤液后，重复步骤（15）。（17）室温下，将空的HiBind○RDNA过滤柱在13000×g下离心2min，以除去残存的无水乙醇，之后将其转入新的1.5mL离心管中。（18）将70℃预热好的洗脱缓冲液直接加入过滤柱，室温下放置5min后，在13000×g下离心1min。（19）倒掉滤液后，重复步骤（18）。（20）丢掉HiBind○RDNA过滤柱，将纯化后的DNA保存于-20℃冰箱中。4.1.5病样真菌群落多样性分析将枇杷病样微生物总DNA样品送至上海美吉生物医药科技有限公司，使用通用的ITS引物对ITS1/ITS2进行PCR扩增，随后进行rDNA-ITS序列高通量测序。4.1.6数据处理Miseq高通量测序得到的是双端（pair-end）序列数据，首先根据PEreads之间的overlap关系，将成对的reads拼接成一条序列，同时对reads的质量和拼接的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，即得到优化数据。之后，使用Unite真菌数据库进行序列比对。使用Usearch、Mothur、Qiime、Circos-0.67-7软件进行生物信息学分析，利用R语言工具进行统计与作图，使用Excel对数据进行进一步的统计与分析。50 第4章枇杷主要叶斑病真菌菌群多样性研究4.2结果与分析4.2.1Miseq高通量测序结果统计学分析对重庆地区春梢、夏梢、秋梢生长时期18个枇杷病样进行Miseq高通量测序后，总共获得865802条有效ITS序列，为了减少数据量以及由于测序错误导致物种的多样性被高估，我们在97%的相似水平下对所有序列进行操作分类单元OTU（OperationalTaxonomicUnits）划分，共得到861个OTU。为保持后续结果的一致性，按最小样本序列数进行抽平，得到559742条高质量的序列和837个OTU，平均每个样品31097条序列，具体测序信息表见表4-1。对重庆、四川、福建三个地区18个枇杷病样进行Miseq高通量测序后，总共获得676532条有效ITS序列和686个OTU。按最小样本序列数进行抽平后得到559692条高质量的序列和683个OTU，平均每个样品31094条序列，具体测序信息表见表4-2。后续的分析均采用抽平后的高质量序列。表4-1重庆地区枇杷样品Miseq高通量测序结果及菌群多样性指数Table4-1ResultsofMiseqsequencingandfungaldiversityindicesofsamplesfromChongqing群落丰富度指数群落多样性指数样品序列数1SobsCoverageRichnessEstimatorDiversityIndexSampleNo.ofReadsChaoACEShannonSimpsonCKSpring394931110.999743139115.148743.3278270.060321HBSpring339272130.998296272.913264.038352.8519550.127171LWSpring395141870.998778210.4333213.733881.7075530.422742TJSpring37877310.99990432.532.8232141.213180.479607YJKSpring392441210.999100152.5147.267331.5906940.408168YBSpring405552160.998842234240.551092.3754450.221416CKSummer42745900.998907125.0625176.07631.525630.318628HBSummer392722110.998649231.0233242.049892.1627790.262468LWSummer377581490.998167221.5455283.32672.4153560.157573TJSummer330471590.998135256.2353302.220022.1304970.283536YJKSummer310971150.998810162.5714207.780642.2289340.186859YBSummer370421810.998167242.3846294.816322.1793870.254604CKAutumn810001930.997845252.7568326.195472.5299180.129422HBAutumn525581680.998489209.5769219.593652.1352040.251955LWAutumn613001490.998360196.2222261.572432.1026770.19453251 西南大学硕士学位论文TJAutumn819711300.998296236242.94891.599330.317289YJKAutumn75637980.998907144.75203.427021.9846990.263431YBAutumn617652860.998360333.2222323.383953.232170.094083注：CK代表枇杷对照叶片，HB、LW、TJ、YJK、YB分别代表疑似枇杷灰斑病、轮纹病、炭疽病、叶尖枯斑病、圆斑病病样，下同。Spring、Summer、Autumn分别代表重庆春梢、夏梢、秋梢生长时期。HBSpring代表重庆春梢上的疑似灰斑病病样。1.表征实际观测到的OTU数目。Note:CKrepresentscontrolleaves;HB,LW,TJ,YJK,YB,representsuspectedloquatgrayleafspotdisease,ringspotdisease,anthracnose,tipspotdisease,roundspotdisease,respectively.HBspringshootsrepresentsloquatleaveswithgrayleafspotcollectedinspring.1.SobsrepresentsobservedOTUs.