西藏地区羊肠道寄生虫流行病学研究与人兽共患风险分析

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河南扈！农业大学专业硕士学位论文题目西藏地区羊肠道寄生虫流行病学研究与人兽共患风险分析学位申请人姓名常艳凯导师姓名张素梅教授专业学位类别兽医硕士领域基础兽医学研究方向人兽共患寄生虫学中国郑州２０１８年５月 分类号密级河南农业大学专业硕士学位论文论文题目：西藏地区羊肠道寄生虫流行病学研究与人兽共患风险分析英文题目：EpidemiologicalStudyofIntestinalParasitesandRiskAnalysisofZoonoticinTibetansheepinTibet学位申请人：常艳凯导师：张素梅教授学位类别：兽医硕士领域：基础兽医学研究方向：人兽共患寄生虫学论文提交学位授予日期：日期： 本论文受到下述项目资助：1：国家基金重点项目：微小隐孢子虫Ⅱd亚型家族起源及区域独特性遗传结构形成机制（31330079）2：十三五国家重大研发计划：禽畜重要人兽共患寄生虫病源头防控与阻断技术研究（2017YFD0501300-5）3：十二五国家重大科技专项子课题：重要寄生虫病监测技术研究（2012ZX10004220-011） 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书学位论西藏地区羊肠道寄生虫流行病学研宄学位ＺＺ｜｜入文题目与人兽共患风险分析一常艳凯基础兽医张素梅｜｜｜習丨丨＾ｔａｍｕｍ，ｍｍｍｍ年月曰独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研宄工作及取得研宄成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用一过的材料，指导教师对此进行了审定。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生签名：导师签名日期：月日日期：年６月日７７￣￣丨学立论文使用授权及知识产权归属承诺＃本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。本人完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业一离开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第署名河南单位农业为河大南学农所有业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归注，否则，承担相应的法律责任。研：究生保密签名学位文在解密后导用师于签本名授权书。一学院领导ｇ￥月日日期月日曰期：年月曰 致谢岁月如歌。转眼间，三年的研究生生涯即将结束，而我即将踏上另一段新的征程。回首三年的求学历程，从懵懂的韶年到几近而立之年，美好的青春韶华都在校园里度过。三年走来，遍尝了倾力付出的辛苦和学有所获的喜悦，此篇论文不仅倾注的自己的努力和满腔热血，更是承载了许多人在此过程中给予的无私帮助、支持和关心指导。内心充满了感激。感谢恩师张素梅教授。张老师儒雅的风采和严谨的治学态度，精益求精、科学求实的工作作风，深深的影响了我。论文的选题、撰写和修改无不倾注老师大量的心血，正是在老师的帮助和指导下论文才得以顺利完成。同时，老师在思想和生活上给予了无微不至的照顾和关怀。在此深表感激，自己也深知只有更加努力才能不负恩师教诲。学高为师，身正为范。感谢老师张龙现教授。入学之初，先生便教导说“人品”是做人的根本，要好学问必须先做好人。先生实事求是的科学态度、开拓创新的精神、广博的知识和把握全局的能力为我今后的学习和生活中树立了榜样。由衷感谢河南农业大学寄生虫学实验室宁长申教授、菅复春教授、王荣军副教授和王艳歌老师，感谢他们在学业上的授业解惑以及生活中给予的无私的指导和帮助。由衷感谢课题组杨玉荣副教授、董海聚副教授、赵青玉老师和刘红英老师在生活和学习中提供的支持、鼓励和帮助。由衷感谢导师组胡功政教授、李奎教授、杜向党教授、苑丽副教授、刘建华副教授、商艳红老师，感谢各位老师在课题和学习上的提出的问题和建议。特别感谢西藏农牧学院动物科学学院李家奎教授在采样过程中提供的热情帮助，感谢藏族同胞普布次仁在采样过程中提供的便捷及贡嘎畜牧局洛桑卓嘎对养殖信息的提供！特别感谢师兄李俊强博士在思想上的开导和教诲，师兄清晰的科研思路和对科研的一丝不苟的态度值得我的学习，富有激情的学习态度激励着我更加努力。特别感谢师姐王海燕博士、梁楠博士、史柯博士、张艳博士、崔艳艳博士和师兄齐萌副教授、黄建营博士、翁少亭博士、崔朝辉博士、余复昌博士在实验技能和生活的指导和帮助。特别感谢师兄曹建科、王臣荣、张振杰和师姐王晓星、张璐、李玉婉在学习和生活上的大力帮助。感谢同学毋亚运、胡苏辉、王震、闫亚群、党冰怡、刘珍珍、刘营营在学习和生活上的风雨同舟，相互支持与鼓励。感谢师弟李东方、郑双健、陈远才和师妹李松瑞、王璐、陈凯丽、张贵玲、赵姗姗、牛子文在样品采集和处理的帮助。衷心感谢我的父母、姐姐对我学业的支持，正是在他们关心、鼓励和支持下我才能更加努力和专心的学习。最后感谢我的爱人高晓敏在我求学过程中所给予的深深的理解和关怀！短暂的研究生生活，让我在生活和科学上学到了许多知识。但是，以后的路还很长，还需自己更加努力的学习和工作。 目录致谢...........................................................................................................................................1中文摘要...................................................................................................................................I第一章文献综述.....................................................................................................................1引言...................................................................................................................................11.羊胃肠道寄生虫种类..................................................................................................21.1羊胃肠道寄生蠕虫............................................................................................21.2羊胃肠道寄生原虫....................................................................................................22.羊胃肠道寄生虫生活史..............................................................................................42.1羊胃肠道寄生蠕虫生活史................................................................................42.2羊胃肠道寄生原虫生活史................................................................................53.胃肠道寄生虫对羊的危害..........................................................................................83.1胃肠道寄生蠕虫对羊的危害............................................................................83.2胃肠道寄生原虫对羊的危害............................................................................94.羊胃肠道寄生虫的诊断............................................................................................104.1病原学诊断......................................................................................................104.2分子生物学诊断..............................................................................................104.3免疫学诊断......................................................................................................115.羊肠道寄生虫防治....................................................................................................115.1预防..................................................................................................................115.2治疗..................................................................................................................126.研究的目的及意义....................................................................................................12第二章藏羊肠道寄生虫感染情况调查...............................................................................151.引言............................................................................................................................152.材料与方法................................................................................................................152.1样品采集...........................................................................................................152.2样本处理..........................................................................................................162.3材料..................................................................................................................162.4检查方法..........................................................................................................172.5生物学鉴定......................................................................................................173.结果与分析................................................................................................................171 3.1藏羊肠道寄生虫感染情况..............................................................................173.2藏羊肠道寄生虫混合感染情况......................................................................183.3不同品种藏羊寄生虫感染情况......................................................................183.4不同地区藏羊寄生虫感染情况......................................................................183.5不同放牧方式藏羊寄生虫感染情况..............................................................214.结论与讨论................................................................................................................21第三章藏羊艾美尔球虫种类形态学鉴定...........................................................................231.引言............................................................................................................................232.材料与方法................................................................................................................232.1样本采集..........................................................................................................232.2样本处理..........................................................................................................232.3材料..................................................................................................................232.4检测方法..........................................................................................................232.4.2饱和蔗糖溶液漂浮法...................................................................................232.5生物学鉴定......................................................................................................243.结果与分析................................................................................................................243.1羊球虫感染情况..............................................................................................243.2绵羊球虫种类及孢子化卵囊形态特征..........................................................243.3山羊球虫种类及孢子化卵囊形态特征..........................................................263.4鉴别山羊球虫检索表.......................................................................................283.5不同地区绵羊球虫种类感染情况..................................................................293.6羊艾美尔球虫混合感染情况..........................................................................314.结论与讨论................................................................................................................32第四章藏羊毕氏肠微孢子虫分子生物学鉴定...................................................................351.引言............................................................................................................................352.材料与方法................................................................................................................352.1样品来源..........................................................................................................352.2DNA提取.........................................................................................................352.3PCR扩增..........................................................................................................362.4电泳..................................................................................................................372.5测序..................................................................................................................37 2.6DNA序列分析.................................................................................................373.结果与分析................................................................................................................383.1微孢子虫感染情况..........................................................................................383.2毕氏肠微孢子虫基因型..................................................................................383.3种系发育分析..................................................................................................394.结论与讨论................................................................................................................41第五章藏羊十二指肠贾第虫系统进化分析.......................................................................431.引言............................................................................................................................432.材料与方法................................................................................................................432.1样品来源..........................................................................................................432.2DNA提取.........................................................................................................432.3PCR扩增..........................................................................................................432.4电泳..................................................................................................................462.5测序..................................................................................................................462.6种系发育分析..................................................................................................463.结果与分析................................................................................................................463.1十二指肠贾第虫感染情况..............................................................................463.2十二指肠贾第虫基因型..................................................................................463.3种系发育分析..................................................................................................474.