甜菜坏死黄脉病毒侵染本生烟和大果甜菜的生物学、转录组学和蛋白质组学研究

《甜菜坏死黄脉病毒侵染本生烟和大果甜菜的生物学、转录组学和蛋白质组学研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

分类号：单位代码：密级学号：博士学位论文甜菜坏死黄脉病毒侵染本生烟和大果甜菜的生物学、转录组学和蛋白质组学研究研究生：范慧艳指导教韩成贵教授申请学位门类级别：农学博士专业名称：植物病理学研究方向：分子植物病毒学所在学院：农学与生物技术学院二零一四年五月 Ph.DDissertationBiological,transcriptomic,proteomicanalysisofNicotianabenthamianaandBetamacrocarpainfectedbyBeetnecroticyellowveinvirusPresentedtoChinaAgriculturalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofPhilosophyCandidate:HuiyanFanSupervisor:ChengguiHanMay2014 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中已经注明引用和致谢的内容外,论文中不包含本人和其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：时间：；年左月曰关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人同意中国农业大学有权保存及向国家有关部门和机构送交论文的纸质版和电子版,允许论文被查阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》或《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版,并享受相关权益。保密的学位论文在解密后应遵守此协议)学位论文作者签名：兔緣艳时间：义年月如曰导师签名：支时间：一今■年月办日 摘要甜菜坏死黄脉病毒,基因组包含条正单链,是甜菜丛根病的病原物,对甜菜生产造成严重危害,在全球各个甜菜主产区均有分布。该病毒在不同寄主上的系统侵染能力和致病性不尽相同,本论文在己有的研究基础上,主要对侵染系统寄主本生烟和大果甜菜的生物学、转录组学和蛋白组学特点进行比较分析。本实验室前期研究表明,在系统侵染本生烟时会发生高频的自然丢失。为了探究导致不稳定的原因,先对在不同系统寄主本生烟和大果甜菜上的稳定性和复制积累量进行了比较。和分析表明,在大果甜菜上可以稳定地系统侵染,复制积累量也明显高于本生烟。利用、以及重组分子转染本生烟原生质体,证明复制效率低是导致其在本生烟上不稳定的主要原因,且该复制能力主要与其非翻译区序列密切相关。系统侵染本生烟,当含有时可以造成叶片下卷、植株矮化的严重型症状,但不含时则表现为温和型症状。激光共聚焦扫描显微镜观察发现,编码的致病因子与的融合蛋白主要定位在本生烟表皮细胞的细胞核内。由此推测,导致的严重型症状的原因可能是的核定位影响了植物的转录谱表达进而改变了植物的正常生理代谢。因此,利用新一代测序技术对不同分离物侵染本生烟后叶片组织的转录组表达进行了分析。将,侵染的样品与健康样品比较,共得到,条差异表达的转录本,其中包含大量由病毒侵染激活的寄主抗病候选基因。数据分析表明,由导致的严重症状表型可能与基因沉默、泛素化途径、细胞壁合成以及赤霉素代谢等相关基因有关。为了比较在本生烟和大果甜菜上致病机制的差异,利用测序平台对大果甜菜也进行了转录组测序并对侵染后整个转录谱变化进行了比较。通过拼接,共获得,条,个基因在侵染后表达发生明显变化,其中个基因上调表达,个基因下调表达。功能分析表明这些基因主要涉及生物性刺激反应和初级代谢过程。蛋白质是生理功能的具体执行者,对蛋白质的研究将直接阐明发病的生理和病理条件下的变化机制。从水平进行研究,只包括了转录水平的调控,不能反映蛋白质的表达水平。蛋白质组学是从整体角度分析细胞蛋白的动态变化,可以获取样品完整的蛋白表达图谱。为此,利用双向电泳(,技术结合质谱鉴定和生物信息学方法,初步分析了、侵染本生烟后叶片组织的蛋白质组变化,共鉴定出个差异表达蛋白质点,功能分析表明这些蛋白主要与植物抗病性、细胞骨架、应激反应、光合作用及氧化还原等功能相关。本实验第一次提供了与本生烟相互作用的蛋白质表达全貌,为今后更好地理解在寄主植物上的致病机理提供蛋白质组学方面的信息。关键词：甜菜坏死黄脉病毒,与,本生烟,大果甜菜,转录组学与蛋白质组学 AbstractBeetnecroticyellowveinvirus(BNYVV),containseitherfourorfiveplus-sensesinglestrandedRNAsandisthecausalagentofrhizomaniadiseaseinsugarbeet,whichisawidelydistributedvirusinmostregionsoftheworld.Thevirusexhibitsvarioussystemicinfectivityandpathogenicityindifferenthosts.Basedonthepreviousresearches,thisdissertationwasmainlyfocusonbiological,transcriptomic,proteomicanalysisofNicotianabenthamiartaandBetamacrocarpainfectedbyBNYWwithdifferentRNAcomponents.OurpreviousstudieshavedemonstratedthatRNA5wasusuallyeliminatedspontaneouslyinN.benthamiana.TounderstandthecauseofRNA5instability,themaintenanceandaccumulationofBNYVVRNA5wereinvestigatedduringsystemicinfectionsofN.benthamianaandB.macrocarpa.RT-PCRandNorthernblotanalysisshowedthatRNA5hadahigherlevelofaccumulationandwasmaintainedmoreconsistentlyinB.macrocarpathaninN.benthamiana.Comparativeanalysisofp-glucuroidase(GUS)expressionfromRNA4andRNA5repliconsandrecombinantsrevealedthatuntranslatedregions(UTR)sequenceinRNA5hadapositiveeffectonreplicationinprotoplastsandsystemicinfectionofN.benthamiana.ThesedatademonstratethatthelowreplicationefficiencyofRNA5dependsontheuntranslatedsequenceandregardstosystemicinfectivityinN.benthamiana.BNYWcaninfectN.benthamianasystemically,, Proteinsarespecificphysiologicalfunctionsexecutor,thestudyofproteinexrpessionchangeswilldirectlyelucidatethemechanismunderphysiologicalandpathologicalconditions.TheresearchatmRNAlevelcanonlyreflecttheregulationoftranscription,butcannotreflecttheexpressionoftheprotein.Proteomicsisthelarge-scalestudyofproteins,withwhichwecangainaglobalunderstandingofproteinexpressionpaternofsamples.Usingtwo-dimesionalelectrophoresis(2-DE)followedbymassspectrometryandbioinformaticsmethodtoanalyzetheproteinexpressionchangesinBN3-andBN34-infectedN.benthamianaleaves.ThesignificantexpressionalchangesinN.benthamianaproteinsweremostlyrelatedtopathogenesis-relatedproteins,cytoskeletalproteins,stressreponseproteinsandproteinsinvolvedinphotosynthsis,oxidationreductionandmetabolism.Thirteendifferentiallyexpressedproteinsweresuccessfullyidentified.ThestudyisthefirstattempttocomaprethecomplexpictureofN.benthamianaproteinexpressionduringBNYWinfection,henceprovideslargescalevaluableprotein-relatedinformationforbeterunderstandingthehostimmuneresponsetoBNYWandpotentiallymlecularpathogenesis.Keywords:Beetnecroticyellowveinvirus,RNA4andRNA5,Nicotianabenthamiana,, 縮略词表缩写全称中文名称竹花叶病毒甜菜坏死黄脉病毒双分子荧光互补实验蓝绿温和凝胶电泳甜菜土传花叶病毒牛蒡斑驳病毒甜菜黄化病毒花椰菜花叶病毒木薯褐条病毒黄瓜花叶病毒免疫共沉淀数字基因表达谱斑点免疫结合试验表达序列标签荧光共振能量转移实验磷酸甘油醛脱氢酶葡萄卷叶病毒葡萄病毒等电点聚焦促分裂原活化蛋白激酶玉米细条纹病毒大规模平行测序技术开放阅读框木瓜粘性病毒马铃薯帚顶病毒病程相关蛋白花生矮化病毒马铃薯病毒依赖于的聚合酶水稻条纹坏死病毒一枝蒿莲痕病毒水稻条纹病毒水稻黄化斑驳病毒 SBWMVSoil-bornewheatmosaicvirus土传小麦花叶病毒南方豇豆花叶病毒南方水稻黑条矮缩病毒三联基因区烟草花叶病毒番茄花叶病毒烟草脆裂病毒番茄斑萎病毒番茄斑点枯萎病毒中国番茄黄化曲叶病毒番郝黄化曲叶病毒非翻译区酵母双杂交双向荧光差异凝胶电泳技术双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 m^Abstract缩略词表—章文献综转录组学及其在病毒与植物互作研究中的应用转录组学概述转录组学研究技术转录组测序在植物病毒研究中的应用蛋白组学及其在病毒与植物互作研究中的应用蛋白组学概述蛋白组学研究技术蛋白质组学在植物与病毒互作研究中的应用甜菜坏死黄脉病毒的研究进展甜菜坏死黄脉病毒概述甜菜坏死黄脉病毒株系分类本论文研究的目的及意义第二章材料与方法实验材料毒源和抗血清植物材料和培养条件菌种和载体侵染性克隆引物设计和序列测定酶和化学试剂试剂配制常用溶液和试剂具体实验所用溶液和试剂实验方法髙温高压蒸汽灭菌的制备重组克隆的构建接种寄主植物及检测介导法转化本生烟原生质体农杆菌浸润法瞬时表达目的蛋白 2.3.7蛋白质双向电泳实验检测植物内源基因转录水平的表达差异第三章甜菜坏死黄脉病毒在不同寄主植物上系统侵染能力的比较研究和在不同寄主上系统侵染能力的比较和在不同寄主上系统侵染能力的检测和系统运动能力的比较和复制能力的比较转染本生烟原生质体体系的建立及条件优化和在本生烟原生质体上复制积累量的比较的非翻译区对其在本生烟系统侵染不稳定的影响与重组病毒在不同寄主上系统侵染能力的比较与重组病毒在本生烟原生质体中复制积累量的比较小结与讨论的复制能力是系统侵染不稳定的关键原因的复制积累量主要与其非翻译区密切相关在不同寄主上复制积累量存在差异可能的原因第四章受甜菜坏死黄脉病毒侵染的本生烟的转录组测序及分析可加重在本生烟上的症状不同组分侵染本生烟的症状差异不同组分侵染本生烟对病毒积累量的影响编码的蛋白在细胞内的定位蛋白融合在植物细胞中的定位蛋白融合在植物细胞中的定位和在植物细胞核中存在互作本生烟转录组测序测序样品的提取与检测转录组测序的拼接与注释转录组数据差异比较分析病害症状相关因子的筛选方法验证测序结果赤霉素喷施对产生症状的影响小结与讨论侵染改变本生烟转录组表达可能的机制对植物防御机制相关基因的影响加重本生烟病害症状的原因分析第五章受甜菜坏死黄脉病毒侵染的大果甜菜的转录组和测序 及分析侵染大果甜菜的症状和分子检测大果甜菜转录组测序转录组测序的拼接与注释大果甜菜的发掘转录组数据的差异比较分析方法验证测序受侵染的大果甜菜的高通量测序分析大果甜菜高通量测序样品之间不同的群体构成的长度分析正负义链的极性分布和端核苷酸偏好性在病毒基因组上的分布小结与讨论侵染对大果甜菜基因表达的影响不同基因组产生的表达特征第六章受甜菜坏死黄脉病毒侵染的本生烟差异蛋白质组学初步研究不同组分侵染本生烟后叶片蛋白质双向电泳图谱分析本生烟叶片蛋白双向电泳条件的优化本生烟叶片蛋白双向电泳分析不同组分侵染本生烟后叶片蛋白质组的差异分析’差异表达蛋白点的筛选蛋白质点的质谱鉴定小结与讨论蛋白质双向电泳的条件优化侵染后本生烟叶片组织蛋白质组差异的结果分析第七章结论与展望结论展望附录引物赚附录本生烟晰戈谢通路注释附录第四章检测所用到的引物列表附录大果甜的代谢通路注释附录第五章检测所用到的引物列表 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述第一章文献综述作为一种细胞内专性寄生物,病毒需要依赖寄主蛋白或核酸参与其侵染、复制、装配和运动等过程来完成其生命循环。植物病毒侵染寄主植物的过程中通常采用多种策略适应或改变寄主细胞从而达到复制增殖的目的,如抑制转录后基因沉默,干扰植物细胞周期、促进细胞间的移动等。与此同时,植物也发生了一系列生理和组织变化来抵御病毒或其它病原物的侵染。在病毒与寄主植物相互作用的过程中,往往会伴随花叶、矮化、皱缩、萎蔫和畸形等症状的产生。随着生物化学、细胞生物学、遗传学、功能基因组学以及分子生物学技术的应用和发展,参与病毒活动及致病的寄主因子以及它们的作用正逐渐被揭示出来。病毒与寄主间的互作包括直接互作和间接互作。直接互作一般指寄主的蛋白、膜和核酸与病毒的大分子之间存在的特异性识别,其作用涉及整个病毒侵染循环,往往是对病毒的复制和侵染极其重要甚至起决定性作用(。例如多种马铃薯病毒属病毒的基因组链接蛋白(可选择与不同的植物的基因家族成员直接互作参与病毒蛋白的起始合成,同时阻止寄主细胞本身的蛋白表达起始(。竹花叶病毒及其卫星的区域可以与互作显著地负调控病毒基因组的积累寄主除了参与病毒的复制与翻译,也常常影响病毒的运动。番菊花叶病毒与蛋白互作是病毒长距离运动所必需的,通过分离叶绿体的试验表明,这种互作可能会影响叶绿体功能的稳定性,从而引起褪绿症状(。甜菜黄化病毒的证明可以与细胞骨架结构的肌动蛋白互作参与细胞的胞间移动(。目前鉴定与病毒直接互作的寄主因子主要通过酵母双杂系统、双分子突光互补实验(、焚光共振能量转移实验免疫共沉淀技术(和基于表面等离子共振(,的系统等技术手段展开。除了寄主与病毒大分子之间的直接互作外,存在更为普遍的是病毒与寄主之间的间接互作。病毒的侵染往往会引起一系列信号转导与识别,随后激发一系列反应(图可能直接或间接地使大量植物基因的表达发生明显变化,其中各种植物基因的开启或关闭都属于病毒与寄主的间接互作(,。最常见的例子就是抗性基因识别病原物后的过敏性坏死反应以及伴随着的病程相关蛋白(和其他抗病组分表达的剧烈变化,而病毒入侵寄主后通过影响某个编码关键组分基因干扰寄主内源激素的正常代谢水平则可导致各种症状的产生。这些表型往往不是由单个基因控制的,而是由一个调控机制网络来完成。由于调控机制网络具有庞大和复杂的特点,单个基因的检测已无法满足相应的研究需要(’。 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述德咖參泰攀…。￥田植物对病毒侵染的反应和基因表达的变化(‘年人类基因组计划的启动和后续各种组学技术的发展将生物学带入了全面的系统科学时代,使对植物整体调控机制网络的研究成为可能。目前各种组学技术在植物病毒与寄主间的互作研究,转基因抗病植物品种培育的应用己成为植物病理学领域的研究热点。这使我们可以从全局出发观察到一种病原侵染后整个基因组的表达变化,在对感病寄主受到病毒侵染的影响有了更为全面认识的同时,也可以筛选出一些新的抗性资源。转录组学及其在病毒与植物互作研究中的应用转录组学概述转录组的概念最先由等人(,提出,是指特定细胞在某一功能状态下每个基因的序列和表达水平全部信息的总和。同一细胞基因的表达情况具有特定的空间性和时间特性,在不同的生长时期或生长环境下是不完全相同的。不同与基因组静态实体的特点,转录组通常受外源和内源因子调控的,反映生物个体基因表达的动态过程,比如特定的组织器官或不同生长发育阶段所有基因的表达情况,能够提供全部基因的表达调节系统和蛋白质的功能,以及相互作用信息(,。此外,转录组学打破了传统选定单个基因或少数几个基因的局部研究模式,将功能基因组学研究带入了一个全新的宏观整体研究时代(,。转录组学通常仅指所有的总和,但随着研究的不断深入和技术上的不断创新,广义上转录组学包含的对象十分丰富,是指生物体细胞或组织在特定状态下所转录出来所有的总和,包括编码蛋白质的即、非编码蛋白质的如、、等)以及今年来研究热点之一长非编码等等。了解转录组学对揭示基因组的功能元件、细胞和组织中的分子组成以及发育和致病机理都是至关重要的。目前转录组学的研究主要包括、非编码和小在内的转录本的表达谱分析；确定基因的转录结构,包括转录起始位点、端和端、剪切模式以及转录后加工；通过比较不同组织或生理状况下 中国农业大,丨冉士立论文第章文献综述基因表达水差异,挖掘特定生理功能相关的基因(,丨,。转录组学研究技术酿酒酵母细胞是第个被描述的转呆组,共获得超过六万个转求本,其中包括,个从未被鉴定过的基因,。随着研究的逐步深入,形成了系列比较完善的方法和技术用于研究转呆组。前这辟研究技术主要分为两大类：(基于第代测序技术的转呆组分析方法,如表达序列标签(文库测序、基因表达序列分析技术、大规模行测序技术(和微阵列芯片(技术；基于第二代测序技术的转录组分析方法,如新兴起的测序(技术和数字基因表达谱(技术。基于第一代测序技术的转录组分析方法第一代测序技术,也称为测序法,是由等于十九世纪世纪中叶开创的双脱氧核苗酸末端终止法测序技术,成功绘制出世界第一张唾菌体全基因组图谱(。基本原理是通过在聚合酶作用下合成互补链过程中加入不同突光标记的双脱氧核苷三憐酸(使其不能结合后续形成憐酸二酷键,使得核酸链在某一特定碱基处终止,从而根据识别最后一位碱基的突光标记确定碱基的类型。随着技术的不断发展,新的测序技术层出不穷,但测序技术由于其拥有较好的测序准确性,在全世界范围内仍然被广泛应用。在测序技术的基础上,开发出了一系列转录组测序方法。其中文库测序和技术是最先应用于大规模转录组学研究的两大核心技术,分别由和于和年提出(,。技术的关键是利用消减杂交等方法构建自己所感兴趣文库,并对克隆进行大规模测序分析。目前,的转录组数据的数量最大,所涉及生物种类最全。美国为此专门设立数据库来收录这些数据,为研究人员比对和发掘基因序列、预测新基因的提供了超强大的数据库支持。但利用该技术所构建得到的文库通量较小,无法对某个未知遗传背景的物种进行整个转录组水平的系统研究,且对于低丰度的基因序列来说,在数据库中通常无法比对到匹配的信息。为了弥补技术的缺陷,技术开始出现,至今依然活跃于转录组学和比较基因组学的研究领域。微针芯片技术来是计算机芯片技术与杂交实验技术相结合的产物。与技术体系相比,通量上有了巨火的提升,同时可以检测上万个基因,且成本低,操作简年,很快在比较转录组相关的研究屮得到了广泛的应用(,,。年,公司于制作了世界上第一块微阵列芯片用于研究病毒的基因序列检测,此后各种特殊订制的基因芯片在世界生物领域显示出巨大的商业价值和研究意义。虽然技术大大促进了人们对转录组学的研究,但不可避免存在一些局限性。首先,需要设计相应样本的杂交探针,这对于一些非模式物种来说,由于缺乏基因序列信息而订制对应的芯片。其次,基因芯片对于表达量很低的基因类型因不容易杂交上而丢失,且相当高比例的标签不能与基组唯一！配,只能分析一部分转录本,。此外,同样基 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述于测序发展形成的和技术也在一定程度上得到应用,推动了后基因组时代的快速发展,。基于第二代测序技术的转录组分析方法第二代测序技术(,,被称为深度测序技术(是相对于第一代测序技术而言的新型测序方法。在传承第一代测序技术准确性的同时,兼具了高通量和低成本的特点,为快速、全面、准确地揭示生物基因组信息提供了可靠的技术支持与保障。目前三个大型的商业测序平台已经相当成熟,根据出现的时间顺序,分别是测序平台年、公司的和平台年,以及公司的测序平台年。其中,测序序列读长(最长,为但通量最低,仅有通量量最大,但读长短,仅为测的读长仅有,但双碱基编码的应用使其拥有独一无二的准确性,特别适合用于需要高质量参考基因组序列物种的重测序(,。迄今为止,第二代高通量测序己广泛应用于在生物基因组及表达研究的各个领域,诸如物种全基因组的从头测序(、测序(技术和数字基因表达谱(,测序等等,为挖掘基因表达水平和调控网络奠定了基础。测序是在第二代测序技术背景下发展而来,主要用于针对和的高通量测序技术。公司的测序平台和测序平台是目前转录组测序领域最常用的测序平台,其特点是通量高,成本低,准确性好,可重复性和灵敏度高,具备传统的测序技术和其他高通量测序平台不可比拟的独特优势。在全面揭示生物整个转录组所有转录本的同时也能够对不同转录本之间差异表达的精确分析。测序大致分为以下几步：(提取样品总利用带在有磁珠对进行富集；⑶将打断至小片段；利用反转录酶进行第一链的合成；(第二链的合成与片段末端修复和加；片段加接头；(扩增片段构建利用测序平台进行双端或单端测序；(所得的序列通过与参考基因组比对或从头组装(针对于没有参考基因组的物种)获得全基因组范围的转录谱,大致分析流程如图所示(,。的应用范围十分广泛,主要有：挖掘未知转录本和稀有转录本；确定基因表达量,分析不同转录本的表达水平差异；⑶研究非编码的功能和结构,包括、等(；,；转录本结构变异研究,发现新的剪切方式和基因融合模式(,；开发新的分子标记,如、、等(。技术的基本原理是利用反转录得到的进行双酶切,使得一条得到一个相对应的标签,而后进入高通量测序和数据分析流程,通过均一化处理后比较样品间标签条数的差异,从而反映出基因表达的差异。该技术与十分相似,均是利用标签标识某个基因,只是前者使用测序,而后者则基于高通量测序技术对标签进行直接测序,所以又称为。通过标签可以计算出基因的数,并使之转化为基因的表达值,所以可 中国农业大学博上学位论文第一章文献综述自接用于有参考基因组的物种或一些没有参考基因组但有足够的数据的物种。