资源描述：
《西格列汀对糖尿病大鼠大血管病变自噬水平的影响及其机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号Ｒ５８密级公开ＵＤＣ６１０学校代码１０５５５？名孳硕士学位论文（专业学位）西格列汀对糖尿病大鼠大血管病变自噬水平的影响及其机制研究研究生姓名：李玫＇指导教师、职称：王建平教授专业学位类别（领域）：临床医学（内科学）研究方向：内科学（内分泌及代谢病学）所在学院：第二临床学院二○一八年五月 ＇西格列＞丁对糖尿病大鼠大血管病变自嗔水平的影响及其机制研究论文作者签名：Ｉ咬＾指导教师签名：论文评阅人１：硌紗ＣＭ叙孩．破Ｕ琦辭Ｉ）野评阅人２－：趙庆ａｍｔ左丈ｇｗＭ〉手／＾平３评阅人：答辩委员会主席：ｉ）（叙ｍａＨｓｓｊｆ委员１：嗲仁ｆ（衣技，砀ｕ私ｇ财＆秦二ｇ＿ｊ委员２：王＇，命咐絲二ｉ身搞（ｉ仏ｇ，，綏Ｉ奸）委员３：（｜：ｌＭＭ委员４：委员５：答辩日期：別各年ｔ月Ｗ曰 南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的。尽我所知，论文中不包含研宄成果，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外其他人已经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文。中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担作者签名年＾月＾／日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读（博／硕）士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留、使用学可位论文的规定，即：学校有或权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校论以文公布学位论文的全部湖部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保留论学文位；学校可根据国家或论南文省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文全加文入数《据中国优秀博硕士学位全文数据库》，并按《中国优秀博硕士学位库出版章程》规定享位受论相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到《中国学文文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论，解密后适用该授权。＾年上作者签名：ｒ月＾Ｈ导师签名：年月斤曰 西格列汀对糖尿病大鼠大血管病变自噬水平的影响及其机制研究摘要：目的：1、建立糖尿病大鼠大血管病变模型，观察其胸主动脉组织自噬（Autophagy）相关蛋白的表达情况。2、西格列汀（Sitagliptin）干预糖尿病大鼠大血管病变模型，观察其胸主动脉组织自噬活性的变化并探讨其可能作用机制。方法：随机选取58只5周龄（体重约180g-200g）的SD大鼠，适应性喂养1周，随机分为正常对照组（A组，n=10）和模型组（n=48）。A组喂以普通饲料，模型组喂以高脂高糖饲料饮食。4周后，称体重（BW），测空腹血糖(FBG)、胰岛素(FINS)水平、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。将造模组禁食12小时后以35mg/kg剂量STZ腹腔注射给药，A组腹腔注射等量的缓冲液，72小时后，测随机血糖(BS)连续3次≥16.7mmol/L者确定为糖尿病大鼠（3只未建模成功）。造模成功的糖尿病大鼠继续予以高脂饲料喂养，并随机分为5组，B组：未干预组（n=9），C组:西格列汀5mg/kg·d组（n=9），D组:西格列汀1mg/kg·d组（n=9），E组:西格列汀5mg/kg·d组+CXCR4特异性抑制剂AMD31001mg/kg·d（n=9），F组:西格列汀1mg/kg·d组+CXCR4特异性抑制剂AMD31001mg/kg·d（n=9），C、I D、E、F组每日9点以西格列汀溶于生理盐水灌胃，A、B组予以等量生理盐水灌胃，共干预8周，E、F组自实验第8周起每日腹腔注射AMD31001mg/kg·d。给药期间，B、C、F组各死亡1只老鼠。实验第12周末称体重后处死大鼠，心尖处取血3-4ml用于检测血生化指标、血清基质细胞衍生因子-1α（Stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1α）水平，取各组大鼠胸主动脉段，一部分用于HE染色，一部分用于免疫组织化学染色，一部分用于Western-blot检测LC3-II（Microtubuleassoeiatedprotein1lighthain3-II）、P62、Beclin-1、ClassIIIPI3K（ClassIIIPhosphoinositide3-kinase）、CXCR4蛋白表达。结果：1、4周末，各大鼠BW及生化指标比较，与A组相比，造模组大鼠BW、FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C较正常组明显增高。2、12周末，各大鼠FBG、TC、TG、LDL-C指标比较：与A组相比较，B组、C组、D组、E组、F组FBG、TC、TG、LDL-C水平均增高，C组与B、D组比较，FBG、TC、TG、LDL-C水平有下降，与F组比较，E组FBG、TC、TG、LDL-C水平有下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。3、12周末各组大鼠血清SDF-1α水平、胸主动脉组织CXCR4及自噬相关蛋白表达比较：与B组相比，C、D组血清SDF-1α、LC3-II、CXCR4、Beclin-1、ClassIIIPI3K蛋白表达增加，P62表达减少，差异有统计学意义（P<0.05），而C组与D组相比较，SDF-1α、LC3-II、II CXCR4、Beclin-1、ClassIIIPI3K蛋白表达增高更显著，P62表达减少更显著，差异有统计学意义（P<0.05）。E组与C组比较，F组与D组比较，血清SDF-1α、LC3-II、CXCR4、Beclin-1、ClassIIIPI3K蛋白表达增加，P62表达减少，差异有统计学意义（P<0.05），E组与F组差异无明显统计学意义。结论：1、STZ诱导的糖尿病大鼠胸主动脉组织中LC3-II、Beclin-1、ClassIIIPI3K表达下调，P62蛋白表达上调，自噬活性下降。2、西格列汀可能通过激活SDF-1α/CXCR4生物轴以调控自噬，从而进一步延缓糖尿病大鼠大血管病变。关键词：糖尿病大血管病变；自噬；西格列汀；SDF-1α/CXCR4；ClassIIIPI3KIII STUDYONEFFECTOFSITAGLIPTINONDIABETICRATSWITHMACROANGPAHTYINAUTOPHAGYANDITSMECHANISMAbstractObjectives:1.Adiabeticratmodelofmacroangiopathywasestablishedtoobservetheexpressionofautophagy-relatedproteinsinthoracicaortatissues.2.Sitagliptinwasintervenedinthemodelofdiabeticratswhichhadmacrovascularcomplicationstoobservethechangesofautophagyactivityinthoracicaortatissueandexplorethepossiblemechanism.Methods:Fifty-eightSDratsaged5weeksold(weighabout180g-200g)wererandomlyselectedandadaptivelyfedfor1week.Theywererandomlydividedintonormalcontrolgroup(groupA,n=10)andmodelgroup(n=48).GroupAwasfedwithnormalfood,andthemodelgroupwasfedwithhigh-fatandhigh-carbohydratefood.After4weeks,BWwasmeasuredandFBG,FINS,TG,TCandLDL-Clevelsweretestedintheserats.Afterthemodelgroupwasfastedfor12hours,35mg/kgdoseofSTZwasintraperitoneallyadministered,andthegroupAreceivedequivalentbufferbyintraperitonealinjection.Diabeticratswereidentifiedaswhoserandombloodglucose(BS)wasmorethan16.7mmol/Lbytesting3consecutivetimesafter72hours(3ratswerenotsuccessfullymodeled).V Thesuccessfulmodeloftheratscontinuedtobefedwithahighfatdietandthenrandomlydividedinto5groups:GroupB:un-pretreatedgroup(n=9),GroupC:Sitagliptinwith5mg/kg·ddosegroup(n=9),GroupD:Sitagliptinwith1mg/kg·ddosegroup(n=9),Egroup:Sitagliptinwith5mg/kg·ddose+CXCR4specificinhibitorAMD3100with1mg/kg·ddosegroup(n=9),GroupF:Sitagliptinwith1mg/kg·d+CXCR4specificinhibitorAMD3100dose1mg/kg·dgroup(n=9).GroupC,D,E,andFgroupsweretreatedwithsitagliptindissolvedinnormalsalineat9o’clockperday,gavagewasperformedingroupsAandBwithequalvolumeofnormalsalinefor8weeks.IngroupsEandF,AMD31001mg/kg·dwasintraperitoneallyinjecteddailyfromthe8thweekoftheexperiment.Duringthedosingperiod,onemousediedingroupsB,C,andF.Attheendofthetwelfthweekoftheexperiment,theratsweresacrificedafterbodyweightandbloodwastakenfromtheapexoftheheartat3-4mltodetectbloodbiochemicalmarkersandserumstromalcell-derivedfactor-1(SDF-1α)levels.ThethoracicaortasegmentofratswaspartiallystainedwithHE,partofitwasusedforimmunohistochemicalstaining,andaportionwasusedforWestern-blotdetectionforLC3-II,P62,Beclin-1,ClassIIIPI3K,andCXCR4proteinexpression.Results:1、Attheendofthe4thweek,BWandbiochemicalindexesofeachVI