结论与讨论................................................................................................................48结论与创新点.........................................................................................................................51参考文献.................................................................................................................................53英文摘要.................................................................................................................................65英文缩略表.............................................................................................................................69个人简历.................................................................................................................................713 中文摘要西藏地区羊的养殖通常以个体放牧养殖为主，管理的粗放和对寄生虫的忽略认识导致寄生虫病经常发生。寄生虫病常常造成羊的生产性能下降、消化能力降低、体重减轻、羊毛质量下降等问题，造成发病率和死亡率的上升，并导致巨大的经济损失。迄今为止，国内外关于羊寄生虫感染情况和诊断调查较多，但西藏地区作为传统牧区，关于羊肠道寄生虫的研究相对缺乏。一般情况下对于寄生虫的认识也限于对病死动物的处理和屠宰场的脏器的采集。而对于一些寄生虫的种类、致病性的调查和认识不足。检测的结果也受到检测条件和技术人员水平的影响。一些重要的人兽共患寄生原虫在光学显微镜检查中也难以检测到其病原体。应用现代分子生物学技术不仅可以对一些重要的人兽共患病原体进行调查，对于其系统进化和种群遗传及其溯源也可以提供技术支持。为进一步了解西藏羊肠道寄生虫的感染情况，掌握它们在不同放牧方式下的感染的流行病学特征。本研究于2016年6月-7月在西藏地区林芝地区工布江达县、山南地区乃东县、扎囊县和贡嘎县、日喀则地区南木林县、谢通门县共采集了880份羊粪便（绵羊粪便620份，山羊粪便260份）。通过镜检在785份粪便样品中发现8类寄生虫的虫卵或卵囊，总体感染率为89.2%（785/880）。其中绵羊总体感染率89.68%（556/620），山羊总体感染率为88.07%（229/260）。在绵羊寄生虫的调查中，共检测到7种肠道寄生虫。其中球虫的感染率最高，感染率为79.2%（491/620），阿米巴原虫、圆线虫、毛首线虫、细颈线虫、莫尼茨绦虫和肝片吸虫的感染率分别为30.16%（187/620），40.48%（251/620），7.58%（47/620），2.42%（15/620），2.42%（15/620），0.97%（6/620）。在260份山羊粪便样品中。检测到6种肠道寄生虫的感染。其中以球虫的感染率最高，感染率为81.2%（211/260）。阿米巴原虫、圆线虫、毛首线虫、莫尼茨绦虫、结肠小袋纤毛虫的感染率分别为29.6%（77/260）、16.2%（42/260）、5.4%（14/260）、1.9%（5/260）、0.4%（1/260）。在固定居所周围放牧羊的肠道蠕虫感染率显著高于游牧羊群肠道寄生虫的感染率。球虫病是造成羔羊死亡的重要因素，且根据上述研究，球虫也是感染藏羊的优势虫种。羊可以感染不同种类的艾美尔球虫，不同种类的艾美尔球虫致病性不同。为了解羊艾美尔球虫种类的感染情况，本调查共检测到695/880份球虫阳性样本，因部分样品感染量小，未进行球虫孢子化培养，对进行培养的638份球虫阳性样品（其中山羊209份，绵羊429份）了形态学定种。共检测到12种绵羊艾美尔球虫，12种山羊艾美尔（Eimeria）球虫。检测到的绵羊艾美尔球虫感染率为颗粒艾美尔球虫（Eimeriagranulose)7.7%（48/620），槌型艾美尔球虫（E.crandallis)2.6%（16/620），巴库艾美尔球虫（E.bakuensis)11.0%（68/620），错乱艾美尔球虫（E.intricate)2.7%（17/620），阿撒他艾美尔球虫（E.ahsata)4.5%（28/620），类绵羊艾美尔球虫（E.ovinoidalis)21.8%（135/620），浮氏艾美尔球虫（E.faurei)17.6%（109/620），贡氏艾美尔球虫（E.gonzalezi)8.5%（53/620），马尔西卡艾美尔球虫（E.marsica)12.9%（80/620），苍白艾美尔球虫（E.pallida)31.3%（194/620），小型艾美尔球虫（E.parva)39.4%I （244/620），温布里吉艾美尔球虫（E.weybridgensis)4.0%（25/620）。12种山羊艾美尔球虫感染率分别为：艾丽艾美尔球虫（E.alijevi）52.7%（137/260），苍白艾美尔球虫（E.pallida）50.8%（132/260），克氏艾美尔球虫（E.christenseni）10.8%（28/260），柯察艾美尔球虫（E.kocharli）9.6%（25/260），家山羊艾美尔球虫（E.hirci）8.8%（23/260），阿普艾美尔球虫（E.apsheronica）7.3%（19/260），阿氏艾美尔球虫（E.arloingi）5%（13/260），山羊艾美尔球虫（E.caprina）4.2%（11/260），约奇艾美尔球虫（E.jolchijevi）2.7%（7/260），斑点艾美尔球虫（E.punctata）2.7%（7/260），妮氏艾美尔球虫（E.ninakohlyakimovae）1.5%（4/260），羊艾美尔球虫（E.caprovina）0.4%（1/260）。依据本次调查山羊球虫的结果和艾美尔球虫孢子化卵囊特征，制订了山羊球虫检索表。本次调查显示山羊与绵羊混合感染2~7种球虫，不同采样地点混合感染率有差异。山羊和绵羊主要感染1~4种球虫，其中感染艾美尔球虫种类中以感染两种不同数量的艾美尔球虫最多(236/638)。毕氏肠微孢子虫是一种细胞内专性寄生的病原菌，感染宿主范围广，包括人类在内的多种脊椎和非脊椎动物，而且在一些水和蔬菜中也能检测到。在近几年，在绵羊和山羊中进行了一些毕氏肠微孢子虫的调查，一些人兽共患基因型也在绵羊和山羊中的调查中发现。为评估西藏地区羊的毕氏肠微孢子虫（Enterocytozoonbieneusi）分离株的潜在人兽共患性威胁，本研究通过对不同E.bieneusi分离株基于其核糖体RNA内部转录间隔区(internaltranscribedspacer,ITS)基因进行系统进化分析，以探究西藏部分地区藏羊的微孢子虫流行情况和遗传特征。本研究共对880份羊粪便样品进行检测，在测序成功的118份阳性样品中共有12个基因型。其中GenotypeI、CHG1、BEB6和EpbC为已知基因型，8个新基因型命名为NEW1~8。本次调查中NEW3、NEW4和EbpC是优势基因型。本研究检测到的12个基因型分别被划分到两个进化枝中，其中BEB6、CHG1和GenotypeI、以及新基因型New1、New2、New3、New5、New6、New7、New8处于进化树中有一定人兽共患风险的Group2中。基因型EbpC，NEW4在进化树中位于具有高度人兽共患风险的Group1中。贾第虫作为一种致腹泻的肠道原虫，可在人和多种动物之间广泛的传播。十二指肠贾第虫也是羊体内常见的肠道寄生原虫。基于SSUrRNA、TPI、BG和GDH基因，在西藏藏羊粪便样品中检测出十二指肠贾第虫阳性样品，总感染率为0.57%（5/880），检测到感染的基因型为集聚体E，检测到的基因亚型为集聚体E。本研究对藏山羊、藏绵羊肠道寄生虫进行了调查，并对不同的E.bieneusi分离株进行了系统发育分析和人兽共患性风险评估，对更好的保护藏羊的品种独特性并减少肠道寄生虫对藏羊和人类的威胁有积极的意义，并对藏羊的肠道寄生虫病的防控提供一定的理论参考依据。关键词：西藏；藏羊；肠道寄生虫；艾美尔球虫；微孢子虫；十二指肠贾第虫；流行病学 第一章文献综述引言西藏自治区位于我国西南部，地域辽阔，平均海拔在4000米以上，是我国地势最高的地区，被人们成为“世界的屋脊”。因地势起伏的变化大致形成了三个不同的地带，藏北高原地区，东部高山峡谷地区、藏南谷地区[1]。藏北高原地区面积达全区的三分之二，但其自然条件相对比较恶劣；东部高山峡谷地区因高山深谷明显，农业呈现立体特征；南部地区有较多大小不一的河谷地带，相对较好的自然环境使其农牧业较其他地区发达。西藏地区境内高山、湖泊遍布，河流纵横，牧草丛生，分布着丰富的牧草地资源，面积高达全区的68%，居我国天然草地面积之首，为发展畜牧业奠定了雄厚的物质基础[2]。西藏作为我国的传统牧区，动物种类繁多，其畜牧业一直以来都是西藏人民经济生活的基础。因其特殊的生活方式和饮食习惯，畜牧业也担负着西藏人民的衣食重任。西藏地区藏族人数占西藏总人数的92%，其中农牧民约占80%。传统的畜牧业仍然在西藏的经济生活中占有很大份额，近年来在西藏超过75%的出口商品和畜牧产品相关[3]。随着经济的发展，西藏畜牧业仍然是经济发展中不可或缺的重要成分。西藏畜牧业的发展在西部大开发战略中也处于极为重要的位置[4]。藏羊又称藏系绵羊，是西藏地区古老的家畜品种，因其稳定的遗传性能和恶劣环境的适应能力闻名国内外[5]。其肉质鲜美，毛质较为优质，用藏羊毛制成的毛质商品95%用于出口。西藏山羊因其对高寒牧区出色的适应能力，广泛分布于西藏各地。因西藏地区地势较高，气候寒冷干旱，而天然草场植被以草原为主，大家畜如牦牛和马减少，小家畜增多，藏绵羊和山羊占绝对优势[6]。2016年西藏羊存栏量有1437万，占西藏家畜总量的67.7%（国家数据库http://t.cn/RLtrY9G）。西藏绵羊和山羊作为经济类型多和生态适应性广的品种，是我国重要的遗传种质资源。西藏地区河流众多，长期以来恶劣的环境造就了牧草地资源的脆弱，传统的“逐水草而居”的游牧方式仍被大部分牧民沿袭至今。自上世纪末土地改革以来，牧民的生活方式逐渐发生变化，之前过着游牧生活的牧民开始了半定居甚至定居的生活，特别是在西部大开发战略实施以来，城镇化的进程加速了生活方式的转变，而游牧范围的划分更是加快了生活方式的转变[7]。西藏高原水域的分布不同导致了居住方式和放牧方式的变化。在藏北高原绝大部分是时令河流和细小、弯曲分汊的水流，牧民往往进行半定居的生活。相对比于藏北高原，在高原的东、南、西外围区域，则拥有水力资源丰富的的外流水域，且中下游阶段构成了西藏主要的农牧生产环境[8]。虽然放牧方式和生活环境得到了极大改变，近十年内绵羊和山羊的饲养量却经历了不同程度的数量下降。众多学者一直在寻找造成山羊和绵羊种群数量下降的生物和非生物因素原因。寄生虫是可直接或间接的引起个体死亡的生物因素之一，也是动物重要的病原体。感染羊的胃肠道寄生虫主要是由于原虫和蠕虫引起的，可广泛的传播，尤其是对幼畜的生长有着明显的影响。目前，西藏家畜肠道寄生虫的“春季高潮”对反刍动物的影响仍然是一个明显第1页共71页 的问题。捻转血矛线虫和棘球绦虫仍广泛分布于青藏高原地区[9,10]。由于胃肠道寄生虫的危害，常常造成羊的生产性能下降、消化能力降低、体重减轻、羊毛质量下降和动物生产下降等问题，引起发病率和死亡率的上升，并导致了巨大的经济损失[11]。而且一些人兽共患寄生虫的存在给西藏地区人民的生命健康、西藏社会的发展带来了严重的损失和威胁[12]。西藏地区地域辽阔，地形地貌复杂，天气气象变化多且变化快，植被类型也随地区和海拔变化，决定了西藏地区寄生虫的多样性和区域性。因自然环境的限制，西藏地区公路密度较小，现有的公路运输通行能力较差，且多数道路在雨季和雪季来临之时不能通行。交通的不便和管理的粗放导致了牧民难以及时地得到收益的帮助，从而延误了对寄生虫病的治疗。西藏是中国传统的牧场之一，且是我国河流、湖泊众多的省区之一，其中有二十多条不同的河流流入印度洋和太平洋[13]。丰富的水环境给寄生虫虫卵（卵囊）提供了一个适宜的栖息地，并增加了寄生虫传播的风险。复杂的自然环境为不同种类的寄生虫提供了广泛的生态环境。养殖技术落后、缺乏防范措施，加之对寄生虫病的重视程度较低，导致西藏地区绵羊和山羊受到了寄生虫病的侵袭，使当地畜牧业也蒙受了巨大的损失。本部分主要从可以感染羊的寄生虫种类、感染寄生虫后寄生虫对羊的危害和对寄生虫的诊断进行综述。1.羊胃肠道寄生虫种类1.1羊胃肠道寄生蠕虫寄生于羊肠道的蠕虫种类非常广泛，感染羊的肠道寄生蠕虫主要类群有扁形动物门（Platyhelminthes）和线形动物门（Nemathelminthes），而在棘头虫动物门（Acanthelminthes）中暂未发现感染羊的种[14]。在寄生虫的感染中多以扁形动物门中的吸虫纲（Trematoda）、绦虫纲（Cestoda）和线形动物门中线虫纲（Nematoda）混合感染为主[14]。1973年出土的西汉时期（公元前127年）马王堆墓，证实了血吸虫在我国的存在[15]。日本分体吸虫（Schistosomajaponicum），属于分体科（Schistosomatidae），是一种危害严重的人兽共患寄生虫，可感染包括人在内的40种动物[16]。我国不少古代医学典籍中已含有对寄生虫病的记载，如隋唐时期（公元610年）巢元方对绦虫的描述。绦虫纲中只有圆叶目（Cyclophyllidea）和假叶目（Pseudophyllidea）绦虫可以感染人和家畜从而导致人和家畜患病[12]。其中只有圆叶目的裸头科（Anoplocephalidae）和带科（Taeniidae）可以感染羊。寄生于羊上的线虫因大多不需要中间宿主、产卵量较多且卵（幼虫）对外界因素的抵抗里比较强比而其它寄生蠕虫在种类上多得多。早在1788年，Fabicius(1788)[17]就在绵羊肠道中发现了圆线虫目（Strongylida）圆线虫科（Strongylidae）食道口线虫亚科（Oesophagostominae）夏柏特线虫属（Chabertia）线虫新种羊夏柏特线虫（Chabertiaovina）。在1803年Rudolphi[18]在羊的胃肠道中发现了大量淡红色的圆线虫目毛圆线虫科（Trichostrongyloidea）捻转血矛线虫（Haemonchuscontortus）。1.2羊胃肠道寄生原虫据相关文献报道，叶足纲（Lobosasida）、阿米巴目（Amoebida）、内阿米巴科（Entmoebidae）、内阿米巴属（Entamoeba）和纤毛虫门（Ciliophora）、动片纲（Kinetofragminophorea）、毛口第2页共71页 目（Trichostomatida）、小袋科（Balantididae）、小袋属（Balantidium）在山羊和绵羊体内均有报道。近期越来越多文献报道了人兽共患寄生人芽囊原虫（Blastocystishominis）可以感染包括人在内的多种动物[19]。但有关人芽囊原虫的分类地位长期争论不休。1988年，Zierdt[20]等根据Levine等的分类系统，确定其属于叶足纲、阿米巴目、芽囊原虫新亚目（Blastocystina）。Dunn（1989）[21]认为人芽囊原虫和其他生物（如孢子虫和肉足虫）在结构上有很大相似，而不能把它归为任何一个纲目。1993年我国中山大学江静波和何建国认为人芽囊原虫在结构上和阿米巴型虫体形态不符，提出了一个全新的分类学观点，将其另立一个芽囊原虫新亚门（Blastocysta）、牙囊原虫纲（Blastocystidea）、牙囊原虫目（Blastocysta）、牙囊原虫科（Blastocystae）、牙囊原虫属（Blastocystis）、人牙囊原虫（Blastocystishominis）[22]。1.2.1球虫感染羊的球虫主要有顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoa）、球虫亚纲（Coccidiasina）、真球虫目（Eucoccidiorida）、艾美尔亚目（Eimeriorina）、艾美耳科（Eimeridae）和隐孢科（Cryptosporididae）[23]。据不完全统计，感染绵羊的艾美尔球虫有14种，感染山羊的有13种[24]。Shah（1963）和Yutaka（1990）都曾在绵羊中检测到等孢球虫的存在，但不常见[25,26]。运用分子生物学技术在顶复门、孢子虫纲、球虫亚纲、真球虫目、艾美尔亚目、隐孢科、隐孢子虫属（Cryptosporidium）中发现了至少有八种隐孢子虫可以感染羊，其中包括微小隐孢子虫（C.parvum）、人隐孢子虫（C.hominis），安氏隐孢子虫（C.andersoni）、猪隐孢子虫（C.suis）、肖氏隐孢子虫（C.xiaoi）、费氏隐孢子虫（C.fayeri）、泛在隐孢子虫（C.ubiquitum）、种母猪隐孢子虫（C.scrofarum）[27]。1.2.2微孢子虫微孢子虫（Microsporidia）现如今被从原生动物界、微孢子虫门、微孢子虫纲、微孢子虫目、微孢子虫科、划分到真菌。微孢子虫几乎可以感染所有的脊椎动物，在160多个属种含有超过1400个种。报道称只有14个不同属的微孢子虫可以感染人，其中Enterocytozoonbieneusi和E.intestinalis是感染肠道并能引起胃肠道的两个种，大量的E.bieneusi基因型已经在人和家畜中被发现发现[28-30]。1.2.3贾第虫贾第鞭毛虫（Giardia）是寄生于小肠的运动鞭毛纲、双滴虫目、六鞭虫科的一种原虫。每种贾第虫都可以感染多种动物。其中可以感染人只有十二指肠贾第鞭毛虫(Giardiaduodenalis)，十二指肠贾第鞭毛虫还可以感染除人之外的多种动物。G.duodenalis是由8个(A～H)复杂的集合体（集聚体）构成。报道称集聚体A、B和E可以感染羊，其中集聚体A被认为具有人兽共患特性[31]。第3页共71页 2.羊胃肠道寄生虫生活史2.1羊胃肠道寄生蠕虫生活史感染家畜的吸虫和绦虫有较为复杂的生活史。绦虫在发育过程中需要一到两个中间宿主才可完成其完整的生活史[32]。虫卵期、中绦期和成虫期组成了绦虫的完整的生活史。成虫可发现于终末宿主的小肠中，粪便中含有孕节及其大量的虫卵。粪便中的虫卵可随饲料或饮水进入动物的消化道，在消化道液体的作用下，卵内的蚴被释放出来，借助自身的钩子，可由血液或淋巴液到达动物的各器官和组织中，逐渐发育成成虫[32]。图1-1不同发育时期线虫的形态Fig.1-1Morphologyofnematodesatdifferentdevelopmentalstages.所有线虫的发育都需要经历五个不同的幼虫时期，在每个幼虫期之间都要进行蜕皮，因此一共要进行4次蜕皮才能变成成虫（如图1-1）。在这五个时期中，大多数线虫虫卵发育到第三期幼虫时才具有感染性，所以第三期幼虫又称感染性幼虫[33]。前两次发育在环境中即可完成，后两次的发育需要在宿主体内完成。除了在外界自由生活的线虫不需要宿主的参与，所有寄生生活的线虫的都需要一个及其以上的的宿主才能发育完成。动物寄生的部分线虫生第4页共71页 活史类型如图1-2所示。图1-2部分线虫生活史Fig.1-2Thelifecycleofsomenematodes2.2羊胃肠道寄生原虫生活史感染羊的隐孢子虫除了C.andersoni可以寄生在肠道和胃黏膜上，其他比如C.hominis和C.parvum都寄生在肠道中。隐孢子虫的生活史较为简单，在单宿主内即可完成完整的生活史[34]。其生活史大致可以分为6部分（图1-4）：A，环境阶段和感染源（具有感染性的孢子化卵囊）；B，脱囊（四个具有感染性的子孢子离开卵囊）；C，入侵细胞（在分泌细胞器的协助下入侵细胞）；D，无性繁殖（裂殖生殖），含两代裂殖体（MerontI、MerontII），第一代在纳虫空泡中形成滋养体，第二代是第一代裂殖体离开纳虫空泡后感染进入宿主细胞；E，有性生殖（孢子发生有性生殖），MerontII侵入宿主后形成大小配子（雌、雄），开始有性生殖阶段；F，受精（大小配子必须附着在宿主细胞和巨细胞膜上受精才可以发生），只有在附着在巨细胞上受精才可发育成卵囊；G，孢子化，不同于其他球虫种类，其在体内即可形成具有感染力的孢子化卵囊，随粪便排出体外[35]。2.2.1球虫球虫的生活史比较类似，基本生活史如图1-3。宿主吞食卵囊后，子孢子释放出来进入宿主细胞变成裂殖体，通过复分裂的方式形成2-8个裂殖子，新的裂殖子进入新的宿主细胞后再次进行裂殖生殖。一般情况下进行几个固定的无性繁殖，最后一代裂殖子发育成配子，配子结合形成合子，合子周围形成卵囊壁后变成卵囊，通过粪便的形式排出体外。一般情况下排出体外前不进行孢子化。第5页共71页 图1-3球虫发育基本生活史Fig1-3BasiclifecycleofCoccidia.[35]图1-4隐孢子虫生活史Fig1-4LifecycleofCryptosporidium.2.2.2微孢子虫生活史微孢子虫在体外是以孢子的形态存活，在宿主吞食微孢子虫后，在胃肠道消化液的作用下，孢子释放出极丝，卵膜孔或者通过极丝机械的引入宿主细胞，经过裂殖生殖形成裂殖体。随后在宿主的胞浆中形成的空泡周围开始增值（卵块），并发育成为成熟的孢子，随着大量的增值和成熟，空泡扩张，最后细胞破裂，释放出具有感染能力的孢子（图1-5）。然后开始第6页共71页 新的生活周期[36]。*EncephalitozooncuniculiandE.hellem的增殖也在纳虫空泡内进行*DevelopmentinsideparasiteophorousvacuolealsooccursinEncephalitozooncuniculiandE.hellem图1-5微孢子虫生活史（图片来源：美国CDChttp://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Microsporidiosis.html.）Fig1-5LifecycleofMicrosporidia(EnterocytozoonbieneusiandEncephalitozooanintestinalis)（Picfrom：CentersforDiseaseControlandPrevention(CDC).http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Microsporidiosis.html.）第7页共71页 2.2.3贾第虫生活史贾第鞭毛虫生活史较为简单。当动物感染包囊后，吞食的包囊在十二指肠脱囊形成滋养体。滋养体主要寄生在家畜的十二指肠内，以吸盘形式附在肠壁上，以纵的二分裂进行增值。但滋养体在肠腔后端时变为包囊（如图1-6），在包囊内可进行分裂。包囊对外界的阻碍极强，可在冰水中存活数月，通过食入感染性的包囊可感染贾第虫病[31]。AB图1-6贾第虫滋养体和包囊（A滋养体；B包囊）Fig1-6Giardiatrophozoitesandcysts（A:Giardiatrophozoites;BGiardiacysts）3.胃肠道寄生虫对羊的危害因羊对寄生虫有一定的抵抗力，许多寄生于羊上的寄生虫表现为低致病性，羊感染寄生虫后可能没有明显的症状，因此可能造成对寄生虫病的忽视。但寄生虫可广泛寄生在家畜体内，以多种方式掠夺营养，引起家畜繁殖性能和健康状况的下降，降低了家畜的生产性能，从而导致了畜产品质量和数量的下降，严重影响了养羊业的经济效益[37]。3.1胃肠道寄生蠕虫对羊的危害寄生于宿主体内的蠕虫以生物刺激的形式对宿主造成危害，因此，宿主的病理变化取决于蠕虫和宿主机体在生物学上的相互关系。不同种类的宿主对同一种蠕虫可能敏感性不同，从寄生蠕虫对不同种类的宿主产生的危害也不同。蠕虫对宿主的危害，有时不局限于寄生的部位甚至可能影响全身，当蠕虫侵入组织或器官后，可能会产生不同的移行路线，寄生于机体上不同的组织和器官中。不同种类的寄生虫寄生部位可能不同，对宿主的危害和影响也是复杂的。寄生蠕虫对家畜的危害大致如下：掠夺宿主营养。寄生于肠道的一些蠕虫有时可以直接消化或半消化来自外界的食物，或第8页共71页 者吸食宿主的血液使自己可以在宿主体内大量增殖。其中增值过程中所需的营养物质大部分来自宿主。由于寄生虫对宿主营养的掠夺，造成了宿主处于贫血、消瘦等营养不良的状态。机械性损伤。蠕虫依靠他们各种各样的附着器官，如有角质的齿、刺、叶冠、吸盘等附着在宿主的组织上，引起组织的损伤。幼虫在移行过程中造成组织炎症或出血。当寄生虫在肠道或其他器官腔道中聚集可引起管道的阻塞，甚至破裂。有些蠕虫如细粒棘球蚴在生长时可对组织或器官产生慢性压力，引起肝和肺组织的萎缩。分泌毒素。蠕虫在新陈代谢的活动中可产生多种代谢物质，代谢物被机体吸收后可产生急性或慢性的中毒症状，导致宿主组织及机能的损伤带菌作用。