而在既没有参考基因组又没有数据库的物种中,技术常常与技术结合起来使用(。通常先对该物种进彳测序,获得一个完粮的转成组,然后对同处理的样本址彳丁数掘景相对较少的测序,比对已有的转求组信息分析各样本之间基因的差兄表达。一—一一—‘■一置〕岭岭———」导————一》寻‘套■■一个乂图转录组测序分析流程图转录组测序在植物病毒研究中的应用自第二十世纪年代中期,芯片开始用于大规模的基因表达水平研究。但是山于微阵列技术需要已知序列作为杂交的探针,无法检测新的其灵敏度：足以检测低丰度的基因表达,而这正是捕捉病毒侵染或其他逆境条件刺激下生物反应产生细微变化所必须的。随着新一代测序平台的市场化,技术拥有其他转及组技术无可比拟的优点：可以对未知的转组进行注释,定量分析基因表达,从而实现全基因组表达谱“数字化”,而且其成本通常低于大规模的测序或技术。前该技术已被用于分析表达谱、鉴定差兄表达基因、以及分析剪接变兄体。山于测序技术依赖于基因组序列信息,在未来的研究中,可以扩大研究的生物种类,对史多的非模式植物逃行转采组测序,以利于深度研究病毒与寄主植物或介体之的相互作用关系和致病机制。转录组测序在病毒寄主研究中的应用利用测序技术对病毒侵染！的寄主植物转采组进行分析的研究,里然近几年刚刚兴 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述起,但是发展速度非常快,目前己有不少报道(表。一般情况下,寄主植物的转录谱的表达会随着病毒侵染时期的变化而发生变化。比如：利用全转录组测序结合的方法对黄瓜花叶病毒株系侵染普通烟后的六个连续的发病时期：明脉、花叶、严重退绿斑、部分症状恢复、完全症状恢复和次级花叶,进行转录谱的比较分析,对病毒的系统症状的发展在分子水平上有了全面的了解。结果表明,在病毒侵染的发病初期首先会抑制植物光合作用和色素代谢,随着症状的逐渐加重各种抗病相关基因的表达开始不断提高,而发病后期伴随着隐症现象的出现,植物的天然免疫过程而非沉默过程被激活,由此推测植物的天然免疫机制可能在隐症过程中发挥关键作用(,。高通量测序分析不仅在模式植物烟草和本生烟中进行研究,还广泛应用于一些农作物和经济作物,例如水稻、玉米、番燕、木薯和葡萄等。年,研究小组使用全转录组测序的方法分析了被番前黄化曲叶病毒侵染的番前抗病品种和番前感病品种的表达谱。共获得,个注释基因,其中分别有个和个基因在抗病品种和感病品种中差异表达。功能分析显示,一部分防御相关基因的表达在两者间存在差异,比如转录因子(、基因(、蛋白激和类受体激酶(在抗性品种中均有不同程度的表达上调,推测番痴对于侵染的防御反应主要涉及细胞壁重组、转录调控、抗性基因、泛素化和代谢合成等通路(,。转录组测序在介体昆虫研究中的应用病毒的介体昆虫传播是指在环境条件影响下,病毒、介体和寄主植物之间特异性相互作用的一种现象,常见的介体昆虫有虫、叶禅、飞風、烟粉風和莉马等。目前测序也已逐步应用于病毒与介体互作的研究,试图通过对转录组的全局分析来解释病毒在传播过程中涉及的一些机制。玉米细条纹病毒属于双生病毒科、玉米线条病毒属、,黑面叶蜱是其目前唯一已被确定的传播介体,以持久性循回型方式传播。通过对携带病毒的黑面叶禅进行转录组测序之后发现,存在大量与其他昆虫类似的免疫防御基因的相似性序列,而传毒介体中肽聚糖识别蛋白(的表达量显著下调则暗示了该蛋白在病毒的传播过程中可能存在关键的作用。双生病毒科的菜豆金色花叶病毒属病毒以持久性循回型方式由烟粉風专化型传播,中国番節黄化曲叶病毒就是其中典型的病毒之一。利用测序技术对带毒和不带毒的烟粉風进行转录组分析结果表明,带毒烟粉虱有个基因在个生化途径中差异表达。通路分析则进一步说明,可以干扰烟粉風的细胞周期和初级代谢,对病毒复制和持久 ?j^卜§基§■§■§§髮鲁￡￡号善音目目；■§彩￡寸§§￡—：§§￡—賊言、匕圓髮養養：洛§§§运？椒雲謹上囊謹 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述性起到负面的影响。结果表明,可以侵入烟粉虱的卵巢和脂肪体组织,并在其中诱导自睡的产生。此外,病毒的侵染激发烟粉虱的免疫反应下调了参与信号通路和促分裂原活化蛋白激酶(通路基因的表达。这些结果揭示了与烟粉風协同进化的适应关系,将为将来植物病毒和昆虫间复杂的相互作用关系提供研究路线图(,。南方水稻黑条矮缩病毒属于呼肠孤病毒科斐济病毒属是由我国首先发现鉴定和命名的病毒新种,其传毒介体主要是白背飞風、。等人通过转录组的从头拼接和大规模平行测序,获得了白背飞風的全转录组数据,注释基因的功能分类与其他两个近缘飞風,褐飞風和灰飞虱、极为类似。代谢通路分析表明,的侵染扰乱了昆虫体内初级代谢、泛素蛋白酶途径和细胞骨架组织途径。此外,还激活了白背飞虱体内的免疫系统,比如干扰、自唆和抗菌肽的产生等(,。稻条纹病毒由介体昆虫灰飞虱以持久方式传播,是一种重要的水稻病害。釆用高通量焦磷酸测序产生的数据库对带毒和不带毒的灰飞虱进行转录组比较分析,发现除了之外,在带毒的昆虫体内还鉴定到了内共生细菌沃尔巴克氏体属和类酵母共生菌(这些试验结果为今后研究这些生物之间的共生机制提供了分子基础。番郝斑萎病毒属、的番菊斑萎病毒以持久性增值的方式通过莉马传播。最近,等人以西花蓟马为研究对象,通过第二代测序平台首次获得了莉马的转录组数据,通过同源比对获得了,个注释基因,其中有个基因与昆虫的抗药性相关。带毒与不带毒的样品数据比较发现,的侵染可以调节细胞过程和免疫反应,保证病毒在葡马细胞体内的低浓度,从而不会对莉马产生不利的影响,使自身能够持久地存活于介体体内(。利用録组測序检测植物病毒通过转录组测序可以获得大量的序列,把拼接好的长片段与已知病毒序列或寄主植物序列进行比对,在检测各种已知病毒的同时,还可以发现新病毒,并且可以把片段根据组装起来重构出完整的病毒的基因组。等人利用上述方法从千日红中发现了一个黄瓜花叶病毒属的新病毒,暂命名为蛇鞭菊轻微斑点病毒(,等人则从木薯中获得了木薯褐条病毒的两个病毒株系的全长基因组,分别为和,。随后,研究团队利用转录组测序发现,无论葡萄叶片是否发病,均能从中检测到葡萄黄斑类病毒啤酒花矮化类病毒、柑橘裂皮类病毒和相橘裂皮类病毒。參转录组测序的局限性 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述尽管新兴的测序技术能产生海量的数据,但对揭示病毒致病或传毒机制具体的应答途径并不是特别有效,其原因可能是所获得大量新数据没有及时转化成被广泛接受的模型,但基于直接测序所获得的大量核苷酸信息仍有望给植物病毒与寄主植物或传毒介体相互之间的研究带来新的机遇。此外,基因转录谱只能提供基因表达的信息,与自身的蛋白表达并不具备有必然的关联。蛋白质组学与转录组学研究结果的比较表明两者的相关性很低,比如转录水平和翻译水平不一致,无法反映翻译后修饰的信息例如磷酸化、乙酰化作用豆藉酰化等。因此,不能单独利用转录组数据解释病毒与寄主植物之间的抗逆生理机制,必须结合相应的蛋白质组学和代谢组学作出全面谨慎的分析。测序对分植物在病毒胁迫下的应答反应的分析,为了证明结果在很大程度上与已知的生理学研究结果吻合,往往过度简化为光合作用、初级能量代谢、以及氨基酸合成等相关基因表达下调,同时,病程相关蛋白、胁迫信号和转运蛋白等基因表达的上调,但这样的概括忽略了体内真正表达模式的复杂性,无法深入找到某个具体基因的功能,。此外,测序得到的数据异常巨大,需要借助得力的生物信息平台分析,但由于生物研究人员通常欠缺对计算机专业数据专业处理能力,经常无法获得理想的分析结果,造成大量测序数据的浪费,因此,需要在目前已获得的大量数据的基础上开发出一些列简单、适用、易操作的生物信息分析软件。蛋白组学及其在病毒与植物互作研究中的应用蛋白组学概述蛋白质组(这一概念最早是由提出(,,即基因组表达产生的所有相应的蛋白质,并由派生出蛋白质组学(—词,指的是一门从蛋白质的整体表达水平来阐明生命现象、研究生命活动规律的新学科(,。与静态的基因组学研究相比,蛋白质组是具有时间性、空间性的动态的细胞动力学研究,除生物体在不同发育阶段或是各种外界环境条件刺激下所有蛋白质的表达外,还包括大量的蛋白翻译后修饰和蛋白与蛋白相互作用等信息(,。蛋白组学研究技术蛋白质组学主要分为比较蛋白质组学,功能蛋白质组学和结构蛋白质组学。其中比较蛋白质组学是是目前应用最为广泛的蛋白质组学的研究模式,其研究策略是对细胞、组织整体或局部的蛋白表达情况进行比较、分析,鉴定不同样品间差异表达的蛋白；功能蛋白质组学主要研究蛋白质间、蛋白质与核酸间的相互作用,从而建立细胞内外信号传递的复杂网络；结构蛋白质组学则通过鉴定一个蛋白复合物或一个细胞器的所有蛋白,测定它们的位置、特性,研究蛋白之间的相互作用,有助于更好地理解细胞的整体结构,以及解释某一特定蛋白的表达对细胞产生的特定作用李平。技术方法对比较蛋白质组学研究的成功与否起到至关重要的作用。蛋白质组学研究技术远比基因研究技术更为复杂和困难,因为不仅蛋白质氨基酸残基种类数要远多于核苷酸残基数,而且还具有憐酸化、泛素化和糖基化等一系列复杂的蛋白质翻译后修饰。蛋白质组学首先需要对蛋白质进行大规模的平行分离分析,所以现在甚至今后相当长的一段时间内在的蛋白质组 中国农业大学博士学位论文第章文献综述学研究的主要任务是开发高通量,高灵敏度,高精度的〒台技术。蛋质组学研究过程主要由三个部分组成：分离蛋白质、鉴定蛋质和鉴定结果的生物信息学分析。前主要的蛋质分离技术有双向聚丙稀酰胺凝胶电泳(、突光差异凝胶电泳(、高效液相居析、高效亲和层析(和毛细管电泳(等。其中最为常用的足技术和技术。技术的应用始于世纪年代(,迄今为止仍然是分离蛋白质最有效的方法,该方法具有通量高、灵敏度高、重复性好等优点。其基本说理是根据蛋质的分子量和等电点的不同将各种蛋质分离开。其中第向分离是等电聚焦使得蛋白质沿梯度电泳至各自的等电点。第二向分离是聚丙稀酰胺凝胶电泳(,在第一向等电点分离的基础上,通过聚丙稀酰胺对分子量大小不同的蛋白质再次在垂直方向进行分离。通过两个彼此不相关的重要性质分离得到的蛋白质分辨率比较高,一般能分辨出个蛋白质样点(,。为了比较不同处理的蛋白质组表达的差异,图像分析也是技术关键的一部分。通常样品需要在银染、考马斯亮蓝染色、突光染色或同位素标记后,利用图像扫描仪、焚光或磷光测定仪等设备上获得双向凝胶电泳图谱进行后续比对分析(。技术是在传统的技术的基础上引入了内标,即利用多重突光,进行标记,可以在同一块胶上同时分离多个样品,极大地提高了结果的准确性、重复性和可靠性。在技术中,软件能够根据每个蛋白点的内标自动对其表达量进行校准,从而真实地反映出蛋白质丰度的变化(。利用技术还可以对样品进行蛋白质组痕量分析,甚至可以检测到两个样品间小于的蛋白表达差异。前使用广泛的蛋白质鉴定技术主要有质谱鉴定技术和同位素标记相对和绝对定量技术。质谱技术的进步为近年来蛋质组学研究的发展提供了不可或缺的助力,其原理是将离子化的样品分子通过检测离子间质荷比(来确定质量,具有高灵敏度、高特异性、检测快等优点。质谱测定的过程首先是通过分离得到单个的蛋白质点,然后用蛋白酶例如胰蛋白酶将其消化成小的肽段,最后利用质谱仪对各个肽段进行指纹图谱鉴定。质谱仪根据软电离离子化技术的差别,分为基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(、表面增强激光解吸离子化质谱(和电喷雾电离质谱(三者所获得的质谱信息可以相互补充(,。除了能够测量蛋白质的相对分量和氨基酸序列外,质谱技术还可用于一些蛋白质的翻译后修饰研究,但暂时只适用于较短的氨基酸的肽段,大概在：十几个氨基酸以内。对于异亮氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺以及某些肽的岡有序列,前的质谱技术也无法区分。是山美应用生物系统公司研发的一种多肽体外标记技术。其原理是首先将蛋白质裂解为肽段后,用试剂进行差异标记后可同时对种或种不同的样品进行比较。该技术的主要特点在于：分离能力强、覆盖范围广；可以定性分析,在给出每一个蛋白的绝对表达量或相对表达量的同时,还能提供分了量和结构信息；高灵敏度,可以满足对微小变化差异的检测要求；分离效果好,分析时间快；自动化程度高；应用范围广,除发现常规的胞楽蛋白外,对膜蛋白、核蛋白及胞 |||M农业大学博士学位论文第章文献综述外蛋也具有良好的检测效果。值得注意的是,技术可以发现更多数量和种类的蛋,而结合使用在比较胞策蛋质表达量变化具有优势的技术,则可以弥补实验结果的足(,。除上述提到的两种常见的技术外,基于高通量、高灵敏度等检测要求,前还幵发了其他辟更具针对性的蛋质鉴定技术,如同位素亲和标签(技术、无标记的质谱定量方法(、表增强激光解析电离飞行吋叫质谱和蛋质芯片技术等。生物倍息学对数据的处理和分析也是蛋白质组研究的个重要内容。根据各自的功能特点,蛋质数据库主要包括序列数据库、结构数据库和功能数据库。前蛋白质组学研究中最常用的数据库有、、、、、、等。其中对数据录入最为严格,需要人工审核,且只收录实际存在的蛋质。而且每条数据都有详细的注释以及引文和其他数据序的链接。因此,任何蛋白质序列数据的搜寻和比较都应先用进行搜索,如果获得不到相应信息,再尝试比对其他数据库。国际蛋白质序列数据库也是常用的一个蛋白质数据库,它包含所有序列已知的然界中野生型蛋白质的信息。所包含信息最为全面,包括由中翻译而来的蛋白质信息,以及、和数据库中蛋白质序列。通常情况下会对几个数据库的信息进行联合搜索,最后综合比较来对已知或未知的基因产物进行功能分析和预测。蛋白质组学在植物与病毒互作研究中的应用病毒侵染植物后,为了适应寄主细胞的环境完成身的侵染循环,通常会编码一些多功能蛋白质与寄主蛋白发生一系列的相互作用,比如改变寄主细胞蛋白表达模式、蛋白翻译后修饰、以及蛋白酶剪接等。病毒与寄主之间的相互作用的全过程,包括病毒的复制和翻译、胞间运动和长距离运动、以及对寄主抗病性的抑制作用等。在这个极为复杂的过程中,无论是寄主因子,还是病毒自身表达的蛋白,抑或两者间的相互作用都起到了十分重要的作用。近年高通量蛋白组学技术有了飞速的发展,已被广泛应用于病毒寄主相互作用的研究中,为揭示病毒的分子致病机制、对新的病毒病害的诊断和防治提供了新的解决途径。但是由于从高通量数据中获得的结果存在一定的假阳性,大多数通过蛋白质组学方法鉴定得到的病毒和寄主间相互作用的蛋白,还需结合其他的技术手段进一步进行验证,比如酵母双杂交实验、双分子劳光互补实验、体外实验及免疫共沉淀实验等,在确定蛋白相互作用之后,通常还会利用病毒载体瞬时表达蛋白或诱导基因沉默,以及转基因过表达技术等对该蛋白的生物学意义进行更为深入的研究。病毒诱导的差异蛋白质组研究最早有关植物病毒与寄主相互作用的蛋內组学的研究是在经典植物病毒互作模型—侵染烟草上进行的。年研究小组对侵染三生烟、诱导表达的蛋白变化进行了系统的分析,并通过抗体库鉴定出了包括、在内的多个抗病蛋白(,。随着高通量测序技术的飞速进步,包括植物拟南芥和烟草在内的更多植物的基因组信息被公布,在拥有完善的蛋白质数据库的基础上,一些农作物和经济作物,例如水稻、玉米、甜菜、棉花和葡萄等与病毒相关的蛋白质组学研究的报道也越来越多, H~i"3'crIf§城■§§—；名自者曰§；§§§§§自穿寸§§￡§罕老长：！讀”‘：腫—載抓§§§套：§§。 3Cog^§§°§§；§、名￡￡￡§考長邑■§§§§圉：譲°麵廷今画囊：§§§■§°￡抓§§§努售务■室隱義圓身 媒藤§衰,；贫贫宅￡§；§曰‘§§百兰“墓若！曰奋曹爸孩￡奋§二二§§基与§養§§■§￡￡、敏今§§—：：公 巾国农、大学博士学位论文第章文献综述表例举了比较经典的儿炎病毒与寄主植物相互作用的蛋组学研究。差异衣达蛋体现了寄主细胞正常生理途径的改变,同吋也揭不了病毒与寄主問的相互作,为进步探究病毒侵染和致病机制提供了研究方向和蛋组学倍总。年,等人通过多维高效液相质谱法和分析了侵染两种甜菜品系：感病品种(和抗病品种(后根部组织的蛋质组变化,井鉴定出个蛋白斑点,其中有个蛋差另农达,这辟蛋丨：主要属于病程相关蛋,例如儿丁质酶,葡聚糖酶和防御素等在感病和抗病品种中均有表达,在抗病品种中农达量更高。片由沾性氧刺激产生的氧化酶类,例如多酌氧化酶(和草酸氧化酶(也有类似的蛋白表达模式。而一些激素相关蛋例如蛋白(、生长素相应因子(和胁迫成熟诱导蛋白只在感病品种中过量表达,表明这些蛋白很有可能参与植物的防御反应或症状的产生(丨。很多病毒在寄主植物中能够造成系统侵染,为了对该植物受到病毒侵染后的蛋白表达谱有一个全面的了解,往往会对其不同组织、器官和亚细胞水平的蛋白组进行差异比较。例如木瓜粘性病毒可以系统侵染木瓜,最初的症状是叶片坏死,之后在果实内大量复制繁殖,通过改变果菜内钾离子的水平影响渗透平衡,最终导致细胞的破裂使果装外溢。和他的同事分别对侵染后寄主植物叶片和果楽的蛋白质表达变化进行了研究,用和两种方法在叶片上分别获得个和个差异表达蛋白,主要包括胁迫相关蛋白和新陈代谢相关蛋白。应用在果楽样品中鉴定出个差异表达蛋白,主要是各种不同亚型的植物蛋白酶。进一步的分析结果表明,的侵染可以诱导木瓜产生胁迫相关蛋白,同时抑制初级代谢相关蛋白和果菜蛋白水解酶的表达,因此,这些蛋白的表达可以作为控制木瓜粘性病害研究中的候选生物标记(〖,。除了单个病毒的侵染外,多种病毒复合侵染后植物的蛋白质表达水平变化的研究也有相关报道。最近的一项研究工作就是将三种朝皮部局限的病毒：葡萄卷叶病—、葡萄病毒和一枝蒿蓬撞病毒复合侵染葡萄,分别在果肉和果皮样品中检测到个和个差异表达蛋白,发现在病毒侵染后果皮中主要是氧化应激反应蛋白的表达受到影响,而果肉中则是细胞结构新陈代谢相关蛋白表达被强烈抑制,从而导致衆果的软化变形。此外,三种病毒仅有的外売蛋内在果皮中被检测到(。花生矮化病毒、是黄瓜花叶病毒属成员,具有三条基因组和两条亚基因组,某些株系的病毒颗粒内包裹着卫星。年等研究者对株系以及其卫星侵染木生烟后叶片的蛋白质谱变化进行了分析,发现与其卫星共同侵染时有个蛋白差异表达,其屮仅有个蛋白的表达量有所升高,其余蛋白的表达均有一定程度的下调。结合单独侵染后的蛋白谱数据表明,的卫星主要影响植物的光合作用和碳水化合物代谢途径,不参与诱导植物的防御反应相关蛋白,甚至某一程度上对该类蛋白质的表达会有所抑制(。病毒与寄主蛋白互作的蛋白质组研究 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述蛋白质之间的相互作用承载着细胞的一切代谢活动如生物催化、物质转运、信号转导、免疫及细胞调控,贯穿了一个生物体生长发育的整个过程,且大部分的蛋白都通过蛋白复合物的形式或和伴侣分子一起发挥作用的。这种蛋白质蛋白质相互作用在植物防御病原微生物的调控网络中非常普遍,要深入理解病原微生物的致病机制,就必须涉及到蛋白质相互作用的研究。自从等人首次将酵母双杂交(应用于病毒病毒蛋白相互作用的研究中以来(,,该方法已成为研究病毒侵染寄主植物过程中蛋白质蛋白质相互作用最经典的方法之一。但由于酵母双杂交存在实验过程繁琐,假阳性率高等缺点,近年来,一些新颖的蛋白质组学技术,如、蓝绿温和凝胶电泳(、串联亲和纯化(、免疫共沉淀等也逐渐受到多个实验室的青睐,应用于植物和病原蛋白间相互作用研究。等人基于和串联开发了一种蹄选病毒与寄主互作蛋白的方法,从侵染了水稻黄化斑驳病毒的水稻样品中提取病毒与寄主蛋白的复合物,并通过不同的蛋白质复合物确定病毒的侵染阶段,结果显示与病毒互作的蛋白质参与植物防御(例如过氧化物酶、新陈代谢(例如糖酵解、苹果酸和梓檬酸循环、以及蛋白的合成(例如延伸因子、分子伴侶)等。推测可能为病毒的复制提供所需的物质、能量和酶,从而帮助其完成侵染循环。在南方豆花叶病毒和普通烟、的病毒寄主组合中也得到了类似的结果,说明不同的病毒在侵染植物时寄主的同源蛋白可能起到相同的作用(。除了通过提取病毒与寄主蛋白的复合物来蹄选体内互作蛋白,还可以利用和的方法筛选体外互作蛋白,即先将寄主的总蛋白有效分离,然后与蛋白编码的目的蛋白进行体外解育,最后利用血清学鉴定的方法获得与其互作蛋白。周益军课题组就利用类似的方法从传毒介体灰飞虱中筛选到了与互作的五个蛋白,其中三个核糖体蛋白(,和在进一步的酵母双杂交实验中依然互作,另外两个蛋白激活蛋白藤,和磷酸甘油酸脱氢酶不互作。但在斑点免疫结合试验(中,这五个蛋白均能与的病毒粒体结合。推测和参与了病毒粒体在介体上表皮细胞间的胞转作用,而三个核糖体蛋白很可能在病毒侵染和复制中起到关键作用。利用蛋白质组研究技术发现新病毒在全面了解寄主蛋白质组信息的基础上,还可以利用差异蛋白质组技术鉴定待检测植物中未知病毒的种类,进而展开后续病毒学研究。研究小组首次利用和技术,获得了未知病毒侵染的烟草叶片组织中的差异表达蛋白质信息,并根据与已知病毒蛋白的特异性,成功鉴定出侵染植物的未知病毒为马铃薯病毒(,,。随后,研究小组通过利用高分辨率的串联质谱技术和从头测序的方法,将获得的蛋白肽段信息与已知病毒数据库进行同源性比对,从西氏烟中不仅准确鉴定出了已知的黄瓜花叶病毒和番却斑萎病毒、,还同时检测到种未知病毒,发现种分别属于马铃薯病毒属和葡萄病毒属的新病毒(,。这一实验 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述的成功意味着,作为高通量扫描工具的差异蛋白质组学技术可以为植物的病毒病害检测提供了一种更加快速和简便的鉴定方法,对相关植物病毒的防治、病毒与寄主的致病机制研究产生深远影响。甜菜坏死黄脉病毒的研究进展甜菜坏死黄脉病毒概述甜菜坏死黄脉柄毒是一■种正义的多分体杆状病毒,由甜菜多點菌传播,是甜菜丛根病(的病原物。甜菜丛根病是一种重要的甜菜病害,在世纪中期发现于意大利北部,而病原物则首先由日本学者和于年命名(,。国际病毒分类委员会(丨曾将归为真菌传杆状病毒属可能成员,随着科学研究的逐步深入,根据传播介体、病毒基因组数量和结构特征等对这些真菌传植物病毒进行了重新分类。新建立的甜菜坏死黄脉病毒属的特征是由甜菜多點菌传播,具有或条基因组、和且基因组端有⑷尾。目前、甜菜土传花叶病毒和牛蒡斑驳病毒是该属的确定成员,水稻条纹坏死病毒是该属的暂定成员(甜菜丛根病的症状、危害及分布由引起的甜菜丛根病最典型的症状特征是感病植株主根缩短主根和侧根异常增生。一些小根通常坏死,最终会形成“胡须状”、“酒瓶状”的丛根症状(图,在块根和侧根的剖面可以看到维管束黄化或坏死。该病叶部症状变化较多,在生长季节后期最易识别,主要导致叶片褪绿黄化(图,叶柄变狭长、直立,有时会有波状皱缩,严重时会引起焦枯、萎蔫等症状。偶尔病株出现明脉黄化症状,即沿脉呈现鲜黄色至橙黄色,后期沿叶脉形成褐色坏死斑,这正是该病毒命名为甜菜坏死黄脉病毒的由来(,。甜菜丛根病不仅使甜菜产量下降、而且使块根含糖量降低、氦基酸分布紊乱,导致甜菜失去加工价值,给甜菜生产造成极大的损失。土壤中病毒含量、天气情况和受侵染的时期,通常是造成甜菜的产量损失的关键因素。侵染严重时可导致产量下降一半或更多,含糖量也大大降低,甚至是植株的死亡,是甜菜种植业中一种毁灭性病害。其中含糖量的异常降低可作为病毒侵染的一个早期指示(,。不能通过种子或花粉传播,但可以被病土污染的种子传播,实验表明,干燥的病根或病根粉末可以在室内储藏许多年仍保持其致病性。在大田里,存在于甜菜多點菌休眠孢子体内,其侵染性至少可以保持年(。使用耐抗病品种是目前防治甜菜丛根病最有效的途径(。最早于发现于意大利,随后在日本、欧洲中南部至东北部以及亚洲、欧洲和中东国家,在全世界的甜菜主产国均有分布丨,『—口。我国分别于、在内蒙古、新疆先后发现甜菜丛根病,导致甜菜减产,如今已广泛分布于我国西北部和东北部甜菜主产区(。美国糖用甜菜的病害损失报告表明,该病害在美国多个洲均有分 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述布,自年以来,甜菜丛根病导致加利福尼亚州甜菜种植面积减少—■““華…—‘‘、■乂‘图甜菜丛根病的典型症状(,的形态结构和生物学特征是一种典辨的多分组病毒,山种同长度的奸状病毒粒了组成。