替米沙坦治疗早期糖尿病肾病前后血尿NGAL的变化

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中文摘要1背景目的糖尿病肾病(DN)是糖尿病（DM）常见和严重的慢性微血管并发症之一，危害极大。目前临床上常用的实验室指标大都是以反映肾小球损伤为主，在诊断早期DN发生上存在各种各样的局限性，较难及时发现早期肾脏损伤。中性粒细胞脂质酶相关载脂蛋白（NGAL）作为一种新的肾小管炎性标志物，在诊断急、慢性肾病（AKI、CKD）发生和病情判断上的价值和作用近年来备受关注。DN是最常见的CKD之一，与NGAL的关系也是备受瞩目，近两年开始有国外学者报道。但是，在DN各个分期中，血、尿NGAL变化以及干预治疗后变化报道尚有争议，且NGAL变化的原因及机制也尚不清楚。本研究将病程5年以上、非大量蛋白尿的2型糖尿病肾病患者为研究对象，以健康人群作为实验对照组，检测基线DN患者血、尿NGAL蛋白水平并分析NGAL水平与其他常用肾功能指标的关系，ROC曲线分析探讨2型DN患者血、尿NGAL测定的临床意义。同时观察替米沙坦随机治疗3或12个月前后血、尿NGAL的变化，分析干预治疗后NGAL变化的可能原因。2材料和方法2.1本研究收集2009-2010年汕头大学医学院第二附属医院住院及门诊符合1999年WHO糖尿病诊断标准的2型糖尿病患者，平均病程大于5年，根据尿白蛋白/肌酐比值（UACR）筛查出非大量蛋白尿2型糖尿病肾病患者（UACR≤300mg/g）72例，其中包括正常蛋白尿（DN1组）患者27例，微量蛋白尿（DN2组）患者45例，收集其相关临床资料；并设立健康对照组（NC组）35例。2.2基线监测：采用酶联免疫吸附技术（ELISA）对DN患者及健康人群血、尿NGAL进行检测；用放射性免疫法对患者尿液中微量白蛋白的排泄进行测定，计算出尿微量白蛋白，并用尿肌酐进行校正，求出UACR比值；检测其它肾功能指标（CysC、hsCRP、BUN、sCr、eGFR），运用相关性分析、线性回归分析和ROC曲线分析，分析探讨NGAL与这些肾功能I 指标的关系，对比它们在诊断疾病和评估病情的意义。2.3前瞻性干预对照研究：将非大量蛋白尿的2型糖尿病肾病患者72例随机分为普通组治疗组及替米沙坦治疗组。普通组治疗组给予常规的控制高血糖和高血压、调节血脂治疗，替米沙坦治疗组在普通治疗组的基础上每天口服替米沙坦80mg，疗程再随机分为持续3或12个月。治疗结束后再次收集所有患者的血、尿标本，重新检测并对比上述指标。3结果基线结果显示：（1）DN1组患者血NGAL较DN2和NC组明显升高（均为p<0.001）。DN2组与NC组对比无统计学差异；尿NGAL随着尿蛋白排泄的增加而增加，三组间对比差别具有统计学意义（均为p<0.001）。（2）DN2组的eGFR较DN1和NC组明显升高(p<0.05和p=0.000），后两者差别无统计学意义。（3）以NC+DN1作为体质变量，血NGAL=225.5ng/ml为分界值时AUC=0.96，灵敏性=92.6%，特异性=91.4%，明显优于其它肾功能指标,差别均有统计学意义；尿NGAL=46.00ng/ml为分界值时AUC=0.86，灵敏性=74.1%,特异性=88.6%。以DN1+DN2作为体质变量，尿NGAL=60.05ng/ml为分界值时AUC=0.79，灵敏性=95.6%，特异性=66.7%。随访干预结果显示：（1）替米沙坦治疗后DN组患者的血、尿NGAL均显著下降（均为p<0.001），其中12个月疗程的降幅明显大于3个月疗程的降幅。（2）替米沙坦治疗后DN2组的高滤过状态也明显改善（p=0.000），与基线NC组无统计学差异。（3）对比之下，只接受糖尿病治疗的DN患者，血NGAL降幅明显小于对应替米沙坦治疗组，尿NGAL的变化无统计学意义。（4）相关性分析显示：血、尿NGAL间及分别与其它肾功能指标存在密切相关，且相关性在DN不同分期表现不同，随干预治疗后病情变化而变化。4结论（1）在微量蛋白尿未出现的病程大于5年的2型DN患者，血、尿NGAL已明显升高，当血NGAL>225.5ng/ml和（或）尿NGAL>46.00ng/ml时应高度怀疑早期DN发生。同时尿NGAL随尿蛋白排泄增多而升高，可用于评估DN病情的进展。（2）微量蛋白尿患者eGFRII 明显升高，替米沙坦起肾脏保护作用，可改善患者高滤过状态，减少NGAL和尿蛋白排泄，其作用与疗程成正比。（3）肾小球滤过状态、肾小管重吸收功能、肾脏及肾外组织的分泌综合因素可能共同决定着不同DN时期血、尿NGAL的水平关键词中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白；糖尿病肾病；替米沙坦；ROC曲线；标志物本研究资金来源于广东省科技计划项目（2006B36005007）任务来源于汕头市重点科技计划项目（汕科府[2006]82号）III ABSTRACT1.BackgroundsandaimsDiabeticnephropathy(DN)isoneofseriousmicrovascularcomplicationswhichdoesgreatharmtodiabetespatients.Unfortunately,nowthelaboratoryindicatrixesmainlyreflectingglomeruluminjuryarenotsensitiveenoughtoillustrateearlychangeofrenalfunctionofpatientswithDN.Neutrophilgelatinase–associatedlipocalin(NGAL)isasmallsecreted25-kDamonomerofthelipocalinsuperfamilywhichhaspowerfulfunctionespeciallyinthephysiopathologicmechanismofkidney.Asoneofthemostpromisingnoveltubulartubularandinflammatorybiomarker,NGALhasemergedinclinicalandexperimentaldiagnosticfieldofacuteandchronicrenaldiseasesinthelastdecade.Meanwhile,moreandmoreattentionisconcentratedinthehottopicaboutNGALandDN.However,thechangeofNGALafterinterventionaltreatmentisstillcontroversialandthemechanismofNGALintheoccurrenceanddevelopmentofDNstillmeritsfurtherstudies.Inthisstudy,WedetectedthelevelsofsNGAL,uNGALandotherrenalfunctionparameters（CysC,hsCRP,BUN,sCr,eGFRandUACR）fromacohortof72type2diabetespatientswithnon-macroalbuminurieand35non-diabeticcontrolsubjects.Pearson/SpearmancorrelationtestandLinearregressionanalysiswereusedtoinvestigatetherelationshipbetweenNGALandotherparameterswhileROCcurveswereconstructedtoassessedtheclinicalvalueofNGALintype2DNpatients.Furthermore,asecondprospectivecontrolledtrialthattreatedwithtelmisartan80mgperdayforarandomtimelastingfor3or12monthscanhelptoexplorethemaincauseofNGALchange.2.MethodsInacross-sectionalstudy,weevaluatedthelevelsofsNGALanduNGALfromacohortof72type2diabetespatientswithnon-macroalbuminurie（inculding27normo-and45IV microalbuminuric,dividedaccordingtourinaryalbumin/urinarycreatininerate(UACR)and35non-diabeticcontrolsubjects.Furthermore,68patientsaccomplishedinasecondprospectivecontrolledtrial,and43ofthemweretreatedwithtelmisartan80mgperdaybasedongeneraldiabetestreatment(includingstandardstrategiesfordiabetes,hypertension,andhyperlipidemia),forarandomtimelastingfor3or12months.Fordoingthecomparion,theother25patientsonlyacceptedgeneraldiabetestreatmentfor12monthswithouttelmisartan.AssaysofsNGAL,uNGALandrenalparameterswererepeated.uNGALandsNGALwerequantifiedbyenzyme-linkedimmunosorbentassaymethod(ELISA)bothinthecross-sectionalandinterventionalstudy.RadioimmunoassaywasusedtomeasureurinaryalbuminwhileKineticJaffe’smethodwasusedtoassessurinarycreatinineinsterileurinefromearlymorningorrandomspotcollectionsofurine.Andtheratioofurinaryalbumintourinarycreatininewasobtainedtodividegroups.Meanwhile,differentstatisticalmethodswereusedtoanalyzedthecorrelationsbetweenNGALandotherclinicalparameters.3.ResultsInthecross-sectionalstudy,resultsindicatedthat:(1)sNGALinnormoalbuminuricswashigherthanmicroalbuminuricsandcontrols(bothp<0.001).Therewasnostatisticaldifferencebetweenthelattergroups.uNGALelevatedwithincreasingalbuminuria(allp<0.001).