在蠕虫对机体产生机械性损伤的同时，促使其他病原菌的入侵，甚至可以一同携带入内，继而引发宿主伴发性的传染病。同时，蠕虫的寄生导致宿主免疫力下降，这使得潜伏于宿主体内的病原菌得到了大量的繁殖。“春季高潮”是羊出现线虫病高发期的的一个明显特征[38]。原因主要有两方面，一是可以在冬天的环境下保持感染力的幼虫在春季羊放牧之后可以很快的感染羊。二是羊在夏秋季节感染虫卵后因牧草充足，自身抵抗力强使得寄生虫的幼虫发育受到限制，而在冬末春初季节缺乏牧草时抵抗力下降使得幼虫开始发育，到春季（4-5月份），羊体内成虫数量达到高峰，即成虫的“春季高潮”[38]。3.2胃肠道寄生原虫对羊的危害据报道，羊对阿米巴有一定的抵抗力，羊的感染率很高，但是一般都为带虫者，不表现出一些临床症状。但其中一些感染羊的种类比如脆双核阿米巴作为人兽共患病种类，可导致人出现腹胀腹痛腹泻等症状[39]，一些调查发现羊感染寄生虫后有阿米巴原虫的混合感染。有研究发现阿米巴可激活补体旁路，激活的补体可以溶解阿米巴，在阿米巴患者血清中也发现有激活该途径的物质。阿米巴对感染动物的毒力效果可能和宿主产生的补体或者通路激活后的效率有关[40]。原虫可对肠道造成粘膜损伤，造成羊的吸收能力下降，导致腹泻和营养不良等一系列症状。3.2.1球虫对羊的危害球虫可引起羊的球虫病。羊的球虫病是羊重要的消化道疾病。有研究表明，球虫病引起的腹泻可能是引起羔羊死亡的第二大病因。Pout（1976）[41]等认为羊的球虫是引起羊腹泻唯一的因素，它最初可能由营养失的调或者细菌的感染所引起。羔羊感染球虫后引起腹泻、消瘦、贫血、食欲不振等症状，甚至导致死亡。青年羊或成年羊感染球虫后一般表现为亚临床症状，导致生长发育迟缓和繁殖性能下降，且作为带虫者可能会增加羔羊的患病率。3.2.2微孢子虫对羊的危害微孢子虫病是一种慢性的寄生原虫病，一般情况下为隐性感染。微孢子虫的裂殖子在宿主体内大量增殖，吸收消耗大量的养分，使宿主缺乏营养。羊在免疫功能降低时可能变现出自限性的腹泻、角膜炎以及肌炎，但在艾滋病病人体内可引起腹泻和体重减轻[42]。微孢子虫病作为一种新发传染病已引起世界范围的公共卫生问题，被美国国立过敏和传染性疾病研究第9页共71页 院列入第二类具有潜在危险的微生物名单。3.2.3贾第虫对羊的危害贾第虫是一种机会性致病病原，可感染包括人在内的多种动物。贾第虫对小肠的糖膜（glycocalyx）的直接毒性作用造成了营养吸收障碍、细菌定居的增加、能量和叶酸盐的缺乏，从而可导致宿主除腹泻外的恶心、腹部绞痛和头痛等症状。羊感染贾第虫病后，可出现腹泻、营养不良等症状，造成免疫力降低。因缺乏特效药，十二指肠贾第虫在免疫缺陷病病人体内是一种致死性的腹泻病原[31]。4.羊胃肠道寄生虫的诊断羊可感染多种胃肠道寄生虫，而且多以多种类的寄生虫混合感染为主。而在肠道蠕虫的致病性中，虫口密度或相对寄生虫负荷是在寄生虫方面最重要的因素；在肠道原虫的致病性中，致病因素主要考虑虫株的毒力[43]。但在一般情况下，寄生虫的感染常处于隐性感染状态或不表现出明显的临床症状。因此准确和有效的鉴定寄生虫的感染状况，不仅可以及时和有效的治疗羊寄生虫病，而且可以有效的组织一些人兽共患寄生虫病的传播。为准确、快捷的了解寄生虫的感染率和感染情况，需要进行快速和准确的检查手段。4.1病原学诊断由于家畜感染寄生虫后可能不表现出明显的临床症状，因此，利用实验室方法进行肠道寄生虫病原的检测是诊断寄生虫病的主要手段，也是确诊的依据。通过粪便的显微镜检查可以检测到肠道寄生蠕虫的虫卵、幼虫、虫体节片，检测到原虫的卵囊、包囊、滋养体等。粪便检查局限于显微镜的检测，而一些感染量小、虫卵/卵囊形态较小时影响检测结果。粪便检查的方法主要是直接涂片法、浓集法和肛门拭子法。浓集法主要包括离心法、沉淀法和漂浮法。肛门拭子法主要用于在肛周产出的虫卵或在肛门附近发现的带绦虫卵。西藏地区对家畜进行肠道寄生虫的检查大都是对病死动物或者屠宰场的剖检，但对于感染寄生虫而不表现出临床症状的家畜来说，粪便检查无疑是必要的手段[44]。粪便检查是检测寄生虫病原的最主要的方法。但粪便检查因采样方式、粪便存放的时间、技术人员良莠不齐、实验条件参差不一可能会造成阳性率偏低。一些肠道原虫因形态较小，普通光学显微镜难以检测到其病原体，譬如毕氏肠微孢子虫，因此其他方式的检测方式的辅助成为了必要。4.2分子生物学诊断从分子和基因水平上研究寄生虫的寄生现象已经成为现代寄生虫研究的重要方向。分子寄生虫学的发展，使科学人员不仅可以进行寄生虫的流行病学调查和诊断，又可以探讨寄生虫入侵宿主时的分子机制，在了解寄生虫病的发生、发展以及解决寄生虫病的诊断、治疗和预防方面起到了重要的作用。利用分子寄生虫学方法在虫种的鉴定、虫株的变异和系统发育研究方面已经得到了广泛的应用[45,46]。在分子诊断是分子寄生虫学应用最广泛的方法，它解决了粪便检查中敏感性低、劳动强度大的问题[47]。目前，寄生虫的诊断技术主要包括特异性PCR技术、DNA探针技术、限制第10页共71页 性片段长度多态性（RFLP）和随机扩增多态性DNA（RAPD）等。应用特异性PCR主要检测寄生虫的单拷贝特异性基因、种内多拷贝基因和核糖体DNA来进行寄生虫病的诊断和流行病学调查及虫株的分析。DNA探针是用同位素或生物素标记寄生虫的特异性片段来达到检测和鉴定的目的。实时荧光定量聚合酶链反应（quantitativereal-timePCR,qPCR）的应用，解决了病原极低时难以检测的问题。随着分子寄生虫的发展，基因组学对发现新的候选疫苗和药物靶标、促进寄生虫病的治疗以及了解寄生虫的寄生现象提供了一个新的解决方案和解决途径[31]。4.3免疫学诊断粪便检查是检测寄生虫病原的最主要的方法。但粪便检查因感染的强度、采样方式、粪便存放的时间、技术人员良莠不齐、实验条件参差不一可能会造成阳性率偏低。为了提高诊断效率，免疫学诊断在寄生虫的诊断方面具有重要意义。寄生虫在入侵机体过程中和感染宿主后可产生不同的生长代谢物质，宿主产生不同的物质作为免疫应答，因此可以利用寄生虫和宿主之间的抗原抗体进行免疫学的诊断[48]。目前，在一些人兽共患寄生虫病和重要的家畜寄生虫病的诊断方面，已经建立了很多免疫诊断的方法，其中主要包括间接免疫荧光（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、琼脂糖扩散试验（AGID）、胶体金快速诊断技术（IHA）和斑点印迹法（dotblot）等。IFA技术是以荧光物质标记抗体而进行的抗原定位技术。可灵敏、快捷的检测出感染率和感染的强度。ELISA是一种应用广泛的寄生虫检测方法，它采用抗原与抗体的特异反应将待测物和酶连接，然后通过酶和底物颜色反应，用于定量测定。目前大多数商品化的试剂盒属于ELISA检测方法。胶体金技术是待测物质和抗原（抗体）结合后的复合物和胶体金在固相载体上的颜色反应。是一种方便快捷、结果直观的现代免疫技术。AGID是抗原抗体在琼脂糖凝胶中形成肉眼可见的沉淀，借以来判断感染的有无，虽然灵敏性高，但其耗费时间较长，1-3天后才有结果。朱雪龙等[49]在研究鸡艾美尔球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶时，利用Westernblot和间接免疫荧光(indirectimmunofluoresceneassay,IFA)对重组细胞表达情况进行鉴定，证明了重组质粒构建成功。HYDarani等[50]利用dotblot制备的特异性十二指肠贾第虫抗体血清，检测十二指肠贾第虫时灵敏度和特异性达到97%和64%。5.羊肠道寄生虫防治羊肠道寄生虫不仅引起繁殖性能和健康状况的下降，而且一些人兽共患寄生虫也严重威胁了人类的生命健康，因此寄生虫的防治关系着畜牧业的发展和人类的健康。5.1预防寄生虫生活史、生活环境复杂，给防治工作增加了难度和复杂性。因此，对于羊的寄生虫病我们必须贯彻以预防为主的治疗方针。羊的寄生虫病的预防措施有以下几个方面。一、粪便及厩肥的处理。肠道寄生虫的感染一般通过粪口途径，羊感染寄生虫后排出的粪便中含有大量的寄生虫虫卵（卵囊或包囊）。粪便的生物发酵（堆肥）可杀死99%的虫卵，因微生物的发酵作用，在堆肥过程中粪便温度高达60℃-75℃，约7天左右便可杀死寄生虫虫卵（卵囊或包囊），发酵后的粪便可作为肥料。二、预防性驱虫。根据寄生虫的流行病学特征及其第11页共71页 生活方式，制定合理的驱虫方案，定时驱虫或接种疫苗，预防寄生虫的感染。三、消灭中间宿主及病媒昆虫。对于需要媒介传播的寄生虫，要利用物理法、化学法或生物防治来驱除中间宿主病媒昆虫。四、改善营养及加强饲养管理。动物的抵抗能力和健康状况有关，饲料的营养水平决定了动物的健康状况，提高抵抗能力可阻滞寄生虫的正常发育。改善卫生环境，加强卫生的管理，合理的安排牧群的数量，适时的轮牧。5.2治疗驱虫是寄生虫防治的重要程序，一般用药物来达到驱虫的目的。因现代兽医医学的发展，中药类的驱虫药因效果相对较慢，渐渐淡出人们的视线。虽然生命科学得到了快速的发展，疫苗的开发和利用成为了治疗疾病的重要手段，因寄生虫主要为专性寄生且有较强的免疫逃避能力，难以获得高效的疫苗。化学药物因经济、疗效好成为了主要的驱虫药物。因寄生虫的寄生部位和生长方式大都不同，抗寄生虫药物的种类也不尽相同。不同于细菌感染后可以用抗生素治疗，抗寄生虫的药物一般为光谱的治疗性药物。在动物寄生蠕虫的治疗上，可用苯并咪唑类、四氢蝶啶类和三苯双脒等药物治疗线虫病；绦虫可用氯硝柳胺、砒喹酮等治疗；常用苏拉明、乙胺嗪和伊维菌素等治疗丝虫病；砒喹酮、硫氯酚和三氯苯达唑通常用于吸虫病的治疗。对于原虫的治疗可用甲硝唑、替硝唑、硝唑尼特和替唑特。同一种药物在治疗肠道原虫时往往不能根治，根治原虫通常需要几种药物共同的作用。如治疗疟疾时，氯喹、甲氟喹、奎宁、青蒿素、伯氨喹和乙胺嘧啶等的使用才能根治原虫。一些广谱类的原虫药物只是对原虫的活性造成部分影响，不能产生良好的驱虫效果。比如隐孢子虫病、贾第虫病迄今为止没有特异性的药物。而在寄生虫药物方面仍待大量的研究。6.研究的目的及意义西藏地区羊的养殖通常以个体放牧养殖为主，管理的粗放和对寄生虫的忽略认识导致寄生虫病经常发生。迄今为止，国内外关于羊寄生虫感染情况和诊断调查较多，但西藏地区作为传统牧区，关于羊肠道寄生虫的研究相对缺乏。一般情况下对于寄生虫的认识也限于对病死动物的处理和屠宰场的脏器的采集。而对于一些寄生虫的种类、致病性的调查和认识不足。检测的结果也受到检测条件和技术人员水平的影响。一些重要的人兽共患寄生原虫在粪便的显微镜检查中也难以发现病原体。巢氏PCR具有较好的灵敏性，微量感染即能检测到病原体的存在。巢氏PCR的两次套内扩增，提高了待检物质的扩增倍数，PCR的灵敏性得到了极大的提高，不同引物的使用，降低了非特异性的扩增，使得检测有很好的特异性。球虫种类的确定，可以了解和评估致病性强的种类，为球虫病的爆发和球虫药物的预防提供了研究的基础和流行病学参考。本研究对西藏自治区藏绵羊、藏山羊的粪便样品进行了调查，初步了解了藏绵羊与藏山羊肠道寄生虫的感染情况，探讨了在不同放牧方式情况下线虫感染的差异原因，对优势虫种第12页共71页 艾美尔球虫进行了形态学鉴定，对人兽共患寄生原虫微孢子虫和十二指肠贾第虫进行了分子鉴定，通过系统发育分析对微孢子虫和十二指肠贾第虫进行了公共卫生学分析。这为西藏地区藏山羊和藏绵羊的胃肠道寄生虫的诊断、治疗提供了基础，而且增加了我们对微孢子虫和十二指肠贾第虫系统进化的了解，丰富了遗传学、基因型、表型、系统进化及种群遗传的分子数据库。为藏羊的养殖和寄生虫病的预防提出了建议，在藏羊的物种保护、寄生虫的预防和诊断方面提供了有力的技术支持。第13页共71页 第14页共71页 第二章藏羊肠道寄生虫感染情况调查1.引言西藏高原平均海拔高度超过4000米，面积约250万平方公里，是欧亚大陆最大的草原地区，也是中国天然草地面积最大的地区。因交通的限制，该地区的牲畜很少受到外部品种的影响。藏羊是耐低温和低氧的西藏特有品种，主要生活在高山牧区，是当地重要经济资源。藏羊因优质的皮毛闻名于世，作为西藏主要的家畜之一，其农副产品是西藏人民重要的经济来源。由于当地疾病防控的落后，家畜寄生虫病仍然难以得到有效的控制。家畜感染寄生虫后可能没有明显的症状，因此，胃肠道寄生虫病是发展中国家治疗最容易被忽视的疾病。寄生虫病不仅引起家畜繁殖性能和健康状况的下降，而且一些人兽共患寄生虫也严重威胁了人类的生命健康[51]。近年来藏羊肠道寄生虫的“春季高潮”对反刍动物的影响仍然是一个明显的问题，但关于西藏地区的山羊寄生虫病的调查报道少于国内外其他地区。为了解西藏地区放牧藏绵羊与藏山羊胃肠道寄生虫感染情况，探讨分析肠道寄生虫的流行特征，减少肠道寄生虫病对羊的侵害，保护藏羊在西藏的品种和数量，本研究与2016年6月-7月采集了西藏地区藏绵羊与藏山羊的粪便样品，检查了粪便中的寄生虫虫卵（卵囊或包囊），旨在为羊的寄生虫病的预防和治疗提供科学的依据。2.材料与方法2.1样品采集于2016年6月-7月在西藏部分地区（图2-1）采集的新鲜绵羊粪便620份，新鲜山羊粪便260份，共计880份。其中林芝地区93份，山南地区484份，日喀则地区303份，详情见表2-1。受采集动物的饲养方式的限制，未记录采样动物的年龄、性别、症状等信息。为避免重复采样，每份样品采样间隔最少十米，每个牧群最多采集二十份样品。每份样品的均用一次性手套采集，每份样品20-30克，并编号记录地点和品种信息。为避免样品发酵，在样品采集的2小时内每份样品加入20mL2.5%的重铬酸钾，置于4℃环境中保存。采样结第15页共71页 束后带回河南农业大学牧医工程学院河南省人兽共患病国际联合实验室待检。图2-1本次调查在西藏地区采样分布Fig.2-1Atotalof880tibetansheepandtibetangoatfecalspecimenswerecollectedfromGongbo’gyamda;Nêdong;Zhanang;Gonggar;Namling;Xietongmen表2-1不同地区采样地点及样本量Table2-1Numberofspecimensfromdifferentsamplinglocations.品种采样地区采样地点总样本量林芝工布江达县93乃东县34绵羊山南扎囊县290贡嘎县160日喀则南木林县43山羊日喀则谢通门县260总计8802.2样本处理样品到达实验室后将样品分为三份，一份装入2mLEppendorf管中等待待提取DNA，一份装入2mLEppendorf管中加2.5%重铬酸钾保存，将剩余剩余的粪便样品用于显微镜检查。2.3材料2.3.1主要设备上海安亭科学仪器厂生产的TDL-5-A离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司生产的TDZ5-WS和L550生产的离心机，奥林巴斯株式会社生产的OLYMPUSBX53微分干涉第16页共71页 显微镜，Motic麦克奥迪实业集团有限公司生产的TYPE102M显微镜，三洋电机株式会社生产的MLS-3750全自动高压蒸汽灭菌器，苏州净化设备有限公司生产的SW-CJ-2D型（实用垂直新颖）双人单面净化工作台，海尔集团生产的BC/BD-519HAN电冰箱，AppliedBiosystems公司生产的2720ThermalCyclerPCR仪，上海松特电器生产的全自动交流稳压器，美国Syngene公司生产的凝胶成像系统，瑞士梅特勒-托利多METTLERTOLEDO生产的AB204-N电子天平，北京市六一仪器厂生产的DYY-5型稳压温流电泳仪，美的公司生产的微波炉和电磁炉，美国SIVortex生产的旋涡混合器，郑州生元仪器有限公司生产的DHG-2080B电热鼓风干燥箱，恒温水浴锅。2.3.2主要试剂及配制2.5%重铬酸钾溶液（重铬酸钾2.5克，100mL蒸馏水混匀），卢戈式碘液（碘5克，碘化钾10克，蒸馏水100mL混匀后避光保存），饱和蔗糖溶液（食用白糖500克，蒸馏水320mL加热溶解）。2.4检查方法2.4.1离心沉淀法将10克左右粪便样品加50mL蒸馏水后搅匀，经40目不锈钢粪筛滤去粪渣后置于离心机内，3000r/min离心十分钟，弃去上清液后用一次性筷子搅匀。2.4.2卢戈式碘染色法取一洁净的载玻片滴一滴绿豆大小的卢戈式碘液至载玻片中间，将上述混匀后的粪便和卢戈式碘液混合均匀后盖上载玻片。置于OLYMPUSBX53显微镜光场下400x进行寄生虫虫卵/包囊的检查，每份样品检查三次。主要用于检测贾第虫包囊、阿米巴包囊和吸虫虫卵等。2.4.3饱和蔗糖溶液漂浮法将上述沉淀加入35mL饱和蔗糖溶液搅拌均匀，3000r/min离心20分钟。小心取出离心管，用一不锈钢吊环吊取离心管液面液体，并将液体涂抹至洁净的载玻片上，盖上盖玻片置于OLYMPUSBX53显微镜光场下400x进行寄生虫虫卵（卵囊/包囊）的检查。适用于检查多种蠕虫虫卵和球虫的检查等。2.5生物学鉴定根据寄生虫卵囊或虫卵的大小、颜色和形状等形态特征，参考孔繁瑶等[44,52,53]方法进行寄生虫种（类）的鉴定。3.结果与分析3.1藏羊肠道寄生虫感染情况本次检测绵羊和山羊粪便880份，其中检测到寄生虫的有785份，总感染率为89.20%（785/880），共检测到8类寄生虫，分别为：艾美尔球虫、阿米巴原虫、圆线虫、毛首线虫、细颈线虫、莫尼茨绦虫、肝片吸虫和纤毛虫。其中以艾美尔球虫感染率最高为79.77%（702/880），阿米巴原虫、圆线虫、毛首线虫、细颈线虫、莫尼茨绦虫、肝片吸虫和纤毛虫的感染率分别为29.0%(255/880)，33.3%(293/880)，6.9%(61/880)，1.7%(15/880)，2.3%(20/880)，第17页共71页 0.7%(6/880)，0.1%(1/880)。部分虫卵（卵囊或包囊）如图2-2所示。图2-2藏羊中发现的部分寄生虫虫卵（卵囊/包囊）。（a）阿米巴包囊；（b-c）艾美尔球虫卵囊；（d-e）圆线虫虫卵；（f）细颈线虫虫卵；（g-h）毛首线虫虫卵；（i）莫尼茨绦虫虫卵；（j）肝片吸虫虫卵。Fig.2-2ParasitesidentifiedinstoolsamplesfromTibetansheep.(a):Entamoebaspp.;(b-c):Eimeriaspp.;(d-e):Strongylespp.;(f):Nematodirus;(g-h):Trichurisspp.;(i):Monieziabenedeni;(j):Fasciolaspp..3.2藏羊肠道寄生虫混合感染情况在880份感染寄生虫分辨样品中，共发现2~4种寄生虫混合感染，混合感染率为44.10%。其中主要是两种寄生虫的混合感染，所占的比率为30.80%（271/880）。其中球虫后阿米巴的混合感染率为15.90%（140/880），其次为球虫和圆线虫的混合感染，感染率为7.39%（65/880）。绵羊与山羊感染蠕虫类（圆线虫、毛首线虫、细颈线虫、莫尼茨绦虫、肝片吸虫）样品共计332份。3.3不同品种藏羊寄生虫感染情况在绵羊寄生虫的调查中，绵羊寄生虫感染率为89.68%（556/620）。共检测到7种肠道寄生虫。其中球虫的感染率最高，感染率为79.2%（491/620），阿米巴原虫、圆线虫、毛首线虫、细颈线虫、莫尼茨绦虫和肝片吸虫的感染率分别为30.16%（187/620），40.48%（251/620），7.58%（47/620），2.42%（15/620），2.42%（15/620），0.97%（6/620）。在260份山羊粪便样品中，检测到229份样品有寄生虫的感染，总感染率为88.07%（229/260）。检测到6种肠道寄生虫的感染。其中以球虫的感染率最高，感染率为81.2%（211/260）。阿米巴原虫、圆线虫、毛首线虫、莫尼茨绦虫、结肠小袋纤毛虫的感染率分别为29.6%（77/260）、16.2%（42/260）、5.4%（14/260）、1.9%（5/260）、0.4%（1/260）。3.4不同地区藏羊寄生虫感染情况在三个地区的六个采样地点中，如表所示，以贡嘎县绵羊肠道寄生虫感染率最高，感染率为96.9%（155/160）；南木林次之，感染率为93.02%（40/43）；乃东县的感染率最低，感染率为61.8%（21/34）；工布江达县、扎囊县和谢通门县的感染率分别为82.8%（77/93），第18页共71页 90.7%（263/290）和88.07%（229/260）。六个采样点之间的感染率差异不显著（P＞0.05）。表2-2西藏藏羊羊胃肠道寄生虫感染情况Table2-2PrevalenceofgastrointestinalparasitesinTibetansheepinTibet阳性样本数采样地区寄生虫种类（感染率）工布江达乃东扎囊贡嘎南木林谢通门(%)(n=93)(n=34)(n=290)(n=160)(n=43)（n=260）原虫725(82.4)72(77.4)13(38.2)255(87.9)133(83.1)33(76.7)219(84.2)阿米巴.255(29.0)10(10.8)0(0)100(34.5)69(43.1)8(18.6)77(29.2)艾美尔球虫702(79.8)71(76.3)13(38.2)246(84.8)128(80.0)33(76.7)211(81.2)线虫326(74.0)64(68.8)13(38.2)82(28.3)88(55.0)25(58.1)54(20.8)圆线虫293(33.3)58(62.4)12(35.3)75(25.9)83(51.9)23(53.5)42(16.2)毛首线虫61(6.9)18(19.4)1(2.9)15(5.2)9(5.6)4(9.3)14(5.4)细颈线虫15(1.7)7(7.5)0(0)3(1.0)3(1.9)2(4.7)0(0)绦虫20(2.3)2(2.2)0(0)4(1.4)4(2.5)5(11.6)5(1.9)莫尼茨绦虫20(2.3)2(2.2)0(0)4(1.4)4(2.5)5(11.6)5(1.9)吸虫6(0.7)6(6.5)0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)肝片吸虫6(0.7)6(6.5)0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)纤毛虫1(0.1)0(0)0(0)0(0)0(0)0(0)1（0.4）总计785(89.2)77(82.8)21(61.8)263(90.7)155(96.9)40(93.0)229(88.1)第19页共71页 表2-3西藏地区不同放牧方式藏羊胃肠道寄生虫患病率调查Table2-3InvestigationontheincidenceofgastrointestinalparasitesinTibetansheepinTibetwithdifferentgrazingsystemsNumberofpositivesamplesandrate(%)SamplingSampleInfectedEimeriaEntamoebaStrongyleTrichurisNematodirusMonieziaFasciolaCiliatepositionsize(%)spp.spp.spp.spp.spp.spp.spp.spp.Group1n=136117(86.0)104(76.5)18(13.2)81(59.6)22(16.2)9(6.6)7(5.0)6(4.0)1(0)Gongbo'gyamdan=9377(82.8)71(76.3)10(10.8)58(62.4)18(19.4)7(7.5)2(2.2)6(6.5)0Namlingn=4340(93.0)33(76.7)8(18.6)23(53.5)4(9.3)2(4.7)5(11.6)00Xietongmenn=260219(84.2)211(81.2)77(29.2)42(16.2)14(5.4)05(1.9)01(0.4)170Group2n=484439(90.7)387(80.0)169(34.9)25(5.2)6(1.2)8(1.7)00(35.1)Nedongn=3421(61.8)13(38.2)012(35.3)1(2.9)0000Chanangn=290263(90.7)246(84.8)100(34.5)75(25.9)15(5.2)3(1.0)4(1.4)00Konggarn=160155(96.9)128(80.0)69(43.1)83(51.9)9(5.6)3(1.9)4(2.5)00251Totaln=620556(89.7)491(79.2)187(30.2)47(7.6)15(2.4)15(2.4)6(0.9)1(0)(40.5)第20页共71页 3.5不同放牧方式藏羊寄生虫感染情况在不同采样地点中，放牧方式有些差异。本次调查将绵羊和山羊划分为两组，组一（group1）：羊白天放牧，晚上牧民带羊回到定居的居所；组二（group2）：牧民和牧群为游牧方式生活，当羊生产（羊毛剪裁）时牧民和羊群回到定居的居所。不同地区的放牧方式划分如表所示。结果显示，在不同放牧方式的羊的肠道蠕虫混合感染中，在靠近人类居住地放牧羊群的肠道寄生蠕虫感染率高于游牧羊群的肠道寄生虫的感染率，感染率差异显著（P＜0.01）。4.结论与讨论本次调查西藏三个地区的放牧羊群的肠道寄生虫感染率较高89.20%（785/880），肠道寄生虫在每个采样点都有很高的感染率。调查结果和在乌鲁木齐乌鲁木齐（84.7％）和河南省（93.1％）对放牧绵羊的肠道寄生虫调查相似。不同于在巴基斯坦（72％）和印度（66.3％）对放牧绵羊的调查。不同地区和不同采样点的患病率不尽相同。许多因素，如环境，气候，放牧习惯，草料资源和饲料/水污染的潜在污染等因素导致了患病率的差异。对放牧山羊肠道寄生虫感染率的调查低于曹树轩[54]在河南和陕西地区对奶山羊的调查结果（98.1%，310/316），李梦婕[55]对饶山白山羊的调查结果和韩琼琼[56]在云南、贵州对肉用羊的调查结果。