《中国东北部汉族人群SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇遗传变异及基因表达与冠心病关系的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
中文摘要中国东北部汉族人群SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇遗传变异及基因表达与冠心病关系的研究第一部分SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇单核苷酸多态性与冠心病发病风险及血脂水平的关系目的：探索SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上的rs9346816、rs2221750、rs3127596、rs9364559、rs1367211、rs6415085、rs9347438及rs9355296位点与中国东北部汉族人群冠心病发病风险及血脂水平的关系。方法：本研究采用病例对照研究方法。病例组和对照组分别为551例和544例。研究人群均为中国东北部汉族人群，且个体间无血缘关系。病例组人群筛选自2009年~2012年在吉林大学第一医院二部心血管内科确诊并进行住院治疗的冠心病患者。选择同期在吉林大学第一医院体检中心健康体检的正常人群为对照组。采用SequenomMassArray系统对位于SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上的rs9346816、rs2221750、rs3127596、rs9364559、rs1367211、rs6415085、rs9347438及rs9355296位点进行基因分型，同时收集研究对象的流行病学资料。采用SPSS16.0统计软件对一般资料、等位基因及基因型与冠心病关系、SNPs和冠心病危险因素的关联分析及不同基因型人群间血脂水平的关系；采用SHEsis软件分析单倍型与冠心病的关系；采用Haploview软件进行连锁不平衡分析。采用多元线性回归分析校正混杂因素对结果的影响。结果：1.病例组中吸烟人数高于对照组，并且病例组中患有高血压病、糖尿病患者人数均多于对照组，病例组患者血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、脂蛋白(a)水平高于对照组，并且以上差异均具有统计学意义（P<0.05）。2.校正混杂因素后，SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上rs9364559位点基因型与等位基22因在病例组和对照组人群中的分布仍存在显著性差异（X=7.126,P=0.028；X=4.436,P=0.039）。 3.单倍体型分析结果显示7个位点组成的单倍型中GAAAGTG和GGAAGTG与冠心病发病风险相关（P<0.05），携带GAAAGTG单倍型人群冠心病的发病风险可能降低，但携带GGAAGTG单倍型人群冠心病的发病风险可能增高。由6个SNP位点构成的单倍型中有14种单倍型与冠心病的发病风险相关（P<0.05），其中8种单倍型可能增加冠心病的发病风险，6种单倍型可能降低冠心病的发病风险。由5个SNP位点构成的单倍型中有39种单倍型与冠心病的发病风险相关（P<0.05），其中21种单倍型可能增加冠心病的发病风险，18种单倍型可能降低冠心病的发病风险。由4个SNP位点构成的单倍型中有49种单倍型与冠心病的发病风险相关（P<0.05），其中22种单倍型可能增加冠心病的发病风险，27种单倍型可能降低冠心病的发病风险。由3个SNP位点构成的单倍型中有39种单倍型与冠心病的发病风险相关（P<0.05），其中19种单倍型可能增加冠心病的发病风险，20种单倍型可能降低冠心病的发病风险。由2个SNP位点构成的单倍型中有9种单倍型与冠心病的发病风险相关（P<0.05），其中3种单倍型可能增加冠心病的发病风险，6种单倍型可能降低冠心病的发病风险。4.位于SLC22A3基因上的rs9346816位点不同基因型间LDL-C、TC水平存在显著差异（P<0.05），LPA基因上的rs6415085位点不同基因型之间Lp(a)、LDL-C水平存在显著差异（P<0.05）。结论：1．吸烟、高血压病、糖尿病、血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、脂蛋白(a)水平可能与冠心病发病风险相关。2.SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇与中国东北部汉族人群冠心病发病风险及血脂水平相关。3.在中国东北部汉族人群中位于LPA基因上的rs9364559位点可能参与冠心病的发生与发展。4.多个SNPs位点同时存在可能对冠心病发病风险有不同的影响。第二部分中国东北部汉族人群SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇mRNA表达水平与冠心病发病风险的关系目的：分析SLC22A3,LPAL2和LPA基因mRNA表达水平与冠心病发病风险的关系；阐 述SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇遗传变异对mRNA表达水平的影响。方法：选择2012年在吉林大学第一医院二部心血管内科确诊并进行住院治疗的92例冠心病患者为病例组，选择同期在吉林大学第一医院二部心血管内科进行诊治的非冠心病患者32例为对照组。采用实时荧光定量PCR方法对SLC22A3,LPAL2和LPA基因mRNA的表达水平进行测定。分析病例组与对照组之间及携带不同基因型病例组人群间目的基因mRNA表达水平的差异。以上统计学分析均采用SPSS16.0软件。结果：1.病例组中吸烟、高血压病人数均高于对照组，病例组患者低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、脂蛋白(a)水平高于对照组，并且以上差异均具有统计学意义（P<0.05）。2.与对照组人群相比，冠心病患者外周血中LPA和SLC22A3基因mRNA的表达水平显著增高（P<0.05）；两组间外周血中LPAL2mRNA表达水平无显著差异（P>0.05）。rs9346816、rs2221750、rs3127596、rs9364559、rs1367211、rs6415085和rs9347438位点不同基因型患者外周血SLC22A3、LPAL2和LPAmRNA表达水平均无显著差异（P>0.05）。结论：1.外周血LPA和SLC22A3基因mRNA表达水平升高可能与中国东北部汉族人群冠心病的发病风险相关。2.染色体6q26-27区域SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上rs9346816、rs2221750、rs3127596、rs9364559、rs1367211、rs6415085和rs9347438位点的多态性与冠心病患者外周血中SLC22A3、LPAL2、LPA基因mRNA的表达水平无关，因此，上述SNPs位点可能不是通过影响基因转录水平参与冠心病的发生。第三部分SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇蛋白表达与冠心病发病风险的关系目的：研究SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇蛋白表达与冠心病发病风险的关系；阐明SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇遗传变异对其相邻基因蛋白表达水平的影响。方法： 选择2012年在吉林大学第一医院二部心血管内科确诊并进行住院治疗的55例冠心病患者为病例组，选择同期在吉林大学第一医院二部心血管内科进行健康体检的正常人15例为对照组。采用westernblot方法对外周血SLC22A3基因蛋白表达水平进行测定。用QuantityOne软件对蛋白表达进行半定量分析。采用SPSS16.0统计软件包进行统计学分析。结果：1.冠心病患者外周血中SLC22A3蛋白表达水平明显高于对照组，具有显著差异（P<0.05）。2.位于SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上rs9346816、rs2221750、rs3127596、rs9364559、rs1367211、rs6415085和rs9347438位点不同基因型间SLC22A3蛋白表达水平无显著性差异（P>0.05）。结论：1.冠心病患者外周血中SLC22A3蛋白表达水平增高可能是中国东北部汉族人群冠心病发病机制之一。2.SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇可能通过增加冠心病患者外周血中LPA和SLC22A3基因mRNA转录水平及SLC22A3蛋白表达水平影响冠心病发生。关键词：冠心病，脂蛋白(a)，SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇，遗传变异，基因表达 AbstractTheAssociationbetweenGeneticVariantsandExpressionofSLC22A3-LPAL2-LPAandCoronaryArteryDiseaseintheHansofNortheastChinaPartⅠTheassociationbetweengeneticvariantsoftheSLC22A3-LPAL2-LPAgeneclusterandcoronaryarterydiseaseriskandserumlipidlevelPurpose:Thecase-controlstudyinvestigatedtheassociationbetweenSLC22A3-LPAL2-LPAgeneclusterpolymorphisms(rs9346816,rs2221750,rs3127596,rs9364559,rs1367211,rs6415085,rs9347438andrs9355296)andcoronaryarterydisease(CAD)riskintheHansofNortheastChina.Methods:551well-characterizedCADcasesand544healthycontrolswereincludedinthisstudy.Theywereallrecruitedfromthedepartmentofcardiology,seconddivisionofFirstHospital,JilinUniversitybetween2009and2012.AllthesubjectsincludingthecasegroupandthecontrolgroupusedforthisstudywereChineseofHandescent,andwithoutboodrelationship.EightSNPs(rs9346816;rs2221750;rs3127596;rs9364559;rs1367211;rs6415085;rs9347438andrs9355296)weregenotypedbyreal-timeusingtheMassARRAYsystem(Sequenom;USA)intheSLC22A3-LPAL2-LPAgeneclusterofChineseHansample.Andtheepidemiologicaldataofallsubjectswerecollected.Characteristicsofsubjects,alleles,genotypesandserumlipidlevelsanalysiswereperformedwithSPSS16.0software.HaplotypeanalysiswasperformedwithSHEsissoftware.TheHaploviewprogram(version24.1)wasappliedtoestimatethelinkagedisequilibrium(LD)measures(D’andr)betweenpairedSNPs.WealsoappliedlogisticregressionanalysistocorrectthefinalPvalues.Results: 1.Comparedwithhealthycontrols,CADpatientsweremorelikelytobesmokers,hypertensionanddiabetesmellitus(P<0.05).Additionally,theCADgrouphadhigherlevelsofserumtotalcholesterol,LDL-C,HDL-CandLp(a)(P<0.05).2.Rs9364559wasassociatedwithCADandremainedsignificantevenafteradjustment2oftheconventionalCADriskfactorsbyforwardlogisticregressionanalysis(χ=4.436,P=0.039).ThefrequencyofminoralleleGinrs9364559wassignificantlyhigherinCADpatientsthanthatinhealthycontrols.Thegenotypicassociationbetweenrs9364559andCADandremainedsignificantevenafteradjustmentoftheconventionalCADriskfactorsby2forwardlogisticregressionanalysis(χ=7.126,P=0.028).3.ThehaplotypeanalysisresultsshowedthatsubjectswithdifferentblocksmayassociatedwithCAD(P<0.05).ThehaplotypeGAAAGTGformedby7SNPslociwasassociatedwithsignificantlyreducedriskofCAD,whilethosewithGGAAGTGwereassociatedwithsignificantlyincreasedriskofCAD.8haplotypesformedby6SNPslociwereassociatedwithincreasedriskofCADinthispopulation;6haplotypesformedby6SNPslociwereassociatedwithincreasedriskofCADinthispopulation.21haplotypesformedby5SNPslociwereassociatedwithincreasedriskofCADinthispopulation;18haplotypesformedby5SNPslociwereassociatedwithincreasedriskofCADinthispopulation.22haplotypesformedby4SNPslociwereassociatedwithincreasedriskofCADinthispopulation;27haplotypesformedby4SNPslociwereassociatedwithincreasedriskofCADinthispopulation.19haplotypesformedby3SNPslociwereassociatedwithincreasedriskofCADinthispopulation;20haplotypesformedby3SNPslociwereassociatedwithincreasedriskofCADinthispopulation.3haplotypesformedby2SNPslociwereassociatedwithincreasedriskofCADinthispopulation;6haplotypesformedby2SNPslociwereassociatedwithincreasedriskofCADinthispopulation.4.Thereweresignificantdifferencesamongdifferentgenotypesofrs9346816sitesonSLC22A3geneforLDL-C,TClevel(P<0.05)andofrs6415085sitesonLPAgeneforLp(a),LDL-Clevel(P<0.05). Conclusions:1.Smoking,diabetesmellitusandhypertensionmayberiskfactorsofCAD.2.TheSLC22A3-LPAL2-LPAgeneclusterisstronglyassociatedwithCADriskandserumlipidlevelintheHansofNortheastChina.3.Rs9364559intheLPAgenemayaffectriskofCADintheHansofNortheastChina.4.ManySNPslociexistatthesametimemayhavedifferenteffectsontheriskofcoronaryheartdisease.PartⅡTheeffectofSLC22A3-LPAL2-LPAgeneclusterexpressiononCADriskintheHansofNortheastChinaPurpose:ThepurposeofthisstudywastoanalyzetheeffectofSLC22A3,LPAL2,LPAgeneexpressiononCADriskintheHansofNortheastChina.Methods:First,sevenSNPs(rs9346816;rs2221750;rs3127596;rs9364559;rs1367211;rs6415085andrs9347438)intheLPAgeneweregenotypedusingSequenomMassARRAYtimeofflightmassspectrometer(TOF)in92CADpatientsascasegroupand32non-CADsubjectsascontrolgroup.Second,usingreal-timefluorescentquantitativePCRanalyzethemRNAexpressionlevelsofLPAgeneindifferentgenotypesofsevenloci.AllsubjectswerefromChineseHanancestryandrecruitedfromthedepartmentofcardiology,seconddivisionofFirstHospital,JilinUniversityin2012.SPSS16.0wasusedforaboveanalyses.Results:1.Comparedwithcontrolgroup,CADgrouphadmoresmokersandmoreindividualswithhypertension(P<0.05).Additionally,comparedwithcontrolgroup,CADgrouphadhigherlevelofserumLDL-C,HDL-CandLp(a)(P<0.05).2.Resultsshowedthatcomparedwithcontrolgroup,thecasegrouphasahighermRNAexpressionlevelofLPAandSLC22A3geneintheHansofNortheastChina(P<0.05).However,therewasnodifferenceforthemRNAexpressionlevelofLPAL2geneincaseandcontrolgroups.Additionally,therewasnosignificantdifferenceforthemRNAexpression levelofSLC22A3,LPAL2andLPAgeneamongdifferentgenotypesofsevenloci(rs9346816,rs2221750,rs3127596,rs9364559,rs1367211,rs6415085andrs9347438)intheHansofNortheastChina.Conclusions:1.IncreasedmRNAexpressionlevelofLPAandSLC22A3genemaybeassociatedwithCADrisk.2.Thepossiblemechanismsthatrs9346816,rs2221750,rs3127596,rs9364559,rs1367211,rs6415085andrs9347438attheSLC22A3-LPAL2-LPAgenecluseraffecttheoccurrenceofCADarenotbyinfluencingSLC22A3,LPAL2andLPAgenemRNAexpressionlevelsofthepatientsintheperipheralblood.PartⅢTheassociationbetweenproteinexpressionofSLC22A3-LPAL2-LPAgenecluserandCADriskPurpose:ToindentifytherelationshipbetweenproteinexpressionlevelofSLC22A3-LPAL2-LPAgenecluserandCAD;toclarifytheeffectofgeneticvariationsinSLC22A3-LPAL2-LPAgeneclusertoSLC22A3proteinexpressionlevels.Methods:55unrelatedpatientswithCADand15controlswererecruitedfromthedepartmentofcardiology,seconddivisionofFirstHospital,JilinUniversityin2012.WesternblotwasusedtotestSLC22A3proteinlevels.Semi-quantitativeanalysiswascarriedwithQuantityOnesoftware.SPSS16.0softwarewasusedtoanalyzethedata.Results:1.SLC22A3proteinlevelsincasegroupweresignificanthigerthanthatincontrolgroup(P<0.05).2.TherearenodifferencesofSLC22A3proteinlevelsbetweendifferentgenotypesofsevenloci(rs9346816,rs2221750,rs3127596,rs9364559,rs1367211,rs6415085andrs9347438)intheHansofNortheastChina(P>0.05).Conclusions: 1.IncreasedSLC22A3proteinlevelsmaybeassociatedwithCADrisk.2.IncreasedLPAandSLC22A3genemRNAexpressionlevelsandSLC22A3proteinlevelsofCADpatientsintheperipheralbloodmaybethepossiblemechanismsthatSLC22A3-LPAL2-LPAgenecluseraffecttheoccurrenceofCAD.Keywords：Coronaryarterydisease,Lp(a),SLC22A3-LPAL2-LPAgenecluser,geneticvariants,geneexpression 目录第1章绪论...............................................................................................11.1引言...........................................................................................................11.2文献综述..................................................................................................41.2.1Lp(a)的结构特征...............................................................................41.2.2Lp(a)在动脉粥样硬化形成机制中的作用.......................................51.2.3流行病学研究....................................................................................61.2.4遗传学研究........................................................................................61.2.5降Lp(a)治疗的研究进展..................................................................9第2章SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇单核苷酸多态性与冠心病发病风险及血脂水平的关系...............................................................................112.1材料与方法...........................................................................................112.1.1研究对象基本资料采集................................................................112.1.2生物样本采集................................................................................112.1.3主要试剂和器材............................................................................122.1.4SNPs基因分型方法......................................................................132.1.5统计分析........................................................................................182.2结果........................................................................................................182.2.1研究对象一般特征分析.................................................................182.2.2SNPs基因分型结果.......................................................................192.2.3Hardy-Weinberg平衡检验.............................................................212.2.4等位基因与基因型分析.................................................................222.2.5连锁不平衡分析.............................................................................232.2.6单倍型分析.....................................................................................242.2.7冠心病患者不同基因型之间血脂水平的关系.............................322.3讨论........................................................................................................36 