(2)eGFRelevatedstatisticallyinmicroalbuminuricscomparedwithnormoalbuminuricsandcontrols(p<0.05andp=0.000).(3)ROCcurveanclysissuggestedwhenusingcontrols+diabeticnormoalbuminuricpatientsasthestatusvariables,anoptimalsNGALcutoffof225.5ng/mLhadasensitivityof38.7%,specificityof81.5%,AUCof0.96,surpassedthantheotherparametersabove.uNGALcutoffof46.00ng/mlhadthesecondhighestAUCof0.86,sensitivityof74.1%,specificityof88.6%.Whenusingnormo-+microalbuminuricdiabeticpatientsasthestatusvariables,uNGALcutoffof60.05ng/mlhadthehighestAUCof0.79,sensitivityof95.6%,specificityof66.7%.Intheprospectiveinterventionalcontrolledtrial,resultsindicatedthat:(1)sNGALanduNGALevidentlydecreasedaftertelmisartantreatmentinbothtwodiabetesgroups（bothp<0.001），thedecreasingamplitudeof12monthsweremuchhigherthan3months.(2):ThehigheGFRlevelsreducedremarkably(p=0.000)aftertelmisartantherapy,andhadnoV statisticallydifferentfrombaselinecontrols.(3):Afteroneyeargeneraltreatmentwithouttelmisartaninmicroalbuminurics,sNGALalsodescendedinbothtwodiabetesgroups(bothp<0.05),butthedecreasingamplitudewasgreatlylowerthantelmisartantreatment.Incontrast,thechangesofuNGALhadnostatisticalsignificance.(4):Dependablityanalysis:ThereisastrongcorrelationbetweensNGALanduNGAL,andbothofthemwerecloselycorrelatedwithotherrenalfunctionparameters.ThecorrelationdifferedindifferentperiodofDNandchangedafterinterventionaltreament.4.Conclusion(1)sNGALanduNGALmightbeusefulmarkersinscreeningDN.sNGAL>225.5ng/mland/oruNGAL>46.00ng/mlinT2DMcoursebeyond5yearsmaybeanindicatroforDN.uNGALmightbemoremeaningfulinassessingrenalinjuryprogressionforitslevelsincreasingwithincreasingalbuminuria.(2)ThecontractionofsNGALmightberelatingtotheriseofeGFRintype2diabeticpatientswithmicroalbuminuricnephropathy.Telmisartanplaysanimportantrenoprotectiveroleinimprovingglomerularfiltrationandtubularreabsorption.Therefore,higheGFRregressedtonormalstatewhileexcretionofNGALandalbuminreducedcorrespondingly.(3)NGALiscyclingdynamicallyandhasfinalcomplicatedandchangedexpressioninserumandurine.Aseriesofcomprehensivefactorsincludingglomerularfiltration,tubularreabsorption,renalorextrarenaltissuessecretionmightdeterminesNGALanduNGALlevelsindistinctnephropathyperiods.Keywords:Neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,diabeticnephropathy,telmisartan,ROCcurve,biomarkerVI Abbreviations英文缩写注解中性粒细胞明胶酶相关脂质运载NGALNeutrophilgelatinase-associatedlipocalin蛋白DMDiabetesmellitus糖尿病DNDiabeticnephropathy糖尿病肾病ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附实验UACRurinaryalbumin/urinarycreatininerate尿白蛋白肌酐比CysCcystatinC半胱氨酸蛋白酶抑制剂ChsCRPhighsensitiveC-reactiveprotein高敏C反应蛋白BMIbodymassindex体重指数WHRWaist-hipRatio腰臀比SBPSystolicpressure收缩压DBPDiastolicpressure舒张压BUNBloodUreanitrogen血清尿素氮eGFRestimateglomerularfiltrationrate评估肾小球滤过率Crcreatinine肌酐FBGfastingbloodglucose空腹血糖HbA1CHemoglobinA1C糖化血红蛋白A1CTCTotalcholesterol总胆固醇TGTriglyeride甘油三酯HDLhighdensitylipoprotein高密度脂蛋白LDLlowdensitylipoprotein低密度脂蛋白WBCwhitebloodcell白细胞总数GRAN#Neutrophilicgranulocyte中性粒细胞计数ALTalanineaminotransferase谷丙转氨酶mlminilitre毫升ngnamogram纳克VII TRFTransferrin转铁蛋白TMBtetramethylbenzidine四甲基联苯胺VIII 目录中文摘要........................................................................................................................IABSTRACT................................................................................................................IVAbbreviations英文缩写注解.....................................................................................Ⅶ1．前言.........................................................................................................................12.研究内容与方法......................................................................................................42.1.研究内容........................................................................................................42.1.1.研究目的..............................................................................................42.1.2.研究对象..............................................................................................42.1.3.资料收集内容......................................................................................52.1.4.诊断标准..............................................................................................52.1.5.排除标准...........................................................................................................52.2.研究方法......................................................................................................62.2.1设备及试剂............................................................................................61.