病毒粒了无包膜,自径约为长度为、、、、和。病毒粒了表面亚基排列明显,呈螺旋对称结构,单链右螺旋距每阐山个亚基组成,每个亚基的分了量为,可以清晰地看到中央轴芯(,。,不同地报道的粒了长度略有同,可能是因为株系或提纯方法的不同使然。里然粒了形态结构与其他杆状病毒形似,在粒了形态和传播途径等方面类似土传小麦花叶病毒和马铃萬帚顶病毒,但与烟草花叶病毒、烟草脆裂病毒和之问并无血清学关系 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述大多数分离物存在于系统感病的甜菜根部、表皮、薄壁组织的外皮层、内皮层、薄壁组织间质以及木质部导管中,但不存在于维管束。此外,在其传播介体甜菜多點菌的原生质体、游动孢子囊和成熟的游动孢子切片中可见类似病毒粒子,但在成熟游动的孢子中则未见到病毒粒体(。超薄切片观察到病毒粒子分布在细胞质内,通常以两种不同的聚集形式存在。一种是像很多杆状病毒那样平行聚集成或疏或密的块状物分散在受侵染的叶片或根部细胞质中(；一种是成束的病毒粒子形成度夹角的片状结构(李毅’。等人还对在不同寄主上的系统运动方式进行了比较,绿色焚光标记观察实验表明,在系统寄主本生烟和大果甜菜上存在两种不同的运动方式：在本生烟上,病毒先通过朝皮部进入维管束,先向下运动到根部,然后再往上运动到顶部叶片；在大果甜菜上,病毒则是先通过胞间运动到达顶部叶片,然后往下运动到根部(。的寄主范围较窄,自然条件下可以侵染普通甜菜词用甜菜宭兹菜疲菜及其他几种藜科植物。除甜菜以外,美国、日本和我国宁夏地区也有关于在田间侵染菠菜的报道,被侵染的疲菜幼苗叶片极度皱缩扭曲,叶片小且伴有叶脉黄化,病株生长缓慢,矮化明显,严重时会出现黄脉坏死,根部发育不良,侧根丛生,与甜菜丛根病症状相似(。通过含和的病土人工接种,可以侵染种植物,包括种藜科植物、种石竹科植物和种觅科植物(,。常用的试验寄主包括局部枯斑寄主番杏、昆诺藜及觅色藜和系统寄主本生烟及大果甜菜其中,番杏和昆诺藜还常作为的繁殖寄主。普通甜菜苗作为测试土壤侵染性的引诱植物,用来检测介体多黏菌对的传播。的分子生物学特征是正义的多分体病毒,基因组一般含有条正单链根据核苷酸长度依次命名为、、、。所有的在端都带有帽子结构端有结尾。五条的同源序列存在于端的个核苷酸和尾前面约多个核苷酸(图。具有异常长的,其核酸序列均在以上。基因组的一个特点是在不同的寄主和条件下,病毒组分的存在方式是不同的。在田间自然侵染的甜菜根部,通常只存在但在某些甜菜产区也存在,李大伟’。当用含有的病根汁液接种枯斑寄主番杏和昆诺藜时,只有和是侵染所必需的,而往往内部发生缺失或者整个完全丢失,因此这三条小组分也被称为病毒的“类卫星”韩成贵,但在病毒侵染系统寄主大果甜菜时,虽然仅有和就可以支持其在寄主上正常的复制繁殖,但缺少了则无法 中国农业大学博上学位论文第一章文献综述在大果甜菜上实现系统运动,且该长距离运动的能力是山的“核心区域”核酸序列所决走的(,】。表是目前已报道的编码的基因功能和亚细胞定位。—,丫、—丨“图甜菜坏死黄脉病毒基因组结构和翻译策略(？,和的基因组功能研究作为侵染各种寄主的必需组分,与编妈“持家基因”。山个核苷酸组成,编码一个大小的多聚蛋该蛋含一个与复制相关的甲基转移酶区域(。体外翻译实验表明,在第位和位的密码了均可指翻译起始,分别翻译出和大小的两种蛋,其中翻译产物的多聚蛋可以经自我催化进一步加：成为和的两个蛋叩。分了质景较大的蛋从端到端念有甲基转移酶功能域(结合解旋酶功能域和类木瓜蛋酶基序(和依赖尸的聚合酶(功能区。用体外转物的同组合在寄主植物昆诺藜的原生质体中逃行接种实验,、‘单独存在时就够独立完成自我复制,而、、只有在与共同接种时才能复制(说明基因产物(很可能就是具有病毒基本活性,包了病毒基因组复制所需的全部信息。 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述由个核苷酸组成,包含个开放阅读框(分别为：外壳蛋白(,、通读蛋白、三联基因区蛋白(和沉默抑制子。与其通读蛋白是编码的第一个蛋白,大小为含有七个抗原决定簇(,。顺反子与后面的蛋白以一个玻拍密码子(隔开,该终止密码子在翻译的时候可被核糖体以大约的几率抑制,通读产生一个的大分子。核保护实验表明参与包装病毒核酸的过程,但并不是病毒粒子的构成组分,在包装完后会脱离病毒粒子(进一步的研究发现定位于线粒体的外膜,病毒粒体首先在线粒体表面装配,随后在细胞质中聚集(的端具有线粒体定位序列(和两个跨膜区和,端区域与田间的真菌传毒密切相关,其中位的氨基酸基序是真菌介体传播病毒的关键序列(,。蛋白在蛋白之后紧随着与病毒细胞间运动相关的蛋白,由、、构成。由亚基因组翻译产生,和由亚基因组翻译产生(。在进化过程中蛋白在各种不同的杆状病毒属病毒中广泛存在并具有高度特异性互作,这可能对它们的功能和或稳定性相关(,。的端具有核酸结合区,端具有依赖于的解旋酶保守功能区,突变体接种实验表明两个区域的缺失均对的生物学活性有影响(。融合的亚细胞定位实验表明,定位于胼胝质和胞间连丝,可以穿过细胞壁或者在两侧壁上成对排列。和定位于富含肼胝质的细胞壁加厚区,且只有三个蛋白共同表达时,才能观察到定位于胞间连丝的现象,说明三个蛋白之间存在特异的相互作用(,。利用复制子单独表达、和进行运动蛋白的互补实验当单独表达、以及和共表达均能互补上失活的基因功能,实现病毒的细胞间运动。而单独表达时则无法恢复病毒的胞间运动能力,说明的表达积累量对病毒的细胞间运动具有重要的调控作用(。蛋白的末端的编码可溶性蛋白,由亚基因组翻译产生(。该蛋白富含半胱氨酸,具有“锌指”结构,属于蛋白(。突变体接种实验表明对的积累具有顺式调节作用,而对蛋白的积累具有反式调节作用(。此外,还具有的抑制转录后基因沉默(的功能,并且可以加重其重组表达载体病毒在本生烟上的致病性(。利用载体表达的蛋白,可显著提高在本生烟根部组织中负义链和亚基因组的积累量,表明蛋白能够在植物的根部比在叶 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述部更有效地抑制沉默的发生(。当蛋白融合表达可以观察到绿色荧光在细胞核、核仁和细胞质内均有分布。进一步的氨基酸定点突变实验表明,的核仁定位信号中嵌入的锌指结构域虽然对蛋白的抑制子活性及自身的稳定性有作用,但沉默抑制功能与细胞核核仁定位无关,只对的长距离运动有影响(。表基因产物的功能和亚细施定位组分基因产物基因功能亚细胞定位复制酶外壳蛋白细胞壁、细胞质、细胞核组装、介体传播线粒体外膜细胞间运动细胞壁、胼胝质、胞间连丝细胞间运动细胞壁细胞间运动细胞壁抑制子、顺反式调节细胞核核仁、细胞质从根症状细胞核、细胞质介体传播、根部抑制子、细胞核本生烟致病因子致病因子细胞核、细胞质小组分基因组功能研究作为多分组病毒,存在小组分是—个有别于其他真菌传杆状病毒的一个显著特征。虽然这些小组分并不是病毒侵染所必需的,但它们在特异性地自然侵染过程中起作用。随着研究的深入,人们越来越认识到这些小组分在介体传毒、症状产生等方面的重要性。小组分对叶片病症的作用含有个核苷酸,编码三个蛋白：、蛋白和一个的多肽。其中与蛋白均与病毒侵染寄主的叶部症状相关。对侵染的昆诺藜和墙生藜叶肉以及根部细胞的免疫电镜观察,发现分布于细胞核和细胞质中,且只在病毒侵染初期有大量积累,推测可能早于的表达(。利用融合表达绿色突光观察其亚细胞定位,同样表明在和昆诺藜的叶肉细胞的细胞核和细胞质中均有分布,是第一个报道的由植物病毒编码的可以核质穿梭的蛋 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述白。蛋白端具有核定位信号(,其中、和是关键氨基酸,而端第位的富含疏水性氨基酸的序列是核输出信号(,。突变体接种实验表明,细胞定位的改变会影响病毒在昆诺藜叶片上的症状,说明在叶部的致病能力与其在细胞中的定位分布密切相关(,此外,蛋白基序的变异也会对病毒在番杏和不同抗性品种甜菜叶片上症状的表型产生影响(。蛋白的与的有一部分是重叠的,起始于的端,在全长上通常是沉默或仅有微量表达,但当大范围缺失后可以被激活翻译,过量表达蛋白的突变体不仅能在番杏叶片和觅色藜叶片上产生坏死斑,也可以提高在本生烟上致病力和系统侵染率。当用花椰菜花叶病毒载体表达蛋白,用重组病毒侵染宪菁时,可以观察到系统叶上产生坏死斑而非典型的花叶症状,说明蛋白产生的坏死症状不受其它蛋白的调控(〖。最近的一项研究表明,当以为诱傅蛋白筛选甜菜的蛋白文库时,发现一些与互作的蛋白涉及泛素化途径,其中有一个蛋白包含了一个功能域和两个重复区,推测很可能通过抑制与同源物的互作,从而使其无法正常识别目标蛋白,从而导致甜菜细胞坏死症状的产生。只含有一个编码蛋白(。实验证明可以在昆诺薬叶片上产生特异性坏死症状,同时该生物学功能与蛋白的细胞核定位功能相关联。与类似,也是一个核质穿梭蛋白,推测第位氨基酸可能与有核输出和停留在细胞质内(的特性相关(,。酵母双杂实验表明的前个氨基酸具有转录自激活活性,第、和位天冬氨酸的丙氨酸替换可使其转录自激活活性丧失,但这些突变体均不影响的核定位功能以及在昆诺藜上的坏死表型。在侵染本生烟时,各小组分在寄主植物上系统运动的能力和致病性均具有显著差异：作为本生烟上重要的致病因子,可以稳定地系统上传,诱导植株矮化,上部叶片向下卷曲；容易发生自发丢失或在本生烟选择压下更快地产生内部缺失型,从而加重症状的产生,导致系统叶片坏死点的产生(；而却发生了全基因组的高频率自然丢失,且在本生烟上无明显致病作用(,。系统侵染野生甜菜时,或的存在可以帮助病毒的系统上传并产生植株矮化的系统症状其中产生的局部症状要明显弱于而当与同时存在时则能产生类似与存在时的症状,虽然此反应的机制尚不清楚,但有证据表明这两种小间存在协同作用。小组分对根部病症的作用在田间侵染甜菜时通常局限在作物的根部,导致这些部位通常增生大量细小的侧根和丛根等畸形的症状(,。将含有和的体外转录物的不同组合的分离物摩擦接种甜菜幼苗根部,结果显示含有的接种物可造成甜菜根重减少,病毒浓度提高倍,而不含的分离物接种时,相对于正常对照植株仅造成轻微的产量损失。随后,经过机械接种分离得到的端分别缺失和个氨基酸的两种自然缺失突变体,通过尸接种甜菜幼苗,五个月后检测发现接种野 中国农业大学博士学位论文第章文献综述生型甜菜出现典型的从根症状,而接种突变体的甜菜没有产生明的须根增生症状,由此说明是引起甜菜从根病症状的决定因子(。最近研究表明蛋白第位織氨酸的单点突变可以使克服含有基因介导的抗性,并且突变的病毒能在山间抗性甜菜植株内正常复制(。除了之外,和对根部症状也具有定的影响,但是可能致病性更强。等人将不同分离物接种同甜菜品种时发现,含有的型分离物引起的症状比—、含有的型分离物严重(。等人也发现含有的病毒浓度在主根及侧根的比率比含的型和型高,推测型分离物在甜菜植株内比型和型运动的更快(。刘涛等人将的体外转录物分别与分离物含和和念、和混合后接种甜菜的幼苗,也观察到了类似的结果(刘涛,。编码两个蛋白,其中是一个重要的致病因子,除了在本生烟上有较强的致病力之外,在番杏、野生甜菜和甜菜亚种上也有微弱的促进致病的作用瞬时表达的农杆菌注射实验显示,在植物叶片内无沉默抑制子功能,但在发生了系统沉默的转基因本生烟上接种含有的分离物可以在根部观察到绿色突光的回复现象,而接种不含的分离物则未观察到恢复现象。检测也显示仅在分离物接种的植株根部检测到了的积累,这说明在根部具有基因沉默抑制子的功能。另外,也有研究表明和以及和间的相互作用对根部症状的发展具有协同作用,。小组分对真菌介体传播的作用甜菜多點菌是的传播介体,对病毒在田间的传播起到了不可替代的作用,人量研究探讨了与甜菜多粘菌之间的关系。等人通过单斑分离从番杏发病叶片上获得含有不同组分的分离物,机械接种甜菜幼苗的根部,然后用这些甜菜对无毒进行词喂,天后将带毒的尸作为毒源进行传毒试验,测试结果表明,传播分离物含有、和的效率比传播含有、和及含和的效率耍高倍。此外,在病毒低浓度时仍能保持较高的传播效率,而和只能在病毒高浓度时才能被介体传播,由此说明对高效传播病毒非常重要(,。韩成贵等通过对全长及种编码区突变体的俊染性克隆构建,将及其突变体的体外转录物与含有的分离物总混合接种枯斑寄主番杏,然后利用无毒￡在甜菜上进行传毒试验。结果表明,缺失区域分别为、、和的叫个突变体的传毒效率均低于野生型韩成贵。进一步实验表明,编码框的内部、、和的缺失也能够导致病毒菌传效率的降低,由此确认是真菌介体高效传毒的必要因子,且需要完整的蛋白发挥作用(。在缺少的情况下,含有的分离物要比没有的分离物传播效率高得多,这可能与的存在可以提高病毒在根部的积累相关,类似的结果也能在上观察得到。推测在甜菜上对病毒水平的影响并不是它们在病毒传播屮起 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述到了直接作用,而是由于增强了在根部的系统性运动,使得病毒在初侵染点及再次侵染点进行扩展的能力更强,进而增加了病毒在根部的积累,从而间接提高了菌传的效率。甜菜坏死黄脉病毒株系分类病毒在所有生物中具有最快的变异速度,一般同一种病毒会存在不同的株系。在不同的生态坏境下也形成了许多病毒株系,一般可以根据生物学及分子生物学的手段对其进行分类。生物学鉴定在早期的研究中,等人根据病毒在番杏寄主上表现出的局部枯斑类型将分为个不同的株系,分别为不鲜明的视绿斑或无症状、黄斑、褪绿斑)和坏死斑,其中只有株系能在甜菜上产生典型的叶脉黄化症状(,。这些症状的表现决定于其他小组分、、或它们的缺失突变体)的存在情况(表。通常弓丨起症状,引起典型的类型枯斑,不含有和的分离物表现为较弱的枯斑,含有但缺乏的分离物可导致严重的类型枯斑,有时还伴随症状的产生。在普通甜菜上,含有的分离物可产生典型的症状并导致丛根症状此夕卜,沿海甜菜的四种品系,,和也可用来鉴别这四种病毒株系。混合了不同组分的接种实验表明,或的存在可以帮助病毒在词用沿海甜菜品系和大果甜菜上实现系统性侵染(。好生物学鉴定植物病毒的基因组结构简单,遗传密码主要集中在核酸链上,只要核酸链上的碱基发生改变,就有可能产生新的株系。研究表明的基因以及和与致病性有关,于是和等人(””从世界各地釆集的样品,对上述样品的、和进行扩增,根据限制性片段多态性(和杂交分析结果,将分成株系和株系。后来,又采用单链构象多态性检测(方法对的的部分区域进行了分析,发现除株系和株系以外,还存在分布范围很窄的株系和其他变种(,。不同的株系分布区域各不相同,株系广泛分布于欧洲大部分国家,株系主要在德国、法国、日本和瑞士检测到(丨,型仅在法国、英国和哈萨克斯坦的局部地区有发现(。型和型株系可以根据上个氨基酸的改变来区分,其中型为型为,虽然的氨基酸发生了改变,但这些位点位于抗原识别位点区域外,因此、株系在血清学上没有差异。根据三种类型株系的序列比较分析发现,型和型之间的同源关系比型更近从进化的角度看,也许在甜菜成为他们的寄主之前,型和型很早就被隔离,随着时间的推移,它们在不同的寄主和不同的区域沿着不同的路线进化发展,型 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述株系很可能来源于型株系(丨,。等人(在甜菜种植中型株系的致病力要略强于型株系,而型株系的致病力比前两者都要强。表含有不同组分的分商物的症状番杏沿海甜菜大果甜菜分分离物的离物组分接种接种接种接种叶系统接种系统接种叶叶叶叶叶叶叶曰本)日本)日本)德国)柱：播绿斑：浅褪绿斑或无症：黄斑：褪绿或黄斑、以后坏死斑；黄化或斑驳；矮化；未侵染。括号内表示偶尔产生的症状。为了分析不同基因变异的特点以及各个分离物之间的进化关系,等人对来自亚洲、欧洲和美国三个地区的个分离物的、和分别进行了系统发育分析。根据、和型的氨基酸的特点,对应地划分为、和蛋白在第位氨基酸存在多种与甜菜抗病性相关的基序,将其作为划分变异类型的主要标志,将种基序分为、和三组；则根据其内部是否存在第位和第位氨基酸的缺失划分为型(亚洲分离物,存在缺失)和型(欧洲分离物,无缺失,与的划分一致,分化为、和三个组(。最近关于分类的报道中,日本的研究学者对种病毒分离物的进行系统进化树分析,将其划分成四组(、、和图,,。此外,有些来自英国、中国和日本的分离物具有更加复杂的、兼具几种分离物类型特征的混合型基因组(。比如来自中国包头的分离物的为型,和属于欧洲的型,而则属于中间类型的组(,在模拟类似自然条件的最大选择压下,发现最为保守,的变异最大。的和位氨基酸的改变会使克服由单基因介导的抗性。大量的序列比对表明,非抗性丧失的分离物十分保守都为,当分离物的这两个氨基酸出现各种变异时(、、、、和,则会导 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述致抗病甜菜品系抗性的丧失(,,,。本论文研究的目的及意义甜菜是一种重要的世界性糖料作物,种植面积占整个糖科作物的。甜菜丛根病是危害甜菜生产的重要病害之一,目前在我国主要甜菜产区均有发生,并造成极其严重危害,使甜菜生产和制糖业面临严峻挑战。该病害的病原物是一种真菌传的多分体正义病毒,株系分化复杂,目前对该病毒的防治主要利用耐病品种,但存在抗性丧失的问题,因此,深入了解病毒的致病机制对提供有效的防治策略具有重大的现实意义。迄今,有关的研究主要集中在病毒各组分的分子生物学特征和基因产物功能上对该病毒不同小组分间的比较研究,以及病毒与寄主植物间的的互作以及症状产生的机制研究却鲜有报道。基于以上问题,本论文的研究目的为：进一步利用病毒重组分子,比较研究了和在本生烟和大果甜菜两种不同系统寄主上侵染稳定性差异,并从病毒的复制、运动、致病性等发面探究产生上述现象的根本原因,为深入理解小组分与寄主的相互作用及侵染过程的分子机理提供新的证据。应用新一代高通量深度测序技术分析含有不同组分的侵染后本生烟表达谱的变化,寻找导致本生烟产生矮化和卷叶症状的原因,并蹄选和抗性相关的基因,为今后开发新的抗病基因资源提供线索。采用双向凝胶电泳技术结合质谱鉴定和生物分析研究含有不同组分的侵染后本生烟叶片组织的蛋白质组变化,为更好地理解的分子致病机理提供蛋白质组学方面的信息,并筛选病毒侵染后蛋白表达变化明显的相关基因,以期更好地理解的致病机理以及病毒和植物间的相互作用关系。再次利用高通量测序技术分析了侵染后大果甜菜叶片转录组的表达的变化,从水平初步分析致病的原因,并筛选出与抗性或易感性相关的基因,为今后甜菜丛根病的抗病育种奠定基础。与此同时,对侵染后大果甜菜叶片和根部产生的小分子也进行了高通量测序分析希望能够通过比较多分体病毒各个基因组的沉默特征,对这些基因组之间的相互作用关系以及植物不同组织沉默机制对侵染的影响有更多的了解。 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法第二章材料与方法实验材料毒源和抗血清本研究所用的甜菜坏死黄脉病毒呼和浩特分离物含、和,由本实验室分离并保存。病毒通过接种番杏进行扩繁。和兔抗特异性抗血清由本室李旻同学制备,绿色突光蛋白抗血清由本实验室郭晓芬等同学制备,抗血清购于公司。植物材料和培养条件番杏、昆诺阿蓁、觅色囊大果甜菜均由本实验室繁殖保存,普通甜菜、甜研由内蒙古农科院张惠忠研究员提供。本生烟由英国的教授惠赠。所有植物材料的培养条件相同,首先将植物种子播种到直径的塑料圆盆育苗,表面覆盖厚的沙子或者蛭石,待长出真叶后再将幼苗移栽到直径的塑料圆盆中；接种病毒后的植物材料均在°气候室培养,光照时间为,光照强度约为,湿度控制在。菌种和载体大肠杆菌菌株、、和根癌农杆菌菌株、和由本实验室保存。克隆载体、购自公司；瞬时表达载体、和由的教授惠赠；用于双分子劳光互补试验的瞬时表达载体和由的教授惠赠；含葡糖苦酸酶(,基因的质粒由本实验室保存。侵染性克隆在启动子下的全长侵染性克隆和融合于端的的表达载体由韩成贵教授构建(；基因替换编码框的表达载体由本实验室李旻博士(李要构建；在启动子下的全长侵染性克隆和基因替换编码框的表达载体,和的重组突变体和由王颖博士构建(王颖,；载体 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法由张艳敬博士构建(张艳敬,。引物设计和序列測定实验中所使用的各种引物见附录的引物目录。引物于上海英潍捷基生物技术有限公司和上海生工生物工程技术服务有限公司合成；序列测定由北京擎科新业生物科技有限公司完成；转录组高通量测序和小分子高通量测序由杭州沃森生物技术有限公司完成。和化学试剂聚合酶、聚合酶、酶抑制剂、聚合酶、、及大部分限制性内切酶购自公司；聚合酶及部分限制性内切酶购自公司；购自公司；聚合酶、逆转录酶和随机引物标记试剂盒购购自公司；试剂购于公司》、、、、氨节青霉素(、卡那霉素(、利福平(、、和碱性磷酸酯标记的蛋白(、、过硫酸氨、丙稀酰胺、甲叉丙稀酰胺、二硫苏糖醇、、、尿素(、硫尿(、三氟乙酸、乙腈(色谱级、碳酸氢铵均购自公司；和购自福瑞生物工程公司；纯水装置购于公司；孔酶标板、及耗材购自公司；确酸纤维素膜购自公司；片段纯化试剂盒购自公司；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自公司。载体两性电解质(,和,等电聚焦,预制胶条、矿物油(、考马斯亮蓝碘乙酰胺、双向电泳蛋白质定量试剂盒(均购自公司；胰蛋白酶蛋白质组级(购自公司；氰基经基肉桂酸(,购自公司。其它化学试剂多为国产分析纯或进口分装。试剂配制常用溶液和试剂培养液：胰蛋白胨酵母提取物,,溶于蒸馆水后,用调值至,加水定容到,°高压蒸汽灭菌。固体培养基：在培养液中加入琼脂,°高压蒸汽灭菌缓冲液：称取溶于中,溶液冷却至室温后,用一定体积的浓盐酸调节,加定容至,高温高压灭菌。：称取,加入搅拌溶解,固体 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法调节至溶液变澄清,定容至,高温高压灭菌。储备液(溶于蒸馆水中,°避光保存。缓冲液：,硼酸,加水定容至。缓冲液：电泳上样缓冲液：含溴紛蓝、甘油的水溶液,常温保存。电泳上样缓冲液：溴粉蓝,甘油,：取溶于含有和中的溶液中’°煮沸,室温冷却后分装于°保存。苯粉氣仿异戊醇：饱和酌(提取用水饱和粉配制,三氯甲院,异戊醇,充分混勻后用或含巯基乙醇)密封,。避光保存。：称取无水,加入中充分搜拌溶解,用冰醋酸调节至而后定容至,室温保存。溶液称取,溶解于中,浴加热,充分搅拌使之溶解,再定容至通风橱内操作。：取,粉末先用的助溶,再用定容至高压灭菌。：溶于,定容至,高压灭菌。抗生素的紀制：⑴氣节青蓽素酸卡那酶素液：氨’青霉素或硫酸卡那酶素溶于灭菌水中,过滤灭菌后分装于°保存。利福平液：取利福平粉末溶于甲醇或二甲基亚砜)中,分装于°保存。四环素：用无水乙醇或乙醇配制,分装于°保存。具体实验所用溶液和试剂大肠杆菌感受态细胞的制备和转化所需试剂：溶液：称取无水,定容至,过滤后高温高压灭菌,°保存。农杆菌感受态细胞的制备和转化所需试剂：溶液：称取,定容至,过滤后高温高压灭菌,°保存。溶液：称取无水定容至过滤后高温高压灭菌,°保存。粗挪毒和雑接种所需试剂： 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法硼酸缓冲液(含定容至。缓冲液(,定容至。缓冲液：甘氨酸,桂藻土(,高温高压灭菌,分装后。保存(,。植物总提取所需试剂：抽提缓冲液：的,的的的用定容至。提取缓冲液(热酌法：：称取,溶于中,加入的充分混勻,。温箱中处理过夜,高温高压灭菌(。。所需试剂：：称取和梓檬酸三钠,溶于用浓盐酸调值至后定容至,高温高压灭菌后室温保存。憐酸盐缓冲液(用于杂交液配制,称取和溶于定容至杂交液：,磷酸缓冲液(。母液终浓度所需量甲醜胺洗膜液：第一次洗膜液：；二次洗膜液：,脱探针液：所需试剂：蛋白上样缓冲液：,甘油,溴酌蓝巯基乙醇,现用现加。下层胶缓冲液：调加用定容至,°保存。