表4-2不同地区枇杷样品Miseq高通量测序结果及菌群多样性指数Table4-2ResultsofMiseqsequencingandfungaldiversityindicesofsamplesfromdifferentregions群落丰富度指数群落多样性指数样品序列数SobsCoverageRichnessEstimatorDiversityIndexSampleNo.ofReadsChaoACEShannonSimpsonCQCK392281880.998006240.5278264.97062.5417750.128134CQHB330161520.998939176179.66842.1387190.251321CQLW405511470.998392198.0417283.792.1337230.192292CQTJ427431290.998521180.75185.22621.6591770.306777CQYJK31094950.998971150.1111191.10642.0431480.252497CQYB370432730.998681304.5385299.76443.2294460.093875SCCK335091620.998456224.6667218.83081.8894390.30672SCHB420231820.998488229235.19933.1569380.072486SCLW340181790.998167255279.28291.8315140.377801SCTJ364421210.998714169.75193.86121.0903380.638185SCYJK429671860.998135304.0714255.77952.0818660.275802SCYB392792130.998424258.2308258.79322.979560.121789FJCK339541250.998681168.1579211.37752.0807120.246374FJHB394471140.999035162.3333174.46032.9802010.07837FJLW428911090.99881148.1765180.58931.7831390.305053FJTJ353181500.998681198.2353185.60831.7527160.327292FJYJK37879770.999164117.625139.87390.9648380.644458FJYB351301490.998971165172.24062.3200240.149414注：CQ、SC、FJ分别代表重庆、四川、福建地区，下同。CQHB代表重庆地区疑似灰斑病病样。Note:CQ,SC,FJrepresentChongqing,Sichuan,FujianProvince,respectively.CQHBrepresentsloquatleaveswithgreyleafspotcollectedinChongqing.52 第4章枇杷主要叶斑病真菌菌群多样性研究4.2.2枇杷主要叶斑病病样真菌多样性分析Coverage指数可用来分析每个样品的测序覆盖率，数据显示各组的测序覆盖率均达到99%以上（表4-1、4-2），表明本研究中的测序量能够反映样品中真菌群落的种类和结构。指数ACE和Chao以数据的形式体现各病样菌群丰富度，由表4-1可知，灰斑病病样随春梢、夏梢、秋梢生长物种丰富度在不断增加，但是圆斑病病样却与此相反，轮纹病、炭疽病、叶尖枯斑病则是先升高后降低。指数Shannon和Simpson可以反映微生物群落多样性，由表4-1可知，对照样品、圆斑病中微生物多样性随春梢、夏梢、秋梢变化先降低后升高，轮纹病、炭疽病、叶尖枯斑病病样则相反，灰斑病样微生物多样性则不断降低。由此可知，微生物群落丰富度及多样性并不能决定枇杷叶斑病的发病与否。为评估枇杷病样菌群的多样性及测序深度，从每个样品中分别随机选择一定数量的样本，以横坐标代表序列深度，纵坐标代表多样性值，分别使用Sobs、Shannon和Simpson多样性指数绘制稀释曲线（Rarefactioncurve），重庆地区枇杷春梢、夏梢、秋梢病样稀释曲线见图4-1，重庆、四川、福建三个地区枇杷秋梢病样稀释曲线见图4-2。由图可知，以上三个多样性指数中的样本稀释性曲线最终均趋于平缓，继续增加测序数据也可能只产生少量新的OTU，说明此时测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物多样性信息。图4-1重庆地区枇杷主要叶斑病病样稀释性曲线Fig.4-1RarefactioncurvesofmainLLSDsfromChongqing53 西南大学硕士学位论文图4-2不同地区枇杷主要叶斑病病样稀释性曲线Fig.4-2RarefactioncurvesofmainLLSDsfromdifferentregions4.2.3重庆地区枇杷叶斑病病样真菌菌群结构年周期变化通过对高通量测序样品的序列进行比对分析，我们研究了重庆地区春梢、夏梢、秋梢生长时期枇杷5种主要叶斑病病样的微生物群落结构。在门（Phylum）的水平上，枇杷病样真菌菌群序列主要分属于5个菌门（图4-3），其中绝大多数序列隶属于子囊菌门Ascomycota（78.33%）和担子菌门Basidiomycota（19.39%），这两个菌门序列约占序列总数97.72%，是枇杷病样中的绝对优势菌，剩余序列分别隶属于接合菌门Zygomycota（0.96%）和壶菌门Chytridiomycota（0.12%），另外还有1.2%未分类真菌（unclassifiedFungi）。由图4-3可知，三组枇杷病样的微生物群落组成相同，但相对丰度不同，Ascomycota在春梢、夏梢、秋梢枇杷病样中的相对丰度逐渐升高（76.16%、78.73%、80.09%），而Basidiomycota在秋梢中相对含量最低（20.16%、20.18%、17.83%）。54 第4章枇杷主要叶斑病真菌菌群多样性研究图4-3重庆地区不同时期枇杷主要叶斑病病样共线性关系图Fig.4-3Co-linearrelationshipofmainLLSDsfromChongqingatdifferentgrowthstages在属（Genus）的水平上，三组枇杷病样的微生物群落结构及其相对丰度如图4-4所示。三组样品中共获得260个属，其中有64个属尚未被注释出菌体菌属名（以g__k__、g__p__、g__c__、g__o__、g__f__表示，分别表示真菌只鉴定到具体的界、门、纲、目、科，而没有鉴定到具体的属），占总体的24.62%。