主要实验试剂.....................................................................................62.仪器与设备........................................................................................73.技术路线............................................................................................74.实验方法............................................................................................82.3.资料的整理与分析方法..............................................................................93.实验结果................................................................................................................113.1.临床基本资料结果...................................................................................113.2.基线与治疗后NGAL水平.....................................................................133.3.MDRD评估的肾小球滤过率（eGFR）.................................................173.4.替米沙坦/一般糖尿病治疗前后其他相关临床指标对比.....................183.5.相关性分析..............................................................................................19IX 3.6.ROC曲线分析..........................................................................................254.讨论........................................................................................................................295.结论和展望............................................................................................................345.1.结论.............................................................................................................345.2.展望............................................................................................................356.参考文献..............................................................................................................36610.个人简历..............................................................................................................7711.致谢.......................................................................................................................78X 1．前言糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)常见和严重的慢性微血管并发症之一，也是慢性肾功能不全的首要病因，约有1/3的DM患者最终发展为肾衰需要肾透析。而随着DM发病率的持续升高，DN患者也不断增多。最新调查显示，我国城市人口中成年人DM发病率在进行年龄标准化校正之后已达9.7%，由此推测目前中国DM患者人数已达9240万。根据世界卫生组织2005年发布的预测数据，如不采取有效措施，2005年至2015年中风、糖尿病和心脏病将导致中国的国民收入损失5580亿美元，将对我国经济和国民健康状况造成巨大危害[1]。DN发病的可能机制包括高血糖及其引发的代谢紊乱（如多元醇代谢途径亢进、氧化应激、糖基化终产物蓄积等）和血流动力学改变（如系统性高血压、肾小球内高压等），其早期表现为肾小球滤过率增加，随之出现微量白蛋白尿,继之出现临床蛋白尿，最后进展为终末肾功能衰竭，最终可导致病人死亡。研究认为，DN早期的肾脏病理改变大多是可逆[2]的，如能在早期阶段发现并及时干预，可阻断病情向不可逆蛋白尿阶段发展，减少或推迟终末肾功能衰竭的发生。因此，DN的早期诊断及治疗尤为重要。目前临床上常用的传统实验室指标：CysC、hsCRP、UACR、BUN、sCr都是以反映肾小球损伤为主，在诊断早期DN发生上存在各种各样的局限性，较难及时发现早期肾脏损伤。如：sCr和BUN在一定程度上可反映肾小球滤过功能，但其特异性及敏感性均较差，由于肾脏强大的贮备能力，只有当GFR下降至正常的50%时，它们才表现出滞后性的升高，且血清肌酐含量与肌肉组织密切相关，故还受年龄和性别的影响。hsCRP是由肝脏合成的一种时相炎症反应蛋白，只要机体有炎症，hsCRP则迅速升高，其反映早期DN发生缺乏特异性。CysC是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族中的成员之一，它不受性别、年龄、饮食、炎症、血脂、肝脏疾病的干扰，能自由的通过肾小球滤过膜，并在近曲小管重吸收和降解，在近曲小管完全吸收不再重新回到血液中去，同时肾小管也不分泌CysC，肾脏是清除循环中CysC的唯一器官。因此，有学者[3]认为CysC可作为反映肾小球滤过率的灵敏标志物，但在早期DN发生时，因GFR大多数情况下尚属于正常水平甚至高于正常，所以作为反映GFR的CysC在诊断早期DN方面的价值也争议较大。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,1 NGAL）是1993年最先发现于活化中性粒细胞中的一种25kDa的分泌蛋白，属于载脂家族成员之一，呈β折叠桶装，含178个氨基酸残基。其基因定位于人类9号常染色体（9q34）上，全长5869bp，有7个外显子。随着基因和蛋白组学等基础研究的开展及深入，它强大的功能在不断被挖掘。早有研究[4]认为，DN进展中肾小管损伤要早于肾小球损伤，最近有学者[5]还声称“肾病的肾小管时代已来临”。NGAL作为一种新的肾小管炎性标志物，在诊断急性肾脏损伤（AKI）和慢性肾脏疾病（CKD）的发生和病情判断上的价值和作用近十年来备受关注。NGAL与AKI的研究近年来主要集中在肾脏急性缺血―再灌注[6][7]损伤、心脏术后急性肾衰等方面。2003年Mishra等人先后在动物和临床实验中发现：在缺血-再灌注造成的AKI发生的早期（2小时内），血、尿NGAL就明显升高。最近在[8][9]对急诊和ICU的AKI病人研究中也充分证实了NGAL具有高灵敏度和特异性的优点（分别为90％和99％），不仅可作为AKI的早期标志物，对于预测血肌酐正常的急诊或[10]ICU住院病人AKI严重程度也具有独特的作用和价值。2009年Haase等人在对超过2500例AKI患者进行的一个回顾性荟萃分析后提出：血、尿NGAL可能成为AKI诊断和判断预后的非常有用的标志物。关于NGAL与CKD的研究近年也颇热，主要集中在IgA肾病、原发性肾小球肾炎（PGN）及多囊性肾病（PKD）等方面。IgA肾病患者血、尿[11]NGAL对比健康组都显著升高，且尿NGAL肌酐比率与临床疾病活动性即肾脏损害病理学平行，血NGAL则没有明显相关。而关于NGAL与DN（最常见的CKD之一）的关系近两年也成为研究热点之一。Wang[12]Y等发现，对比正常小鼠，NGAL在糖尿病或肥胖小鼠体内的脂肪组织及肝脏中大量表达，而人体检测结果也显示NGAL与肥胖、高脂血症、高血糖、胰岛素抵抗呈正相关，与高密度脂蛋白的水平呈负相关；DM小鼠及T2DM患者使用胰岛素增敏剂治疗后NGAL水平均明显下降。伴有胰岛素抵抗病人的循环NGAL浓度可随脂肪过度摄入而急剧升高，[13]减肥可明显改变了NGAL的昼夜节律。由此可见NGAL可能是肥胖及其相关代谢疾病[14][15~17]的一种炎性标记物，与T2DM的发生发展关系密切。2009-2010两年来动物和临床实验均发现：与健康组对比，正常蛋白尿的DN患者（或模型小鼠）的血、尿NGAL就已经明显增加，且与肾功能指标密切相关。随着病情的加重或好转，尿NGAL相应地增[14-17][14]加或减少，而血NGAL的变化则存在众多争议。新近有学者使用ARB药物治疗1[17]型DN模型小鼠，发现尿NGAL显著减少77%，而血NGAL无明显改变；S.E.Nielsen等人则对1型DN患者进行ACEI药物干预治疗，结果发现尿NGAL有所下降，但治疗前后差别没有统计学意义，该作者并未对治疗前后的血NGAL进行检测。2 到目前为止，尚无运用药物对2型DN患者进行干预治疗以探讨NGAL与DN的关系的研究报道。DN早期血、尿NGAL升高对肾脏起保护作用还是损伤作用目前研究还存争议。NGAL在DN各期表现不同，随病情变化而变化的趋势研究报道不一，且变化的原因及机制也尚不清楚。所以，本实验设计除在基线上检测非大量蛋白尿的2型DN患者和健康对照组的血、尿NGAL水平，还运用相关性分析、线性回归分析和ROC曲线分析血、尿NGAL与其它肾功能指标（包括CysC、hsCRP、BUN、sCr、eGFR）测定在诊断早期DN和评估其病情进展的意义，并在糖尿病治疗基础上运用替米沙坦（ARB类药物）对患者进行早期干预治疗，明确随治疗后病情变化血、尿NGAL的表现，以及比较替米沙坦不同疗程（3或12个月）的效应，并设立平行组（只进行糖尿病治疗）做对照，探讨NGAL改变的可能原因及机制。