ratwerecompared.ComparedwithgroupA,BW,FBG,FINS,HOMA-IR,TG,TC,andLDL-Cinthemodelgroupweresignificantlyhigher.2、Attheendofthe12thweek,theratFBG,TC,TG,andLDL-Cindexeswerecomparedineachgrouprats:ComparedwithgroupA,thelevelsofFBG,TC,TG,andLDL-CingroupB,C,D,E,Fincreased.ComparedwithgroupBandD,thelevelsofFBG,TC,TG,andLDL-CingroupCdecreased.ComparedwithgroupF,thelevelsofFBG,TC,TG,andLDL-CingroupEdecreasedandthedifferencehasstatisticalsignificance(P<0.05).3、ThelevelsofserumSDF-1α,CXCR4,andautophagy-relatedproteinexpressioninthoracicaortatissuewerecomparedattheendof12thweek:ComparedwithgroupB,serumSDF-1α,LC3-II,CXCR4,Beclin-1,andClassIIIPI3Kproteinexpressionincreased,P62expressiondecreased,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).whilecomparedwithgroupD,SDF-1α,LC3-II,CXCR4,Beclin-1,andClassIIIPI3KproteinexpressioningroupCincreasedsignificantly,andtheexpressionofP62reducedobviously.Thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).whenComparinggroupCwithgroupEandgroupDwithgroupF,theexpressionofSDF-1α,LC3-II,CXCR4,Beclin-1andClassIIIPI3KproteininserumincreasedandP62expressiondecreased.TherewasnosignificantdifferencebetweengroupEandgroupF.Conclusions:1.TheexpressionofLC3-II,Beclin-1andClassIIIPI3KintheVII aortatissueofSTZ-induceddiabeticratswasdown-regulated,theexpressionofP62proteinwasup-regulatedandtheautophagicactivitydecreased.2.SitagliptinmayregulateautophagybyactivatingSDF-1α/CXCR4biologicalaxis,whichmayfurtherdelaythemacrovascularlesionsindiabeticrats.Keywords:diabeticmacroangiopathyautophagysitagliptinClassIIIPI3KSDF-1α/CXCR4VIII 目录摘要………………………………………………………………………IAbstract………………………………………………………………V前言……………………………………………………………………1实验方法…………………………………………………………3结果…………………………………………………………………13讨论…………………………………………………………………35结论……………………………………………………………………41参考文献………………………………………………………………43文献综述………………………………………………………………47致谢……………………………………………………………………55 主要缩略语及英文索引英文缩写英文全称中文全称ASAtherosclerosis动脉粥样硬化BWBodyweight体重CMAChaperonemediatedautophagy分子伴侣介导的自噬CXCR4Chemokinerreceptor-4趋化因子受体4DMDiabetesmellitus糖尿病DABDiaminobenzidine二氨基联苯胺DEPCDiethypyrocarbonate碳酸二乙酯DKADiabeticketoacidosis糖尿病酮症酸中毒FBGFastingbloodglucose空腹血糖FINSFastinginsulin空腹胰岛素HEHematoxylineosin苏木素伊红HOMA-IRHomeostasismodelassessmentofInsulin胰岛素抵抗指数ResistanceHSFDsHighsucrose-fatdiets高糖高脂饮食IVCIndividuallyVentilatedCages独立通气笼盒LC3-IIMicrotubuleassoeiatedprotein1lighthain微管相关蛋白轻链3-II3-IILDL-CLowdensitylipoproteincholesterol低密度脂蛋白胆固醇NF-κBNuclearfactor-KappaB核因子κBODOpticaldensity光密度值PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PI3KPhosphoinositide3-kinase磷脂酰肌醇3-激酶RAPArapamycin雷帕霉素SDF-1αStromalcell-derivedfactor-1基质衍生细胞因子1α SPSSStatisticalpackageofsocialscience社会科学统计软件包STZStreptozotocin链脲佐菌素TCTotalcholesterol总胆固醇TGTriglyceride甘油三酯VSMCVascularsmoothmusclecell血管平滑肌细胞VECVascularendothelialcell血管内皮细胞 前言伴随着人们生活水平的提高及饮食习惯、生活方式的改变，糖尿病（Diabetesmellitus，DM）患病率逐年升高，流行病学调查显示，我国成年人2型糖尿病患病率高达9.7%～11.6%。糖尿病大血管病变（DiabetieMacroangiopathy）是糖尿病最为多见的慢性并发症之一。高血糖所致的动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是糖尿病大血管病变的特征性病理改变，该病变的主要机制十分复杂，可能在高血糖诱导性损伤下，通过激活氧化应激、蛋白激酶C激活、晚期糖化终产物等多种生物途径促进血管病变。而近期有研究表明，在高血糖所致的动脉粥样硬化的发生发展中，细胞自噬（Autophagy）发挥着重要的作用，因此，阐明糖尿病大血管病变发生发展中的自噬相关机制可能成为一个新的治疗靶点。细胞自噬是通过自我降解、自我消化可使细胞处于各种应激状态下重复利用三羧酸循环和营养物质生成的ATP继续生存，该现象普遍存在真核细胞生物及哺乳动物内。自噬分为分子伴侣介导的自噬(chaperonemediatedautophagy，CMA)、微自噬(microautophagy)和巨自噬（macroautophagy)[1]，生长因子缺乏，能量不足及氧化应激的状态下常可诱导自噬，当营养缺失时，细胞胞浆内生理性自噬作为一种保护机制，而过度自噬可能导致代谢失衡、降解细胞自身成分、细胞死亡等。自噬的激活与抑制在许多疾病中至关重要，如肿瘤、糖尿病、肝病、神经退行性变、心肌病、自身免疫疾病及感染性疾病[2-3]。细胞自噬的过程及其机制十分复杂，多条信号转导通路均参与到了自噬的调控，其中磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide3-kinases，PI3Ks）是自噬过程中重要的调节分子，根据其结构特征及作用底物的不同将其分为ClassIPI3K、ClassIIPI3K、ClassIIIPI3K，ClassIIIPI3K为Vps34的类似物，是细胞自噬重要的启动因子，III型PI3K与Beclin-1能形成复合物促进自噬的发生，在自噬体的早期形成中发挥重要的作用[4]。西格列汀作为二肽基肽酶4（DPP-4）的抑制剂，通过增加胰高血糖素样肽1（GLP-1）的活性及作用时间从而发挥降糖作用，在降糖之余，西格列汀可以起到延缓高血糖所致的动脉粥样硬化的作用[5]，但其具体机制目前尚未完全阐明。MuraseH[6]等人研究利用DPP-4抑制剂作用于2型糖尿病心肌梗塞大鼠模型，发现梗塞区域自噬水平得以恢复，并成功减少其死亡率，那么，在西格列汀作用于高1 血糖所致的动脉粥样硬化过程中自噬扮演怎样的角色我们还不得知。基质衍生细胞因子1α（Stromalcell-derivedfactor-1,SDF-1α）作为DPP-4的重要底物，是一种具有趋化活性的细胞因子，西格列汀通过消减DPP-4对SDF-1α的降解作用以上调其血清SDF-1α水平，且该效应与血糖下降无关，而高浓度的SDF-1α有稳定斑块的作用[7]。趋化受体因子4（CXCR4）及趋化因子受体因子7（CXCR7）是SDF-1目前发现的仅有的受体，关于SDF-1α/CXCR7轴目前研究极少，其与肿瘤的转移、细胞粘附等生物学效应相关，而SDF-1α/CXCR4轴介导的信号转导通路已被大家熟知，它通过诱导内皮组细胞分化，趋化炎症细胞聚集等作用参与了动脉粥样硬化、血管内层炎症反应、血管内皮损伤修复等过程，高浓度的SDF-1α因能发挥抗炎、稳定斑块作用而被作为动脉粥样硬化的保护因素。而在近期许多研究中表明，SDF-1α/CXCR4生物轴与自噬关系密切，SDF-1α可以诱导牙髓干细胞发生自噬，并促进其迁移[8]；在早期软骨损伤阶段，SDF-1α能通过调控小鼠关节软骨细胞自噬水平以进一步抑制软骨细胞的损伤[9]。综上所述，我们是否可以设想西格列汀通过底物作用SDF-1α/CXCR4生物轴激活自噬启动因子III型PI3K及Beclin-1从而进一步激活自噬从而起到延缓高血糖所致的动脉粥样硬化作用。因此，本实验首先建立糖尿病大鼠大血管病变模型，观察其胸主动脉的自噬情况，用不同剂量的西格列汀干预该模型，观察其自噬活性的改变，并使用SDF-1α/CXCR4特异性抑制剂AMD3100，以探讨SDF-1α/CXCR4轴是否参与其中，基于自噬理论下探究该轴在糖尿病大血管病变发生发展过程中的可能作用机制。2 实验方法1实验材料1.1实验动物与饲料选取58只无特定病原体级（SPF）SD雄性大鼠，约5周龄，体重180g-200g左右，购于长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SYXK（湘）2015-0001。高脂饲料成分：88.5%普通标准饲料、10%熟猪油、1%胆固醇、0.5%胆酸钠。高糖高脂饲料（HSFDs）成分：66.5%普通标准饲料、10.0%熟猪油、20.0%蔗糖、2.5%胆固醇、1.0%胆酸钠。