相对丰度大于1%的菌属被定义为优势菌属，共有24个属，占总菌属相对丰度的88.38%。在枇杷不同生长时期菌群组成中，春梢病样共获得147个属，优势属13个；夏梢病样共获得162个属，优势属16个；秋梢病样共获得157个属，优势属16个，具体分布情况如下：55 西南大学硕士学位论文图4-4重庆地区不同时期枇杷主要叶斑病病样在属水平上的相对丰度Fig.4-4RelativeabundanceatgenericlevelofmainLLSDsfromChongqingatdifferentgrowthstages重庆地区枇杷春梢、夏梢、秋梢病样中的共享菌属有85个，其中8个属为优势属，分别占各自时期总测序量的53.67%、57.31%、78.9%，具体年周期变化情况如图4-5所示。由图可知，g__o__Pleosporales、Ascochyta、Neosetophoma、Pestalotiopsis、g__k__Fungi的相对丰度均呈现出先降低后升高的趋势，g__o__Pleosporales虽未被注释出具体属名，但它的含量在枇杷各个发育时期均较高，且为秋梢病样中丰度最高的属（24.94%）。Ascochyta及Pestalotiopsis属的真菌可分别导致枇杷轮纹病和灰斑病，存在于枇杷整个生长时期中且比例较高。目前未见Neosetophoma引起枇杷病害的报道，但作为重庆地区枇杷叶斑病病样中的优势菌属，它很可能成为枇杷病害的病原菌。与上述5个属相反的是，Cladosporium、Alternaria、Cryptococcus（隐球菌属）的相对含量变化为先升高后降低，Cladosporium的变化幅度及相对含量明显大于Alternaria和Cryptococcus，且为夏梢病样中相对丰度最高的属（26.21%）。56 第4章枇杷主要叶斑病真菌菌群多样性研究图4-5重庆地区不同时期共享优势菌属相对丰度变化图Fig.4-5RelativeabundanceofsharedpredominantgeneraofLLSDsfromChongqingatdifferentgrowthstages春、夏梢病样共享优势属仅有一个，为Strelitziana（1.84%vs1.44%），春、秋梢病样则共享Colletotrichum（2.18%vs1.27%），夏、秋梢的共有菌属较多，其中Setophoma及g__c__Tremellomycetes在夏梢病样中的相对含量（5.11%和4.07%）要高于秋梢（1.01%和2.63%），但是夏梢病样中的Sarocladium（1.3%）低于秋梢（2.08%）。春、夏、秋梢病样独有的优势菌属是不同的，春梢病样中为g__p__Ascomycota（19.34%）、g__c__Agaricomycetes（12.36%）及g__o__Tremellales（1.73%），目前均未被注释出具体属名。夏梢病样包括Articulospora（13.34%）、Boeremia（6.28%）、g__c__Dothideomycetes（2.13%）及Erythrobasidium（1.78%）。Pseudozyma（2.23%）、Ceratobasidium（1.72%）、Gibellulopsis（1.21%）、g__o__Hypocreales（1.09%）而则为秋梢病叶所有。同时，重庆春、夏、梢枇杷病样最优势真菌发生了变化，分别为g__p__Ascomycota、Cladosporium、g__o__Pleosporales。由此说明在不同生长阶段枇杷病样真菌群落结构变异较大。重庆地区枇杷不同生长时期5种主要叶斑病优势菌属高通量测序结果如图4-6所示。由图可知，春、夏、秋梢对照样品中的共享菌属有g__o__Pleosporales、Rhodotorula（红酵母属）、Cladosporium、Cryptococcus，这4个属在春梢对照中的相对丰度之和为41.51%，在夏梢中增加至86.03%，在秋梢中下降至54.85%，g__o__Pleosporales及Rhodotorula在春梢样品中相对丰度最高，而Cryptococcus57 西南大学硕士学位论文及Cladosporium则为夏、秋梢病样中的第一及第二优势菌属；同时，春梢对照叶片上各优势属分布均匀，夏、秋梢对照叶片中占绝对优势的菌属所占比例相当，说明这4个属可能对维持枇杷叶片健康具有重要作用。春梢对照样品中独有的优势菌属包括Uwebraunia、Paramycosphaerella、g__o__Tremellales、Ascochyta、Strelitziana、g__p__Ascomycota、g__f__Mycosphaerellaceae，而秋梢中则含有Pseudozyma、Erythrobasidium。春、秋梢对照样品菌群共享g__k__Fungi（5.76%vs2.03%）及Alternaria（1.78%vs3.88%），夏、秋梢对照样品共享g__f__Dothioraceae（8.02%vs6.29%）、g__c__Tremellomycetes（1.35%vs10.12%）及g__p__Basidiomycota（1.05%vs2.17%）。疑似枇杷灰斑病病样中，春、夏、秋梢样品优势属中均含有Neosetophoma、Cladosporium及g__o__Pleosporales，在春梢病样中三者的相对丰度之和为41.49%，在夏梢病样中增加到60.54%，但在秋梢病样中又降低到50.61%，且Neosetophoma为春、秋梢病样中比例最高的属（29.87%、43.58%），Cladosporium在夏梢中丰度最高（48.47%）。春、夏梢病样中均含有g__k__Fungi（5.61%vs1.43%）及Articulospora（2.08%vs3.22%），春、秋梢病样中共享Colletotrichum（10.54%vs2.40%）、Ascochyta（10.26%vs23.63%）及Leptospora（3.04%vs[31]2.03%），且Colletotrichum、Ascochyta可分别引起枇杷炭疽病和轮纹病，[61]Alternaria为夏、秋梢病样共有（7.43%vs2.02%），可引起枇杷链格孢叶斑病。