2.4小结........................................................................................................38第3章中国东北部汉族人群SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇mRNA表达与冠心病的关系.....................................................................................393.1材料与方法............................................................................................393.1.1研究对象和样本采集.....................................................................393.1.2主要试剂和器材.............................................................................393.1.3SNPs基因分型...............................................................................413.1.4外周血中SLC22A3、LPAL2、LPA基因mRNA表达水平检测......413.1.5数据处理与分析.............................................................................433.2实验结果................................................................................................433.2.1总RNA质检结果..........................................................................433.2.2基本资料的比较.............................................................................443.2.3目的基因mRNA表达量与冠心病的关系...................................453.2.4冠心病患者基因分型与目的基因mRNA表达量的关系...........463.3讨论........................................................................................................483.4小结........................................................................................................49第4章SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇蛋白表达与冠心病的关系...............504.1材料与方法............................................................................................504.1.1研究对象和样本采集.....................................................................504.1.2主要试剂和器材.............................................................................504.1.3SNPs基因分型...............................................................................524.1.4试剂配制.........................................................................................524.1.5外周血中SLC22A3蛋白表达水平检测......................................534.1.6统计学分析.....................................................................................564.2实验结果................................................................................................564.2.1目的基因蛋白表达量与冠心病的关系.........................................564.2.2冠心病患者基因分型与目的基因蛋白表达量的关系.................57 4.3讨论........................................................................................................584.4小结........................................................................................................58第5章结论.............................................................................................61本研究的创新之处........................................................................................61参考文献.............................................................................................................63附录.............................................................................................................75作者简介及在学期间所取得的科研成果.........................................................77致谢.............................................................................................................79 中英文缩略词对照表缩写英文全称中文名称CADCoronaryarterydisease冠心病CVDCardiovasculardisease心血管疾病CHDCoronaryheartdisease冠心病OCTOrganiccationtransporters有机阳离子转运蛋白Lp(a)Lipoprotein(a)脂蛋白（a）LDL-Clowdensitylipoprotein-cholesterol低密度脂蛋白胆固醇TCtotalcholesterol总胆固醇TGtriglyceride甘油三酯VLDLverylowdensitylipoprotein极低密度脂蛋白ApoAapoproteinA载脂蛋白AApoBapoproteinB载脂蛋白BHDL-Chighdensitylipoprotein-cholesterol高密度脂蛋白胆固醇CIConfidenceinterval可信区间ASatherosclerosis动脉粥样硬化MImyocardialinfarction心肌梗死BMIBodymassindex体重指数EBEthylenedibromide溴化乙啶FBGfastingbloodglucose空腹血糖GWASGenome-wideassociationstudy全基因组关联研究HGPHumangenomeproject人类基因组计划HWEHardy-Weinbergequilibrium哈迪-温伯格平衡LDLinkagedisequilibrium连锁不平衡MIMyocardialinfarction心肌梗死MTAPMethylthioadenosinephosphorylase甲硫腺苷磷酸化酶 ODOpticaldensity吸光度OROddsratio比值比SNPsinglenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应Reversetranscription-polymerasechainRT-PCR逆转录聚合酶链反应reactionSDStandarddeviation标准差SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠TBSTrisbufferedsaline三羟甲基氨基甲烷缓冲液IMTintimamediathickness颈动脉内膜中膜厚度 第1章绪论1.1引言冠心病以极高的致死率及致残率成为影响人类健康的主要疾病之一，占所有致命性[1]事件的40%。并且每年全世界范围内因心血管疾病死亡的人数逐年增高。据统计，发[2,3]达国家心血管病死亡人数将从2000年的500万至2030年将增至6000万。在我国随着经济飞速发展，人民生活水平极大改善，居民生活方式改变，心血管疾病的发病率与死亡率也逐年增高。根据《中国心血管病报告2013》调查结果显示，中国城乡居民心血[4]管病患病率呈上升趋势,死亡率居高不下，全国每年约有350万人死于心血管病。因此，对以冠心病为首的心血管疾病的早期筛查、系统诊治及相关基础研究成为目前我国面临的重大公共卫生问题。多年来人们研究发现冠心病是多种因素作用于不同环节所致的一种复杂疾病。除了早期发现的年龄、性别、血脂异常、肥胖、高血压、糖尿病、不良生活方式等传统危险[5-7][8]因素，遗传因素也是导致冠心病发病的主要因素。存在冠心病、糖尿病、高血压、血脂异常家族史的人群冠心病发病率明显增加。近年来已克隆出与冠心病危险因素相关的易感或突变基因200种以上。冠状动脉粥样硬化引起管腔狭窄或闭塞是冠心病发病的主要环节。而内皮损伤反应被认为是动脉粥样硬化形成的主要机制。在长期血脂异常等危险因素作用下血管内皮损[9]伤，进一步导致血管内膜脂质异常沉积，最终致动脉粥样斑块形成。因此血脂代谢异常是动脉粥样斑块形成的主要环节。大量研究证实血清总胆固醇（totalcholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（lowdensitylipoprotein-cholesterol,LDL-C，尤其是氧化的LDL）或极低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein,VLDL）增高，相应的载脂蛋白B（apoproteinB，ApoB）增高，高密度脂蛋白胆固醇（highdensitylipoprotein-cholesterol,HDL）及载脂蛋白A（apoproteinA,ApoA）降低都是冠心病的危[10-12]险因素。近年来，Lp(a)[Lipoprotein(a),Lp(a)]在冠心病发病中的作用越来越受到人们的重视。大量研究表明Lp(a)与动脉粥样硬化的形成相关，是导致冠心病发生的独立危险因[13-16]素。Lp(a)是1963年挪威遗传学家Berg在研究低密度脂蛋白的遗传变异时首次发现[17]的，是一种特殊独立的血浆脂蛋白。Lp(a)是由富含胆固醇的LDL微粒通过apoB100与apo(a)形成二硫键组成，因其独特的化学结构，不论从结构和生物学特点方面，Lp(a)[18-24]均与LDL相似。1 免疫学定位发现在纤维帽、细胞外基质、内皮细胞和内皮下层等部位存在大量Lp(a)。进一步研究发现Lp(a)可通过本身的apo(a)组分引起人脐静脉内皮细胞和人冠状动脉内皮细胞的肌动蛋白细胞骨架重排，分散钙粘连蛋白，导致细胞收缩和通透性增加，造成内[25]皮功能紊乱。并且通过与内生性半乳凝集素-1结合，参与促进前者在血管内皮下的停[26,27]留与积聚，从而增加动脉硬化风险。另外，Lp(a)可通过破坏促凝与抗凝平衡导致[28]严重的血栓形成。Lp(a)通过与纤维蛋白溶酶原竞争纤维蛋白的结合位点，直接抑制组织型纤维蛋白溶酶原激活物的活性，同时刺激血管内皮细胞及肝脏细胞分泌组织纤溶酶原激活抑制物-1抗原及其mRNA的表达，间接抑制组织型纤维蛋白溶酶原激活物的活性，造成血浆纤溶与凝血功能失去平衡，凝血功能占相对优势，促进血栓形成和动脉粥[28,29]样硬化(atherosclerosis,AS)发展。并且Lp(a)能够破坏抗炎机制，通过apo(a)特异性和β2整联蛋白Mac-1相互作用，不但促进单核细胞黏附和迁移到血管内皮下，而且能激[30]活促炎转录因组NFκB的表达，使炎症细胞聚集到粥样硬化斑块中，促进AS进程。[31,32]流行病学研究结果显示Lp(a)水平与心血管疾病患病率和死亡率呈正相关。孟德尔随机研究结果显示升高的Lp(a)与增高的心肌梗死(myocardialinfarction,MI)发病[33]风险之间存在因果相关。另外，欧洲动脉粥样硬化协会(EAS)同样认为升高的Lp(a)[34]与升高的CVD/CHD风险关联，并且其关联具有广泛而持续的特点。美国卫生保健研究与质量管理处实施了一个16项高质量研究的荟萃分析，结果显示高于300mg/L的血浆Lp(a)水平相对低于此标准的人群增加的CHD风险比是1.57(95%CI:1.31-1.88)，而且随追[35]踪观察时间延长这种风险比趋于更高。通过上述研究可以证实增高的Lp(a)水平可增加冠心病发病风险。这也使得科学家们更加关注Lp(a)增高及其导致冠心病发生的分子机制。试图通过降低血浆Lp(a)水平或干预导致冠心病发病的关键环节从而起到对冠心病早期预防及针对性治疗的作用。目前单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)是人类发现的第三代遗传标记，广泛应用于复杂疾病及性状的遗传学研究。其广泛存在于人类基因组中，是人类可遗传的变异中最常见的一种。而全基因组关联分析(Genome-wideassociationstudy，GWAS)，是在人类全基因组范围内找出存在的序列变异，即SNP，从中筛选出与疾病相关的SNPs。为人们打开了一扇通往研究复杂疾病的大门。近年来，全世界通过[36-40][41-48]GWAS发现了多个与冠心病及危险因素相关的遗传区域，包括9p21，1p13，SLC22A3-LPAL2-LPA等。[49-51]研究发现Lp(a)血浆水平主要受遗传因素调控，其中90%由LPA遗传变异决定2 [52]。Apo(a)基因LPA位于染色体6q26-27区域，基因多态性可通过影响apo(a)颗粒大小而发挥作用。研究发现apo(a)分子大小与血浆Lp(a)水平呈负相关，并且相同Lp(a)水平，携[53-56]带小分子apo(a)者心血管疾病发病风险明显增高。LukeMM等科学家的研究发现位[57]于LPA基因上的6个SNPs明显与Lp(a)血浆水平有关，其中，携带LPArs3798220（I4399M）等位基因者的血浆Lp(a)水平是非携带者的5倍。rs3798220和rs10455872与低[33]kringleIV-2拷贝数相关，rs3798220解释了8%的Lp(a)水平的变异，rs10455872解释了25%的变异，而两者联合可解释36%的Lp(a)水平变异，因此含有一个或多个SNP变异的[58]等位基因样本平均Lp(a)水平呈几何增加。但是Lp(a)水平分布存在种族特异性。2009年以来，国内外科学家分别对欧洲人群及中国汉族人群中进行的GWAS研究均发现位于染色体6q26-27上的SLC22A3[40]-LPAL2-LPA基因簇与Lp(a)水平及冠心病发病风险相关。2011年,ShawSY等科学家对SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇进行DNA分析，发现此位点基因多态性可增加MI的危[59]险性。另外，KochW等人在2136病例组与1211对照组中分别检测LPA基因上的基因多态性，结果显示rs3798220和rs10455872位点的次要等位基因与冠心病发病风险相[60][61]关（rs3798220-C:P=0.00080;rs10455872-G:P<0.00001）。LvXF等人在中国东北部汉族人群中检测了SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上rs2048327，rs3127599，rs7767084andrs10755578等4个基因多态性位点，结果显示在汉族人群中未发现该遗传区域与冠心病发病风险相关。因此，关于SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇基因多态性与冠心病发病风险关系的研究有待进一步阐明。本研究应用质谱分析法分别对位于染色体6q26-27上SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇区域的8个SNPs位点（rs9346816,rs2221750,rs3127596,rs9364559,rs1367211,rs6415085,rs9347438和rs9355296）进行基因分型，通过统计学方法分析SNPs与冠心病发病风险的关系，寻找SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇与冠心病发病相关的阳性位点，从而探讨SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇与冠心病发病机制的关系。