1.2主要试剂及药品猪油丰源浩泰食品专营店蔗糖粉河南宏益生物科技有限公司胆固醇江苏祥晟生物科技有限公司胆酸钠江苏祥晟生物科技有限公司STZ美国Sigma公司磷酸西格列汀片(捷诺维100mg/片)杭州默沙东制药有限公司AMD3100美国MCE公司地特胰岛素诺和诺德公司HE染色试剂盒英国abcam公司SP试剂盒(通用型)北京中杉金桥生物有限公司DAB显示试剂盒北京中杉金桥生物有限公司P62兔抗大鼠单克隆抗体美国Proteintech公司LC3-II兔抗大鼠单克隆抗美国CST公司Beclin1兔抗大鼠单克隆抗体美国Proteintech公司ClassIIIPI3K兔抗大鼠单克隆抗体英国abcam公司CXCR4兔抗大鼠单克隆抗体美国Proteintech公司3 SDF-1αELISA检测试剂盒英国abcam公司RIPA裂解液中国长沙维士尔生物公司Tris美国Sigma公司SDS美国Sigma公司TEMED美国Sigma公司Tween-20美国Sigma公司丙烯酰胺美国Sigma公司甘氨酸美国Sigma公司HRPgoatanti-mouseIgG美国Proteintech公司蛋白酶抑制剂德国Merck蛋白磷酸酶抑制剂瑞士RocheHRPgoatanti-rabbitIgG美国Proteintech公司10%水合氯醛南华大学附属第二医院制剂室无菌枸橼酸钠缓冲液鹏博生物有限公司胰岛素ELISA检测试剂盒英国abcam公司1.3主要仪器设备强生血糖仪美国强生公司倒置显微镜深圳森东宝科技有限公司电子天平上海海康有限公司BMJ-III型包埋机德国徕卡公司切片机美国eoShandon公司（型号325）摊片机德国徕卡公司电泳仪及电泳槽美国EMBITEC公司半干转膜仪美国BIO-RAD公司全自动生化分析仪日本日立公司（型号CX7）FM-2000放射免疫分析仪上海天普分析仪器有限公司MK3型酶标仪美国Thermo公司磁力搅拌器德国徕卡公司离心机中国深圳黑马公司4℃、-20℃、-80℃冰箱中国海尔公司4 紫外分光光度仪上海菁华有限公司AlphaImager凝胶成像分析系统北京六一有限公司MoticImagesAdvanced3.2彩色图像分析加拿大Motic公司恒温水浴箱北京六一有限公司2实验方法2.1糖尿病模型建立及分组2.1.1动物饲养58只雄性SD大鼠检测血糖均在正常范围内后，分笼饲养于南华大学动物实验部动物用独立通气笼盒（IndividuallyVentilatedCages,IVC）内，无特定病原体（specificpathogenfree,SPF）级屏障系统饲养条件，自由饮水及进食，12小时明暗交替，室内温度控制在22-26℃，空气湿度为55%-65%。予以普通饲料喂养7天后开始实验。采用体重大小随机分为2组，正常对照组（A组,n=10）及造模组(n=48)，A组予以普通标准饲料喂养，造模组予以高糖高脂饲料喂养，喂养4周后随机选取A组与造模组大鼠各10只称体重，采用眼眶后静脉丛采血检测FBG、TG、TC、LDL-C、FINS等，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。取血3天后模型组大鼠因出血感染死亡2只。2.1.2模型的建立及判定利用柠檬酸及柠檬酸钠按严格比例配置成浓度为0.1mol/L,pH=4.2-4.5的柠檬酸盐缓冲液，高温高压灭菌后将之与无菌的STZ配成1%的浓度，置于冰浴中，锡纸包好避光，将46只模型组及10只A组大鼠过夜进食后称重，以35mg/Kg剂量STZ液与同剂量的缓冲液快速腹腔注射。72小时后，连续三天同一时段采尾静脉血测大鼠随机血糖（BS），三次BS均大于16.7mmol/L确定为糖尿病大鼠。模型组中有1只大鼠连续3次注射STZ后BS仍低于16.7mmol/L，将其剔除模型组。2.1.3实验分组将造模成功的45只模型组大鼠喂予高脂饲料喂养，再随机分为5组，B组：未干预组（n=9），C组：西格列汀5mg/kg·d组（n=9），D组：西格列汀1mg/kg·d5 组（n=9），E组：西格列汀5mg/kg·d组+CXCR4特异性抑制剂AMD31001mg/kg·d（n=9），F组：西格列汀1mg/kg·d组+CXCR4特异性抑制剂AMD31001mg/kg·d（n=9），C、D、E、F组每日09:00以西格列汀溶于生理盐水灌胃，A、B组予以等量生理盐水灌胃，共干预8周，E、F组自实验第8周起每日腹腔注射AMD31001mg/kg·d，共干预4周。期间A组继续普通标准饲料喂养，所有大鼠自由饮水，进食，每1-2天更换垫料，在此期间注意密切观察大鼠的摄食量、活动量、毛色、粪便、精神状态等，每周测1次体重及血糖，当BS过高时给予长效胰岛素2.0U皮下注射。给药期间，B、C、F组间各死亡1只老鼠，死亡原因考虑感染和（或）糖尿病酮症酸中毒（diabeticketoacidosis,DKA）所致。2.2动物组织取材12周末，以0.3mg/100g剂量腹腔注射10%水合氯醛将各组大鼠麻醉后，将各组大鼠仰卧固定，消毒皮肤，无菌环境下暴露心脏，游离出胸主动脉，心尖部抽血3ml左右用于试管内，3000rpm离心5分钟后分离血清并保存于冰箱用于检测血生化指标。沿心脏主动脉出口处游离主动脉弓至胸主动脉段，反复生理盐水冲洗后用滤纸(DEPC处理过)吸干其表面水分，将游离出的血管分为三段：第一段甲醛固定行HE染色；第二段行免疫组织化学染色；第三段快速冰冻后用于Western-blot检测CXCR4、自噬相关蛋白等表达。2.3各组大鼠血生化指标测定1）氧化酶法检测FBG，全自动生化分析仪检测所有血清标本中的TG、TC、LDL-C；2）采用放射免疫法分析空腹胰岛素（FINS）水平，并计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR=[FBG(mmol/L)×FINS（mIU/L）]/22.5；3）采用ELISA法检测血清SDF-1α：严格按照大鼠SDF-1αELISA试剂盒说明书操作以测量各组血清样本中SDF-1α水平：按严格稀释比例稀释标准品、大鼠血清样品、生物素化的SDF-1α抗体及浓缩的链酶亲和素-HRP；计算所需要的大鼠血清数目；标记孔数，每孔加入100ul标准品或样品，盖上封板膜后过夜；次日揭开封板膜，加入洗液洗涤并甩干，重复4次；重复上述操作分别加入100ul6 生物素化的SDF-1α抗体及浓缩的链酶亲和素-HRP；再向每孔加入100ul四甲基联苯胺（TMD），封板避光并摇匀30min，最终加入终止液后立即放入酶标仪中读读数，测量各孔的吸光度。根据标准品的浓度及其OD值致计算出标准曲线的回归氏方程，最终根据测量出样品的OD值得出各样品的浓度。2.4各组大鼠胸主动脉HE染色2.4.1石蜡切片：1)取材：取10%甲醛固定48h的各组大鼠胸主动脉组织，蒸馏水清洗1h以清除残余甲醛。2)脱水透明：依次经过75%、85%、95％、100％乙醇溶液中进行梯度脱水后置于二甲苯溶液中浸泡至主动脉组织透明。3)浸蜡包埋：将上述步骤处理的主动脉组织置于已经融化的石蜡中，再放置于溶蜡箱中恒温，待组织已完全浸入石蜡，准备好已放置融化石蜡的金属包埋盒，夹取组织放入其中，等待其冷却。4)切片烤片：固定好蜡块置于切片机上，切成4μm厚的蜡带，再将之放置于乙醇溶液中水平展开，捞片后铺正，放置于60℃恒温箱中烤干2h，密封后低温保存。2.4.2大鼠胸主动脉组织HE染色：1）脱蜡：取上述步骤得到的石蜡切片，二甲苯脱蜡，无水乙醇浸泡5min后再依次放置于100%、95%、90%、85%、75%、55%乙醇及蒸馏水中各3-4min。2）染色：进行苏木素染色约12min，切片呈蓝色后用蒸馏水小心清洗2min。3)返蓝：0.5%盐酸乙醇溶液将切片褪色10s，呈粉红后予以1%稀氨清洗返蓝，持续约1min后待切片恢复蓝色。4)脱水后复染：切片依次放入50%、75%、85%乙醇脱色，各2min，用1%伊红溶液再次对比染色3min，蒸馏水清洗1min。5)脱水封片：用75%乙醇溶液冲洗切片2min，依次放入85%、95%、100%乙醇溶液中浸泡5min，后将其放入二甲苯中浸泡5min，最终利用中性树胶封片。6）光镜下观察切片形态并采集图像。7 2.5免疫组织化学法检测大鼠胸主动脉组织LC3-II、P62、Beclin-1、ClassIIIPI3K、CXCR4的表达1）脱蜡水化：取石蜡切片，常规脱蜡10min，梯度酒精脱水。2）灭酶：3%H2O2溶液37℃孵育10min，PBS溶液冲洗5min×3次。3）抗原修复：0.01mol/L枸椽酸盐缓冲液(PH:6.0)中煮沸20min，冷却后PBS冲洗5min×3次。4）孵育一抗：滴加适当的一抗（LC3-II、P62、Beclin-1、ClassIIIPI3K、CXCR4）4℃过夜，PBS冲洗5min×3次。5）孵育二抗：滴加50μL抗-兔，兔，兔，兔，兔-IgG抗体-HRP多聚体37℃孵育30min，PBS冲洗5min×3次。6）滴加链霉素卵白素工作液（已辣根过氧化物酶溶液标记，即三抗），37℃孵育30min。PBS冲洗5min×3次。7）DAB显色：滴加预制好的DAB工作液50μL，显微镜下观察反应速度，后用蒸馏水冲洗停止显色。8）苏木素复染1min后蒸馏水冲洗，PBS反蓝。9）显微镜下观察。2.6蛋白提取及Western-blot法检测大鼠胸主动脉组织的LC3-II、P62、Beclin-1、ClassIIIPI3K、CXCR4表达2.6.1样品制备及蛋白浓度检测剪取适量大鼠主动脉组织，预冷PBS溶液冲洗，加入300uLRIPA裂解液置于匀浆器中研磨至看不见组织；冰浴中静置20min，12000rpm离心15min（4℃），吸取离心后的上层液体转移至离心管内，即为提取的总蛋白。按照BCA蛋白定量说明测定蛋白浓度。2.6.2制胶及电泳1）配10％及12%分离胶，加四甲基乙二胺（TEMED）后摇匀，灌胶后用异丙醇封胶。2）配4.8%浓缩胶后加TEMED摇匀，灌胶后将梳子插到浓缩胶中。3）蛋白变性：计算出每个样品所需取样量，将之与5*loadingbuffer混匀，95℃变性约5min，冰浴后放入-20℃冰箱保存。8 4）根据BCA蛋白定量法测量出的蛋白浓度在第1孔加入标准蛋白分子量maker，其他每孔加入20ul已经变性的蛋白，利用电泳缓冲液（Tris:3.03g＋甘氨酸:18.77g＋SDS:1g＋蒸馏水至1000ml）电泳，浓缩胶80V，分离胶120V，待溴酚蓝跑出停止电泳，等待转膜。2.6.3转膜1）切胶：P62（62KD），Beclin-1（60KD），LC3-II（14、16KD），ClassIIIPI3K（100KD）、CXCR4（60-70KD）、β-action（42KD）。2）准备1张NC膜在转膜缓冲液（Tris:5.8g＋甘氨酸:2.9g＋SDS:0.37g＋甲醇：200ml＋蒸馏水至1000ml）中浸润，然后准备6张与胶相同大小的滤纸一起置入其中，并浸透。3）按照3张滤纸、膜、胶、3张滤纸的顺序放好，开始转膜，转膜300mV，P62约80min，Beclin-1约80min，LC3-II约30min，ClassIIIPI3K约120min、CXCR4约80min、β-action约1h。4）转膜终止后，将其放入1*TBSB（20%Tween20:1.65ml+700mlTBS缓冲液，现配现用）中冲洗1次，持续约5min。5）使用丽春红（丽春红S：2g+三氯乙酸：30g+磺基水杨酸：30g+蒸馏水至100ml，稀释10倍）染膜，观察蛋白转移到膜上的效果，再用1*TBSB将丽春红冲洗干净。2.6.4封闭与杂交1）将膜浸入到封闭液（1*TBSB+5%脱脂奶粉）后室温放置1.5h。2）用1*TBSB将一抗按照一定比例稀释，其比例分别为：P62（1:1000），Beclin-1（1:1000），LC3-II（1:1000），ClassIIIPI3K（1:1000）、CXCR4（1:500）、β-action（1:5000），将稀释后的一抗与膜一起孵育，4℃过夜后，用1*TBSB冲洗15min×3次。3）1*TBSB稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，兔抗稀释比例1:6000，鼠抗稀释1:5000，再与膜一起孵育90min，1*TBSB冲洗15min×3次。2.6.5ECL显色/曝光ECL化学发光液与膜孵育3min后曝光显影。用ImageJ图像分析软件分析。2.8统计学处理所有实验数据采用x±s表示。SPSS19.0统计软件进行统计分析，各组数据行9 方差齐性检验，组间差异使用单因素方差分析，后用最小显著差异法LSD-t检验行各组间两两比较。P<0.05认为差异有统计学意义。10 结果1各组大鼠的一般情况模型组共48只大鼠，4周后内眦取血存活的46只SD大鼠在注射STZ后，1只大鼠3次注射STZ后仍未达标，退出实验，共成模45只，成模率为93.75%。饲养过程中A组大鼠一般情况可，体重自然增加，皮毛光泽，行动正常；未干预组（B组）大鼠造模后3天左右开始出现多饮、多尿、多食症状，伴随体重下降、活动减少、行动迟缓、毛发稀疏等。西格列汀干预组（C组、D组），也存在活动减少、多食、多饮、多尿现象，但C组相较D组症状轻微，不同剂量西格列汀+AMD3100组（E组、F组）上述现象较B、C、D组无明显差异。