春梢病样独有的优势属包括g__o__Tremellales、Pestalotiopsis、Strelitziana，夏梢病样为g__c__Tremellomycetes、Cryptococcus，秋梢病样为Ceratobasidium。[31]Pestalotiopsis属的真菌可引起枇杷灰斑病，但该属仅为春梢病样优势菌属，在夏、秋梢病样中的含量均很低（<1%）。疑似枇杷轮纹病病样中，春、夏、秋梢样品的共享菌属有g__o__Pleosporales、Pestalotiopsis、Setophoma及Ascochyta，这4个属占到各自生长时期总测序量的50%以上（在春梢病样菌群中的相对丰度为74.92%，在夏梢中为54.24%，在秋梢中为61.43%），说明它们可能是枇杷轮纹病的重要致病菌，并且目前已知Ascochyta[125]可导致枇杷轮纹病，Setophoma属真菌可引起南瓜根腐病，推测Setophoma可能成为枇杷轮纹病的潜在致病菌。春、夏梢病样中均包含Cryptococcus（2.45%vs3.28%），夏、秋梢病样中则含有Cladosporium（18.38%vs22.91%），且均为各自时期第二优势属。夏梢病样菌群独有的优势菌属较多，包括Sarocladium、Neosetophoma、Articulospora、g__c__Dothideomycete，春梢病样中有两种：Alternaria和Strelitziana，秋梢病样中仅有一种Ceratobasidium。疑似枇杷炭疽病病样中，春、夏、秋梢样品中无共享菌属。春梢病样中优势属只有2个，分别为g__p__Ascomycota（94.40%）及Geosmithia（4.58%），二者58 第4章枇杷主要叶斑病真菌菌群多样性研究占测序总量的98.98%。夏、秋梢病样中含有较多种类优势菌属，并且共同包含Setophoma、Cladosporium、g__k__Fungi及Ascochyta，但整体所占比例较低，分别为18.82%和16.85%。夏梢病样中Articulospora所占比例最高（55.19%），其次为Cryptococcus（8.61%）；秋梢病样中g__o__Pleosporales及Pestalotiopsis的相对丰度分别为46.07%和31.23%，在秋梢病样中占绝对优势。前人报道的枇杷炭疽病致病菌Colletotrichum并未在本试验中炭疽病病样中出现，推测g__p__Ascomycota、Articulospora、g__o__Pleosporales及Pestalotiopsis可能为枇杷炭疽病的病原。疑似枇杷叶尖枯斑病病样中，春、夏、秋梢样品均含有g__o__Pleosporales及Cryptococcus，这2个属的总比例随着枇杷生长发育时期不断增加，在春梢病样中为12.77%，在秋梢病样中为53.38%，并且g__o__Pleosporales分别为夏梢、秋梢病样的第二、第一优势属，说明它们可能在枇杷叶尖枯斑病的发病过程中起重要作用。Pestalotiopsis及g__o__Tremellales为春、秋梢病样所共有，且在春梢病样中的相对丰度均大于秋梢；夏、秋梢病样中的共有菌属包括Cladosporium、g__c__Tremellomycetes、Alternaria、g__c__Dothideomycetes，总比例在夏、秋梢病样中相当（26.34%vs24.20%）。夏梢病样中丰度最高的属为Boeremia（30.74%），[126][127][128]该属真菌可引起豌豆叶斑病、马铃薯坏疽病、秋葵叶斑病等，推测该属[31]可能为枇杷叶尖枯斑病的致病菌。枇杷叶尖枯斑病的致病菌为Phoma属真菌，但本研究中高通量测序并未得到Phoma或其有性型Didymella的测序信息。疑似枇杷圆斑病病样中，春、夏、秋梢样品中含有较多的共享菌属，包括Ascochyta、Cladosporium、Neosetophoma、g__o__Pleosporales及Cryptococcus，虽然这5个属的整体比例在枇杷生长发育时期呈下降趋势，但是他们的相对丰度仍在50%以上，并且Ascochyta及Cladosporium均占据春、夏、秋梢病样菌群丰度的前两位，推测以上菌属混合作用可导致枇杷圆斑病。Alternaria在夏梢病样中的相对丰度大于秋梢（7.95%vs2.21%）。Pestalotiopsis、g__o__Hypocreales及Sarocladium在秋梢病样中的比例均大于春梢（4.70%vs1.44%，4.01%vs1.39%，[31]8.32%vs1.31%）。枇杷圆斑病的病原菌为Phyllosticta属真菌，但本研究中高通量测序并未测得Phyllosticta或其有性型Guignardia的序列信息。59 西南大学硕士学位论文图4-6重庆地区枇杷主要叶斑病优势菌属组成年周期变化Fig.4-6AnnualshiftsofpredominantgeneraconstitutionofmainLLSDsfromChongqing60 第4章枇杷主要叶斑病真菌菌群多样性研究通过上述水平的分析，初步表明重庆地区枇杷在不同生长时期5种主要叶斑病病样的真菌群落结构是不同的。为了进一步分析各样品之间真菌群落结构的差别，我们在OTU分类水平上构建了unweighted-unifrac距离矩阵，基于这一矩阵进行了主坐标分析（PrincipalCo-ordinatesAnalysis，PCoA），从图4-7可知，该分析中前两个主成分分析分别解释了总变量的19.82%和12.88%，基于OTU的单个样品水平上，重庆地区枇杷春梢炭疽病病样与其他样品之间差异较大，这可能是由采样造成的误差，其余样品之间差异不明显，整体来说，重庆地区春、夏、秋梢生长时期枇杷主要叶斑病真菌多样性差异并不明显。图4-7重庆地区不同时期主要叶斑病真菌多样性主坐标分析Fig.4-7PCoAoffungaldiversityofmainLLSDsfromChongqingatdifferentgrowthstages4.2.4不同地区枇杷主要叶斑病病样真菌菌群结构分析经Miseq高通量分析可知，在门（Phylum）的水平上（图4-8），重庆、四川、福建三个地区的枇杷秋梢病样真菌菌群序列主要分属于4个菌门，其中绝大多数序列隶属于子囊菌门Ascomycota（89.34%）和担子菌门Basidiomycota（6.22%），这两个菌门序列约占序列总数95.56%，是枇杷病样中的绝对优势菌，剩余序列分别隶属于接合菌门Zygomycota（0.29%）和壶菌门Chytridiomycota（0.15%），另外还有4%未分类真菌（unclassifiedFungi）。