另外，通过检测人外周血中SLC22A3，LPAL2和LPA基因mRNA表达量及SLC22A3蛋白表达的水平进而分析不同基因型对SLC22A3，LPAL2和LPA基因转录和翻译水平的影响，进一步探索SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇影响冠心病发病的分子机制，为冠心病早期预防、基因诊断及个性化治疗奠定实验基础。3 1.2文献综述脂蛋白(a)与冠心病关系的研究进展冠心病以极高的致死率及致残率成为影响人类健康的主要疾病之一，占所有致命性[1]事件的40%。并且每年全世界因心血管疾病死亡的人数逐年增高。据统计，发达国家[2-3]心血管病死亡人数将从2000年的500万到2030年将增至6000万。随着我国经济的飞速发展，人民生活水平极大改善，居民生活方式改变，我国心血管疾病的发病率与死亡率也逐年增高。根据《中国心血管病报告2013》调查结果显示，中国城乡居民心血管[4]病患病率呈上升趋势，死亡率居高不下，全国每年约有350万人死于心血管病。因此，对以冠心病为首的心血管疾病的早期筛查、系统诊治及相关基础研究成为目前我国面临的重大公共卫生问题。尽管动脉粥样硬化的病理学改变已经得到证实，一些易患因素也作为防治的重要手段，可能的诸多发生机制也得到一定的共识，但是，动脉粥样硬化发生发展的真正面纱远远没有揭开。多年来研究认为胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇增高是动脉粥样硬化的独立危险因素，进而低密度脂蛋白胆固醇被氧化、迁移到内皮下成为粥样斑块的重要原因。然而，目前的研究远远没有揭开这个威胁人类健康疾病的面纱。从病理解剖结果我们可以看到动脉内膜脂质异常沉积是动脉粥样硬化形成的主要原因，因此脂质代谢异常是冠心病的独立危险因素，并有可能是冠心病发病机制之一。大量研究证实血清TC、TG、LDL或VLDL增高，相应的ApoB增高，HDL减低，ApoA[31,58,62,63]降低都是冠心病的危险因素。并且控制上述危险因素有助于降低冠心病发病风险。近年来Lp(a)在冠心病发病中的作用越来越受到科学家们的广泛关注。大量研究表明Lp(a)是冠心病的独立危险因素，增高的Lp(a)水平可通过多种途径作用于血管内皮致[12,14-16]动脉粥样硬化形成。本文我们分别将从以下方面阐述目前国内外关于Lp(a)与心血管疾病关系的研究现状。1.2.1Lp(a)的结构特征[17]Lp(a)是一种特殊独立的血浆脂蛋白，是Berg于1963年分离血浆脂蛋白时发现的，[18,21,23,24,64]由富含胆固醇的LDL微粒通过apoB100与apo(a)形成二硫键组成（图1.1）。不论从结构和生物学特点方面，Lp(a)均与LDL相似，其体积介于LDL与VLDL之间，但4 密度相当于HDL的密度。Lp(a)结构中的apo(a)是由多个高度糖基化的三维环状结构(Kingle)构成，每个环状结构平均包含80个氨基酸，而apo(a)的主要组成成分环状结构IV(KIV)被分为10种不同的亚基，其中第9亚基(KIV-9)中Cys67通过二硫键与ApoB100中[19]的Cys3734相连。除了KIV-2外，其他9种亚型仅表达一种拷贝数，而kringleIV-2因拷[20]贝数不同成为apo(a)亚型划分的依据。图1.1脂蛋白（a）分子结构图[18]1.2.2Lp(a)在动脉粥样硬化形成机制中的作用免疫定位发现，Lp(a)存在于纤维帽、细胞外基质、内皮细胞和内皮下层部位，通过多种机制参与动脉斑块形成：①Lp(a)可与内生性半乳凝集素-1结合，参与促进前者在血[26,27]管内皮下的停留与积聚，从而增加动脉硬化风险。②Lp(a)可通过其apo(a)组分引起人脐静脉内皮细胞和人冠状动脉内皮细胞的肌动蛋白细胞骨架重排，分散钙粘连蛋白，[25]导致细胞收缩和通透性增加，造成内皮功能紊乱。③Lp(a)可通过破坏促凝与抗凝平[28]衡导致严重的血栓形成。Lp(a)与纤维蛋白溶酶原竞争纤维蛋白的结合位点，直接抑制组织型纤维蛋白溶酶原激活物的活性，同时刺激血管内皮细胞及肝脏细胞分泌组织纤溶酶原激活抑制物-1抗原及其mRNA的表达，间接抑制组织型纤维蛋白溶酶原激活物的活性，造成血浆纤溶与凝血功能失去平衡，凝血功能占相对优势，促进血栓形成和AS[28,29]发展。④Lp(a)易与细胞表面的黏多糖，包括正常抑制血栓形成的肝素和硫酸乙酰肝素结合，封闭后二者的底物，使抑制血栓形成作用失活，从而加剧血栓的形成。⑤Lp(a)5 能够破坏抗炎机制，其通过apo(a)特异性和β2整联蛋白Mac-1相互作用，不但促进单核细胞黏附和迁移到血管内皮下，而且能激活促炎转录因组NFκB的表达，使炎症细胞聚集[30][65]到粥样硬化斑块中，促进AS进程。⑥Lp(a)可以诱导内皮细胞的凋亡。1.2.3流行病学研究多项大型前瞻性研究结果表明：Lp(a)水平与心血管疾病患病率和死亡率呈正相关，但是基线水平Lp(a)与已知的心血管风险因子几乎没有关联，个体内Lp(a)水平随时间保[31,32]持高度一致。孟德尔随机研究结果显示升高的Lp(a)与增高的心肌梗死（myocardial[33]infarction,MI）发病风险之间存在因果相关。欧洲动脉粥样硬化协会（EAS）认为升[34]高的Lp(a)与升高的CVD/CHD风险关联，并且其关联是广泛而持续的。同样，美国卫生保健研究与质量管理处实施了一个16项高质量研究的荟萃分析，结果显示高于300mg/L的血浆Lp(a)水平相对低于此标准增加的CHD风险比是1.57（95%CI:1.31-1.88），而且随追踪观察时间延长这种风险比趋于更高,综合评估在男性和女性中产生了相同的结[35]果。然而，目前对Lp(a)水平与动脉粥样硬化关系的研究结果并不完全一致。CalmarzaP等人研究对比了不同Lp(a)水平颈动脉内膜中膜厚度（IMT），结果显示在健康人群中，高水平Lp(a)（>300mg/L）个体和较低水平（<300mg/L）个体的IMT并没有明显差异，[66]说明高水平Lp(a)不能促使早期As的发生。综上所述，流行病学研究表明升高的Lp(a)水平确实与冠心病发病风险相关，并且这个相关性为线性相关，但无明显的临界值，并且不依赖于LDL与非HDL胆固醇水平增高，与其他心血管危险因素也无关。但是，目前的研究结果在评估Lp(a)水平对冠心病预防及治疗的作用方面并未给出详细的依据。1.2.4遗传学研究[8]冠心病是环境因素与遗传因素共同作用导致的一种复杂疾病。因此对于冠心病遗传因素的研究成为探索冠心病发病机制的热点。单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）是第三代遗传标记，广泛存在于人类基因组中，是人类可遗传的变异中最常见的一种。目前广泛应用于复杂疾病及性状的遗传学研究。而全基因组关联分析（Genome-wideassociationstudy,GWAS），是在人类全基因组范围内找出存在的序列变异，即单核苷酸多态性，从中筛选出与疾病相关的SNPs。为人们打开了一扇通往研究复杂疾病的大门。近年来，全世界通过GWAS发6 [36-40][41-48]现了多个与冠心病及危险因素相关的遗传区域，包括9p21,1p13，SLC22A3-LPAL2-LPA等。[49-51]Lp(a)的血浆水平主要受遗传因素调控，其中主要取决于遗传因素中apo(a)基因[31][67]多态性（图1.2）。apo(a)基因LPA位于染色体6q26-27区域，血浆Lp(a)水平90%由LPA[52]决定。研究发现，影响LPA的Lp(a)血浆水平主要受SNP和kringleIV-2的拷贝数的影响[58,63][57]。已经发现LPA的6个SNP明显与Lp(a)血浆水平有关。其中，携带LPArs3798220(I4399M)等位基因者的血浆Lp(a)水平是非携带者的5倍。rs3798220和rs10455872与低[33]kringleIV-2拷贝数相关，rs3798220解释了8%的Lp(a)水平的变异，rs10455872解释了25%的变异，联合二者可解释36%的Lp(a)水平变异，含有一个或多个以上二者SNP的变[58,63][59]异等位基因样本的平均Lp(a)水平呈几何增加。2011年,ShawSY等科学家的研究对SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇进行DNA分析，发现此位点基因多态性可增加心肌梗死的危险性。但上述SNP变异导致Lp(a)水平变化及冠心病发病的具体机制尚不明确。[67]图1.2血浆脂蛋白（a）水平调控示意图另外，Lp(a)水平分布存在种族特异性。在非西班牙白人、非西班牙黑人、墨西哥美国人3个亚群中进行LPA变异与Lp(a)水平的关联试验，对7159个参与者用19个LPA的标签SNP进行基因分型后，发现15个SNP至少在一个亚群中与Lp(a)水平有很强的相关性，有6个SNP分别在两个亚群与Lp(a)水平相关，但没有一个SNP分别在3个亚群中都与Lp(a)7 [68]水平相关。由南亚、中国、欧洲高加索多民族组成的样本，在100kb的LPA上基因分型出49个SNP，通过定量PCR在每个样本中检测出kringleIV-2的拷贝数。SNP与kringleIV-2拷贝数共同解释了高加索人种36%Lp(a)水平变异，中国人Lp(a)水平的27%变异，南[69]亚人种21%的Lp(a)水平变异。另外LPA转基因小鼠证实LPA启动子的-846—-814核苷酸之间的同向重复序列1作为法尼酯X受体（FXRfarnesoidXnuclearreceptor）负性反应元件。这段基因序列也能结合肝细胞核因子4α（hepatocytenuclearfactor4α,HNF4α），后者[70]可启动LPA的转录，FXR与HNF4α竞争结合这段基因序列可抑制LPA的表达。Lp(a)颗粒大小由kringleIV-2拷贝数决定，而Lp(a)颗粒大小又决定了其分泌速度乃至Lp(a)血浆[71,72]浓度，因而kringleIV-2拷贝数直接影响Lp(a)的血浆水平。对来自哥本哈根居民心脏研究（CCHS），哥本哈根一般群体研究（CGPS）和哥本哈根缺血性心脏病研究（CIHDS）的白人进行个体评估后，发现rs3798220和rs10455872两个等位基因上总的kringleIV-2拷贝数变化范围在6-99之间，在CCHS和CGPS的变异分析中，kringleIV-2分别解释了21%[33]和27%的Lp(a)水平变异，同样kringleIV-2拷贝数解释了CGPS22%的Lp(a)的变异水平。SNPs的研究属于基因组DNA多态性研究范畴。而疾病的发生可能存在于基因最终表达为功能蛋白质过程中的任何阶段。目前对于基因功能及基因表达调控的研究也成为冠心病发病机制研究的热点。NieS等人研究发现位于OCT3基因上的4个SNPs位点rs2292334，rs2048327，rs1810126，rs3088442可在基因转录及翻译水平降低肝脏SLC22A3[73]mRNA及蛋白表达。另外，MicroRNA是一种单链非编码RNA，其长度为22nt左右，[74]于1993年由LeeRC等首次发现。miRNA主要通过与目前基因mRNA结合，在翻译水平抑制该mRNA翻译成蛋白质，从而下调该蛋白的表达水平。周莉等人研究发现位于SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇下游3’UTR区域的rs3088442-G等位基因可能是通过影响microRNA结合来增加了mRNA的稳定性，从而使该基因簇上的基因表达水平提高[75]。另外，miR-626显著下调apo(a)表达水平；miR-626下调HepG2表达apo(a)是通过[76]直接和LPAmRNA3’-UTR序列结合，抑制LPAmRNA翻译实现的。综上所述，通过对Lp(a)与冠心病关系的遗传学研究不仅使我们进一步详细明确Lp(a)在冠心病发生发展中的作用机制，并且其导致冠心病发生的任何环节都有可能成为早期预防与临床治疗的靶点。8 1.2.5降Lp(a)治疗的研究进展由于高血浆Lp(a)水平是冠心病的独立危险因素，因此对于寻找降Lp(a)的治疗方法一直是科学家们研究的热点之一。但是由于Lp(a)独特的合成与分解代谢方式，导致人们目前尚未发现有效降低Lp(a)水平的方法。Lp(a)水平在不同个体间差异较大，临床应[77]用的正常参考值范围为0-300mg/dl。研究发现Lp(a)血浆浓度比较稳定，不受饮食与[78-80]运动的影响。对于降低Lp(a)水平的药物研究发现，可有效降低其他血脂水平及冠[81-84]心病发病风险的他汀类药物对Lp(a)水平无效。另外，人们研究发现雌激素与血浆[85]Lp(a)水平有关，但是目前尚不能应用于临床治疗。人们研究发现甲状腺激素类似物[86,87]伊罗替罗可与他汀类药物或依折麦布协同作用降低Lp(a)水平，但有研究发现其可[88][89]导致软骨损伤。目前研究发现烟酸可有效降低Lp(a)水平。LavignePM等科学家对11个随机对照试验的9959名受试者进行分析，结果显示烟酸可有效降低心血管事件[90]。但是最近BodenWE等进行的研究显示烟酸可降低Lp(a)水平，但是并无充分的证据证明其可降低心血管病事件。因此烟酸可作为降脂药物，但是其作用机制及对心血管事件的作用尚未明确。另外，研究发现apoB100抑制剂、微粒体甘油三酯转运蛋白抑制剂、胆固醇酯转运蛋白抑制剂、前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCKS-9）等可降低Lp(a)[91-94]水平，但是其有效性及安全性尚待进一步研究明确。除了药物治疗外，人们研究发现血液透析不仅可有效降低LDL-C，同时可降低血浆Lp(a)水平，可用于严重的高脂血[95,96]症人群。但是因其复杂性及费用昂贵目前尚不能广泛应用于临床。因此，进一步寻找有效的降Lp(a)的方法仍是目前研究的重点。9 技术路线（1）阳性位点的筛选：所有的研究对象（签署知情同意书）病例组对照组分析传统危险因素在两收集样本资料采集血样组中的差别提取DNA，采用质谱法对SNPs分型分析SNPs与冠心病分析不同基因型间发病风险间的关系血脂水平的差异（2）基因表达水平分析：根据质谱分析结果对受试者按照基因型进行分组提取外周血RNA提取血浆蛋白反转录为cDNA进行Westernblot目的片段PCR扩增QuantityOne软件分析测定区带的光感密度SyberGreen荧光定量PCR检测分析不同基因型间蛋白质表达水分析不同基因型平的差异mRNA转录水平的差异10 第2章SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇单核苷酸多态性与冠心病发病风险及血脂水平的关系2.1材料与方法2.1.1研究对象基本资料采集本研究采用病例对照研究方法。病例组和对照组分别为551例和544例。研究人群均来自于中国东北部汉族人群，且个体间无血缘关系。病例组为2009年~2012年在吉林大学第一医院二部心血管内科确诊并进行住院治疗的冠心病患者。入选标准：①临床表现及心电图改变均符合1979年WHO制定的冠心病诊断标准；②经冠状动脉造影显示至少有1支冠状动脉管腔狭窄≥50%；③个体之间无血缘关系。排除标准：①合并其他心脏疾病如扩张型心肌病、风湿性心脏病等；②严重的肝肾疾病。选择同期在吉林大学第一医院体检中心健康体检的人群为对照组，入组对象均经病史询问、体格检查、心电图、心脏彩超和其他血液生化检查无异常发现，且以前无冠心病病史的正常人。对所有研究对象进行统一问卷调查（见附录）。流行病学调查的资料包括：（1）一般人口学资料：姓名、年龄、性别、民族、婚姻状况、职业、学历、居住条件等。（2）病史资料：现病史、既往病史（高血压、糖尿病、心脏病、其他血管性疾病）、有无服用雌激素和避孕药史（女性填写）、有无降血压及降血脂治疗、家族史（父亲、母亲、子女、兄弟姐妹、祖父母、外祖父母及其他亲属）等。（3）生活方式资料：吸烟、饮酒、饮食习惯、工作压力和体育锻炼等。