对放牧山羊较上述调查感染率低，调查结果符合Morgan[57]的观点。Morgan认为可能的原因有两点，一是干冷地区不适于虫卵（卵囊）的发育，感染率变低；二是虫卵（卵囊）在人类聚居地附近的密度大于草原上的密度，牧群感染的机会相应降低。朱丹[58]调查的结果也和此保持一致。本次调查发现，靠近村庄放牧的羊的蠕虫感染率高于在远离村庄的草原上放牧的羊的肠道蠕虫的感染率。这一发现和Morgan报道的结果一致。但是在球虫中没有显著的差异。结果可能由环境和放牧的方式所影响。线虫需要发育到第三期幼虫才具有感染力，球虫孢子化一般需要2-7天，但是线虫在第三阶段的发育过程中比球虫需要更长的时间和更适宜的温度。因此球虫卵囊可以在各种环境下更有效的感染家畜，线虫的感染可能会出现差异。结果和Cai和Kanyari调查的结果相同。家畜在其定居地点附近的公共土地上放牧也会增加线虫再次感染的风险，并且或多或少地对自由生活阶段的一些线虫创造适宜的环境。本次调查，球虫的感染率比线虫高，它可能由于过去在寄生虫的控制主要集中在的线虫上，而忽视了球虫的预防。蠕虫病是绵羊常见的主要寄生虫病，其中最常见的是线虫病。本次调查发现在蠕虫的感染上圆线虫为优势虫种。然而这一结果和Liu和Dorny对绵羊的调查结果不同，他们调查显示捻转血矛线虫为优势虫种，阳性率粪便为60.0%和68.6%。虽然牧民一年中有4-5次进行广谱驱虫（个人采样、电话询问），但是发现近年来在中国西南地区的大多数调查圆线虫为优势虫种。线虫感染率高可能是由于牧民过度使用抗寄生虫药物，导致对线虫的抗药性，这一现象需要更多的调查或治疗来解决这个问题。本次调查仅在林芝地区检测到人畜共患肝片吸虫。这可能是因为沿着尼洋河的牧场有适宜的温度和湿度，为羊感染提供了很高的机会。而且西藏地区还有较多的人兽共患寄生虫病的发生。在世界不同地区的许多研究人员也报道第21页共71页 了本研究中检测到的其他寄生虫。此外，家畜的其他线虫需要更多的信息和关注，因为它们在治疗和诊断中同样重要。在解晓钰[59]的调查中发现羊感染了13种肠道寄生虫，顾有方[60]与肖芳萍[61]等关于羊的肠道寄生虫种类的调查结果均高于本调查，相比于上述曹树轩[54]和顾有方[60]等对羊的调查，本次发现羊的吸虫的感染率较低。可能与本实验的检测方法有关，粪便沉淀直接抹片的方法对比于尼龙筛水洗法检测率较低。在小反刍动物中，流行最广泛和最易感染的是寄生虫病[62]，其中线虫类病是主要导致羊的亚健康和死亡率上升的最直接因素[63]。羊感染线虫后寄生部位出现不同程度的损伤，使机体免疫力下降，引起一系列症状，严重者甚至死亡[64,65]。王光雷等[66,67]调查家畜感染线虫后会出现不同程度的混合感染。本次调查发现羊感染的蠕虫出现不同虫种的混合感染，和上述报道一致。球虫可引起羊球虫病。羊感染球虫后，摄食量减少、被毛枯燥稀疏，严重影响了养殖业的效益。而由球虫病引起的腹泻是引起羔羊死亡的重要原因[68]。尽管蠕虫被报道[69,70]是放牧羊群中感染最普遍的寄生虫之一，但在本次调查中蠕虫的感染率（20.77%，54/260）低与球虫的感染率（81.2%，211/260）。和阎晓菲[71]的调查结果相一致，而且在阎晓菲在羊消化道寄生虫中球虫和圆线虫的感染率分别为71.38%、36.53%。Borgsteede[72]认为在放牧羊群中羊感染虫卵和卵囊的概率一致，蠕虫感染率应和球虫感染率也应大体一致。但本次调查球虫为优势虫种。球虫感染率较高可能有两方面的原因：一是球虫相比于蠕虫生活史周期短，在合适的温度和湿度下48h左右便可孢子化，而蠕虫的第三阶段幼虫更易受到干冷的条件影响[33]；二是在西藏和中国的其他地区，过去藏羊寄生虫的预防多集中于线虫[73-75]，这也可能是造成球虫感染率较高的原因。本次调查寄生虫混合感染率较高（44.10%，101/229），以球虫和阿米巴的混合感染为主。至今为止，每年有上万的人死于阿米巴病[76]。阿米巴一般情况下不侵害组织，但是否致病取决于虫株的毒力和宿主的自身状况[77]。阿米巴病是一种重要的人兽共患病，人和动物之间可以相互传播[78,79]，本次调查阿米巴感染率较高，应引起重视。综上所述，本次调查山羊肠道寄生虫普遍感染，且发现存在人兽共患风险的阿米巴和纤毛虫，球虫和蠕虫类的感染率均较高，有关部门应采取必要的措施控制肠道寄生虫的传播。第22页共71页 第三章藏羊艾美尔球虫种类形态学鉴定1.引言藏羊是我国优良的家畜品种，作为高原地区的主要家畜[80]，它比其他地区及其品种的羊在生长上更能适应不利条件，而且将低质量植物转化成能量密集的脂肪、肌肉很和奶。近年来，对西藏羊及其畜产品的需求日益增加，因此羊的健康饲养变得格为重要。尽管食品供应链和市场多样化的改变迅速，藏羊在西藏地区的饲养数量仍然最大。虽然藏羊的饲养量多，但是管理、营养和卫生问题仍然困扰着西藏畜牧业。球虫病是由属于艾美球虫属的原生动物寄生虫引起的普遍疾病，并且其可影响多种动物，包括小反刍动物。粪便中的卵囊是感染的主要感染源，家畜可以通过摄食直接传播，因此在一些管理差、环境恶劣和免疫力降低时感染率更高。例如，羔羊在潮湿和脏乱的环境中更易受到一些寄生虫的感染。球虫是各种年龄段的绵羊和山羊中比较常见的寄生虫，但它们主要感染羔羊，并且是羔羊重要的肠道寄生虫。羔羊感染球虫后因腹泻导致生长受阻甚至死亡严重造了巨大的经济损失。而且成年羊是羔羊常见的感染源，它们可持续数月在粪便中排出卵囊。羊可以感染不同种类的艾美尔球虫，但是其中大多数不会引起明显的临床症状，因此球虫的诊断必须伴有种类的鉴定。本研究的目标是使用传统的形态学诊断方法在藏羊粪便中检测和鉴定感染的艾美球虫种类及其感染率。2.材料与方法2.1样本采集见第二章2.1。2.2样本处理见第二章2.2。2.3材料2.3.1主要设备见第二章2.3.1。2.3.2主要试剂及配制见第二章2.3.22.4检测方法2.4.1球虫孢子化培养上述肠道寄生虫检测完成后，对剩余的约10克左右球虫阳性样本粪便进行孢子化培养。将粪便加蒸馏水混匀后经40目不锈钢粪筛滤去粪渣后置于离心机内，3000r/min离心十分钟，弃去上清液后加少量2.5%重铬酸钾溶液与沉淀混匀，倒入一次性培养皿中，再倒入适量的2.5%重铬酸钾溶液覆盖沉淀。28℃培养箱内每隔6小时用一次性吸管进行吹打，并及时添加2.5%重铬酸钾溶液防止干涸，7×24小时后应用饱和蔗糖漂浮法对培养的球虫样品进行富集。2.4.2饱和蔗糖溶液漂浮法球虫孢子化完全后收集培养液，3000r/min离心十分钟，弃去上清液后应用饱和蔗糖溶第23页共71页 液漂浮法（见第二章2.4.3）进行检查。载玻片置于1000×油镜下进行观察。2.5生物学鉴定为确定球虫的种类，将孢子化球虫卵囊置于显微镜（OLYMPUSBX53）下进行鉴定。根据卵囊大小、形状、卵囊结构、内残体的有无和孢子囊形状进行形态学定种[24,77,81-83]。3.结果与分析3.1羊球虫感染情况880份粪便样品中，检测到702份球虫阳性样品。因部分样品球虫感染量小，未进行球虫孢子化培养，本试验对绵羊491份球虫阳性样本中的429份球虫样本和211份球虫阳性样品中的209份球虫样本进行了形态学鉴定，共鉴定出12种绵羊艾美尔球虫和12种山羊艾美尔球虫。在绵羊艾美尔球虫的感染中以小型艾美尔球虫（E.parva）感染率最高感染率为39.4%（244/620），其他种类和感染率分别为颗粒艾美尔球虫（E.granulose)7.7%（48/620），槌型艾美尔球虫（E.crandallis)2.6%（16/620），巴库艾美尔球虫（E.bakuensis)11.0%（68/620），错乱艾美尔球虫（E.intricate)2.7%（17/620），阿撒他艾美尔球虫（E.ahsata)4.5%（28/620），类绵羊艾美尔球虫（E.ovinoidalis)21.8%（135/620），浮氏艾美尔球虫（E.faurei)17.6%（109/620），贡氏艾美尔球虫（E.gonzalezi)8.5%（53/620），苍白艾美尔球虫（E.pallida)31.3%（194/620），马尔西卡艾美尔球虫（E.marsica)12.9%（80/620），温布里吉艾美尔球虫（E.weybridgensis)4.0%（25/620）。山羊艾美尔球虫以艾丽艾美尔球虫（E.alijevi）感染率最高，感染率为52.7%（137/260）。其他山羊艾美尔球虫感染率分别为：苍白艾美尔球虫（E.pallida）50.8%（132/260），克氏艾美尔球虫（E.christenseni）10.8%（28/260），柯察艾美尔球虫（E.kocharli）9.6%（25/260），家山羊艾美尔球虫（E.hirci）8.8%（23/260），阿普艾美尔球虫（E.apsheronica）7.3%（19/260），阿氏艾美尔球虫（E.arloingi）5%（13/260），山羊艾美尔球虫（E.caprina）4.2%（11/260），约奇艾美尔球虫（E.jolchijevi）2.7%（7/260），斑点艾美尔球虫（E.punctata）2.7%（7/260），妮氏艾美尔球虫（E.ninakohlyakimovae）1.5%（4/260），羊艾美尔球虫（E.caprovina）0.4%（1/260）。3.2绵羊球虫种类及孢子化卵囊形态特征3.2.1小型艾美尔球虫（E.parva）：卵囊大小18.1（12.8-22.1）×16.0（12.3-19.5）μm，呈球形，卵囊壁光滑，无极帽，无卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊卵圆形，大小9.0（6.5-11.7）×5.8（4.2-7.3）μm，无斯氏体，有孢子囊残体。3.2.2颗粒艾美尔球虫（E.granulose）：卵囊大小31.3（23.5-35.5）×21.8（17.9-33.0）μm，呈壶型，卵囊壁光滑，有极帽，有卵膜孔，卵膜孔和极帽位于卵囊宽的一端，无卵囊残体，孢子囊卵圆形，大小14.3（10.4-17.4）×7.9（6.5-10.2）μm，有斯氏体，有孢子囊残体。3.2.3槌型艾美尔球虫（E.crandallis）：卵囊大小24.9（20.1-30.7）×19.3（15.4-25.6）μm，宽椭圆形，双层卵囊壁，卵囊壁光滑，有极帽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊宽卵圆形，无斯氏体，有孢子囊残体。3.2.4巴库艾美尔球虫（E.bakuensis）：卵囊大小36.5（24.2-46.1）×26.1（16.1-38.0）μm，第24页共71页 呈椭圆形，卵囊壁光滑，有极帽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊卵圆形，有斯氏体，有孢子囊残体。3.2.5错乱艾美尔球虫（E.intricate）：卵囊大小51.5（43.5-57.4）×38.5（30.2-44.2）μm，呈椭圆形，卵囊壁有横纹，深褐色，有极帽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊长卵圆形，大小20.3（17.4-27.3）×10.7（9.0-13.0）μm，有斯氏体，有孢子囊残体。3.2.6阿撒他艾美尔球虫（E.ahsata）：卵囊大小36.7（28.6-45.6）×23.7（17.9-33.3）μm，呈椭圆或卵圆形，有极帽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊长椭圆型，无斯氏体，有孢子囊残体。3.2.7类绵羊艾美尔球虫（E.ovinoidalis）：卵囊大小26.8（20.5-32.5）×20.0（15.4-28.3）μm，近球形，卵囊壁光滑，无极帽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊长卵圆形，大小12.9（8.2-15.4）×7.5（6.0-9.0）μm，有斯氏体，有孢子囊残体。3.2.8浮氏艾美尔球虫（E.faurei）：卵囊大小33.4（28.2-36.4）×24.7（20.3-29.2）μm，卵圆形，且一端较尖，单层卵囊壁且光滑，无极帽，有内陷的胚孔，无卵囊残体，孢子囊梨形，无斯氏体，有孢子囊残体。3.2.9贡氏艾美尔球虫（E.gonzalezi）：卵囊大小30.6（26.8-34.6）×22.7（20.2-26.0）μm，呈椭圆形，卵囊壁光滑，有极帽，极帽宽扁，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊卵圆形，大小14.3（10.4-17.4）×7.9（6.5-10.2）μm，有斯氏体，有孢子囊残体。3.2.10苍白艾美尔球虫（E.pallida）：卵囊大小18.2（14.3-22.5）×13.2（12.2-15.4）μm，呈长椭圆型，卵囊壁光滑，无极帽，无卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊长卵圆型，大小7.5（5.0-9.1）×4.8（3.1-6.4）μm，无斯氏体，无孢子囊残体。3.2.11马尔西卡艾美尔球虫（E.marsica）：卵囊大小（15-22）×（11-15）μm，呈椭圆形，卵囊壁光滑，无极帽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊长卵圆型，无斯氏体，有孢子囊残体。第25页共71页 3.2.12温布里吉艾美尔球虫（E.weybridgensis）：卵囊大小31.5（27.7-35.3）×22.3（18.4-25.2）μm，呈亚球形，卵囊壁光滑，有极帽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊长卵圆形，大小14.8（12.5-16.1）×7.8（7.2-9.0）μm，无斯氏体，有孢子囊残体。图3-1绵羊孢子化艾美尔球虫卵囊图Fig3-1SporulatedoocystsofEimeriaspeciesinsheepA-小型艾美尔球虫E.parvaB-苍白艾美尔球虫E.pallidaC-类绵羊艾美尔球虫EovinoidalisD-浮氏艾美尔球虫E.faureiE-马尔西卡艾美尔球虫E.marsicaF-巴库艾美尔球虫E.bakuensisG-贡氏艾美尔球虫E.gonzaleziH-颗粒艾美尔球虫E.granuloseI-温布里吉艾美尔球虫E.weybridgensisJ-阿撒他艾美尔球虫E.ahsataK-错乱艾美尔球虫E.intricate;L-槌型艾美尔球虫E.crandallis3.3山羊球虫种类及孢子化卵囊形态特征3.3.1约奇艾美尔球虫（E.jolchijevi）：卵囊大小31.4（27.7-41.6）×22.3（18.4-28.6）μm，呈壶形或罐状，有极帽且极帽稍平，近极帽端较宽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊椭圆形，大小14.3（11.7-16.9）×7.7（6.1-10.4）μm，有斯氏体，有孢子囊残体。3.3.2家山羊艾美尔球虫（E.hirci）：卵囊大小26.1（19.2-30.2）×19.1（15.4-20.8）μm，宽椭圆形，或近似球形，卵囊壁光滑，有极帽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊宽椭圆形，大小11.2（9.0-13.1）×7.7（6.2-9.3）μm，有斯氏体，有孢子囊残体。第26页共71页 3.3.3阿氏艾美尔球虫（E.arloingi）：卵囊大小30.5（25.6-38.7）×21.3（17.9-26.0）µm，椭圆形，两边相对平直，卵囊壁光滑，有极帽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊长椭圆形，大小14.8（13.0-17.9）×7.5（5.6-8.2）μm，无斯氏体，有孢子囊残体。3.3.4克氏艾美尔球虫（E.christenseni）：卵囊大小40.9（36.4-46.1）×26.1（24.3-28.6）μm,卵圆形，卵囊壁光滑，有极帽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊宽椭圆形，大小15.3（13.5-17.4）×9.7（8.2-10.9）μm，斯氏体不明显，有孢子囊残体。3.3.5阿普艾美尔球虫（E.apsheronica）：卵囊大小33.4（22.9-38.4）×24.8（22.5--28.2）µm，尖卵圆形，卵囊外壁较厚，无极帽，有卵膜孔，且卵膜孔内陷成一个小孔，无卵囊残体，孢子囊卵圆形，大小14.5（12.8-17.9）×8.4（7.7-10.2）µm，斯氏体不明显，有孢子囊残体。3.3.6羊艾美尔球虫（E.caprovina）：卵囊大小32.8（26.1-41.1）×26.4（20.5-38.8）μm，短椭圆形或近似球形，卵囊壁光滑，无极帽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊长椭圆形，大小15.3（12.8-17.7）×8.2（7.2-10.4）μm,有斯氏体，有孢子囊残体。3.3.7斑点艾美尔球虫（E.punctata）：卵囊大小30.2（25.6-35.8）×22.3（17.9-25.6）μm，卵囊呈椭圆形、近似球形或卵圆形，卵囊壁粗糙，呈波浪状，有极帽，有卵膜孔，有卵囊残体，孢子囊呈梨形，大小12.1（10.2-15.4）×6.9（5.1-8.2）μm，有斯氏体，有卵囊残体。3.3.8山羊艾美尔球虫（E.caprina）：卵囊大小37.0（28.1-42.9）×25.3（20.5-28.6）μm，椭圆形，卵囊壁光滑，无极帽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊长椭圆形，大小15.8（11.7-18.2）×9.0（6.4-10.4）μm，有斯氏体，有孢子囊残体。3.3.9柯察艾美尔球虫（E.kocharli）：卵囊大小51.5（43.5-57.4）×38.5（30.2-44.2）µm，椭圆形或卵圆形，卵囊表面有颗粒状浮起，有横纹，有极帽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊长椭圆形，大小20.3（17.4-27.3）×10.7（9.0-13.0）μm，有斯氏体，有孢子囊残体。3.3.10妮氏艾美尔球虫（E.ninakohlyakimovae）：卵囊大小24.9（20.5-29.4）×19.7（15.4-25.6）μm，卵圆形，卵囊壁光滑，无极帽，有卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊椭圆形，大小12.9（10.2-15.4）×7.6（6.4-9.1）μm，有斯氏体，有卵囊残体。3.3.11艾丽艾美尔球虫（E.alijevi）：卵囊大小17.8（15.4-21.1）×15.7（12.8-19.5）µm，球形或近似球形，卵囊壁光滑，无极帽，无卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊卵圆形，大小9.5（7.7-11.7）×5.3（4.2-6.5）µm，斯氏体不明显，有孢子囊残体。3.3.12苍白艾美尔球虫（E.pallida）：卵囊大小18.2（14.3-22.5）×13.2（12.2-15.4）µm，长椭圆形，卵囊壁光滑，无极帽，无卵膜孔，无卵囊残体，孢子囊长椭圆形，大小7.5（5.0-9.1）×4.8（3.1-6.4）μm，无斯氏体，无孢子囊残体。第27页共71页 图3-2山羊孢子化艾美尔球虫卵囊图Fig3-2SporulatedoocystsofgoatEimeriaspeciesA-约奇艾美尔球虫（E.jolchijevi）G-斑点艾美尔球虫（E.punctata）B-家山羊艾美尔球虫（E.hirci）H-山羊艾美尔球虫（E.caprina）C-阿氏艾美尔球虫（E.arloingi）I-柯察艾美尔球虫（E.kocharli）D-克氏艾美尔球虫（E.christenseni）J-妮氏艾美尔球虫（E.ninakohlyakimovae）E-阿普艾美尔球虫（E.apsheronica）K-艾丽艾美尔球虫（E.alijevi）F-羊艾美尔球虫（E.caprovina）L-苍白艾美尔球虫（E.pallida）3.4鉴别山羊球虫检索表山羊球虫种类较多，结构上较为相似，但不同种类形态上有差异，依据国内外相关文献[24,77,81-83]和本次检测到的球虫种类，制订了山羊艾美尔球虫检索表（表1），为其他学者在鉴定种类时提供参考。第28页共71页 表3-1山羊艾美尔球虫检索表Table3-1TheidentificationkeysofEimeriaspeciesingoat山羊艾美尔球虫检索表1无极帽（妮氏、山羊、艾丽、羊、阿普、苍白）----------------------------------------2有极帽（约奇、家山羊、阿氏、克氏、斑点、柯察）----------------------------------52卵膜孔不明显，或无，卵囊球形到椭圆形，小型体积（艾丽、苍白）-------------3有卵膜孔卵膜孔不凹陷（山羊、羊、妮氏）----------------------------------------------4有卵膜孔且卵膜孔呈小凹陷--------------------------------------------------------------阿普3卵囊呈球形或近似球形--------------------------------------------------------------------艾丽卵囊呈椭圆形--------------------------------------------------------------------------------苍白4卵囊卵圆形，中小型体积20-29.4×15.4-25.6μm--------------------------------------妮氏卵囊椭圆形，孢子囊长椭圆形，大型体积--------------------------------------------山羊卵囊短椭圆形或近似球形，大型体积-----------------------------------------------------羊5卵囊壁光滑----------------------------------------------------------------------------------------6卵囊壁粗糙----------------------------------------------------------------------------------------76卵囊椭圆形，两侧相对平直--------------------------------------------------------------阿氏卵囊呈罐状-----------------------------------------------------------------------------------约奇卵囊宽椭圆形或近似球形，孢子囊宽椭圆形，中小型体积19.2-30.2×15.4-20.8μm----------------------------------------------------------------------------------------------------家山羊卵囊卵圆形，孢子囊宽卵圆形，大型体积36.4-46.1×24.3-28.6μm---------------克氏7卵囊壁呈波浪花纹状，有卵囊残体，中型体积25.6-35.8×17.9-25.6μm---------斑点卵囊表面有粒状浮起，有横纹，无卵囊残体，大型体积43.5-57.4×30.2-44.2μm---柯察3.5不同地区绵羊球虫种类感染情况本次调查结果显示，在绵羊艾美尔球虫感染种类中E.parva感染率最高，感染率为56.9%（244/429），其次为E.pallida，感染率45.2%（194/429）。E.crandallis的感染率最低，感染率为3.7%（16/429）。调查显示E.parva、E.pallida和E.ovinoidalis为优势感染虫种。不同地区绵羊艾美尔球虫种类感染情况如表所示。