上层浓缩胶缓冲液(：调加,用 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法定容至,°保存。丙稀酰胺存储液：丙稀胺,亚甲双丙烯酰胺用定容至温水浴助溶,通风橱称量配制,滤纸过滤后于棕色瓶中°保存,注意带手套和口罩进行配制。过硫酸铵(：过硫酸铵’定容至分装并。避光保存。电泳缓冲液(,甘氨酸,用定容至。不连续系统不同浓度凝胶配制用量表：分离胶浓度浓缩胶下层胶储备液上层胶储备液染色液(考马斯亮蓝先将充分溶解于甲醇而后加入冰乙酸(,并用定容至。注意：考马斯亮蓝先充分溶于甲醇后,而后再加入其它成分。脱色液：冰乙酸(,乙醇(,定容至膜转移缓冲液(甘氨酸,用定容至室温保存。使用前稀释倍,加入甲醇。：或用定容至封闭液：,含脱脂奶粉。碱性磷酸酷酶(显色缓冲液：用定容至。液(：称取加入二甲基甲酰胺(。用 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法之前,先用二甲基甲酸胺将液稀释倍(。而后显色缓冲液中加稀释液(终浓度。液(,：称取,加入二甲基甲酰胺。用之前,先用将液稀释倍(而后显色缓冲液中加稀释液(终浓度。赚免疫吸附实验所需试剂碳酸盐缓冲液(包被液调节值至定容至长期使用加入叠氮化钠,室温保存。：,,加入定容至。封闭缓冲液(溶于溶液中。抗体稀释缓冲液(溶于溶液中。二乙醇胺缓冲液(二乙醇胺用蒸馆水溶解,浓盐酸调节值至定容至°避光保存。显色前现加入对硝基苯基磷酸二钠(于二乙醇胺显色液中(,°避光暂存。终止液将溶解在中,并定容至。染色所需试剂溶液(称取§粉末溶于二甲基酰胺中,现配现用。染色液：在的缓冲液(中加入…的溶液(的溶液,的溶液,…的溶液,用定容至转化本生烟原生质体所需试剂本生烟叶片酶解液：纤维素酶(离析酶(甘露醇,,,定容至,用调至,。水浴,冷却后在加入和。过滤灭菌备用(需现用现配。溶液：,,定容至用调至。溶液：甘露醇,定容至用调至。溶液：,甘露醇(,定容至。本生烟原生质体培养基：甘露醇,鹿糖,肌醇,定容至,用调至,高压灭菌。冷却后加入和°保存。农杆菌悬浮缓冲液：称取粉末溶解在中,调节至定容至用滤器过滤除菌,分装成小份°保存。 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法：过滤除菌。乙酰丁香酮：称取溶于二甲基亚砜(用定容至用滤器过滤除菌,分装成小份°保存,重悬缓冲液：,。染色所需试剂染色液(将溶解在水中,每管分装,°保存。用于细胞核染色时,存储液可稀释使用。蛋白质欢向电泳所需试剂蛋白提取液三氯乙酸(巯基乙醇(加°预冷的丙酮充分溶解,可°暂存,溶液需现用现配。蛋白提取液尿素,硫脲,蛋白抑制剂,加定容至,°保存和蛋白酶抑制剂均在使用前加入。胶条水化液：尿素,,加定容至,分装管,°保存在使用前加入。使用时根据选用的胶条的范围加入相应的。分离胶缓冲液(称取溶于,用调至加定容至用的滤膜过滤待用。丙烯酰胺储存液：丙稀酰胺(,亚甲基双丙稀酷胺(,加定容至,°避光保存。琼脂糖封顶液(琼脂糖加入到的电泳缓冲液中,使用时加入痕量的使溶液呈蓝色即可。凝胶固定液：乙醇(,冰乙酸(,定容至。凝胶染色液：考马斯亮蓝一片,溶于乙酸和乙醇的混合溶液中,定容至,滤纸过滤后使用。溶液(称取,加定容至,溶液需现用现配。胶粒脱色液：乙腈溶于,定容至。胶粒缓冲液：盐酸定溶于中。酶解缓冲液：乙腈、定容于中。酶解消化液：酶液定容至酶解缓冲液中。酶解抽提液(：分别将乙腈和混合后,定容至。基质溶液：用或和溶解,终浓度。其中所用到的其他试剂电泳缓冲液(,过硫酸铵溶液(凝胶脱色液配方见。 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法实验方法高温高压蒸汽灭菌灭菌前先向灭菌锅中加入一定量的,放入需要灭菌的溶液或实验容器,打开排气阀,待锅内沸腾后,排气,然后关闭排气阀,等温度上升至°,时,关闭加热阀,打开保温阀,灭菌,关闭电源,直到锅内压力降至零后打开盖子。的制备取缓冲液,分别加入限制性内切和补至丨,°温箱中反应,反应后用的上样缓冲液终止,每管分装,°保存。重组克隆的构建⑴目的片段的回收从的琼脂糖电泳胶上切下目的片段,按照回收试剂盒(或的使用说明回收,溶于,约纯化的产物。连接反应酶切回收的片段、相应的酶切载体、连接酶缓冲液和连接酶按照合适的比例加入,混句后于°下连接小时以上。大肠杆菌感受态细胞的制备将大肠杆菌单菌落接种于液体培养基中,°振荡培养过夜,按的比例接种于液体培养基,。振荡培养至为冰浴。。下离心弃上清,加入,轻轻悬浮菌体,冰浴。°条件下,离心弃上清,菌体用轻轻悬浮,加甘油至终浓度为,每管分装于°保存备用。大肠杆菌感受态细胞的转化取新鲜制备或冻存的感受态细胞置冰上,加入连接产物(不超过感受态体积的或少许质粒,冰浴于°热激立即置冰上再加入液体培养基,°培养至,涂布于含相应抗生素的固体培养基上(抗生素终浓度为°培养过夜。对于需要蓝白斑蹄选的质粒,涂布平板时每板需加入至终浓度。重组质粒的阳性克隆蹄选牙签挑取单菌落划线到含相应抗生素的固体培养基平板上；用牙签挑取少许菌体,涂抹 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法于管的底部,然后加入混匀的反应液(聚合酶缓冲液,叫聚合酶,补至进行反应,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；挑取阳性单菌落接种于含相应抗生素的液体培养基(抗生素终浓度为中,°振荡培养以上。将菌液倒入的管中,离心收集菌体,弃上清,采用：提取质粒,并进行相应的限制性酶切检测,选择阳性的质粒进行序列测定。接种寄主植物及栓测⑴病毒的粗提取将侵染的番杏病叶称重后用液氮充分研磨,加入倍体积的硼酸缓冲液(预先放置于°冰箱冷却,充分匀浆,双层尼龙纱布过滤；离心弃沉淀,上清液加至含疏基乙醇,°搅拌或过夜；庶糖垫(约,超速离心,弃上清；皿？约悬浮沉淀,°搅拌,,弃沉淀；上清液紫外扫描测含量,计算病毒浓度。°保存。病毒的体外转录以约线性化的质粒为模板,在的反应体系中含有、、、各、、和。反应,反应后取进行电泳检测转录的质量。机械摩雜种汁液接种：在叶片上均匀撒上少量金刚砂,取部分发病叶片病斑用缓冲液研磨充分,双手带洁净胶手套蘸取少量病汁液摩擦涂抹整片叶片,该方法用于对毒源的扩繁。体外转录物接种：取接种的发病番杏叶片提取总,溶于中备用。以线性化为模板进行体外转录,先在病叶总中加入等体积的体外转录物,然后再加入等体积的缓冲液,混勾后摩擦接种供试植物。植物总的提取热粉法)大量提取植物总采集侵染的番杏叶片,约植物材料加入液氮充分研磨成粉末,转入离心管中,迅速加入°预热的水饱和苯盼(和等体积的抽提溶液,振荡；静置后加入的氯仿,振荡放置离心；取上清液至新的管中,加入等体积溶液,混匀后°放置至少。离心沉淀用重悬,充分溶解后分别吸取上清放置在两个离心管中,分别加入的醋酸钠和的无水乙醇,混匀后°放置至少；°条件下,将上述混合物离心后,再用乙醇洗一遍,瞭干,加入悬浮干粉,浓度测定后保存,用于检测大分子的杂交实验或者接种实验。小量提取植物总取植物材料,加入液氮充分研磨成粉末,转入离心管；迅速加入水齡和八抽提缓冲液,剧烈混勻后,置于冰上；待全部样品研磨处理 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法完后,冰上放置°,离心取上清,加入倍体积的,混匀后°沉淀过夜；°,离心,沉淀用和乙醇各洗绦一次,干燥后溶于适量处理的水中,°或°保存备用。检测以的为模板,与的下游引物混合后°：变性,迅速置于冰上,冷却；随后,在反应体系中含有的反转录酶,的,的反转录缓冲液和。反应以的反转录产物为模板,在的反应体系中含有聚合酶、上下游引物各和,进行扩增。。：变性：,。复性,。延伸,循环。复性温度根据所用引物的值确定,延伸时间根据所扩增片段的长度确定。大分子的检洒制备的琼脂糖凝胶,样品上样进行电泳；电泳结束后,用转移液将转移至尼龙膜(转膜结束后用紫外交联仪画定核酸样品,随后用漂洗尼龙膜,将尼龙膜置于超净台内吹干,保存于室温。配制杂交液,混勻后预热至°将尼龙膜有核酸的一面朝内,卷成筒状放入杂交管中,加入预热的杂交液,于°杂交炉预杂交至少；按照试剂盒说明,以随机引物法标记探针,取适量模板(,加入一定量的混匀,于°加热,冰上迅速冷却；依次加入反应缓冲液,、、各,……加补杂交前加入混匀后,于°；沸水浴变性探针,冰上迅速冷却,随后加入杂交管。杂交洗膜：。；,。；°；漂洗,去掉残留的。洗膜结束后,取出尼龙膜用保鲜膜包好,压磷屏,,常温下保存,用透射扫描仪扫描并存储图片。植物总蛋白的检測取一定质量的植物材料,液氮中研磨,每植物样品加入的蛋白上样缓冲液,振荡混勾后沸水浴立即置于冰上；°下离心取上清置于新的离心管中°备用。取样品进行电泳(公司电泳槽,先以的恒压,待样品进入分离胶后,加大电压至电泳结束后,将胶置于考马斯亮蓝染色液中,微波炉煮沸后室温冷却,重复次；回收染色液,加入微波炉煮沸后室温冷却,换新的蒸馆水,如此反复次脱色,直至条带清晰为止。调整上样量至均勾一致,再次电泳,待溴酷蓝完全跑出胶的底部后停止电泳,将整块胶切下,进行随后的转膜；凝胶在转移缓冲液中采用电转移槽以电转移的方法将蛋白质转移至銷酸纤维素膜上(,；转移完毕 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法的膜放入封闭液中,°封闭约或者°封闭过夜；直接在封闭液中加入—抗反应液,°反应约或者°过夜；用缓冲液漂洗次,每次,加入磷酸酯酶标记的二抗反应液,°反应约缓冲液漂洗次洗涤后加入显色液避光显色,适时终止并立即扫描记录。检测间接法)取待测叶片于离心管中,加入铁珠,液氮冷冻后用研磨仪(程序：次两次)研磨成粉末,分别加入提取缓冲液,°,离心用包被缓冲液稀释样品,孔,每个样品两个重复,°温育或°过夜(阳性对照为病叶,阴性对照为健康叶片,空白对照为抗原包被缓冲液；用洗板仪洗漆,洗錄缓冲液洗漆次,孔,加入封闭缓冲液孔,°封闭或°封闭过夜；洗漆后加入一抗反应液,…孔,温育或°过夜；洗漆后加入二抗反应液,孔,°温育洗漆后按孔加入显色液,°±音养箱中避光反应适时终止,而后用酶标仪,测的吸收值,并用的值进行作图和分析。介导法转化本生烟原生质体本生烟原生质体的制备选取光照黑暗培养周的野生型本生烟,剪取其第一和第二全展开的幼叶。用锋利的刀片将其切成大小的块状,轻轻迅速放入酶解液。抽真空。黑暗静置酶解以上。用的台盼蓝染液每隔镜检确定细胞的酶解情况,当在显微镜下观察酶解的细胞大部分呈饱满的亮黄色圆球后,停止酶解。,离心,将酶解的细胞充分释放出来。随后依次用目和目的尼龙网膜过滤(最好使用漏斗)酶解后的本生烟原生质体于锥形离心管,去掉植物组织或杂质,用预冷的本生烟原生质体洗液定容至离心离心机调到,调到,吸弃上清。倾斜试管,沿侧壁轻轻加入轻轻重悬细胞(避免用枪吹打,至细胞完全溶解。该洗绦步骤进行两次,缓慢置换掉剩余的酶解液。离心,吸弃上清。再次用重悬细胞后在冰上静置以上,吸弃上清,加入适量的溶液细胞的数量为,轻轻悬浮(在保证的原生质体细胞依然处于存活状态的前提下,以的细胞数量进行转染,可达到检测的要求；以的细胞数量进行转染,可达到蛋白检测的要求》本生烟原細体的转染在的的管加入适量的体夕卜转录或植物总与的本生烟原生质体(充分混合均勻后加入溶液,轻柔混匀,室温静置后,立即加入轻轻混勾。离心离心机丨调到,调到吸弃上清。用本生烟原生质体培养基重悬细胞,转移至六孔细胞培养板(购自公司,室温散光培养。 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法原生质体总的提取将培养于细胞培养板的本生烟原生质体收集于离心管,°低温条件下离心收集细胞；弃上清后,加入和三氯甲焼,剧烈震荡至没有细胞结块；室温静置后,在°低温条件下离心取上层透明无色液相于新的离心管,并加入等体积的异丙醇混句后,室温静置沉淀在。低温条件下离心,弃上清,用的乙醇洗两次,的无水乙醇洗一次,每次均在°低温条件下离心；干燥后溶于适量的处理过的,测定浓度及纯度,存于°待检测。原生质体总蛋白的提取将培养于细胞培养板的本生烟原生质体收集于离心管,°低温条件下离心收集细胞；弃上清后迅速液氮冻融,加入蛋白上样缓冲液含的巯基乙醇,剧烈震荡,沸水浴蛋白变性后,迅速置于冰上冷却；在°低温条件下离心取上清转移至新的离心管,存于°待检测。农杆菌浸润法瞬时表达目的蛋白⑴农杆菌感受态的制备挑取农杆菌单菌落于的相应的培养基(含相应的抗生素)中,°振荡培养过夜,取过夜培养菌液】接种于相应的培养基中,°振荡培养至为。离心弃上清后加悬浮农杆菌细胞。离心弃上清后用预冷的悬浮细胞,置于冰上。内使用,或加甘油至终浓度为,每管分装液氮中速冻后置冰箱保存备用。农杆難化取感受态细胞,加入质粒冰浴后,液氮中速冻,°水浴然后加入液体培养基,°慢速振荡培养。离心弃上清,残留约液体培养基重新悬浮细胞,涂布于含有相应抗生素的固体培养基平板上,°倒置培养约菌落挑取阳性克隆用于农杆菌注射试验。农杆難悬液的制备取单菌落接种于含有相应抗生素的液体培养基中,°振荡培养测量菌液值。根据实验需要用菌悬液将农杆菌菌液调至需要的浓度。蛋白的亚细胞定位试验将或悬浮液浓度调至为,浓度调至为,然后将两种悬液按比例混合,使终浓度分别为和。研究蛋白共定位时,将和悬浮液浓度均调至为浓度调至为然后将悬液按比例混合,使 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法终浓度分别为、和。室温静置后对周龄的本生烟叶片进行农杆菌浸润。双分子突光互补验将和悬浮液浓度均调至为浓度调至为然后将悬液按比例混合,使使、和的终浓度分别为、和。室温静置后对周龄的本生烟叶片进行农杆菌浸润》激光共聚魚显微镜观察在载玻片上滴加一滴溶液或水,将本生烟注射叶片贴在载玻片上,或用镊子撕取注射周围部位的下表皮细胞,用染料对植物细胞核进行染色,之后盖上盖玻片用激光共聚焦显微镜中国农业大学农业与生物技术国家重点实验室进行观察：和突光经舰激发,通过滤镜获得荧光信号；焚光经激发,通过滤镜后获得突光信号；焚光经激发,通过的滤镜收集；结果用软件进行分析。蛋白质双向电泳实验⑴蛋白样品的制备取植物样品的叶片,在液氮下研磨充分后,将样品粉末转移至离心管中,并加入倍体积的蛋白提取液°沉淀一小时以上(推荐过夜沉淀；°,离心一小时,弃去上清,保留沉淀；用三倍沉淀体积的只含有的疏基乙醇的冷丙酮,°沉淀一个小时以上；°离心一小时,弃去上清,保留沉淀；重复洗漆两次,以除盐充分；将沉淀在真空千燥器中抽干,,干燥好的样品应该是松散的粉末而不是结成块状；将干燥后的粉末取转移至的离心管中,加入蛋白提取液即,根据实验需要可适量增多粉末的量；置于摇床上持续震荡小时(,°直至蛋白全部溶解,溶解过程中可用用超声波助溶,设置为：功率,工作时间,暂停,共工作°,超速离心小时,吸取上清,弃去沉淀,样品分装至于离心管中保存在°冰箱中待用。双向电泳样品蛋白浓度的測定利用试剂盒提供的标准品准备好蛋白浓度的标准曲线；根据需要将样品稀释至测定范围以内(质量和体积须在和以内,取加至的离心管中,根据说明书的操作要求与各种试剂反应后,读取各管溶液在的吸光值,同一样品做次重复；以标准品的各点吸光值对应其质量做标准曲线,根据待测样品的吸光值计算出其相应浓度。样品的溶胀根据定量结果取相应量的蛋白,再加入胶条水化液补齐至叫；每个样品加入的或,混合均勾后加入到水化盘 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法的凹槽内；将在室温放置了的胶条,从正极端撕去塑封,胶面向下从正极端开始缓缓的铺在水化盘的蛋白溶液上,注意避免产生气泡；为防止泡胀过程中水的蒸发可能导致尿素结晶,在胶条上均勻的滴加覆盖油(室温水化⑷等电聚焦电泳溶胀完成后,用镊子将水化槽中的胶条在滤纸上渐干覆盖油,正面朝上放置在电泳槽中央,给每一个样品的电泳槽中加入的覆盖油,为了防止胶条暴露于空气中覆盖油可多加过量；在胶条的两端覆盖上用润湿的滤纸片(,在滤纸片安装电极并开始电泳,其中电泳仪的参数设定如下：,；,；；,；,；,；,；总伏时至。设置每根胶条的极限电流(根；等电聚焦时的温度为°。胶条的平衡完成等电聚焦后,将胶条在滤纸上吸掉覆盖油,支持膜面靠管壁放置在平衡管中；每根平衡管中加入含有的胶条平衡液在往复式摇床上振荡；第一次平衡结束后,再将胶条放入第二个平衡管,加入含有碘乙酷胺的胶条平衡液在往复式摇床上避光振荡。分离电泳胶条平衡后,用清除残留的平衡液,小心地放在预先制备好的凝胶顶端,使之与聚丙烯酷胺凝胶胶面完全紧贴,避免气泡；然后用加有漠酷蓝的琼脂糖封顶液封好’待琼脂糖封胶液完全凝固后’设置参数,在电泳仪上进行第二向电泳；电泳参数设定为：预电泳,胶；电泳,胶,冷循环水仪设定温度为°,待溴酷蓝跑出胶时停止电泳。联色与脱色将凝胶放入固定液(乙醇,乙酸)中,水平摇床振荡固定弃掉固定液,加入凝胶染色液,水平摇床染色过夜；用的乙酸脱色液漂洗次,每次脱色完全后,加入去离子水漂洗,扫描保存。凝脑描和图像分析染色完成的聚丙稀酷胺凝胶用扫描仪扫描获取电子图像,随后利用专业胶分析软件进行双向电泳的图像对比分析。每个样品经过三次重复实验和图像相互匹配后生成一个参考的胶图。将经分析得到的差异蛋白点从凝胶上切下,放入的管,加入的防止凝胶干燥,送至华大基因公司进行质谱鉴定。检測植物内源基因转录水平的表达差异引物的设计根据已知序列,使用软件设计引物,取扩增产物,为°,弓物长 中国农业大学博士学位论文第二章材料与方法度其他参数为默认值。植物总的提取法)叶片在液氮中充分研磨成粉末,加入试剂与粉末充分混合后转移至离心管中,加入的氯仿,振荡混匀,室温静置°,离心取上清,加入的氯仿颠倒混勾,室温静置离心后取上清,加入倍体积异丙醇充分混勾,室温静置沉淀离心后弃上清,沉淀分别用冷乙醇和无水乙醇洗淥,瞭干,加入￡册充分溶解。⑶反转录反应取总引物,°变性模板,立即置冰上,再加入缓冲液,逆转录酶,补至充分混匀；°°进行反转录反应(,合成第一条反应结束,°灭活逆转录酶活性。产物可立即用于反应或°。⑷预实验选用设计好的引物进行预试验,取产物作为反应的模板。反应条件为：。；°；°；°,；个循环。取产物用于琼脂糖凝胶电泳,检查引物的扩增状况,选用无非特异性条带和引物二聚体的引物用于后续实验中的检测。反应取的产物作为模板,反应使用进行突光标记。反应体系为：；反应条件：°,预变性；°,解链；°,个循环,退火、延伸及扫板；°,°扫板,。反应后用然间进行数据分析。 中国农业大学博士学位论文第三章甜菜坏死黄脉病毒在不同寄主植物上系统侵染能力的比较研究第三章甜菜坏死黄脉病毒在不同寄主植物上系统侵染能力的比较研究病毒侵染寄主植物的主要特征就是它们通常能够在寄主细胞内高水平复制自身基因,合成衣壳蛋白等组分按照一定的排列方式装配成完整的病毒粒体,然后通过胞间连丝和朝皮部分别进行胞间移动和长距离系统移动,最终可能会分布于受侵染植株的大部分组织中。然而各种病毒都有一定的寄主范围,寄主植物种类的变化会直接影响病毒的侵染性。作为一种多分体病毒,不同的组分在同一寄主或同一组分在不同寄主间的侵染性均存在差异。其中在枯斑寄主和系统寄主本生烟与菠菜上,只需有和就能建立侵染(而在大果甜菜寄主上,是建立系统侵染的必要组分,研究表明病毒能否在大果甜菜上沿维管束运动决定于的“核心区域”,而不是其编码的蛋白。本实验室王颖博士研究发现,当接种本生烟时小组分稳定性与致病力差异显著,野生型能够相对稳定地系统侵染,但在寄主的选择压下容易产生一系列内部缺失型突变体来增强病毒的致病力；可以稳定高效地上传,同时也是诱发产生矮化卷叶等严重症状的关键致病因子；却在系统叶上极易自发产生高频丢失,在本生烟上观察不到明显的致病作用。和编码框相互替换的重组病毒接种试验和高通量测序分析表明,的非翻译区与其在本生烟上的不稳定性关系密切,由于和能够产生大量与的末端同源的因此能够用来指导沉默复合体降解。此外,在局部寄主番杏和昆诺藜上的胞间运动能力也要远远低于王颖。基于以上结果,本章增加系统寄主大果甜菜和本生烟原生质体等研究材料,进一步比较了和在本生烟和大果甜菜两种不同系统寄主上侵染稳定性差异,并从病毒的复制、运动、致病性等方面探究产生上述现象的根本原因,为深入理解小组分与寄主的相互作用及侵染过程的分子机理提供新的证据。和在不同寄主上系统侵染能力的比较和在不同寄主上系统侵染能力的检测首先将含有的中国分离物在番杏叶片上扩繁,然后提取发病叶片的总再加入与总等体积的缓冲液,分别机械接种叶期的本生烟和大果甜菜幼苗(图。接种后天(接种的本生烟出现明显的系统症状,即植株矮化,新生叶片严重下卷。与其相比,接种了的大果甜菜出现系统症状的时间要稍晚,左右,系统叶片开始出现隐约的褪绿斑,然后逐渐变成明亮的黄色圆斑,之后,系统症状逐渐加重,与健康对照相比,植株显著矮化,且新生叶偶尔会出现一定程度的畸形(图表。根据上述的症状观测结果,分别在丨和对本生烟和大果甜菜进行单株采样,利用技术对接种叶片和上部叶片中病毒各组分的复制积累量进行检测。其中釆用引物对扩增编码框序列来检测,引物对扩增编码框序列检测。 中国农业大学博上学位论文第三章甜菜坏死黄脉病毒在不同寄主植物上系统侵染能力的比较研究在本生烟寄主上,无论是接种叶还是系统叶几乎都能检测到的存在(表,说明在该寄主上的侵染能力相对比较稳定。与此同时,的侵染效率就降低很多,仅仅可以侵染的接种叶片,而系统叶片的侵染率则更低,大约只有其中株中检测到的株在其接种叶上也能检测到的存在,该结果与王颖博士报道的在本生烟寄主上容沾发生自发丢失的现象一致。备—■輸懸图分离物侵染本生烟和大果甜菜后的症状比较在大果甜菜由：主上,对寄主的侵染能力及系统上传能力的表现与在本生烟寄主上相似,接种叶与系统叶的侵染效率均达到了。而的侵染能力相比本生烟则有了显著提高(表,其中接种叶片和系统叶片的侵染效率分别达到了和表,几乎与的侵染能力一致。检测结果表明,在本生烟奇主上,的小组分与的侵染能力存在显著差兄,但在另一系统寄主大果甜菜上,两者的侵染能力都非常稳定,几乎没有差兄。病毒是否能够在寄主上建立有效的系统侵染,与其能否在寄主细胞中复制,能否通胞间连丝和靭皮部的移动以及侵染与寄主因了之间的分了互作等因素均有着密切的关系。因此,要更深入地研究在同寄主上存在侵染能力差兄的现象,首先需要明确影响其在本生烟上系统上传不稳足的主要原因。 中国农业大学博士学位论文第三章甜菜坏死黄脉病毒在不同寄主植物上系统侵染能力的比较研究表分离物侵染本生烟和大果甜菜后基因组分和的检测症状寄主植物侵染株数接种株数侵染株数接种株数接种叶系统叶接种叶系统叶接种叶系统叶本生烟大果甜菜表示微弱的黄斑：“”表示卷叶；“”表示矮化；“”表示黄斑；”表示黄色斑驳。和系统运动能力的比较病毒采用两种基本的路径在植株中移动而产生系统侵染：细胞间的移动和靭皮部长距离移动。由于前期的实验仅对和局部寄主上的胞间运动进行了观察,因此本节对这两个病毒小组分在系统寄主上的长距离运动能力进行了比较。首先将和异源表达的载体和经线性化,各取约的产物作为模板进行体外转录,将体外转录物与分离物的总按照体系混合均匀,然后加入与混合物等体积的缓冲液,分别接种的系统寄主本生烟和大果甜菜。与接种了野生型的植株不同,和体外转录物接种的本生烟均未出现明显的野生症状,偶尔在新生叶出现微弱的卷曲,表明以基因取代部分的序列会对在本上烟上的致病力产生严重影响。和体外转录物接种的大果甜菜则在系统叶出现黄斑,随着时间推移,植株出现明显矮化。分别对的本生烟发病植株和的大果甜菜发病植株进行单株釆样检测,染色的结果与前面的检测一致(在大果甜菜上,和在接种叶、系统叶以及根部、叶脉、莲都有一定的表达,两者表达的效率都达到以上,在接种的十株大果甜菜中有株检测到的表达,有株检测到了的表达,但总体上的单株表达量要略微强于图。在本生烟寄主上,接种的株本生烟中仅有一株的接种叶和系统叶上出现浅蓝色区域,而在所有接种的植株中都可以观察到的表达(图。由此可以推测在不同的寄主中系统运动能力存在显著差异,其中在大果甜菜上的系统上传的能力比较稳定,在本生烟上却很容易发生自发丢失,但仍然具有系统上传的能力(在本生烟上有微弱地表达。