禽致病性大肠杆菌ompT缺失株特性及其对雏鸡小肠炎症相关基因表达的影响

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羞激采肯大学ＡｎｈｕｉＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙ硕士学位论文禽致病性大肠杆菌ｏｍｐＴ缺失株特性及其对雏鸡小肠炎症相关基因表达的影响ＴｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｏｍｐＴｄｅｌｅｔｉｏｎｓｔｒａｉｎｉｎＡｖｉａｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｈｉｃｋｅｎｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｒｅｌａｔｅｄｅｎｅｓｇ姓名王琦学号１５７２０２５４导师祁克宗教授专业基础兽医学研究方向动物疫病病理与生物防治学院动物科技学院二〇—八年六月 中图分类号：Ｓ８５２．２１单位代码：１０３６４ＵＤＣ：６３６．３密级：安徽农业大学硕士学位论文禽致病性大肠杆菌０／７７；＾缺失株特性及其对雏鸡小肠炎症相关基因表达的影响ＴｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｏｍｐＴｄｅｌｅｔｉｏｎｓｔｒａｉｎｉｎＡｖｉａｎａｔｈｏｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｇｏｆｃｈｉｃｋｅｎｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｒｅｌａｔｅｄｅｎｅｓｇ１５７２０２５４：干琦姓名学号：：祁克宗教授学科门类：农学导师专业名称：基础兽医学研究方向：动物疫病病理与生物防治学院：：动物科技学院答辩委员会主席、韩先干薛挺．．论文评阅人：二〇—八年六月 ADissertationSubmittedtoAnhuiAgriculturalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheMasterofAgricultureThecharacteristicsofompTdeletionstraininAvianpathogenicEscherichiacolianditseffectontheexpressionofchickensmallintestinalinflammationrelatedgenesbyWangQiSupervisedbyProf.QiKezongMajoredinBasicVeterinaryMedicineJune2018AcademyofAnimalScienceandTechnologyHefei,Anhui,P.R.China I 致谢时光过的如此之快，我在安徽农业大学研究生三年的求学生涯即将就结束了。这三年时光中有欢乐和欣喜，也有忧伤和泪水，在离别之际，心中却有万分不舍。这三年中，我收获了许多，也长大了许多，非常感谢在这三年中陪伴着我的你们。首先我要诚挚的感谢我的导师祁老师在这几年中对我的谆谆教诲，不单单是学习、科研中的指导，还包括对我生活上的关心，更重要的是对我人生道路上的指引和教导，让我学会许多为人处事及待人接物的道理，使我一身受益。祁老师对工作认真负责的态度和对科研的严谨态度是我学习的最好榜样。在这里我向我的导师祁克宗教授致以我最崇高的敬意和最衷心地感谢！诚挚地感谢本实验室的涂健老师、宋祥军老师、刘红梅老师等各位老师对我的试验、学习等方面给予的热情帮助和耐心指点，敦促着我完成试验，使我知道本身的不足，并不断得完善自己。在此还要对基础兽医学科点的周杰老师、李琳老师、王菊花老师、阮祥春老师等各位老师表示衷心地感谢。感谢兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室的师兄师姐尹磊、张煜、吕小龙、王惠珂、李少参、石水琴、李春晓、刘江以及徐柳柳、李汀、薛媚、蒋雯、袁林，感谢朱丽君、朱雪婷、王慧敏、刘瑞、束玲玲、邱明宇、申辉、来晓东、邓志文、侯曼曼等师弟师妹们对我试验和生活上的帮助。感谢室友洪仁芸、郁晓梅、丁娜娜、黎秀梅，因为有你们的关心与帮助，才使我的研究生学习生涯更加精彩而充实。特别感谢我的家人及好友，感谢你们给予我生活上的照顾与精神上的支持，因为你们的理解与支持，才使得我无后顾之忧，勇往直前。谢谢你们总是在我迷茫时给予我鼓励，给予我克服困难的动力。最后，诚挚地感谢所有关心我、帮助过我的老师、亲人、朋友、同学和陌生人，愿你们一切都好！作者：王琦二〇一八年五月II 课题来源国家自然科学基金《PhoP/Q对APEC关键毒力因子及β-防御素抗感染的调控研究》项目编号31372402III 摘要禽致病性大肠杆菌（AvianpathogenicEscherichiacoli，APEC）导致的禽大肠杆菌病被公认为是影响世界范围内养禽业的主要细菌性疾病，给养禽业带来重大的经济损失。APEC的毒力因子有菌毛、摄铁系统、毒素和外膜蛋白等，致病性复杂，血清型多样。细菌调控基因转录表达的途径众多，PhoP/Q二元调控系统是其中一个关键途径，其中调控与外膜蛋白合成相关基因的表达是其功能之一。本实验室前期研究发现APECphoP/Q的缺失引起ompT基因表达的显著下调。外膜蛋白酶T（Outer-membraneproteaseT，OmpT）是革兰氏阴性菌中的一种外膜蛋白酶，它不仅可以作为水解蛋白的蛋白酶发挥功能，还可能是细菌的一个毒力相关因子，在病原菌的感染致病过程中起着一定作用。本试验通过Red重组技术构建了ompT缺失株及回复株，并进行生物学特性分析，基于RNA-Seq技术对ompT缺失株测序筛选并分析差异表达基因，并对ompT缺失株感染雏鸡小肠炎症相关基因mRNA水平的表达进行检测，为进一步研究ompT基因在禽致病性大肠杆菌中的致病作用提供理论依据，研究内容及结果如下：1.ompT基因缺失株、回复株的构建及其生物学特性和致病性分析本试验以AE17为野生株，通过Red重组技术成功构建了ompT缺失株及回复株。细菌生长曲线测定结果显示与野生株相比，ompT基因缺失株差异不显著；环境耐受性试验表明ompT基因缺失导致菌株耐酸性显著增加(p<0.01)，耐碱性显著降低(p<0.05)，耐热性显著降低（p<0.01）；LD50测定结果显示，ompT缺失株对雏鸡的致病力降低；组织载菌量试验结果表明，ompT缺失株显著降低感染雏鸡组织（脾脏、肝脏、肺脏）的载菌量（p<0.01）；与野生株相比，ompT基因缺失后，菌株对APEC的运动能力、抗生素的敏感性及抗吞噬能力差异不显著。2.基于RNA-Seq筛选APECompT缺失株差异表达基因为了探索ompT缺失对APEC基因水平的影响，本试验通过RNA-Seq技术从转录组水平筛选ompT缺失引起的差异表达基因，结果显示有490个差异表达基因，其中包括125个下调表达基因，365个上调表达基因。GO功能结果表明差异基因主要涉及铁离子稳态、裂解酶活性、肽聚糖生物合成过程、细胞形态调控等生物学过程；KEGG通路分析结果显示差异基因主要涉及细菌趋化性、生物膜形成、鞭毛装配、脂多糖生物合成等通路。筛选出fliY、ompF、ibeT、aphA、motB、rfaQ、flgK、cheA、irp2、asnC、ycgR、lpxK、kpsU等与毒力相关的基因。通过RT-PCR验证了部分差异基因（fliY、ompF、ibeT、aphA、motB、rfaQ、cheA、irp2）的表达，结果与RNA-SeqIV 中基因表达变化趋势一致，说明RNA-Seq结果可靠。3.RT-PCR检测ompT缺失株感染雏鸡小肠炎症相关基因mRNA的转录水平通过RT-PCR比较攻毒组与对照组雏鸡空肠炎症相关基因PTGDS、MMEmRNA水平的转录水平。结果显示攻毒12h、24h和48h后缺失株攻毒组的PTGDS基因mRNA的表达量较AE17攻毒组显著降低（p<0.01或p<0.05），攻毒12h、24h后PTGDS基因mRNA的表达量高于0h、48h和72h。攻毒12h后，所有攻毒组的MME基因mRNA的表达量较0h显著降低；攻毒24h、48h后缺失株攻毒组的MME基因mRNA的表达量较AE17攻毒组显著降低（p<0.01或p<0.05）。综上所述，本试验成功构建了ompT缺失株及回复株，缺失ompT后导致耐酸性增强，耐碱性、耐热性降低，肝脏、脾脏、肺脏载菌量减少，显著降低了APEC的毒力和致病性，但对运动性、药物敏感性、抗吞噬能力方面影响不显著。APECompT基因的缺失引起毒力相关基因（fliY、ompF、ibeT、aphA、motB、rfaQ、flgK、cheA、irp2、asnC、ycgR、lpxK、kpsU）的表达变化。APEC感染雏鸡引起空肠炎症相关基因PTGDS、MMEmRNA的表达变化，且菌株缺失ompT后影响空肠炎症相关基因PTGDS、MMEmRNA的表达，说明炎症相关基因PTGDS、MME参与了机体抗APEC感染的过程，且ompT可能参与APEC感染机体的过程。关键词：禽致病性大肠杆菌；ompT；基因缺失；生物学特性；雏鸡小肠；炎症相关基因V ABSTRACTTheavianpathogenicEscherichiacolidiseasecausedbyAvianpathogenicEscherichiacoli(APEC)isrecognizedasthemajorbacterialdiseaseaffectingtheworldpoultryindustryanditbringssignificanteconomiclossestothepoultryindustry.APEC'svirulencefactorsarepilus,ironintakesystem,toxins,invadingenzymesandoutermembraneproteins,etc.Thepathogenicityiscomplexandtheserotypesarediverse.Therearemanywaystoregulatethegenetranscriptionbybacteria,andthePhoP/Qbinaryregulatorysystemisoneofthekeypathways.Amongthem,theexpressionofgenesrelatedtoregulationandoutermembraneproteinsynthesisisoneofitsfunctions.OurpreviousstudyfoundthatthelossofAPECphoP/QcausedasignificantdownregulationofompTgeneexpression.Outer-membraneproteaseT(OmpT)isanoutermembraneproteaseinGram-negativebacteria.Itisnotonlyactsasaproteaseforhydrolyzedproteins,butalsomaybeavirulence-relatedfactorofbacteria.Pathogenicbacteriaplayaroleinthepathogenesisofinfection.Inthisstudy,theompTdeletionstrainandcomplementationstrainwereconstructedbyRedrecombinationtechnology,andtheirbiologicalcharacteristicswereanalyzed.ThedeletionstrainsweresequencedandanalyzedfordifferentiallyexpressedgenesbasedonRNA-SeqtechnologytostudytheeffectofompTgenedeletiononbacterialvirulence.ToprovidefurthertheoreticalbasisforthefurtherstudyofthepathogenicroleofompTgeneinavianpathogenicE.coli.Theresearchcontentsandresultsareasfollows:1.ConstructionofompTdeletionandcomplementationstrainsandanalysisoftheirbiologicalcharacteristicsandpathogenicityInthisexperiment,AE17wasusedasawildstrain,andtheompTdeletionstrainandcomplementationstrainweresuccessfullyconstructedbyRedrecombinationtechnology.BacterialgrowthcurvemeasurementsshowednosignificantdifferenceintheompTgene-deletedstrainscomparedtowild-typestrains.EnvironmentaltolerancetestsshowedthattheompTgenedeletionresultedinasignificantincreaseinacidresistance(p<0.01),asignificantdecreaseinalkaliresistance(p<0.05),andasignificantdecreaseinheatresistance(p<0.01).TheLD50assayshowedthattheompTdeletionstrainhadreducedvirulenceinchicks.Theresultsofthetissue-bornebacteriatestshowedthattheamountofbacteriainompT-deficienttissue(spleen,liver,lung)decreased.Theresultsofexercisetest,VI