2各组大鼠BW、血生化指标2.14周后大鼠BW、FBG、FINS、血脂水平的变化4周后，与A组（正常对照组）相比较，模型组大鼠BW、FBG、FINS、TG、TC、LDL、HOMA-IR升高，差异有统计学意义(P<0.05)，两组HOMA-IR比较提示造模组大鼠已经形成胰岛素抵抗。(见表1-3，图1-5)。表14周后两组大鼠BW及FBG比较（x±s）组别例数BW(g)FBG(mmol/L)对照组10203.2±5.194.7±0.6模型组10256.4±6.91a6.6±0.4a注：a:与A组（正常对照组）比较，P＜0.05表24周后两组大鼠FINS及HOMA-IR比较（x±s）组别例数FINS(mU/L)HOMA-IR对照组1014.82±0.733.03±0.65模型组1029.03±0.80a7.98±0.52a注：a:与A组（正常对照组）比较，P＜0.0511 表34周后两组大鼠血脂的比较（x±s）组别例数TG(mmol/L)TC(mmol/L)LDL-C(mmol/L)正常组100.70±0.131.78±0.190.35±0.04造模组100.97±0.13a3.01±0.14a0.50±0.12a注：a:与A组（正常对照组）比较，P＜0.05a图14周后两组大鼠BW比较（x±s，g）注：Controlgroup:正常对照组；Modelgroup:模型组注：a:与A组（正常对照组）比较，P＜0.05a图24周后两组大鼠FBG比较（x±s，mmol/L）注：Controlgroup:正常对照组；Modelgroup:模型组a:与A组（正常对照组）比较，P＜0.0512 a图34周后两组大鼠FINS比较（x±s，mU/L）注：Controlgroup:正常对照组；Modelgroup:模型组a:与A组（正常对照组）比较，P＜0.05a图44周后两组大鼠HOMA-IR比较（x±s）注：Controlgroup:正常对照组；Modelgroup:模型组a:与A组（正常对照组）比较，P＜0.0513 aaa图54周后两组大鼠血脂比较（x±s，mmol/L）注：Controlgroup:正常对照组；Modelgroup:模型组a:与A组（正常对照组）比较，P＜0.052.212周末各组大鼠FBG、血脂的比较与A组比较，B、C、D、E、F组FBG、TG、TC、LDL-C均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；D组与B组相比较，FBG、TG、TC、LDL-C稍降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，C组与D、B组比较，FBG、TG、TC、LDL-C有下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；E组与C组、F组与D组FBG、TG、TC、LDL-C相比较，差异无统计学意义(P＜0.05)，E组与F组相比较，E组FBG、TG、TC、LDL-C有下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。(见表4，图6-7)。14 表412周后六组大鼠FBG、血脂比较（x±s）组别nFBSTGTCLDL-C（只）(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)A组104.7±0.60.79±0.111.54±0.160.40±0.16B组819.9±1.6a1.74±0.15a3.12±0.06a0.79±0.04aC组816.5±0.6ab1.48±0.07ab2.85±0.17ab0.57±0.07abD组917.9±1.3ac1.81±0.10ac3.14±0.18ac0.81±0.04acE组916.8±0.5ab1.50±0.05ab2.79±0.12ab0.62±0.13abF组818.7±1.1ae1.80±0.10ae3.10±0.13ae0.78±0.15ae注：a:与A组比较，P<0.05；b:与B组比较，P<0.05；c:与C组比较，P<0.05；d：与D组比较，P<0.05；e：与E组比较，P<0.05。图612周末大鼠FBG比较（x±s，mmol/L）注：a:与Agroup比较，P<0.05；b:与Bgroup比较，P<0.05；c:与Cgroup比较，P<0.05；d：与Dgroup比较，P<0.05；e：与Egroup比较，P<0.05。15 图712周末大鼠血脂比较（x±s，mmol/L）注：a:与Agroup比较，P<0.05；b:与Bgroup比较，P<0.05；c:与Cgroup比较，P<0.05；d：与Dgroup比较，P<0.05；e：与Egroup比较，P<0.05。2.312周末各组大鼠血清SDF-1α水平检测C组（5mg/kg·d西格列汀）及D（1mg/kg·d西格列汀）与A组（正常对照组）及B组（未干预组）比较，血清SDF-1α水平有上升，差异有统计学意义（P<0.05）；而C组与D组比较，C组血清SDF-1α水平有上升，差异有统计学意义（P<0.05）；E组（西格列汀组5mg/kg.d+AMD31001mg/kg.d）与C组相比，F组（西格列汀组1mg/kg·d+AMD31001mg/kg.d）相比，SDF-1α水平有下降，差异有统计学意义（P<0.05）；E组与F组相比，差异无统计学意义。(见表5，图8)。16 表512周后六组大鼠血清SDF-1α比较（x±s）组别nSDF-1α（只）(ng/L)A组105.65±0.18B组82.32±0.13aC组86.13±0.23abD组95.47±0.04bcE组92.55±0.18cF组82.54±0.11d注：a:与A组比较，P<0.05；b:与B组比较，P<0.05；c:与C组比较，P<0.05；d：与D组比较，P<0.05；e：与E组比较，P<0.05。abbcccdad图812周后六组血清SDF-1α比较（x±s，ng/L）注：a:与Agroup比较，P<0.05；b:与Bgroup比较，P<0.05；c:与Cgroup比较，P<0.05；d：与Dgroup比较，P<0.05；e：与Egroup比较，P<0.05。3HE染色400倍显微镜下：A组大鼠胸主动脉组织血管内膜完整光滑，内皮细胞无脱17 落。B组（未干预组）可见内膜缺损，内皮细胞偶有脱落，平滑肌细胞增殖明显，弹性纤维紊乱，可见泡沫细胞(箭头所指)。与B组比较，不同剂量西格列汀干预组C组及D组胸主动脉病理改变明显改善，而不同剂量西格列汀+AMD3100组，即E组及F组胸主动脉病理改变有改善，但无C、D组明显。(见图9)。A组：正常对照组（HE染色，400x）B组：未干预组(HE染色,400×)C组：西格列汀5mg/kg.dD组：西格列汀1mg/kg.d(HE染色，400×)(HE染色，400×)E组：西格列汀5mg/kg.d+AMD3100F组：西格列汀1mg/kg·d+AMD3100组(HE染色，400×)组(HE染色，400×)图912周末各组大鼠胸主动脉组织HE染色18 4免疫组化通过S-P染色法检测各组大鼠胸主动脉组织CXCR4及自噬相关蛋白表达，显微镜下观察到棕褐色颗粒（如下图箭头所示）及其平均光密度值为依据进行比较。与A组（正常对照组）比较，B组（未干预组）CXCR4、LC3-II、Beclin-1、ClassIIIPI3K蛋白表达量减少，P62表达量增多；与B组比较，C、D组CXCR4、LC3-II、Beclin-1、ClassIIIPI3K蛋白表达量增多，P62表达减少；而C组与D组相比较，LC3-II、CXCR4、Beclin-1、ClassIIIPI3K蛋白表达量增多，P62表达减少；E组与C组比较，F组与D组比较，LC3-II、CXCR4、Beclin-1、ClassIIIPI3K蛋白表达减少，P62表达增多；而E组与F组组间比较，无明显差异。（见表6）。表612周后六组大鼠CXCR4、自噬相关蛋白平均光密度（OD值）比较（x±s）组别NLC3-IIP62Beclin-1ClassIIIPI3KCXCR4A组100.033±0.0030.081±0.0030.045±0.0070.028±0.0030.189±0.002B组80.027±0.006a0.123±0.006a0.031±0.004a0.023±0.002a0.011±0.002aC组80.048±0.007ab0.067±0.009ab0.089±0.003ab0.077±0.003ab0.043±0.006abD组90.042±0.004bc0.073±0.006bc0.063±0.007bc0.049±0.004bc0.039±0.005bcE组90.036±0.002c0.071±0.004c0.043±0.002c0.038±0.006c0.025±0.004cF组80.034±0.003d0.073±0.002d0.045±0.003d0.039±0.005d0.024±0.003d注：a:与A组比较，P<0.05；b:与B组比较，P<0.05；c:与C组比较，P<0.05，d：与D组比较，P<0.05；e：与E组比较，P<0.05。19 4.1各组大鼠胸主动脉组织LC3-II免疫组化结果（见图10-11）A组：正常对照组（免疫组化400x）B组：未干预组（免疫组化400x）C组：西格列汀5mg/kg.d组D组：西格列汀1mg/kg.d组（免疫组化400x）（免疫组化400x）E组：西格列汀5mg/kg.d+AMD3100F组：西格列汀1mg/kg.d+AMD3100组（免疫组化400x）组（免疫组化400x）图1012周末各组大鼠胸主动脉组织LC3-II表达（免疫组化）20 ababbcbccddda图11六组大鼠胸主动脉组织LC3-IIOD值比较（x±s）注：a:与Agroup比较，P<0.05；b:与Bgroup比较，P<0.05；c:与Cgroup比较，P<0.05；d：与Dgroup比较，P<0.05；e：与Egroup比较，P<0.05。4.2各组大鼠胸主动脉组织Beclin-1免疫组化结果（见图12-13）A组：正常对照组（免疫组化400x）B组：未干预组（免疫组化400x）21 C组：西格列汀5mg/kg.d组D组：西格列汀1mg/kg.d组（免疫组化400x）（免疫组化400x）E组：西格列汀5mg/kg.d+AMD3100F组：西格列汀1mg/kg.d+AMD3100组（免疫组化400x）组（免疫组化400x）图12六组大鼠胸主动脉组织Beclin-1表达（免疫组化）abbcdca图13六组大鼠胸主动脉组织Beclin-1OD值比较（x±s）注：a:与Agroup比较，P<0.05；b:与Bgroup比较，P<0.05；c:与Cgroup比较，P<0.05；d：与Dgroup比较，P<0.05；e：与Egroup比较，P<0.05。22 4.3各组大鼠胸主动脉组织ClassIIIPI3K免疫组化结果(见图14-15)A组：正常对照组（免疫组化400x）B组：未干预组（免疫组化400x）C组：西格列汀5mg/kg.d组D组：西格列汀1mg/kg.d组（免疫组化400x）（免疫组化400x）E组：西格列汀5mg/kg.d+AMD3100F组：西格列汀1mg/kg.d+AMD3100组（免疫组化400x）组（免疫组化400x）图14六组大鼠胸主动脉组织ClassIIIPI3K表达（免疫组化）23 abbccda图15六组大鼠胸主动脉组织ClassIIIPI3KOD值比较（注：a:与Agroup比较，P<0.05；b:与Bgroup比较，P<0.05；c:与Cgroup比较，P<0.05；d：与Dgroup比较，P<0.05；e：与Egroup比较，P<0.05。4.4各组大鼠胸主动脉组织CXCR4免疫组化结果(见图16-17）A组：正常对照组（免疫组化400x）B组：未干预组（免疫组化400x）C组：西格列汀5mg/kg.d组D组：西格列汀1mg/kg.d组（免疫组化400x）（免疫组化400x）24 E组：西格列汀5mg/kg.d+AMD3100F组：西格列汀1mg/kg.d+AMD3100组（免疫组化400x）组（免疫组化400x）图16六组大鼠胸主动脉组织CXCR4表达（免疫组化）abbccdaa图17六组大鼠胸主动脉组织CXCR4OD值比较（x±s）注：a:与Agroup比较，P<0.05；b:与Bgroup比较，P<0.05；c:与Cgroup比较，P<0.05；d：与Dgroup比较，P<0.05；e：与Egroup比较，P<0.05。