3 2.研究内容与方法2.1研究内容2.1.1研究目的通过检测血、尿NGAL浓度，明确它们在2型糖尿病肾病各期中的表现，分析它们与其它肾功能指标（包括CysC、hsCRP、BUN、sCr、eGFR）的相关性，探讨血、尿NGAL测定在早期2型糖尿病肾病的临床意义。并进一步运用替米沙坦治疗患者，观察治疗前后血、尿NGAL及其它肾功能指标的变化，明确随治疗后病情变化血、尿NGAL的表现及替米沙坦不同疗程的效应，探讨NGAL改变的可能原因及机制。2.1.2研究对象（1）早期2型糖尿病肾病（DN）选取自2009-2010年汕头大学医学院第二附属医院住院及门诊就诊的患者，符合1999年WHO糖尿病诊断标准。平均年龄（62±10）岁，糖尿病病程（9.59±4.23）年。（2）健康对照组（normalcontrol,NC）为同期在汕头大学医学院第二附属医院体检中心筛查后的健康体检者。为减少检查误差，所有入选志愿者均经过相关检查，除外相关的排除标准。（3）糖尿病分组：根据尿白蛋白/肌酐比（UACR）筛查出非大量蛋白尿2型DN患者（UACR≤300mg/g）72例，其中包括正常蛋白尿患者27例（DN1组，UACR<30mg/g），微量蛋白尿患者45例（DN2组，30mg/g≤UACR≤300mg/g）。4 2.1.3资料收集内容（1)一般情况：姓名、性别、年龄、住院号或者门诊号。（2）病史：糖尿病发病时间、病程、治疗情况、血压。（3）实验室指标：血常规：白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板数值血脂常规：总胆固醇（CH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）肝功能：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）肾功能：尿素氮(BUN)、肌酐（sCr）、hsCRP、CysC尿常规检查：糖尿病指标：空腹血糖（FBG），糖化血红蛋白（HbA1C）2.1.4诊断标准(1)糖尿病诊断以1999年WHO糖尿病诊断依据为标准。(2)早期糖尿病肾病患者诊断标准参照Mogensen糖尿病肾病分型标准。2.1.5排除标准排除标准：患者近6个月内发生过全身感染、酮症酸中毒等糖尿病急性并发症；患者伴有心、肝等重要器官功能不全，恶性高血压，恶性肿瘤，免疫性疾病以及机体处应激状态时；患者血肌酐超过265umol/L；患者近期正在使用ARB/ACEI药物治疗；怀孕或者哺乳期妇女。5 2.2研究方法2.2.1设备及试剂1.主要实验试剂（1）尿微量白蛋白放射免疫分析试剂盒北京原子高科股份有限公司试剂盒内容物如下：1)白蛋白标准品：浓度分别为1，2，5，10，20，50μg/ml；2)温育液1253)I-白蛋白4)白蛋白抗体5)分离试剂6)质控品（2）ELISA试剂盒（NGALRapidELISAKit037）丹麦Antibodyshop公司BioPoRTo试剂盒内容物如下：7)96孔（12×8）预先用NGAL抗体包被的微孔8)5×样品稀释液（1×60ml）9)NGAL快速标准品1～6各1ml，浓度单位：ng/ml;（浓度从低至高分别为0，0.2，2.1，4.8，10.7，20.2）10)25×洗涤液（1×30ml）11)辣根过氧化物酶标记的NGAL抗体（1×6ml）12)四甲基联苯胺显色液（TMB）（1×12ml）13)终止液（1×12ml）14)96孔多聚U形微孔板6 2.仪器与设备FJ－2008PS型γ放射免疫计数器西安核仪器厂台式冷冻离心机（LD5－10B）北京JINGLI电热恒温水浴锅上海跃进医疗器械厂超低温冰箱SANYO冰箱华凌冰箱ELISA机器西班牙GRIFOLS3．技术路线资料收集健康组（NC）35例符合条件的2型糖尿病患者72例检测尿白蛋白肌酐比(UACRmg/g)UACR＜30UACR[30,300]正常蛋白尿组(DN1)27例微量蛋白尿组(DN2)45例横断性研究：检测血、尿NGAL和其它肾功能指标（CysC、替米沙坦80mg/d+一般糖尿病治疗一般糖尿病治疗hsCRP、BUN、sCr、eGFR等，运用相关性分析它们间的关系，（DN115例+DN228例）（DN110例+DN215例）ROC曲线分析检测上述指标的治疗3M治疗12M治疗12M曲线下面积、截断值等。前瞻性随访对照研究：重新检测血、尿NGAL和其它肾功能指标，纵向对比替米沙坦治疗前后上述指标，观察不同疗程的效应；并与对照组横向对比。7 4.实验方法（1）血、尿标本收集入组患者清晨空腹时经正规静脉穿刺术获取其血液标本，离心提取其上层血清，同时收集患者第一次晨尿或随机尿，同样离心静置去除沉淀，在实验分析前，均盛放于无菌EDTA试管中，保存在–80℃冰箱里待用（研究已经证实在此温度条件下NGAL浓度可以长[18]期保持稳定）。同时，标本避免反复冻融及检测。（2）实验室指标检测方法酶联免疫吸附法（ELISA）检测血、尿NGAL，使用ELISA快速试剂盒（Kit037，Gentofte;AntibodyShop,Grusbakken8,丹麦）；放射免疫法测定尿微量白蛋白(试剂盒购自北京原子能研究所)；Jaffe’s苦味酸法测定血、尿肌酐，尿素酶法测定尿素氮，三者均使用全自动生化仪检测分析；空腹血糖使用葡萄糖氧化酶法检测；糖化血红蛋白使用微柱离子交换层析法检测；半胱氨酸蛋白酶抑制剂C使用乳胶颗粒增强免疫比浊法测定；高敏C反应蛋白使用免疫比浊法测定。放射免疫法用于检测尿微量白蛋白1）标记试管。分别为“NSB”管，“0”空白管，标准管“S1”－“S6”，质控管“低”、“中”、“高”；样品管“1”……及样品平行管“1’”……；2）“NSB”管加入温育液300ul，“0”空白管加入温育液100ul，标准管分别加入100ul对应的标准液，质控管分别加入100ul对应的质控液，样品管及样品平行管分别加入相应患者的尿液，各100ul；1253）上述各管分别加入I－白蛋白100ul；4）除“NSB”管外，各管分别加入白蛋白抗体200ul；5）充分摇匀，置入37℃水浴箱中温育30min；6）各管分别加入分离试剂500ul；7）充分摇匀后室温下静置15min，以3500转/min速度离心20min；8）吸弃上清，全自动放射免疫检测仪计数，每管1min；9）计算尿白蛋白排肌酐比值（Jaffe’s苦味酸法测定尿肌酐）。酶联免疫吸附法用于检测各组患者血、尿NGAL蛋白含量：8 1）试剂和样品准备：将试剂盒和所有待测血清及尿液样本至于室温下（20～25摄氏度），按要求稀释25×洗涤剂及5×样品稀释液并摇匀试剂。将待测血清按1：100比例稀释；尿液样本按照1：50比例稀释，充分摇匀。2）吸取50ul辣根过氧化物酶标记的NGAL抗体于预先包被好NGAL抗体的微孔中。3）用多排移液枪将50ul体积的标准品及待测样品分别加入微孔中，盖住微孔，置于摇床上以200/分钟的速度在室温下孵育30分钟。4）将微孔中的反应物吸去，并用稀释好的洗涤液洗涤微孔3次，每次至少用300ul的洗涤液。5）分别加入100ul的显色液（TMB），盖好微孔在暗室中于室温下孵育15分钟（自加第一个微孔开始计时）。6）分别加入100ul的终止液（保持与上一步骤相应的顺序加液），轻轻摇匀20秒钟，在30分钟内读数。7）在酶标仪波长450nm读数。8）创建标准曲线及拟合方程，得出NGAL浓度（ng/ml）2.3资料的整理与分析方法①运用EXCEL输入数据，使用SPSS13.0进行统计分析;②肾功能评估：使用适合中国人种的简易MDRD方程（theModificationofDietinRenalDisease[19]equation）计算肾小球滤过率（glomerularfiltrationrate，GFR），评估肾脏功能：2-1.154-0.203MDRDGFR(mL/min/1.73m)=186.0×SCr（mg/dl）×年龄(岁)×0.742×1.233（中国人）。③统计学处理：运用SPSS13.0软件包(SPSS,Chicago,IL,USA)及GraphPadPrism(version4.0)软件包统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，计数资料以频数表示。正态、方差齐同的计量资料多组间比较使用方差分析；偏态计量资料、计数资料多组间比较用Kruskal－WallisH检验法，独立样本两两比较采用独立样本T检验法。使用Pearson或Spearman相关分析和线性回归分析比较各指标间的相关性。绘制ROC曲线,以灵敏度为9 纵坐标,(1-特异性)为横坐标,并计算AUC，Youden’s指数最大时的界值点（Cut-off值）及其对应的灵敏性和特异性。④以α=0.05为检验水准；P≤0.05认为差异具有统计学意义10 3.实验结果3.1临床基本资料结果本实验共纳入72例非大量蛋白尿的2型糖尿病肾病患者（DN1组27例，DN2组45例）和35例健康者（NC组）。68例完成2010年的前瞻性干预对照研究，4例退出本实验（1例因血压过低、1例因发生心衰、2例因医从性不好停用替米沙坦）。其中43例在一般糖尿病治疗（包括正规的调节高血糖、高血压、高血脂治疗）基础上予替米沙坦80mg/天治疗（15例DN1组：7例服用3个月，8例服用12个月；28例DN2组：13例服用3个月，15例服用12个月），25例只予糖尿病治疗，最终随访治疗率为94.4%。DN组和NC组基本情况详见表1。三组间年龄、性别、BMI差别无统计学意义（p>0.05），具有可比性，BUN、sCr、CysC、TC、HDL、WBC和ALT差别也无统计学意义。DN组间糖尿病病程、FBG、HbA1c同样配比良好，无统计学差异。对比NC组，DN组的DBP(p<0.01)、FBG(p=0.000)、HbA1C(p=0.000)、TG(p<0.05)升高，DN1与DN2组间差异无统计学意义。DN2组的hsCRP(p<0.01)、LDL(p<0.05)、WHR（p=0.000）、UACR（p=0.000）、eGFR（p=0.000）较NC组的升高，WHR（p<0.05）、UACR（p=0.000）、eGFR（p<0.05）较DN1组升高；DN1组的DBP(p<0.01)、FBG(p=0.000)、HbA1C(p=0.000)、TG(p<0.05)较NC组升高；SBP三组间差别有统计学意义.