（4）体检资料：身高，体重、臀围和腰围等。（5）实验室检查资料：空腹血糖（fastingbloodglucose,FBG）、TC、TG、LDL-C、高密度脂蛋白胆固醇（highdensitylipoprotein-cholesterol,HDL-C）、Lp(a)、apoA、apoB等。高血压、糖尿病、肥胖等疾病的诊断均按照国际通用的统一诊断标准。本研究已通过吉林大学第一医院医学伦理委员会批准，并且研究对象已签署知情同意书。2.1.2生物样本采集经知情同意后，抽取研究对象空腹肘静脉血5毫升，EDTA-K2抗凝管采集后分离全血和血浆，储存于-80℃冰箱备用，全血用于提取基因组DNA。11 2.1.3主要试剂和器材2.1.3.1主要试剂血液基因组DNA提取试剂盒TIANGEN，北京引物Invitrogen公司，美国TaqDNA聚合酶sequenom公司，美国PCR缓冲液sequenom公司，美国dNTPMixsequenom公司，美国SAP缓冲液sequenom公司，美国SAP酶sequenom公司，美国iPLEXBufferPlussequenom公司，美国iPLEXTerminationmixsequenom公司，美国iPLEXEnzymesequenom公司，美国DNAmarkerDL2000TIANGEN，北京琼脂糖Biowest，西班牙溴酚蓝宝生物，大连溴化乙锭宝生物，大连矿物油Sigma，美国三羟甲基氨基甲烷Promega，美国乙二胺四乙酸Sigma，美国硼酸北京化工厂，北京2.1.3.2主要器材MALDI-TOF质谱仪sequenom公司，美国分光光度计岛津，日本DNA浓度检测仪Thermo，美国凝胶成像系统BIO-RAD，美国高速台式离心机Eppendorf，德国电子分析天平BIO-RAD，美国电泳仪六一仪器厂，北京水平琼脂糖电泳槽六一仪器厂，北京12 恒温水浴箱上海贺德实验设备有限公司，上海高压灭菌锅SANYO，日本FSD-40B型微波炉珠海格力小家电有限公司，珠海烘箱黄石市恒丰医疗器械有限公司，黄石旋涡混合器北京同正生物技术发展公司-80℃冰箱SANYO，日本20μL，200μL，1000μL移液器Gilson，法国星星牌低温冷柜星星集团有限公司，浙江制冰仪Scotsman，美国微量移液器吸头江苏海门塑料厂，江苏Eppendorf离心管江苏海门塑料厂，江苏2.1.4SNPs基因分型方法2.1.4.1DNA提取和检测采用TIANGENDNA提取试剂盒提取外周血白细胞中基因组DNA。具体操作步骤如下：（1）取300μL抗凝血于1.5mlEP管中，再向管中加入750μL细胞裂解液CL，并颠倒混匀5次。（2）12000rpm离心1分钟，倒掉上清，将EP管倒扣在干净的吸水纸上，留下细胞核沉淀。（3）按照100:1的比例配置缓冲液FG和蛋白酶K的混合液。（4）加入150μL配置好的缓冲液FG和蛋白酶K混合液，立即混匀至完全溶解。若有少量的胶状沉淀未混匀，可向管中补加30μL的混合液。（5）65℃水浴10min，并颠倒混匀数次至溶液从红色变为黄绿色。（6）加入150μL异丙醇，充分颠倒混匀（至少20次）至出现絮状基因组DNA沉淀。（7）12000rpm离心5分钟，倒掉上清，将EP管倒扣在干净的吸水纸上，并确保沉淀在EP管中。（8）沿管壁转圈加入150μL浓度70%的乙醇，涡旋震荡混匀5秒钟，12000rpm离13 心2分钟，倒掉上清。（9）重复步骤8。（10）将EP管倒扣在干净的吸水纸上至少5分钟，并确保沉淀在EP管中。（11）晾干DNA沉淀至少5分钟，保证所有液体挥发干净，同时要避免DNA沉淀过分干燥。（12）加入200μL缓冲液TB，轻轻低俗涡旋5秒钟，65℃水浴溶解DNA，轻弹助溶至DNA完全溶解。为防止DNA降解，将DNA产物保存于-20℃待用。使用美国BECKMAN公司生产的Du640型紫外分光光度计，分别测量所提取DNA产物的吸光度值OD260和OD280。终浓度为20-50ng/ul，OD260/OD280为1.5-2.0。通过以下公式计算所提DNA浓度和纯度：DNA含量计算公式：DNA含量=50mg/ml×OD260×稀释倍数；DNA纯度计算公式：DNA纯度=OD260/OD280。2.1.4.2引物设计及合成选择已报道的SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上冠心病风险位点rs9346816、rs2221750、rs3127596、rs9364559、rs1367211、rs6415085、rs9347438及rs9355296为待测位点，通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov及http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP以SNP位点为中心获取100bp以上长度的基因序列。采用AssayDesigner3.1软件进行扩增引物和延伸引物设计，引物序列见表2.1。设计好的引物由美国Invitrogen公司合成。Table2.1TheamplificationprimersandextensionprimerssequenceofthelocigeneSNPsForwardprimer（5’-3’)Reverseprimer（5’-3’)Extensionprimer（5’-3’)SLC22A3rs9346816ACGTTGGATGCTCACTTACGTTGGATGCTCTGTACGAAAATCCTTTCCTCCTAATCCCTACCCACCTTCCTTTCCTCCTAAAAAAAACrs2221750ACGTTGGATGTTTCTCCACGTTGGATGCTCTTGCTGGGGAAGTATTGGAAATCAGAGCCTGCTTCGTGCAGTATTGGACTGCTCATALPArs3127596ACGTTGGATGTATGGGACGTTGGATGAAGCACTAGTAATATGCTCATAAGTATGCCATCCTTCTCGCAGATGCTTGAGTCCC14 续表：Table2.1TheamplificationprimersandextensionprimerssequenceofthelocigeneSNPsForwardprimer(5’-3’)Reverseprimer(5’-3’)Extensionprimer(5’-3’)rs9364559ACGTTGGATGTTTTGTCACGTTGGATGAGGAGAGATGAGAATTAGGAAGTACATGTACCTGCCCGAAGAGCAAAAGCAACAGACrs1367211ACGTTGGATGGTGGATTACGTTGGATGGCTCTATGATGGGAAACTGGATTATAGGTTCAGAATGCCTGGAAAACTGGTGAACAGGCACrs6415085ACGTTGGATGACTTTAGACGTTGGATGCACTTCCTTATTCCCCACATGATTTCATATGTAGAGGAATTATTCCCCACAGGrs9347438ACGTTGGATGGTTCTAGACGTTGGATGTTCAGCCCCATGGAAACTAGGATGCCTTTGGGTGTAGCATGGAAACTAGGTAGArs9355296ACGTTGGATGAGAAGTACGTTGGATGAGTGATGTACCGAAGAGTATTTTGTTGCCAGCTTCTCTTTTCTTTGTCCCAAATGCACCA2.1.4.3SequenomMassArray系统基因分型由博淼生物科技（北京）有限公司对DNA样本进行SNP基因分型，分型方法采用SequenomMassArray系统，主要步骤如下：（1）PCR扩增反应①已经标化至10~20ng/μL的样本，1,000g离心3分钟备用。②将各PCR组份溶解后置于冰上备用（注意酶一定要保存在冰上，防止在高温中长时间暴露而失活）。③扩增PCR反应组份见表2.2。Table2.2ComponentsandreagentsofamplificationPCRinSequenomMassArraysystemConc.in5μLVolumeofreagentVolume（20%>27plexesVolume（20%Reagentrxnin5μl[μL]overhang)[μL]overhang)[μL]384×1.20Water,HPLCgradeN/A1.8829.8829.4410xPCRBuffer1.25×0.5230.4230.4with15mMMgCl2(1.875mMMgCl2)25mMMgCl21.625mM0.4184.4184.3225mMdNTPMix500uM0.146.146.080.5uMPrimerMix0.1uM1461460.85U/μlHotStarTaq1Unit0.292.292.16Totalvolume[μL]n/a41843.91843.210ng/μLDNA10ng/rxn1n/an/a15 ④将上述配好的试剂小心混匀后分在12孔的连排管中，每孔加入混匀试剂148μL。⑤12道移液器吸取混合试剂4μL加入到384孔板中，其中H11、H12、P11、P12孔留作对照，其孔中不加入引物，只含其他组份。⑥每板按照标记好的样本板加入相应的模板，加入体积为1μL。⑦移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。⑧进行PCR扩增，反应程序为：94℃15min94℃20sec56℃30sec45cycles72℃1min72℃3min4℃∞⑨配置1%琼脂糖凝胶，每排留有25个孔，其中一个作为标记孔，其他加入PCR反应后的产物。⑩吸取2μL上样缓冲液，1μLPCR产物进行电泳，电压110V，电流75mA，40分钟后观察结果，结果良好可继续SAP反应。（2）SAP反应①配置相关试剂（表2.3）。Table2.3ComponentsandreagentsofSAPreactionFinalCin7μLVolumeofVolume(38%Volume(38%ReagentReactionvolumereagentin2μlofoverhang)[μL]overhang)[μL]（PCR+SAP）SAPcocktail384×1.38NanopureWater,N/A1.53810.9810.778AutoclavedSAPBuffer0.24×0.1790.190.086SAPenzyme0.5U0.3159158.976(1.7U/μL)Totalvolume[μL]n/a210601059.840②将配置好的溶液均匀分配到96孔板中，每孔加入试剂量10μL/板。16 ③从96孔板中移液2μL到384板的每个孔中。④移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。⑤SAP反应程序为：37℃40min，85℃5min，4℃∞。（3）延伸反应①配置相关试剂（表2.4）。Table2.4ComponentsandreagentsofextensionPCR>18plexesVolumeFinalCin9μLVolumeofreagentVolume(38%Reagent(38%overhang)[μL]Reactionvolumein2μl[μL]overhang)[μL]384×1.38NanopureWater,N/A0.619328.07328.0205AutoclavediPLEXBufferPlus0.222×0.2106105.984iPLEXTerminationmix1×0.2106105.984iPLEXExtend0.84/1.04/1.250.94498.2498.1248PrimerMixiPLEXEnzyme1×0.04121.7321.727Volume[μL]N/A210601059.84SAP+PCRreactionN/A7N/AN/ATotalvolume[μL]N/A9N/AN/A②将配置好的溶液均匀分配到96孔板中，每孔加入试剂量10μL/板。③从96孔板中移液2μL到384孔板的每个孔中。④移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。⑤进行延伸反应，反应程序为：94℃30sec94℃5sec52℃5sec45cycles80℃5sec72℃3min4℃∞（4）完成去盐，导入Assay中，样本表格输入，建板，点样，MassARRAY分析，质17 量控制及输出报告等实验工作。2.1.4.4样本检出率rs9355296位点在样本中检出率低，故排除此SNP位点。Table2.5DetectionratesofSNPsgeneSNPs检出率（%）SLC22A3rs934681696.4rs222175093.9LPArs312759697.6rs936455997.0rs136721197.2rs641508596.3rs934743897.4rs93552962.72.1.5统计分析2将实验结果数字化录入Excel2003数据库中。应用拟和优度χ检验，计算基因型分布是否符合Hardy-Weinburg平衡。应用SPSS16.0统计软件，进行一般资料和等位基因、基因型与冠心病的关联性分析以及SNPs和冠心病危险因素、类型的关联分析。采用Haploview软件进行连锁不平衡分析；SHEsis软件（http://analysis.bio-x.cn;Bio–XinstitutesofShanghaiJiaoTongUniversity;China）分析单倍型与冠心病的关系。采用多元线性回归分析校正混杂因素对结果的影响，校正后P<0.05认为差异有显著性意义。不同基因型人体间比较采用单因素方差分析（OneWayANOVA）。组间两两比较方差齐时，采用SNK检验；方差不齐时，采用Games-Howell检验法。2.2结果2.2.1研究对象一般特征分析表2.6中显示病例组与对照组年龄、性别、体重指数（Bodymassindex,BMI）无明显差异，但病例组中吸烟、高血压、糖尿病（Diabetesmellitus,DM）人数均高于对照组，病例组血浆TC、LDL-C、HDL-C、Lp(a)水平高于对照组，并且以上差异具有统计学意18 义（P<0.05）。血清TG、apoA、apoB水平在两组间无明显差异（P>0.05）。Table2.6BasecharacteristicsofcasegroupandcontrolgroupVariableCasegroup(n=551)Controlgroup(n=544)PAge(year)62.07±11.0860.94±13.700.155Sex(%)53.548.50.097Smoking(%)40.531.10.001Drinking(%)23.019.10.111Hypertension(%)42.119.30.000Diabetesmellitus(%)35.922.00.000TC(mmol/L)5.04±1.054.61±1.250.000TG(mmol/L)1.74±1.211.74±1.220.973LDL-C3.08±0.842.74±0.820.021HDL-C1.21±0.321.16±0.240.032Lp(a)226.34±123.25195.96±117.190.000apoA1.12±0.261.18±0.340.124apoB0.87±0.180.82±0.140.276BMI(kg/m2)24.20±2.7023.93±3.370.2532.2.2SNPs基因分型结果采用SequenomMassArray方法对染色体SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上8个SNPs位点（rs9346816,rs2221750,rs3127596,rs9364559,rs1367211,rs6415085,rs9347438和rs9355296）进行基因分型，其中rs9355296未分型成功，其他位点分型图谱见图2.1~图2.7。