第29页共71页 表3-2西藏地区不同地区绵羊艾美尔球虫种类感染情况Table3-2Prevalencerate(no.positive/no.examined×100)ofEimeriaspeciesinsheepinTibet阳性动物数量Numberofpositiveanimals(no.positive/no.identified,%)艾美尔球虫种类总计工布江达南木林乃东扎囊贡嘎EimeriaspeciesTotalGongbo'gyamdaNamlingNedongChanangKonggar(n=12)(n=33)(n=12)(n=245)(n=127)E.parva244(56.9)8(66.7)23(69.7)3(25.0)127(51.8)83(65.4)E.pallida194(45.2)2(16.7)17(51.5)3(25.0)100(40.8)72(56.7)E.ovinoidalis135(31.5)4(33.3)7(21.2)6(50.0)83(33.9)35(27.6)E.faurei109(25.4)2(16.7)4(12.1)3(25.0)72(29.4)28(22.0)E.marsica80(18.6)2(16.7)8(24.2)049(20.0)21(16.5)E.bakuensis68(15.9)1(8.3)12(36.4)2(16.7)41(16.7)12(9.4)E.gonzalezi53(12.4)3(25.0)7(21.2)031(12.7)12(9.4)E.granulose48(11.2)04(12.1)040(16.3)4(3.1)E.weybridgensis25(5.8)4(33.3)4(12.1)1(8.3)11(4.5)5(3.9)E.ahsata28(6.5)03(9.0)2(16.7)18(7.3)5(3.9)E.intricate17(4.0)01(3.0)08(3.3)8(6.3)E.crandallis16(3.7)001(8.3)8(3.3)7(5.5)E.parva60E.granuloseE.crandallis50E.bakuensis40E.intricateE.ahsata30E.ovinoidalis感染率%E.faurei20E.gonzalezi10E.marsicaE.pallida0工布江达县乃东县扎囊县贡嘎县南木林县E.punctataE.weybridgensis图3-3西藏不同地区绵羊艾美尔球虫种类感染情况Fig3-3TheinvestigationofovineEimeriaspeciesindifferentareasinTibet第30页共71页 E.jolchijevi60E.hirciE.arloingi50E.christenseni40E.apsheronicaE.caprovina感染率%30E.punctataE.caprina20E.kocharli10E.ninakohlyakimovaeE.alijevi0E.pallida日喀则地区图3-4西藏日喀则地区谢通门山羊艾美尔球虫种类感染情况调查Fig3-4InvestigationontheinfectionofgoatEimeriaspeciesinTibetShigatsearea,xaitongmoin3.6羊艾美尔球虫混合感染情况本次调查显示山羊与绵羊混合感染2-7种球虫，不同采样地点混合感染率有差异。山羊和绵羊主要感染1~4种球虫，其中感染艾美尔球虫种类中以感染两种不同数量的艾美尔球虫最多(236/638)，检测最多有7种不同的艾美尔球虫的感染。球虫总混合感染率为74.83%，以扎囊县羊球虫混合感染率最高，感染率为80.41%（197/245）。山羊阳性样本中，最多有7种球虫的混合感染，平均感染1.9种球虫。混合感染2、3、4、5、7种球虫的所占的比率分别为38.3%、15.8%、6.7%、0.5%、0.5%。详情见表2图3-5西藏绵羊球虫种类混合感染情况Fig.3-5.PercentagewithsingleormixedinfectionsofdifferentEimeriaspeciesinTibetansheepinTibet第31页共71页 表3-3山羊与绵羊艾美尔球虫混合感染情况Table3-3TheinvestigationmultipleinfectionofovineEimeriaspecies球虫感染含有的种类数混合感染率%采样地总样品种地区（混合感染数/阳点本量1种2种3种4种5种6种7种性总数）工布江林芝93523110058.33（7/12）达县乃东县34633000050.00（6/12）80.41绵羊山南扎囊县290481026023552（197/245）贡嘎县1603841251490070.08（89/127）南木林43789531078.79（26/33）日喀县则谢通门61.7226080803314101县（129/209）山羊74.83总计880184236133571963（547/638）4.结论与讨论在本次调查中，结果显示在西藏地区球虫的感染率较高。本次调查共检测到12种绵羊艾美尔球虫。结果和其他对羊球虫种类的调查大致相同[84,85]。据报道，E.crandallis和E.ovinoidalis[83]是绵羊中的高致病性的艾美尔球虫种类，其他物其他艾美尔球虫种类致病性较低。本次调查显示E.parva，E.pallida和E.ovinoidalis为优势艾美尔球虫种类，但发现藏羊没有明显的临床球虫病的体征或症状。球虫病的临床症状缺乏可能是因为和感染的种类和卵囊密度有关。艾美球虫的混合感染被认为是自然感染的规律[86]。在本次调查中，艾美耳球虫病的两种和三种混合感染最常见（75.76％）。其他调查也报道了类似的结果[84-86]。本次调查中混合感染艾美球虫的种类数量少于Wang[84]和Skirnisson[87]对绵羊球虫种类的报道。球虫病主要对羊的肠道造成损伤，而且是导致羔羊腹泻和死亡率上升的主要原因之一。绵羊感染球虫后会增加细菌、病毒和蠕虫感染的机会[68,88]。国内外很多调查发现并记录了球虫病伴随有蠕虫的感染，并可能是导致死亡率上升的主要原因[85,89]。成年羊感染球虫后可能没有明显的临床症状，但是在严重的情况下，如何蠕虫混合感染时会破坏宿主的寄生虫平衡，增加发病率和死亡率。大量的研究表明羊球虫和蠕虫的感染是正相关的[90,91]。在本次调查中显示混合感染主要是球虫和蠕虫的混合感染。根据Duszynski[92]的调查发现，寄生虫种类间第32页共71页 的混合感染可加重临床症状的严重程度[93]。另外，在球虫可能造成的负面影响方面需要进一步的调查。本次对谢通门区域山羊球虫感染情况调查，结果显示球虫的感染率较为普遍（81.2%，211/260）。和夏晨阳[94]7月份在青藏高原尼木县对放牧山羊的调查（86.7%，1040/1200）、韩琼琼[56]在云南、贵州等高山地区对肉用山羊球虫的调查（88.0%，243/276）的结果相一致，朱丹[58]在河南（95.6%，807/844）、Penzhorn[95]在美国（97.2%，599/616）、Koudela[96]在捷克（92.2%，2671/2897）和Cavalcante[97]于巴西（91.2%，196/215）的结果都高于本调查，这可能因为高山地区较平原温度低，气候不适于卵囊的生长发育[98]。但是远远高于阎晓菲[71]在新疆（71.4%，893/1251）、Cai[33]对宁夏地区放牧山羊（86.7%，26/30）和巴基斯坦Gadahi[99]的报道（43.9%，136/310），可能与空气的湿度对卵囊的感染传播有影响。自Marotel[100]第一次描述山羊的球虫，到如今被描述的山羊球虫多达20种，但其中一些种类被重复描述，且部分种类是在绵羊体内发现而当作山羊感染的种类[24,82]。一些科学家在山羊和绵羊间进行了球虫的交叉感染[101,102]，以期证明山羊和绵羊可以同时感染相同种类的球虫，但都未得到预期结果。综合国内外相关文献，多数学者认为感染山羊球虫有13种[24,103]。本次在谢通门县地区共发现12种山羊艾美尔球虫，其中斑点、柯察、苍白艾美尔球虫在西藏地区首次报道，国内其他地区也有检测记录[82]。据Andrews[104]统计，现有的艾美尔球虫中，阿氏、克氏、家山羊、山羊、妮氏、艾丽艾美尔球虫是在山羊体内发现最多的虫种。本次调查中艾丽和苍白艾美尔球虫为本试验中的优势虫种，李梦婕[55]对尧山白山羊的调查阿氏、克氏、艾丽艾美尔球虫为优势虫种，陶立[105]在广西的调查显示阿氏、艾氏、雅氏、阿普、克氏和约氏艾美耳球虫为优势虫种，涂宜强[106]报道的陕西大耳山羊优势虫种为阿氏、雅氏及艾氏艾美耳球虫。夏晨阳[94]在西藏对放牧山羊球虫的调查艾丽、阿氏、山羊、雅氏、约奇、羊艾美尔球虫为优势虫种。不同地区的优势虫种不同可能与地区的差异、生活环境因素和山羊品种有关，有待进一步的研究。本次调查球虫在山羊体内主要呈现混合感染（61.7%，129/209），混合感染2-7种虫种，和国内外其他学者调查基本一致[84,86,106-108]，但是在目前的研究中涉及的混合感染的虫种的平均数量小于Skirnisson[87]所报道的每个样品平均感染7.4种。球虫的混合感染也被认为是引起山羊球虫病的一个重要因素[109]。山羊感染球虫病时会出现腹泻，甚至死亡。有研究表明，球虫病引起的腹泻可能是引起羊死亡的第二大病因[68]。并且球虫病会伴发感染蠕虫病、肺炎、疥癣等疾病，如果不及时治疗，会导致山羊的死亡率增加。综上所述，西藏谢通门县地区山羊球虫的感染率和混合感染率均较高，且感染虫种较多。本次调查在高原地区首次发现了斑点、柯察、苍白艾美尔球虫，更为重要的的是山羊球虫检索表的制定为今后其他学者进行羊球虫病的防控提供了重要参考。第33页共71页 第34页共71页 第四章藏羊毕氏肠微孢子虫分子生物学鉴定1.引言毕氏肠微孢子虫是一种细胞内专性寄生的病原，感染宿主范围广，包括人类在内的羊等多种脊椎和非脊椎动物，而且在一些水和蔬菜中也能检测到[110-116]。可通过粪口途径进行传播。毕氏肠微孢子虫造成了超过90％的人类微孢子虫病，通常侵入小肠的上皮细胞，导致免疫功能低下的个体，包括获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者的慢性腹泻，吸收不良和消瘦[117]。基于对核糖体内转录间隔区（ITS）区域的序列分析，已经在不同的宿主和水样中鉴定了200多种不同基因型的毕氏肠微孢子虫，其中在人类样品中至少检测到了60种基因型[118,119]。在系统发育分析中，所有的毕氏肠微孢子虫的ITS基因型被划分到至少九个组中[120,121]。第1组，也被称为人畜共患组，造成大多数人类毕氏肠微孢子虫感染，并且包含来自各种动物宿主的绝大多数基因型。组2-8是宿主特异性组，可在大多数动物和环境水源中检测到[122]。在近几年，在绵羊和山羊中进行了一些毕氏肠微孢子虫的调查[46,47]，一些人兽共患基因型也在绵羊和山羊中的调查中发现[42]。但是缺乏关于西藏地区藏羊的毕氏肠微孢子虫的调查。藏羊是我国古老的家畜品种，也是西藏地区主要的家畜品种，藏羊及其藏羊的畜产品具有很高的经济价值。随着“一带一路”沿线国家经济贸易的深入推进和人员的频繁流动，人畜共患传染病的传播风险逐步加大，藏羊和牧民的生活方式也可能增加了一些人兽共患基因型的传播危险。本研究的目的是为了确定西藏部分地区藏羊的微孢子虫流行情况和遗传特征，降低人兽共患病发病风险。2.材料与方法2.1样品来源见第二章2.1。2.2DNA提取粪便样品用OMEGA公司试剂盒提取，提取步骤按照产品说明书进行提取。本次产品编号批次：LotooD4015020000G15O011LotooD4015020000G15O013步骤：A.将存储于2mLEppendorf管中待提取DNA的粪便样品加蒸馏水，混匀后离心，弃去含有重铬酸钾的上清液，重复操作，至上清液澄清。B.弃去上清，留约0.2克左右沉淀，向沉淀中加入0.2克玻璃珠和100μL蒸馏水。加入300μL的buffersp1后用一洁净的枪头往2mLEppendorf管液面下加入10μL的蛋白酶K，Vortex旋涡混合器最大值漩涡振荡15min。C.70℃孵育15分钟后Vortex旋涡混合器最大值震荡1min，70℃孵育5min，再次重复震荡1min、孵育5min。第35页共71页 D.70℃孵育结束后立即置入冰盒冷激2min，后加入100μLBufferSP2（冰上操作），30s混匀后冰浴5min。E.15000r/min离心5min，小心取出2mLEppendorf管，轻轻吸取上层澄清液体（勿吸出沉淀和上层脂肪）至新的1.5mLEppendorf管中。F.向移液后的1.5mLEppendorf管加入混匀的HTRRegent，混匀，室温放置2min使HTRRegent充分吸收吸取上层液体的蛋白质。G.15000r/min离心2min，小心吸取上层澄清液体250μL至新的1.5mLEppendorf管中，并依次加入BL和无水乙醇250μL迅速合上管帽。H.将液体轻轻摇晃均匀，全部转移至DNA收集柱内，15000r/min离心1min，弃去废液及收集管，并将DNA收集柱转移至新的收集管中。I.向DNA收集柱内加入750μLWashBuffer，15000r/min离心1min。J.弃去废液及收集管，并将DNA收集柱转移至新的收集管中，再次15000r/min离心1min。K.将DNA收集柱转移至新的DNA收集管中，打开Eppendorf管管帽，室温放置2min至酒精挥发完全。L.将60℃预热的200μLElutionBuffer加入至DNA收集柱内，室温溶解DNA2min后15000r/min离心1min。M.弃去DNA收集柱，标记信息分装保存DNA。2.3PCR扩增参考Buckholt[123]的方法，根据毕氏肠微孢子虫转录间隔区（ITS）的rRNA序列设计的巢氏PCR引物，以粪便样品DNA为模版，进行PCR扩增。引物序列如表4-1：基于ITS基因的PCR反应体系为25μL反应体系，试验均设置阳性对照和阴性对照。第一轮PCR和第二轮PCR反应条件和反应程序相同。反应体系和反应条件具体如下（KOD-Plus酶产自日本TOYOBO）：表4-1毕氏肠微孢子虫ITSrRNA基因扩增位点的引物Table4-1TheprimersofE.bieneusibasedonITSrRNAgene基因位点退火温度片段大小引物名称序列EBITS3GGTCATAGGGATGAAGAG外55℃435bpEBITS4TTCGAGTTCTTTCGCGCTCITSrRNAEBITS1GCTCTGAATATCTATGGCT内55℃389bpEBITS2.4ATCGCCGACGGATCCAAGTG第36页共71页 扩增体系：KOD-Plusbuffer2.5μLdNTPs（2mM）2.5μLMgSO4（25μm）1.4μLForwardPrimer（25μM）0.5μLReversePrimer（25μM）0.5μLKOD-Plusenzyme（1U/μL）0.5μLDNA1μLDoubledistilledWater16μL总体积25μL反应程序如下：94℃5min94℃30sec55℃30sec35cycle72℃1min72℃10min4℃∞2.4电泳巢氏PCR结束后产物应用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。5μL产物加入Loading加入凝胶孔中，100V电压下电泳25min。电泳结束后置入凝胶成像系统进行凝胶拍照。2.5测序阳性样品委托北京诺赛基因组研究中心有限公司完成，所有阳性样本均进行双向测序。运用Sanger测序法进行测序。2.6DNA序列分析测序结果在NCBI网站上进行Blast搜索，下载覆盖度较高的相关序列，应用ClustalX2.1软件对下载的序列和测序结果进行拼接比对。得到正确完整的测序结果后用MEGA5.0软件构件系统进化树。第37页共71页 3.结果与分析3.1微孢子虫感染情况本试验对880份藏羊粪便全部提取DNA并进行ITS位点PCR扩增，扩增出了118份阳性样品。目的基因片段292bp，部分电泳图片如图4-1所示。其中藏绵羊的毕氏肠微孢子虫感染率为15%（93/620），藏山羊的毕氏肠微孢子虫感染率为9.6%（25/260）。六个地区中，贡嘎县的感染率最高，感染率为23.8%（38/160）；工布江达和乃东仅有一份毕氏肠微孢子虫感染，感染率为1.1%（1/93）和2.9%（1/34）。详情如表所示。图4-1毕氏肠微孢子虫ITS基因部分PCR扩增结果M：DL2000Marker；1-31：样品；N：阴性对照；P：阳性对照Fig.4-1PartialofPCRresultofEnterocytozoonbieneusi.ITSgene.M:DL2000Marker;1-31:samples;N:negativecontrol;P:positivecontrol3.2毕氏肠微孢子虫基因型基于ITS基因位点进行序列比对分析，检测出的118份样品全部测序，共检测出12种基因型，其中I、CHG、BEB6和EpbC为已知基因型，8个新基因型命名为NEW1~8。本次调查中NEW3、NEW4和EbpC是优势基因型。NEW3与BEB6在ITS位点的基因序列相比，碱基第265处G替换成T；NEW4和基因型EbpC在ITS位点的基因序列相比，碱基第324处G替换成A。在贡嘎和扎囊优势感染基因型是NEW3,其中EpbC和NEW4仅在山羊中发现。第38页共71页 检测出的阳性样品中有6份出现混合感染，混合感染基因型为EpbC和NEW4。各地区感染毕氏肠微孢子虫种类如表所示。表4-2西藏不同地区毕氏肠微孢子虫ITS基因型Table4-2ITSgenotypesofEnterocytozoonbieneusiindifferentregionsofTibet地点样品数阳性数感染率基因型（阳性数）StateSampleNoPositiveNoInfectionrateGenotype（PositiveNo）工布江达9311.1%I(1)乃东3412.9%CHG(1)BEB6(3),NEW1(3),NEW2(4),NEW3(35),扎囊2905017.2%NEW5(1),NEW6(2),NEW7(1),NEW8(1),贡嘎1603823.8%NEW2(3),NEW3(33),NEW7(1)南木林4337.0%BEB6(3)谢通门260259.6%EpbC(16),NEW4(16)I(1),CHG(1),BEB6(6),EpbC(16),NEW1(3),总计88011813.4%NEW2(7),NEW3(68),NEW4(16),NEW5(1),NEW6(2),NEW7(2),NEW8(1)3.3种系发育分析获得初始序列后，在NCBI上筛选参考序列并下载参考序列，经ClustalX2.1(http://www.clustal.org/clustal2/#Download)对比后，对原始序列进行必要的手工修改，生成一条校准序列，应用MEGA5.0(https://mega.co.nz/)软件进行系统进化树的构建，进化树使用的邻近算法（Neighbour-joining）是基于双参数模型，可靠性运用bootstrap1000个重复对进化树进行分析。结果显示，检测到的基因型被分到两个组中，其中新基因型NEW4和已命名的EbpC在Group1，7个新基因型（NEW1、NEW2、NEW3、NEW5、NEW6、NEW7和、NEW8）和已命名的genotypeI、BEB6、CHG1在Group2。Group1为人兽共患基因型组，其中的基因型可以感染包括人在内的多种动物。Group2为宿主特异性组。第39页共71页 图4-2基于ITS基因毕氏肠微孢子虫基因型亲缘关系。根据Kimura-2参数模型计算的遗传距离，使用ITS基因构建邻接树。自检值为1000个重复。Figure4-2GenotyperelationshipoftheITSgeneEnterocytozoonbieneusibasedonthegeneticdistancecalculatedbytheKimura-2parametricmodel,contiguoustreeswereconstructedusingtheITSgene.Self-testvalueis1000repetitions第40页共71页 4.结论与讨论在本次调查中，在每个地区均发现有毕氏肠微孢子虫的感染。调查显示，藏绵羊的毕氏肠微孢子虫感染率为15%（93/620），藏山羊的感染率为6.2%（25/260）。Zhao[46]和Jiang[124]等对黑龙江和东北区绵羊的调查显示毕氏肠微孢子虫的感染率为22.5%和13.9%。Ye[125]等人对内蒙古绵羊的毕氏肠微孢子虫调查显示感染率较高，感染率为69.3%。本次调查和在其他地方的调查感染率不同可能和品种、地理环境、季节及生长的环境有关[119,124-127]。本次调查的四种已知的基因型（BEB6、EbpC、genotypeI、CHG1）在其他动物中已有报道[128]。大量报道BEB6可感染人[129]、绵羊[127]、非人灵长类[130,131]、鹿[112]、猫[113]和牛[132]等多种动物，有调查显示在废水[133,134]中也含有BEB6。BEB6首次在美国报道以来[135]，被认为是牛的宿主特异性基因型。随后不久，大量的报道显示BEB6可以感染多种动物，而且几乎在国内外的每个农场都发现了该基因型[127]，这表明该基因型具有广泛的地理分布、广泛的宿主范围和人兽共患潜力。基因型EbpC已经在HIV阳性和阴性患者中发现[129]，而且还在儿童[136]、非人灵长类[130,137]、狗[113]、猪[127,138]、红熊猫[139]甚至在湖泊和城市废水[133]都有报道。在本次的调查中EbpC仅在藏山羊的样品中发现，结果和Shi[42]等对我国部分地区山羊和绵羊的毕氏肠微孢子虫调查结果一致，Zhao[46]等人在内蒙古的调查中也发现EbpC仅感染山羊。有调查显示，家畜可能和人类感染EbpC密切相关。调查显示EbpC在多种家畜中发现，而且在多个在人类中的调查显示EbpC为优势基因型[140]。为避免易感人群患微孢子虫病，应减少他们和家畜的接触，以减少微孢子虫病的传播。基因型也I位于具有宿主特异性的Group2中，但是越来越多的调查发现I可以感染包括人在内的多种动物[141,142]。只依靠ITS位点的进化分析已经不能确定依靠遗传关系的远近来判断基因重组的程度，因此很难判断新发现的8个基因型是否有公共卫生学意义。本次对藏羊毕氏肠微孢子虫调查发现感染藏羊的BEB6、EbpC、genotypeI和CHG1毕氏肠微孢子虫基因型可以感染包括人在内的多种动物。此外，本研究中的BEB6、EbpC、genotypeI和CHG1基因型在湖泊和城市污水中发现，这些都可能导致人和动物的感染。因此，应减少易感人群与山羊或绵羊之间的接触，以减少人畜共患病或人类传染病的传播。而且需要更多的研究来充分阐明山羊和绵羊在人类微孢子虫病流行病学中的重要性。第41页共71页 第42页共71页 第五章藏羊十二指肠贾第虫系统进化分析1.引言十二指肠贾第虫是人类和家畜中常见的肠道寄生虫病原菌。在一些发展中国家，特别是儿童和幼畜中常见有贾第虫的感染[143,144]。尽管一些儿童和幼畜感染贾第虫后不表现出临床症状，一些研究发现人和家畜感染贾第虫后引起营养不良和发育迟缓[145-147]。一个近期的Meta分析表明，营养不良与贾第虫病患者的持续性腹泻有关[148]。基于分子生物学手段和形态学方法，人们把十二指肠贾第虫分成了八个集聚体（A-H），不同的集聚体具有不同的宿主特异性。感染人的主要是集聚体A和B[149,150]。目前，缺乏对西藏藏羊的十二指肠贾第虫的基因分布和一些潜在人兽共患风险的了解。而且一些研究发现感染羊的十二指肠贾第虫主要为集聚体A、B和E，其中E为常见的感染类型。一项在中国的研究发现，羊可能是人兽共患集聚体A和B的储虫宿主，尽管感染羊的优势类型为集聚体E[45,151-154]。分子生物学为鉴定贾第鞭毛虫提供了强大的新工具，对该属内先前未被发现的遗传差异的分析，彻底改变了我们对人类和驯养动物中贾第虫病的分类学，群体遗传学和流行病学的理解。虽然一些简单的PCR检测方法已用于检测临床和环境样品中的贾第虫属，但最新的分子工具用于在物种/组合和基因型水平上区分贾第鞭毛虫。这些工具广泛用于鉴定临床标本中的十二指肠贾第虫的基因型。贾第虫在不同的遗传位点的替代率上有所不同，因此，十二指肠贾第虫分型的分辨率在不同位点之间是不同的。因此，保守的SSUrRNA在基因传统上常用于物种和集合体分化（主要是基因分型），而最易变的基因座TPI经常用于亚型分型。BG和GDH位点的替代率介于SSUrRNA和TPI基因之间，具有广泛的应用范围。十二指肠贾第虫在其他地区和其他动物中报道较多，但是缺乏对以放牧为主的西藏地区藏羊的调查，为了解西藏地区藏羊十二指肠贾第虫的感染情况，我们应用分子生物学手段对藏羊十二指肠贾第虫进行了调查。2.材料与方法2.1样品来源见第二章2.1。2.2DNA提取见第四章2.2。2.3PCR扩增参考Appelbee、Caccio和Sulaiman等的方法，根据十二指肠贾第虫核糖体小亚基RNA（SSUrRNA）、谷氨酸脱氢酶基因(GDH)、磷酸丙糖异构酶基因(TPI)和β-贾第素基因（BG）序列设计的巢氏PCR引物，以粪便样品DNA为模版，进行PCR扩增。引物序列如下：第43页共71页 表5-1十二指肠贾第虫多位点基因扩增位点的引物Table5-1TheprimersofG.duodenalisbasedonthefourgenotypinglocigene基因位退火片段引物名称序列点温度大小Gia2029AAGTGTGGTGCAGACGGACTC外55℃497SSUGia2150cCTGCTGCCGTCCTTGGATGTrRNARH11CATCCGGTCGATCCTGCC内59℃292RH4AGTCGAACCCTGATTCTCCGCCCAGGG7AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC外65℃753G759GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGACBGG759GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC内65℃384G376CATAACGACGCCATCGCGGCTCTCAGGAAGdh1TTCCGTRTYCAGTACAACTC外50℃-Gdh2ACCTCGTTCTGRGTGGCGCAGDHGdh3ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT内50℃520Gdh4GTGGCGCARGGCATGATGCAAL3543AAATIATGCCTGCTCGTCG外55℃605AL3546CAAACCTTITCCGCAAACCTPIAL3544CCCTTCATCGGIGGTAACTT内55℃530AL3545GTGGCCACCACICCCGTGCC基于贾第虫多位点基因的PCR反应体系为25μL反应体系，试验均设置阳性对照后阴性对照。