表1糖尿病及健康对照组一般情况的比较Table1.GeneralcharacteristicsofthediabetesandcontrolGroups项目组别NC组DN1组DN2组病例数/例352745男性百分比/%57.159.366.7年龄/岁63.66±8.7563.22±8.7460.76±10.2411 2体重指数/kg/m22.96±3.2924.50±3.5524.16±3.16腰臀比0.87±0.0710.90±0.090.94±0.08▲﹟DM病程/年/8.81±2.8710.06±4.83收缩压/mmHg118.80±10.20130.74±18.25Δ143.73±17.53▲☆舒张压/mmHg73.28±8.6481.15±9.02Δ81.09±11.26Δ尿白蛋白肌酐比/mg/g14.56±5.5016.11±7.1668.14±41.65▲★空腹血糖/mmol/L5.12±0.5110.68±4.47▲9.65±4.08▲HbA1C/%4.77±0.528.60±2.11▲9.09±2.39▲尿素氮/mmol/L5.57±1.365.49±1.315.32±1.38血肌酐/umol/L71.90±10.8668.60±9.6967.79±12.172肾小球滤过率/mL/min/1.73m104.65±20.61113.03±28.38125.72±18.82▲﹟CysC/mg/L0.89±0.221.17±0.291.11±1.16hsCRP/mg/L2.03±1.413.17±2.644.06±3.69Δ总胆固醇/mmol/L4.81±0.665.20±1.105.50±2.25甘油三酯/mmol/L1.11±0.451.61±0.89﹡1.56±1.15﹡高密度脂蛋白/mmol/L1.17±0.301.27±1.131.29±0.49低密度脂蛋白/mmol/L2.73±0.713.10±0.673.20±1.03﹡9白细胞总数/×10/L6.51±1.557.33±1.627.26±2.419中性粒细胞计数/×10/L3.81±1.164.25±1.324.26±2.16谷丙转氨酶/U/L26.77±7.2229.85±14.5527.20±14.69血NGAL/ng/ml165.51±51.71375.93±130.68▼204.64±103.65●尿NGAL/ng/ml33.45±9.6656.42±19.05▼79.81±21.96▼●血NGAL/尿肌酐/g/g348.33±264.15709.20±567.56Δ577.66±412.23﹡尿NGAL/尿肌酐/g/g71.78±51.29110.26±94.52258.80±224.47★▲与健康组对比，▲p=0.000、▼p<0.001、Δp<0.01、﹡p<0.05；与DN1组对比，★p=0.000、●p<0.001，☆p<0.01、﹟p<0.05。12 3.2基线与治疗后NGAL水平3.2.1基线DN组与健康组的NGAL对比DN1组患者血、尿NGAL较NC组已经明显升高（sNGAL：375.93±130.68ng/mlVS165.51±51.71ng/ml,p<0.001;uNGAL：56.42±19.05ng/mlVS33.45±9.66ng/ml,p<0.001）。DN2组患者sNGAL较DN1组明显下降（204.64±103.65ng/ml，p<0.001），与NC组对比无统计学差异；uNGAL随着尿蛋白排泄的增加而继续升高（79.81±21.96ng/ml,VSNC、DN1组均为p<0.001）。使用尿肌酐校正后，DN组的sNGAL都较NC组明显升高，差别有统计学意义，但DN组间无统计学差异；校正后uNGAL在DN2组比NC和DN1组明显升高，后面两者无统计学差异。图1.1DN组和NC组血NGAL对比箱式图▼p=0.000,▼▼p<0.001，DN1组血NGAL较NC和DN2组明显升高。图1.2DN组和NC组尿NGAL对比箱式图▼p<0.001，尿NGAL随着蛋白尿排泄的增加而升高，DN2>DN1>NC。13 3.2.2替米沙坦干预治疗前后NGAL对比替米沙坦治疗后，DN两组患者血、尿NGAL均明显下降，降幅跟疗程成正比。替米沙坦治疗后DN组患者的血NGAL均明显下降（DN1组：353.2±127.03ng/mlVS191.87±77.51ng/ml，p<0.001，降幅为45.7%；DN2组:202.29±109.42ng/mlVS120.82±56.71ng/ml，p<0.001，降幅为40.3%）；其中，DN2组替米沙坦治疗12个月的降幅明显大于治疗3个月的降幅，差别有统计学意义(58.06%VS18.15%，p<0.05)，DN1组12个月与3个月降幅分别为48.57%和41.86%，差别无统计学意义，但是治疗前后血NGAL下降的统计学意义12个月比3个月的要更显著（(p<0.01VSp<0.05）。替米沙坦治疗后尿NGAL也明显下降（DN1组：62.61±20.73ng/mlVS44.43±21.18ng/ml，p<0.001，降幅为26.0%；DN2组:78.01±22.11ng/mlVS42.70±27.66ng/ml，p<0.001，降幅为45.3%）；两组治疗12个月的降幅都明显大于治疗3个月的降幅，差别有统计学意义（DN1组：39.95%VS13.18%,p<0.05；DN2组:66.41%VS22.04%，p<0.01）。详见图2.1，2.2，3.1，3.2。图2.1替米沙坦治疗前后血NGAL箱式图▼p<0.001，替米沙坦治疗后DN1和DN2组的血NGAL都明显下降。14 图2.2替米沙坦治疗前后尿NGAL箱式图▼p<0.001，替米沙坦治疗后DN1和DN2组的尿NGAL都明显下降。图3.1不同疗程替米沙坦治疗前后血NGAL箱式图:▼p<0.05,▼▼p<0.01。DN1组12个月与3个月降幅分别为48.57%和41.86%，差别无统计学意义，但是治疗前后血NGAL下降的统计学意义12个月比3个月的要更显著（(p<0.01VSp<0.05）；DN2组替米沙坦治疗12个月的降幅明显大于治疗3个月的降幅，差别有统计学意义(58.06%VS18.15%，p<0.05)。15 图3.2不同疗程替米沙坦治疗前后尿NGAL箱式图:▼p<0.05,▼▼p<0.01,▼▼▼p=0.001，DN两组替米沙坦治疗12个月的降幅都明显大于治疗3个月的降幅，差别有统计学意义。3.2.3糖尿病一般治疗前后NGAL对比一般糖尿病治疗后，血NGAL明显下降，尿NGAL变化无统计学意义。DN组患者的血NGAL在糖尿病治疗一年后均有统计学意义的下降（DN1组：411.40±146.87ng/mlVS385.40±130.64ng/ml，p<0.05；DN2组:199.73±93.12ng/mlVS182.07±85.34ng/ml，p<0.05）；但降幅明显小于替米沙坦治疗组的（DN1组:45.7%VS6.2%，p=0.001；DN2组:40.3%VS8.8%，p<0.05）；相反，尿NGAL在糖尿病治疗一年前后差别无统计学意义。参见图4。图4一般糖尿病治疗一年前后血NGAL箱式图▼p<0.05，DN两组治疗后血NGAL下降具有统计学意义。16 3.3MDRD评估的肾小球滤过率（eGFR）3.3.1基线DN组与健康组的eGFR对比2DN2组的eGFR较DN1和NC组明显升高(DN2组：125.72±18.82mL/min/1.73mVSDN1组:113.03±28.38,p<0.05；VSNC组：104.65±20.61,p=0.000）。DN1组eGFR与NC组对比差别无统计学意义。详见表1和图5。图5：DN组和NC组eGFR对比箱式图，DN2组的eGFR较DN1和NC组明显升高。3.3.2干预治疗前后eGFR对比2经替米沙坦治疗前后DN2组的eGFR差别有统计学意义（127.31±18.77mL/min/1.73m2VS111.71±18.61mL/min/1.73m,p=0.000），与基线NC组对比无统计学差异。而DN1组在替米沙坦治疗前后变化无统计学意义。一般糖尿病治疗前后DN组eGFR差别均无统计学意义。参见表1和图6。17 图6：替米沙坦治疗前后肾小球滤过率水平比较箱式图：▼p=0.000，替米沙坦治疗后DN2组eGFR明显下降，差别有统计学意义。3.4替米沙坦/一般糖尿病治疗前后其他相关临床指标对比由表2可见，无论是经过替米沙坦治疗还是糖尿病一般治疗，BUN、CysC、hsCRP、#TC、TG、HDL、LDL、WBC、GRAN和ALT的变化均无统计学意义，相反，UACR则都出现有统计学意义的下降。除了经一般糖尿病治疗的DN1组患者外，经过替米沙坦治疗后的DN患者和一般糖尿病治疗的DN2患者的SBP、HbA1C都出现有统计学意义的下降。DBP和sCr仅在经替米沙坦治疗后的DN2患者中表现出下降的趋势，而FBG仅在经替米沙坦治疗后的DN1患者中表现出下降的趋势，前后差别均有统计学意义。表2替米沙坦/一般糖尿病治疗前后其他相关临床指标对比Table2.Comparisonsofothermainclinicalparametersbeforeandaftertelmisartantreatmentandgeneraltreatment替米沙坦一般糖尿病治疗项目组别DN1DN2DN1DN2尿白蛋白肌酐比/mg/g18.72±7.7564.68±40.7912.95±4.9971.99±14.11收缩压/mmHg132.67±19.03142.25±14.53130.00±19.15145.33±23.23舒张压/mmHg81.4±10.5984.89±10.1681.00±7.7574.47±10.68治疗前HbA1c/%8.39±2.278.44±2.508.77±1.8810.36±1.80空腹血糖/mmol/L10.27±4.569.21±4.2011.38±4.9410.48±4.15尿素氮/mmol/L4.66±1.815.88±2.205.05±1.895.17±1.4818 血肌酐/umol/L66.61±10.7566.15±10.9570.90±8.4671.99±14.11CysC/mg/L1.18±0.281.16±1.471.15±0.351.01±0.18hsCRP/mg/L3.10±2.113.87±3.663.61±3.533.64±3.29总胆固醇/mmol/L5.21±1.15.56±2.555.23±1.225.33±1.799白细胞总数/×10/L7.32±1.936.89±1.967.34±1.347.87±3.00尿白蛋白肌酐比/mg/g8.62±4.27★35.14±31.50▲11.79±5.26﹡90.48±85.23收缩压/mmHg122.00±9.80☆134.93±11.83Δ129.30±18.80139.27±17.56﹟﹟舒张压/mmHg77.87±7.0883.00±7.92﹟81.00±6.2275.73±8.42治疗后HbA1c/%7.23±1.29﹡7.25±1.60Δ9.87±1.569.10±1.85﹟﹟空腹血糖/mmol/L7.79±1.40﹡8.56±2.888.42±2.829.65±3.40尿素氮/mmol/L5.03±1.475.83±1.505.12±2.255.03±1.39血肌酐/umol/L69.73±9.4175.05±15.75▲71.56±6.7073.88±14.91CysC/mg/L1.00±0.380.75±0.301.32±1.291.01±0.36hsCRP/mg/L2.10±2.773.19±3.013.80±3.243.76±3.32总胆固醇/mmol/L4.87±0.805.18±1.005.06±0.925.51±1.429白细胞总数/×10/L7.11±2.047.37±2.077.29±0.627.19±1.06替米沙坦治疗组：与治疗前对应DN1组对比，★p＝0.000，☆p<0.01，﹡p<0.05。