drugsusceptibilitytestandchickenmacrophagephagocytosistestshowedthatcomparedwiththewildstrain,theompTgenedeletionshowednosignificantdifferenceintheAPECexerciseability,antibioticsensitivityandanti-phagocyticability.2.ScreeningfordifferentiallyexpressedvirulencegenesinAPECompTdeletionbasedonRNA-SeqToexploretheeffectofompTdeletiononAPECgenelevels,differentlyexpressedgenesresultingfromompTdeletionwerescreenedfromtheleveloftranscriptionusingRNA-Seqtechnology.Theresultsshowed490differentlyexpressedgenes,ofwhich125weredown-regulatedand365wereup-regulated.TheresultsofGOfunctionindicatedthatthedifferentialgenesmainlyinvolvedinthebiologicalprocessessuchasironhomeostasis,lyaseactivity,peptidoglycanbiosyntheticprocess,andregulationofcellshape,etc;theresultsofKEGGpathwayanalysismainlyinvolvedbacterialchemotaxis,biofilmformation,andflagellarassembly,lipopolysaccharidebiosynthesispathways,etc.Thevirulence-relatedgenessuchasfliY,ompF,ibeT,aphA,motB,rfaQ,flgK,cheA,irp2,asnC,ycgR,lpxK,kpsUwereselected.Theexpressionofsomeofthedifferentialgenes(fliY,ompF,ibeT,aphA,motB,rfaQ,cheAandirp2)wasverifiedbyRT-PCR.TheresultswereconsistentwiththetrendofgeneexpressioninRNA-Seq,indicatingthattheresultsofRNA-Seqwerereliable.3.InflammationrelatedgenesmRNAtranscriptionlevelsinthechicksofintestinaltissueafterinfectedwithAPECanditsompTdeletionstrainbyRT-PCRTheexpressionlevelsofPTGDSandMMEmRNAinthejejunalinflammatorytractofchickswerecomparedbyRT-PCR.TheresultsshowedthattheexpressionlevelofPTGDSgenemRNAinthechallengegroupwassignificantlylowerthanthatintheAE17challengegroupat12h,24hand48hafterchallenge(p<0.01orp<0.05),andtheexpressionofPTGDSgenemRNAat12hand24hafterchallengewasobserved.Theamountishigherthan0h,48hand72h.After12hoursofchallenge,theexpressionofMMEgenemRNAinallchallengegroupswassignificantlylowerthanthatin0h;theexpressionlevelsofMMEmRNAinthechallengegroupweresignificantlylowerthanthoseintheAE17challengegroupat24hand48hafterchallengewiththevirus(p<0.01orp<0.05).TheaboveresultsindicatethattheompTdeletionstrainandcomplementationstrainsofAvianpathogenicE.colistrainweresuccessfullyconstructedinthisstudy.OmpTdeficiencyresultedinenhancedacidresistance,decreasedalkali-tolerance,heatresistance,reducedbacterialloadintheliver,spleen,andlungs,significantlyreducingthetoxicityandpathogenicityofAPEC.Butnosignificanteffectonexercise,drugsensitivity,VII anti-phagocyticability.DeletionoftheAPECompTgenecausedchangesintheexpressionofvirulencerelatedgenes(fliY,ompF,ibeT,aphA,motB,rfaQ,flgK,cheA,irp2,asnC,,ycgR,lpxK,kpsU).TheexpressionofPTGDSandMMEmRNAofjejunumwasincreasedinchickensinfectedwithAPEC,andtheexpressionofPTGDSandMMEmRNAofjejunumwasaffectedaftertheompTwasdeleted,indicatingthattheinflammationrelatedgenesPTGDSandMMEparticipatedintheprocessofresistingAPECinfection.ompTmayparticipateintheAPECinfectionprocess.KEYWORDS:AvianpathogenicE.coli;ompT;genedeletion;biologicalcharacteristics;smallintestinesofchicks;inflammationrelatedgenesVIII 目录致谢.....................................................................................................................................I摘要..................................................................................................................................IVABSTRACT.........................................................................................................................VI英文缩写词表......................................................................................................................XI文献综述................................................................................................................................1引言........................................................................................................................................61材料与方法........................................................................................................................81.1试验材料.................................................................................................................81.1.1试验菌株、质粒及细胞..............................................................................81.1.2试验动物......................................................................................................81.1.3主要试剂及试剂盒......................................................................................81.1.4主要培养基及试剂的配制..........................................................................81.1.5仪器设备......................................................................................................91.2试验方法与步骤.....................................................................................................91.2.1目的菌株AE17中ompT基因的检测........................................................91.2.2AE17缺失株ΔompT的构建......................................................................101.2.3回复株ΔompT-comp的构建.....................................................................121.2.4AE17、ΔompT和ΔompT-comp的生物学特性及致病性分析...............131.2.5基于RNA-Seq技术筛选ompT缺失株差异表达基因...........................141.2.6ompT缺失株感染雏鸡小肠炎症相关基因mRNA的转录水平测定.....162结果与分析......................................................................................................................182.1ompT缺失株及回复株的鉴定..............................................................................182.1.1导入pkD46质粒的菌株鉴定...................................................................182.1.2导入ompT-pKD3片段的菌株鉴定..........................................................182.1.3禽致病性大肠杆菌ompT缺失株的构建.................................................182.1.4ompT回复株的鉴定...................................................................................202.2ompT缺失株和回复株生物学特性及致病性分析..............................................202.2.1生长曲线的测定结果................................................................................202.2.2运动性测定结果........................................................................................212.2.3环境耐受试验结果....................................................................................212.2.4药敏试验结果............................................................................................22IX 