第一轮PCR和第二轮PCR反应条件相同。反应体系和反应条件具体如下（LATaq酶产自日本TaKaRaShuzoCo.,Ltd）：反应体系：GCBuffer12.5μLdNTPs（2.5mM）2μLForwardPrimer（25μM）0.4μLReversePrimer（25μM）0.4μLLATaqenzyme（1U/μL）2μLDNA2μLDoubledistilledWater17.5μL总体积25μL第44页共71页 反应程序如下：SSUrRNAnestedPCR（1st）SSUrRNAnestedPCR（2nd）96℃5min96℃5min96℃45sec96℃45sec55℃30sec35cycle59℃30sec35cycle72℃45sec72℃45sec72℃10min72℃10min4℃∞4℃∞BGnestedPCR（1st）BGnestedPCR（2nd）94℃5min94℃5min94℃30sec94℃30sec65℃30sec35cycle65℃30sec35cycle72℃1min72℃1min72℃10min72℃10min4℃∞4℃∞GDHnestedPCR（1st）GDHnestedPCR（2nd）94℃5min94℃5min94℃30sec94℃45sec50℃30sec35cycle50℃30sec35cycle72℃1min72℃1min72℃10min72℃10min4℃∞4℃∞TPInestedPCR（1st）TPInestedPCR（2nd）94℃5min94℃5min94℃45sec94℃45sec50℃45sec35cycle50℃45sec35cycle72℃1min72℃1min72℃10min72℃10min4℃∞4℃∞第45页共71页 2.4电泳见第四章2.4。2.5测序见第四章2.5。2.6种系发育分析见第四章2.6。3.结果与分析3.1十二指肠贾第虫感染情况本试验对880份粪便DNA进行十二指肠贾第虫的PCR检测，基于SSUrRNA的PCR扩增发现，共扩增出5份贾第虫阳性样品，藏羊十二指肠贾第虫感染率为0.6%（5/880）。部分电泳图片如图所示。仅在藏绵羊中检测到有感染，未能在山羊样品中检测到感染。在调查绵羊的五个地区中，乃东有一份十二指肠贾第虫的感染，扎囊有4份贾第虫的感染。详情见表5-2。表5-2西藏地区藏羊贾第虫感染情况Table5-2TibetansheepgiardiainfectionsituationinTibet地点样品数阳性数感染率基因型（阳性数）StateSampleNoPositiveNoInfectionrateGenotype（PositiveNo）工布江达9300乃东3412.9%E扎囊29041.4%E贡嘎16000南木林4300谢通门26000总计88050.6%3.2十二指肠贾第虫基因型基于多位点TPI、GDH和BG扩增，对阳性样品进行PCR扩增，5份样品在GDH位点阳性，两份样品在BG位点阳性，一份样品在TPI位点阳性。经BLAST比对分析，扩增样品序列属于公认的集聚体E5亚型。未检测到其他亚型。详情如表5-3所示。第46页共71页 表5-3贾第虫不同位点基因亚型感染情况Table5-3TheprevalenceofG.duodenalisandgenotypedistributionsoftheSSUrRNA,bg,gdh,andtpigenes地点样品数阳性数感染率不同位点基因亚型情况StateSampleNoPositiveNoInfectionrateSSUrRNABGGDHTPI工布江达9300乃东3412.9%EE5扎囊29041.4%EE5E5E5贡嘎16000南木林4300谢通门26000总计88050.6%图5-1十二指肠贾第虫16S基因部分扩增产物电泳结果M：Marker；1-22：样品；-：阴性对照；+：阳性对照M:Marker;+:positivecontrol;-:negativecontrol;1-22:SamplesFigure5Electrophoresisresultsofpartialamplificationproductsof16SgeneintheGiardia3.3种系发育分析为了解本次扩增出的贾第虫GDH序列和其他种群的亲缘关系，本调查在NCBI上筛选了部分贾第虫参考序列并下载参考序列，应用MEGA5.0(https://mega.co.nz/)软件对贾第虫进行系统进化树的构建。见图5-2。基于GDH基因建立系统进化树构建发现，和其他集聚体E在同一枝上。如图5-2。较多的亚型可能是因为十二指肠贾第虫存在地理隔离现象。第47页共71页 图5-2基于GDH基因十二指肠贾第虫基因型亲缘关系。根据Kimura-2参数模型计算的遗传距离，使用GDH基因构建邻接树。自检值为1000个重复。Figure4-2GenotyperelationshipoftheGDHgeneG.duodenalisbasedonthegeneticdistancecalculatedbytheKimura-2parametricmodel,contiguoustreeswereconstructedusingtheGDHgene.Self-testvalueis10004.结论与讨论十二指肠贾第虫是羊体内常见的寄生虫，尽管不同地区贾第虫的感染率差别很大。在本次调查中，十二指肠贾第虫的感染率为0.6%（5/880），感染率低于Zhang等人[155]在黑龙江对绵羊和Olson[156]在加拿大的调查。Rayn等人和Gomez-Munoz[157]等人在比利时和西班牙的调查也都高于本研究。贾第虫存在较多的亚型，不同地区调查发现贾第虫基因亚型不同可能是因为十二指肠贾第虫存在地理隔离。其他调查也发现贾第虫可能存在地理隔离的现象。第48页共71页 在加拿大的一项调查中发现，羔羊比成年羊更易感染贾第虫[156]。澳大利亚Ryan等人[152]也发现羔羊感染贾第虫的概率是成年羊的七倍。巴西的一项调查[158]发现羊感染贾第虫的感染率为34%，其中成年羊的感染率仅为2%。而在意大利对绵羊的调查[151]显示检测到的贾第虫全为羔羊。在我国内蒙古，Ye等人对绵羊的调查[137]也发现羔羊的感染率显著高于成年羊。贾第虫可对羊的肠道粘膜造成损伤[159]，羔羊较于成年羊，免疫力较低，更易感染贾第虫，也更易出现贾第虫病。国内外多项调查已经对绵羊体内感染的贾第虫进行了基因型的研究[137,151]。在这些研究中发现，贾第虫集聚体E相对比于人兽共患基因型集聚体A是优势感染基因型。集聚体E常见感染有蹄类动物，包括绵羊。然而，最近的两份报告显示贾第虫可以在家畜和灵长类之间进行传播。一项在埃及的调查从人的粪便中分离出了集聚体E分离株[160]，在乌干达[161]发现非人灵长类红疣猴感染的贾第虫为集聚体E，而且发现该贾第虫可以感染人。因此，对于研究人类和家畜中十二指肠贾第虫流行病学、跨物种传播生态学和临床诊疗至关重要。多项研究发现，在基因型和基因亚型上基于十二指肠贾第虫的单基因核苷酸分析已经不足以评估由人兽共患传播风险。因此，近几年来，多位点分析已经成为基因分型和基因亚型分型的必要条件，它在爆发监测、追踪污染源及评估动物间的传播潜力中扮演着重要的角色[162-164]。为更好的了解贾第虫的传播、流行特性和人兽共患风险分析，多位点分析至关重要。第49页共71页 第50页共71页 结论与创新点结论1.对我国西藏部分地区藏羊肠道寄生虫进行调查，发现肠道寄生虫的感染率为89.2%，共发现了8种寄生虫：阿米巴原虫、圆线虫、毛首线虫、细颈线虫、莫尼茨绦虫、肝片吸虫和纤毛虫。以球虫和圆线虫感染率最高，为79.8%（702/880）和33.3%（293/880）。应用统计学分析发现在靠近村庄放牧和在远离村庄游牧羊群的线虫感染率有差异。2.通过对球虫的孢子化培养发现绵羊感染艾美尔球虫12种，山羊感染艾美尔球虫12种。在绵羊艾美尔球虫的感染中以小型艾美尔球虫（E.parva）感染率最高感染率为39.4%（244/620），山羊艾美尔球虫以艾丽艾美尔球虫（E.alijevi）感染率最高，感染率为52.7%（137/260）；并制定了山羊艾美尔球虫鉴定表。3.对藏羊的毕氏肠微孢子虫进行了分子流行病学调查，感染率为13.4%（118/880）。基于ITS基因位点进行序列比对分析，共检测出12种基因型。不同基因型间有较高的同源性，检测到的基因型被分到两个组中，其中新基因型NEW4和已命名的EbpC在人兽共患基因型组，7个新基因型（NEW1、NEW2、NEW3、NEW5、NEW6、NEW7和、NEW8）和已命名的genotypeI、BEB6、CHG1在Group2。4.对藏羊进行了十二指肠贾第虫进行了分子流行病学调查，感染率为0.6%（5/880）。感染类型为集聚体E。创新点1.本研究首次报道了藏羊肠道寄生虫感染情况。并发现在不同放牧方式下线虫的感染率有差异。2.对藏羊的艾美尔球虫种类进行了调查，并制定了山羊艾美尔球虫鉴定表。3.首次对西藏地区藏羊的毕氏肠微孢子虫和十二指肠贾第虫进行了分子流行病学调查和遗传进化进行了分析。鉴定出毕氏肠微孢子虫的新基因型8个，且一个新基因型属人兽共患基因型。第51页共71页 第52页共71页 参考文献[1]李森,董玉祥,董光荣,等.青藏高原土地沙漠化区划[J].中国沙漠,2001,21(4):418-27.[2]刘淑珍,范建容,周麟.西藏自治区草地退化及其发展趋势分析[J].2002,[3]廖顺宝,孙九林.基于GIS的青藏高原人口统计数据空间化[J].地理学报,2003,58(1):25-33.[4]纪素玲,佘永新,田发益.科技是西藏草地畜牧业可持续发展的关键[J].草业科学,2002,19(11):58-60.[5]HUANGJ,LIY,LUOY.BacterialcommunityintherumenofTibetansheepandGansualpinefine-woolsheepgrazingontheQinghai-TibetanPlateau,China[J].JournalofGeneral&AppliedMicrobiology,2017,63(2):122.[6]王永,王杰.不同生态区藏山羊的产绒性能研究[J].草业与畜牧,1998,3):57-62.[7]秦小静.西藏自治区畜牧业与乡村人口的时空格局及耦合关系[D];西华师范大学,2016.[8]周杨.藏北牧民居住文化变迁调查——以西藏改则县为例[J].西藏科技,2016,(9):40-2.[9]LIK,JIANGJ,SHAHZADM,etal.Revealingtheparasiticinfectionindiarrheicyaksbypilotinghigh-throughputsequencing[J].Microbialpathogenesis,2018,[10]FENGX,QIX,YANGL,etal.HumancysticandalveolarechinococcosisintheTibetAutonomousRegion(TAR),China[J].JournalofHelminthology,2015,89(6):671-9.[11]何劲.西藏畜牧业发展的现状、困难及对策[J].西藏科技,2007,5):51-3.[12]NKOUAWAA,HAUKISALMIV,LIT,etal.Crypticdiversityinhymenolepididtapewormsinfectinghumans[J].ParasitologyInternational,2016,65(2):83.[13]XIEZC,FENGQH,LIUCH.ModelingtheVariationofGlacierSystem——TakingtheSouthernTibetRegionasanExample[J].JournalofGlaciolgy&Geocryology,2002,[14]黄兵,董辉,沈杰,等.中国家畜家禽球虫种类概述[J].中国预防兽医学报,2004,26(4):313-6.[15]郑江,周晓农,梁幼生,等.辉煌的成就神圣的使命[J].中国血吸虫病防治杂志,2008,3):[16]XUX,ZHANGY,LIND,etal.SerodiagnosisofSchistosomajaponicuminfection:genome-wideidentificationofaproteinmarker,andassessmentofitsdiagnosticvalidityinafieldstudyinChina[J].LancetInfectiousDiseases,2014,14(6):489-97.[17]HERDRP.TheparasiticlifecycleofChabertiaovina(Fabricius,1788)insheep[J].InternationalJournalforParasitology,1971,1(2):189-99.[18]BREMNERKC.CytologicalpolymorphisminthenematodeHaanchuscontortus(Rudolphi1803)Cobb1898[J].Nature,1954,174(4432):704.[19]BALDURSSONS,KARANISP.Waterbornetransmissionofprotozoanparasites:reviewofworldwideoutbreaks-anupdate2004-2010[J].WaterResearch,2011,45(20):6603-14.第53页共71页 [20]ZIERDTC.Blastocystishominis,along-misunderstoodintestinalparasite[J].ParasitologyToday,1988,4(1):15-7.[21]DUNNL,BOREHAMP,STENZELD.UltrastructuralvariationofBlastocystishominisstocksinculture[J].Internationaljournalforparasitology,1989,19(1):43-56.[22]JIANGJB,HEJG.TaxonomicstatusofBlastocystishominis[J].Parasitologytoday(Personaled),1993,9(1):2-3.[23]左仰贤.球虫学:畜禽和人体的球虫与球虫病[M].天津科学技术出版社,1992.[24]汪明.绵羊与山羊艾美耳球虫种类的命名与鉴别[J].中国兽医杂志,1990,1):42-4.[25]SHAHHL.Coccidia(Protozoa:Eimeriidae)ofdomesticsheepintheUnitedStates,withdescriptionsofthesporulatedoocystsofsixspecies[J].TheJournalofparasitology,1963,799-807.[26]NAKAIY,MORIZANEK.ThecoccidianoocystsofBlackbellyBarbadossheep[J].JapaneseJournalofZootechnicalScience,1990,61(11):1023-7.[27]王海燕.河南省家畜的三种肠道原虫分子流行病学调查[D];中国农业大学,2015.[28]LIJ,LUON,WANGC,etal.Occurrence,molecularcharacterizationandpredominantgenotypesofEnterocytozoonbieneusiindairycattleinHenanandNingxia,China[J].Parasites&Vectors,2016,9(1):1-5.[29]HUS,LIUZ,YANF,etal.Zoonoticandhost-adaptedgenotypesofCryptosporidiumspp.,GiardiaduodenalisandEnterocytozoonbieneusiindairycattleinHebeiandTianjin,China[J].VeterinaryParasitology,2017,68-73.[30]RYANU,HIJJAWIN,XIAOL.Foodbornecryptosporidiosis[J].InternationalJournalforParasitology,2017,[31]FENGY,XIAOL.ZoonoticpotentialandmolecularepidemiologyofGiardiaspeciesandgiardiasis[J].ClinicalMicrobiologyReviews,2011,24(1):110.[32]LIUQ,LIMW,WANGZD,etal.Humansparganosis,aneglectedfoodbornezoonosis[J].LancetInfectiousDiseases,2015,15(10):1226-35.[33]CAIKZ,BAIJL.InfectionintensityofgastrointestinalnematodosisandcoccidiosisofsheepraisedunderthreetypesoffeedingandmanagementregimsinNingxiaHuiAutonomousRegion,China[J].SmallRuminantResearch,2009,85(2):111-5.[34]王荣军.我国局部地区隐孢子虫分子流行病学研究[D];河南农业大学,2011.[35]BOUZIDM,HUNTERPR,CHALMERSRM,etal.Cryptosporidiumpathogenicityandvirulence[J].ClinicalMicrobiologyReviews,2013,26(1):115.[36]KARIMMR.中国非人灵长类隐孢子虫、贾第虫及微孢子虫的分子流行病学研究和多位点基因分型[D];河南农业大学,2014.[37]KAPLANRM.Drugresistanceinnematodesofveterinaryimportance:astatusreport[J].Trends第54页共71页 inParasitology,2004,20(10):477-81.[38]杨文科.春季高潮和消化道线虫感染之间的关系[J].新疆畜牧业,2007,4):50-1.[39]PEEKR,REEDEKERFR,VANGT.DirectamplificationandgenotypingofDientamoebafragilisfromhumanstoolspecimens[J].JournalofClinicalMicrobiology,2004,42(2):631.[40]PUMIDONMINGW,WALOCHNIKJ,DAUBERE,etal.BindingtocomplementfactorsandactivationofthealternativepathwaybyAcanthamoeba[J].Immunobiology,2011,216(1–2):225-33.[41]POUTDD.Coccidoisisofsheep:areview[J].VeterinaryRecord,1976,98(17):340-1.[42]KES,LIM,WANGX,etal.MolecularsurveyofEnterocytozoonbieneusiinsheepandgoatsinChina[J].Parasites&Vectors,2016,9(1):23.[43]陈筱侠.寄生虫与适应性免疫应答的协同进化[J].中国动物传染病学报,1994,2):64-7.[44]朱兴全.全国高等院校教材小动物医学系列教材小动物寄生虫病学[M].中国农业科学技术出版社,2006.[45]WANGH,QIM,ZHANGK,etal.PrevalenceandgenotypingofGiardiaduodenalisisolatedfromsheepinHenanProvince,CentralChina[J].InfectionGenetics&Evolution,2016,39(330-5.[46]ZHAOW,ZHANGW,YANGD,etal.PrevalenceofEnterocytozoonbieneusiandgeneticdiversityofITSgenotypesinsheepandgoatsinChina[J].InfectionGenetics&Evolution,2015,32(265-70.[47]ZHANGQ,CAIJ,LIP,etal.EnterocytozoonbieneusigenotypesinTibetansheepandyaks[J].ParasitologyResearch,2018,117(1-2):1-7.[48]李允鹤.寄生虫病免疫学及免疫诊断[M].江苏科学技术出版社,1991.[49]朱雪龙,黄兵,韩红玉,等.柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶真核表达质粒的构建及其在DF-1细胞中的表达[J].中国动物传染病学报,2016,24(3):48-54.[50]DARANIHY,YAZDANIH,SHARAFISM.DiagnosisofGiardialambliainfectionusingDotBlotinComparisonwithParasitologicalMethods[J].InfectiousDisordersDrugTargets,2016,16(999):[51]边琼.西藏常见畜禽寄生虫病的诊断与防治探析[J].西藏科技,2011,8):52-4.[52]孔繁瑶.家畜寄生虫学(第2版修订版)[M].中国农业大学出版社,2010.[53]索勋.高级寄生虫学实验指导[M].中国农业科学技术出版社,2005.[54]曹树轩,张志敏,崔艳艳,等.我国部分地区奶山羊肠道寄生虫感染情况调查[J].河南农业科学,2015,44(10):146-9.[55]李梦婕,朱丹,齐萌,等.尧山白山羊肠道寄生虫感染情况调查[J].中国畜牧兽医,2012,39(3):191-4.[56]韩琼琼.我国亚热带地区人工放牧草地肉羊寄生虫感染情况调查[D];河南农业大学,2014.[57]MORGANER,TORGERSONPR,SHAIKENOVBS,etal.Agriculturalrestructuringand第55页共71页 gastrointestinalparasitismindomesticruminantsontherangelandsofKazakhstan[J].VeterinaryParasitology,2006,139(1):180-91.[58]朱丹,吕亚莉,李梦婕,等.我国部分地区山羊肠道寄生虫感染情况调查[J].中国草食动物科学,2013,33(1):43-6.[59]解晓钰.博州地区羊消化道寄生虫感染调查及冬季驱虫试验研究[D];新疆农业大学,2009.[60]顾有方,李文超,王立克,等.安徽省山羊肠道寄生虫感染情况调查[J].畜牧与兽医,2014,46(10):100-3.[61]肖芳萍,周思旋,刘辉,等.山羊消化道寄生虫感染情况调查及防制[J].中国畜牧兽医,2012,39(3):195-7.[62]TORRES-ACOSTAJFJ,HOSTEH.Alternativeorimprovedmethodstolimitgastro-intestinalparasitismingrazingsheepandgoats☆[J].SmallRuminantResearch,2008,77(2–3):159-73.[63]SYKESAR.Parasitismandproductioninfarmanimals[J].AnimalScience,1994,59(2):155-72.[64]唐仲璋.人畜线虫学[M].科学出版社,1987.[65]詹希美.人体寄生虫学[J].2005,[66]王光雷,努素甫,周自富,等.寄生虫病的危害、诊断及综合防制(上)[J].草食家畜,1996,3):41-5.[67]王光雷,努素甫.寄生虫病的危害,诊断及综合防制(下)[J].草食家畜,1996,4):51-4.[68]KUSILUKALJM,KAMBARAGEDM,HARRISONLJS,etal.CausesofmorbidityandmortalityingoatsinMorogorodistrict,Tanzania:Theinfluenceofmanagement[J].SmallRuminantResearch,1998,29(2):167-72.[69]刘毅,曹小明,谭美英,etal.南方山地牧场绵羊消化道线虫感染情况调查及虫卵季节动态的观察[J].中国兽医杂志,2003,39(11):9-10.[70]TARIQKA,CHISHTIMZ,AHMADF,etal.EpidemiologyofgastrointestinalnematodesofsheepmanagedundertraditionalhusbandrysysteminKashmirvalley[J].VeterinaryParasitology,2008,158(1–2):138-43.[71]阎晓菲,黄兵,童婷,等.乌鲁木齐县羊消化道寄生虫感染季节动态变化调查[J].