与此相比,则均可以在以上两种寄主上稳定地系统侵染,这一有关稳定性的结果与日本的研究报道相一致。 中农业大学博土学位论文第三章甜菜坏死黄脉病毒在同待主植物上系统侵染能力的比较研究门图和在大果甜菜上基因表达的比较“”农七接种叶农示系统叶；农』》根。阁屮数及检测到基肉农达的株数接种植株总数。摩：剩’傘闕十’‘、图和在本生烟寄主上基因表达的比较“”』接种叶；“”小系统叶；“”阁屮数卞农小：检测到基因农达的株数接种椬株总数。观察发现大果甜菜的发病时问要晚丁本生烟,为了进一步研究该现象是否与病毒的系统运动模式相关,随后又将系统侵染相对稳定的接种两种同的系统寄主,并在、同时问点取样,进行全株染色观察和检测(阁,,实验结果表明,在两种寄主上的系统运动方式同：在本生烟上先从接种叶往下传至根部,评向上传至系统叶；而在大果甜菜上则山接种叶先向上传至系统叶,再向下传至根部。此前本的实验室也利用的作为载体表达观察到类似的结果(。山此以推测,同 中国农业人学博士学位论文第三章甜菜坏死黄脉病毒在丨寄主植物上系统侵染能力的比较研究组分和在同一寄主上的系统运动方式存在若一致性,但在不同治：主上则釆取同的系统运动模式,而这系统运动模式的选择可能是导致在不同寄主上系统侵染稳定性存在显著差兄的原因之一。■根部图不同接种时期在本生烟和大果甜菜上的检测和复制能力的比较转染本生烟原生质体体系的建立及条件优化为了比较与的复制能力,首先要建立单细胞水平侵染的寄主原生质体体系。本系统以本生烟叶片为制备原生质体的植物材料,利用聚二乙醇(介导法将侵染了病叶的植物总接种到本生烟原生质体内,并找到了转化效率较高的转化参数组合以及最佳检测时问点,可用于的侵染、复制、基因组功能以及病毒与本生烟寄主互作等方面的研究。获得高质景的原生质体是保证病毒能高效侵染的前提。本实验按照材料方法中的叙述步骤制茶原生质体,最后的心洗潘所获得的原生质体细胞破损少、形态完核饱满、质膜光亮、液泡系统发达、大小均匀、早圆球状的裸露细胞,产量可达到图。使用台盼兰染色(丁作浓度为吸取原生质体悬浮液,加入染色液混合均勻,室温静置用露醇溶液清洗次沿在显微镜下观察,活的细胞被染色,死亡的细胞则被染成蓝色。染色结果显示其中的活细胞细胞总数总数的以上(图,说明制备得到的原生质体活力良好。 中国农业人学博士学位论文第三章甜菜坏死黄脉病毐在不同寄主植物上系统侵染能力的比较研究‘色…―‘、一々、勒气經隱之：图不同接种时期在本生烟和大果甜菜上的基因的表达接种体外转采物后本生烟发病植株扑洞时点的金株染色(上)及局部放火罔(下)接种体外转物后人果甜菜发病祖株在不同时间点的企株染色(及部放大阁下随后,对本生烟原生质体转染条件作逃一步优化。将常规机械接种病叶中提取的植物总在同浓度梯度、总量梯度下分别转染己制备的本生烟原生质体,室温培养小时后对病毒的表达景进行检测。在植物总总景为的前提下,其浓度达到时幵始可以侵染本生烟原生质体,且随若浓度的增加其病毒的表达景也随之增加,在其浓度为时,表达景达到最大值,但之后随着浓度的递增,的表达量反而下降(图。分析的表达量降低的原因,可能过景的病毒接种量影响了原生质体的存活力,原生质体的活力降低则反过来影响了在细胞内的复制增值,导致其表达量较低。在总浓度」呢…,总量为时,可以侵染本生烟原生质体,并且随若总量的增加表达量也随之增加,总量时表达量达到最大值,并逐渐趋向于平稳(图。上述结果说明,在本生烟原生质体上成功建立侵染对总的浓度有一定的要求,如果总浓度过低,即使病叶的植物总的总最达到病 中闽农业大学博上学位论文第三章甜菜坏死货脉病毐在不同主椬物上系统侵染能力的比较研究毒侵染原生质体所需量也无法建立侵染。：！“图解后的本生烟原生质体细胞解后的本生炳原生质体细胞(〗台盼蓝染色后的本生烟原生质体细胞(〗在最佳转化条件下(病叶的植物总浓度为略尔总量为,经接种本生烟原生质体,分别在,取样,对病毒的表达量进行检测,如图所示,在】的条带处表达量有所小同,在接种左右开始在原生质体中表达,左右达到最大值,而之后随着时问的增加,的表达量有一定的降低,这可能与细胞活力下降有关。综上所述,在该介导的侵染本生烟原生质体体系中,含有病毒的植物总在浓度总量》时进行原生质体转化效率最高,后续实验检测病毒复制及表达的检测应选择在侵染后内为佳。转染浓度(鳴義細图检测比较在梯度转染浓度时的表达水平、、、、、：提取的侵染番？！叶片总的浓度梯度丨)：等体积的水取代总进行细胞转染：七從取的侵染昏叶片的总蛋提取细胞总组,采用抗饭内的淸进行检测(短线所指为的出「条：。 中国农业大学博士学位论文第三章甜菜坏死黄脉病毒在司寄主植物上系统侵染能力的比较研究转染量(—图比较在梯度转染量时的表达水平、、、、、、：极取的授染番叶片总的转染运梯度(；用等体积的水取代总进行细胞转染；提取的俊染潘“？叶斤的总广丨：提取细胞总蛋来用抗饭岛的血清进行短线所措为的蛋丨条带。转染时间(■图比较在不同转染时间的表达水平、、、、：转染原生质体后取样的时间点(：用等体积的水取代总进行细胞转染；提取的侵染番杏叶片的总蛋白：提取细胞总蛋白,采用抗蛋白的血清进行检测(短线所指为目的蛋白条带。和在本生烟原生质体上复制积累量的比较分别将和侵染性克隆的体外转采物(混合发病叶片的总通过的方法转染本生烟原生质体,散光培养提取总细胞的进行检测,采用标记的的片段(,区域,的片段(】域和的片段区域作为检测探针。杂交结果显不的复制积累景要远远高于,而各样品之问的复制枳累水平没有显著差异图表和在本生烟单细胞上初始复制量存在较大差兄,可能对两者在植株上的系统侵染能力有着重耍影响。以复制积累景为内参的的结果图与的结果一致。该实验重复三次,所得结果一致。 中农业火学博丨学位论文笫三章甜菜坏死黄脉病毒丨寄主植物上系统侵染能力的比较研究寸寸■—。一“。一由一！！一——■——乂—±—■—图野生型、和重组病毒体转染小时后本生烟原生质体总和检测、和重飢病毒的。检测：丨和重纽沾毒的、检测的非翻译区对其在本生烟系统侵染不稳定的影响前期的研究结果表明,在本生烟上系统上传稳定的关键区域在于其非翻译序列而非翻译区序列(颖,为了进一步研究非翻译区序列是通过运动还是复制来影响的稳定性,本节分别将野生彳丨、、以及和的重组突变体和侵染性克隆的体外转设物混合发病叶片的总接种同的系统寄主和本生烟原生质体,来对其系统运动能力和单细胞水平的复制能力诉进行比较。 中农业大学博士学位论文第三章甜菜坏死黄脉病毒在同寄主植物上系统侵染能力的比较研究与重组病毒在不同寄主上系统侵染能力的比较将野生輸毒和重组病毒的侵染性克隆、、和经恐线性化,各取的产物作为模板进行体外转录实验,将体外转果物与分离物的总按照比例混合均勾,然后加入与混合物等体积的缓冲液,分别接种的系统寄主本生烟和大果甜菜,并分别在和对系统叶进行检测。接种症状观察发现,接种体外转呆物的本生烟系统症状明显,表现为系统叶下卷,植株矮化,接种和体外转朵物的本生烟几乎没有显系统症状,与接种的类似。则表现出了温和的系统症状,在新生叶上有轻微的卷曲,没有植株的矮化现象(图。接种了、、和的大果甜菜均表现出类似接种的症状,即初期叶片出现黄色病斑,随养时问推移,最终会辱致显著的植株矮化症状(图。检测结果与接种的实验结果一致(在所有接种的株本生烟的系统叶上均可以检测到,而仅在一株上可以检测到。而在株体外转求物接种的本生烟系统也上均可以检测到重组病毒,但在所有接种了的植株系统叶上均未能检测到该重组分子》在大果甜菜舒主上,、、的系统侵染效率均为】但重组病毒无法系统上传。将每个处理的个单株样品混合后进行检测(图结果和—致,重组病毒和在番杏叶片上都能达到一定的复制积累量,但在本生烟系统叶中无法检测到,而能在系统叶上检测到。山此可以确认干：颖博士的结果,在本生烟上容发生丢失与它的非翻译区(复制了)关系密切,而和编码框的序列没有明显的关联,而且在本生烟上没有明显的致病作用。此外,在大果甜菜与番杏上的复制积累量与本生烟上的同,番杏的复制积累量最高,大果甜菜次之。重组分子在大果甜菜接种叶和番杏上的复制积累量均比低,且在大果甜菜上降低的更为明显。其重组分了复制积累量的降低也许是■致其无法在大果甜菜上系统运动的原因之一,山此推知在接种叶上的复制积累量可能影响了其系统上传的能力。綱孩图丨、野生型侵染性克隆及重组病毒侵染本生烟丨天后的症状, 中国农业大学博士学位论文第三章甜菜坏死黄脉病毒在不同街主植物上系统侵染能力的比较研究圖隱顯图、野生型侵染性克隆及重组病毒侵染大果甜菜天后的症状表、野生型侵染性克隆及重组病毒侵染本生烟和大果甜菜的检测系统侵染株数接种棺体外转录物寄主植物系统症状株总数数本生烟本生烟本生烟本生炳丨人果甜菜人果甜菜人果甜菜人果甜菜 中国农业大学博士学位论文第三章甜菜坏死黄脉病毒在不同寄主植物上系统侵染能力的比较研究与重组病毒在本生烟原生质体中复制积累量的比较分别将重组突变体和侵染性克隆的体外转采物混合发病叶片的总,通过的方法转染本生烟原生质体,散光培养后提取总细胞的进行检测,釆用标己的的片段(区域,的片段(区±或)和的片段(区域)作为检测探针。与预期的实验结果相符,各样品之闻的复制积累水平没有显著差好,重组病毒的复制积累量里然略低于,但要远远高于复制积累景与的复制水平相似的图,以复制积累量为内参的的结果(图与的结果一致。山此可推测,在本生烟上复制能力的关键区域主要是在非翻译区,而在原生质体上所其有较高的复制积水平也与其核酸序列或编码蛋表达没有关联,重组病毒的低复制量可能是使其与—样最终无法高效地系统侵染本生烟的主要因素。§醒疆漏謹漏靈驅画漏画图和在本生烟和大果甜菜发病叶片上的检测 屮国农业大学博士学位论文第三章甜菜坏死黄脉病毒在不同寄主植物上系统侵染能力的比较研究必必必勝譽暴警爆上盡關酵雅置图和在本生烟和大果甜菜发病叶片上的检測小结与讨论通过对人量样品中小组分的分子检测,进一步证明了的系统稳定性在不同寄主上存在明显差异,即■以稳定地在大果甜菜上系统侵染,而在本生烟上却极易发生然丢失。和在原生质体上复制积累量的比较证明,复制积累量远低于」能是导致不能系统侵染本生烟的主要原因。结合王颖博士的小测序数据分析,推测该非翻译区主要通过抑制复制和增加的降解来影响其系统侵染效率。此外,病毒在本生烟和人果甜菜两者间采取不同的系统运动模式,也可能是导致在本生烟上无法稳定系统上传的原因之一。的复制能力是系统侵染不稳定的关键原因病毒能否定地系统侵染,往往涉及多方面的原因,如病毒的复制、胞间运动、系统运动和病毒的沉默抑制能力等。本章利用作为报告基因比较在不同系统寄主上的胞间运动和系统运动。结果显示,虽然在本生烟上的系统侵染效率(远远低于大果甜菜(,但仍可在系统侵染本生烟样品的顶叶和根部均能观察到蓝的斑(图和图,接种叶上形成的蓝色斑点并非局限于病斑的中央,逐步从病斑往扩展,并且可以最终进入叶脉屮(图,说明在本生烟上具有与大果甜菜上相当的胞间运动能力和系统运动能力,在不同寄主上复制积累量的差界(图才是导致其系统侵染效率不同的关键原因。与 中国农业大学博士学位论文第三章甜菜坏死黄脉病毒在不同寄主植物上系统侵染能力的比较研究此同时,通过染色不难发现和—样具有类似的胞间运动能力和系统运动能力,只是系统侵染效率不同而已图和图。随后,本章研究在原生质转染实验中证实了的复制积累量与其系统侵染效率呈正相关(图因此推测与复制能力的不同是导致两者在本生烟上存在系统稳定性差异的主要原因。与重组分子的实验进一步证实,的复制能力与病毒的沉默抑制能力无关。当的编码框替换成沉默抑制子的编码框时(重组分子的复制积累量和系统上传效率均未得到提高,而重组分子则可以在本生烟上稳定地系统上传,且其复制积累量与相当(图和表。由此推测,在本生烟上能够稳定上传与所编码的抑制子的沉默抑制能力无关,高效的复制能力才是其稳定系统侵染的保证。另外,大量表达的虽然能有效地进行系统侵染,但在本生烟上却始终未观察到明显的发病症状(图说明与甜菜和昆诺藜不同(,在本生烟上不是主要的致病因子。的复制积累量主要与其非翻译区密切相关正义单链病毒基因组均由模板链、新生链、复制酶和寄主因子形成的复合体实现复制过程,由于病毒模板链的核苷酸组成不同以及复制酶结构存在区别,因此各种病毒的复制调控过程也有较大区别,而这些与复制相关的元件往往存在于病毒的非翻译区(和的重组病毒分子的原生质体转染实验进一步证实,与的复制积累量与其关系密切,而与编码框序列无明显关联,替换上的编码框仍然具有较髙的复制积累量(图。本实验室早期的研究数据发现,和在端既没有序列的同源性也不存在结构的保守性,复制所必须的元件集中在这段序列内(李要,,而的之间的序列对其复制有正调节作用(王颖,因而推测与釆取不同的复制策略,当病毒接种本生烟时可能具有更为有效的复制能力,占用复制相关因子而大量复制,而的在竞争复制或其他相关因子时不占有优势,因而复制水平很低,随着病毒的系统侵染被逐步剔除。此外,一些研究还表明在某些植物病毒的还包含了一些具有寄主特异性相关的复制元件。比如,宪菁曲叶病毒侵染木槿原生质体时,整个序列和二级结构都是复制所必须的,但侵染拟南芥原生质体时仅需要其中的一段序列,且破坏上的莲环结构仍旧可以复制,只是复制积累量有所降低(,。本研究中在大果甜菜接种叶上的复制积累量要远远高于本生烟,推测在的可能也存在具有寄主特异性的复制相关元件,但具体是哪一段序列,还需要构建不同的复制突变体展开进一步的研究。的复制积累量是复制和降解动态平衡的结果。为了进一步探究和在本生烟中的稳定性是否与它们在烟草中面临不同的沉默压力相关,王颖博士对分离物侵染本生烟后产生的进行了高通量测序(王颖,。结果显示,与同源的大部分分布在基因组的末端,此区域和同源,能够用来指导沉默复合体降解。由此推测,本生烟的同源物在切割过程中可能具有底物偏 中国农业大学博士学位论文第三章甜菜坏死黄脉病毒在不同寄主植物上系统侵染能力的比较研究好性,在产生的同源的标下,初侵染的可能率先被降解,而的复制能力弱于,在沉默压力下容易丢失初始复制模板,从而再反过来影响复制速率,最后只能导致丢失。在不同寄主上复制积累量存在差异可能的原因并不存在于所有的病毒株系中,自年最早发现存在于日本分离物之后,目前在亚洲大部分甜菜种植区和欧洲小部分甜菜产区有所报道前期的田间研究认为含有的分离物对甜菜具有更强的致病力。而在大部分实验寄主,如番杏、昆诺薬、宽色藜和本生烟等,仅和是叶部侵染所必须的。由此可知,不同植物对病毒不同组分的选择压力是不同的,虽然不是侵染所必须的,但在田间由于起到一定的功能而被保留,甜菜很可能是自然界推动进化过程的寄主之一,至于获得还是丢失是进化的方向还需要更多的实验来验证。植物病毒由于基因组大小的局限,编码的蛋白种类有限,侵染过程中的绝大多数环节需要借助寄主因子的参与,例如病毒的翻译、复制、胞间运动和系统运动等。尤其是在病毒进行复制时,往往需要占用一部分寄主因子。而不同植物的寄主因子对病毒的识别或亲和力存在差异,从而影响复制效率。有研究报道称番游可以通过自身的蛋白与烟草轻绿花叶病毒的复制酶结合来抑制病毒的复制从而抵制病毒的侵染,、而在烟草中由于不存在这样的寄主因子而使建立系统侵染(,本章研究中所涉及的寄主植物本生烟和大果甜菜亲缘关系较远,存在大量不同的寄主因子,从而导致的复制能力具有寄主特异性,但需要更多的实验来证明哪些寄主因子起到了主导作用。另外,通过连续时间点的检测和染色观察发现,在不同系统寄主中的运动模式存在差异：在本生烟中先从接种也往下传至根部,再向上传至系统咔；在大果甜菜上则由接种叶先向上运动至顶叶,再向下系统运动到根部(图和图。结合日本研究小组利用进行的实时突光观察结果推测在本生烟中可能需要先进入韧皮部向下运动,而这一过程可能损耗大量而的复制初始量相对较低,在这一过程中容易丢失无法进行系统侵染；在大果甜菜中,先通过莲表皮细胞的胞间运动到达顶叶再进入韧皮部向根部运动,在胞间运动的过程中通过复制得以不断积累,最后有足够的可以进入钥皮部建立系统侵染。 中国农业大学博士,位论文第四章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本牛烟的转录组测序及分析第四章受甜菜坏死黄脉病毒侵染的本生烟的转录组测序及分析病害的各种宏观症状和微观症状均是由病毒直接或接导致的寄主植物生理、生化异常引起的。病毒利用寄主的翻译体系,在某典情况下,病毒控制着翻译自身先与翻译：辛：少部分寄主的优先权,从而改变植物的转录组表达,使得病害进步发展(,。近年来,高通量转采组测序技术的、断发展和完善为开同生物功能基因组学研究提供了全新的思路和方法。与以大量恶因序列或分子数据库倍总为前提的基因芯片技术相比,该方法更适合基因组阁谱尚未完成或数据佶息乏的物种,并已经广泛应用到了包括人类、酵母、拟南芥、水稻、老默等多个物种的研究中,其中对于病毒侵染的模式植物拟南芥、烟草、水稻的转求组测序为研究病毒症状形成和致病机制提供了良好的数据基础。本研究利用第二代高通量测序技术宵次对基因组不同组合(和侵染后的系统寄主本生烟进行转录组测序研究,全面比较分析在侵染后寄主在水平上基因的表达变化情况,蹄选出与致病相关的候选基因,为的致病机理及与寄主之间的相互作用研究提供核酸水平的寄主数据,也为在分子水平上研究的防治新策略提供了更翔实的基闪信息和线索。可加重在本生烟上的症状不同组分侵染本生烟的症状差异仅需要和就可以系统侵染本生烟,但其他小组分的系统运动能力和致病性各有不同。分别将食有基因组分的和含有的在番杏叶片上扩繁,然后提取发病叶片的总,加入与总等体积的缓冲液,机械接种叶期的本生烟幼苗。接种天后,丨以观察到接种的本生烟的症状比较温和,除新生叶有轻微花叶和卷曲的症状外,与健康植株几乎没有差别。接种的本生烟有症状加重的表型,具体表现为接种叶有明显的黄斑甚至局部坏死,全株矮化,系统叶明显向下卷曲(图。根据已有的研究结果表明编码的是寄主甜菜上一个关键的致病因子,导致甜菜出现典型的丛根症状,但在本生烟寄主上与症状的产生几乎没有关联,而甜菜上主要与介体高效传毒相关的编码的蛋内,却是本生烟寄主上一个重要的致病子,说明的同一基因组分在不同的寄主上将会行使不同的功能。这一现象与日本实验室报道的实验结果相一致(,不同组分侵染本生烟对病毒积累量的影响于不同的基因组分对在本生烟上的症状有明显的影响,为了验证该症状的严重度是否与病毒粒体的积累量相关,分别对和侵染的木生烟系统叶进行不同时间点采样,并通过分析法检测的病毒含量。结果显示,接种了和后本牛烟系统叶上病毒的积累量及变化趋势非常相似,在接种后最初天内随着时间的推移 中国农业人学博学位论文第叫章侵染甜菜坏死黄脉病母的本生烟的转录纟测序及分析早逐渐递增的趋势,到了第之后病毒的总禽量趋于稳定,并在有所降低。山此表明里然能够引起典艰的矮化和卷叶症状,但对病毒的积累量几乎没有影响,山此推测在本生烟上的矮化卷叶症状与病毒粒体的积累量无相关性》———图和分离物侵染本生烟的系统症状：屮分丨之丨物与接种本个烟天的症状：：拨种样！丨冲条基大】纽的检测 中闺农业大学博：丨：学位论文第四章侵染甜菜坏死黄脉侦毒的本生烟的转录组测序及分析■—士她”—”—：图接种与后病毒粒体在本生烟系统叶片中积累量的时间曲线分别在接种、、、、、和天來染科朱系统叶进行检测。阁屮两条丨线分别代农和接种的样样稀释倍数为编码的蛋白在细胞内的定位在病毒的侵染和复制过程中,病毒蛋白在寄主细胞的同部位具有特定的分布,明确病毒蛋丨的亚细胞定位有助于択小病毒侵染过程及致病机理。前研究表明,编妈的是一种多功能蛋,；、仅与真菌介体的高效传毒相关,还能使本生烟产生植株矮化,新生叶片下卷的严重症状,并在本生烟根部其有基因沉默抑制了的功能(。目前除了在局部寄主昆诺黎上有少景的研究之外,还没有关于在其他寄主上细胞定位情况的报道。既然蛋是本生烟上一个重要的致病因了那么很有必要明确丨蛋丨二在该寄主体内的亚细胞定位,以进一步理解的致病机制。蛋白融合在植物细胞中的定位为了明确的亚细胞定位,分别在的末端和末端融合。通过农杆菌注射的方法使其在植物细胞中瞬时表达并检测融合蛋突光的分布。首先以侵染性克隆为模板,以为引物,扩增基因,产物经收丨连入得到中问载体,阳性克隆经过测序确认正确。用限制性内切酶和从质粒酶切下片段,连接到含有的载体的相同酶切位点中,得到能够瞬时表达融合蛋的重组克隆图。同时以载体为模板,利用引物对扩增的基因,产物经丨“丨收后连入得到中问载体,阳性克隆经过测序确认正确。将基因用和从酶切下,收纯化片段连入经相同酶切处理的载体中,得到置于之后的中间载体。然后将片段用和制从质粒梅切下,连接到经过相同酶切处理的载体中,得到能够瞬时表达融合蛋的重组克隆 中国农业大学博学位论文第叫章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录组测序及分析图。重组克隆酶切鉴定和扩增证明构建正确。将质粒和分别入农杆菌中,通过农杆菌浸润本生烟叶片,使其在植物细胞中瞬时表达,三天后用激光共聚焦显微镜检测本生烟叶片下表皮细胞中融合蛋内的分布,发现无论还是,其融合表达的红色突光都主要存在于表皮细胞的细胞核中,但是细胞质中也有极少量表达。在细胞核的亚核结构中也是均匀分布,而是虽散点状分布(图内嵌图。为了进一步确定细胞核的位置,采用染料将表皮细胞染色,结果表明与的突光能够重合,说明了红色突光的集中区域就是细胞核的位置,而空载体所表达的平均分布于细胞核和细胞质中(图。这表明的其有定位于细胞核的能力,因而能够使得融合蛋山细胞质向细胞核富集。。—■政‘丄图融合的表达载体示意图山于分了景小于的蛋由能够自山扩散通过核孔复合体(进入细胞核,的分了量是,的分了量是,为了减少融合蛋山于分子景低而造成的自山扩散,将的连入到载体中,闲为具有核定位信兮,能够有效防止非核定位的蛋白进入细胞核。首先利用为模板,用引物对广增得到基因,产物经丨收后连入,经蹄选获得中问载体。将基因用工和从切下,卩」丨收纯化片段连入相同酶切处理的载体,蹄选获得阳性克隆。再以载体为模板,引物对扩增得到片段,产物经」丨收后连入得到中闻载体,阳性克隆经过测序确认正确。将片段用和从质粒酶切下,连接到经过相同酶切处理的载体中,最终得到能够瞬时表达融合蛋的重组克隆图。重组克隆经双酶切鉴记和扩增证明构建正确。将斤入农打菌,通过农打菌注射本生烟三天后激光共聚焦显微镜观察结果表明表达的融合蛋能够富集于细胞核,在细胞质中也有少量表达,这与和的融合蛋丨在细胞质中的极微量分布同(图。除了在细胞质中分布景有差兄外,在细胞核的亚核结构中的分布也存在差兄,和的融合方式使得红突光在细胞核中早散点状分布,而在细胞核中分布比较均‘习,在类似核仁的位置有大景分布(图内嵌图。推测能是山于在融合蛋加入了之造成构象、同所造成的,在以前的报道中也有一些类似 中国农业人学博士学位论文第四章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录组测序及分析的情况(。—■■■■剛■■圓■图丨蛋白融合融合蛋白在本生烟叶片中的定位、有,丨和质粒的农杆菌注射本生烟叶片天后,观察叶片农皮细胞的红色焚光的分布,同时利迸行细胞核染色。蛋白融合在植物细胞中的定位为了进一步验证细胞核定位情况,将蛋融合检测其定位情况。首先将片段用和从质粒酶切下,收后连接到有与相同酶切位点的载体中,得到重组克隆,但农打菌注射瞬时表达无法检测到绿光,推测有可能是蛋白与融合后会对蛋内空问折叠有所影响,从而影响的发光,在前人的报道中也有一些类似的情况。因此,又以载体为模板,为引物为引物对扩增得到融合于端的片段,产物经丨收后用和双酶切连入经相同酶切处理的载体中,构建能够正常表达的重组克隆图。重组克隆酶切鉴定和扩增证明构建正确。 中农业人学博丨学位论文第叫章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录纟测序及分析他■■寺■—图丨的表达载体示意图■■國■■闘■图在本生烟表皮细胞中的定位■有质粒的农杆苗注射本烟叶厂「天观察叶片丧皮细胞的绿色突光的分布,同时利丨进行细胞核染色。将质粒入农奸菌中,通过农杆菌浸润本生烟叶片,使其在植物细胞中瞬时表达,三天后用激光共聚焦显微镜(检测本生烟表皮细胞中融合蛋白的分布,与和融合蛋科表达的结果类似,所观察到的绿色灾光主要存在于衷皮细胞的细胞核中,在细胞质中几乎观察到。