2.2.5鸡巨噬细胞吞噬试验结果........................................................................232.2.6细菌半数致死量（LD50）的测定............................................................232.2.7组织载菌量试验........................................................................................242.2.8APEC感染雏鸡空肠组织病理切片观察..................................................242.3RNA-Seq数据处理与分析...................................................................................242.3.1RNA-Seq数据预处理结果......................................................................242.3.2AE17菌株与ΔompT菌株基因组比对结果..............................................262.3.3AE17菌株与ΔompT菌株差异基因筛选..................................................262.3.4AE17菌株与ΔompT菌株差异表达基因的GO功能分类......................262.3.6RT-PCR验证差异基因...............................................................................282.4AE17与ΔompT感染雏鸡空肠炎症相关基因转录水平的检测.........................292.4.1空肠中PTGDSmRNA转录水平的检测.................................................292.4.2空肠中MMEmRNA转录水平的检测....................................................303讨论..................................................................................................................................313.1ompT基因缺失株、回复株的构建及其对生物学和致病性的影响..................313.2运用RNA-Seq筛选ompT基因缺失株差异表达基因......................................323.3AE17及其ompT基因缺失株对雏鸡空肠炎症相关基因表达的影响...............334结论..................................................................................................................................35参考文献..............................................................................................................................36作者简介..............................................................................................................................43X 英文缩写词表中文名英文全称英文缩写禽致病性大肠杆菌AvianpathogenicEscherichiacoliAPEC外膜蛋白酶TOuter-membraneproteaseTOmpT菌落形成单位colonyformingunitcfu碱基对basepairbp电泳缓冲液Tris-BoricacidTBE聚合酶链式反应PolymerasechainreactionPCR实时聚合酶链式反应RealtimepolymerasechainreactionRT-PCR图figureFig表tableTab磷酸盐缓冲液Phosphate-bufferedsalinePBS光密度OpticaldensityOD半数致死量medianlethaldoseLD50氨苄青霉素AmpicillinAmp氯霉素ChloroamphenicolCm毫摩尔millimolesmmol脱氧核糖核酸deoxyribonucleicacidDNA核糖核酸ribonucleicacidRNAFragmentsPerKilobaseofexonmodelper基因表达量的算法FPKMMillionmappedreads脂多糖LipopolysaccharidesLPSNationalCenterforBiotechnology美国国立生物技术信息中心NCBIInformation双蒸水DoubledistilledH2OddH2O转录组测序RNAsequencingRNA-SeqXI 文献综述禽致病性大肠杆菌(AvianpathogenicEscherichiacoli,APEC)是引起禽大肠杆菌病的病原菌，APEC可通过消化道、呼吸道等途径传播，当不同的应激因素引起机体抵抗力降低时，就会发生感染。各阶段的家禽均可受到感染，其中雏鸡更易被感染。APEC导致的家禽大肠杆菌病主要以全身性炎症为特征，尤其是对肺部、心脏、肝脏和脾脏等器官的侵袭，对宿主造成严重的损伤，甚至死亡。有研究学者认为，APEC与尿道致病性大肠杆菌（UropathogenicEscherichiacoli,UPEC）间有很大的相似性[1]，UPEC是人类常见的尿道感染中的病原菌，所以APEC很可能是UPEC中毒力基因的储存库。由于APEC致病机制复杂，不仅给家禽养殖业造成严重的经济损失，而且对人类公共卫生也构成重大的威胁，因此充分认识了解APEC毒力因子的功能和致病机理及其在与宿主相互作用中所扮演的角色对预防APEC疾病有着重要的现实意义。APEC的毒力因子有菌毛、摄铁系统、毒素和外膜蛋白等，致病性复杂，血清型多样。细菌调控基因转录表达的途径众多，PhoP/Q二元调控系统是其中一个关键途径，其中PhoP/Q系统可以调控病原菌中某些编码外膜蛋白酶基因的表达[2,3]。外膜蛋白酶T（Outer-membraneproteaseT，OmpT）是革兰氏阴性菌中的一种外膜蛋白酶，它不仅可以作为水解蛋白的蛋白酶发挥功能，还可能是细菌的一个毒力相关因子，在病原菌的感染致病过程中起着重要作用。PhoP/Q系统调控ompT基因转录水平的表达，而OmpT很可能通过影响某些毒力基因的表达从而影响细菌对宿主的感染，但关于这方面研究甚少。细菌外膜蛋白酶是涉及宿主-致病菌相互作用中的关键毒力因子，在宿主-致病菌相互作用过程中，OmpT是否在炎症反应中发挥着作用还未发现有关报道。1.禽致病性大肠杆菌及其毒力因子概述禽致病性大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，这类菌最外层有细胞壁且大多数菌株有运动性，含有鞭毛。禽大肠杆菌血清型种类很多，但最常见的血清型是O1，O2和O78。APEC引起的禽大肠杆菌病是一种重要的家禽传染病，该病可以引起禽全身性炎症，如气囊炎，心包炎，肝周炎，腹膜炎，输卵管炎，骨髓炎，多浆膜炎，败血症和卵黄囊感染等[4-8]。近几年，由于APEC感染的发病率和死亡率迅速上升，大肠杆菌病给家禽养殖业造成更加严重的经济损失，而且对人类公共卫生也构成重大威胁。禽致病性大肠杆菌的毒力强弱是由大肠杆菌自身携带的多种毒力因子决定。目前研究热门的毒力因子主要包括：耶尔森菌强毒力岛（HPI）、外膜蛋白、荚膜、侵袭素、鞭毛毒素、脂多糖、溶血素、黏附素等。耶尔森菌强毒力岛是APEC一个重要的铁摄取系统，irp1-9、fyuA、ybtA共11个基因构成HPI介导铁摄取系统的位点，其中irp2和fyuA是HPI的关键基因[9]。外膜蛋白是革兰氏阴性菌细胞壁中特有的结构，其不仅在维持细菌的形态、运输1 物质等方面扮演着重要角色，还是细菌的毒力因子。外膜蛋白可促进巨噬细胞对抗原的摄取，刺激机体的体液免疫和细胞免疫，有较强的免疫原性。荚膜中存在K抗原，K抗原与大肠杆菌的致病性相关，而荚膜多糖是引起大肠杆菌感染的重要致病因素。研究发现APECMT78株(O2:K1:H+)荚膜的缺失，可降低细菌在感染中潜在的增殖能力[10]。ibeT基因是一个具有侵袭功能的毒力基因[11]，ibeT基因有助于大肠杆菌K1对HBMEC的侵袭，并且有助于大肠杆菌K1逃逸HBMEC溶酶体[12]。内毒素参与禽致病性大肠杆菌的致病过程，并且与大肠杆菌的致病作用具有协同作用，内毒素可以引起家禽的急性炎症。细菌内毒素的主要成分是脂多糖（LPS），而LPS可导致机体的组织损伤。2.OmpT外膜蛋白酶的研究进展2.1外膜蛋白酶概述细菌外膜蛋白酶是参与宿主-病原菌相互作用中的主要毒力因子，这类酶有多种功能，其中包括一些非蛋白水解的功能，例如对上皮组织或上皮细胞和吞噬细胞的黏附性或侵袭性。Omptins是普遍存在于革兰氏阴性病原菌中的外膜蛋白酶，它们通过加工或降解多种宿主蛋白质来影响对宿主的致病性。Omptins家族各成员间蛋白质结构具有较高的整体同源性，作为宿主与病原菌中相互作用的毒力因子在感染致病过程中发挥着不同作用，除了蛋白质区域对底物识别重要的序列不同外，还包括一些表面结构如脂多糖（LPS）对Omptins功能的影响。Omptins需要与外膜上的LPS结合才能成为有活性的酶，尤其是该家族中的OmpT，Pla和PgtE[13,14]。Omptins蛋白酶的名字来源于大肠杆菌OmpT蛋白，大多数已知的Omptins蛋白酶是各种肠杆菌病原体的关键毒力因子，可作为蛋白酶，黏附素或侵袭素[15,16]，并且与细菌致病性有关。2.2OmpT的结构与功能OmpT是革兰氏阴性细菌特别是临床上分离的大肠杆菌中发现的重要毒力因子[17]。OmpT存在于大肠杆菌菌株的外膜中，归类在Omptins外膜蛋白家族，含有高度保守的β桶折叠结构是其重要的特征之一。由5个胞外环形成的凹槽中含有OmpT的活性位点，OmpT与其他跨膜蛋白一样，其在水-脂界面处含有两个芳香族氨基酸残基环[18]。大多数人认为OmpT是一种管家蛋白酶，其在内源性蛋白或融合蛋白与外膜接触的过程中扮演着重要角色。2.3OmpT与细菌致病性的研究Lundrigan和Webb对临床上分离的282株大肠杆菌检测ompT，发现其中约77％的菌株含有ompT基因[19]。ompT基因在尿路感染（UTI）的大肠杆菌分离株中的检出率为83.1％-88.5％，粪便大肠杆菌分离株中约有67.7％含ompT[20]，在新生儿脑膜炎病例中分离的大肠杆菌株中的检出率为96％[21]，大概97%的APEC分离株中含有ompT基因[22]，这些流行病学数据表明，大肠杆菌中的ompT基因在大肠杆菌中的流行率很高。近年来，研究人员察觉到OmpT不单单是作为水解蛋白的蛋白酶，还是细菌的一个毒力相关因子，在病原菌的感染致病过程中起着一定作用。大肠杆菌蛋白酶OmpT作为一种毒力因子参加细菌感染机体过程可2 能是以多种机制共同发挥毒力作用，导致机体致病。第一方面是OmpT发挥蛋白酶的水解功能，通过降解宿主分泌的抗菌肽来增加细菌在宿主体内的存活率，并有助于病原菌抵抗上皮组织中的先天免疫细胞和巨噬细胞[23]。许多研究人员已经确定OmpT与大肠杆菌抵制防御素类的抗菌肽有着密切的关系。第二方面是OmpT利用激活纤维酶原的方法来降解细胞外基质以达到侵袭宿主细胞的目的[24,25]。虽然OmpT激活的纤溶酶被天然纤溶酶抑制剂迅速抑制[26]，但有限被活化的纤溶酶可能足以使UPEC穿透泌尿道上层细胞以建立感染[19]。第三方面是OmpT有利于细菌黏附于基底膜[13]、细胞外基质蛋白[27]和人上皮细胞[28]等，帮助细菌附着于宿主上皮组织（如尿道上皮、肠道上皮），并建立持续的细菌感染。有研究证明OmpT有利于细菌在尿路上皮的定植而引发细菌对机体的感染[29]。第四方面是OmpT可能通过影响某些毒力基因的表达从而影响细菌对宿主的感染，但关于这方面研究甚少。陈娟通过荧光定量PCR方法检测到缺失ompT基因的大肠杆菌菌株中I型菌毛合成必需蛋白基因FimC表达量下调，推测ompT基因可能通过影响菌株黏附的能力来改变APEC的致病力[30]。2.4OmpT与APEC致病性的研究OmpT在APEC感染致病过程中起着重要作用，OmpT既能在宿主细胞的黏附和侵袭中起作用[21]，也可以通过水解宿主上皮细胞分泌的抗菌肽增强对宿主的感染作用[3,31,32]，还可以通过帮助宿主细胞内的细菌传播来发挥毒性作用[33]。徐晓静等人通过试验研究分析发现APEC中存在许多潜在毒力基因，而ompT基因可能就是其中之一，但现如今对ompT在机体中的表达情况还研究甚少[34]。大多数学者关注于作为外膜蛋白酶的OmpT对蛋白方面的作用，而ompT作为APEC的毒力基因，在致病机理上及致病菌与机体相互作用中发挥的作用方面研究甚少。高清清通过定量PCR结果检测APEC中的ompT基因在鸡感染模型中表达量上调，猜测ompT很可能是导致APEC致病感染的致病基因[35]。3.病原菌与小肠相互作用的研究3.1病原菌与小肠炎症反应小肠是机体消化吸收至关重要的场所，而小肠黏膜屏障是阻止病原菌侵袭宿主的一道有效防御屏障。肠上皮屏障是肠道黏膜屏障中最主要的组成部分[36]。肠上皮屏障主要是通过肠上皮细胞之间的紧密连接（tightjunction，TJ）阻止肠道病原菌进入肠黏膜[37]。紧密连接的破坏促使病原微生物通过肠黏膜迁移到肠道固有层，激活肠道中的免疫细胞并引发炎症反应。LPS在介导炎症反应及病原微生物感染中扮演着重要角色，LPS损伤鸡肠道黏膜并破坏其上皮组织促使APEC进入机体的循环系统，引发机体的炎症反应及免疫应答，诱导肠道炎症与免疫应答基因的防御性表达。炎症反应有利于促使致炎因子诱导机体自动产生防御反应增加机体抵抗病原菌的能力，但过度的炎症反应也会造成机体损害，组织器官受损，从而促进疾病的产生。