与治疗前对应DN2组对比，▲p＝0.001，Δp<0.01，﹟p<0.05。糖尿病治疗组：与治疗前对应DN2组对比，﹟﹟p<0.05。3.5相关性分析3.5.1血、尿NGAL间的相关性分析2DN1组患者的sNGAL与uNGAL有高度的正相关(r=0.674,p=0.000,R=0.455)。治疗前后这种相关性并没有改变。；相反的，DN2组患者的sNGAL则与uNGAL高度负相2关(r=0.445,p<0.01,R=0.198)，而这种负相关在经替米沙坦治疗后有所减弱，详见图3。使用尿肌酐校正后，DN患者的sNGAL与uNGAL都有正相关，(DN1组：r=0.941,p=0.000,22R=0.885；DN2组：r=0.302,p<0.05,R=0.091)。参见图7和表3。19 150200r=0.67P<0.001150r=-0.445P<0.0110010050uNGAL/ng/mluNGAL/ng/ml50R2Linear=0.455R2Linear=0.1980002004006008000200400600800sNGAL/ng/mlsNGAL/ng/ml图7：DN组血NGAL与尿NGAL的线性回归分析图（左图为DN1组，有图为DN2组）DN1组患者的sNGAL与uNGAL有高度的正相关；DN2组患者的sNGAL则与uNGAL高度负相关。表3.替米沙坦/一般糖尿病治疗前后血NGAL与尿NGAL的相关性分析Table3.TheCorrelationsbetweensNGALanduNGALbeforeandaftertelmisartantreatmentandgeneraltreatment替米沙坦一般糖尿病治疗组别N/例N/例r(前)p(前)r(后)p(后)r(前)p(前)r(后)p(后)DN1150.87<0.0010.61<0.05100.80<0.010.88<0.01DN228-0.89<0.050.57<0.0115-0.57<0.05-0.22>0.05“N”:患者人数；“前”：治疗前；“后”：治疗后。3.5.2NGAL与其他临床指标的相关性分析表4.1和4.2分别显示了经替米沙坦和一般糖尿病治疗前后NGAL与其他临床指标的相关性。在DN1组：治疗前，sNGAL与eGFR、UACR、CysC、hsCRP高度正相关，与BUN、sCr高度负相关，与FBG、HbA1C没有相关性，治疗后（包括有无替米沙坦治疗）正/负相关性减弱或者无相关；尿NGAL与众多这些指标的相关性与血NGAL的保持高度一致。相反，在DN2组中，治疗前，sNGAL与eGFR高度负相关，与UACR、CysC中度负相关，而与BUN、sCr高度正相关，与hsCRP、FBG、HbA1C没有相关性，治疗后（包括有无美卡素治疗）除CysC、hsCRP有负相关外，其他指标与sNGAL无相关性。uNGAL在DN2组仍然与GFR、UACR高度正相关，治疗后正相关减弱或消失；uNGAL与BUN、sCr、CysC、20 hsCRP、FBG、HbA1C治疗前后均无相关性。表4.1：替米沙坦治疗组治疗前后NGAL与其他临床指标的相关性比较Table4.1.TheCorrelationsbetweenNGALandotherClinicalParametersbeforeandaftertelmisartantreatment血NGAL(ng/ml)尿NGAL(ng/ml)组别指标r(前)p(前)r(后)p(后)r(前)p(前)r(后)p(后)2DN1GFR/mL/min/1.73m0.89<0.0010.58<0.050.91<0.0010.52<0.05UACR/mg/g0.78<0.010.56<0.050.96<0.0010.49>0.05BUN/mmol/L-0.73<0.01-0.66<0.01-0.79<0.001-0.60<0.05SCr/umol/L-0.68<0.01-0.64<0.01-0.82<0.001-0.57<0.05CysC/mg/L－>0.05－>0.05－>0.050.85<0.001hsCRP/mg/L0.52<0.05－>0.050.54<0.05－>0.05FBG/mmol/L－>0.05－>0.05－>0.05－>0.05HbA1C/%－>0.05－>0.05－>0.05－>0.052DN2GFR/mL/min/1.73m-0.61<0.01－>0.050.40<0.05－>0.05UACR/mg/g-0.39<0.05－>0.050.97<0.001－>0.05BUN/mmol/L0.69<0.001－>0.05－>0.05-0.38<0.05SCr/umol/L0.50<0.01－>0.05－>0.05-0.41<0.05CysC/mg/L-0.40<0.05-0.50<0.010.53<0.01-5.37<0.01hsCRP/mg/L－>0.05-0.39<0.050.50<0.01-0.46<0.05FBG/mmol/L－>0.05－>0.05－>0.05－>0.05HbA1C/%－>0.05－>0.05－>0.050.42<0.05“N”:患者人数“前”：治疗前；“后”：治疗后。21 表4.2：一般糖尿病治疗组治疗前后NGAL与其他临床指标的相关性比较Table4.2.TheCorrelationsbetweenNGALandotherClinicalParametersbeforeandaftergeneraltreatmentwithouttelmisartan血NGAL(ng/ml)尿NGAL(ng/ml)组别指标r(前)p(前)r(后)p(后)r(前)p(前)r(后)p(后)2DN1GFR/mL/min/1.73m0.62>0.05－>0.050.69<0.050.56>0.05UACR/mg/g0.89<0.010.80<0.010.95<0.0010.72<0.05BUN/mmol/L-0.66<0.05－>0.05-0.81<0.01－>0.05SCr/umol/L-0.81<0.01-0.66<0.05-0.83<0.01－>0.05CysC/mg/L0.64<0.050.62>0.050.71<0.05－>0.05hsCRP/mg/L－>0.050.66<0.050.83<0.010.67<0.05FBG/mmol/L－>0.05－>0.05－>0.05－>0.05HbA1C/%－>0.05－>0.05－>0.05－>0.052DN2GFR/mL/min/1.73m-0.90<0.001-0.68<0.010.52<0.05－>0.05UACR/mg/g-0.52<0.05-0.54<0.050.99<0.001-0.75<0.01BUN/mmol/L0.65<0.010.70<0.01－>0.05－>0.05SCr/umol/L0.69<0.010.65<0.01－>0.05－>0.05CysC/mg/L-0.67<0.01-0.64<0.010.51>0.05－>0.05hsCRP/mg/L-0.64<0.01-0.60<0.05－>0.05－>0.05FBG/mmol/L－>0.05－>0.05－>0.05－>0.05HbA1C/%－>0.05－>0.05－>0.05－>0.05“N”:患者人数“前”：治疗前；“后”：治疗后。22 图8.1DN1组sNGAL与众多指标的线性回归分析图（sNGAL与CysC、hsCRP、eGFR、UACR2高度正相关，r∈[0.47,0.68],R∈[0.261,0.463]，与BUN、sCr高度负相关，r=-0.62和-0.64，2R=0.382和0.405）。23 图8.2DN2组sNGAL与众多指标的线性回归分析图（与DN1相反，DN2组患者的sNGAL2与CysC、eGFR、UACR高度负相关，r∈[-0.69,-0.36],R∈[0.193,0.475]；与BUN、sCr高2度正相关，r均为0.59，R=0.344和0.243；与hsCRP无相关，图略）图8.3DN2组uNGAL与众多指标的线性回归分析图（与DN2组患者的sNGAL相反，uNGAL与2CysC、hsCRP、eGFR、UACR正相关，r∈[0.38,0.98],R∈[0.142,0.951]；与BUN、sCr无相关，图略）24 图8.4：替米沙坦治疗前后DN1组患者血/尿NGAL与eGFR的线性回归图.（1-治疗前;2-治疗后.治疗前血、尿NGAL均与eGFR高度正相关，替米沙坦治疗削弱了这种相关性）图8.5：替米沙坦治疗前后DN2组患者血/尿NGAL与eGFR的线性回归图.（1-治疗前.治疗前sNGAL与eGFR高度负相关，uNGAL与eGFR中度正相关，替米沙坦治疗后血、尿NGAL与eGFR均无相关性，此线性回归图未显示，详见表4.1）3.6ROC曲线分析3.6.1诊断早期2型DN的价值比较图9.1显示的是sNGAL、uNGAL与CysC、hsCRP、eGFR、UACR、BUN和sCr共八项指标在诊断早期2型DN（蛋白尿尚属于正常）的价值上对比的ROC曲线图，它们的AUC分别为：0.96,0.86,0.78,0.62,0.60,0.58,0.36,0.42。可见，sNGAL、uNGAL、CysC、hsCRP、eGFR、UACR六项指标的AUC大于0.5，具有诊断价值，其中，sNGAL具有最25 大的AUC，明显优于以上另外五项指标（VSuNGALP<0.05,VSCysC、hsCRP、eGFR、UACR,均为P<0.001），uNGAL的AUC仅次于sNGAL，明显优于eGFR、UACR和hsCRP（均有P<0.001），但与CysC差别无统计学意义。相反，BUN和sCr的AUC小于0.5，没有诊断价值。sNGAL和uNGAL在最佳诊断界值上都具有较高的灵敏性和特异性：sNGAL>225.5ng/ml和uNGAL>46.00ng/ml可以诊断早期2型DN（蛋白尿尚属于正常）的发生，前者灵敏度和特异性为92.6%和91.4%，后者的为74.1%和88.6%。详见表5.1。