与红色突光的散点状分布同,绿色突光在细胞核内的表达相对较高,早规则聚集体分布(图。和在植物细胞核中存在互作能够在细胞核内富集,然只有典丨的细胞核定位信兮,但是我们仍想知道是各通过己报道的经典途径进入细胞核。因此,将己经报道的本生烟蛋分别通过的方法检测是否与丨互作,从而推测进入细胞核的途径。以侵染性克隆为模板,为引物对,扩增基因,产物经过与双酶切后,连入经相同酶切处理的载体中,得到重组克隆。重组载体经测序确认正确,并利用与双酶切和鉴定片段插入情况。将舍有同质粒的农奸菌组合 中国农业大学博土学位论文第四章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生炳的转录组测序及分析共浸润本生烟叶片,天后共聚焦显微镜观察表明和在表皮细胞能够检测到明显的互作突光,并且突光与发出的突光相重合,这说明互作发生在细胞核内,在细胞质中完全检测到突光,而对照组合未观察到突光(图。以上结果表明的能够与,互作,推测可能正是通过与植物的相结合被转运到细胞核中。■■■■图与丨在本生烟表皮细胞中互作“”农小激发光下的视野,农示烟农皮利染色在紫外激发光下的视野；“”农明场下观察细胞的轮廓；“”足叨场和‘炎光视野的的重營。本生烟转录组测序测序样品的提取与检测根据对同时问点采集样品的检测结果(发现到接种天病毒的总禽景趋于稳定,并且此时山引起的典型矮化和卷叶症状也相’明显。因此本实验中用于转求组测序的材料选取接种后第天的植物样品,利用法对样品,及未被病毒侵染的本生烟健康对照提取总。经琼脂糖凝胶电泳和质景检测显示供试的三分材料、及条带完整,纯度较高,满足下一步建库要求(图。送交杭州沃森 屮国农业大学博士学位论文第章侵染甜菜坏死黄脉病毒的木生烟的转隶组测序及分析公司完成转录组测序。围本生烟样品总的电泳检測转录组测序的拼接与注释测序数据的初步分析由高通量测序共得到的原始数据(,先去除和的序列和其中的比例大于的,然后通过过滤去杂(利用软件包中的过滤掉低质量读序,参数设置：去除了测序质量值低于,且序列长度低于的原始,获得的有效转录组数据(,作为后续分析的基础。二份材料和的各自转录组数据详见表。表转录组数据统计结果转录组数据的拼接本实验将预处理后的总数据比对到已山康奈尔大学实验室在网上公布本生烟的基因组草图上比对上的数据详见表。获得的总长度约为大于的有个,平均长度为长度(覆盖所有核背酸的最大序列重叠群长度)为表。对转录组的长度分布特征进行分析(表,在总屮,所占比例最大的为,占。 中国农业大学博士学位论文第四章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录组测序及分析随后是和分别是和。长度大于共有条,约占。随后根据结果及信息对片段进一步进行拼接,共得到条。表转录本的组装结果綠组的功能注释与分类为了从整体上了解转录物序列信息,首先利用非冗余数据库、、和公共蛋白数据库对上述条转录物数据进行比对(。结果显示,在,条序列中,的,条)具有同源比对信息：其中在库中比对上,比对上,比对上,比对上表。在对同源基因数量进行分析时,图结果显示,注释上信息的与葡萄的同源基因数量最多,其次是杨树菌麻和烟草排除物种自身基因信息完整性的影响,基本能反应出本生烟与其他植物物种之间的亲缘关系的远近。 中国农业大学博丄学位论文第叫章侵染甜菜坏死货脉病毐的本生烟的转录纟测序及分析表本生烟转录组的功能注释,结合数据库对本生烟的条进行功能注释分类分析,共有,种获得了功能分类注释。数据库可分为个亚类,即基因所涉及的生物学过程、细胞组分(和分了功能(丨。上述功能可被分为更为详细的个类别,分别食了、和个功能亚类(图。在这二个主要的类别里“细胞过程”(个、“细胞部分”(个和“结合”个分别有最多的数景。“催化活性”(个、“代谢过程”(个、“生物调节”(和(,个“膜”(个类别也有很多基因的分布,而“生物学黏附”(个、“信兮传递”(个和“细胞器部分”(个所属的数目最少。■■■。一一■一—籍丄。肩—■图注释的物种分布 中国农业大学博上学位论文第四章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录测序及分析丨⑷。丨丨■■图烟草转录组的功能分类为了一步评估转呆组文库的完整性和注释的有效性,对序列又进行了分类,共有,个有分类。按照其功能分类可分为大类,其中最多的为一般功能预测类,有条；其次为翻译、核糖体结构与生物合成类,蛋质翻译后修饰与运转、分伴侣类；数景最少的为胞外体结构,只有一条序列(图。—■■■■■■二—「■■■■■■■■漏—■■图丨烟草转录组的功能分类根据注释信息可进一步得到的注释,在本生烟转中发现可能参 中国农业大学博士学位论文第四章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录组测序及分析与或涉及代谢途径的共,条,将次生代谢途径按代谢产物可分为类附录。含相关数量较多的代谢路径主要有：代谢通路(、次级生物合成代谢和在不同环境中微生物的代谢(等。转录组数据差异比较分析为了研究侵染后本生烟的生理过程的变化,本实验比较了、侵染后发病的本生烟与健康对照三者之间转录组表达的差异。本组实验中用了法计算基因表达水平,即每百万个上的片段中到外显子的每一千个碱基上的片段个数,消除基因长度差异和测序深度的影响。其中有条转录本的值低于等于说明能检测极低水平基因表达。在三个样品间,共有个基因发生显著的表达差异小于等于。两组间比较分别为：在中有个基因表达水平发生变化,其中个基因表达水平上调,个基因表达水平下调；在：中有,个基因表达水平发生变化,其中个基因表达水平上调,个基因表达水平下调；在中有个基因表达水平发生变化,其中个基因表达水平上调,个基因表达水平下调(图。这些结果初步表明本生烟的转录组在不同的组分的侵染下存在一定的表达差异,而且这一差异显示侵染本生烟基因表达发生变化数量的多少与症状的严重程度呈正相关。差异表达基因的分析显示,与侵染造成的基因富集在生物过程与分子过程两大类中呈相似的富集特征,只是基因的富集数量要远高于,但在分子功能分类中,两者之间的富集特点有较大的差异(图。其中侵染后有两个类别呈现显著聚集,分别是催化活性(和结合(；侵染后却有两个完全不同的类别呈现显著的聚集,分别是受体活性(和通道调节活性。当富集的特征与相似,同样富集于催化活性与结合两大类别,由此推测,催化活性和结合两类基因的变化可能是由侵染本生烟引起的,而侵染引起的严重症状可能与具有受体活性与调节通道活性功能的基因相关。对差异表达的基因在数据库中作进一步分析,结果显示侵染与侵染本生烟导致的差异表达基因富集的代谢通路大致相同,主要是代谢通路(次生生物合成代谢植物病原物互作(氨基糖和核苷酸糖代谢(光合作用天线蛋白和半乳糖代谢(六大途径(表。其中代谢通路和光合作用天线蛋白两大途径是特有的表达差异富集途径,表明这两大途径的生理代谢变化可能与侵染本生烟造成的矮化与卷叶等特有的症状相关。 中国农业大学博上学位论文第四章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录组测序及分析二‘腳■严■—品■：图侵染后烟草基因组的表达变化藉弁基闲的聚类分析红色：农纟农达上调的基因绿色：示农达下调的基因韦恩阁农示斧另农达基因叫的关系差好衣达基因屮的上下调比例病害症状相关因子的蹄选基因沉默途径相关基因的变化干涉(属于转朵后基因沉默,齊遍存在于真核体物中,在寄主与病毒长期进化的过程中,植物通过抵抗外来病毒的入侵；与此同时,植物病毒也能通过编码同的抑制了来抵制或干扰寄主植物沉默的发生。我们转采组测序分析同样发现一系列与沉默途样相关的基因表达发生显著的变化(表其中作为引发植物抗病毒沉默的起始蛋在多种植物病毒侵染植物时都有相同趋势的变化,本研究中的 中国农业大学博上学位论文笫叫草：侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录组测序及分析无论在或的侵染下都发生了表达量的上调,但两者问上调倍数有很大差兄,且该差兄与症状的严重度早正比。蛋是病毒诱导沉默中的效应因了,参与病毒产生的小的祀向降解作用。有趣的是,我们检测到的四种蛋丨二无论在变化趋势,还是变化幅度上都有若同的表现,说明在本生烟植物对抗的过程中同的蛋可能发押着同的作用。因此,这些基因可以作为烟草抗性研究中的候选标,以进一步祝不其在抗病毒过程中扮演的佑色。■■、”“夕‘‘”—图差异基因的富集表差异基因的分析 中国农业大学博士学位论文第四章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录组测序及分析泛素化途径相关基因的变化泛素化是一种蛋白质翻译后修饰(作用,在细胞生命活动的许多进程中发挥着至关重要的作用,比如内吞作用、细胞凋亡、转录调节、组蛋白活性和修复等过程。越来越多的研究发现,泛素化系统与植物抗病性密切相关。我们的研究表明,当或侵染本生烟时,都影响泛素化相关的一些基因的正常表达。如大部分与泛素结合酶(或泛素连接酶(相关的基因发生了明显的表达上调,而两个泛素蛋白酶体途径相关基因(在侵染植物后却发生了大幅度的表达下调(表。表基因沉默途径相关基因的表达—细胞壁合成相关基因的变化矮化和卷叶是侵染本生烟的主要症状,这两个症状的形成往往与细胞壁合成相关基因紧密相连,目前最新的研究结果表明纤维素合成酶与植物矮化症状的表现有关。通过对转录本表达量的分析,我们获得了一系列表达量发生变化的基因参与植物细胞壁合成,其中包括纤维素合成酶基因、结构蛋白、和葡聚糖酶等。在这些基因中,所有的纤维素合成酶相关基因(和和大部分与细胞壁结构相关的基因表达呈下降趋势,且与症状表型正相关。但少数几个与细胞壁结构相关的基因丨和的表达量反而有着不同程度的升高(表,由此可推测,的侵染引起了大部分细胞壁合成相关基因的表达变化,而纤维素合成基因表达的下调可能是导致矮化症状的原因之一。寄主植物激素途径相关基因的变化植物病毒侵染植物寄主后,会影响植物中激素的活性,而内源激素对调节植株的生长发育起着十分重要的作用。研究表明,侵染植物的病毒可以通过改变植物体内激素的含量从而扰乱其正常的生理平衡导致症状的产生。通过分析转录本的表达量,发现许多与激素合成代谢途径或激素响应相关的基因表现明显的表达变化。这里包括与激素代谢或编码中间产物合成关键酶的基因,如,和丨,激素应答相关基因,如 中国农业大学博士学位论文第四章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录组测序及分析’和,这些基因均呈上调表达趋势(表。表“泛素化途径相关基因的表达—￡￡方法驗证測序结果为了验证转录组数据的准确性,共选取了个设计引物(附录,其中有个不能扩出预期条带,这可能与基因序列拼接的准确性及引物设计区域选择相关。其余的的实验结果与转录组测序结果一致,且两组数据呈线性相关(图。 中国农业大学博士学位论文第四章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录组测序及分析表细施壁合成相关基因的表达,】表植物激索相关基因的表达 中农业大学博丨：学位论文第四苹侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录纟测序及分析■丨丨。,■■■丽■■■圓匪产玄—？图丨验证转录组数据的实验结果蓝色农转,乂飢实验结架,红色代农验结架：转組数掘与验证结果数掘的线性相关间赤霉素喷施对产生症状的影响植物激素及其类似物对某些植物病毒具有一定的防治效果。为了进一步探究植物激素与产生的症状之问的关系,对接种的本生烟进行外源激素和的喷施,为了避免激素使用过景产生药害,我们选择的浓度为,在接种第二灭进行喷施,每株喷两次,每隔三天冉喷施一次,共重复喷施三次。停止喷施后一周(即进行观察,结果表使用外源激素处理时,本生烟矮化症状消失,与健康植株没有明显差兄,个别植株接至略商健康植株,可能与使用浓度偏高相关。而使用剛哚乙酸处理时,除植株叶片变的史肥大 中国农业大学博丨学位论文第四章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录组测序及分析以外,对株高几乎没有影响(图。在转录组测序的结果中,与赤霉素降解相关的基因表达量的上调(表表明植物体内的赤霄素含景将相应下降,可能导致被病毒侵染的植株出现矮化症状。山此推测,的很可能通过某种机制影响了植物细胞内的新陈代谢途托,进而致株高的变化。至于通过仆么途径,如柯调控赤素的代谢,是一个值得深入研究的问题。(本部分实验山刘俊空同学帮助完成)图接种了的本生烟在喷施外源激素后的症状小结与讨论本研究首次釆用高通景测序技术对同组分侵染后的本生烟转录组进行测序和功能分析,并重点挖掘与其症状和致病性相关的基因。在目前本生烟基因组及转组学研究刚刚起步,遗传背景几乎清楚的情况下,本研究共获得,种具有较高注释可信度的表明高通量测序技术是批量挖掘本生烟功能基因的有效段。与传统测序技术相比,高通景测序的长度完全可以满足序列数据分析的要求,且测序还具有测度快、通量高、成本低等优点。对于本生烟转及组测序数据的分析将为在模式寄主植物本生烟上的致病相关基因、寄主与病原互作基因以及寄主受病毒侵染的影响以及防御反应等方面的研究真有重要参考作用。高通景测序技术对植物与病原物之闻的相互作用研究提供了一条新的方法和思路。侵染改变本生烟转录组表达可能的机制尽管前有许多的关于病毒侵染■致寄主植物转采组表达变化的报道,但导致这一变化的机制仍然未知。其中最主要的两个机制模型是：竞争病害模根和互作病害模难。竞争病害模型是指病毒在复制过程中通过大量篡夺寄主植物的生长原料从而技致病害的产生,这一模屯往往伴随着病毒自身复制积累景的增加。而互作病害模耶则认为病毒通过与寄主植物组分之间的特异性互作 中国农业大学博士学位论文第四章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录组测序及分析从而破坏了寄主正常的生理过程导致病害的发生。本实验中的检测表明,或侵染本生烟虽然导致症状上存在明显的差异,但在病毒粒体的含量方面,两者几乎没有差异。表明侵染本生烟导致寄主产生严重的症状很可能采取的是第二种模型。此外,已有研究表明导致本生烟严重症状的致病因子很可能是编码的蛋白,而且也己被证实为组织特异性的根部抑制子(因此,可以推测是由于编码的蛋白与寄主关键因子的互作而导致症状的产生。对植物防御机制相关基因的影响基因沉默是植物抵抗病毒侵染的一种重要途径。大多数的植物病毒是病毒,它们在植物体内都能在依赖的聚合酶参与下形成双链结构,为植物体内的提供了诱导起始物,从而引发植物体针对病毒基因的干扰过程,阻止病毒的复制,沉默途径主要蛋白的缺失会促进病毒在寄主体内的积累(,。目前有许多关于病毒侵染导致基因沉默通路上重要基因表达量发生变化的报道。与以上的报道类似,不同组分侵染本生烟也导致了许多基因沉默相关基因的差异表达。其中在与侵染的过程中都明显的发生了表达量上调,但,及只有在侵染的过程中基因表达水平才发生较大的变化,其中和基因表达水平上调,和的基因表达水平下调。推测,本生烟可能对病毒具有通用抗性,而其他基因沉默相关基因则对不同的病毒具有特异的抗性,且不同的基因的防御策略可能存在差异。除了基因沉默途径之外,泛素蛋白酶降解途径也是重要的寄主防御机制目前关于病毒与该途径的相互作用也有许多研究。不仅病毒的侵染会改变寄主植物泛素蛋白酶体降解途径相关基因的表达,而且泛素蛋白酶体途径的变化也会影响病毒的复制积累量,。本实验的转录组测序结果表明,许多涉及泛素蛋白酶降解途径的基因表达发生了显著的变化。其中蛋白酶体相关基因的表达都呈现下调趋势,而泛素相关基因的表达水平则大部分表现为上调。目前还不清楚对这些植物防御体系相关的基因在本生烟的途径特别是抗病毒(尤其是的过程中扮演什么角色,但是它们在其它植物寄主的抗性途径中的关键作用己被证实。因此,这些基因可以作为本生烟抗病毒机制研究中的候选目标。加重本生烟病害症状的原因分析矮化是侵染本生烟产生的一个重要症状。矮化症状的形成往往与细胞尺寸、细胞形状、新陈代谢以及细胞中间板的形成有密切联系,其中细胞壁的合成是重要的影响因素(植物的细胞壁大多数由多糖组成,纤维素是最重要的组分,纤维素的合成酶家族包含着和。目前许多最新的研究都表明纤维素合成酶会影响植物的株高,比如基因的水稻突变体,其表型与病毒侵染水稻导致的粗缩症状非常相似(,。本研究的结果表明,侵染后,本生烟转录组中在细胞壁相关基因中,很大一部分变化显著,其中包括纤维素合成酶基因,内切葡聚糖酶,果胶质 中国农业大学博士学位论文第四章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的转录组测序及分析酶等。在这些基因表达中,可以发现大部分的纤维素酶相关基因均呈下降趋势,但其他细胞壁组装及结构蛋白基因则上下调趋势不一致。由此推测,引起了大部分细胞壁合成相关基因的显著变化,而纤维素酶合成基因表达的降低可能是导致植株矮化症状形成的主原因。此外研究表明的合成对细胞的伸长有影响。由于病毒侵染后常导致植株显著矮化,因而对含量的研究有诸多报道。比如侵染烟草,侵染黄瓜,侵染水稻,侵染马铃薯和侵染大麦均导致寄主体内含量的降低目前研究发现,侵染水稻后导致植株生长迟缓、变矮、叶片浓绿,是由于其编码的蛋白与合成关键酶之一内根贝壳杉烯氧化酶相互作用,下调内根贝壳杉烯氧化酶的表达量,使得合成受阻而造成的(,。本实验的转录组数据分析显示,侵染的本生烟中许多抑制合成的相关基因的表达都得到了大幅度的上调,其中基因在水稻上证明与的降解相关(,该基因的过表达突变体表型与病毒侵染导致的矮化症状很相似。此外,对接种了的植株使用外源激素处理时,本生烟矮化症状消失,而喷施症状不恢复。综上所述,侵染本生烟导致的矮化症状可能是细胞壁合成相关基因表达下调与体内积累受到抑制共同作用的结果,而通过什么途径改变这些基因的变化还需要进行深入研究。 中国农业大学博士学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录组和小分子测序及分析第五章受甜菜坏死黄脉病毒侵染的大果甜菜的转录组和测序及分析病毒对植物的致病性就是病毒与植物之间相互作用的结果。病毒进入寄主体内的过程、触发和调控寄主的抗病通路以及随后的病毒复制导致了病毒和寄主间的一系列复杂的相互作用,而其中大部分内容可以通过寄主植物的转录谱变化来了解,这样就可以鉴定和病毒致病过程相关的关键候选基因,从而广泛了解病毒致病的整个过程。第三章的研究表明,包含不同基因组的对本生烟和大果甜菜这两种系统寄主的致病性存在显著差异,在本生烟上必须有的存在才能造成植株矮化、新生叶下卷的严重症状而在大果甜菜上仅需要、和就具有类似的致病力,且增加或对症状的增强无明显影响。由此推测,在这两个系统寄主上可能存在着不同的致病机制。然而,究竟在大果甜菜上是如何致病的以及何种因素导致了症状的产生目前还没有相关的研究报道。为了探究在大果甜菜上的致病机理,本章利用公司开发的新一代高通量测序技术结合生物信息学分析,详细分析了侵染后的大果甜菜叶片的转录组的差异,从水平初步分析引起严重发病症状的原因和可能的分子机制,并与前一章中本生烟上的转录组分析结果进行了比较,为更好理解在不同系统寄主上存在的致病力差异的原因提供了分子水平的相关线索。此外,病毒参与寄主的沉默反应也有可能调节病毒侵染的症状,为了更加深入地了解大果甜菜与病毒的相互作用机制,对侵染后产生的也进行了高通量测序分析,试图通过分析的表达特征来获得更多关于病毒如何致病的分子信息。侵染大果甜菜的症状和分子检测将的基因组和的侵染性克隆经恐线性化,各取的产物作为模板进行体外转录实验,将体外转录物与分离物的总按照体系混合均勾,最后加入等体积的缓冲液,摩擦接种番杏叶片进行扩繁。叶片发病后提取含有基因组的发病叶片总然后加入等体积的缓冲液,机械接种叶期的大果甜菜幼苗,每叶接种体积为,每棵大果甜菜接种三片展开叶。时,接种叶片出现褪绿花叶症状,随着时间推移上部叶片也开始出现褪绿斑,时,植株症状显著,生长严重受到抑制,植株矮小,上部叶片偶尔会出现不同程度的卷曲(图同时,发病植株的根部较于健康植株瘦弱细小,但未观察到类似甜菜上的丛根症状。此时釆集上部发病叶片和根部组织提取符合高通量测序要求的总图保存于°,以备后续实验。 中国农业人学博」：学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录组和小分子测序及分析■图侵染本生烟的症状阁为接种丫乂乂天；大张甜菜的症状农型；閱为大央甜弟拉株叶部和根部样纟总的电泳检测大果甜菜转录组测序转录组测序的拼接与注释将质景合格的样品根据构建测序要求的文库,最终得到的产物经过琼脂糖检测和片段选择后用川进行高通量测序。测序仪产生的原始图像数据经转化为序列数据,获得的结果以文件格式存储,文件也的序列及的测序质量。测序得到的并都是有效的数据,部分带有接头序列,或者禽有部分低质量序列,这些会对后续的拼接和比对分析造成影响,首先需要进行一系列的数据处理去除杂质和低质量序列数据,得到大于个的测序数据情况见表。表测序数据的统计利用软件对数据的拼接,拼接山三步组成,分别是“”,“”,。其核心方法也是利用算法绘制序列路样图(。首先,“”将双端序列组装成唯一的转本序列,“”则根据这些序列利用算法描述序列路径,其值为恒定值,最“”分析粮合路径图,给出全 中国农业大学博士学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录组和小分子测序及分析长转录本及可变剪切等信息。最终从的转录组数据中获得条在数据的基础上,结合信息对片段进一步进行拼接,共得到片段条,序列信息达到了,平均长度为,长度为,。其中长度大于的片段有,条,比例为的有,条,比例为大于的有条,占总数的。具体的长度分布信息见表。为了从整体上了解转录组的序列信息,通过本地构建搭载在服务器上的利用公共数据库、、、和对转录组数据进行全面比对注释。表结果显示,在,条序列中,,条在库中具有同源比对信息,其中有条能够在比对到具体的蛋白功能。具体注释信息的物种来源分类见图,其中与葡萄的同源的基因最多,其次是碧桃、杨树和蓖麻、。表大果甜菜转录组中数据长度分布表大果甜菜转录组的功能注释 中国农业大学博士学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录纽和小分了测序及分析随后利用及功能注释分类体系对具有同源比对信息的进行功能比对和注释。在功能分类体系中,大果甜菜叶片转录组中的报据功能大致可分为类图中用表示,并对每一类的基因数量进行了统计。山图可以看出,的功能种类比较全面,涉及了大多数的生命活动,一般功能类的基因数景最多,有条,核酸结构基因类的数景最少,仅有条；其他种类基因的表达丰度小尽相同。在功能分类体系中,有,条序列建立了对应关系,大致可分为生物过程、细胞组分和分了功能大类小类,并对每一类基因数量进行了统汁。从图中可以看出来,其中分了功能这一大类中,涉及的基因数最多,有条；在生物过程这一大类中,涉及的基因有,条；在细胞组成这一大类中,涉及的基因有条,具体的亚分类见图。「一。一：丨聽■‘‘图注释基因的物种分类；：舌—“；今,〔■■【專醫證漏思谨口■■■战■■■■。⑴图大果甜菜转录组的功能分类 中国农业大学博学位论文第五章侵染甜菜坏死货脉病齒的野生甜菜的转录纟和小分了测序及分析利用数据库作为参考,可能涉及或参与代谢途径的有条依据代谢通路可分成丨类,具体列表见附杂表。其中主要参与的代谢途径有,剪接体(丨,涉及基因条；植物病原物互作(,涉及的基因有条；植物激素信转斤涉及的基因有条；泛素化介■的蛋质水解涉及的基因条；降解(涉及基因：核酸切除修复(,涉及基因条；此外与光合代谢相关的途校光合作用(、卩卜啉和叶绿素代谢(及光合作用天线蛋涉及基因分别为条、条和条。