当宿主肠道上皮细胞与致病菌相互作用时，可通过产生的细胞因子募集炎性细胞来调节机体的炎症反应。小肠上皮细胞中分泌的β-防御素可诱导前炎症细胞因子的形成，有助于中性粒细胞在炎症部位积累，使得局部炎症反应的恶化。肠上皮细胞在损伤-修复的平衡中发挥着关键作用，在损伤-修复的平衡中导致机体有关基因转录表达水3 平的变化，而这些变化的基因对探讨机体抵抗病原微生物感染的致病机制尤为关键。黄怡发现屎肠球菌能够增强大肠杆菌对PGE2分泌的诱导，猜测可能与屎肠球菌增强巨噬细胞的炎症应答水平来防御病原菌入侵有关[38]。李少参发现APEC及phoP/Q缺失株可以导致被感染的雏鸡小肠中AvBD6mRNA表达量的增加，提示AvBD6在抗APEC感染过程中发挥作用，并且phoP/Q可能参与APEC调控AvBD6的抗感染过程[39]。3.2外膜蛋白与炎症反应外膜蛋白位于病原菌表面，是最先与宿主细胞相互作用的部位，在维持自身菌体结构及物质转运、致病性等方面发挥着重要作用，而且参与了多项生理功能：参与革兰氏阴性细菌感染中的炎症反应[40-42]、激发宿主产生免疫保护性[43-45]，产生耐药性[46,47]等。前炎症外膜蛋白oipA有很强的免疫原性，可以明显增高血清中IL-8的表达水平，并且与嗜中性粒细胞的浸润有关[48]。Singh等[49]发现鼠伤寒沙门氏杆菌OmpW可导致反应性关节炎/未分化脊柱关节病。粪拟杆菌的OmpW与炎症性肠道疾病有关[50]。有学者在生物学测定中发现，OmpT能够单独或在LPS存在下诱导炎症反应，OmpT在影响LPS中脂质的流动性中起着关键作用，OmpT可以导致磷脂酰基链以及LPS的显著流化[17]，OmpT有可能能够通过影响LPS来影响机体的炎症反应。或许外膜蛋白除了在细菌的生长、生存、核酸的转运、毒力因子的传递中发挥作用，可能在改变宿主的炎症反应和免疫反应方面也发挥作用，它很可能是大肠杆菌中的毒力相关因子[51,52]，然而OmpT在肠杆菌中的致病机理中扮演着什么角色，至今还未完全清楚，虽然OmpT在生物学功能方面的研究还未完全明确，但它很可能有保护E.coli的作用。4.RNA-Seq技术的应用RNA-Seq技术是以RNA逆转录形成的cDNA为模板来获取特定样本中不同基因中的RNA片段含量的一种高通量测序技术。由于RNA-Seq技术可以得到全部RNA转录本的丰度信息，并且准确性也很高，使之广泛应用于各个领域。RNA-Seq技术不仅可以用于检测新的转录本，注释基因结构及鉴定新基因，探索基因突变及寻找表达数量性状位点(eQTL)融合基因及鉴定非编码RNA，还用于在基因转录水平筛选分析不同样本中的差异表达基因，尤其是筛选致病菌株中相关的毒力基因。4.1RNA-Seq技术在筛选致病菌株相关毒力基因中的应用RNA-Seq技术中Illumina测序是将总cDNA打断成很多小片段，然后将添加好接头序列的cDNA通过桥式扩增的方法形成成千上万的单分子簇，最后基于这些单分子簇进行测序。测序数据是将短的读长与基因组注释信息比对，得到不同基因和基因上的不同结构特征的表达丰度，而这种表达丰度为研究不同条件处理后生命体中的差异基因提供了很好的方案。现如今，越来越多的学者利用RNA-Seq技术进行细菌转录组测序，有助于研究人员在致病菌株中寻找毒力相关基因，为诊断防治疾病及研发疫苗或抗生素提供理论依据。刘翠翠通过对诱导产生耐药性的福氏志贺菌株进行RNA-Seq分析，对福氏志贺菌株在耐药、毒力等作用机制有了初步的认识[53]。HebertER等人通过对人体全血感染的奈瑟氏脑膜炎4 奈瑟球菌进行转录组测序分析发现该菌通过一些与转录调节物、运输及表面暴露的毒力因子等相关基因的动态表达来适应血液中的存活及生长[54]。杜楠基于RNA-Seq分析三株II型猪链球菌筛选出96个三株菌共同拥有的毒力因子，而这些毒力因子主要集中涉及细菌的黏附、生物膜的形成及转运等生物过程，并发现了3个可能影响致病菌毒力的新基因[55]。李会通过对耐氯霉素的空肠弯曲菌进行RNA-Seq测序，鉴定出290个差异表达基因（DEGs），主要参与代谢通路、次生生物合成代谢、核糖体和鞭毛组装等途径；对耐氟苯尼考的空肠弯曲杆菌进行RNA-Seq测序，鉴定出93个差异表达基因（DEGs），主要参与代谢通路、不同环境中微生物的代谢、核糖体和氮代谢等途径[56]。4.2RNA-Seq技术在筛选致病菌敲除株中相关毒力基因中的应用通过RNA-Seq技术筛选致病菌某毒力基因敲除株中相关差异表达的毒力基因有助于从转录水平解析该毒力基因的调控机制，为进一步鉴定和研究受该毒力基因调控的基因提供基础数据。岳晓凤等人通过对敲除毒力基因znf1的稻瘟病菌中进行高通量测序，筛选出709个差异表达基因，KEGG富集分析显示这些差异基因主要参与代谢途径、次生代谢物质生物合成、甘油磷脂代谢等[57]。刘念对缺失毒力基因eha的迟缓爱德华菌进行高通量测序，筛选出差异表达基因147个，GO分析发现这些基因重要涉及细菌加工、定位、代谢等功能，KEGG分析发现差异基因主要集中在氨基酸、核苷酸、铁转运等通路中[58]。张娜通过对单增李斯特菌双组分调控系统RS08195/RS08200缺失突变株进行RNA-Seq测序，分析得到115个上调差异表达基因，98个下调差异表达基因，其中dltB、dltC及dltD这3个依赖VirR调控的毒力基因表达下调，hly、inlA和inlH这3个依赖PrfA调控的毒力基因表达上调；KEGG-Pathway富集结果显示，差异表达基因主要被富集到氨基酸代谢通路和营养代谢通路中[59]。安春霞对禽致病性大肠杆菌ArcA缺失株进行RNA-Seq测序，筛选到129个差异表达基因，虽没有筛选到经典毒力因子，但筛选到部分与大肠杆菌致病性相关的基因，包括鞭毛合成功能基因flgB、flgK、motB，趋化性功能基因cheA、cheW，等[60]。5.本课题研究目的意义由于APEC致病机制复杂，不仅对家禽养殖业造成经济损失，而且对人类公共卫生也造成重大威胁，因此充分认识了解APEC毒力因子的功能和致病机理及其在与宿主相互作用中所扮演的角色对预防APEC疾病有着重要的现实意义。OmpT是宿主与病原微生物相互作用中的关键毒力因子，所以本研究以APEC的ompT作为目标基因，通过构建ompT基因缺失株并进行生物学特性评价，结合RNA-Seq技术对缺失株测序分析差异表达基因，并对野生株与ompT缺失株感染雏鸡小肠炎症相关基因mRNA的转录水平进行检测，研究ompT基因缺失对细菌毒力的影响，为进一步研究ompT基因在禽致病性大肠杆菌中的致病作用提供理论依据，初步探讨ompT对APEC感染雏鸡后小肠炎症反应的影响，为进一步研究APEC与雏鸡相互作用的过程中APEC对机体的感染机制奠定一定的基础。5 引言禽致病性大肠杆菌（AvianpathogenicEscherichiacoli,APEC）是导致禽大肠杆菌病的病原菌，它能够利用LPS破坏肠道黏膜侵入宿主的循环系统，给宿主带来严重损伤。家禽集约化饲养导致APEC感染的发病率和死亡率迅速上升，给家禽养殖带来巨大的经济损失。APEC的毒力因子有菌毛、摄铁系统、毒素和外膜蛋白等，致病性复杂，血清型多样。细菌调控基因转录表达的途径众多，PhoP/Q二元调控系统是其中一个关键途径，其中调控与外膜蛋白合成相关基因的表达是其功能之一。本实验室前期研究发现APECphoP/Q的缺失引起ompT基因表达的显著下调。外膜蛋白酶T（Outer-membraneproteaseT,OmpT）是革兰氏阴性菌中的一种外膜蛋白酶，它不仅可以作为水解蛋白的蛋白酶发挥功能，还可能是细菌的一个毒力相关因子，在病原菌的感染致病过程中起着一定作用。徐晓静等人通过试验研究分析发现APEC中有很多潜在的毒力基因，而ompT基因可能就是其中之一[34]，而陈娟通过缺失ompT基因发现ompT的确影响禽大肠杆菌的致病力[30]。本实验室前期研究发现APEC的phoP/Q缺失后引起ompT基因的表达发生变化，所以在此研究基础上，本研究中将ompT基因作为研究对象，以AE17为野生株，利用Red同源重组技术构建了ompT缺失株及其回复株，进行了生物学表型分析，并基于RNA-Seq技术对ompT缺失株测序筛选并分析差异表达基因。本实验室前期发现APEC感染雏鸡后导致小肠炎症相关基因表达变化，同时有文献报道ompT能够诱导炎症反应，但对宿主-病原菌相互作用过程中，ompT是否在机体炎症反应中发挥作用尚未见报道。因此，本试验以ompT缺失株感染雏鸡，通过荧光定量PCR方法检测并比较ompT缺失株与野生株感染雏鸡后小肠炎症相关基因表达的变化，初步探讨ompT是否影响APEC感染雏鸡后小肠的炎症反应，为进一步研究APEC与雏鸡相互作用的过程中APEC对机体的感染机制奠定一定的基础。6 主要技术路线7 1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌株、质粒及细胞APEC野生株AE17储存于安徽农业大学兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室；质粒pkD3、pCP20、pKD46、低拷贝质粒pSTV-28、鸡巨噬细胞HD-11均由本实验室保存；DH5α感受态细胞购买于天根生化科技(北京)有限公司。1.1.2试验动物1日龄健康雏鸡购买于安徽省安禽养殖公司，经过自由饮水和采食不含抗生素的雏鸡全价料，分别饲养至7日龄和14日龄进行攻毒。1.1.3主要试剂及试剂盒琼脂糖、GelGreen核酸染色液、5×TBE、氯霉素、氨苄青霉素、L-阿拉伯糖、胰蛋白胨、Nacl、DNA胶回收试剂盒、质粒小量提取纯化试剂盒、β-巯基乙醇、限制性内切酶（EcorI、HindIII）均购买于上海生工生物工程技术服务有限公司。2×PCRMix、高保真Mix、DNAMarker、T4DNA连接酶均购自大连宝生物工程有限公司。SYBRGreenPCRMasterMix购买于ABI公司。TransStartTopGreenqPCRSuperMix、TransScript®One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix购自北京全式金生物技术有限公司。1.1.4主要培养基及试剂的配制LB液体培养基：酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl5g，加ddH2O至1L，调节pH值7.4-7.6，121℃灭菌20min。LB固体培养基：LB液体培养基1L，琼脂粉15g，121℃灭菌20min后倒入平板，凝固后倒置平板。运动性培养基：胰蛋白胨10g，NaCl5g，葡萄糖8g，琼脂3g，加入ddH2O定容至1L，115℃高压灭菌30min后备用。SOB培养基：NaCl0.05g，酵母提取物0.5g，胰蛋白胨2g，250mmol/LKCl1mL，加双蒸水至100mL，115℃高压灭菌30min后备用。SOC培养基：SOB培养基5mL，1mol/L葡萄糖100µL，2mol/LMgCl225µL。DMEM完全培养基：DMEM1.35g，NaHCO30.37g，加入ddH2O至100mL，再加入10%胎牛血清和1%双抗贮存液，一次性滤器过滤后，4℃保存备用。8 磷酸盐缓冲液(PBS)：KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8g，Na2HPO4•12H2O2.9g，加ddH2O定容为1L，调pH为7.2左右，121℃灭菌20min。4%多聚甲醛固定液：多聚甲醛40g，ddH2O1L，加热磁力搅动并滴加少许1mol/LNaCl溶液至溶液澄清后备用。1.1.5仪器设备表1-1主要仪器Tab1-1Primaryinstruments仪器名称仪器型号生产厂家EquipmentnameInstrumentmodelManufacturer双面超净工作台SW-CJ-1F江苏苏州智净净化设备有限公司恒温培养箱HPX-9052MBE博迅恒温摇床BSD-TX270博讯紫外分光光度计WFZUV-2100尤尼柯超低温冰箱MDF-U3386Spanasonic立式压蒸气灭菌器YXQ-2S-50S11上海博迅实业有限公司医疗设备厂荧光定量PCR仪Steponeplus塞默飞世尔科技高速冷冻离心机ALLEGRA64RBeckmancoulter电泳仪DYY-6C北京六一仪器厂电转化仪GenePulserXcellBioRAD生物组织切片机JJQ-P2016J武汉俊杰电子有限公司梯度PCR仪MyCyclerBioRAD倒置显微镜IX53日本OLYMPUS公司台式通风柜PF-1科贝科技超纯水仪SMART-N广州安邦生物科技有限公司制冰机IMS-30雪科微波炉WD900SL23-2格兰仕1.2试验方法与步骤1.2.1目的菌株AE17中ompT基因的检测根据GenBank中已发布的APECO1型ompT基因序列利用PrimerPremier5.0软件设计引物，以反复冻融后的AE17菌液为模板，以AE17-F/AE17-R、ompT-in-F/ompT-in-R为引物，引物序列见表1-2。通过PCR鉴定菌株AE17，PCR反9 应总体系20µL：2×PCRMix10µL，DNA模板1µL，上游引物1µL，下游引物1µL，ddH2O7µL。ompT-in基因扩增Tm为57℃，AE17基因扩增Tm为55℃。将20µL混合物混合均匀后置于PCR仪中，扩增程序为：94℃5min；94℃40sec，Tm30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。扩增程序结束，通过琼脂凝胶成像系统观察。表1-2用于基因敲除和回复的引物序列Tab1-2Primersusedinthegenedeletionandcomplemented.