由图4-8可知，三个地区枇杷病样的真菌群落组成相同，但相对丰度不同，Ascomycota在重庆、四川、福建的枇杷秋梢病样中相对丰度分别为88.29%、96.56%、83.16%，Basidiomycota为9.61%、0.02%、6.74%。61 西南大学硕士学位论文图4-8不同地区枇杷主要叶斑病病样共线性关系图Fig.4-8Co-linearrelationshipofmainLLSDsindifferentregions在属（Genus）的水平上，三组枇杷病样的微生物群落结构及其相对丰度如图4-9所示。三组样品中共获得223个属，其中有50个属尚未被注释出具体菌属名，占总体的22.42%。相对丰度大于1%的菌属被定义为优势菌属，共有27个优势属，占总菌属相对丰度的85.20%。在不同地区枇杷病样微生物菌群组成中，重庆地区共测得156个属，其中优势属16个；四川地区共测得135个属，其中优势属14个；福建地区共测得133属，其中优势属15个，具体分布情况如下：62 第4章枇杷主要叶斑病真菌菌群多样性研究图4-9不同地区枇杷秋梢病样在属水平上的相对丰度Fig.4-9RelativeabundanceatgenericlevelofmainLLSDsindifferentregionsinAutumn重庆、四川、福建三个地区枇杷秋梢病样中的共享菌属有75个，仅有4个属为优势属，占各自区域测序总量的31.31%、39.91%、40.38%，其具体变化情况如图4-10所示。由图可知，4个优势菌属在不同地区含量差异较大，Pestalotiopsis在四川、福建地区均为相对丰度均最高的优势菌，且四川地区要高于福建地区，但在重庆地区比例略低（15.23%）。Ascochyta在重庆地区比例最高（12.7%），Colletotrichum及g__k__Fungi在福建地区比例最高（2.9%和10.1%）。图4-10不同地区枇杷主要叶斑病共有优势菌属相对丰度变化图Fig.4-10RelativeabundanceofsharedpredominantgeneraofmainLLSDsindifferentregions63 西南大学硕士学位论文重庆地区相对丰度最高的为g__o__Pleosporales（25.13%），该属同为四川优势属，但比例略低（6.3%）。除此之外，这两个地区其他共有菌属在四川地区的含量均高于重庆地区，包括Cladosporium（14.91%vs10.88%）、g__o__Hypocreales（4.99%vs1.1%）及Setophoma（1.84%vs1.02%）。重庆、福建地区的共享菌属有Neosetophoma（9.36%vs1.47%）、Pseudozyma（2.24%vs1.08%）及Gibellulopsis（1.33%vs7.01%）。四川、福建地区的共享菌属有：Acremonium（9.12%vs9.89%）、g__p__Ascomycota（4.22%vs5.37%）、g__c__Dothideomycetes（1.22%vs1.42%）每个地区独有的优势菌属是不同的，在重庆地区为g__c__Tremellomycetes（2.63%）、Alternaria（2.19%）、Sarocladium（2.06%）、Ceratobasidium（1.74%）、Cryptococcus（1.29%）。四川地区包括Pseudocercospora（6.22%）、Arthothelium（1.29%）、g__f__Xylariaceae（1.09%）。而g__f__Glomerellaceae（19.39%）、Tulostoma（3.32%）、Chaetospermum（2.49%）、Articulospora（1.45%）、Leptospora（1.08%）则为福建地区所特有。重庆、四川、福建地区枇杷灰斑病病样中的共享菌属有4个，分别为Ascochyta、Leptospora、Sarocladium、g__o__Hypocreales，他们的菌群总量在各个地区的相对含量相似，在20%~30%之间。重庆地区相对丰度最高的属为Neosetophoma（43.62%），在福建地区较低（6.72%），该属为四川地区非优势属。Acremonium为四川、福建地区相对含量最高的属，比例分别为21.05%和19.34%，但重庆地区并未测得该属的序列信息。Cladosporium为四川地区第二优势属（15.84%），在重庆地区相对丰度较低（3.46%），而福建地区未见该属。g__c__Dothideomycetes、Heteroacanthella、Articulospora仅为福建地区优势属，Arthothelium、g__f__Xylariaceae仅为四川地区优势属，Ceratobasidium仅为重庆地区优势属。三个地区枇杷轮纹病病样中的共享菌属有3个，分别为Pestalotiopsis、Ascochyta及Acremonium，且Pestalotiopsis为三个地区最优势菌属，相对丰度分别为31.75%、60.26%、52.28%，说明Pestalotiopsis在秋梢枇杷轮纹病的发病过程中扮演重要角色。Cladosporium是重庆地区第二优势属（22.92%），在四川地区相对丰度为1.19%，但该属为福建地区非优势属。Colletotrichum、Chaetospermum、Articulospora及Pseudocercospora仅为福建地区优势属。三个地区枇杷炭疽病病样中的共享菌属有2个，分别为Pestalotiopsis及Ascochyta，且Pestalotiopsis为四川、福建地区相对丰度最高的属，占到两地区总序列的79.79%和53.56%，在重庆地区为第二优势属，比例略低（31.34%），Ascochyta在三个地区的相对含量很低，说明Pestalotiopsis可能加重枇杷炭疽病的发生程度。重庆地区相对丰度最高的属为g__o__Pleosporales（46.10%），该属菌64 第4章枇杷主要叶斑病真菌菌群多样性研究名虽尚未被注释，但由此可推测该属可能为重庆地区炭疽病致病菌。