‘釋卜”丨图大果甜菜转录组的功能注释大果甜菜旳发掘标记是目前应用最为广泛的一种分了标记。相较之其他植物,甜菜的标记资源相匮乏。因此,本实验室利用上述已获得的大果甜菜转求组数据进行了新标记的发。挖掘山软件程序包来完成(本研究中,的杳找标池为：一核哲酸重复次数,三核苷酸四核苷酸彳核苷酸六核苷酸重复次数。通过对,条非冗佘序列分析,共发现位点个,分布于条中,其中条禽有一个以上位点。在的重复基元中,三核苷酸重复基元的出现频率最高其次是二核苷酸重复(和四核苷酸重复(其体分布见表。在,个中共有种重复基元(,其中,所占比例最大的是和。。。 中国农业大学博士学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录组和小分子测序及分析表大果甜菜转录组核苷黢重复类型的分布重复类型重复数总数频率％转录组数据的差异比较分析在对转录组进行拼接及功能注释后,我们需要对侵染后的大果甜菜叶片与健康对照两个样本间进行系统的转录本表达量差异比较分析,以研究侵染后大果甜菜的生理过程的变化。利用的升级版将两组序列回贴到拼接好的参考序列上,输出每条转录本在不同样品中的值,将差异蹄选的阈值设定为。通过比较总共筛选得到个差异表达基因(如图,其中有个基因上调,个基因下调(如图。差异基因的功能富集对于研究差异基因与表型变化之间的联系有着重要的作用。通过功能富集,我们可以得到差异基因集中作用的祀标途径及功能,对于比较基因组学有重要意义。用软件,结合先前对于转录组的注释信息,进行了不同差异基因集的功能富集研究,探索不同材料和时期之间差异基因的功能分布和主要调控途径,富集分析的蹄选条件为。表为在细胞组成、生物过程和分子功能三大类下富集到的功能分类。 中农业人学博：丨：学位论文第五苹侵染甜菜坏死货脉祸毒的野生甜菜的转录纟■和小分了测序及分析一—：“；：—‘口。一—■■二一》■■—图大果甜菜叶片两组样品间的差异表达基因聚类分析差异农达基因；侵染大果甜策的基闲农达变化,红色农小调农达基闪数,绿色农不下调及达基因数根据的代谢途径注释结果发现,侵染大果甜菜后引起差兄表达的基因主要富集于信兮途径和氨基糖与核苷酸糖代谢途径表,可能参与了病毒对寄主的致病机制。表差异基因的代谢通路富集方法验证测序为了验证转采组数据的准确性,共选取了对设汁引物(附采,其中有对引物无法扩出预期条带或扩增出非单一条带,对引物所检测到的表达变化趋势与测序结果相反,其佘的的实验结果与转采组测序结果一致,且两组数据早线性相关阁。 中国农业大学博士学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录组和小分子测序及分析表差异基因的功能富集 中国农业人学博学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录纟和小分了测序及分析丨丨■〒■■丨丨丨丨丨塵—￡命二畚,上▲二！图验证转录组数据蓝色农小转姐文验结架,红代验结染；转：飢数抛勾验证结来数姻的线性相关阁 中国农业大学博士学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录组和小分子测序及分析受侵染的大果甜菜的高通量测序分析大果甜菜高通量測序如第四章所述,的不同组分在本生烟和大果甜菜两种不同的系统寄主上的侵染性存在差异。本实验室的王颖博士也已证实的小组分在侵染本生烟时也面临了不同的沉默压力(王颖,。为了进一步探究不同组分在大果甜菜中的侵染性与寄主植物沉默机制的关系,同时考虑到在甜菜上是一个典型的根部传播病毒,本研究分别提取了侵染后的大果甜菜叶部和根部组织的总,对其中的进行了高通量测序分析。样品之间不同的群体构成样品由杭州沃森生物技术有限公司根据方法进行克隆,最后建立健康叶片侵染叶片(健康根部组织(和侵染根部组织四个文库进行大规模测序,读长每个样品以上。在获得各文库的序列后,选取长度的进行后续分析。通过与病毒基因组的高通量比对,发现病毒来源的,与病毒基因组序列会出现一定程度的错配(表。虽然完全匹配的数量占绝对优势(以上,但错配数量在个核苷酸的也占有一定比例(特别是具有一个核昔酸错配的数量在发生错配的中占大多数。考虑到在寄主上的病毒是以一个群体的形式存在,即有由一个优势基因型和一系列占很小比例的相关变异体组成,因此选取错配碱基数目在个以内的作为研究对象可以更为真实地反应生物体内的存在情况(,。表大果甜菜叶片组织和根部组织文库中来源的突变统计从的数量上看,大果甜菜上的结果与本生烟类似,无论是叶片组织还是根部组织,以上的为非病毒来源的病毒来源的仅占很小的一部分表图。从的种类上看,病毒接种样品中的种类和健康样品无显著变化,说明侵染对寄主植物的群体变化影响不大,也可能是受到高通量测序方法的局限,使一些低丰度的被大量高丰度所掩盖未被检测到(表图。由于是多分体的正义病毒,又将与各条基因组分别进行比对分析,其中来源于基因组同源区的每比对上一次就计数一次。结果显示,叶部和根部的情 中闺农业人学博学位论文笫五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录纟和小分测序及分析况类似,均是和来源的数景都占主导,其次是和来源的的数耀：最少(表。而此前的本生烟测序发现,来源的数景最多,占了总暈的一半以上,山此推测,在同的奇主中面临养同的沉默力,这可能与其在本生烟中丹有重要的致病作用相关联。此外,各同源区来源的主要集中于三者共有的区段。在大果甜菜上,种类的分布与其数景的分表数量组成分析丨丨丨丨表非冗余的组成分析：■■■■■■■■■■■■■■■■■■扣——■,丨丨一°°°图数量和种类组成分析数纽成分祈：种炎成分祈 中国农业大学博士学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录组和小分子测序及分析布趋势几乎一致(表。整体看来,各条基因组产生的正义链数量接近,正义链的数量略高于负义链的数量。表叶片组织和根部组织文库中各病毒基因组产生的的总数分析表叶片组织和根部组织文库中各病毒基因组产生的的组成分析,, 中农业大学博上学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的财生甜菜的转录纽和小分测序及分析的长度分析选取长度的进行长度分析表明,健康样品中主要以为主,丨和次之(图。在病毒接种的样品中,长度分布的粮体趋势没有改变,但长度的数景有明显的上调,同时,其巾非病毒来源的长度分布与健庞样品中总的分布完全一致(图,说明病毒侵染在一走程度上影响了的长度分布,但山于非病毒来源的的数景要远远高于因此掩盖了部分长度分布的变化,为此将病毒来源的分岛开进行单独分析。分别将不同病毒基因组来源的进行长度分析表明,与植物来源的叫司,长度以和为主,同的基因组上的长度分布略有差异(图和图。在叶片组织中,、和的分布类别一致,所占比高于,其中在上这种优势相对更加明显。而和的分布类丨一致,所占比例略低于。在根部组织中,、和的分布类型也与叶片组织类似,但禾的分布类削发生变化,所占比例高于。相同基因组分在同寄主不同组织中的长度分布存在差兄,说明大果甜菜的同源物的切割方式可能存在组织特应性,并且与本生烟中的结果类似,大果甜菜的同源物对不同的基因组分的切割也可能具有偏好性,同的偏好切割同的组分,从而产生长度冋的分布。——■■■■。匪：图长度分布 中国农业火学博：丨：学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录纟和小分了测序及分析——■！■。」■——■■■图非病毒来源的长度分布■——■■卜图丨叶片组织文库中基因组来源的的长度分布 中农业人学博上学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录纽和小分了测序及分析謹■■■■—■。…■图根片组织文库中基因组来源的的长度分布正负义链的极性分布和‘端核苷酸偏好性对病毒侵染样品中同基因组来源的的正负链所占比例进行了统计分析,山数据比例图可知,在叶片组织中,、、和的都以正义链为主,其数景所占比例主要在这一范内波动(图。而在根部组织中,五条基因组上也未出现显著的极性分布,但与叶部组织的结果同,中负义链所占的比例要高于正义—■■■■…孺■————■—■■令々旁、图叶部组织文库中各基因组来源的正负义链比例 中国农业火学博士学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录组和小分了测序及分析、、‘‘■謹旁旁令旁、七、图根部组织文库中各基因组来源的正负义链比例链(图。比较同源区的结果发现,无论在叶部还是在根部组织中除以外,其他同源区的也均以正义链为主,山此推知,在大果甜菜中负义链的产生可能存在段特兄性分布特征,其中以的同源区为产生的主要区段,而来源的在根部组织中正负义链极性分布的变化很可能受该区段产生数景的影响。图叶片组织中的端核苷酸偏好性 中农业人学博：：丨：学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录纟和小分测序及分析—■一■■…—图】根部组织中的端核苦酸偏好性同类的仅长度区别,末端的第一个核苦酸更加重要,在模式植物拟南芥中末端核苷酸对其进入同的蛋复合体起到决定性的作用(。为此进一步将所有的进行端核苷酸偏好性分析(图和图,叶部组织与报部组织的的端核苷酸的偏好性类似,均以起始的为主,其次是,和的比例相、。但是同的病毒基因组分中的端核苷酸的偏好性存在一定差兄,其中、、禾中‘端为的占以内,但在中其比例上至以上,在根部组织更为明显,其比例高达,这一结果与的长度的在病毒基因组上分布结果类似,山此可推测,基因组山同源物偏好性切割产生的病毒廷致下游产生的偏好性结合蛋从而参与和其他病毒基因组同的沉默通路。在病毒基因组上的分布根据所有的对应病毒基因组的位置,以基因组长度为横处标,的数景为纵处标绘制的病毒基因组分布图(图。通过比较发现,在大果甜菜的叶片组织或根部组织,在不同病毒基因组分上的分布愔况大体趋于一致。来源的在病毒基因组上的分布主要集中于病毒基因组近端,正义链和负义链的分布比例相类似。病毒基因组的端是病毒复制酶基因转采起始的区域,可能是基因组以负义链为模板开始复制时形成的双链诱辱启动了奇主植物沉默机制,使得该区域成为降解热点区。在和基因组上分布比较均衡,其中在近端的热点区在其他组分上也存在,说明这是山于来源于同源区的重复汁算而形成的。基因組分布的热点主要分布除了近端和近端外,还括附近区域和附近区域,其中前两个域存在于甜菜寄主上重要的致祸因了蛋丨编妈区内。在因组 中国农业大学博士学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录组和小分子测序及分析上呈现明显的负义链极性偏好和降解热点,其中在端的负义链处产生的的丰度占主导地位,推测该热点可能与负义链为模板开始复制时受到寄主识别切割有关,由于负义链的高效切割,导致无法保证正义链复制模板的数量的供给,这可能也是造成组分在大果甜菜上的复制积累量低于其他组分的原因之一。小结与讨论本章主要是利用高通量测序技术对侵染大果甜菜的转录组变化和产生的进行了详细的分析,通过与前一章本生烟转录组测序的结果的比较,从水平的变化和多分体病毒侵染植物诱导产生的表达特征来分析病毒参与寄主的沉默通路和病毒侵染可能的分子机制,为更好理解和大果甜菜的致病机理,及筛选甜菜上和抗性相关的基因奠定了基础。侵染对大果甜菜基因表达的影响高通量测序技术对于非模式植物基因的挖掘开创了一条新的方法和思路。目前,各数据库中公布的关于大果甜菜基因序列方面的数据很少,有关分析不同大果甜菜病害的发病机理等方面的研究更少,功能基因组学方法有助于我们更好地理解病毒与寄主间复杂的互作关系。本研究选择了测序技术对健康和侵染后的大果甜菜叶片组织进行深度转录组测序和从头拼接分析,这些数据将为大果甜菜致病相关基因、寄主与病原互作基因,寄主受到侵染影响及防御反应等方面的研究提供大规模的数据信息。此外,四千多个标记的开发为不同来源的甜菜种资材料间遗传差异分析,相关基因表达和基因功能的关联分析、以及分子遗传图谱加密等研究提供了可能。上一章对侵染的本生烟转录组数据的分析表明,的侵染主要影响了代谢通路、次生生物合成代谢、植物病原物互作、氨基糖和核苷酸代谢、光合作用天线蛋白和半乳糖代谢六大途径,而在大果甜菜上,只影响了某些信号传导途径及氨基酸和核苷酸代谢途径。由于病毒需要从寄主细胞中摄取复制所需的原料和的能量,因此都两种寄主的基础代谢均有影响,但在致病机理以及症状的产生上可能通过不同的途径。在大果甜菜差异表达基因的分析中,我们同样发现一些列的抗病及逆境相关基因,比如丨、和转录因子,但却没有蹄选到细胞壁合成相关基因或代谢途径相关基因,由此可以推测,虽然侵染后本生烟和大果甜菜都表现出了植株矮化和叶片下卷的症状,但相关的基因可能不同,这与不同基因组组合在不同寄主中的致病性差异也有一定关联。由于目前大果甜菜或同一种属植物的基因序列信息相当匮乏,同时也无法排除短片段拼接后基因注释对基因功能和代谢通路分析的影响。 中农业大学博丄学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录组和小分了测序及分析‘香丨。丨丨‘丨卜丨丨：“‘」”§—丨‘“丨§丨“‘‘“‘“‘‘■‘‘‘“‘““‘““‘“；■■‘；丨卜。？？■■■■‘‘‘‘丨 中国农业大学博」：学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录纟和小分了测序及分析？【咖‘翻“？■吻晰咖站。丨—二一厂丨」图大果甜菜中在各基因组上的分布不同基因组产生的表达特征本草通过高通景测序分析,明确来源的的长度分布、端碱基偏好性、在正负链上的分布、在各个基因组上的位置分布及基因组上产生的热点区域。侵染的样品中叶片组织和根部组织测得比对到病毒基因组上的比例分别为和表与本生烟中左右的病毒来源比例相似,可能与植物中病毒的滴度有关,因为所取的本生烟和大果甜菜样品均己经产生明显的病毒病害症状,此时病毒的增值到达了一个相对稳记的时期,各寄主间病毒的量变化的差兄不大。单链病毒复制过程中双链中如体和病毒基因组内部折叠形成的次级结构是产生的来源(,来源的正负义链比例接近,怠味若大部分的 中国农业大学博士学位论文第五章侵染甜菜坏死黄脉病毒的野生甜菜的转录组和小分子测序及分析都是由切割所产生的,这一结果与本生烟类似,说明在两种寄主上产生的方式是一样的。由于是多分体的正义病毒,又将与各条基因组分进行比对分析,叶部和根部的情况类似,均是和来源的数量都占主要部分,其次是和,来源的的数量最少。而此前的本生烟测序发现,来源的数量最多,占了总量旳一般以上(王颖,由此推测,在不同的寄主中面临着不同的沉默压力,这可能与其在本生烟中具有重要的致病作用密切相关。但是这种推测没有实验数据的支持,诱导产生的是否与本生烟的症状产生相关以及如何起作用等一系列问题还需要深入研究。病毒来源的的产生存在热点区域,这种现象已经在许多病毒中报道,基因组的某些特殊结构会影响与底物的亲和性从而影响的产生(紅,己有实验表明卫星产生的发卡状结构可以被更高效地识别(。本研究中,不同组分均有各自的热点区,其中在近‘端的热点区在各个组分上有存在,可能是来源于同源区的重复计算而形成的。大果甜菜上来源于的的数量虽然多本生烟,但在两个寄主上的热点降解区类似,即在端的负义链处产生的的丰度占主导地位,该热点可能与负义链为模板开始复制时受到寄主识别切割有关,由于负义链的高效切割,导致无法保证正义链复制模板的数量的供给,最终使组分在大果甜菜上的复制积累量低于其他组分。由此推测,在本生烟上不稳定的根本原因是复制效率低,而与寄主植物的沉默机制关系不大。在大果甜菜中,虽然也被寄主植物高效降解,但由于复制相率相对较高,使的最终有足够的复制积累,成功实现系统侵染。至于是本生烟中的哪一个寄主因子影响了的复制,还需要更多的实验来验证。产生的的‘端第一个碱基具有和的偏好性,这与产生的具有类似的特点(,与植物中产生的具有和的碱基偏好性一致这些的首位碱基偏好性不同的原因尚不清楚,推测可能与蛋白的祀标识别有关。叶片组织和根部组织产生的的表达特征有一定的差别,说明大果甜菜在叶部和根部的沉默通路存在组织特异性。 屮国农业大学博士学位论文第六章侵染甜菜坏死黄脉病毒的木生烟的差昇蛋质组学初步研究第六章受甜菜坏死黄脉病毒侵染的本生烟差异蛋白质组学初步研究病毒侵染植物后会与寄主植物发生复杂的相互作用,尽管病毒的基因组很小,但其利用寄主蛋进行复制、增殖和运动,导致其基因和蛋白表达谱发生显著的变化(。从侵染本生烟的转录组数据分析结果发现,在病毒侵染后期,即可观察到明显的系统症状时,有大量的基因表达被上调或下调,这些基因涉及植物生长发育的各个过程,包括激素调节、细胞周期调控、细胞骨架、信号传导和防御反应等。这些基因表达调控可能直接参与病毒对寄主代谢的抑制和寄主对病毒侵染的防御。然而多数情况下水〒与翻译的蛋白质之间并存在较好的相关性,从水平进行研究,只包括了转录水平的调控,不但在丰度上不能反应蛋白质的表达水平,而且蛋白质复杂的翻译后修饰、亚细胞定位和迁移、蛋白质和蛋白质的相互作用等,也几乎无法从水平来判断(蛋白质是生理功能的执行者,是生命现象的直接体现者,对蛋白质的研究将直接阐明生命体在生理和病理条件下的变化机制。因此,除了寄主的转录子变化谱外,还需要在蛋白质水平上进行整体的研究。为了进一步研究的侵染对本生烟寄主的影响和两者间的相互作用机制,本实验优化了本生烟叶片双向电泳体系,并对侵染本生烟后的蛋白整体表达情况进行了初步的比较研究,以便更加深入了解该病毒的致病机制。不同组分侵染本生烟后叶片蛋白质双向电泳图谱分析本生烟叶片蛋白双向电泳条件的优化选择合理有效的高质量蛋白质样品制备方法,获得淸晰分辨率高的双向电泳图谱是开展蛋白质组学研究的重要前提。本实验采用的是三氯乙酸(丙酮沉淀法提取本生烟叶片的总蛋内,在除去植物样品中的盐、多糖、植物紛以及其他对电泳产生影响的杂质的同时,尽可能获得更多的总蛋白。溶解蛋白时,选取了含有尿素、硫脲和兼性离子去污剂的裂解液,并在使用前加入蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶的活性,以及还原剂用以断裂氨基酸间的二硫键,从而保证蛋内质在高效溶解的前提下避免被降解。此外,在蛋白溶解过程中增加低温条件下超声波辅助破碎步骤,两次以上的超声波破损可明显提高叶片总蛋的提取得率。目前,商业化的胶条■提供多种长度和梯度的规格以供选择,合适的预制胶条范围的选择对蛋内样品的分离起着重要的作用,本实验首先对预制胶条的选用进行了优化。其屮公司的提供的胶条长度为、、、和一般来说,胶条越长,上样量就越大。短胶条便于操作,适用于方法的优化；长胶条则能提供更多的上样量,有利于低丰度蛋白的检测。为了得到更全更完整的蛋白组信息,本实验选择长度为的胶条。随后分别以和的上样量选用两种范围的胶条,即胶条(和胶条(,进行双向电泳实验。 中同农业人学博士学位论文第六章侵染甜菜坏死黄脉沾毒的本生烟的差晃饭质组学初步研究——‘：：；■■■■’、；；“■■“、‘■“丄‘’：‘：‘：丄图本生烟叶片蛋白双向电泳图谱,上样量上样量丨图中可以看出,在釆用胶条双向电泳图谱上的蛋丨点大多集中在偏酸性端,分岛碱性端只有少部分蛋点分布,偏酸性范制内的蛋点经常会聚集在很相近的区域,点与点之互相融合,图谱横条纹明显,酸性部分背景相对模糊(图。与此同时,本生烟叶片蛋样品在丨胶条范内几乎无横条纹和拖尾现象,蛋点呆圆形,分岛均匀,点与点之间相互融合的程度减小,高丰度蛋的干扰明显降低,其分效果优于范丨制。因此,后续的双向电泳实验中,均采用了预制胶条,样品上样景为。如果需要对表达丰度较低的蛋点进行酶解鉴定,我们会沾将上样增加到,使得蛋点更容沾识别。本生烟叶片蛋白双向电泳分析分别将含有和的中国分物和在番杏叶片上扩紧,然；提取发病叶片的总再加入与总等体积的缓冲液,分别机械接种生长状况相’的叶期的本生烟苗(图,同时一部分本生烟以接种缓冲液作为对照纽。后,本生烟出现明显的系统症状(图此时釆发病叶片的本生烟上位叶,提取叶片总蛋进行双向电泳分析。每组实验进彳个技术重复,为了获得稳定且可信的差兄表达蛋丨结果,对本生烟叶片进行了三批生物学重复实验。利用双向凝胶电泳技术分别对健康对照组,侵染的样品和迹行叶片蛋姐分析,获得了背景清晰、重复性好的原始凝胶图谱,如图所。利用软件进行图像分析,以策次结为例,三组样品分别检测到,和个清晰可见的蛋丨质点。里然每次结果所检测到蛋丨质点的只体数略有变化,但每次所获得的蛋点数均在之间,且总体趋势相似,即对本生烟的侵染会激发植物某些蛋〖‘彳的特兄性表达,始终致其表达蛋卩总数的柄加。 中国农业人学博丨学位论文第六章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的差晃进白质纽学初步研究图侵染本生烟的症状；本生烟四周苗龄接种；本生烟接种后天的症状‘；——：“、,二」广—；■‘‘、、‘》■■“‘‘“；■‘啤图不同分离物和侵染后本生烟叶片蛋白表达图谱(,上样量丨 中闺农业人学博士学位论文第六侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的差拜饭质纟■学初步研究不同组分侵染本生烟后叶片蛋白质组的差异分析、差异表达蛋白点的筛选将健康的本生烟叶片与被和侵染的本生烟叶片蛋丨质双向电泳凝胶图谱拟合进行斑点匹配,即可得到具有差兄表达的高级凝胶图谱,且选取值小于等于为差兄显著,共获得差兄性表达蛋质点个,其中个点在三个样品中均有表达,样品特兄性表达蛋点】个,样特兄性表达蛋内点个包括在三个样品中均表达的个蛋内质点和在中差兄表达的个蛋内点,见图。在这些共有表达的差兄蛋点中,表现上调的蛋有个,表现下调的蛋内点个；表现上调的蛋内点有个,表现下调的蛋点有个；表现上调的蛋点有表现下调的蛋白点有个(图。综合肉眼观测结果,在分析出的差异蛋质点中,挑选了个在多次生物学重复中均表达稳定、差兄明显的蛋质点(蛋内质点编￥分别为】、、、、、、、、、、、和这些蛋质点在双向电泳凝胶中的其体位置见图。其中和是侵染后本生烟特兄性表达的蛋点,两者在侵染后开始有微量表达,侵染后则表达量有了较大的上调；三个样品中均能检测到的蛋点除了、和的表达量在侵染能后有下调之外,其余的蛋点表达量其有同程度的上调(表。结果表明病毒侵染后,总体的趋势是激活或上调了植物一些特殊蛋的表达。■■■■图差异表达的蛋白质点整体分析 中国农业大学博上学位论文第六章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的差晃进质纽学初步研究：：；：等‘‘乂：‘气‘：,泰‘畢图侵染本生烟后差异蛋白质点在表达谱中的定位信息表和侵染后本生烟叶片蛋白质点的差异表达分析组白质点的表达质点编统汁数挪的评价标准与化小广』■时,农小数掘的芳祥显否：农蛋丨质点丨该样品屮未检测到。 中国农业大学博士学位论文第六章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的差异蛋白质组学初步研究蛋白质点的质谱接定将选取的蛋白质差异点经胰蛋白酶酶切,进行质谱分析,得到肽质量指纹图谱,将结果通过网站进行搜索比对,根据各自的可信度阈值选择出比较准确的注释结果,成功鉴定出个蛋白质点,按照其功能分为个类群(表病程相关蛋白,这一类群是得到鉴定的蛋白质点数目最多的一组,共有个,包括编号为为病程相关蛋白、编号为内切,葡糖昔酶,酸性异构体病程相关蛋白、编号为的酸性,葡聚糖酶(病程相关蛋白以及编号为的病程相关蛋白。其中病程相关蛋白和只有在侵染后才能特异性表达,而病程相关蛋白和在健康烟草叶片中叶亦有少量表达,在病毒不同分离物的侵染后均能够被诱导上调,且侵染后这些病程相关蛋白诱导上调的表达量要远远高于表,。植物膜联蛋白(该类群的蛋白质点共鉴定到个,分别是编号为的液泡相关膜联蛋白和编号为的膜联蛋白(表。