Fig.2.1Thegraphforgenotypicdetectionofrs136721119 Fig.2.2Thegraphforgenotypicdetectionofrs2221750Fig.2.3Thegraphforgenotypicdetectionofrs3127596Fig.2.4Thegraphforgenotypicdetectionofrs641508520 Fig.2.5Thegraphforgenotypicdetectionofrs9346816Fig.2.6Thegraphforgenotypicdetectionofrs9347438Fig.2.7Thegraphforgenotypicdetectionofrs93645592.2.3Hardy-Weinberg平衡检验SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇rs9346816、rs2221750、rs3127596、rs9364559、rs1367211、rs6415085和rs9347438位点的基因型分布在对照组和病例组均为偏离Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），表明本研究人群是随机婚配的自然群体，见表2.7。21 Table2.7Hardy-WeinbergequilibriumtestofthedistributionofgenotypicfrequencyControlsCasesGeneSNPs22χPχPSLC22A3rs93468161.2440.2650.0010.981rs22217501.2720.2591.2950.255LPArs31275960.0950.7580.2710.603rs93645590.6620.4160.0000.986rs13672110.7490.3870.2040.652rs64150850.7380.3902.0640.151rs93474380.0110.9170.0010.9752.2.4等位基因与基因型分析SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上rs9346816、rs2221750、rs3127596、rs9364559、rs1367211、rs6415085和rs9347438位点均位于内含子区域。以上位点等位基因与冠心病的关系分析结果见表2.8。经校正吸烟、高血压、糖尿病、TC、LDL-C、HDL-C、Lp(a)等危险因素后，2在病例组和对照组人群中rs9364559位点等位基因分布有显著性差异（χ=4.436,P=0.039）。其他位点等位基因在病例组和对照组人群中的分布均无明显差异（P>0.05）。Table2.8SNPslociallelicfrequencydistributionofSLC22A3-LPAL2-LPAgeneclusterandtherelationshipwithcoronaryheartdiseaseControlsCases2GeneSNPsχPAGAGSLC22A3rs22217502387922238090.6670.414rs93468164615954236332.8090.094LPArs13672112048422168600.1090.741rs31275968891579141700.1860.667ars93645597383067163584.4360.039GTGTrs64150857692577962800.2620.609CTCTrs93474383956534076710.0010.976aadjustmentforthepresenceofsmoking,hypertension,diabetesmellitus,TC,LDL-C、HDL-C、Lp(a）bylogisticregressionanalysis.22 SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上rs9346816、rs2221750、rs3127596、rs9364559、rs1367211、rs6415085和rs9347438位点基因型与冠心病的关系分析结果见表2.9。经校正吸烟、高血压、糖尿病、TC、LDL-C、HDL-C、Lp(a)等危险因素后，在病例组和对2照组人群中rs9364559位点基因型分布仍有显著性差异（χ=7.126,P=0.028）。其他位点等位基因在病例组和对照组人群中的分布均无明显差异（P>0.05）。Table2.9SNPslocigenotypefrequencydistributionofSLC22A3-LPAL2-LPAgeneclusterandtherelationshipwithcoronaryheartdiseaseControlsCases2GeneSNPsχPAAGAGGAAGAGGSLC22A3rs222175023192300241753171.2760.528rs9346816107247174912411962.6750.263LPArs136721123158342201763420.9670.616rs312759637913113387140150.1860.911rs936455926620650231254527.1260.028aGGGTTTGGGTTTrs6415085346779035292941.5740.455CCTCTTCCTCTTrs934743875245204772532090.0040.998aadjustmentforthepresenceofsmoking,hypertension,diabetesmellitus,TC,LDL-C、HDL-C、Lp(a)bylogisticregressionanalysis.2.2.5连锁不平衡分析对SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇rs9346816、rs2221750、rs3127596、rs9364559、rs1367211、rs6415085和rs9347438位点的连锁不平衡分析结果显示，SNPs位点rs1367211分别与rs6415085、rs9347438，rs3127596与rs9364559紧密连锁。见图2.8。23 Fig.2.8linkagedisequilibriumplotofgeneticvariantsinSLC22A3-LPAL2-LPAgenecluster2.2.6单倍型分析本研究中SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇的7个SNPs位点（rs9346816、rs2221750、rs3127596、rs9364559、rs1367211、rs6415085和rs9347438）可组成多种单倍体型，通过分析每种单倍体型在病例组和对照组中的分布，探讨单倍体型和冠心病的关系。其中频率小于5%的单倍体型被剔除。分别对7个位点和6个位点组成的单倍体型进行分析，结果显示7个位点组成的单倍型中GAAAGTG和GGAAGTG与冠心病发病风险相关（P<0.05），其中携带单倍型GAAAGTG的人群冠心病的发病风险可能降低，而携带单倍型GGAAGTG的人群冠心病的发病风险可能增加。6个位点组成的单倍型中有14种单倍型与冠心病的发病风险相关（P<0.05），其中8种单倍型可能增加冠心病的发病风险，6种单倍型可能降低冠心病的发病风险。见表2.10。24 Table2.10Haplotypeanalysisofallblocksbetweentwogroups2HaplotypecasecontrolχPOR95%CIrs2221750,rs9346816,rs1367211,rs3127596,rs6415085,rs9347438,rs9364559GAAAGTG39.76(0.040)64.13(0.068)5.5170.0190.606[0.398~0.923]GGAAGTG58.73(0.060)33.22(0.035)9.0530.0031.973[1.260~3.091]rs2221750,rs9346816,rs1367211,rs3127596,rs6415085,rs9347438GGAAGT78.92(0.080)56.41(0.059)4.2490.0391.462[1.017~2.102]GGGAGT116.31(0.117)87.78(0.092)4.8520.0281.407[1.037~1.908]rs2221750,rs9346816,rs1367211,rs3127596,rs6415085,rs9364559GAAAGG35.63(0.036)61.65(0.065)6.6830.0100.571[0.372~0.877]GGAAGG60.57(0.062)31.32(0.033)11.1540.0012.113[1.351~3.305]GGGAGA135.92(0.138)105.65(0.112)6.0770.0141.429[1.075~1.898]rs2221750,rs9346816,rs1367211,rs3127596,rs9347438,rs9364559GAAATG39.54(0.040)63.97(0.066)6.6250.0100.585[0.387~0.883]GAGATA127.25(0.128)158.48(0.164)4.9220.0270.743[0.571~0.966]GGAATG58.07(0.059)34.59(0.036)6.0550.0141.718[1.112~2.656]GGGACA56.29(0.057)26.46(0.027)11.0350.0012.199[1.368~3.538]GGGGCA62.75(0.063)40.56(0.042)4.8460.0281.581[1.049~2.383]rs2221750,rs9346816,rs1367211,rs6415085,rs9347438,rs9364559GAAGTG39.99(0.041)63.22(0.067)5.9800.0140.597[0.393~0.906]GGAGTG57.76(0.059)33.59(0.035)6.8850.0091.802[1.155~2.812]rs2221750,rs9346816,rs3127596,rs6415085,rs9347438,rs9364559GAAGTG36.94(0.038)79.37(0.084)14.1810.0000.459[0.304~0.694]rs9346816,rs1367211,rs3127596,rs6415085,rs9347438,rs9364559AAAGTG42.92(0.042)68.66(0.069)6.5520.0100.595[0.399~0.888]Frequency<0.05inbothcontrol&casehasbeendropped.对5个位点组成的单倍体型进行分析，结果显示5个位点组成的单倍型中有39种单倍型与冠心病的发病风险相关（P<0.05），其中21种单倍型可能增加冠心病的发病风险，18种单倍型可能降低冠心病的发病风险。见表2.11。25 Table2.11Haplotypeanalysisofallblocksbetweentwogroups2HaplotypecasecontrolχPOR95%CIrs9346816,rs1367211,rs6415085,rs9347438,rs9364559AAGTG42.09(0.042)68.56(0.069)6.6770.0100.595[0.400~0.886]GGTCA53.41(0.053)32.79(0.033)5.3030.0211.681[1.076~2.626]rs9346816,rs1367211,rs3127596,rs9347438,rs9364559AAATG41.16(0.040)70.23(0.069)8.3880.0040.559[0.375~0.832]rs9346816,rs1367211,rs3127596,rs6415085,rs9364559AAAGG38.22(0.038)65.42(0.066)7.7340.0050.561[0.371~0.847]rs9346816,rs1367211,rs3127596,rs6415085,rs9347438GAAGT129.05(0.127)84.47(0.085)10.7290.0011.631[1.215~2.190]rs2221750,rs1367211,rs6415085,rs9347438,rs9364559GGTCA69.46(0.070)46.56(0.048)4.0660.0441.484[1.009~2.182]rs2221750,rs9346816,rs6415085,rs9347438,rs9364559GAGCA29.18(0.030)52.24(0.055)6.2710.0120.555[0.348~0.885]GGGCA89.35(0.091)56.07(0.059)9.6070.0021.737[1.221~2.470]rs2221750,rs9346816,rs3127596,rs9347438,rs9364559AGATA69.24(0.070)91.87(0.095)4.1700.0410.710[0.511~0.987]GAATG45.24(0.046)81.12(0.083)12.0480.0010.516[0.353~0.754]GGACA59.19(0.060)27.08(0.028)11.9090.0012.232[1.400~3.559]GGATG80.42(0.081)41.37(0.043)12.6690.0002.006[1.359~2.962]GGGCA65.66(0.066)40.10(0.041)6.0300.0141.657[1.103~2.488]rs2221750,rs9346816,rs3127596,rs6415085,rs9364559AGAGA56.90(0.057)82.69(0.087)5.3870.0200.658[0.462~0.939]AGAGG54.13(0.055)31.82(0.033)6.0820.0141.753[1.117~2.751]GAAGG76.34(0.077)115.01(0.121)9.1910.0020.621[0.455~0.846]rs2221750,rs9346816,rs3127596,rs6415085,rs9347438GAAGT161.17(0.162)194.72(0.204)5.4220.0200.746[0.583~0.955]GGAGT189.67(0.190)145.12(0.152)6.9710.0081.404[1.091~1.808]rs2221750,rs9346816,rs1367211,rs6415085,rs9347438AGGGC35.09(0.035)54.96(0.058)5.1930.0230.606[0.392~0.936]GGGGT120.45(0.121)88.75(0.093)4.5720.0331.374[1.026~1.841]GGGTC53.98(0.054)23.95(0.025)11.3180.0012.275[1.393~3.717]26 