Tulostoma及Pseudozyma仅为福建地区优势属。三个地区病样中均未测得Colletotrichum的序列信息。三个地区枇杷叶尖枯斑病病样中的共享菌属有3个，分别为g__o__Pleosporales、Cryptococcus及g__o__Tremellales，他们在重庆地区的相对丰度之和最高，为54.98%，在福建地区最低，仅为4.10%。四川地区病样中相对丰度最高的为Cladosporium（48.64%），该属在重庆地区为4.72%，但未在福建地区发现。Alternaria也是重庆、四川地区共享菌属，但相对含量均低于Cladosporium，分别为4.37%和2.31%。福建地区7个优势属中，前5个均未鉴定到具体属名，且多为福建地区特有。三个地区枇杷圆斑病病样中的共享菌属有3个，分别为Ascochyta、Cladosporium及Pestalotiopsis，在重庆地区的相对丰度最高（45.97%），在其他两地较低且比例相当，这3个属的真菌均可引起枇杷病害。Pseudocercospora为四川地区所特有，且相对丰度最高（31.08%）。福建地区菌群含量最多的是g__k__Fungi（24.51%）及Gibellulopsis（22.83%），这2个属同样为重庆地区优势属，但相对丰度明显低于福建地区，分别为2.99%和5.58%。Acremonium及g__p__Ascomycota在福建地区的相对丰度均高于四川地区，未在重庆地区测得该属序列信息。图4-11不同地区枇杷主要叶斑病优势菌属对比Fig.4-11ComparisonofpredominantgeneraofmainLLSDsindifferentregions65 西南大学硕士学位论文通过上述水平的分析，初步表明重庆、四川、福建三个地区在枇杷秋梢生长时期主要叶斑病病样的真菌群落结构是不同的。为了进一步分析各样品之间真菌群落结构的差别，在OTU分类水平上构建了unweighted-unifrac距离矩阵，基于这一矩阵进行了主坐标分析（PCoA），从图4-可知，该分析中前两个主成分分析分别解释了总变量的17.09%和16.02%，基于OTU的单个样品水平上，重庆、四川地区枇杷病样真菌群落多样性差异不明显，但是与福建地区可明显区分开来，说明福建病样与川渝地区病样有明显差异，结合上述分析，可知主要差异是由g__f__Glomerellaceae、Chaetospermum、Cladosporium、g__o__Pleosporales四个属的相对丰度造成的，前二者为福建地区特有优势属，相对含量显著高于重庆、四川地区（P＜0.05）；后二者为重庆、四川地区共有的优势属，相对含量显著高于福建地区（P＜0.05）。图4-12不同地区枇杷主要叶斑病真菌多样性的主坐标分析Fig.4-12PCoAoffungaldiversityofmainLLSDsindifferentregions4.3讨论微生物传统分离鉴定法具有局限性，仅能针对可实现实验室培养的微生物种类。迄今，已完成上千种（Species水平）的微生物全基因组测序。但事实上99%的微生物，尤其是厌氧和在极端环境生存的菌种，仍然无法分离纯化而实现实验[129][130]室培养或尚未成功建立培养体系。高通量测序数据量大，不依赖于培养条件与技术，而以整个微生物群落遗传物质为研究对象，可以检测到那些难于培养的真菌种类，从而促使人们不断深入了解微生物和植物病害发生的关联性。[131]Keisha等对健康人不同皮肤部位的真菌DNA进行了高通量测序，最终生成了66 第4章枇杷主要叶斑病真菌菌群多样性研究超过五百万个DNA系统发育标记，代表八十多种真菌。而传统培养方法只能鉴定出18种真菌。本研究中共得到超过1073个OTU，代表了超过309个属的真菌，但是在常规分离中作者只鉴定出31个属。Miseq高通量测序采用定向测序技术，避免了非定向测序造成的数据冗余，能充分利用每条有效序列，且便于后期的菌群分类处理，同时该技术可以克服真菌大部分不可培养的技术难题，对枇杷叶斑病微生物进行比较全面的检测与分析。目前，Miseq高通量测序技术已经成功应[96][102][132][133]用于对土壤、水、空气及肠道中微生物群落的多样性分析，说明了此技术的可行性。迄今，未见对枇杷叶斑病微生物群落组成的研究报道，且本实验Miseq测序结果中有相当多的优势属尚未命名，说明有关枇杷叶斑病微生物在属水平上的研究还不够深入。在后续的研究中，还有待通过其他先进手段对其进行更加深入的分类研究，并结合枇杷生长的相关指标进行深度探索。本研究中，通过高通量测序所得的多样性指数和基于Sobs、Shannon、Simpson指数的稀释性曲线分析表明，此次测序的数据比较全面地覆盖了研究对象的微生物，可以真实反映其具体的组成情况。由表4-1可知，枇杷叶片发病与否并不能由微生物丰富度和多样性判断得知，灰斑病病样中的微生物多样性及丰富度随春梢、夏梢、秋梢生长均在不断增加，轮纹病、炭疽病、叶尖枯斑病的多样性及丰富度则是先升高后降低，圆斑病病样物种丰富度在不断增加，但是物种多样性则[134]是先降低后升高。微生物的多样性由物种丰富度和均匀度共同决定，微生物对外界环境非常敏感，环境的微小变动都会引起微生物多样性的变化，发生不同病害的枇杷叶片中的微生物群落结构会发生变化，从而导致物种均匀度改变，进而影响微生物多样性与物种丰富度的关系，导致多样性指数发生变化。枇杷病害发生过程复杂，微生物感染只是其中的一个诱因，整个微生物群落结构和组成的变[135]化也很重要。Beta多样性可衡量各样本之间的差异，本研究中PCoA结果显示，整体来说重庆地区不同时期枇杷主要叶斑病真菌多样性差异不明显。不同地区枇杷秋梢病样PCoA结果显示，重庆、四川地区的样品之间不能明显区分，但福建地区却分属在不同的区域，这种差异可能与三个地区的气候及枇杷种植条件有关，福建有800多年的枇杷栽培历史，四川、重庆则为新兴的枇杷主产区，且福建地区年降雨量高于川渝地区，枇杷病害的种类及发生频率不同，导致福建地区与川渝地区优势菌群差异较大。Miseq高通量结果显示，枇杷病样真菌群落主要隶属于子囊菌门Ascomycota和担子菌门Basidiomycota，且Ascomycota占据绝对优势，这两个菌门在其他环[136][9][137][138]境微生物种也为优势菌门。