25 4.5各组大鼠胸主动脉组织P62免疫组化结果(见图18-19)A组：正常对照组大鼠（免疫组化400x）B组：未干预组（免疫组化400x）C组：西格列汀5mg/kg.d组D组：西格列汀1mg/kg.d组（免疫组化400x）（免疫组化400x）E组：西格列汀5mg/kg.d+AMD3100F组：西格列汀1mg/kg.d+AMD3100组（免疫组化400x）组（免疫组化400x）图18六组大鼠胸主动脉组织P62表达（免疫组化）26 aacdabbc图19六组大鼠胸主动脉组织P62OD值比较（x±s）注：a:与Agroup比较，P<0.05；b:与Bgroup比较，P<0.05；c:与Cgroup比较，P<0.05；d：与Dgroup比较，P<0.05；e：与Egroup比较，P<0.05。5Western-Blot取各组大鼠胸主动脉组织行Western-Blot检测LC3-II、P62、Beclin-1、ClassIIIPI3K、CXCR4蛋白的表达。其中结果显示：与A组相比较，B组（未干预组）大鼠主动脉中可观察到LC3-II、CXCR4、ClassIIIPI3K、Beclin-1表达显著下调，P62表达显著上调；与B组相比，C、D组在使用不同剂量西格列汀干预后，LC3-II、CXCR4、Beclin-1、ClassIIIPI3K蛋白表达上调，P62表达下调，差异具有统计学意义（P<0.05），而C组与D组相比较，LC3-II、CXCR4、Beclin-1、ClassIIIPI3K蛋白表达上调更显著，P62表达下调更显著，差异具有统计学意义（P<0.05）。E组与C组比较，F组与D组比较，LC3-II、CXCR4、Beclin-1、ClassIIIPI3K蛋白表达下调，P62表达上调，差异具有统计学意义（P<0.05），E、F组组间比较差异无统计学意义。(见表7，图20-25)。27 LC3-ⅡP62Beclin-1ClassIIIPI3KCXCR4β-actinA组B组C组D组E组F组图20六组大鼠胸主动脉组织CXCR4、自噬相关蛋白表达曝光图注：A组：正常对照组，B组：未干预组，C组：西格列汀5mg/kg.d组，D组：西格列汀1mg/kg·d组，E组：西格列汀5mg/kg.d+AMD31001mg/kg.d组，F组：西格列汀1mg/kg·d+AMD31001mg/kg.d组表7各组大鼠胸主动脉CXCR4、自噬相关蛋白/β-actin值比较（x±s）IC3-ⅡP62Beclin-1ClassⅢCXCR4组名N/β-actin/β-actin/β-actin/β-actin/β-actinA组100.42±0.030.27±0.010.44±0.040.29±0.010.26±0.03B组80.35±0.02a0.34±0.02a0.32±0.03a0.09±0.02a0.14±0.01aC组80.58±0.04ab0.12±0.03ab0.74±0.04ab0.62±0.04ab0.67±0.04abD组90.44±0.01bc0.16±0.03bc0.58±0.03bc0.42±0.03bc0.51±0.03bcE组90.39±0.02c0.24±0.02c0.48±0.03c0.38±0.01c0.30±0.02cF组80.38±0.03d0.25±0.01d050±0.02d0.39±0.02d0.29±0.01d注：注：a:与A组比较，P<0.05；b:与B组比较，P<0.05；c:与C组比较，P<0.05；d：与D组比较，P<0.05；e：与E组比较，P<0.05。28 aba图21六组大鼠胸主动脉组织LC3-II/β-actin值比较（x±s）注：a:与Agroup比较，P<0.05；b:与Bgroup比较，P<0.05；c:与Cgroup比较，P<0.05；d：与Dgroup比较，P<0.05；e：与Egroup比较，P<0.05。aab图22六组大鼠胸主动脉组织P62/β-actin值比较（x±s）注：a:与Agroup比较，P<0.05；b:与Bgroup比较，P<0.05；c:与Cgroup比较，P<0.05；d：与Dgroup比较，P<0.05；e：与Egroup比较，P<0.05。29 图23六组大鼠胸主动脉组织Beclin-1/β-actin值比较（x±s）注：a:与Agroup比较，P<0.05；b:与Bgroup比较，P<0.05；c:与Cgroup比较，P<0.05；d：与Dgroup比较，P<0.05；e：与Egroup比较，P<0.05。bc图24六组大鼠胸主动脉组织ClassIIIPI3K/β-actin值比较（x±s）注：a:与Agroup比较，P<0.05；b:与Bgroup比较，P<0.05；c:与Cgroup比较，P<0.05；d：与Dgroup比较，P<0.05；e：与Egroup比较，P<0.05。30 图25六组大鼠胸主动脉组织CXCR4/β-actin值比较（x±s）注：a:与Agroup比较，P<0.05；b:与Bgroup比较，P<0.05；c:与Cgroup比较，P<0.05；d：与Dgroup比较，P<0.05；e：与Egroup比较，P<0.05。31 讨论糖尿病患病率逐年升高，已逐渐成为足以影响全球人类健康的重担[10]，根据最新的国际糖尿病联盟（IDF）统计的数据显示，全球共有4.5亿成年糖尿病病患者，该数目还在不断增加。糖尿病与心血管系统的关系十分密切，中国地区中，糖尿病患者与非糖尿病患者相比，动脉粥样硬化的发病率及病死率是其2.4倍[11]。糖尿病大血管病变的本质在于高血糖所致的动脉粥样硬化，其病理过程十分复杂，其中“内皮损伤反应学说”被广泛接受，而近期国内外大量研究表明，自噬参与其中，目前自噬作为治疗糖尿病大血管病变的潜在靶点受到越来越多的关注。许多降糖药物已广泛用于临床，而其作用的最终目标不仅仅单纯降低血糖水平，更需要进一步防治其血管并发症的发生发展，进而改善人们的生活质量和延长生存时限。本实验通过建立糖尿病大鼠大血管病变模型，探讨并使用西格列汀及SDF-1α/CXCR4特异性阻滞剂AMD3100干预，观察糖尿病大鼠血清中SDF-1α水平、主动脉组织中LC3-II、P62、Beclin-1、ClassIIIPI3K、CXCR4蛋白的表达情况，以探讨自噬在糖尿病大鼠大血管病变发生发展中的作用及西格列汀可能通过激活SDF-1α/CXCR4轴对糖尿病大鼠大血管自噬产生影响。1.构建糖尿病大鼠大血管病变模型建立动物实验模型是人类探究并防治疾病的重要手段，自发性糖尿病动物模型、转基因动物模型及诱发性糖尿病动物模型是目前最常见的糖尿病动物模型，相较前两种，诱发性糖尿病动物模型操作简单易行并花费较少。小剂量的STZ有高度选择性破坏大鼠胰岛β细胞的作用，而建立糖尿病大血管病变模型胰岛素抵抗及高脂饮食至关重要，本实验通过持续高脂高糖饮食喂养SD大鼠4周后成功建立胰岛素抵抗模型后，利用小剂量STZ选择性损坏胰岛β细胞，成功模拟糖尿病发病过程并建立糖尿病实验模型。在高血糖基础上继续长时间高脂饮食喂养，模拟“脂毒性”进一步造成血管损害继而成功建立糖尿病大鼠大血管病变模型。在本实验的4周末，与A组相比，B（未干预组）、C、D、E、F组的BW、FBG、FINS、TG、TC、LDL-C、HOMA-IR值均有增高，提示胰岛素抵抗形成。造模组48只大鼠在注射STZ后，45只成模，成模率为32 93.75%，在实验12周末，B组(未干预组)大鼠主动脉组织HE染色可见血管内膜缺损，内皮细胞偶有脱落，平滑肌细胞可见明显增殖，弹性纤维紊乱，偶可见大量泡沫细胞，提示使用早期糖尿病大鼠大血管病变模型成功。2.糖尿病大鼠大血管病变与自噬高血糖所致的动脉粥样硬化（AS）是糖尿病大血管病变的主要病理特征性改变，在人类动脉粥样硬化病变中可以发现血管细胞中存在自噬现象，而在相同病变的动物及细胞模型中，血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）、血管内皮细胞（vascularendothelialcell,VEC）及巨噬细胞（macrophage）也发现不同程度的自噬反应[12]。在众多AS机制中，自噬参与了刺激胆固醇流出、抑制泡沫细胞形成、抗感染应答[13]。当用高糖处理正常血管内皮细胞后，可见内皮细胞内出现自噬缺陷，而使用自噬增强剂雷帕霉素（rapamycin，RAPA）后可见自噬反应明显增强，炎症反应被抑制，内皮细胞被保护[14]；伴随着巨噬细胞自噬水平的下降，炎症因子及泡沫细胞的形成会逐渐增加，进而加重动脉粥样硬化的形成[15]；由此可见，通过增强血管细胞被高糖抑制的自噬水平有可能成为一个潜在的治疗糖尿病大血管病变的切入点。细胞自噬已成为近期研究的热点，自噬的形成过程主要包括：1）自噬的诱导；2）吞噬泡(phagophore)成核启动自噬；3）自噬体（auto-phagosome)的形成；4）自噬体的延伸及自噬体的成熟；5）自噬的降解（degradation），由Beclin-1、Vps15、Vps34等成员组成的ClassIIIPI3K复合物在自噬前体膜囊的形成、膜泡的延伸、自噬小体的形成等自噬的启动过程中发挥关键作用[16]。通过激活ClassIIIPI3K/Beclin-1信号通路进一步可激活自噬，姚峰[17]等人在细胞及动物模型中均发现Apelin13能激活ClassIIIPI3K/Beclin-1信号通路进而激活自噬以改善动脉粥样硬化。当自噬反应中，LC3-II因其一直稳定于自噬体膜上而被用来反应自噬体的数量及活性，P62则可与LC3结合将多泛素聚合体转移到自噬融合体中消解，故也可检测P62的蛋白水平来评价自噬活性[18]。在本实验的免疫组化及Western-Blot（WB）结果中，与A组比较，B组（未干预组）大鼠主动脉中可观察到LC3-II、ClassIIIPI3K、Beclin-1表达显著下调，P62表达明显上调，与A组相比较，差异具有统计学意义（P<0.05），由此我们推断糖尿病大鼠主动脉组织中自噬活性被抑制，自噬功能受损。33 3.西格列汀调控自噬作用糖尿病大鼠大血管病变西格列汀是目前临床上常用的降糖药物之一，能防止DPP-4水解促胰岛激素，从而进一步增加GLP-1及糖依赖的胰岛素释放肽等激素以达到降糖效果[19]。除降糖之外，西格列汀可以改善血脂谱以进一步减少糖尿病患者心血管疾病危险因素[20]，这与本次实验12周末各组大鼠血糖、血脂变化结果基本一致。在我们的前期研究[21]中发现西格列汀作用糖尿病大鼠大血管病变可以促进核因子κB(NF-κB)表达增加进一步改善糖尿病大血管病变。更有研究表明[22]西格列汀可以通过诱导细胞产生自噬以进一步保护心脏功能及防治动脉粥样硬化，在糖尿病肾病大鼠模型中也发现西格列汀可以通过增强其自噬水平，从而进一步起到保护糖尿病肾脏血管的作用[23]。在此次试验中，我们通过建立糖尿病大鼠大血管模型，同时分别使用5mg/kg·d西格列汀及1mg/kg·d西格列汀干预该模型，在12周末，我们可以观察到C组（5mg/kg·d西格列汀）及D组（1mg/kg·d西格列汀）大鼠胸主动脉HE染色与B组相比较，内膜基本平整，弹性纤维连续，内皮细胞大致完整，未见泡沫细胞，仅见少许平滑肌细胞增殖，提示西格列汀有保护糖尿病大鼠大血管作用。结合免疫组化及WB的结果分析，与B组（未干预组）相比，C组与D组LC3-II表达均有上调，P62表达水平明显下调，差异具有统计学意义（P<0.05）；与D组比较，LC3-II表达有上调，P62表达水平下调，差异有统计学意义（P<0.05），以上我们推断出西格列汀呈浓度依赖性上调糖尿病大鼠胸主动脉组织自噬活性，但该效应具体的作用机制仍不明确。4.SDF-1α/CXCR4生物轴参与西格列汀调控自噬作用糖尿病大鼠大血管病变SDF-1α作为DPP-4的作用底物，在人鼠之间的同源性高达92%[24]。Fadini[25]等人研究发现，2型糖尿病患者在使用西格列汀4周后，其血清SDF-1α水平比正常对照组增加50%，而血清中高浓度的SDF-1α具有抗炎及稳定斑块的作用已被明确证实，随着动脉粥样硬化的病程进展，SDF-1α的特异性趋化受体CXCR4可以防止中性粒细胞过度活化而造成的动脉粥样硬化斑块扩大[26]。