图9.1NGAL与其它肾功能指标作为诊断2型DN早期标志物对比的ROC曲线（NC+DN1作为体质变量）表5.1NGAL与其它肾功能指标作为诊断2型DN早期标志物的曲线下面积、界限值、灵敏性和特异性对比Table5.1ComparisonsofAUC,cut-off,sensitivity,specificityinsNGAL,uNGALandotherrenalparametersasearlydiagnosismarkersoftype2DN.CharacteristicsAUC(95%CI)Cut-offSensitivity/%Specificity/%sNGAL/ng/ml0.96(0.00-1.00)225.5092.691.4uNGAL/ng/ml0.86(0.76-0.96)﹟46.0074.188.6CysC/mg/L0.78(0.67-0.70)△0.9777.868.6hsCRP/mg/L0.62(0.49-0.77)△△2.1551.977.12eGFR/mL/min/1.73m0.60(0.45-0.75)△△119.0940.791.426 UACR/mg/g0.58(0.43-0.73)△△21.0037.088.6BUN/mmol/L0.36(0.22-0.50)△△///sCr/umol/L0.42(0.28-0.56)△△///与sNGAL的AUC对比:﹟p<0.05,△p<0.00；与sNGAL和uNGAL的AUC对比:△△p<0.0013.6.2诊断早期2型DN的价值比较图9.2显示的是sNGAL、uNGAL与CysC、hsCRP、eGFR、BUN、和sCr共七项指标在评估早期2型DN病情进展（DN1进展为DN2）的价值对比的ROC曲线图（因UACR作为本实验分组标准，所以该指标的AUC为100%，不参与对比）。它们的AUC分别为：0.14,0.79,0.30,0.53,0.68,0.63,0.45。可见，uNGAL、hsCRP、eGFR、BUN的AUC大于0.5，其中，uNGAL具有最高的AUC，明显优于后面三项指标，差别均有统计学意义（P<0.05）而sNGAL、CysC、sCr的AUC小于0.5，没有诊断价值。uNGAL在最佳诊断界值上具有较高的灵敏性：uNGAL>60.05ng/ml可以诊断早期2型DN病情进展，灵敏度为95.6%，2特异性为66.7%。其次，eGFR的AUC为0.68，当>103.48mL/min/1.73m时也具有一定评估DN早期病情进展的价值，灵敏度为93.3%，但特异性较低（40.7%）。详见表5.2。图9.2NGAL与其它肾功能指标评估早期DN病情进展价值对比的ROC曲线(DN1+DN2作为体质变量)27 表5.2NGAL与其它肾功能指标在评估2型DN病情进展的曲线下面积、界限值、灵敏性和特异性对比Table5.2AUC,cut-off,sensitivity,andspecificitycomparisonsofsNGAL,uNGAL,andotherrenalparametersinassessingrenalinjuryprogressionfromnormo-tomicroalbuminuria.CharacteristicsAUC(95%CI)Cut-offSensitivity/%Specificity/%sNGAL/ng/ml0.14(0.05-0.22)△///uNGAL/ng/ml0.79(0.67-0.91)60.0595.666.7CysC/mg/L0.30(0.18-0.42)///hsCRP/mg/L0.53(0.39-0.66)△1.0922.244.42eGFR/mL/min/1.73m0.68(0.55-0.82)﹟103.4893.340.7BUN/mmol/L0.63(0.49-0.76)△4.3184.440.7sCr/umol/L0.45(0.31-0.59)△///对比uNGAL的AUC:﹟p<0.05,△p<0.00128 4.讨论NGAL是1993年最先发现于活化中性粒细胞中的一种25kDa的分泌蛋白，属于载脂家族成员之一，它功能强大，既能结合并运输疏水性小分子，还与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及肿瘤的发生与发展过程相关。[16]与我们先前的研究一致，本实验的横断研究发现，对比NC组，DN1组患者的血、尿NGAL明显升高（见表1和图1），而尿NGAL随着尿蛋白排泄的增多继续增加，这与[15；17]近2年国外的一些研究一致，以上相同的实验结果也支持了一个观点：肾小管损伤的发生早于肾小球损伤（出现蛋白尿），学者称之为“肾小管时代的来临”。血、尿NGAL在早期DN发生时升高的表现目前研究结果比较一致，但此时NGAL的升高对肾脏是起保护作用还是损伤作用呢？近十年来，基础研究的一些学者通过基因、转录、蛋白组学等技术先后提出NGAL的升高具有肾脏保护作用：NGAL在泌尿系统中的表达主要集中2+于近曲小管上皮细胞，在生理情况下，NGAL通过肠菌素与Fe形成复合物（NGAL/肠2+菌素/Fe），介导铁离子向细胞内转运，促进肾脏祖细胞转化为肾小管上皮细胞，是肾脏[20]生长发育的重要保障；在病理情况下，可诱导肾小管上皮细胞修复再生，还可通过诱[21]导肾小管、间质中的中性粒细胞凋亡，抑制及减少炎症导致的肾脏损害。更重要的是，在DN发生的早期，MMP9这一基质金属蛋白酶高表达增高，发挥降解系膜区细胞外基质、减少基质沉积的作用，而NGAL是MMP9的重要活化物，可能也参与降解DN纤维[22]化过程。而一些急、慢性肾病的临床及动物实验也印证了NGAL升高起保护肾脏功能[23]的作用，MoriK等人发现往缺血―再灌注急性肾脏损伤模型小鼠中注入重组NGAL能[24]明显减轻肾脏损伤。在对多囊性肾病（PKD）的体外试验中，WeiF等人发现往PKD突变模型小鼠细胞中加入NGAL，发现囊性病变的发展明显受抑制。以上均支持NGAL[25]的升高起保护肾脏的作用。相反的，Berger等人在对敲除NGAL基因模型小鼠的研究[26]中发现，NGAL并未参与AKI肾损修复过程。而最新研究又发现NGAL作为促纤维化通路下游调节因子可增强表皮生长因子（EGFR）的活性，在肾功能恶化期间介导其促有丝分裂效应，刺激细胞增殖和加速CKD进展，同时在CKD动物模型中使用EGFR抑制剂可阻止NGAL上调和肾损伤发展，改善病情。于是他们推测：NGAL不仅可做为肾脏损伤的标志物，且在快速CKD进展中过表达，增强EGFR活性而在肾脏病情进展中起到积极推动的作用。可见，关于NGAL升高的真正作用目前学术届争议强烈，仍需要更大29 规模的临床和基础科学研究来进一步挖掘和论证清楚。尽管如此，学者们在NGAL作为早期诊断DN的标志物认识上还是比较一致的。接着，本实验运用相关性和线性回归分析来探讨NGAL与其他肾功能指标的关系，结果发现：DN1组患者sNGAL、uNGAL均分别与hsCRP、eGFR及反映GFR的UACR、CysC高度正相关，而分别与BUN、sCr高度负相关；DN2组患者的sNGAL与eGFR高度负相关，与UACR、CysC中度负相关，与BUN、sCr高度正相关，uNGAL则与GFR、UACR高度正相关（详见表2）。换句话说，DN患者的sNGAL和uNGAL均与反映肾小球功能的众多指标密切相关，在肾脏受损的早期（出现蛋白尿之前）它们的急剧升高是否像“肌钙蛋白对应于心梗”一样具有很高的灵敏性和特异性呢？NGAL在评估早期2型DN病情进展上又具有多大的价值呢？本实验采用ROC曲线分析比较其它肾功能指标与NGAL在这些方面的的诊断价值，结果显示：在诊断早期2型DN（蛋白尿尚属于正常）上众多指标的AUC大小排序为:sNGAL>uNGAL>CysC>hsCRP>eGFR>UACR>0.5，sNGAL以绝对的优势（AUC=0.96）成为诊断早期DN发生的最佳标志物，诊断界限值为225.5ng/ml，灵敏度92.6%，特异性91.4%；uNGAL次之（AUC=0.86），同样是早期DN[19]的良好诊断指标。NickolasTL等人运用NGAL来诊断急诊病人AKI的早期发生，同样发现NGAL具有相当高的灵敏性、特异性（90％和99％）可作为AKI的早期标志物。在评估早期2型DN病情进展（DN1进展为DN2）上，uNGAL在众多肾功能指标中具有最高的评估价值（AUC=0.79），Cut-off值为60.05ng/ml，灵敏度95.6%，特异性66.7%，eGFR次之（AUC=0.68），sNGAL的AUC<0.5。如前所述，在早期DN发生时，BUN和sCr变化不大，AUC基本都在0.5以下，没有早期诊断价值；eGFR、CysC和hsCRP次于血、尿NGAL有一定诊断早期DN发生的价值；在评估早期DN病情进展上，eGFR次于uNGAL，也具有一定的评估价值。有趣的是，本实验发现DN2组患者较DN1组的血NGAL明显下降，而较NC组差异[17]无统计学意义，这一现象也同样出现在NielsenSE等人的实验中。随后，为了研究RAAS系统阻滞剂ARB类药物的肾脏保护作用对NGAL的效应，我们选择替米沙坦（美卡素）治疗非大量蛋白尿的糖尿病患者。此干预治疗效果显著，我们发现：患者的血、尿NGAL在治疗后均较治疗前显著下降，且疗程越长，这种下降的幅度就越大（参见图3.1、3.2）。另一方面，我们在替米沙坦的干预治疗中设立了只给予一般糖尿病治疗的平行对照组，对比结果显示，没有接受替米沙坦治疗的患者一年后血NGAL也出现有统计学意义的下降，但这种降幅明显小于有接受替米沙坦治疗的，差别具统计学意义；相反，尿NGAL一年30 前后的变化则没有统计学意义。换句话说，对比只接受一般糖尿病治疗，接受替米沙坦治疗能更有效的降低患者血、尿NGAL，即替米沙坦能有效降低代表肾小管损伤标志物的水平。众所周知，DN患者体内高血糖等因素可使ACE基因表达上调，进而激活RAAS系统。研究已证明，肾脏RAAS系统各成分是循环的1000倍，是引起肾脏受损的主要原[20]因。有研究报道所有形式的CKD都与肾小管间质损伤有关，不管最初的病理是肾小球性或者其它，肾小管间质损伤程度比肾小球损伤严重程度更能良好预测疾病进展和长期预[27]后。而RAAS阻断剂可显著减少肾小管的凋亡因子。T2DN大鼠模型实验也证实了肾脏损伤与肾小管间质纤维化和肾小管上皮细胞凋亡密切相关，同时RAAS阻滞剂的肾脏[28]保护治疗可以改善和逆转这些损伤。在ARB药物中，替米沙坦因其强大的优势被本实验采纳：1、是唯一治疗剂量下选择性有效激活（27倍）PPARγ受体的ARB药物，能增加胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗。对比其它ARB类药物，使用替米沙坦（美卡素）治疗高血压合并2型糖尿病等代谢综合症患者，能更有效的降低胰岛素抵抗指数，从而显著[29～33]降低空腹血糖、血浆胰岛素水平。2、它具有最高的体表分布容积，半衰期长达24小时，能高效、紧密、持续的拮抗AT1受体以平稳、强效降压。3、它拥有丰富肾脏保护[34]循证医学证据（PROTECTION），其中TRENDY研究发现美卡素可以改善DN患者肾[35]脏内皮功能障碍及高滤过状态；INNOVATION研究确指出美卡素可以减少微量蛋白尿期进展至显性肾病的风险。另外，本研究还发现在这些非大量蛋白尿的DN患者中，血、尿NGAL分别与众多实验室及肾功能相关指标有着紧密而复杂的相关性，这提示NGAL与肾脏的功能状态关系密切，是肾功能评估的一项新型指标。基线上，DN1组患者的血、尿NGAL均分别与eGFR、UACR、CysC和hsCRP正相关，而均分别与BUN、sCr负相关。DN2组患者尿NGAL与GFR、UACR正相关，而血NGAL则与eGFR、UACR和CysC负相关。这些正、负相关性在经过替米沙坦/一般糖尿病治疗后都有减弱或消失的趋势。