据报道，子囊菌多引起叶斑、根腐、茎腐、[139][140][141][142]果(穗)腐和枝枯等症状，担子菌可引起作物的黑穗病和锈病等。67 西南大学硕士学位论文[143]本研究利用了Byrd等在2016年提出的改良柯赫氏法则，该法则对高通量测序技术和常规分离培养进行了全新的结合，具体内容为：首先通过高通量测序对微生物群落的所有成员进行分类后，其次使用计算模型来评估对于疾病诱导所必需的微生物，随后靶向培养以从患病宿主中分离目标微生物。本研究中，由于时间限制问题，常规分离和高通量测序是同时进行的，结果显示，Miseq高通量测序可以在相对丰度为1%的水平上测得常规分离得到的Colletotrichum、Alternaria、Pestalotiopsis、Cladosporium、Pleosporales、Ceratobasidium、Acremonium、Gibellulopsis等8个属的序列信息，而传统培养中分离频率较高的菌属如Phoma、Fusarium、Epicoccum、Diaporthe、Phyllosticta等在高通量测序中的相对丰度均小于0.1%，几乎是不存在的，这可能时因为目前研究者对枇杷病害病原的多样性研究较少，相关病原菌的序列信息并没有上传至NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）或者Unite真菌数据库中，所以很多菌属没有被注释；同时，在这些数据库中，尽管现有的ITS序列数量巨大，但还是有至少20%的ITS序列没有凭证菌种或标本注释，甚至有些序列来源于错误的物种鉴[144]定，所以对于目前高通量测序中的unclassified菌属，无法确定其具体的分类地位。我们在后续的研究中希望通过准确的鉴定而确定枇杷寄主上的真菌，继而不断完善相应的真菌数据库。[135]窦妍等通过Miseq高通量测序技术分析了健康与3个患脓包病虾夷扇贝样品的微生物群落组成及差异，发现扇贝养殖过程中的病害法发生可能是由多种微生物群落相互作用、菌群失调所致，而不是由单一病原菌浓度过高引起，本研究中有类似的发现，高通量测序结果显示，重庆地区健康与患病枇杷叶片中有55个共享菌属，包括Colletotrichum、Ascochyta、Alternaria、Pestalotiopsis、Cladosporium、Cryptococcus、Rhodotorula等多种优势菌属，但是他们的相对丰度差异很大。对照叶片中真菌群落分布均匀，且Cladosporium、Alternaria、Cryptococcus及Rhodotorula的总相对丰度较高（28%~85%）。Alternaria与[145]Cladosporium为枇杷内生真菌，具有一定的抑菌效果。在第3章中，作者通过对常规分离得到的一些Alternaria属的真菌进行致病性测定，发现有些菌株是可[146]以致病的，但是Montemurro等从已分离出来的多种链格孢菌此生代谢产物中，[147]除真菌毒素外，也不乏有杀虫、杀菌和杀原生生物活性者。鲁海菊等从枇杷健康组织和患病组织中分离得到144株内生真菌，他们从中选取了97株内生真菌以筛选可以拮抗石榴干腐病病原菌的菌株，通过对峙培养发现PGSC9等9株Alternaria、YPZG3等3株Cladosporium的抑菌率在70%以上，DPZT15等6株Alternaria、PGSC4’等2株Cladosporium的抑菌率为60%~50%，PGSC9等7株Alternaria、、DPLY9（Cladosporium）的抑菌率为50%~60%，DPXY2等2株68 第4章枇杷主要叶斑病真菌菌群多样性研究[148]Alternaria、DPXY3等2株Cladosporium的抑菌率在50%以下。冯成亮等从无花果一株内生真菌链格孢属FL25（Alternariasp.FL25）的次生代谢产物中首次分[149]离得到4个化合物，对大部分测试菌均具有明显的抑制活性。赵春安等从华凤仙中分离到的内生真菌Cladosporiumsp.对杨树炭疽菌（C.gloeosporioides）、立枯丝核菌（R.solani）、香石竹疫病（P.nicotianaevar.parasitica）及腐皮镰刀菌（F.solani）[150]等有良好的抑菌效果。Cryptococcus属中的真菌具有拮抗活性，如隐球酵母Cryptococcussp.可用来防治葡萄、番茄上的灰霉病（Botrytisspp.），罗伦隐球酵母[151]C.laurentii可抑制柑橘酸腐病菌（Geotrichumcitri-aurantii）的生长，对柑橘酸腐病具有良好的防治潜力，浅白隐球酵母（C.albidus）对苹果和梨果实上感染的灰霉病（Botrytiscinerea）及青霉病（Penicilliumexpansum）有很好的控制效果[152]。这些拮抗菌的抑制机理可能为与病原微生物竞争营养与空间、诱导寄主产生抗性或者分泌抗菌物质有关。红酵母Rhodotorulaglutinis可有效防治苹果青霉病[153]（PeniciliumexpansumLink）及甜樱桃果实采后病害，黏质红酵母Rhodotorula[154]mucilaginosa为辣椒内生真菌，可以降低辣椒及番茄的腐烂率。由此推断，Cladosporium、Alternaria、Cryptococcus及Rhodotorula相对含量高有利于保持枇杷叶片健康。虽然在枇杷主要叶斑病病样中也出现了Cladosporium、Alternaria及Cryptococcus，但它们的总比例通常明显低于健康叶片，但是已经确定致病性的Colletotrichum、Ascochyta、Pestalotiopsis在病叶中总的相对含量要明显高于健康叶片，并且在患病枇杷叶片的优势属中均没有Rhodotorula，推测Rhodotorula对枇杷病害病原菌具有重要的拮抗作用。枇杷叶部真菌病害的有效防治主要依赖于抗病品种的选育，在尚无优良抗叶斑病品种的情况下，化学防治仍是目前病害有效防控的主要途径，而使用化学药剂早已被证实会对动植物及人类产生巨大的危害，此时，可开发生防微生物作为化学药剂的有效替代品，在防治植物病害的同时，可减少环境污染及农残超标等化学防治带来的诸多问题，可探索本研究中的Cladosporium、Alternaria、Cryptococcus及Rhodotorula，作为生防菌使用。