引物名称引物序列(5'—3')大小/bpPrimerSequence(5'—3')Size/bpAE17-FGAGCGATCTTGGCTATACC1023bpAE17-RGTGAAGCTATCTAACAACGGompT-in-FGCTCCTCAACGAACCCAAT120bpompT-in-RTCATCTCTGAATCCCTCCTCAATGCGGGCGAAACTTCTGGGAATAGTCCTGACACCCompT-pKD3-FCCTATGTAGGCTGGAGCTGCTT1013bpTTAAAAGGTGTACTTAAGACCAGCAGTAGTGATGAAompT-pKD3-RGTTACATATGAATATCCTCCTTAGTTCompT-out-FCAAGAATTGTGGCTCCGTAT2427bpompT-out-RAGATCGCCTCGCTGTTAGpKD46-FGATACCGTCCGTTCTTTCCTT888bppKD46-RTGATGATACCGCTGCCTTACTpCP20-FTTAGTGGTTGTAAAAACACCTGACC409bppCP20-RGTTAGCGTTGAAGAATTTAGCCCM13-FCAGGAAACAGCTATGACM13-RGTTTTCCCAGTCACGACompT-EcorI-FCCGGAATTCCGGATGCGGGCGAAACTTCTGGGAAompT-HindIII-RCCCAAGCTTGGGTTAAAAGGTGTACTTAAGACCA1.2.2AE17缺失株ΔompT的构建1.2.2.1ompT-pKD3抗性片段的扩增通过引物ompT-pKD3-F/ompT-pKD3-R扩增出ompT-pKD3抗性片段，扩增片段大小为1013bp。PCR扩增反应总体系50µL：PrimeSTARMaxDNAPolymerase25µL，DNA模板1µL，上游引物1µL，下游引物1µL，ddH2O22µL。将50µL混合物离心混合均匀后执行以下PCR程序：94℃5min；94℃40sec，62℃20sec，72℃1min，10 35个循环；72℃10min。1.2.2.2胶回收PCR产物将上述PCR产物通过1.2%的琼脂糖凝胶电泳扩增出目的条带，然后通过胶回收对PCR产物进行纯化。（1）含目的DNA片段的琼脂凝胶通过灭菌的手术刀切割并置于1.5mLEP管中称重。（2）按每0.1g琼脂胶加300µL的比例加BufferB2溶胶液。（3）将加了BufferB2的离心管放入50℃水浴锅孵育5-10min，直到琼脂糖凝胶全部溶化。（4）将已溶解的液体转移至吸附柱中，8000×g离心30sec后弃掉管中液体。（5）加300µL的BufferB2至吸附柱中，9000×g离心30sec后弃掉管中液体。（6）加500µL的WashSolution至吸附柱中，9000×g离心30sec后弃掉管中液体。（7）重复步骤（6）一次。（8）将空吸附柱9000×g离心1min，尽可能地去掉漂洗液，以防残留的酒精影响得率。（9）在吸附膜的中央添加20µLElutionBuffer，室温静放1min，9000×g离心1min。（10）将所得DNA溶液分装出2µL用于核酸纯度和浓度的测定，其余所得DNA溶液置于-20℃冰箱保存或直接用于后续试验。1.2.2.3感受态的制备及电转化将AE17接种于液体LB中，28℃过夜培养。翌日按1:100比例接种菌株至200mLLB中，28℃200r/min培养。培养至OD600值为0.5-0.6时，将200mLAE17菌液分装到4个灭过菌的50mL离心管中并冰浴15min后5000r/min，4℃离心15min，弃去上清；添加提前预冷的10%甘油水，反复吹打混合均匀，5000r/min，4℃离心15min，弃掉上清；反复洗3次后将菌液浓缩为1mL的感受态细胞，并分装至EP管，每管100µL，直接用于后续试验或冷冻于-80℃冰箱。将纯化后的pKD46质粒5µL与100µL感受态细胞充分混合后，冰上放置15min左右后，转入提前冷处理的1mm灭菌电击杯。通过200Ω、1.8kV、25µF的电击条件电转感受态细胞。电击后快速添加500µLSOC培养基至电击杯中，充分混合均匀后于28℃摇床200r/min培养60min。将培养后的菌液涂布于含Amp抗生素（100µg/mL）的LB固体培养板上，并于28℃培养24-48h。挑单菌落用含有Amp（100µg/mL）的LB液体培养基进行增殖培养。通过pKD46-F/pKD46-R以鉴定pKD46质粒电转入AE17中的情况。28℃摇床中200r/min震荡培养含质粒pKD46的AE17菌株至OD600值为0.2-0.3时，添入L-阿拉伯糖（30mmol/L），充分诱导pKD46表达Red重组系统中的exo、bet、gam3个基因。继续震荡培养至OD600值为0.5-0.6。通过上述描述的方法制备感受态细胞，然后将已制备好的含pKD46的AE17感受态细胞分装成每管100µL，用11 于后续试验或-80℃冰箱冷冻。将10µL纯化后的ompT-pKD3片段与100µL含pKD46的AE17感受态细胞中充分混合均匀后，按上述方法进行电转化。28℃摇床中200r/min培养60min后用含有终浓度为34µg/mL的Cm抗生素LB培养基初步筛选阳性重组子。然后用ompT-in-F/ompT-in-R、ompT-out-F/ompT-out-R、pKD3-F/pKD3-R三对引物对阳性重组子进行鉴定，以确定ompT基因片段是否被pKD3替换。1.2.2.4阳性重组子氯霉素抗性基因的消除接种鉴定成功的阳性重组子于含Cm抗生素的液体LB中，42℃，200r/min培养过夜，以使pKD46丢失。按上述方法将丢失pKD46的阳性重组子制备成感受态细胞，通过电转将质粒pCP20导入丢失pKD46的阳性重组子制成的感受态细胞后，涂布于含Amp（100µg/mL）和Cm（34µg/mL）的双抗LB固体培养板上，28℃过夜培养以筛选阳性重组子，把阳性重组子转接入没有抗性的LB液体中，通过42℃，200r/min过夜培养的方法去除质粒pCP20。次日用pKD3-F/pKD3-R、ompT-in-F/ompT-in-R、ompT-out-F/ompT-out-R为引物鉴定Cm抗性是否消除，将PCR验证正确的病原菌株命名为ΔompT。1.2.3回复株ΔompT-comp的构建1.2.3.1ompT基因扩增以AE17基因组为模板，以含有EcorI和HindIII酶切位点的ompT-EcorI-F/ompT-HindIII-R为引物进行PCR，扩增出含启动子且条带大小为954bp的ompT回复片段EcorI-ompT-HindIII，并胶回收纯化EcorI-ompT-HindIII片段。1.2.3.2ΔompT-comp回复株的构建使用EcorI酶和HindIII酶分别酶切EcorI-ompT-HindIII片段和低拷贝质粒pSTV-28。反应总体系20µL：10×Buffer2µL，DNA10µL，EcorI1µL，HindIII1µL，ddH2O6µL。将上述20µL混合物离心混匀后，置于37℃水浴锅中温育2h后对其进行琼脂凝胶电泳鉴定酶切结果并胶纯化回收。将酶切以后的片段EcorI-ompT-HindIII和pSTV-28质粒利用T4连接酶连接。连接体系10µL如下：EcorI-ompT-HindIII片段3µL，pSTV-28质粒1µL，5×T4DNALigaseBuffer2µL，T4DNALiga1µL，ddH2O1µL。混匀样品后25℃恒温3h后将连接后的产物进行电泳鉴定片段连接结果。将连接产物10µL与DH5α感受态细胞100µL混合均匀后进行化转后涂布于含Cm抗生素的LB固体培养板中，37℃，12-16h，挑阳性单菌落转接至含有Cm抗生素抗性的LB液体中，通过M13-R/M13-F和ompT-in-F/ompT-in-R引物鉴定含ompT回复片段的载体pSTV-28-ompT是否构建成功，并测序。活化含连接成功的pSTV-28-ompT的大肠杆菌12 DH5ɑ，提取pSTV-28-ompT载体，并将其电转入ΔompT中。最后通过M13-R/M13-F和ompT-out-F/ompT-out-R两对引物鉴定是否成功构建ompT基因回复株ΔompT-comp。1.2.4AE17、ΔompT和ΔompT-comp的生物学特性及致病性分析1.2.4.1生长曲线的测定接种环挑取AE17和ΔompT的菌液四区划线于LB固体平板中；挑取ΔompT-comp菌液四区划线于含有Cm抗性的LB固体平板中，37℃，12h。挑取AE17、ΔompT和ΔompT-comp的单菌落转接至LB液体中，并调OD600至相同值，37℃，200r/min震荡培养，以1h为间隔时间，通过分光光度计测定OD600值，根据OD600值绘制三株菌的生长曲线并比较差异。1.2.4.2运动性能的测定挑取AE17、ΔompT、ΔompT-comp的单菌落分别置于LB液体培养基37℃震荡过夜；第2日将AE17、ΔompT菌株转接于新鲜灭菌的LB培养基，将ΔompT-comp转接于含Cm抗性的LB液体中培养。吸取对数期的菌液，4℃，6000×g，5min，去掉培养基上清，留取菌体，PBS洗3次，最后调菌液OD600值为1.0。滴加10μL菌液于运动性培养基中央，37℃过夜培养。次日用游标卡尺记录菌圈大小，比较三种菌运动性差异。1.2.4.3环境耐受性试验挑AE17、ΔompT的单菌落分别转接于LB液体中，挑ΔompT-comp单菌落转接于含Cm抗生素的LB液体中，培养至对数期，离心并用PBS洗3次后调整OD600值为1.0。（1）耐热试验：将细胞悬液在54℃条件下加热3min后10倍梯度稀释至合适梯度后，用稀释平皿计数法计数后，计算细菌存活率。（2）耐酸性试验：将900μL醋酸LB培养液(pH=5.0)与100µL细胞悬液充分混合后，37℃，20min后，10倍梯度稀释后，用稀释平皿计数法计数后，计算细菌存活率。（3）耐碱性试验：将800µLTris-Hcl(pH=10.0)、100µL蒸馏水与100µL细胞悬液充分混合后，37℃，30min后，10倍梯度稀释后，用稀释平皿计数法计数后，计算细菌存活率。1.2.4.4药敏试验选取多黏菌素B、磷霉素、头孢曲松、头孢噻肟4种抗生素对AE17、ΔompT、ΔompT-comp三株大肠杆菌进行药敏试验。37℃培养，使菌株生长至OD600约为1.0时，将一定量的菌液与MH琼脂培养基混合均匀后倒入培养板中，培养板凝固后，贴药敏纸片，每个菌株做3个平行。37℃培养18-24h后测量三株菌的抑菌圈直径。1.2.4.5鸡巨噬细胞吞噬试验培养鸡巨噬细胞HD-11，接种2×105个HD-11细胞于12孔细胞培养板上，滴加13 DMEM完全培养基，培养24h，使细胞贴紧细胞板，PBS洗3次后，每孔加入2×107cfu细菌（细菌：细胞=100:1），将加入细菌后的细胞板置于细胞培养箱1h，使细菌充分与巨噬细胞作用后，用灭菌PBS洗3次，充分去除巨噬细胞外没有被吞噬的菌体。每孔滴加1mL含庆大霉素（100µg/mL）的DMEM培养基，37℃培养1.5h使细胞外细菌充分被杀灭，PBS洗3次后通过0.1%的TritonX-1001mL裂解巨噬细胞，释放胞内细菌。10倍梯度稀释后涂板培养18h后，通过平板计数法来计算细菌数量。1.2.4.6细菌半数致死量（LD50）的测定四区划线AE17、ΔompT及ΔompT-comp三株菌于LB固体平板中，挑单菌落转接于LB液体中增殖，37℃培养至对数期，吸适量菌液并留取菌体，使用灭菌PBS洗3次，调整至合适的OD600值后倍比稀释，每株菌稀释6个浓度梯度。将7日龄雏鸡随机分为21组，每组8只鸡，AE17、ΔompT和ΔompT-comp三株菌分别以1×108cfu/只、1×107cfu/只、1×106cfu/只、1×105cfu/只、1×104cfu/只和1×103cfu/只的剂量通过大腿肌肉注射的方式对每组雏鸡进行攻毒试验，对照组注入等量的无菌PBS。注射病原菌后连续观察7天并记录雏鸡的死亡量。1.2.4.7组织载菌量试验分别挑AE17、ΔompT及ΔompT-comp的单菌落转接于LB液体中，37℃生长至对数期，离心后收集菌体，无菌PBS洗3次后调整菌体浓度至1×106cfu/mL。将三株细菌分别感染7日龄雏鸡，每组8只，大腿肌肉注射1×106cfu/mL的菌液1mL/只。感染24h后颈部放血处死并无菌采集肝、脾和肺组织。称量组织重量，添加灭菌的PBS研磨后，10倍梯度稀释后，通过平板计数法来细菌计数。1.2.4.8空肠组织病理切片观察将AE17、ΔompT及ΔompT-comp三株细菌分别感染7日龄雏鸡，采集空肠组织通过4%的多聚甲醛溶液固定并进行石蜡切片的制作，经过HE染色后并在显微镜下观察病变拍照。1.2.5基于RNA-Seq技术筛选ompT缺失株差异表达基因1.2.5.1RNA-Seq测序所需细菌样品准备分别挑AE17、ΔompT及ΔompT-comp三株菌的单菌落于LB液体中，37℃过夜，翌日将三株菌按1:100的比例转接到灭菌的液体LB中，37℃，200r/min培养菌液至OD600值约1.5，4℃，6000r/min，5min后丢掉上清收集菌体，无菌PBS洗3次后，将菌体经过液氮快速冷冻后保存在-80℃冰箱，然后由上海伯豪公司对其进行RNA-Seq测序试验。1.2.5.2RNA-Seq测序样本RNA的抽提与质检利用RNeasyMiniKit(Cat#74106,Qiagen)并依照操作流程的标准提取菌株的总14 RNA，将提取得到的总RNA通过AgilentBioanalyzer2100(Agilenttechnologies,SantaClara,CA,US)电泳并质量检测合格后再利用RNACleanXPKit(CatA63987,BeckmanCoulter,inc.KraemerBoulevardBrea,CA,USA)及RNase-FreeDNaseSet(Cat#79254,QIAGEN,GmBH,Germany)，对总RNA进行纯化。利用NanoDropND-2000分光光度计和AgilentBioanalyzer2100(Agilenttechnologies,SantaClara,CA,US)检测纯化后的总RNA，检测合格的RNA用于后续的RNA-seq测序。1.2.5.3RNA-seq测序文库的构建和测序文库构建检测合格的总RNA，然后依照构建的文库通过Qubit®2.0Fluorometer测量浓度，通过Agilent2100测量文库的大小。依照IlluminaUserGuide准备好测序所需的试剂，将含有cluster的flowcell上机进行测序。选择Paired-end程序对菌样进行双端测序。1.2.5.4转录组测序数据处理本试验应用Seqtk对测序的原始序列数据(RawReads)进行过滤，剔除不合格的Reads得到纯净序列（CleanReads）。应用bowtie2（version:2-2.0.5）[61]对预处理后的CleanReads进行基因组映射，将所得的Reads与鸡的参考基因EscherichiacoliAPECO2-211进行比对。