续表：Table2.11Haplotypeanalysisofallblocksbetweentwogroups2HaplotypecasecontrolχPOR95%CIrs2221750,rs9346816,rs1367211,rs6415085,rs9364559AGGGA59.02(0.060)84.14(0.089)4.8050.0280.677[0.477~0.961]GAAGG36.39(0.037)62.21(0.066)7.1670.0070.565[0.370~0.862]GAGTA63.34(0.064)87.15(0.092)4.1230.0420.703[0.500~0.989]GGAGG59.59(0.060)29.81(0.031)10.6790.0012.096[1.333~3.296]GGGGA176.80(0.179)138.20(0.146)6.2120.0131.376[1.070~1.769]GGGTA90.28(0.092)57.71(0.061)8.1030.0041.651[1.166~2.338]rs2221750,rs9346816,rs1367211,rs9347438,rs9364559GAATG38.49(0.039)64.80(0.067)6.1990.0130.596[0.395~0.899]GGATG58.91(0.059)34.58(0.036)7.6980.0061.829[1.188~2.818]rs2221750,rs9346816,rs1367211,rs3127596,rs9364559AGGAA66.23(0.067)91.99(0.095)4.8810.0270.687[0.492~0.960]GAAAG36.43(0.037)62.93(0.065)7.7570.0050.553[0.363~0.843]GAGAA152.07(0.153)190.47(0.197)5.9290.0150.740[0.580~0.943]GGAAG59.61(0.060)34.53(0.036)6.9750.0081.779[1.154~2.741]GGGAA193.99(0.195)157.19(0.162)4.7800.0291.308[1.028~1.664]GGGGA73.76(0.074)44.20(0.046)7.8590.0051.732[1.175~2.552]rs2221750,rs9346816,rs1367211,rs3127596,rs9347438GAGAT132.01(0.132)172.93(0.178)7.3360.0070.708[0.551~0.910]GGAAT81.37(0.081)57.51(0.059)4.1840.0411.442[1.014~2.052]rs2221750,rs9346816,rs1367211,rs3127596,rs6415085GGAAG83.01(0.084)55.21(0.058)6.0460.0141.561[1.092~2.232]GGGAG203.32(0.205)169.55(0.178)3.9260.0481.270[1.002~1.609]Frequency<0.05inbothcontrol&casehasbeendropped.对4个位点组成的单倍体型进行分析，结果显示4个位点组成的单倍型中有49种单倍型与冠心病的发病风险相关（P<0.05），其中22种单倍型可能增加冠心病的发病风险，27种单倍型可能降低冠心病的发病风险。见表2.12。27 Table2.12Haplotypeanalysisofallblocksbetweentwogroups2HaplotypecasecontrolχPOR95%CIrs2221750,rs9346816,rs1367211,rs3127596GAGA226.28(0.225)265.26(0.273)5.7580.0160.775[0.629~0.954]GGAA83.17(0.083)58.14(0.060)4.1630.0411.436[1.013~2.035]rs2221750,rs9346816,rs1367211,rs6415085AGGG87.90(0.088)113.05(0.119)4.4430.0350.728[0.541~0.979]GAGG168.21(0.169)198.15(0.208)4.3160.0380.783[0.621~0.987]GGGG246.71(0.248)201.27(0.211)4.5840.0321.266[1.020~1.572]GGGT101.60(0.102)73.23(0.077)4.2530.0391.394[1.016~1.913]rs2221750,rs9346816,rs3127596,rs6415085GAAG212.31(0.212)254.14(0.266)7.0160.0080.744[0.598~0.926]GGAG285.50(0.285)225.90(0.237)8.3940.0041.372[1.107~1.699]rs2221750,rs9346816,rs1367211,rs9347438AGGC52.14(0.052)81.46(0.084)7.1340.0080.614[0.428~0.881]GAGT146.88(0.146)179.11(0.184)4.1190.0420.780[0.613~0.992]GGGC179.86(0.179)136.93(0.141)6.7260.0101.380[1.081~1.762]rs2221750,rs9346816,rs3127596,rs9347438GAAT207.96(0.207)261.67(0.268)10.9540.0010.698[0.564~0.864]GGGC60.82(0.060)39.55(0.041)4.1030.0431.527[1.011~2.306]rs2221750,rs9346816,rs6415085,rs9347438AGGC38.60(0.039)60.09(0.063)5.8930.0150.601[0.396~0.910]GGGT199.42(0.200)156.50(0.164)4.5250.0331.288[1.020~1.627]GGTC50.22(0.050)26.89(0.028)6.4460.0111.841[1.142~2.969]rs2221750,rs9346816,rs1367211,rs9364559AGGA86.26(0.087)127.30(0.131)8.2260.0040.653[0.487~0.875]GAAG36.54(0.037)63.41(0.065)7.1780.0070.567[0.373~0.863]GAGA197.45(0.198)240.14(0.248)4.6750.0310.785[0.629~0.978]GGAG59.51(0.060)32.55(0.034)8.9100.0031.932[1.245~2.996]GGGA267.71(0.269)202.96(0.209)14.3200.0001.516[1.221~1.882]rs2221750,rs9346816,rs3127596,rs9364559AGAA79.04(0.079)113.19(0.116)8.1090.0040.645[0.477~0.874]AGAG71.22(0.071)40.48(0.042)7.9470.0051.759[1.183~2.617]GAAA188.75(0.189)219.23(0.226)4.3830.0360.790[0.634~0.985]GGGA75.50(0.075)51.17(0.053)4.1870.0411.465[1.014~2.115]rs2221750,rs9346816,rs6415085,rs9364559AGGA72.29(0.073)107.61(0.113)8.6680.0030.625[0.456~0.857]AGGG55.30(0.056)30.97(0.033)6.6660.0101.797[1.145~2.821]GAGG77.23(0.078)114.87(0.121)9.2990.0020.623[0.459~0.846]GATA63.06(0.064)86.56(0.091)4.6460.0310.690[0.491~0.968]GGTA91.05(0.092)57.71(0.061)7.3990.0071.608[1.139~2.269]28 续表：Table2.12Haplotypeanalysisofallblocksbetweentwogroups2HaplotypecasecontrolχPOR95%CIrs2221750,rs9346816,rs9347438,rs9364559GACA50.77(0.051)80.33(0.082)6.3390.0120.628[0.436~0.905]GATG43.25(0.043)82.53(0.085)12.0510.0010.515[0.352~0.753]rs2221750,rs1367211,rs6415085,rs9347438AGGC46.25(0.046)64.95(0.067)3.9660.0460.675[0.457~0.996]GGTC110.43(0.111)81.44(0.084)4.0060.0451.361[1.006~1.842]rs2221750,rs3127596,rs6415085,rs9364559AAGG62.18(0.062)35.43(0.037)6.8620.0091.753[1.146~2.679]rs2221750,rs1367211,rs9347438,rs9364559AGCA32.22(0.032)66.50(0.068)12.2650.0000.470[0.305~0.723]rs9346816,rs1367211,rs3127596,rs6415085GAAG129.08(0.126)84.28(0.085)9.1320.0031.563[1.168~2.092]rs9346816,rs1367211,rs3127596,rs9347438GAAT131.05(0.127)85.56(0.084)10.1990.0011.596[1.196~2.131]rs9346816,rs1367211,rs6415085,rs9347438GAGT133.29(0.130)99.36(0.100)4.6480.0311.353[1.027~1.783]rs9346816,rs3127596,rs6415085,rs9347438GAGT288.61(0.282)239.58(0.240)7.0430.0081.329[1.077~1.641]rs9346816,rs1367211,rs3127596,rs9364559AAAG37.53(0.037)67.11(0.066)9.5310.0020.529[0.351~0.797]rs9346816,rs1367211,rs6415085,rs9364559AAGG38.68(0.038)65.80(0.066)7.1080.0080.577[0.384~0.868]GAGA38.66(0.038)58.45(0.059)4.0010.0450.655[0.432~0.994]rs9346816,rs3127596,rs6415085,rs9364559AAGG89.82(0.088)124.81(0.126)6.1340.0130.695[0.520~0.928]GAGG181.72(0.179)132.45(0.133)10.0630.0021.490[1.164~1.908]rs9346816,rs3127596,rs9347438,rs9364559AATG48.53(0.047)86.88(0.086)12.5310.0000.523[0.363~0.752]rs9346816,rs1367211,rs9347438,rs9364559AATG40.04(0.039)70.48(0.070)8.3460.0040.559[0.375~0.834]rs2221750,rs9346816,rs3127596,rs9364559GAAA268.65(0.263)323.34(0.319)6.5350.0110.776[0.639~0.943]GGAA141.61(0.139)110.91(0.109)4.6590.0311.340[1.027~1.749]Frequency<0.05inbothcontrol&casehasbeendropped.对3个位点组成的单倍体型进行分析，结果显示3个位点组成的单倍型中有39种单倍型与冠心病的发病风险相关（P<0.05），其中19种单倍型可能增加冠心病的发病风险，20种单倍型可能降低冠心病的发病风险。见表2.13。29 Table2.13Haplotypeanalysisofallblocksbetweentwogroups2HaplotypecasecontrolχPOR95%CIrs2221750,rs9347438,rs9364559ACA32.44(0.032)68.88(0.070)13.1070.0000.461[0.301~0.708]rs2221750,rs6415085,rs9364559AGA99.87(0.100)129.12(0.134)5.2890.0210.721[0.545~0.954]AGG62.56(0.063)35.97(0.037)6.8260.0091.743[1.144~2.655]rs2221750,rs3127596,rs9364559AAG80.54(0.080)46.78(0.047)8.7870.0031.744[1.203~2.528]AGA26.87(0.027)50.11(0.051)7.8440.0050.511[0.317~0.824]rs2221750,rs9346816,rs9364559AGA99.96(0.100)149.66(0.154)12.3420.0000.617[0.471~0.809]AGG72.00(0.072)40.02(0.041)9.1610.0021.833[1.232~2.727]GGA291.06(0.290)232.71(0.239)7.7330.0051.332[1.088~1.631]rs2221750,rs6415085,rs9347438AGC50.57(0.050)70.14(0.072)4.2420.0390.677[0.466~0.983]rs2221750,rs1367211,rs9347438AGC68.10(0.068)99.18(0.100)6.7880.0090.653[0.473~0.902]rs2221750,rs9346816,rs9347438AGC50.41(0.050)82.24(0.084)8.9080.0030.579[0.403~0.832]GAT229.04(0.227)268.93(0.275)5.4770.0190.783[0.638~0.961]GGC181.94(0.180)137.22(0.140)6.4880.0111.369[1.075~1.745]GGT252.11(0.250)209.96(0.215)4.0200.0451.240[1.005~1.530]rs2221750,rs9346816,rs6415085GAG250.27(0.249)288.47(0.302)6.6700.0100.766[0.626~0.938]GGG332.44(0.331)264.78(0.277)7.4520.0061.316[1.080~1.603]rs2221750,rs9346816,rs3127596GAA300.71(0.297)355.22(0.364)11.0450.0010.723[0.598~0.876]GGA360.21(0.356)293.25(0.300)6.6900.0101.287[1.063~1.558]GGG77.02(0.076)51.82(0.053)4.2170.0401.463[1.016~2.106]rs2221750,rs9346816,rs1367211AGG131.91(0.131)162.81(0.167)4.1940.0410.770[0.599~0.989]GAG275.13(0.273)314.74(0.323)4.4570.0350.809[0.665~0.985]GGG350.49(0.348)280.45(0.288)10.9340.0011.386[1.142~1.682]rs9346816,rs9347438,rs936455930 