AMD3100作为SDF-1α/CXCR4的特异性阻滞剂，其作用为竞争性的占据CXCR4的结合位点以阻断SDF-1α/CXCR4生物轴的生物学效应。而近期有研究表明，34 SDF-1α/CXCR4生物轴可能参与到自噬的调控。Herberg等人研究表明[27]SDF-1能提高过氧化氢有诱导下的骨髓间充质干细胞自噬水平,以增强其生存能力，在标记靶向肿瘤细胞的小鼠体内，SDF-1α可以通过抑制mTOR(Mammaliantargetofrapamycin)进一步激活肿瘤细胞的自噬[28],在SDF-1α与CXCR4结合后，可促进细胞膜表面G蛋白三聚体分离，形成GβGγ和Gαi均可以激活下游重要的节点分子PI3K[29]，王天宝[30]等人研究得出，当CXCR4表达下调将导致人结肠癌细胞中ClassIIIPI3KmRNA表达及自噬相关蛋白下降。为进一步探究SDF-1α/CXCR4生物轴是否参与西格列汀调控自噬作用糖尿病大鼠大血管病变，在利用不同浓度西格列汀干预的基础上，我们使用了AMD3100作用糖尿病大鼠大血管病变模型，因血管组织中SDF-1α组织中表达较少，因此我们利用ELISA法检测各组大鼠血清SDF-1α水平得出以下结果：C组（5mg/kg·d西格列汀）及D（1mg/kg·d西格列汀）分别与A组（正常对照组）及B组（未干预组）比较，大鼠血清中SDF-1α水平均明显上调，差异具有统计学意义（P<0.05）；而C组与D组比较，C组血清SDF-1α的水平也有上调，差异具有统计学意义（P<0.05）；由此推断西格列汀呈剂量依赖性上调糖尿病大鼠大血管模型血清中SDF-1α水平，与Fadini等人研究结果相一致。而在使用AMD3100干预后，E组与C组比较，F组与D组比较，血清血清SDF-1α有下调趋势，E组、F组两组相比较差异无明显统计学意义，由此推断AMD3100在阻断SDF-1α/CXCR4生物轴后对其血清SDF-1α有下调作用。在免疫组化及WB的结果提示：与B组相比，C、D组在使用不同剂量西格列汀干预后，LC3-II、CXCR4、Beclin-1、ClassIIIPI3K蛋白表达上调，P62表达下调，差异具有统计学意义（P<0.05），而C组与D组相比较，LC3-II、CXCR4、Beclin-1、ClassIIIPI3K蛋白表达上调更显著，P62表达下调更显著。E组（5mg/kg·d西格列汀+1mg/kg·dAMD3100）与C组比较，F组（1mg/kg·d西格列汀+1mg/kg·dAMD3100）与D组比较，LC3-II、CXCR4、Beclin-1、ClassIIIPI3K蛋白表达下调，P62表达上调，差异具有统计学意义（P<0.05），E、F组组间比较差异无统计学意义。由此我们可以推断西格列汀可能通过上调SDF-1α/CXCR4生物轴进一步上调自噬相关蛋白的表达，而AMD3100可能通过抑制SDF-1α/CXCR4生物轴从而进一步抑制自噬相关蛋白表达。其机制可能为35 西格列汀上调血清SDF-1α水平后促进其与CXCR4结合，进一步促进细胞膜表面G蛋白三聚体分离，形成GβGγ和Gαi均可以激活ClassIIIPI3K，ClassIIIPI3K与Beclin-1、Vps15等结合形成ClassIIIPI3K复合物从而进一步激活自噬。综上所述，糖尿病大血管病变发病机制十分复杂，西格列汀不仅可以通过降低血糖及血脂谱及炎性因子改善糖尿病大血管病变，还可以通过上调自噬水平起到延缓糖尿病大血管病变的作用，其中SDF-1/CXCR4生物轴可能发挥重要作用，但自噬的过程涉及多条信号通路，各条通路之间联系密切并相互影响，尽管我们对西格列汀在糖尿病大血管病变自噬及可能机制进行了初步的探讨，但还有许多自噬通路需要进一步验证。36 37 结论1、STZ诱导的糖尿病大鼠胸主动脉组织中LC3-II、Beclin-1、ClassIIIPI3K表达下调，P62蛋白表达上调，自噬活性下降；2、西格列汀可能通过激活SDF-1α/CXCR4生物轴以调控自噬，从而进一步延缓糖尿病大鼠大血管病变。38 39 参考文献[1]JinM,KlionskyDJ.Regulationofautophagy:modulationofthesizeandnumberofautophagosomes[J].FEBSLett,2014,588:2457-2463.[2]ChoiAM,RyterSW,LevineB.Autophagyinhumanhealthanddisease[J].NEnglJMed,2013,368:651-662.[3]MenghiniR,CasagrandeV,MarinoA,etal.MiR-216a:Alinkbetweenendothelialdysfunctionandautophagy[J].CellDeathDis,2014,5(1):1029-1038.[4]MatsunagaK,SaitohT,TabataK,etal.TwoBeclin1-bindingproteins,Atg14LandRubiconreciprocallyregulateautophagyatdifferentstages[J].Naturecellbiology,2009,11(4):385-396.[5]ZhongJ,RaoXQ,SanR,etal.Anemergingroleofdipeptidylpeptidase4(DPP4)beyondglucosecontrol:Potentialimplicationsincardiovasculardisease[J].Atherosclerosis,2013,226(2)：305-314.[6]MuraseH,KunoA,MikiT,TannoM,etal.InhibitionofDPP-4reducesacutemortalityaftermyocardialinfarctionwithrestorationofautophagicresponseintype2diabeticrats[J].Cardiovasculardiabetology,2015,14:103.[7]ShamimaA,FelixG,FabianK,etal.CXCL12promotesthestabilizationofatheroscleroticlesionsmediatedbysmoothmuscleprogenitorcellsinApoe-deficientmice[J].ArteriosclerosisThrombosis&VascularBiology,2013,33(4):679-686.窗体顶端[8]YangJW,ZhangYF,WanCY,etal.AutophagyinSDF 1α mediat edDPSCmigrationandpulpregeneration[J].Biomaterials,2015,44:11 23.[9]张津铭,吕正涛,卢伟伟,等.基质细胞衍生因子-1对小鼠关节软骨细胞自噬水平的影响[J].骨科,2016(04):268-273.[10]GuariguataL,WhitingDR,HambletonI,etal.Globalestimatesofdiabetesprevalencefor2013andprojectionsfor2035[J].DiabetesResClinPract,2014,103(2):137-149.[11]BraggF,HolmesMV,IonaA,etal.Associationbetweendiabetesandcause-specific40 mortalityinruralandurbanareasofchina[J].JAMA,2017,317(3):280-289.[12]PerrottaI.Theuseofelectronmicroscopyforthedetectionofautophagyinhumanatherosclerosis[J].Micron,2013;50:7-13.[13]LiGH,LinXL,ZangH,etal.Ox-Lp(a)transientlyinducesHUVECautophagyviaanROS-dependentPAPR-1-LKB1-AMPK-mTORPathway[J].Atherosclerosis,2015,243:223-235.[14]FanW,HanD,SunZ,etal.EndothelialdeletionofmTORC1protectsagainsthindlimbischemiaindiabeticmiceviaactivationofautophagy,attenuationofoxidativestressandalleviationofinflammation[J].FreeRadicBiolMed,2017,108(1):725-740.[15]TanakaM,MatsuoY,YamakageH,etal.DifferentialeffectsofGLP-1receptoragonistonfoamcellformationinmonocytesbetweennon-obeseandobesesubjects[J].Metabolism,2016,65(2):1-11.[16]MehrpourM,EsclatineA,BeauI,etal.Overviewofmacroautophagyregulationinmammaliancells[J].CellRes,2010,20(7):748-762.[17]姚峰.Apelin-13诱导自噬促进泡沫细胞胆固醇流出的作用及机制[D].南华大学,2016.[18]LonborgJ,etal.ExenatidereducesreperfusioninjuryinpatientswithST-segmentelevationmyocardialinfarction[J].EurHeart，2012.33(12):p.1491-9.[19]NunezDJ,BushMA,CollinsDA,etal.GuthormonepharmacologyofanovelGPR119agonist(GSK1292263),metformin,andsitagliptinintype2diabetesmellitus:resultsfromtworandomizedstudies[J].PLoSOne,2014,9(4):e92494.[20]DerosaG,RagonesiPD,FogariE,etal.Sitagliptinaddedtopreviouslytakenantidiabeticagentsoninsulinresistanceandlipidprofile:a2-yearstudyevaluation[J].FundamClinPharmacol,2012,28(2):221-229.[21]付婷,王建平,陈洋.西格列汀对糖尿病大鼠大血管NF-kB的影响.[J].实用医学杂志,2014,30:41-44.[22]ZengY,LiC,GuanM,etal.TheDPP-4inhibitorsitagliptinattenuatestheprogressofatherosclerosisinapolipoprotein-E-knockoutmiceviaAMPK-andMAPK-dependentmechanisms[J].CardiovascDiabetol,2014,13:32.41 [23]席悦.西格列汀对糖尿病肾损伤的保护作用研究[D].中国人民解放军医学院，2014.[24]HakimizadehE,ShamsizadehA,NazariM,etal.IncreasedcirculatinglevelsofCXCchemokinesiscorrelatedwithdurationandcomplicationsofthediseaseintapy-1diabetes:astudyonIraniandiabeticpatients[J].ClinicalLaboratory,2013,59:531-537.