1.2.5.5筛选差异表达基因为了使不同样本间的基因表达水平有可比性，将reads转化成FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads），使得基因表达量标准化[62]。应用edgeR[63]通过基因表达量（FPKM值）分析样本间的差异表达基因，以差异倍数(Foldchange)绝对值≥2且q-value≤0.05为标准条件筛选差异基因。FPKM的公式表示如下：比对到基因exon上的fragment数目FPKM=比对到参考基因组的总reads数目×基因exon的总长度1.2.5.6GO和KEGG富集以AE17菌株作为对照，将差异表达基因映射到GO及KEGG数据库中的各个条目，以q-value≤0.05为阈值，筛选出差异基因显著富集的GO及KEGG条目。1.2.5.7RT-PCR验证RNA-Seq中部分差异表达基因结果随机选取8个差异基因，以dnaE作为内参基因通过RT-PCR来验证RNA-Seq的结果（表1-3）。反应体系20uL:ForwardPrimer（10μM）0.4μL，ReversePrimer（10μM）0.4μL，2×TransStart®TipGreenqPCRSuperMix（+DyeI）10.0μL，cDNA2.0μL，ddH2O7.2μL。扩增条件：94℃，30sec；94℃，5sec；60℃，30sec，40个15 －ΔΔCT循环。根据熔解曲线分析引物的特异性。数据采用2法计算相关基因mRNA的转录水平。通过SPSS17.0对RNA-Seq和RT-PCR两种方法的结果进行相关性分析。表1-3荧光定量的引物序列Tab1-3PrimersusedintheReal-timePCR基因名称引物序列（5´-3´）产物长度/bpGenenameSequence（5´-3´）Productsize（bp）F：CGGTTACTGCCAGCGTATCGTTGfliY138R：GCGTGGATGTGCGTACCTATGATGF：TTCGCTGCCAGGTAGATGTTGTTCompF125R：GGTGCTTATGGTGCCGCTGACF：GTCTGTTACCGCTACTGCCTATGCibeT108R：ATCCAACCAATACGGCCACGAACF：TTCCTGCCACCAACATGAATCCGaphA156R：GGATACCACGAGCGCCAACATCF：GGCGCTTACTGGCTCATTCTGGmotB99R：GCCGTCAACCGTCGCATCAGF：CAACACCTGCATGATCAAGTTCGCrfaQ114R：ACTTATCCGTGCTGACGCCATTGF：GCTACACGGATGCTGGTGGATTCcheA194R：ATCGCCGAAGATGACATCACTGCF：GTCGGTGTGGTCAACGGTTCTCirp2138R：CTCAGCAGCATCAGCGAGGTGF：GATTGAGCGTTATGTCGGAGGCdnaE80R：GCCCCGCAGCCGTGAT1.2.6ompT缺失株感染雏鸡小肠炎症相关基因mRNA的转录水平测定1.2.6.1APEC感染雏鸡模型的建立及雏鸡空肠病理变化的观察购买1日龄正常雏鸡饲养至14日龄，将其随机分为PBS组、APEC攻毒组、ΔompT攻毒组、ΔompT-comp攻毒组4组，每组25只。选取APEC、ΔompT、ΔompT-comp菌株，倍比稀释到5×105cfu/mL，每只雏鸡腿部肌肉注射0.5mL菌液。对照组腿部肌肉注射PBS0.5mL/只。分别于0、12、24、48、72h后采集空肠组织经PBS清洗后于液氮速冻后放于-80℃冰箱保存，16 1.2.6.2雏鸡空肠总RNA的提取及反转录从-80℃冰箱取出空肠组织迅速称重后放入预冷的研钵中，利用液氮将组织研磨成粉后置于预冷的1.5mL无RNA酶的EP管中，并按总RNA纯化试剂盒的说明步骤提取总RNA。提取的总RNA于-80℃冰箱保存。将提取的总RNA依照反转录试剂盒说明书步骤反转录为cDNA。反应体系20µL:AnchoredOligo(dT)18Primer(0.5µg/µL)1µL、2×ESReactionMix10µL、EasyScript®RT/RIEnzymeMix1µL、gDNARemover1µL、RNA模板2µL、RNase-freeWater5µL。反应条件为：42℃水浴15min，85℃水浴5sec。-20℃保存反转录后的cDNA。1.2.6.3引物设计与合成根据GenBank中目的基因的DNA序列利用PrimerPremier5.0软件设计引物，并经由BLAST比对引物序列，合成最为合适的引物。以β-actin为内参，引物序列如表1-4所示。1.2.6.4RT-PCR扩增将β-actin作为内参基因，通过RT-PCR技术相对定量检测上述基因的表达量。反应体系总体积20μL：ForwardPrimer（10μM）0.4μL，ReversePrimer（10μM）0.4μL，2×TransStartTipGreenqPCRSuperMix（+DyeI）10.0μL，cDNA2.0μL，ddH2O7.2μL。扩增条件：94℃，30sec；94℃，5sec；60℃，30sec，40个循环。熔解曲线分析并－ΔΔCT鉴定引物特异性：95℃15sec，60℃1min，95℃15sec。数据通过2法计算相关基因mRNA的转录水平，并通过SPSS17.0分析差异性。表1-4荧光定量的引物序列Tab1-4PrimersusedintheReal-timePCR基因名称引物序列（5´-3´）产物长度/bpGenenameSequence（5´-3´）Productsize（bp）F：GGTGCTGTTCTGCTACTTGGTCTCMME167R：GTCTGACTGTGACGCTCTTCCTTGF：CAGATGGCAACATGGAGGTCACCPTGDS193R：GTTCCTCTTCTCGCACTGTTCACCF：TGCGTGACATCAAGGAGAAGβ-actin111R：GACCATCAGGGAGTTCATAGC17 2结果与分析2.1ompT缺失株及回复株的鉴定2.1.1导入pkD46质粒的菌株鉴定将质粒pKD46电转入AE17菌株中，并通过AE17鉴定引物AE17-F/AE17-R、pKD46鉴定引物pKD46-F/pKD46-R和ompT内侧引物ompT-in-F/ompT-in-R进行PCR鉴定，分别扩增出大小为1023bp，888bp，120bp的目的片段，结果如图2-1所示。图2-1pKD46质粒PCR鉴定Fig2-1IdentificationofpKD46byPCRM：DNA分子质量标准；1.以AE17-F/AE17-R为鉴定引物，转入pKD46质粒的AE17扩增出1023bp的目的片段；2.以pKD46-F/pKD46-R为鉴定引物，AE17能扩增出888bp的目的片段；3.以ompT-in-F/ompT-in-R为鉴定引物，转入pKD46质粒的AE17能扩增出120bp的目的片段；4.阴性对照M:2000bpDNAmarker;1.AE17-F/AE17-RPCRamplification(1023bp);2.pKD46-F/pKD46-R,PCRamplification(888bp);3.ompT-in-F/ompT-in-R,thePCRamplificationofsecondcrossingover;4.Negativecontrol2.1.2导入ompT-pKD3片段的菌株鉴定将ompT-pKD3片段电转导入含pKD46质粒的AE17菌株中，通过ompT-out-F/ompT-out-R、ompT-in-F/ompT-in-R两对引物鉴定，由图2-2可知ompT-pKD3片段已导入含pKD46质粒的大肠杆菌菌株中。2.1.3禽致病性大肠杆菌ompT缺失株的构建电转pCP20质粒于同源重组菌AE17ΔompT-cat中，电转入pCP20质粒的目的是用于去掉Cm抗生素抗性基因片段。通过ompT内侧和外侧引物PCR鉴定菌株，结果表明已成功构建了ompT缺失株ΔompT（图2-3）。18 图2-2同源重组菌AE17ΔompT-cat的PCR鉴定Fig2-2IdentificationofAE17ΔompT-catdeletionbyPCRM：DNA分子质量标准；1.以ompT-out-F/ompT-out-R为引物，AE17扩增出2427bp的目的片段；2．以ompT-out-F/ompT-out-R为引物，同源重组菌AE17ΔompT扩增出2566bp的目的片段；3.阴性对照；4.以ompT-in-F/ompT-in-R为鉴定引物，AE17能扩增出120bp的目的片段；5.以ompT-in-F/ompT-in-R为鉴定引物，同源重组菌AE17ΔompT扩增不出目的片段；6.阴性对照M:5000bpDNAmarker;1.ompT-out-F/ompT-out-R,PCRamplification(2427bp);2.ompT-out-F/ompT-out-R,PCRamplification(2566bp);3.ompT-in-F/ompT-in-R,PCRamplification(120bp);4.ompT-in-F/ompT-in-R,PCRamplification(120bp);5.UsingompT-in-F/ompT-in-Rastheidentificationprimer,homologousrecombinantstrainAE17ΔompTcouldnotbeamplified;6.Negativecontrol图2-3缺失株AE17ΔompT的PCR鉴定Fig2-3IdentificationofAE17ΔompTdeletionbyPCRM：DNA分子质量标准；1.以ompT-out-F/ompT-out-R为引物，AE17扩增出2427bp的目的片段；2．以ompT-out-F/ompT-out-R为引物，缺失株AE17ΔompT扩增出1553bp的目的片段；3.阴性对照；4.以ompT-in-F/ompT-in-R为鉴定引物，AE17能扩增出120bp的目的片段；5.以ompT-in-F/ompT-in-R为鉴定引物，缺失株AE17ΔompT扩增不出目的片段；6.阴性对照M:5000bpDNAmarker;1.UsingompT-out-F/ompT-out-Rprimers,AE17amplifiedthetargetfragmentof2427bp;2.UsingompT-out-F/ompT-out-Rastheprimer,thetargetstrainof1553bpwasamplifiedfromthedeletionstrainAE17ΔompT;3.Thenegativecontrol;4.TheidentificationprimerwasompT-in-F/ompT-in-R.,AE17canamplifya120bptargetfragment;5.UsingompT-in-F/ompT-in-Rasanidentificationprimer,andthedeletionstrainAE17ΔompTcannotamplifythetargetfragment;6.Negativecontrol19 2.1.4ompT回复株的鉴定将酶切后的EcorI-ompT-HindIII片段和pSTV-28质粒片段通过T4连接酶连接后使用化学转化的方法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，抽提阳性转化子中的质粒，将质粒电转入ΔompT中，挑取阳性转化菌株通过M13-R/M13-F、ompT-out-F/ompT-out-R、ompT-in-F/ompT-in-R三对引物鉴定，结果显示ΔompT-comp回复株成功构建，如图2-4。图2-4PCR鉴定基因回复株Fig2-4PCRanalysisofcomplementationstrainsM：DNA分子质量标准；1.以M13-R/M13-F为引物，回复株ΔompT-comp扩增出1059bp的目的片段；2．以ompT-out-F/ompT-out-R为引物，回复株ΔompT-comp扩增出1553bp的目的片段；3.以ompT-in-F/ompT-in-R为引物，回复株ΔompT-comp扩增出120bp的目的片段。M:5000bpDNAmarker;1.TheM13-R/M13-Fprimerswereusedtoamplifythetargetfragmentof1059bp;2.TheompT-out-F/ompT-out-Rprimerswereusedtoamplifythetargetfragmentof1553bp;3.TheompT-in-F/ompT-in-Rprimerswereusedtoamplifythetargetfragmentof120bp.2.2ompT缺失株和回复株生物学特性及致病性分析2.2.1生长曲线的测定结果通过对AE17、ΔompT和ΔompT-comp三株菌的生长曲线测定，结果表明，ompT的缺失没有明显影响AE17在LB液体中的生长速率（图2-5）。图2-5生长曲线的测定Fig2-5Determinationofgrowthcurve20 2.2.2运动性测定结果通过游标卡尺测量野生株、缺失株及回复株的运动直径，得到三株菌的运动直径如图图2-6和图2-7所示。测量结果说明，缺失ompT基因后，并未明显影响大肠杆菌的运动性。ABC图2-6运动性能力的检测Fig2-6Bacterialmotilityassay注：A：AE17组；B：ΔompT组；C：ΔompT-comp组Note：A:BacterialmotilityassayofAE17；B:BacterialmotilityassayofΔompT；C:BacterialmotilityassayofΔompT-comp图2-7运动性能力的检测Fig2-7Bacterialmotilityassay2.2.3环境耐受试验结果试验结果显示，54℃热作用后，AE17、ΔompT、ΔompT-comp的存活率分别为：10.34%、4.66%、6.81%，说明AE17、ΔompT、ΔompT-comp三株菌的存活率存在极显著差异（p<0.01），表明ompT基因的缺失降低了菌株对热应激的抗性（图2-8A）；在pH=5的醋酸LB培养基中，AE17、ΔompT、ΔompT-comp存活率分别为：4.62%、24.90%、4.07%，说明AE17、ΔompT、ΔompT-comp三株菌的存活率存在明显差异，结果表明ompT基因的缺失增加了菌株对酸的抗性，缺失株对酸性环境的抵抗力较野生株提高了5.39倍(p<0.01)（图2-8B）；在pH=10的Tris-Hcl中，AE17、ΔompT、ΔompT-comp存活率分别为：8.83%、4.46%、4.04%，结果表明ompT基因降低了对碱的抗性，21 缺失株对碱性环境的抵抗力较野生株降低了1.98倍(p<0.05)（图2-8C）。