中国动物传染病学报,2016,5):39-45.[72]BORGSTEEDEFH,DERCKSENDP.CoccidialandhelminthinfectionsingoatskeptindoorsintheNetherlands[J].VeterinaryParasitology,1996,61(3-4):321-6.[73]永荣.乌审旗地区绵羊蠕虫病流行病学调查及驱虫效果比较研究[D];内蒙古农业大学,2010.[74]刘文道.草原畜牧业与寄生虫病防治研究[J].青海畜牧兽医杂志,1995,2):28-31.[75]米玛顿珠,米玛.西藏牧区家畜寄生虫病防治对策[J].湖北畜牧兽医,2010,1):25-7.[76]JRWAP,HAQUER,MANNBJ.TheBittersweetInterfaceofParasiteandHost:Lectin-第56页共71页 CarbohydrateInteractionsDuringHumanInvasionbytheParasiteEntamoebahistolytica[J].AnnualReviewofMicrobiology,2002,56(1):39.[77]蒋金书.动物原虫病学[M].中国农业大学出版社,2000.[78]黄道超,杨光友,王强,等.人和动物阿米巴原虫病研究进展[J].动物医学进展,2006,27(5):51-5.[79]PAIHH,KOYC,CHENER.Cockroaches(PeriplanetaamericanaandBlattellagermanica)aspotentialmechanicaldisseminatorsofEntamoebahistolytica[J].ActaTropica,2003,87(3):355-9.[80]西藏自治区农牧厅,西藏自治区畜牧总站.西藏畜禽品种遗传资源[M].中国农业大学出版社,2010.[81]BECKERER.CoccidiaandCoccidiosisofDomesticated,GameandLaboratoryAnimalsandofMen[J].AmericanJournaloftheMedicalSciences,1934,188(3):415.[82]卫九健.我国部分地区羊球虫种类及梨形虫病分子流行病学调查[D];河南农业大学,2013.[83]CHARTIERC,PARAUDC.CoccidiosisduetoEimeriainsheepandgoats,areview☆[J].SmallRuminantResearch,2012,103(1):84-92.[84]WANGCR,XIAOJY,CHENAH,etal.PrevalenceofcoccidialinfectioninsheepandgoatsinnortheasternChina[J].VeterinaryParasitology,2010,174(3-4):213.[85]JALILAA,DORNYP,SANIR,etal.CoccidialinfectionsofgoatsinSelangor,peninsularMalaysia[J].VeterinaryParasitology,1998,74(2):[86]ABO-SHEHADAMN,ABO-FARIEHAHA.PrevalenceofEimeriaspeciesamonggoatsinnorthernJordan[J].SmallRuminantResearch,2003,49(2):109-13.[87]SKIRNISSONK.Eimeriaspp.(Coccidia,Protozoa)infectionsinaflockofsheepinIceland:Speciescompositionandseasonalabundance[J].IcelandicAgriculturalSciences,2007,20(20):73-80.[88]PEELEREJ,WANYANGUSW.InfectiouscausesofsmallruminantmortalityinKenya:Areview[J].SmallRuminantResearch,1998,29(1):1-11.[89]CATCHPOLEJ,HARRISTJ.InteractionbetweencoccidiaandNematodirusbattusinlambsonpasture[J].VeterinaryRecord,1989,124(23):603.[90]CHHABRARC,PANDEYVS.PrevalenceofcoccidiainsheepinZimbabwe[J].SmallRuminantResearch,1992,8(3):257-64.[91]YUSOFAM,ISAMLM.PrevalenceofgastrointestinalnematodiasisandcoccidiosisingoatsfromthreeselectedfarmsinTerengganu,Malaysia[J].AsianPacificJournalofTropicalBiomedicine,2016,6(9):735-9.[92]DUSZYNSKIDW,UPTONSJ.EntericProtozoans:Cyclospora,Eimeria,Isospora,andCryptosporidiumspp[M].IowaStateUniversityPress,2008.第57页共71页 [93]DUSZYNSKID,UPTONSJ.Cyclospora,Eimeria,IsosporaandCryptosporidiumspp[J].2001,[94]夏晨阳,刘建枝,宋天增,等.西藏尼木县山羊球虫感染情况的调查[J].动物医学进展,2015,36(9):120-3.[95]PENZHORNBL,ROGNLIEMC,HALLLL,etal.EntericcoccidiaofCashmeregoatsinsouthwesternMontana,USA[J].VeterinaryParasitology,1994,55(1–2):137-42.[96]KOUDELAB,BOKOVA.CoccidiosisingoatsintheCzechRepublic[J].VeterinaryParasitology,1998,76(4):261-7.[97]CAVALCANTEACR,TEIXEIRAM,MONTEIROJP,etal.EimeriaspeciesindairygoatsinBrazil☆[J].VeterinaryParasitology,2012,183(3–4):356-8.[98]DUSZYNSKIDW,WILBERPG.AguidelineforthepreparationofspeciesdescriptionsintheEimeriidae[J].JournalofParasitology,1997,83(2):333.[99]GADAHIJA,ARSHEDMJ,ALIQ,etal.PrevalenceofgastrointestinalparasitesofsheepandgoatinandaroundRawalpindiandIslamabad,Pakistan[J].VeterinaryWorld,2009,2(2.000):51-3.[100]MOUSSUG,MAROTELG.Lacoccidiosedumoutonetsonparasite[J].1902,[101]MCDOUGALD,L.R.Attemptedcross-transmissionofcoccidiabetweensheepandgoatsanddescriptionofEimeriaovinoidalissp.n[J].JournalofEukaryoticMicrobiology,1979,26(1):109-13.[102]TSYGANKOVA,PAICHUKN,BALBAEVAZ.Onspecificityofcoccidiainsheep,goatsandrabbits[J].TrInstZoolAkadNaukKazSSR,1963,19(55-7.[103]彭德旺,杨延桂,葛兆宏,等.山羊和绵羊的球虫种类与形态[J].中国动物传染病学报,1994,4):52-5.[104]ANDREWSAH.Someaspectsofcoccidiosisinsheepandgoats[J].SmallRuminantResearch,2013,110(2–3):93-5.[105]陶立,韦志锋,兰美益,等.广西圈养山羊球虫种类和感染状况的调查[J].畜牧与兽医,2011,43(4):82-5.[106]涂宜强,简永利,高永安.陕西省某羊场简阳大耳山羊球虫感染情况调查及种类鉴定[J].动物医学进展,2016,37(6):132-5.[107]杜立中.河南省部分地区羊寄生虫感染情况调查及临床驱虫试验[D];南京农业大学,2004.[108]KARAM.TheprevalenceofcoccidianspeciesinsheepinKarsprovinceofTurkey[J].Tropicalanimalhealthandproduction,1999,31(3):161-5.[109]STNK,NAVARRECB.CoccidiosisinLargeandSmallRuminants[J].VeterinaryClinicsofNorthAmericaFoodAnimalPractice,2017,[110]ZHANGZ,HUANGJY,KARIMMR,etal.ZoonoticEnterocytozoonbieneusigenotypesinPere第58页共71页 David'sdeer(Elaphurusdavidianus)inHenan,China;proceedingsofthe中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会论文集,F,2015[C].[111]ZHOU,PENG,CHEN,etal.Food-borneparasiticzoonosesinChina:perspectiveforcontrol[J].TrendsinParasitology,2008,24(4):190-6.[112]ZHAOW,ZHANGW,WANGR,etal.Enterocytozoonbieneusiinsikadeer(Cervusnippon)andreddeer(Cervuselaphus):deerspecificityandzoonoticpotentialofITSgenotypes[J].ParasitologyResearch,2014,113(11):4243.[113]KARIMMR,DONGH,YUF,etal.GeneticdiversityinEnterocytozoonbieneusiisolatesfromdogsandcatsinChina:hostspecificityandpublichealthimplications[J].JournalofClinicalMicrobiology,2014,52(9):3297-302.[114]KARIMMR,YUF,LIJ,etal.Firstmolecularcharacterizationofentericprotozoaandthehumanpathogenicmicrosporidian,Enterocytozoonbieneusi,incaptivesnakesinChina[J].Parasitologyresearch,2014,113(8):3041-8.[115]SANT-NM,FAYERR.Microsporidiosis:Enterocytozoonbieneusiindomesticatedandwildanimals[J].ResearchinVeterinaryScience,2011,90(3):363-71.[116]CORRADIN.Microsporidia:EukaryoticIntracellularParasitesShapedbyGeneLossandHorizontalGeneTransfers[J].AnnualReviewofMicrobiology,2015,69(69):167.[117]DIDIERES,WEISSLM.Microsporidiosis:currentstatus[J].CurrentOpinioninInfectiousDiseases,2006,19(5):485.[118]YANGJ,SONGM,WANQ,etal.EnterocytozoonbieneusigenotypesinchildreninNortheastChinaandassessmentofriskofzoonotictransmission[J].JournalofClinicalMicrobiology,2014,52(12):4363.[119]ZHAOW,ZHANGW,YANGZ,etal.GenotypingofEnterocytozoonbieneusiinFarmedBlueFoxes(Alopexlagopus)andRaccoonDogs(Nyctereutesprocyonoides)inChina[J].PlosOne,2015,10(11):e0143992.[120]KARIMMR,DONGH,LIT,etal.PredominationandNewGenotypesofEnterocytozoonbieneusiinCaptiveNonhumanPrimatesinZoosinChina:HighGeneticDiversityandZoonoticSignificance[J].PlosOne,2015,10(2):e0117991.[121]FAYERR,SANTIN‐DURANM.Epidemiologyofmicrosporidiainhumaninfections[J].Microsporidia:PathogensofOpportunity,FirstEdition,2014,135-64.[122]GUOY,ALDERISIOKA,YANGW,etal.HostSpecificityandSourceofEnterocytozoonbieneusiGenotypesinaDrinkingSourceWatershed[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2014,80(1):218-25.[123]BUCKHOLTMA,LEEJH,TZIPORIS.PrevalenceofEnterocytozoonbieneusiinSwine:an18-第59页共71页 MonthSurveyataSlaughterhouseinMassachusetts[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2002,68(5):2595-9.[124]JIANGY,TAOW,WANQ,etal.ZoonoticandPotentiallyHost-adaptedEnterocytozoonbieneusiGenotypesinSheepandCattleinNortheastChinaandAnIncreasingConcernonZoonoticImportanceofPreviouslyConsideredRuminant-adaptedGenotypes[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2015,81(10):3326-35.[125]YEJ,XIAOL,WANGY,etal.DominanceofGiardiaduodenalisassemblageAandEnterocytozoonbieneusigenotypeBEB6insheepinInnerMongolia,China[J].VeterinaryParasitology,2015,210(3–4):235-9.[126]LORESB,DELÁGUILAC,ARIASC.Enterocytozoonbieneusi(microsporidia)infaecalsamplesfromdomesticanimalsfromGalicia,Spain[J].MemóriasdoInstitutoOswaldoCruz,2002,97(7):941-5.[127]LIW,LIY,LIW,etal.GenotypesofEnterocytozoonbieneusiinlivestockinChina:highprevalenceandzoonoticpotential[J].PlosOne,2014,9(5):e97623.[128]QIM,LIJ,ZHAOA,etal.HostspecificityofEnterocytozoonbieneusigenotypesinBactriancamels(Camelusbactrianus)inChina[J].Parasites&Vectors,2018,11(1):219.[129]WANGL,ZHANGH,ZHAOX,etal.ZoonoticCryptosporidiumspeciesandEnterocytozoonbieneusigenotypesinHIV-positivepatientsonantiretroviraltherapy[J].JournalofClinicalMicrobiology,2013,51(2):557.[130]KARIMMR,WANGR,DONGH,etal.GeneticpolymorphismandzoonoticpotentialofEnterocytozoonbieneusifromnonhumanprimatesinChina[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2014,80(6):1893.[131]DUSZ,ZHAOGH,SHAOJF,etal.Cryptosporidiumspp.,Giardiaintestinalis,andEnterocytozoonbieneusiinCaptiveNon-HumanPrimatesinQinlingMountains[J].KoreanJournalofParasitology,2015,53(4):395.[132]ZHAOGH,DUSZ,WANGHB,etal.FirstreportofzoonoticCryptosporidiumspp.,GiardiaintestinalisandEnterocytozoonbieneusiingoldentakins(Budorcastaxicolorbedfordi)[J].InfectionGenetics&Evolution,2015,34(394-401.[133]LIN,XIAOL,WANGL,etal.MolecularsurveillanceofCryptosporidiumspp.,Giardiaduodenalis,andEnterocytozoonbieneusibygenotypingandsubtypingparasitesinwastewater[J].PLoSNeglectedTropicalDiseases,6,9(2012-9-6),2012,6(9):e1809.[134]XIAOS,YANZ,ZHAOX,etal.PresenceandmolecularcharacterizationofCryptosporidiumandGiardiainrecreationallakewaterinTianjin,China:apreliminarystudy[J].SciRep,2018,8(1):[135]FAYERR,SANTNM,TROUTJM.Enterocytozoonbieneusiinmaturedairycattleonfarmsin第60页共71页 theeasternUnitedStates[J].ParasitologyResearch,2007,102(1):15-20.[136]WANGL,XIAOL,DUANL,etal.ConcurrentinfectionsofGiardiaduodenalis,Enterocytozoonbieneusi,andClostridiumdifficileinchildrenduringacryptosporidiosisoutbreakinapediatrichospitalinChina[J].PLoSneglectedtropicaldiseases,2013,7(9):e2437.[137]YEJ,XIAOL,LIJ,etal.Occurrenceofhuman-pathogenicEnterocytozoonbieneusi,GiardiaduodenalisandCryptosporidiumgenotypesinlaboratorymacaquesinGuangxi,China[J].ParasitologyInternational,2014,63(1):132-7.[138]LIW,DIAOR,YANGJ,etal.Highdiversityofhuman-pathogenicEnterocytozoonbieneusigenotypesinswineinnortheastChina[J].ParasitologyResearch,2014,113(3):1147.[139]TIANGR,ZHAOGH,DUSZ,etal.FirstreportofEnterocytozoonbieneusifromgiantpandas(Ailuropodamelanoleuca)andredpandas(Ailurusfulgens)inChina;proceedingsofthe中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会论文集,F,2015[C].[140]SULAIMANIM,BERNC,GILMANR,etal.AmolecularbiologicstudyofEnterocytozoonbieneusiinHIV-infectedpatientsinLima,Peru[J].JournalofEukaryoticMicrobiology,2003,50(s1):591-6.[141]ZHAOW,ZHANGW,YANGF,etal.EnterocytozoonbieneusiinDairyCattleintheNortheastofChina:GeneticDiversityofITSGeneandEvaluationofZoonoticTransmissionPotential[J].JournalofEukaryoticMicrobiology,2015,62(4):553-60.[142]ZHANGX,WANGZ,SUY,etal.Notes:IdentificationandGenotypingofEnterocytozoonbieneusiinChina[J].JournalofClinicalMicrobiology,2011,49(5):2006-8.[143]GILMANR,MIRANDAE,MARQUISG,etal.RapidreinfectionbyGiardialambliaaftertreatmentinaHyperendemicThirdWorldCommunity[J].Lancet,1988,1(8581):343-5.[144]GILMANRH,BROWNKH,VISVESVARAGS,etal.EpidemiologyandserologyofGiardialambliainadevelopingcountry:Bangladesh[J].TransactionsoftheRoyalSocietyofTropicalMedicine&Hygiene,1985,79(4):469-73.[145]AL-MEKHLAFIMS,AZLINM,NORAU,etal.GiardiasisasapredictorofchildhoodmalnutritioninOrangAslichildreninMalaysia[J].TransactionsoftheRoyalSocietyofTropicalMedicine&Hygiene,2005,99(9):686-91.[146]ÇELİKSZA,ACIZM,DEĞERLİS,etal.Effectsofgiardiasisonschoolsuccess,weightandheightindicesofprimaryschoolchildreninTurkey[J].PediatricsInternational,2005,47(5):567-71.[147]PRADOMS,CAIRNCROSSS,STRINAA,etal.Asymptomaticgiardiasisandgrowthinyoungchildren;alongitudinalstudyinSalvador,Brazil[J].Parasitology,2005,131(Pt1):51-6.