本研究中存在一定的不足，实验中仅着重于对枇杷病叶真菌群落组成和变化的研究，未将具体的环境因子纳入其中。在后续的研究中，应更加注意实验的严谨性和科学性，将环境因子和微生物因素结合起来分析枇杷病害发生的原因和控制方法；深入研究微生物群落组成及其结构变化对枇杷病害的影响，探索预防和早期检测枇杷病害的方法，使枇杷产业能够稳定健康地发展。69 西南大学硕士学位论文70 第5章结论及创新点第5章结论及创新点5.1结论本研究以5种枇杷主要叶斑病——灰斑病、轮纹病、炭疽病、叶尖枯斑病和圆斑病——为研究对象，结合传统分离鉴定方法（包括菌落特征及孢子形态观察、rDNA-ITS序列分析和致病性测定）及Miseq高通量测序技术，对各叶斑病病原菌进行鉴定，同时分析不同病害病样的真菌群落组成及多样性，以期为枇杷叶斑病的有效防治提供参考，主要结论如下：1.重庆地区枇杷主要叶斑病并非由一种致病菌引起，而是由多种病原菌混合导致。推测灰斑病的致病菌可能为：Colletotrichum（40.00%）、Alternaria（20.00%）、Phoma（10.00%）、Pestalotiopsis（6.67%）；轮纹病的致病菌可能为：Leptosphaeriamicroscopica（6.67%），该菌为国内首次报道；炭疽病的致病菌可能为Alternaria（19.23%）、Phoma（17.95%）、Pestalotiopsis（15.38%）、Colletotrichum（14.10%）；叶尖枯斑病的致病菌可能为：Alternaria（23.91%）、Colletotrichum（21.74%）、Phoma（16.30%）；圆斑病的致病菌可能为：Colletotrichum（40.98%）、Alternaria（18.03%）。同时发现，同一病害不同时期的病原菌组成及分离频率不同。2.重庆地区不同时期（春、夏、秋梢生长时期）枇杷叶斑病病样共分离得到365个菌株，隶属于23个属，其中高频分离（分离频率＞5%）菌属有6个。春、夏、秋梢病样有9个共享菌属，分离频率之和分别为：82.11%、84.56%、88.06%，但三组样品分离频率最高的菌属不同，分别为Phoma（23.16%）、Alternaria（26.47%）、Colletotrichum（41.79%），说明重庆地区不同时期枇杷病样的病原菌组成相似，但是分离频率差异较大。3.不同地区（重庆、四川、福建）枇杷秋梢生长时期主要叶斑病病样经传统分离鉴定，共获得242个菌株，隶属于16个属，其中高频分离菌属有5个。不同地区病原菌的分离频率虽有所不同，但是种类组成相似，尤其是优势菌属组成，分离频率最高的均为Colletotrichum，比例分别为48.75%、60.53%、51.16%。说明不同地区枇杷叶斑病病原菌种类组成及多样性差异不明显。4.重庆地区不同时期枇杷主要叶斑病样本高通量测序中，共获得260个属，其中24个为优势属（相对丰度＞1%），占总菌属相对丰度的88.38%。不同时期病样菌群组成不同，三个时期共享菌属有85个，其中8个为优势共享属。同一病害在不同时期菌群组成及其相对丰度不同，与传统分离结果基本一致。5.不同地区秋梢生长时期5种主要叶斑病样本高通量测序中，共获得223个属，其中有27个优势属，占总测序量的85.20%。不同地区枇杷主要叶斑病菌群组71 西南大学硕士学位论文成不同，三个地区共享菌属有75个，其中4个为优势共享属。福建地区枇杷病害样本与重庆、四川地区差异较大，优势菌属的组成及丰度差异明显。综上所述，枇杷叶斑病的发生并不是由单一致病菌引起，而存在混合致病现象。传统分离鉴定结果与Miseq高通量测序结果均显示，同种病害在同一地区不同时期及不同地区同一时期的菌群组成及相对含量存在差异，且Miseq测序技术能够测得更为详细、全面的菌群信息。通过结合传统分离鉴定方法和Miseq高通量测序技术，可及时预测并诊断植物真菌病害，为病害的有效防治提供保障。5.2创新点（1）本研究首次将Miseq高通量测序技术应用于枇杷真菌病害研究中，将测序分析结果和传统病原鉴定结果相互印证，首次分析了枇杷叶片上的真菌菌群多样性，为更进一步研究枇杷真菌病害打下了基础，在技术上具有创新性。（2）本研究首次对多个枇杷主产区的叶斑病进行调查研究，比较不同地区枇杷病害病斑真菌群落组成与多样性，在材料上具有创新性。5.3后续研究计划（1）对分离得到的病原菌进行致病力排序，以确定重点防治对象。（2）分离得到的病原菌进行活体的混合致病性测定，以完善本研究得出的各种叶斑病的混合致病模式。（3）在本研究的基础上，后续将对枇杷枝干、花、果实、根等部位进行真菌病害鉴定，以建立枇杷真菌病害数据库。72 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致谢致谢西大七年，一晃而过。回首往事，百感交集，充满感恩，在此，谨向所有帮助和鼓励我的老师、同学和朋友们，表示衷心的感谢！首先诚挚地感谢我的导师——梁国鲁研究员。师从恩师，是我的荣幸，更是我的骄傲！梁老师知识渊博、思维敏捷、治学态度严谨、心胸宽广、多才多艺，感谢您为我树立了一个终身学习的榜样，感谢您将我引领到果树资源与遗传育种的知识殿堂，感谢您为我指点迷津，感谢您在科研工作及生活中给予我的无私帮助，在此，谨向您致以最衷心的感谢！再次，要特别感谢吴頔博士，感谢你在科研工作中对我的巨大帮助，感谢你在生活上给予我无微不至的关怀。从论文选题到实验设计，从结果分析到论文撰写，在你的悉心指导下，我的硕士学习和科研课题才能顺利完成，再次向吴頔师姐表示我真挚的感谢！感谢实验室李晓林老师、向素琼老师、郭启高老师、孙海艳老师、何桥老师对我的关心和鼓励；感谢党江波师兄、陈薇薇师姐、张红楠师妹、宋琴师妹、刘松月师妹、袁婷师妹及同级好友杨星、李华、张抗萍在实验过程中对我的支持、帮助和鼓励；感谢实验室其他师兄师姐、师弟师妹对我的关心和照顾；感谢我的室友李妍汶、李慧、李佼阳这三年来的陪伴、包容与帮助，是你们，使我的研究生生活更加多姿多彩！感谢最爱我的父母，感谢你们给予我宝贵的生命，感谢你们对我的支持和尊重，感谢你们多年来无怨无悔的付出，我爱你们！最后，要感谢我自己，感谢自己的坚持，感谢自己的努力，感谢自己的不完美，感谢自己用心体验着人生！张丹华2017年5月84
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