因此得出结论，与AE17相比，ΔompT对热的抵抗力降低，对酸的抵抗力增强，对碱的抵抗力减弱。图2-8不同环境压力下的细菌平均存活率Fig2-8Bacterialsurvivalratesindifferentenvironmentalstress2.2.4药敏试验结果将AE17、ΔompT、ΔompT-comp三株菌37℃培养18-24h后，可通过肉眼观察到抑菌圈，通过游标卡尺对抑菌圈直径进行测量，数据显示ompT基因的缺失并未影响菌株对多粘菌素B、磷霉素、头孢曲松、头孢喹肟这4种抗生素的敏感性(p>0.05)，如图2-9所示。图2-9APEC对抗生素的敏感试验结果Fig2-9SensitivetestresultsofAPEConantibiotics.22 2.2.5鸡巨噬细胞吞噬试验结果将AE17、ΔompT、ΔompT-comp三株菌分别与鸡巨噬细胞HD-11相互作用后，将细胞充分裂解后，采用平板计数法对菌株计数，抗吞噬结果显示1h后HD-11细胞吞噬的细菌量分别为：4.33×106cfu、4.27×106cfu、4.57×106cfu(p>0.05)。结果表明，与野生株相比，ompT缺失株对HD-11细胞抗吞噬能力差异不显著（图8）。图2-10HD-11对大肠杆菌的吞噬试验结果Fig2-10TheresultsofHD-11'sphagocytosistestforEscherichiacoli2.2.6细菌半数致死量（LD50）的测定运用寇氏法对三株菌感染7日龄雏鸡后的试验数据进行计算统计结果显示：AE17组、ΔompT组和ΔompT-comp组的LD4cfu、7.499×105cfu和3.162×10550分别为7.499×10cfu。与AE17相比，ompT基因的缺失使得雏鸡致病力降低了10倍。结果如表2-1所示。表2-1ompT基因缺失对APEC致病性（LD50）的影响Tab2-1TheLD50ofwildstrain,deletionstrainandcomplementaryon7daysoldchick组别攻毒剂量(cfu)LD50（cfu）1*1081*1071*1061*1051*1041*103PBSAE17组8/88/88/84/81/80/80/87.499×104ΔompT组8/88/85/80/80/80/80/87.499×105ΔompT-comp组8/88/85/83/80/80/80/83.162×10523 2.2.7组织载菌量试验根据试验结果表明，相同剂量的AE17，ΔompT，ΔompT-comp感染雏鸡的肺脏组织载菌量分别是107.18，105.66，106.88(p<0.01)，cfu/g（图2-11A）；相同剂量的AE17，ΔompT，ΔompT-comp感染雏鸡的肝脏组织载菌量分别是108.08，105.22，106.94(p<0.01)，cfu/g（图2-11B）；相同剂量的AE17，ΔompT，ΔompT-comp感染雏鸡的脾脏组织载菌量分别是108.07，106.49，108.09，cfu/g(p<0.01)（图2-11C）。表明ompT基因缺失后使得菌株在肺、肝、脾组织中的定植下降。图2-11不同菌株体内感染情况Fig2-11Theinfectionsofdifferentbacterialinvivo2.2.8APEC感染雏鸡空肠组织病理切片观察采集7日龄雏鸡感染APEC、ΔompT、ΔompT-comp菌株的空肠组织和注射PBS后对照组的空肠组织制备HE石蜡切片，组织病理学观察结果显示，感染APEC、ΔompT、ΔompT-comp菌株的空肠组织绒毛中心轴红细胞增多，空肠绒毛上皮组织出现脱落现象(图2-12)。2.3RNA-Seq数据处理与分析2.3.1RNA-Seq数据预处理结果通过过滤RawReads中不合格及低质量的序列得到CleanReads后发现AE17菌株获得的CleanReads占TotalReads达95.96%以上，ΔompT菌株所占比例达96.28%以上，具体结果见表2-2。表2-2数据预处理结果统计Tab2-2Statisticsofdatapreprocessingresults样品名称所有片段纯净序列比例SamplesTotalReadsCleanReadsCleanRatioAE17145508241396286595.96%ΔompT160006321540478696.28%24 ABCD图2-12空肠组织病理切片图Fig2-12HistopathologicexaminationofthechickenjejunaltissuespostAPECinfection注：A、B、C、D分别为AE17攻毒组、ΔompT攻毒组、ΔompT-comp攻毒组、PBS组空肠组织(HE染色,400×)；Note：A,B,C,DwerejejunaltissueofAE17strainsinfectedgroup,ΔompTstrainsinfectedgroup,ΔompT-compstrainsinfectedgroupandcontrolgroup(HE,400×).图2-13AE17菌株与ΔompT菌株差异基因散点图Fig2-13DifferencesingenescatterplotofompTgroupandAE17group注：红色表示上调差异基因，蓝色表示下调差异基因，灰色表示无差异基因Note：Redshowstheraisingofgeneexpression,blueshowsthedecreaseofgeneexpression,grayshowsthereisnodifferenceofgeneexpression25 2.3.2AE17菌株与ΔompT菌株基因组比对结果将所得到的Reads与鸡的参考基因E.coliAPECO2-211比对后发现Mapping到基因组上的结果分别为93.98%和93.04%（表2-3）。表2-3AE17菌株与ΔompT菌株基因组比对结果Table2-3ComparisonofgenomesbetweenAE17andΔompTstrains样品名称所有片段比对上的片段比对上片段的比例SamplesAllreadsMappedreadsMappingratioAE17135923701277442193.98%ΔompT149607421391885793.04%2.3.3AE17菌株与ΔompT菌株差异基因筛选以Fold-change≥2且q-value≤0.05为标准筛选差异基因，共筛选差异基因490个，包括上调365个和下调125个（图2-13），部分差异基因见表2-4。表2-4部分差异表达基因Tab2-4Partofthedifferentiallyexpressedgenes基因符号基因描述ompT/AE17差异倍数GeneSymbolDescriptionFoldchangefliYcystineABCtransportersubstrate-bindingprotein7.42ompFoutermembraneproteinF2.76ibeTtransporter2.81aphAdiadenosinetetraphosphatase2.13motBflagellarmotorproteinMotB2.95rfaQlipopolysaccharidecoreheptosyltransferase2.91flgKhook-filamentjunctionprotein2.85cheAchemotaxisproteinCheA3.23ycgRflagellarbrakeproteinYcgR3.24irp2yersiniabactinbiosyntheticprotein0.49asnCDNA-bindingtranscriptionaldualregulator0.38lpxKLpxK0.42kspU3-deoxy-manno-octulosonatecytidylyltransferaseKpsU0.462.3.4AE17菌株与ΔompT菌株差异表达基因的GO功能分类对筛选出的差异基因进行GO（GOontology）功能分类，结果表明，注释到GO数据库的差异基因共有192个，得到48个GO功能注释，涉及分子功能(Molecular26 function,MF)、细胞组分(Cellularcomponent,CC)及生物学过程(Biologicalprocess,BP)3大功能。其中，在生物学过程方面，共发现25个（52.1%）；分子功能方面，共发现16个（33.3%）；细胞组分方面，共发现7个（14.6%），如图2-14所示。在生物学过程方面，显著性GO功能分析结果显示主要涉及铁离子稳态、裂解酶活性、肽聚糖生物合成过程、细胞形态调控等生物学过程。cellularcomponentbiologicalprocessmolecularfunction图2-14差异表达基因的GO功能分类Fig2-14GOfunctionalclassificationofdifferentiallyexpressedgenes图2-15AE17菌株与ΔompT菌株差异基因的KEGG功能分类Fig2-15KEGGfunctionalclassificationofdifferentiallyexpressedgenesbetweenAE17andΔompTstrains27 2.3.5AE17与ΔompT菌株差异基因的KEGG信号通路功能分类KEGG信号通路结果显示，被注释的差异基因有229个，共涉及112个信号通路，包括上调的通路62个，下调的通路7个，既有上调又有下调的信号通路7个。在生物学过程方面，显著性KEGG功能分析结果显示主要涉及细菌趋化性、生物膜形成、鞭毛装配、脂多糖生物合成等通路，如图2-15和表2-5所示。表2-5野生株与缺失株差异基因显著性富集的通路Tab2-5ThewildstrainsandtheΔompTstrainsdifferentiallyexpressedgenessignificantlyenrichedpathways序号通路ID通路基因数NO.PathwayIDPathwayGenenumberLipopolysaccharidebiosynthesis1ko005405脂多糖生物合成Flagellarassembly2ko0204011鞭毛装配Bacterialsecretionsystem3ko030707细菌分泌系统Quorumsensing4ko0202410群体感应Biofilmformation5ko020255生物膜形成Bacterialchemotaxis6ko020307细菌趋化性Biosynthesisofantibiotics7ko0113041抗生素的生物合成Drugmetabolism8ko009823药物代谢Monobactambiosynthesis9ko002613单环β-内酰胺的合成Two-componentsystem10ko0202018双组分体系2.3.6RT-PCR验证差异基因为验证RNA-Seq结果是否可靠，本试验从RNA-Seq结果中随机选取8个基因用于RT-PCR的验证，并通过SPSS17.0软件对RT-PCR与RNA-seq的结果进行皮尔森28 （pearson）相关系数分析，RT-PCR结果与RNA-seq结果的皮尔森（pearson）相关系数为r=0.822，p=0.012，说明RNA-seq中的差异基因与RT-PCR中验证的差异基因变化趋势是一致的（表2-6和图2-16）。表2-6RNA-seq与RT-PCR基因表达比较Tab2-6ThecomparisonofgeneexpressionlevelbetweenRNA-seqandRT-PCRRNA-seqRT-PCRGeneSymbolDescription（ΔompT/AE17）（ΔompT/AE17）fliYcystineABCtransportersubstrate-bindingprotein5.346.47ompFoutermembraneproteinF3.241.73ibeTtransporter2.811.98aphAdiadenosinetetraphosphatase2.132.93motBflagellarmotorproteinMotB2.081.68rfaQlipopolysaccharidecoreheptosyltransferase2.071.67cheAchemotaxisproteinCheA2.304.01irp2yersiniabactinbiosyntheticprotein0.350.45图2-16RNA-seq与RT-PCR差异表达基因的验证Fig2-16VerificationofdifferentiallyexpressedgenesinRNA-seqbyRT-PCR注：正数表示基因上调倍数，负数表示基因下调倍数Note：Positivenumbersindicateup-regulatedgenemultiplesandnegativenumbersindicatedown-regulatedgenemultiples2.4AE17与ΔompT感染雏鸡空肠炎症相关基因转录水平的检测2.4.1空肠中PTGDSmRNA转录水平的检测建立AE17与ΔompT感染雏鸡的模型，利用RT-PCR对被感染雏鸡的空肠炎症相关基因PTGDS在mRNA转录水平上进行检测。由图2-17发现，不同时间段不同组29 别间PTGDSmRNA含量存在差异，且不同时间段间PTGDSmRNA含量呈一定的规律性。攻毒12h、24h和48h后缺失株攻毒组的PTGDS基因mRNA的表达量较AE17攻毒组显著降低（p<0.01或p<0.05），攻毒12h、24h后PTGDS基因mRNA的表达量高于0h、48h和72h。