这是一类及磷脂结合型蛋白,广泛存在于真核生物(酵母除外)中,并形成了在进化上保守的多基因家族。植物膜联蛋白可能参与植物细胞的分泌作用、胞吐作用、液化过程及低温信号传导过程。等在烟草细胞中发现的一个与液泡有关的膜联蛋白能促进细胞的扩展,本实验中当侵染本生烟后会导致该蛋白表达的显著上调,推测可能与引起的上位叶卷曲的症状相关。参与光合作用蛋白鉴定到该组的蛋白质点共有个,与核酮糖二憐酸核酮糖梭化酶加氧酶(大亚基肽段相对应。其中分子量较小的肽段(编号为在侵染后的本生烟中的表达量与健康叶片无显著差异,但在侵染了后其表达量有所降低而分子量较大的肽段(编号却在侵染后的烟草叶片中表达量有所增加(表。推测在一定条件下大亚基发生了体内片段化作用,不同的降解片段表达情况有所不同。氧化还原麟鉴定到该组的蛋白质点共两个,分别是编号为号的叶绿体半胱氨酸过氧化物酶和编号为号的硫氧还蛋白过氧化物酶。两者均侵染后表达量有微量上调,而在侵染后则表达量大幅度上调(表。推测这两个基因涉及活性氧分子(相关的植物代谢过程,而含有不同组分的分离物对的诱导作用可能存在差异。其他功能蛋白除前述几类蛋白外,本研究还鉴定得到两个抗逆相关的酶类,叶绿体干旱应急蛋白编 中国农业大学博士学位论文第六章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的差异蛋白质组学初步研究号为和苹果酸脱氧酶(编号为,以及一个核糖体蛋白叶绿体核糖体蛋白编号为。双向电泳图谱显示,在侵染后这两个与逆境胁迫相关的基因发生了不同的表达调节,其中叶绿体干旱应急蛋白下调表达,苹果酸脱氢酶则上调表达(表。叶绿体核糖体蛋白的下调表达则暗示了病毒侵染对寄主基因表达调控的另一种方式,即可能通过调节对核糖体蛋白的表达对其的翻译产生选择性作用。表差异表达蛋白尿点的康谱獲定结果蛋白质点蛋白质分子量覆盖度等电点蛋白质得分蛋白质注释及物种编号叶绿体半胱氨酸过氧化物酶硫氧还蛋白过氧化物酶病程相关蛋白叶绿体干旱应急蛋白内切葡糖苷酶,酸性异构体病程相关蛋白液泡相关膜联蛋白苹果酸脱氧酶二憐酸核兩糖活化酶叶绿体核糖体蛋白二酸核酮糖幾化酶膜联蛋白酸性葡聚糖酶病程相关蛋白病程相关蛋白 中国农业大学博士学位论文第六章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的差异蛋白质组学初步研究小结与讨论随着蛋白质分离和鉴定技术的发展,蛋白质组学已成为植物病理学研究的重要手段,也是通过分析植物病毒侵染后蛋白质组学的变化揭示病害发生机制的重要方法(。本章在已有的研究基础上,采用改良的体系对本生烟在不同组分侵染后期的蛋白表达信息进行了初步研究,并对蛋白上样量、染色方法等进行优化。结果表明,与健康本生烟叶片相比,的侵染对其蛋白表达谱影响不大,但侵染后的本生烟叶片组织的在蛋白表达水平有了较大的变化。用相关图像分析软件对双向电泳图谱进行分析后,经质谱鉴定获得了个目标蛋白的注释信息,其中上调表达蛋白点个,下调表达蛋白点个,特异性表达蛋白点个。某些基因会被诱导表达而产生相应的蛋白质,参与到植物的防御反应,诱导植物系统抗性从而组织病毒的侵染；而某些相关基因的表达则会被抑制或推迟,以便通过某种互作方式最终完成病毒与寄主植物的共生。通过分析这些蛋白在侵染后在本生烟中的可能作用,推测的侵染对寄主植物的影响主要体现在抗病反应的病程相关蛋白、细胞骨架变化、光合作用和细胞氧化还原反应等方面。下面分别来对这些内容进行讨论。蛋白质双向电泳的条件优化双向凝胶电泳技术是蛋白质组学研究的三大关键技术之一自提出该技术方案以来,对该方法不断进行补充和完善,使得蛋白质双向电泳分辨率和稳定性有了极大的提高(,。但这一体系一般适用于微生物和动物,植物组织中由于含有较多糖类、色素、酸类等干扰,因此在此方法的基础上进行了实验条件的优化以获得较为满意的双向电泳结果。高质量的图谱是蛋白质进行质谱分析的前提,而样品质量的好坏直接决定了图谱的分辨率和重复性,因此蛋白样品制备是双向电泳成功与否的关键。目前提取植物总蛋白常用的方法有酷提取法和丙酮沉淀法。酷提取法能够有效地除去多粉、多糖和盐离子等对电泳有较大影响的物质,得到的蛋白质纯度高、易溶解且胶背景干净,但由于其操作步骤繁琐,蛋白质提取的得率较低；两酮沉淀法步骤较少,对去除去脂类杂质效果良好,操作简单,但得到的蛋白质较难溶解,对多糖和多粉的除去效果有限。相对于其他的木本植物,本生烟叶片含有多勘、多糖类物质较少,因此我们选取得率相对较高的丙酮沉淀法(。为了提高蛋白的溶解效率,在总蛋白溶解的过程中增加了低温条件下超声波助溶的步骤,在一定范围内增加超生频率和次数可以明显提高蛋白质的溶解率,但每次超声时间不宜过长,否则可能会使蛋白质提取液的温度逐渐升高而导致蛋白质变性或降解。此次增加超声步骤的丙酮沉淀法提取的蛋白质包含了本生烟叶片组织中大部分可溶性蛋白,几乎无明显的横条纹和拖尾现象,蛋白质点呈分离均勾的圆形点,且重复性高,说明改良的方法适用于本生烟叶片组织的总蛋白提取。两性电解质载体是等电聚焦的关键试剂,实验结果发现本生烟叶片组织的蛋白主要分布在的范围,因此后续实验中选用了线性预制胶条。一般来说,胶条越长,上样量就越大,提高蛋白质上样量有利于低丰度蛋白的检测,甚至导致某些特别低的丰度表达蛋白无法在凝胶上显示；但上样量大的样品中含有的盐离子浓度也越高,将直接影响到等电聚 中国农业大学博士学位论文第六章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的差异蛋白质组学初步研究焦电压的上升,从而影响等电聚焦效果,容易产生横纹。本实验选用、和三个上样量梯度,发现时检测到的蛋白数量较多,蛋白质点聚焦效果好,呈有规则的椭圆型。为了增强染色后蛋白点的清晰度和对比度,对传统的考马斯亮蓝染色方法进行了改进。结果表明,当染色液的配方为加入冰乙酸和乙醇时,染色效果更佳,凝胶块背景浅且蛋白质点之间的边界清晰。尽管针对蛋白质提取方法、选择合适范围的胶条和改进凝胶的染色方法三个方面对双向电泳实验进行了一系列优化,但基于双向电泳的局限性,即低丰度蛋白、碱性蛋白以及非极性的膜蛋白都不能在常规的双向电泳凝胶上分离出来,本实验分离出来的只是本生烟叶片组织总蛋白中的一部分可溶性蛋白组,这些数目与真核生物的蛋白质实际数目相距甚远,若要获得本生烟更全面更详尽的蛋白组信息,还需要在特殊蛋白质的提取得率、分辨率、检出灵敏度等方面进一步提高和完善。侵染后本生烟叶片组织蛋白质组差异的结果分析的侵染对病程相关蛋白表达的影晌病程相关蛋白是植物受到病原物侵染后诱导产生的所有蛋白质及其同源物的总称,在响应外界压力及适应不良环境等方面发挥着重要的作用(,。作为下游基因,其表达受到上游基因的调控。年,等人通过对烟草花叶病毒产生过敏性反应的烟草品种的研究,首次发现了四种病程相关蛋白,根据其在中的迁移率,将分为两类：和。随着科学技术的发展和深入,研究者又从植物中陆续发现的新的蛋白,目前根据氨基酸序列的相似度、酶分子活性及血清学关系可将蛋白划分成为个家族,纟,。已有的相关文献报道,植物在被病毒侵染之后,为了抵御其侵染,许多参与抗病反应的蛋白和超敏反应(相关蛋白会被诱导上调(,。本实验结果中,在侵染后的本生烟叶片组织中、和的表达量都被显著上调,且侵染后表达的水平均要远远高于侵染诱导的表达水平,其中这种差异在侵染后蛋白的表达中表现的最为明显,推测可能对蛋白的诱导表达存在一定程度的特异性相关。大量的数据表明,蛋白质在植物抗病反应中发挥着重要作用,其中一些蛋白质的生理生化功能已经被鉴定。家族成员具有,葡聚糖酶的活性,可以分解真菌细胞壁从而抵御病原物的入侵(,。家族成员编码壳多糖酶,可作用于几丁质,从而分解真菌细胞壁,其大量表达可以一定程度上抵御病原物的侵染和胞质聚集,也可以通过破环植物细胞壁结构杀死被病毒侵染的细胞从而限制病毒的运动和系统侵染。家族蛋白同样具有壳多糖酶活性,除具有降解几丁质的作用还具有几丁质结合蛋白的功能(,。蛋白虽然序列各异,结构多样,但有一些共同的特点,例如启动子中含有一些共同的保守序列。大多数蛋白基因含有的保守序列：称为是一种乙稀应答原件,它的存在可使乙烯成为这些蛋白的强有力诱导者(,。酸性蛋白的基因在启动子的上游存在转录因子结合位点,在及水杨酸诱导下从启动子的远端脱离下来,组成了正调控因子的结合,从而使基因得到表达( 中国农业大学博士学位论文第六章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的差异蛋白质组学初步研究。根据转录组的数据显示,许多植物激素表达和传导信号相关的基因在侵染后转录水平发生了显著的变化。由此可推测,本生烟受到侵染后,在侵染点迅速产生大量的活性氧,进而引发过敏性反应。伴随过敏性反应,植物细胞的内源激素如水杨酸、茉莉酸和乙稀浓度大量积累,这些内源激素作为二级信号激活植物的防卫反应,从而诱导一系列蛋白的大量表达,而各种蛋白的大量表达则通过杀死被病毒侵染的细胞限制病毒的运动和扩散来发挥效用,从而有效地抵御病毒侵染。至于这些诱导上调表达的蛋白各自在侵染中起到的具体功能或相互作用,还需要利用病毒载体瞬时表达蛋白或转基因植物等方法进行进一步的研究。的侵染对膜联蛋白表达的影晌当分离物侵染本生烟后,与健康植株相比,除了植株有明显的矮化外,还有一个典型的症状,即上位叶向下卷曲。在比较不同组分侵染本生烟叶片双向电泳图谱蛋白质差异时,发现了一个液泡相关膜联蛋白蛋白质点编号和一个膜联蛋白(蛋白质点编号在侵染后被显著上调,推测这两个基因的表达变化可能与卷叶症状的形成相关。膜联蛋白家族又称依赖性磷脂结合型蛋白,是进化上相对保守的多基因家族,具有段螺旋组成的结构域,广泛存在于除酵母之外的真核生物中(,。自年等人(,首次从番痴悬浮细胞系中纯化出植物膜联蛋白,人们开始关注这类蛋白家族在植物中的功能。与动物膜联蛋白类似,植物膜联蛋白也可能参与细胞的分泌作用、胞吐作用、液泡化过程及低温信号转导过程等多种重要生化过程。等在烟草细胞中发现液泡相关膜联蛋白,它可能促进细胞的扩展,其他植物细胞的膜联蛋白也有相似功能(,。由此可推测,侵染本生烟后,诱导膜联蛋白的过量表达,从而使叶片上表皮细胞扩展,最终导致严重的卷叶症状,但病毒如何上调表达该蛋白以及通过何种方式与编码该蛋白的基因相互作用还需要通过各种实验进行作用机理的研究。质谱结果显示,另一个上调表达的膜联蛋白的氨基酸序列与膜联蛋白的氨基酸序列具有一定同源性,但尚不能判断其是否也定位于植物液泡,推测其可能通过其他途径起到协助膜联蛋白改变细胞骨架的作用,但也无法排除具有其他的功能。的侵染对光合作用的影响植物病毒侵染寄主后,在细胞内利用寄主体内的物质和能量进行复制和增殖的同时也影响寄主正常的生理代谢,通常在植物病毒引起的褪绿、花叶和斑驳症状中,寄主细胞叶绿体结构和功能遭到破坏,严重影响光合作用效率。等人(研究发现,是一种既可以催化羧化反应,又可以催化加氧反应的双功能醇,是植物调节光合过程中的同化光呼吸,决定净光合作用的一个限速酶,其大小亚基的异常可影响光合作用和能量代谢。在侵染后的蛋白质谱分析中,一个分子量较小的大亚基肽段表达量有所降低,而分子量较大的肽段的表达量有所增加,说明的侵染的确对寄主的光合作用产生了显著的影响。伴随着光合作用过程不可避免地会产生,控制植物代谢过程中的多条 中国农业大学博士学位论文第六章侵染甜菜坏死黄脉病毒的本生烟的差异蛋白质组学初步研究途径,同时对一些重要的光合作用结构产生直接的破坏(丨。本研究中发现两个氧化还原酶在侵染后的本生烟叶片中表达量均有大幅度提高,其中一个酶蛋白质点编号定位于叶绿体上这一现象反映了本生烟在侵染后细胞内的氧化还原平衡状态的改变。这些氧化还原的平衡是否直接参与改变光合作用,它们之间的协调关系如何,是后续研究需要回答的一系列问题。 中国农业大学博士学位论文第七章结论与展望第七章结论与展望结论在本生烟和大果甜菜寄主上的系统侵染效率存在显著差异,而由非翻译区序列决定的的复制能力是导致其在本生烟上系统上传不稳定的关键因素。基于新一代高通量测序技术结合生物信息学分析,对有和侵染本生烟后叶片组织的转录组与健康样品进行比较,鉴定出,个表达差异明显的基因,涉及基因沉默、泛素化、植物激素代谢等多个途径。结合体外激素喷施实验,推测侵染本生烟导致的矮化症状可能是体内赤霉素的积累受到抑制和细胞壁合成相关基因表达下调共同作用的结果。利用测序技术对大果甜菜的转录组进行了拼接,在遗传背景不清楚的情况下,共获得,条具有较高注释可信度的,并进行了简单的功能注释。通过对比健康样品和侵染样品的转录谱表达,发现病毒的侵染主要对植物的基础代谢有影响。此外,大果甜菜叶片组织和根部组织的高通量测序结果表明不同样品的表达特征具有差异,说明在不同的植物组织参与不同的沉默途径。利用双向电泳结合质谱技术,初步分析了本生烟在有无组分的和侵染后叶片组织的蛋白质组信息,共鉴定出个差异表达蛋白,功能分析表明这些蛋白主要是与植物抗病性、细胞骨架、应激反应、光合作用及氧化还原与代谢等功能相关。展望对的非翻译区做进一步的突变研究,最终获得该区域在本生烟上的关键的复制元件结构模型。同时设计相关实验蹄选本生烟和大果甜菜上与复制相关的寄主因子,更深入研究在不同寄主上存在系统侵染稳定性差异的生化和分子基础。利用转基因技术,通过过表达或者抑制表达候选基因来确定病害症状产生的相关因子,以此探究在本生烟和大果甜菜寄主上的致病机理,并为田间甜菜丛根病的抗病育种提供基因组学方面的信息。通过纯化互作蛋白复合体的方法,筛选蛋白与本生烟互作的蛋白,结合已鉴定出的差异表达蛋白,对致病机制进行更深入的研究。用亚细胞定位进一步确定在细胞核内的定位,并通过构建突变体的方法确定其定 中国农业大学博士学位论文第七章结论与展望位关键氨基酸区域,探索的细胞核定位的生物学意义和基因功能分类分析,以及造成本生烟严重型症状的分子机制。 中国农业大学博士学位论文参考文献参考文献,,,,,,,,””,,,,,”,,,,”,,”,,,,,,,,,,,,,,’,,,,””,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,’從,,”,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,”””,,”,,,,,,血,”,,,,,,,,,,,,,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献如,,,,,,”,”,”,””,,,,,”,,,,,,”,””,”,”,,”,,,”’””,飢,”,”,,”,”,,,,,,,””””””, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,”,,,,,,,’泛,,”,,,,,,”丄”,,,,,,,,,,,,,,”,,”,,,,”,”,,,,,,,,迪, 中国农业大学博士学位论文参考文献,”,,,,”””,,”,,,,,,,,,,,,,,’,,,,,”,,”,,””,,,”,”,,”,,,,,,,,,”, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,,,,”””,,,,”。,”,,,,”,,,,,,”,,,,,,,,,,,,”,,,”,”,”,,,,,”,,,,机””,”,,,,,■,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献”,,”””丄,,,”,”””,,,,,”,,,,,”,,,,,,”,,,,”,,,,,”,,,,,,”,”,,,”,,,,,,, 中国农业大学傅士学位论文参考文献,,’”,,,,”,,,,,,,,,,,,,”,,,”,”,”,,,,,,””,”,,,,,”,,”,,,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,,,”,,,,,”,,,,”,”,,,,,,,,,,,,,,,,,””,,,”,,,,,”,,,,”,,,,”,,”,,,,,,” 中国农业大学博士学位论文参考文献,,,,”,,”,,,”,”,,,,,”,,””,”,,,,,”,,”,,”,,,”,,’,,”,””,,”,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,,,,,,,,,,,,”,,’,,,,,,,,,”,,,皿,,,,,,,,”,,,,”,”,”,,,,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,”,,””,,,,”,,,,,,,”””,,,,,”,”,,”,,”,,”,,,,,”,,,,,,,,,”,,””,,,,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,”,””,,,,,,,”,,,,,”’,,,,,,”,”,,叫,,,,,,”,,”,,,,,,”,,,”,,,,,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,,,””,”,””,””,,,,,”,,,,,,,,,,”,,,”,,,”,,,”,,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,”,”,,,,,”,”,,,,,,,,,,,,,,,,,”,”,,,丄,,,,,,””,,, 中国农业大学博士学位论文参考文献”,,,,”,,,”,,,,,”,,”,,,,,,””,”切,,,,’,”,,,,””,,,”,,,,,,,,,””,””,”,”,,,,”””,,”,”,‘,,,韩成贵,李大伟,王东勇,杨莉莉,于嘉林,蔡祝南,刘仪甜菜坏死黄脉病毒的菌传功能分析科学通报, 中国农业大学博士学位论文参考文献韩成贵,李大伟,于嘉林,秦树才,杨莉莉,刘仪甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物自然缺失突变体缺失区域的定位分析病毒学报李大伟,于嘉林,韩成贵,刘涛,秦树才刘仪(中国甜菜坏死黄脉病毒的检测及其核苦酸序列分析生物工程学报,李平,尹伏蛋白质组学的应用研究进展生物技术通报,李毅,魏春红,潘乃遂,陈章良,田波真菌传杆状病毒组(内四种病毒的细胞病理学比较研究中国病毒学刘涛,韩成贵,李大伟,蔡祝南,于嘉林刘仪甜菜坏死黄脉病毒对病毒致病性的影响科学通报李旻甜菜坏死黄脉病毒的’端序列功能分析以及病毒载体的构建中国农业大学博士学位论文王颖甜菜坏死黄脉病毒的复制和自然缺失体的致病性研究中国农业大学博士学位论文张艳敬甜菜坏死病毒属两种病毒外壳蛋白的亚细胞定位及其与本生烟蛋白的互作研究中国农业大学博士学位论文 中国农业大学博士学位论文致谢致谢当在键盘上敲击下“致谢”二字的时候,突然意识到自己的研究生生涯即将画上一个句号。此时此刻,感慨万千,近六年时间的点点滴滴在眼前一一浮现。一路走来,有过成长的喜悦,也有过失败的迷茫,但更多的是无限的感恩和眷恋。得以完成博士学业,离不开太多人的帮助和支持,在临别之际,我要向他们致以最诚挚的谢意。首先衷心感谢我的导师韩成贵教授,感谢您一直以来对我课题给予的支持和理解,感谢您对我犯错时的宽容和帮助,感谢您在我遇到困难迷茫无措时的鼓励和引导。六年来,无论是生活上还是学习科研上您都给我悉心的关怀和指导,您乐观和包容的态度是我终身学习的榜样！同时由衷感谢李大伟教授,在我最困难无助的时候,是您给予了我最坚定的支持,是您的鼓励和肯定,使我得以顺利完成学业。您正直热情的处事风格和精益求精的治学态度,深深感染和激励着我。您的语谆教诲和身体力行都是我宝贵的精神财富,让我终身受益！同时也由衷感谢于嘉林教授,您扎实渊博的专业学识和乐观豁达的生活态度给了我很大的启发,并会在今后的生活和工作中时刻激励和鞭策自己！特别感谢王颖师姐对我实验上的指导和帮助,你的关心和鼓励,我都将铭记于心。真诚地感谢王献兵师兄和张永亮师兄对我实验思路上的积极建议和文章撰写中的帮助。衷心地感谢加州大学伯克利分校的教授对我文章的认真修改和英文润色,在和他的交流中,我学到了许多实验之外的知识,这些都使我终身受益。由衷地感谢六年间一起在实验室奋斗过的兄弟姐妹们！感谢孙海文师弟在高通量数据处理上给予的技术支持；感谢赵鸿雁师妹在蛋白质双向电泳实验技术上提供巨大的帮助；感谢已毕业的王倩师姐、徐进师姐和向海英师姐传授给我的实验技术,并在我遇到实验瓶颈和生活苦闷的时候给予的关心和慰藉；感谢郭碧红师姐在我人生低潮期给予温暖的话语、你精湛的厨艺和爽朗的笑声令我难忘；感谢王晓晖师姐、蒲恒师兄和张宗英师姐对我科研和生活的关心,以及找工作中给予的诸多建议；感谢武文綺师兄、张晓峰师兄、卓涛师姐、牛少芳师姐和石林丹师姐一直以来的关心和帮助,我会好好珍惜这份难得的友谊。张晓峰师兄对科研的执着和追求使我钦佩,武文琦师兄和卓涛师姐的乐观豁达的生活态度带来了欢乐和正能量,牛少芳师姐和石林丹师姐的善解人意则让我体会到生活的温暖；感谢同窗好友陶涛对我莫大的帮助和关心,涛哥,我会永远铭记这份情谊；非常感谢刘俊莹和姜宁在后期实验上给予的帮助,使我的实验进度加快不少；感谢曹修岭和胡悦多年来热心帮助和鼓励,和你们轻松的聊天排解了我许多郁闷的心情；感谢张坤和刘德水对我实验的帮助和建议,很享受一起讨论文献的碰撞的灵感火花；感谢李源源、卓娜、周翠姬、孙倩、闫幕和赵添宇和我分享实验中的点滴经验和发现生活中的美好与欢乐。特别感谢卓娜、周翠姬、严勝、闫嘉、郑結、高强、姜宁、刘俊堂、李正刚、张坤、许刘兆、王晓玲、崔灿、靳雪娇、张瑞奇、周星玻对我论文的认真修改,使我从中学到了很多东西。感谢的其他同学,他们是：李文兵、陈相儒、张晓艳、河山、董书维、赵晓菲、张玻、张晓鹏、张珍、杨萌、加娜古丽霍家别克、朱镜蓉；感谢已毕业的实验室战友,他们是李旻、刘贺、丽洁、郭晓芬、李萃、王诗博、贺天柱、王斌、李燕莉、张靖佶、高金龙、郝雨萌、宋俊杰、李嘉未、缪建锟、马金、陈小慧、吴占雨、王院民和丁氏六,六年学习生活的苦与乐, 中国农业大学博士学位论文有你们的帮助,有你们的倾听,有你们陪我一路走过,衷心地感谢你们,与你们共处的时光、轻松融洽的气氛是我人生中永恒的记忆。感谢张之同师傅、贺竹荣女士以及科研助理张亚楠、任君、王平、刘金韬和张馨为保障实验室和温室的正常运转所付出的辛勤劳动和努力。感谢中国农业大学蛋白质双向电泳平台的冯继东老师、张京强老师和蒋欣老师,以及中国农业大学激光共聚焦实验室梁丽萍老师在实验技术上的热心帮助并为实验提供便利条件。感谢我的室友和同学谭桂玉、包菲、赵正楠、周祥利和杨丹,大家的相互鼓励,共同见证了彼此的青春和成长,我会永远珍惜和怀念这份纯真的友谊。感谢我的父亲母亲,感谢您们这么多年来对我的培养和付出,感谢你们一直以来给予我无私的爱,谢谢你们可以让我了无牵挂地专注学业,你们的理解和支持是我最坚强的后盾！最后,再次感谢所有的老师同学以及我的家人和一直以来陪伴我的朋友们,你们的支持与友谊是我永远的财富！谢谢你们！范慧艳年月于北京 中国农业大学博士学位论文个人简介个人简介姓名：范慧艳性别：女籍贯：浙江省金华市出生年月：年月：学习经历：中国农业大学农学与生物技术学院植物保护专业获农学学士学位中国农业大学农学与生物技术学院植物病理专业硕博连读研究生研究生期间获奖情况：年度中国农业大学学习优秀奖学金年度中国农业大学科研成就奖学金年度中国农业大学科研优秀奖学金研究生期间发表的文章和申请的专利：,,,,,,,,,韩成贵,范慧艳,李大伟,于嘉林,王颖,张永亮,武文椅,王晓晖一种用病毒转化植物原生质体的方法国家发明专利(申请号：,沈, 中国农业大学博士学位论文个人简介,范慧艳,王颖,李大伟,于嘉林,韩成贵甜菜坏死黄脉病毒系统侵染本生烟不稳定的原因分析《中国植物病理学会年学术年会论文集》,中国农业科学技术出版社,,王颖,王献兵,范慧艳,韩成贵,李大伟,于嘉林甜菜坏死黄脉病毒的非复制非翻译区的复制关键区域的定位《中国植物病理学位年学术年会论文集》,中国农业科学技术出版社, S