值得一提的是，在横断研究中，我们发现DN2组患者的eGFR明显较DN1组和NC组升高（125.72±18.82vs113.03±28.38，p<0.05;125.72±18.82vs104.65±20.61，p=0.000），对应此高滤过状态，DN2组患者的血NGAL较DN1组的明显下降，而与NC组对比无统计学差异。而且，相关性及线性回归分析（详见图6.1和6.2）均显示此时的eGFR与血NGAL高度负相关，与尿NGAL高度正相关。替米沙坦治疗明显改善DN2组患者的高滤过状态，而血、尿NGAL也随之明显下降。以上均提示eGFR和NGAL关系紧密，它们之间究竟存在怎样的相互[16]影响呢？我们先前的研究报道显示，DN患者当大量蛋白尿发生时，肾功能已经严重受31 破坏，此时eGFR较正常明显下降，且与尿NGAL负相关。在对1型糖尿病肾病患者的[17]研究中也发现同样的结果。但是，在糖尿病肾病发生的早期，eGFR处于正常或者高于正常水平，目前对于此时的eGFR与NGAL相关性的报道尚少。本实验发现处于正常水平的eGFR与血、尿NGAL均有高度正相关；与低水平的eGFR一样，高水平的eGFR与sNGAL高度负相关，反之，与uNGAL高度正相关。关于血、尿NGAL在基线及干预治疗中变化的确切机制还不是很清楚。本实验发现，非大量蛋白尿患者的血、尿NGAL间及它们分别与eGFR、BUN、sCr等肾功能指标间都有微妙而复杂的相关，近年来学者们也从不同角度对NGAL变化的可能机制进行报道，结合以上种种，本研究也进行以下大胆假设：我们知道，任一物质都要经过肾脏肾小球的滤过，肾小管的重吸收及分泌（有少数物质不经过此过程），最终以不同水平出现在血、尿中。除此之外，肾外组织的分泌也起到一定的作用。不例外，NGAL在血、尿中的动态循环及复杂表现也同样受这些综合因素共同影响：在肾脏受损的早期，即出现蛋白尿之前，血、尿NGAL发生“肌钙蛋白对应于心梗样”特异而敏感的反应而急剧升高，此时eGFR正常或者稍微高于正常、肾小管重吸收功能受损也处于极初期，主要决定作用是肾外及肾脏本身保护性产生大量的NGAL，而使总体血、尿NGAL水平都升高。肾外组[36]织产生NGAL增多的观点最先于1997年由ElneihoumAM等人提出，他们认为，糖尿病患者的高糖毒性和炎症状态会诱导肾外组织产生大量炎性因子——NGAL，这一假说[15]后来也得到意大利学者的实验支持。之后，肾脏损伤继续加重，微量蛋白尿出现，肾脏血流动力学异常成为本时期肾病最重要的病理特点，表现为高灌注（肾血浆流量过高）和明显高滤过（DN2组的eGFR较DN1和NC组明显升高）状态。我们猜测，高滤过状态使得血NGAL被大量滤除到尿液中，而表现出血NGAL下降、尿NGAL继续上升。S.E.[17]Nielsen等人的临床实验中也发现：大量和正常蛋白尿的1型DN患者的血NGAL比健康人高，但是微量蛋白尿组患者与健康人对比差别却没有统计学意义，跟本实验结果完全一致。该作者还发现经过eGFR校正后，DN各组的血NGAL就有统计学差异，这一有趣的现象似乎也提示着eGFR对血NGAL水平起重要影响。当肾功能进一步受损，eGFR明显低于正常水平时，肾小管重吸收功能和肾小球滤过功能明显受破坏，而前者成为决定尿[16]NGAL水平的主导因素，所以尿NGAL继续升高并达到顶峰，我们先前的报道与近两[15;17][14]年的临床及动物实验均支持这一结果，而血NGAL在此时期的表现众多报道不一[15;17][16]致，较DN2组患者继续升高？或者降低？这还需要今后更大规模的临床或动物实验来进一步取证。32 本实验前瞻性干预对照研究表明，替米沙坦明显改善早期DN患者的肾小球滤过和肾小管的重吸收功能，高eGFR降至正常，同时，我们预测此时的肾小管和肾外组织分泌的NGAL也随着肾功能改善而相应减少。NGAL和尿蛋白的排泄也随之减少，毫无疑问，伴有高血压的DN患者治疗后血压也明显得到改善（SBP:138.91±16.67vs130.42±12.68,p=0.000;DBP:83.67±10.32vs81.21±17.95，p=0.000）。可见，在eGFR尚处于正常或者高于正常时是给予2型糖尿病肾病患者替米沙坦治疗的极佳时期，我们推测尽早使用适当的RAAS阻滞剂治疗可能预防或者延迟早期糖尿病肾病的发生。33 5.结论和展望5.1小结本研究发现：（1）病程大于5年的糖尿病患者的血、尿NGAL在蛋白尿出现之前就已经明显升高，且均与众多肾功能指标密切相关。NGAL可能成为诊断早期2型DN发生及判断病情进展的一种灵敏的肾小管标志物。（2）ROC曲线分析显示：血、尿NGAL作为诊断早期2型糖尿病肾病发生（蛋白尿尚属正常）的标志物，都具有较高的临床实用价值，明显优于CysC、hsCRP、eGFR、UACR等肾功能指标，其中，血NGAL较尿NGAL具有更高诊断价值。即血NGAL>225.5ng/ml和（或）尿NGAL>46.00ng/ml时应高度怀疑早期DN发生，而尿NGAL更适合用来评估2型糖尿病肾病病情进展。（3）本实验推测微量蛋白尿糖尿病肾病患者的血NGAL下降与该时期的高滤过状态有关，血、尿NGAL水平受肾脏及肾外组织的分泌、肾小球滤过状态及肾小管重吸收功能综合因素影响，在肾脏不同时期表现不同。（4）替米沙坦治疗能明显改善DN早期的肾小球高滤过和肾小管重吸收功能，减少血、尿NGAL水平，尽早使用适当的RAAS阻滞剂治疗可以预防或者延迟早期糖尿病肾病的发生。5.2展望尽管如此，本实验还存在着如下不足：1、为单中心、小样本研究，这可能夸大或者缩小了NGAL与众多肾功能指标的相关关系。2、缺少对伴大量蛋白尿的DN患者的干预研究。3、采用尿蛋白肌酐比值法对DN进行分组，但仅取单次晨尿或者随机尿检测尿白蛋白，存在一定程度的误差。4、从一般资料中可以看到，DN2组的腰臀比明显高于DN1及NC组，虽然三组体重指数差别无统计学意义，但本实验并不能完全排除肥胖因素的影响。5、仅对一种肾小管标志物进行研究，未做同类对比。如其它肾小管标志物KidneyInjury[37]Molecule1（KIM1）、N-acetyl-beta-D-glucosaminidase(NCG)等，最近Vaidya等人在对伴微量蛋白尿的1型糖尿病肾病患者进行研究时发现，经过2年的随访，患者的微量蛋白尿回复至正常，而这两种肾小管标志物水平也明显下降，即肾小管标志物降低预示着34 病情好转。所以，今后开展多中心、大样本并包括大量蛋白尿的DN患者的研究更有益于挖掘血、尿NGAL在DN发生、发展所起的作用。非同日不少于三次检测取平均值来准确评估尿白蛋白能尽量减少实验误差，而KIM1,NCG等更多的肾小管标志物需被同步纳入实验进行对比。35 6.参考文献[1]http://www.morningpost.com.cn[EB/OL].北京晨报,2009,11(14)。[2]LeveyAS,CoreshJ,BalkE,etal.NationalKidneyFoundationpracticeguidelinesforchronickidneydisease:evaluation,classification,andstratification.AnnInternMed,2003,139:137-147.[3]HojsR,BevcS,EkartR,etal:Kidneyfunationestimatingequationsinpatientswithchronickidneydisease.IntJClinPract.2011;65(4):458-64.[4]RichardEGilbert,MarkECooper.Thetubulointerstitiuminprogressivediabetickidneydisease:Morethananaftermathofglomerularinjury?KindeyInternational,1999,56:1627-1637.[5]AmandineViau,1KhalilElKaroui,1DeniseLaouari,et,al.Lipocalin2isessentialforchronickidneydiseaseprogressioninmiceandhumans.JClinInvest2010;doi:10.1172/JCI42004.[6]MishraJ,MaQ,PradaAetalIdentificationofneutrophilgelatinase-associatedlipocalinasanovelearlyurinarybiomarkerforischemicreNAlinjury.JAmSocNephrol,2003,14:2534–2543.[7]MishraJ,DentC,TarabishiR,etal.Neutrophilgelatinase-associatedlipocalin(NGAL)asabiomarkerforacuterenalinjuryfollowingcardiacsurgery[J].Lanaet,2005,365:1231-1238.[8]NickolasTL,O’RourkeMJ,YangJetalSensitivityandspecificityofasingleemergenaydepartmentmeasurementofurinaryneutrophilgelatinase-associatedlipocalinfordiagnosingacutekidneyinjury.AnnInternMed,2008,148:810–819.[9]DeGeusHR,BakkerJ,LesaffreEM,etal.NeutrophilGelatiNAse-associatedLipocalinatICUAdmissionPredictsforAcuteKidneyInjuryinAdultPatients.AmJRespirCritCareMed,2010.[10]HaaseM,BellomoR,DevarajanPetal.AccuracyofneutrophilgelatiNAse-associatedlipocalin(NGAL)indiagnosisandprognosisinacutekidneyinjury:asystematicreviewandmeta-analysis.AmJKidneyDis2009;54:1012–1024[11]DingH,HeY,LiKetal.Urinaryneutrophilgelatinase-associatedlipocalin(NGAL)isanearlybiomarkerforrenaltubulointerstitialinjuryinIgAnephropathy.ClinImmunol,2007,123:227–234.[12]WangY,LamKS，KraegenEW,etal.Lipocalin-2IsanInflammatoryMarkerClosely36 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