[25]FadiniG.P,Boscaro.E,etal.Theoraldipeptidylpeptidase-4inhibitorsitagliptinincreasescirculatingendothelialprogenitorcellsinpatientswithtapy2diabetesmellitus.Possiblaroleofstromalderivedfactor-1[J].DiabetesCare,2010,33,1607.[26]BotI,DaissormontIT,ZemeckeA,etal.CXCR4blockadeinducesatherosclerosisbyaffectingneutrophilfunction[J].JMolCellCardiol,2014,74:44-52.[27]HerbergS,ShiX,JohnsonMH,etal.Stromalcell-derivedfactor-1betamediatescellsurvivalthroughenhancingautophagyinbonemarrow-derivedmesenchymalstemcells［J］.PLoSOne,2013,8(3):e58207.[28]WangYB,GanGF,WangBC,etal.Cancer-associatedFibroblastsPromoteIrradiatedCancerCellRecoveryThroughAutophagy[J].EBioMedicine,2017,17(3):7-8.[29]TeicherBA,FrickerSP.CXCL(SDF-1α)/CXCR4pathwayincancer[J].ClinCancerRes,2010,16(11):2927-2931.[30]王天宝,石汉平,韩方海,等.CXCR4-PI3KⅢ-自噬轴与结肠癌LoVo细胞转移潜能相关性研究[J].中华肿瘤防治杂志,2013(23):1812 1816.42 43 文献综述mTOR通路与自噬在糖尿病慢性并发症中的研究进展李玫，王建平(南华大学附属第二医院内分泌科，衡阳，421000)[摘要]细胞自噬（Autophagy）是以溶酶体介导，将生命体细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器进行消化降解的过程，在适应代谢应激、保护基因组完整性及维持内环境稳定方面起到重要作用。在众多细胞自噬调控的分子机制中，mTOR（Mammaliantargetofrapamycin）信号通路逐渐成为人们关注的热点，本文主要围绕mTOR信号通路与细胞自噬在糖尿病慢性并发症中的研究进展做一综述，为临床治疗提供新的研究思路。[关键词]mTOR；细胞自噬；糖尿病；并发症[中图分类号]R587.2；R363[文献标识码]AResearchprogressofmTORsignalingpathwayandautophagyindiabeticchroniccomplicatiansAbstract:CellAutophagyinlysosomemediated,lifesomaticcelldamageanddegenerationoragingprocessdigestiondegradationofproteinsandorganelles,adapttothemetabolicstress,protectthegenomeintegrityandmaintainastableinternalenvironmentplayanimportantrole.Innumerousmolecularmechanismofcellautophagyregulation,mTORsignalingpathwayhasgraduallybecomethefocusofhotspots,thisarticlemainlyaroundthemTORsignalingpathwayandcellautophagyindiabeticchroniccomplicationsofarecentstudy,provideanewthinkingforclinicaltreatment.Keywords:mTOR;Autophagy;diabetes;complications细胞自噬普遍存在真核细胞生物及哺乳动物内，通过自我降解、自我消化可使细胞处于各种应激状态下重复利用三羧酸循环和营养物质生成的ATP继续生存。大量证据表明，自噬的激活与抑制在许多疾病中至关重要，如肿瘤、糖尿病、44 肝病、神经退行性变、心肌病、自身免疫疾病及感染性疾病[1]。众所周知，糖尿病慢性并发症是糖尿病致死致残的主要原因，而近期研究表明，细胞自噬在糖尿病肾病、糖尿病大血管病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病周围神经病变等慢性并发症的发生发展中起到重要作用。自噬通过mTOR依赖性及非mTOR依赖性途径调控自噬进程，mTOR作为自噬调控中关键的因子，可以通过调节细胞自噬进而影响糖尿病中的神经元、心脏、血管细胞的存活，阐明mTOR信号通路与自噬相互作用的机制可能在分子水平为治疗糖尿病慢性并发症提供新的思路。1细胞自噬与mTOR信号通路1.1细胞自噬自噬分为巨自噬（macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperonemediatedautophagy，CMA)[2]。自噬的主要形成过程包括：自噬的诱导；吞噬泡(phagophore)成核启动自噬；自噬体（auto-phagosome)的形成；自噬体的延伸及自噬体的成熟；自噬的降解（degradation）[2]，现已发现30多种自噬相关基因（autophagyrelatedgenes,ATG）参与自噬体的形成及成熟过程。生长因子缺乏，能量不足及氧化应激的状态下常可诱导自噬，当营养缺失时，细胞胞浆内生理性自噬作为一种保护机制，而过度自噬可能导致代谢失衡、降解细胞自身成分、细胞死亡等，因此研究自噬的机制与各种疾病的关系有着重要作用。1.2mTOR信号通路及其调控细胞自噬mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）是一种进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为氨基酸、生长因子、ATP及营养相关信号的感受器，参与核糖体生成、细胞发育和调节代谢等重要过程中。mTOR分别以雷帕霉素敏感型的mTORC1及非雷帕霉素敏感型的mTORC2存在，mTORC1主要作用于细胞生长、代谢、凋亡及自噬,后者主要利用细胞骨架重组来调控细胞的生长[3]。多条信号转导通路均参与到了自噬的调控，如mTOR信号通路、P53信号通路、beclin1信号通路、PI3K(phosphoinositide3-kinase)/AKT(proteinkinaseB)信号通路、AMPK（AMP-activatedproteinkinase）信号通路等，它们之间并非完全独立。目前，mTOR信号通路已成为研究最多的信号通路。mTORC1通过磷酸化由ULK1（unc-51likeautophagyactivatingkinase1）、Atg13、Atg101、RB1CC1（RB1-induciblecoiled-coil1）/FIP200组成的复合物45 ULK1/ATG1使其失活,从而负调控细胞自噬体的形成[4]。氨基酸及生长因子等营养相关信号可以通过激活mTORC1以调控自噬，当生长因子受体抑制时,Akt蛋白表达下降,TSC1（tuberoussclerosiscomplex-1）/TSC2（tuberoussclerosiscomplex-2）的活性被抑制,导致mTOR激酶的失活,相反,当AKT使TSC2磷酸化后,TSC2与TSC1之间解离,导致mTOR激酶的激活,自噬活性下降[5]；在饥饿及营养缺乏时，高浓度AMP启动AMPK自噬途径，AMPK可以通过激活TSC2进而磷酸化mTOR调控蛋白Raptor或磷酸化ULK1从而使mTORC1失活，诱导自噬水平提高，营养良好时则反之[6]。雷帕霉素（rapamycin,RAPA）作为mTOR抑制剂，又名西罗莫司（sirolimus）,主要对mTORC1发挥抑制作用，RAPA结合其胞内受体与mTOR相互作用干扰复合体结合raptor进而阻断mTOR信号通路[7]。2自噬与糖尿病慢性并发症2.1自噬与糖尿病微血管并发症2.1.1自噬与糖尿病肾病糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）是造成终末期肾病(end-stagerenaldisease，ESRD）的主要原因之一，随着近年来自噬的不断研究表明，自噬也参与到糖尿病肾病中，并有可能成为其新的治疗靶点[8]。链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠模型肾脏组织中可以发现自噬水平下降[9]；同时，在糖尿病患者的肾脏组织活检样本近端小管中我们也发现自噬溶酶体的标志蛋白P62的过多累积，提示自噬水平下降[10]。当mTORC1过度激活时，糖尿病患者及动物模型的肾脏组织中可见足细胞功能障碍、肾小管细胞及肾小球肥大、肾小球滤过率下降，同时，纤维化细胞因子会随着mTOR信号通路活化而表达增加，进一步加重糖尿病肾病间充质纤维化[11]；而糖尿病动物模型中基因敲除足细胞Rapter后，自噬水平上升，而蛋白尿、肾小球硬化、系膜基质扩张等明显减少[12];这些研究表明，适当减低mTORC1过度表达，可以起到延缓DN的作用。在腹腔注射雷帕霉素后，在糖尿病肾病大鼠模型自噬标志物LC3-II（Microtubuleassoeiatedprotein1lighthain3-II）/LC3-I值明显增加，足细胞数量增加[11]；糖尿病肾病患者给予一定剂量的雷帕霉素后，可以缓解尿蛋白、肾小球硬化[13]。除此之外，极低蛋白饮食饲养糖尿病肥胖大鼠20周后，大鼠肾组织中LC3-II值增加，mTORC1减少，提示低蛋白饮食可以通过抑制mTORC1通路从46 而恢复肾小管自噬从而进一步改善DN的损伤[14]。研究发现，中药中的黄连素也可以通过AMPK-mTOR信号通路促进自噬，起到改善DN的作用[15]。2.1.2自噬与糖尿病性心肌病糖尿病性心肌病（diabeticcardiomyopathy,DCM）是无基础心血管疾病的DM患者中存在的心室收缩功能障碍。当心肌长期处于高血糖及营养缺乏的状态下时，心肌可以通过自噬代偿性供能继续存活，在2型糖尿病db/db小鼠模型心肌组织中LC3-II表达明显升高，电镜观察心肌组织中可见不成熟的自噬小体[16],敲除ATG16的小鼠模型在诱导1型糖尿病后，相较野生型1型糖尿病小鼠模型心肌凋亡、纤维化及氧化应激水平均有下降[17]。在果糖诱导的2型糖尿病心肌病动物模型中，自噬水平明显增多，PI3K/AKT、mTOR信号通路参与到自噬的上调，当应用雷帕霉素干预后，通过抑制mTOR的表达，从而进一步改善心脏功能[18]。2.1.3自噬与糖尿病视网膜病变糖尿病病人失明的最主要原因为糖尿病视网膜病变（diabeticretinopathy，DR），自噬作为维持细胞稳态的保护机制，在DR中发挥重要作用。在DR的发展中，自噬标志物AGT5、Beclin1及LC-II明显增加[19]；研究发现，在大鼠视网膜Müller细胞暴露于高糖环境，结果发现自噬功能出现紊乱，导致凋亡增加，同时可以发现大量血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的释放，而使用雷帕霉素后自噬流得以改善，同时减少VEGF的释放，从而进一步延缓DR的进程[20]。mTOR抑制剂也可以通过控制缺氧诱导因子α（hypoxia-induciblefactor-1α,HIF-1α）调节的下游通路VEGF的激活，进而抑制早期DR的恶化[21]。2.2自噬与糖尿病大血管病变糖尿病大血管病变的主要特征性病理改变为高血糖所致的动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）。已有研究表明，人类动脉粥样硬化斑块中发现血管细胞自噬的表现，在AS的动物及细胞模型中，血管平滑肌细胞、血管内皮细胞及巨噬细胞中也存在着不同程度的自噬反应[22]。