图2-17鸡空肠中PTGDSmRNA转录水平的检测Fig2-17DetectionofPTGDSmRNAtranscriptioninjejunumofchicken2.4.2空肠中MMEmRNA转录水平的检测建立AE17与ΔompT感染雏鸡的模型，利用RT-PCR对被感染雏鸡的空肠炎症相关基因MME在mRNA转录水平上进行检测。由图2-18发现，不同时间段不同组别间MMEmRNA含量存在差异，且不同时间段间MMEmRNA含量呈一定的规律性。攻毒12h后，所有攻毒组的MME基因mRNA的表达量较0h显著降低；攻毒24h、48h后缺失株攻毒组的MME基因mRNA的表达量较AE17攻毒组显著降低（p<0.01或p<0.05）。图2-18鸡空肠中MMEmRNA转录水平的检测Fig2-18DetectionofMMEmRNAtranscriptioninjejunumofchicken30 3讨论APEC导致的禽大肠杆菌病被公认为是影响世界范围内养禽业的主要细菌性疾病，给养禽业带来重大的经济损失。近年来越来越多的研究表明很多毒力基因通过对外膜中的脂多糖进行修饰或编码相关的蛋白酶来增强细菌的毒力。OmpT水解酶是宿主-致病菌相互作用中的关键毒力因子。现如今已经有许多研究人员对OmpT进行了研究，但多集中于晶体空间构象、酶活性中心位点、底物识别的序列等与酶相关的研究方面，但关于OmpT作为一个毒力因子是否能够通过影响一些毒力基因的表达来影响细菌对宿主的感染，尤其是在APEC中所起的作用及其与宿主之间互作中所扮演的角色还研究甚少。通过对APEC毒力基因进行功能的研究对禽大肠杆菌病的防治及诊断有极其重要的意义。3.1ompT基因缺失株、回复株的构建及其对生物学和致病性的影响Red重组技术是通过噬菌体Red重组酶将两端含有同源重组序列的DNA片段与基因组上的靶序列发生基因重组和替换[64]。本研究通过该技术成功构建了AE17的ompT缺失株ΔompT，并利用pSTV-28质粒成功构建了ompT基因回复株ΔompT-comp。ΔompT与AE17的生长速率相似，由此可知，ompT基因的缺失对细菌的生长速率无明显的影响。曾有研究表明ompT基因缺失后的大肠杆菌的生长速度与野生株的差异不显著，该研究与本试验的结论一致[30]。ΔompT与AE17在运动性能上差异不显著，提示ompT基因的缺失没有显著影响大肠杆菌的运动性。ompT基因的敲除导致APEC耐酸性增加，有可能ompT基因的缺失导致有关耐酸性基因的高表达，调节酸性耐受系统以适应恶劣环境。试验结果表明ompT对细菌碱性耐受力，热应激也都有一定的影响。ompT基因的敲除并未直接影响多粘菌素B、磷霉素、头孢曲松和头孢噻肟4种作用于病原菌细胞壁和细胞膜上的抗生素对APEC的杀菌作用。抗生素与细菌的互作过程是一个复杂的过程，而OmpT与LPS相互作用过程中可能并未直接影响到抗生素对细菌的杀灭作用。OmpT与TraT蛋白的形成相关，而TraT有增强APEC抵抗吞噬的功能[65]，而本研究中发现缺失ompT基因后并未影响鸡巨噬细胞HD-11对禽大肠杆菌的吞噬作用。表明APEC中ompT基因并未直接影响病原菌抗吞噬作用。通过测定组织载菌量来检测黏附定植于组织中的病原菌数量。白灏发现敲除luxS的APEC在雏鸭组织中载菌量明显减少[66]。本研究中敲除ompT后，肝、肺、脾组织中的载菌量下降，说明ompT影响病原菌对组织的黏附作用，可能缺失ompT基因后导致病原菌在机体中的黏附性下降，黏附有利于病原菌在宿主中的定殖，进而引起感染。本研究结果提示敲除ompT很可能导致APEC的致病力降低。有研究表明31 ompT基因缺失后导致肝、脾、肺、肾的带菌量明显减弱，该研究与本试验的结论一致[38]。当病原菌感染宿主时，量化的指标能够准确直观地对致病菌的毒力进行描述[67]。AE17和ΔompT菌株的半数致死量LD50的测定结果显示：ΔompT菌株的LD50显著低于AE17，说明ompT基因的缺失降低了AE17对机体的致病力，原因一方面可能是ompT的缺失导致细菌降解宿主分泌的抗菌肽能力降低，另一方面可能是由于ompT基因的缺失导致细菌外膜结构的不稳定，黏附能力下降，使得细菌定植于组织的能力减弱，降低了AE17的致病性，还有可能是由于ompT的缺失影响AE17中其他毒力基因的表达，但ompT在APEC中的影响毒力相关基因的具体机制和对机体致病力影响的具体机制还需进行更深入的研究探讨。3.2运用RNA-Seq筛选ompT基因缺失株差异表达基因RNA-Seq技术是根据将RNA反转录成cDNA的序列测出来的方法衡量各个基因的转录表达水平。如今RNA-Seq测序技术用于筛选致病菌中的差异基因已经非常普遍。徐丽通过RNA-Seq发现肺炎克雷伯菌KbvR调控304个基因转录，并且这些受调控的基因包括与荚膜、I型菌毛合成相关的基因等[68]。苏山春基于RNA-Seq技术共筛选获得鼠疫耶尔森氏菌的sRNAs104个，其中新发现78个，已注释过的26个[69]。王立贵基于RNA-Seq技术共发现福氏志贺菌中sRNA717条，并对新发现中的10条sRNA进行靶标的预测，猜测RNAsf46、sf69、sf80可能参与致病菌的毒力调控[70]。本试验中基于根据RNA-Seq测序结果共筛选差异基因490个，包括上调365个和下调125个，并筛选出fliY、ompF、ibeT、aphA、motB、rfaQ、flgK、cheA、irp2、ycgR、lpxK、kpsU、asnC等与毒力相关的差异表达基因。外膜蛋白OmpF与病原菌的药物耐受性、抵抗酸的能力等生理功能有着极其密切的关系[71]。本研究结果显示缺失ompT后AE17抗酸性增加，而基于RNA-Seq分析发现ompF的表达量升高，猜测可能是高表达的OmpF导致缺失株ΔompT的抗酸性高于野生株AE17。病原菌的运动性在病原菌感染宿主并导致机体致病等方面扮演着重要角色。本研究中结果显示fliY、motB、flgk、ycgR这几个与鞭毛相关的基因为上调基因，其中FliY为病原菌鞭毛马达开关蛋白(flagellarmotorswitchprotein)，motB基因对细菌鞭毛的固定起着重要作用，FlgK蛋白构成是鞭毛钩状体的一部分，且在组装中起作用，有研究表示这三个基因的缺失均导致细菌的黏附力下降，毒力下降，致病力减弱[72-74]。而ycgR基因属于鞭毛制动蛋白，YcgR能够和鞭毛的运动蛋白进行互相作用来阻止鞭毛的运动速率[75]。本研究中缺失ompT后并未明显影响细菌的运动性，可能是YcgR与鞭毛运动蛋白MotB、Flgk、YcgR的相互作用后的结果。AsnC是一个可以调控毒力基因的蛋白，有研究表明缺失asnC后的布鲁氏菌的毒力降低[76]。本研究中ompT缺失后asnC基因下调，提示asnC可能导致ompT缺失株毒力下降的一个因素。rfaQ基因参与LPS核32 心的生物合成，而LPS是内毒素的生物学活性成分，细菌缺乏LPS后毒力会变小。有文献报道，rfaQ基因的敲除导致LD[77]50的升高，缺失后使致病菌的毒力显著降低。类脂A是LPS的关键成分，而LpxK是一种合成类脂A早期的关键酶[78]。类脂A可以帮助细菌抵抗如抗生素等不利的外部因素[79]，有利于细菌存活。在本研究中，缺失ompT后，rfaQ表达上调，而lpxK下调，提示在APEC中，ompT与LPS相互作用的同时，ompT影响与LPS组成成分相关基因的表达。KpsU属于Kps基因簇，而Kps基因簇编码荚膜多糖的合成及其在细胞中的表达[80]。荚膜多糖有助于病原菌之间或病原菌与细胞表面间的黏附作用，从而利于病原菌定植[81]。在本研究中，缺失ompT后，kpsU基因下调，提示AE17可能通过下调kpsU基因的表达来减弱细菌对组织细胞的黏附定植作用，从而使得ompT缺失株在肝、脾等组织的定植率弱于野生株AE17。本研究基于RNA-Seq发现敲除ompT后引起APEC毒力相关基因的差异表达，提示ompT影响细菌的毒力可能通过影响毒力相关基因的的表达来完成的，分析这些毒力相关差异表达基因对深入探讨ompT毒力基因的致病机理起着关键作用。3.3AE17及其ompT基因缺失株对雏鸡空肠炎症相关基因表达的影响小肠既是机体消化、吸收至关重要的场所，也是阻止病原菌侵袭宿主的一道防御屏障，肠上皮屏障的破坏使得病原微生物进入到肠道固有层，激活肠道中的免疫细胞并引发炎症反应。革兰氏阴性菌中的LPS通过损伤鸡肠道黏膜并破坏其上皮组织促使APEC进入机体的循环系统，引发机体的炎症反应及免疫应答，诱导小肠炎症与免疫应答基因的防御性表达。有研究发现OmpT能够诱导炎症反应和凝血反应。前列腺素D合酶（prostaglandinD2synthase，PTGDS）参与花生四烯酸(arachidonicacid，AA)代谢通路，花生四烯酸(arachidonicacid，AA)代谢酶异常的表达水平与高血压，炎症等多种心血管疾病紧密相关。花生四烯酸代谢产物间的平衡对于机体的功能及疾病的发生发展极其重要，因为花生四烯酸代谢产生多种生物活性脂质代谢产物，并在多种疾病中的炎症过程起着重要作用，所以花生四烯酸特异性代谢产物水平的异常可能提示机体对于外界刺激或基因干预的应答反应。有学者发现AA能够使内皮细胞DNA的甲基化程度降低，进而促进内皮细胞的趋化作用和血管的新生作用[82,83]。由于血管内皮细胞具有活跃的内分泌及代谢功能，因此在维参与管壁的炎症与修复、持正常的血液流动和调控管壁的张力等过程中扮演着重要角色。PTGDS催化产生的代谢产物前列腺素PGD2在临床病理生理过程中根据结合受体的不同而发挥促炎或者抗炎的生物学效应。AA的多种代谢产物参与炎症过程。AA主要通过COX代谢成为具有生物活性的二十烷酸，而COX通路主要参与炎症反应。有研究通过体内试验已经证实，PTGDS表达水平的上调可以增加COX通路相应代谢产物的浓度，33 进而激活参与介导的内皮细胞。本试验中利用RT-PCR对攻毒后的雏鸡空肠进行PTGDSmRNA的含量的检测。结果发现，攻毒后空肠中PTGDSmRNA的含量明显高于对照组，提示机体对于病原菌的刺激的应答反应，由于病原菌的刺激，导致机体发生炎症反应。攻毒后空肠中PTGDSmRNA表达的差异性说明APEC感染雏鸡后很可能可以诱导机体发生炎症反应，并且空肠参与了炎症反应。MME，即膜金属肽链内切酶(membranemetallo-endopeptidase，MME)，又称脑啡肽酶(enkephalinase，NEP)，是体内最重要的降解Aβ蛋白活性的主要肽酶，Aβ是淀粉样前体蛋白(APP)的一种降解产物，Aβ的积累引发炎症级联反应[84]。有研究发现抑制MME会促进神经源性炎症的发展，如促进降钙素基因相关肽的释放[85]。Aβ能够直接或间接地激活小胶质细胞中的NF-κB转录因子，进而释放产生的炎症因子加重炎症反应，造成机体进一步损伤。越来越多的研究表明，MME能有效抑制参与炎症、凋亡等细胞功能调控的AKT的表达[86]，MME表达的下调，引起Aβ的集聚，从而激活AKT/NF-κB信号通路[87]。MME还可以诱导生成血管抑素的能力最强，可以明显抑制新生微血管内皮细胞的增殖和分化。相关研究表明，MME可能参与了许多脏器疾病病理发生的过程，包括炎症应答[88]、肠道炎症[89]、肾炎[90]等多种疾病。Aβ是APP经分泌酶降解产生的一种多肽，免疫因素的影响则是一方面通过细胞因子影响APP的产生和代谢，如白介素-1可刺激APP的合成并促进其裂解为Aβ，生长转化因子β诱导Aβ的聚集启动并促进的形成，γ-干扰素和肿瘤坏死因子-ɑ结合可诱导APP的产生和代谢，促进Aβ的生成[91]。Aβ是主要的促炎症性反应的前成分。Aβ能激活细胞中NF-κB转录因子，产生炎性因子。本试验中利用RT-PCR对攻毒后的雏鸡空肠进行MMEmRNA的含量的检测。结果发现，攻毒12h内空肠中MMEmRNA的含量显著降低，说明可能是因为APEC感染机体后由于APEC的大量增殖导致MME表达的降低，MME酶活性也随之降低，减弱了Aβ蛋白的降解速度，从而使得Aβ蛋白在机体中的聚集，进而引发炎症反应。攻毒12h后MMEmRNA含量又显著增加，提示机体可能正在进行杀灭抵抗细菌，上调MME活性及表达，可以减少并清除Aβ的沉积，减轻了Aβ积累对细胞造成的损伤作用，很可能此时炎症反应正在慢慢消减。本试验中，AE17攻毒组PTGDS及MMEmRNA的含量基本高于同时间点的ΔompT攻毒组，说明AE17菌株中ompT的缺失影响机体的炎症反应，猜测OmpT可能可以帮助病原菌诱导机体的炎症反应。本试验仅从转录水平对OmpT影响细菌感染机体后的炎症反应，但具体蛋白水平是否有影响还需进一步研究。34 4结论1.成功构建了ompT基因缺失株和回复株，ompT基因的缺失导致耐酸性增强，耐碱性、耐热性降低，肝脏、脾脏、肺脏载菌量减少，引起毒力相关基因的表达变化，ompT基因的缺失可能降低菌株的毒力。2.攻毒APEC引起雏鸡空肠炎症相关基因PTGDS、MMEmRNA的表达水平的变化，且菌株缺失ompT后影响空肠炎症相关基因PTGDS、MMEmRNA的表达，提示ompT的缺失可能降低菌株的致病力。35 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作者简介一、个人基本情况王琦，女，汉族，中共预备党员，1991年8月出生，籍贯为河北省张家口市二、教育及工作经历2011.09—2015.06安徽农业大学动物科技学院动物医学专业，农学学士2015.09—2018.06安徽农业大学动物科技学院基础兽医学专业，农学硕士三、攻读本学位期间发表的学术论文1.王琦,祁克宗*,涂健,等.APEC感染雏鸡小肠炎症相关基因的RNA-Seq分析[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2017,45(8):23-28.2.涂健,张煜,李春晓,薛媚,王琦,祁克宗*.基于非标记定量蛋白质组学技术研究RyhB调控禽致病性大肠杆菌酸性耐受力[J].中国预防兽医学报,2017,39(8):616-620.3.徐柳柳,祁克宗*,涂健,宋祥军,薛媚,王琦.基于RNA-Seq筛选APEC及其PhoP/Q缺失株感染雏鸡肠道免疫相关基因[J].基因组学与应用生物学:1-8.4.汪凯,王琦,潘玲*,等.禽大肠杆菌毒力岛主要摄铁基因及生物膜的检测[J].安徽农业大学学报,2016,43(1):47-50.43