[148]MUHSENK,LEVINEMM.Asystematicreviewandmeta-analysisoftheassociationbetween第61页共71页 Giardialambliaandendemicpediatricdiarrheaindevelopingcountries[J].ClinicalInfectiousDiseasesAnOfficialPublicationoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica,2012,55Suppl4(Suppl4):S271.[149]NASHTE,KEISTERDB.DifferencesinExcretory-SecretoryProductsandSurfaceAntigensAmong19IsolatesofGiardia[J].JournalofInfectiousDiseases,1985,152(6):1166.[150]NASHTE,MCCUTCHANT,KEISTERD,etal.Restriction-EndonucleaseAnalysisofDNAfrom15GiardiaIsolatesObtainedfromHumansandAnimals[J].JournalofInfectiousDiseases,1985,152(1):64-73.[151]GIANGASPEROA,PAOLETTIB,IORIOR,etal.PrevalenceandmolecularcharacterizationofGiardiaduodenalisfromsheepincentralItaly[J].ParasitologyResearch,2005,96(1):32-7.[152]RYANUM,BATHC,ROBERTSONI,etal.SheepmaynotbeanimportantzoonoticreservoirforCryptosporidiumandGiardiaparasites[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2005,71(9):4992-7.[153]OZMENO,YUKARIBA,HALIGURM,etal.ObservationsandimmunohistochemicaldetectionofCoronavirus,CryptosporidiumparvumandGiardiaintestinalisinneonataldiarrhoeainlambsandkids[J].SchweizerArchivFürTierheilkunde,2006,148(7):357.[154]GIESSENJVD,VRIESAD.GenotypingofGiardiainDutchpatientsandanimals:Aphylogeneticanalysisofhumanandanimalisolates[J].InternationalJournalforParasitology,2006,36(7):849-58.[155]ZHANGW,ZHANGX,WANGR,etal.GeneticCharacterizationsofGiardiaduodenalisinSheepandGoatsinHeilongjiangProvince,ChinaandPossibilityofZoonoticTransmission[J].PLoSNeglTropDis,2012,6(9):e1826.[156]OLSONME,THORLAKSONCL,DESELLIERSL,etal.GiardiaandCryptosporidiuminCanadianfarmanimals[J].VeterinaryParasitology,1997,68(4):375.[157]GMEZMUOZMT,CMARABADENESC,MARTNEZHERREROMC,etal.MultilocusgenotypingofGiardiaduodenalisinlambsfromSpainrevealsahighheterogeneity[J].ResearchinVeterinaryScience,2012,93(2):836-42.[158]SILVAFMPE,LOPESRS,BRESCIANIKDS,etal.HighoccurrenceofCryptosporidiumubiquitumandGiardiaduodenalisgenotypeEinsheepfromBrazil[J].ActaParasitologica,2014,59(1):193-6.[159]ADAMRD,DAHLSTROMEW,MARTENSCA,etal.GenomesequencingofGiardialambliaGenotypesA2andBisolates(DHandGS)andcomparativeanalysiswiththegenomesofGenotypesA1andE(WBandPig)[J].GenomeBiologyandEvolution,5,12(2013-12-3),2013,5(12):2498-511.第62页共71页 [160]FORONDAP,BARGUESMD,ABREUACOSTAN,etal.IdentificationofgenotypesofGiardiaintestinalisofhumanisolatesinEgypt[J].ParasitologyResearch,2008,103(5):1177-81.[161]JOHNSTONAR,GILLESPIETR,RWEGOIB,etal.Molecularepidemiologyofcross-speciesGiardiaduodenalistransmissioninwesternUganda[J].PlosNeglectedTropicalDiseases,2010,4(5):e683.[162]CACCISM,BECKR,LALLEM,etal.MultilocusgenotypingofGiardiaduodenalisrevealsstrikingdifferencesbetweenassemblagesAandB[J].InternationalJournalforParasitology,2008,38(13):1523-31.[163]LIUA,YANGF,SHENY,etal.GeneticAnalysisoftheGdhandBgGenesofAnimal-DerivedGiardiaduodenalisIsolatesinNortheasternChinaandEvaluationofZoonoticTransmissionPotential[J].PlosOne,2014,9(4):e95291.[164]SPRONGH,CACCISM,JWVDG.IdentificationofzoonoticgenotypesofGiardiaduodenalis[J].PlosNeglectedTropicalDiseases,2009,3(12):e558.第63页共71页 第64页共71页 英文摘要Gastrointestinalparasitosisofsheepisawidespreadinfectioncausedbytheprotozoaandhelminths,whichhaveasignificanteffectonthegrowthofyounganimalsparticular.Atpresent,theeffectofspringadultparasitichightideonruminantisstillaconspicuousprobleminTibet.SuchasHaemonchuscontortusandEchinococcusarewidelydistributedthroughoutTibetregion.Duetothehazardsofgastrointestinalparasite,oftencausingmanyproblemsinsheep,suchasproductionperformancedecrease,reductionofdigestiveability,weightloss,poorqualityoffleece,loweranimalproduction,increaseofmorbidityandmortalit,andleadtoenormouseconomiclossespoortrafficsandextensivemanagementmadelimitedaccesstoveterinaryservicesanddelayedtherapiesforparasiticdiseases.Althoughpastoralistsgrazingmanagementandlivingenvironmenthavebeengreatlychanged,thepopulationsofsheepandgoatsareexperiencingadeclineinthepastdecade.Manyscholarshavebeenlookingforbiologicalandabioticfactorsthatcauseadeclineinthenumberofgoatsandsheep.Parasitesareoneofthebiologicalfactorsthatcandirectlyorindirectlycauseindividualdeath,andarealsoimportantpathogensinanimals.However,rarereportisavailableonconditionsofintestinalparasiteinfectioninTibetansheepandunderthedifferentgrazingmanagementinTibet.Theapplicationofmodernmolecularbiologytechnologycannotonlyinvestigatesomeimportantzoonoticpathogens,butalsoprovidetechnicalsupportforitsphylogeny,populationgeneticsandtraceability.TosurveytheprevalenceandinfectioncircumstanceofintestinalparasitesinTibetansheepandTibetangoatinTibet,atotalof880freshfecalsampleswerecollectedfromGongbujiangdacountyandNaidongCounty,Zhanangcounty,GonggaCounty,NamlingCountyandXietongmenCounty.Theoverallprevalenceofgastrointestinalparasiteswas88.98%(783/880).Theinfectiousrateofgastrointestinalparasitesfortibetansheepandgoatwas89.68%(556/620)and88.07%(229/260)respectively.Intheinvestigationofsheepparasites,theinfectionrateofEimeriaspp.,Entamoebaspp.,Strongylespp.,Trichurisspp.,Nematodirusspp.,Monieziaspp.andFasciolaspp.were79.5%(429/620),30.16%(187/620)，40.48%(251/620)，7.58%(47/620)，2.42%(15/620)，2.42%(15/620)，and0.97%(6/620),respectively.Amongallparasites,Eimeriaspp.(79.5%)wastheprevalentspecies,followedbyStrongylespp.(40.5%)andEntamoebaspp.(30.2%).Intheinvestigationofgoats,theinfectionrateofEimeriaspp.,Entamoebaspp.,Strongylespp.,Trichurisspp.,Monieziaspp.,andCiliatesspp.,were29.6%(77/260),16.2%(42/260),5.4%(14/260),1.9%(5/260)and0.4%(1/260),respectively.Thereweresignificantdifferencesintheprevalenceofintestinalnematodesbetweendifferentforaginghabitats.Coccidiosisisamajorcauseofdeathanddisabilityinlamb.SheepcaninfectdifferentspeciesofEimeria,anddifferentspeciesofEimeriahavedifferentpathogenicity.Inordertounderstandthe第65页共71页 infectionsituationofTibetansheepandTibetangoatcoccidiosisinTibet,880TibetansheepandTibetangoatfecalsampleswereexaminedbythesheatherfloatationmethodandtheEimeriaspecieswereidentifiedbasedonmorphologicalfeaturesandsizeofthesporulatedoocysts.ResultsshowedthattheprevalenceofEimeriainTibetansheepandTibetangoatwas79.5%(429/620)and81.15%(211/260),respectively.12speciesofsheepEimeriaand12speciesofgoatEimeriawereidentified.ThedominantspeciesofsheepwereE.parva39.4%(244/620)andE.pallida31.3%(194/620),andtheotherspiceswereE.ovinoidalis21.8%(135/620),E.faurei17.6%(109/620),E.marsica12.9%(80/620),E.bakuensis11.0%(68/620),E.gonzalezi8.5%(53/620),E.granulose7.7%(48/620),E.weybridgensis4.0%(25/620),E.ahsata4.5%(28/620),E.intricate2.7%(17/620),E.crandallis2.6%(16/620).EimeriaalijeviandEimeriapallidaweredominantspeciesintwelveidentifiedspeciesinTibetanGoat,with52.7%(137/260)and50.8%(132/260)infectionrates.AndtheotherspecieswereE.christenseni10.8%(28/260),E.kocharli9.6%(25/260),E.hirci8.8%(23/260),E.apsheronica7.3%(19/260),E.arloingi5%(13/260),E.caprina4.2%(11/260),E.jolchijevi2.7%(7/260),E.punctata2.7%(7/260),E.ninakohlyakimovae1.5%(4/260),E.caprovina0.4%(1/260).MostofthesampleswereinfectedtwotosevenEimeriaspecies.Andthesamplemaininfected2-3species.Enterocytozoonbieneusiisanintracellularparasite-specificpathogenthataffectsawiderangeofhosts,includingavarietyofspinalandnon-vertebrateanimals,includinghumans,andisalsodetectedinsomewaterandvegetables.Inrecentyears,anumberofinvestigationsofEnterocytozoonbieneusiinsheepandgoatshavebeencarriedout,andsomezoonoticgenotypeshavealsobeenfoundintheseinvestigationsinsheepandgoats.ToassessthepotentialzoonosesofsheepEnterocytozoonbieneusiisolatesfromsheepinTibet,phylogeneticanalysisofdifferentE.bieneusiisolatesbasedontheITSgeneswasperformedtoexploretheprevalenceandgeneticcharacteristicsofE.bieneusiinTibetansheepandgoatinpartsofTibet.TheoverallprevalenceofE.bieneusiwas13.4%(118/880),12genotypesofE.bieneusiwereidentifiedincluding8newlyrecordedspeciesnamelyNEW1-8.And4wereknowngenotypes,includingGenotypeI、CHG1、BEB6andEpbC.12genotypesdetectedinthisstudyweredividedintotwobranchesofthephylogenetictree,group1andgroup2.EbpCandNEW4wereclusteredintoGroup1withhighzoonoticpotentialinthephylogeneticanalysis.AndgenotypesNew1,New2,New3,New5,New6,New7,New8locatedinthehost-specificGroup2.Giardia,themostdiarrhealintestinalprotozoan,canspreadwidelybetweenhumansandmanyanimals.Giardiaduodenailsisalsoacommonintestinalparasiteinsheep.BasedontheSSUrRNA,TPI,BGandGDHgenes,apositivesampleofGiardiaduodenaliswasdetectedinTibetangoatfecalsamples.Thetotalinfectionratewas0.57%.Thegenotypeofinfectiondetectedwas第66页共71页 assemblageE.ThegenotypeofthegeneisassemblageE5.ThecurrentstudyindicatedthatgastrointestinalparasiticinfectionsoccurfrequentlyinTibetansheepinTibet.PhylogeneticanalysisandzoonoticriskassessmentofdifferentE.bieneusiisolateswerecarriedout.IthaspositivesignificancetobetterprotecttheuniquenessofTibetansheepandreducethethreatofintestinalparasitestoTibetansheepandhumanbeings.StrengthenedmanagementandperiodicallyantiparasitictreatmentsshouldbeusedtocontroltheinfectionofparasiteinTibetansheep.Keywords:Tibet;Tibetansheep;Tibetangoats;gastrointestinalparasites;Eimeria;Coccidia;microsporidia;Giardiaduodenalis;Epidemiology第67页共71页 第68页共71页 英文缩略表英文缩写英文名称中文名称CDCCentersforDiseaseControlandPrevention疾病预防控制中心IFAIndirectfluorescentantibodytechnique间接荧光抗体技术ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验AGIDAgargelimmunodiffusion琼脂糖扩散试验IHAindirecthaemagglutinationtest间接凝血实验PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸RFLPRestrictionfragmentlengthpolymorphism限制性片段长度多态性RAPDRandomAmplifiedPolymorphicDNA随机扩增多态性DNA标记qPCRReal-timeQuantitativePCRDetectingSystem实时定量基因扩增荧光检测系统AIDSAcquiredimmunedeficiencysyndrome获得性免疫缺陷综合症ITSInternaltranscribedspacers内转录间隔区rRNARibosomalRibonucleicAcid核糖体核糖核酸NCBINationalCenterofBiotechnologyInformation美国国立生物技术信息中心BLASTBasiclocalalignmentsearchtool碱基局部对准检索工具SSUrRNASmallsubunitribosomeRNA核糖体小亚基RNAGDHglutamatedehydrogenase谷氨酸脱氢酶TPITriosephosphateisomerase磷酸丙糖异构酶BGBetaGiardiaβ-贾第素bpBasepair碱基对第69页共71页 第70页共71页 个人简历常艳凯，男，生于1992年，汉族，中国共产党党员，河南南乐人。2011.09-2015.06就读于河南农业大学生物工程专业，获得工学学士学位，在此期间同时获河南农业大学经济学专业经济学学士二学位；2015.09-至今就读于河南农业大学兽医硕士专业，攻读硕士学位，师从张素梅教授、张龙现教授，主要从事人兽共患寄生虫病的研究等工作。攻读硕士期间参与发表文章如下：1.常艳凯,毋亚运,郑双健,等.西藏谢通门县山羊球虫感染情况调查[J].中国兽医杂志,2017(9):9-12.2.LiJ,ChangY,ShiK,etal.MultilocussequencetypingandclonalpopulationgeneticstructureofCyclosporacayetanensisinhumans[J].Parasitology,2017,144(14):1890-1897.3.LiJ,QiM,ChangY,etal.MolecularcharacterizationofCryptosporidiumspp.,Giardiaduodenalis,andEnterocytozoonbieneusiincaptivewildlifeatZhengzhouZoo,China[J].JournalofEukaryoticMicrobiology,2015,62(6):833-839.4.Li,J.,Dong,H.,Wang,R.,Yu,F.,Wu,Y.,&Chang,Y.,etal.(2017).Aninvestigationofparasiticinfectionsandreviewofmolecularcharacterizationoftheintestinalprotozoainnonhumanprimatesinchinafrom2009to2015.InternationalJournalforParasitologyParasites&Wildlife,6(1),8-15.5.曹建科,常艳凯,毋亚运,等.甘肃地区奶牛肠道寄生虫感染情况调查[J].畜牧与兽医,2017,49(7):109-1136.毋亚运,常艳凯,郑双健,等.西藏部分地区放牧家畜肠道寄生虫感染情况的调查[J].中国兽医科学,2017(8):1011-1016.7.翁少亭,曹建科,常艳凯,等.新型猪流感疫苗研究进展[J].畜牧与兽医,2016,48(9):139-144..8.翁少亭,曹建科,常艳凯,等.H1和H3亚型猪流感病毒血凝素单因子血清的制备[J].河南农业大学学报,2016(5):646-650.期间获得的荣誉如下：2018年获得河南省第四届自然科学学术奖——河南省自然科学优秀学术论文三等奖。2015年获学术研讨会优秀论文一等奖；2016年“大北农杯”第一届全国农林院校研究生学术科技作品竞赛三等奖；2015年、2016年研究生一等学业奖学金等。第71页共71页