在众多AS机制中，自噬参与了刺激胆固醇流出、抑制泡沫细胞形成、抗感染应答[23]，在巨噬细胞源泡沫细胞中，过度激活的mTORC1导致自噬抑制，体外实验中，应用siRNA干扰mTORC1会诱发细胞自噬，并抑制泡沫细胞形成，从而进一步防止AS斑块形成[24]；在自47 噬促进泡沫细胞胆固醇外流的机制中也同样发现了mTOR信号通路的参与[25]。当选择性阻断mTOR/AKT信号通路时，通过自噬可以清除AS斑块中的巨噬细胞并加强斑块的稳定性[26]。大量的研究表明，靶向mTOR抑制剂的使用可以稳定AS斑块并减少其大小，为AS的治疗提供新的切入点[27]。2.3自噬与糖尿病认知功能障碍糖尿病认知功能障碍（DiabeticCognitiveImpairment,DCI）主要表现为推理能力缺失、记忆减退、学习能力下降、注意力不集中等，是由于糖尿病糖代谢紊乱导致代谢、神经化学、形态学、电生理及行为学等方面的改变引起的[28]。近年来，糖尿病认知功能障碍在医学界越来越受到重视，在阿尔兹海默病（AlzheimerDisease,AD）的模型中，自噬的激活有助于β-淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)的清除，而自噬的阻断则加重该病的发展[29]。孔飞娟等人在糖尿病认知功能障碍的小鼠模型中，发现利拉鲁肽可通过AMPK/mTOR信号通路上调自噬水平，进一步改善糖尿病引起的认知功能下降[30]。3总结与展望糖尿病是一种世界范围内日益严重的疾病，长期高血糖水平可以导致血管疾病、心肌肥厚、心肌细胞损伤、视网膜疾病、精神认知障碍等，而氧化应激及细胞损伤是其发生发展的主要机制。在近期发现的抗氧化应激的细胞策略中，mTOR信号通路与自噬受到广泛重视，它与细胞代谢及糖尿病密切相关，更可以影响血管、心脏、神经细胞的细胞活动。因此，mTOR通路与自噬相互作用及相关新药的研发可以为糖尿病并发症的治疗提供新的靶点。然而mTOR介导自噬在糖尿病并发症中的作用机制目前尚未完全阐明，需要我们更进一步的探究及思考。48 参考文献[1]ChoiAM,RyterSW,LEVINEB.Autophagyinhumanhealthanddisease[J].NEnglJMed,2013,368:651-662.[2]JinM,KlionskyDJ.Regulationofautophagy:modulationofthesizeandnumberofautophagosomes[J].FEBSLett,2014,588:2457-2463.[3]JungCH,RoSH,CaoJ,etal.mTORregulationofautophagy[J].FEBSLett,2010，584(7):1287-1295.[4]WirthM,JoachimJ,ToozeSA.Autophagosomeformation--theroleofULK1andBeclin1-PI3KC3complexesinsettingthestage[J].SeminCancerBiol,2013,23:301-309.[5]MellorKM,BellJR,YoungMJ,etal.Myocardialautophagyactivationandsuppressedsurvivalsignalingisasso-ciatedwithinsulinresistanceinfructose-fedmice[J].JMolCellCardiol,2011,50:1035-1043.[6]RyterSW,CloonanSM,ChoiAM.Autophagy:acriticalregulatorofcellularmetabolismandhomeostasis[J].MolCells.2013Jul;36(1):7-16.[7]LiuJ,MaKL,ZhangY,etal.ActivationofmTORC1disruptedLDLreceptorpathway:apotentialnewmechani-smfortheprogressionofnon-alcoholicfattyliverdisease[J].IntJBiochemCellBiol,2015,61:8-19.[8]KumeS,KoyaD,Autophagy:anoveltherapeutictargetfordiabeticnephropathy[J].DiabetesMetabJ,2015,39(6):451-460.[9]CinaDP,OnayT,PaltooA,etal.InhibitionofmTORdisruptsaytophaqicfluxinpodocytes[J].JAmSocNephr-ol,2012,23(3):412-420.[10]YamaharaK,KumeS,KoyaD,etal.Obesity-mediatedautophagyinsufficiencyexacerbatesproteinuria-inducedtubulointerstitiallesions[J].JAmSocNephrol,2013,24(11):1769-1781.[11]GodelM,HartlebenB,HerbachN,etal.RoleofmTORinpodocytefunctionanddiabeticnephropathyinhuma-nsandmice[J].JClinInvest,2011,121(6):2197-2209.[12]InokiK,MoriH,WangJ,etal.mTORC1activationinpodocytesisacriticalstepin49 thedevelopmentofdiabeticnephropathyinmice[J].JClinInvest,2011,121(6):2181-2196.[13]李锦,白雪源,崔少远,等.雷帕霉素对高糖诱导的肾系膜细胞自噬抑制、氧化损伤和衰老的影响[J].南方医科大学学报,2012,32(4):467-471.[14]MunehiroK,YoshioO,TaekoS,etal.Avery-low-proteindietamelioratesadvanceddiabeticnephropathythro-ughautophagyinductionbysuppressionofthemTORC1pathwayinWistarfattyrats,ananimalmodeloftype2diabetesandobesity[J].Diabetologia,2016,59(6):1307-1317.[15]肖冬.黄癸固体分散体通过激活AMPK通路治疗糖尿病肾病的作用机制研究[D].长春:吉林大学,2014.[16]XuX,KobayashiS,ChenK,etal.Diminishedautophagylimitscardiacinjuryinmousemodelsoftype1diabetes[J].BiolChem,2013,288(25),18077-18092.[17]HouX,HuZ,XuH,etal.AdvancedglycationendproductstriggerautophagyincadiomyocyteViaRAGE/PI3K/AKT/mTORpathway[J].CardiovascularDiabetology,2014,13(1):1925-1953.[18]FuD,YuJY,YangS.Survivalordeath:adualroleforautophagyinstress-inducedpericytelossindiabeticr-etinopathy[J].Diabetologia,2016,59:2251-2261.[19]LopesDE,FariaJM,DuarteDA,MontemurroC,etal.DefectiveAutophagyinDiabeticRetinopathy.InvestOphthalmol[J].VisSci,2016,57:4356-4366.[20]张梅,李春霞.HIF-1α与自噬在糖尿病视网膜病变中的相关性研究现状[J].临床眼科杂志,2017,(05):471-474.[21]PerrottaI.Theuseofelectronmicroscopyforthedetectionofautophagyinhumanatherosclerosis.Micron2013;50:7-13.[22]LiGH,LinXL,ZhangH,etal.Ox-Lp(a)transientlyinducesHUVECautophagyviaanROS-dependentPAPR-1-LKB1-AMPK-mTORPathway[J].Atherosclerosis,2015,243:223-235.[23]WangX,LiL,NiuX,etal.mTORenhancesfoamcellformationbysuppressingtheautophagypathway[J].DNACellBiol,2014,33:198-204.[24]OuimetM,MarcelYL.Regulationoflipiddropletcholesteroleffluxfrommacrophagefoamcells.ArteriosclerThrombVascBiol2012;32(3):575-81.50 [25]ZhaiC,ChengJ,MujahidH,etal.SelectiveinhibitionofPI3K/Akt/mTORsignalingpathwayregulatesautoph-agyofmacrophageandvulnerabilityofatheroscleroticplaque[J].PLoSOne,2014,9.doi:10.1371.[26]MartinetW,LoofH,DeGR.mTORinhibition:apromisingstrategyforstabilizationofatherosclerot-icplaques[J].Atherosclerosis,2014,233:601-607.[27]KanamoriH,TakemuraG,GotoK,etal.Autophagicadaptationsindiabeticcardiomyopathydifferbetweentype1andtype2diabetes[J].Autophagy,2015,11（7）:1146-1160.[28]TiedhjeV,SchlamannM,FÜhrerD,etal.Diabetesinsipidusasararecauseofacutecognitiveimpairmentinmultiplesclerosis[J].MultScler.2013,19(12):1676-1678.[29]JonesB.Liraglutideandcardiovascularoutcomesintype2diabetes[J].AnnClinBiochem.2016,53:712.[30]孔飞娟.利拉鲁肽对糖尿病小鼠认知功能下降的作用及其分子机制研究[D].浙江大学,2017.51 致谢这篇论文是在我的导师王建平教授的耐心指导下完成的！感谢导师王建平教授在这三年研究生阶段期间的悉心教导，从初入临床、课题设计、实验构思、实验实施到论文的撰写及修改，王老师给予了我最大的帮助及最细致的关心。王老师渊博的专业知识，严谨的教学风范，认真求精的工作态度，都让我十分钦佩。感谢南华大学附属第二医院内分泌科董晨珊老师、黄佳克老师、汪学军老师、郑薇老师、刘刚老师、夏常杰老师等全体老师在我临床轮转期间对我的帮助及指导。感谢内分泌科邓珊珊、姜爱花师姐、江涛师兄以及2016、17级师弟师妹们在学习、实验及生活方面给我的帮助。感谢南华大学病理系龙治峰老师，南华大学附属第二医院刘罗根、章运生等老师在实验中给予的指导与帮助。感谢南华大学附属第二医院邓宏军老师、宁文峰老师、陈亚军老师、王毅龙老师等教学科研部全体老师对我们学习及生活的帮助和关怀。感谢南华大学研究生处全体老师三年来对我的帮助。感谢各位教授、老师在忙碌中阅读并对这篇论文提出宝贵的意见。感谢我的室友和同学研究生期间对我的照顾，同窗三年，我们一起分享快乐，相互鼓励，祝愿我们都能顺利毕业，工作顺利。感谢多年来作为坚强后盾的父母亲及长兄，他们为我出了巨大心血，值得我用一生来回报。最后，再次感谢所有关心我、帮助我的人。谢谢！52