续表：Table2.13Haplotypeanalysisofallblocksbetweentwogroups2HaplotypecasecontrolχPOR95%CIATG46.93(0.046)89.03(0.087)14.2290.0000.501[0.348~0.722]rs9346816,rs6415085,rs9364559AGG88.82(0.087)124.89(0.125)6.8760.0090.681[0.510~0.909]GGG182.91(0.179)132.50(0.133)9.6380.0021.471[1.152~1.878]rs9346816,rs3127596,rs9364559GAG218.79(0.213)159.52(0.157)10.5610.0011.452[1.159~1.819]rs9346816,rs1367211,rs9364559AAG37.88(0.037)67.62(0.067)8.8720.0030.542[0.361~0.816]AAG37.88(0.037)67.62(0.067)8.8720.0030.542[0.361~0.816]rs9346816,rs3127596,rs9347438AAT236.43(0.229)277.39(0.272)5.0960.0240.791[0.646~0.970]GAT368.92(0.357)320.84(0.315)4.5210.0331.226[1.016~1.479]rs9346816,rs1367211,rs9347438GAT132.89(0.129)100.40(0.099)4.6180.0321.351[1.026~1.778]rs9346816,rs1367211,rs6415085GAG131.03(0.128)97.92(0.098)4.4150.0361.346[1.019~1.777]rs9346816,rs1367211,rs3127596GAA131.17(0.127)87.04(0.086)8.8370.0031.540[1.157~2.050]rs1367211,rs6415085,rs9364559GTG74.56(0.071)47.69(0.047)5.2730.0221.546[1.063~2.247]rs9346816,rs312759,rs9364559AAA286.04(0.271)337.30(0.320)5.0330.0250.806[0.667~0.973]rs9346816,rs2221750,rs9364559AGA267.49(0.261)326.10(0.321)8.5790.0030.750[0.619~0.910]GGA212.93(0.208)166.50(0.164)6.7710.0091.347[1.076~1.687]rs9346816,rs2221750,rs3127596AGA364.87(0.357)412.71(0.407)4.6690.0310.819[0.683~0.982]GGA363.64(0.356)311.69(0.307)6.3490.0121.272[1.055~1.533]Frequency<0.05inbothcontrol&casehasbeendropped.31 对2个位点组成的单倍体型进行分析，结果显示2个位点组成的单倍型中有9种单倍型与冠心病的发病风险相关（P<0.05），其中3种单倍型可能增加冠心病的发病风险，6种单倍型可能降低冠心病的发病风险。见表2.14。Table2.14Haplotypeanalysisofallblocksbetweentwogroups2HaplotypecasecontrolχPOR95%CIrs2221750,rs9347438AC68.87(0.068)100.24(0.101)7.1320.0080.648[0.471~0.893]rs9346816,rs1367211GA132.58(0.128)100.14(0.098)4.5460.0331.348[1.024~1.775]rs9346816,rs9347438AT255.95(0.247)292.13(0.286)3.9600.0470.820[0.674~0.997]GT393.05(0.379)342.87(0.335)4.3160.0381.211[1.011~1.450]rs9346816,rs6415085AG289.51(0.281)323.40(0.323)4.4300.0350.816[0.675~0.986]rs9346816,rs2221750AG367.26(0.359)416.18(0.410)5.6010.0180.806[0.674~0.964]GG434.74(0.425)363.82(0.358)9.4560.0021.323[1.106~1.581]rs9346816,rs3127596AA387.88(0.368)436.51(0.414)4.7120.0300.824[0.691~0.981]rs9346816,rs9364559AA310.36(0.294)362.71(0.343)5.9760.0150.796[0.662~0.956]Frequency<0.05inbothcontrol&casehasbeendropped.2.2.7不同基因型冠心病患者间血脂水平的关系2.2.7.1冠心病患者SNPs基因分型与血浆Lp(a)水平的关系以β-Actin为内参，对目的基因的血浆Lp(a)水平进行统计分析。结果显示携带rs6415085位点不同基因型患者间Lp(a)水平存在显著差异（P<0.05），另外6个SNPs位点不同基因型患者间血浆Lp(a)水平无显著差异（P>0.05），见表2.15。32 Table2.15TheassociationbetweenSNPsandserumlevelofLp(a)Lp(a)levelGeneSNPsPAAAGGGSLC22A3rs2221750277.71±133.09(22)234.27±197.38(165)228.44±139.16(284)0.599rs9346816229.74±154.60(171)230.89±170.99(217)227.82±128.32(82)0.995LPArs1367211236.57±119.47(21)209.62±119.97(152)237.67±172.35(296)0.504rs3127596218.82±157.81(337)273.26±165.62(123)218.73±46.98(12)0.102rs9364559258.04±193.16(200)210.57±120.85(221)219.49±139.02(46)0.119GG(306)GT(78)TT(85)rs6415085197.56±99.74331.64±243.18255.23±175.740.000CC(63)TC(220)TT(186)rs9347438215.02±132.09227.06±145.57238.82±175.950.7782.2.7.2冠心病患者SNPs基因分型与血浆LDL-C水平的关系以β-Actin为内参，对目的基因的血浆LDL-C水平进行统计分析。结果显示rs9346816及rs6415085位点不同基因型患者间LDL-C水平存在显著差异（P<0.05），另外5个SNPs位点不同基因型患者间血浆LDL-C水平无显著差异（P>0.05），见表2.16。Table2.16TheassociationbetweenSNPsandserumlevelofLDL-CLDL-ClevelGeneSNPsPAAAGGGSLC22A3rs22217503.01±0.62(22)2.87±0.92(165)2.95±0.89(284)0.658rs93468162.74±0.70(171)3.01±0.74(217)3.15±1.34(82)0.003LPArs13672113.11±0.85(21)2.89±0.81(152)2.93±0.91(296)0.715rs31275962.92±0.86(337)2.96±0.96(123)2.91±0.39(12)0.916rs93645592.98±0.95(200)2.89±0.79(221)2.84±0.80(46)0.539GG(306)GT(78)TT(85)rs64150852.85±0.753.24±1.042.95±1.060.011CC(63)TC(220)TT(186)rs93474382.88±0.852.89±0.873.01±0.910.4872.2.7.3冠心病患者SNPs基因分型与血浆HDL-C水平的关系以β-Actin为内参，对目的基因的血浆HDL-C水平进行统计分析。结果显示7个SNPs位点不同基因型患者间血浆HDL-C水平无显著差异（P>0.05），见表2.17。33 Table2.17TheassociationbetweenSNPsandserumlevelofHDL-CHDL-ClevelGeneSNPsPAAAGGGSLC22A3rs22217501.34±0.28(22)1.39±0.38(165)1.39±0.35(284)0.887rs93468161.39±0.36(171)1.41±0.37(217)1.34±0.31(82)0.371LPArs13672111.38±0.29(21)1.40±0.39(152)1.38±0.34(296)0.915rs31275961.40±0.36(337)1.38±0.35(123)1.33±0.32(12)0.739rs93645591.35±0.33(200)1.41±0.36(221)1.47±0.44(46)0.108GG(306)GT(78)TT(85)rs64150851.38±0.351.47±0.351.36±0.370.166CC(63)TC(220)TT(186)rs93474381.35±0.361.40±0.361.38±0.340.7162.2.7.4冠心病患者SNPs基因分型与血浆TC水平的关系以β-Actin为内参，对目的基因的血浆TC水平进行统计分析。结果显示rs9346816位点不同基因型患者间TC水平存在显著差异（P<0.05），另外6个SNPs位点不同基因型患者间血浆TC水平无显著差异（P>0.05），见表2.18。Table2.18TheassociationbetweenSNPsandserumlevelofTCTClevelGeneSNPsPAAAGGGSLC22A3rs22217504.58±0.87(22)4.62±1.39(165)4.59±1.18(284)0.970rs93468164.41±1.19(172)4.69±1.16(217)4.77±1.54(82)0.033LPArs13672114.70±0.95(21)4.53±1.08(152)4.61±1.33(296)0.754rs31275964.58±1.16(337)4.68±1.49(123)4.23±1.04(12)0.430rs93645594.58±1.30(200)4.60±1.21(221)4.57±1.10(46)0.977GG(306)GT(78)TT(85)rs64150854.52±1.204.72±1.164.74±1.500.239CC(63)TC(220)TT(186)rs93474384.55±1.334.54±1.344.68±1.120.51534 2.2.7.5冠心病患者SNPs基因分型与血浆TG水平的关系以β-Actin为内参，对目的基因的血浆TG水平进行统计分析。结果显示7个SNPs位点不同基因型患者间血浆TG水平无显著差异（P>0.05），见表2.19。Table2.19TheassociationbetweenSNPsandserumlevelofTGTGlevelGeneSNPsPAAAGGGSLC22A3rs22217501.77±1.28(22)1.73±1.27(165)1.75±1.20(284)0.983rs93468161.71±1.02(171)1.75±1.31(217)1.81±1.30(82)0.851LPA1.99±1.62(21)1.69±1.10(152)1.75±1.24(295)0.536rs13672111.77±1.21(336)1.70±1.27(123)1.35±0.53(12)0.445rs31275961.79±1.41(199)1.68±0.92(221)1.90±1.49(46)0.388rs9364559GG(305)GT(78)TT(85)1.69±1.211.63±0.832.00±1.380.080rs6415085CC(63)TC(220)TT(185)1.65±0.971.71±1.171.81±1.340.599rs93474382.2.7.6冠心病患者SNPs基因分型与血浆apoA水平的关系以β-Actin为内参，对目的基因的血浆apoA水平进行统计分析。结果显示7个SNPs位点不同基因型患者间血浆apoA水平无显著差异（P>0.05），见表2.20。Table2.20TheassociationbetweenSNPsandserumlevelofapoAapoAlevelGeneSNPsPAAAGGGSLC22A3rs22217501.02±0.22(22)1.06±0.21(165)1.15±0.28(284)0.226rs93468161.07±0.22(171)1.17±0.30(217)1.05±0.22(82)0.212LPA1.08±0.02(21)1.10±0.36(152)1.12±0.22(295)0.940rs13672111.16±0.27(336)1.05±0.21(123)0.93±0.12(12)0.075rs31275961.11±0.30(199)1.14±0.22(221)1.02±0.27(46)0.501rs9364559GG(305)GT(78)TT(85)1.14±0.261.06±0.241.13±0.270.573rs6415085CC(63)TC(220)TT(185)1.10±0.241.14±0.201.10±0.340.775rs934743835 2.2.7.7冠心病患者SNPs基因分型与血浆apoB水平的关系以β-Actin为内参，对目的基因的血浆apoB水平进行统计分析。结果显示7个SNPs位点不同基因型患者间血浆apoB水平无显著差异（P>0.05），见表2.21。Table2.21TheassociationbetweenSNPsandserumlevelofapoBapoBlevelGeneSNPsPAAAGGGSLC22A3rs22217500.90±0.10(22)0.85±0.13(165)0.86±0.20(284)0.800rs93468160.85±0.14(171)0.85±0.17(217)0.95±0.26(82)0.183LPA0.90±0.04(21)0.86±0.19(152)0.86±0.17(295)0.971rs13672110.86±0.20(336)0.85±0.10(123)0.91±0.02(12)0.727rs31275960.84±0.14(199)0.90±0.20(221)0.85±0.20(46)0.182rs9364559GG(305)GT(78)TT(85)0.86±0.170.89±0.210.84±0.160.933rs6415085CC(63)TC(220)TT(185)0.84±0.090.86±0.190.88±0.190.824rs93474382.3讨论随着社会经济的发展，人民生活水平改善，生活方式及节奏改变，我国冠心病的发[97-103]病率及死亡率逐年增高。血脂异常人群数量增加与冠心病发病率增高直接相关。因此血脂异常是冠心病的主要危险因素之一。TC、LDL-C、TG增高，HDL-C降低均是[104-109]冠心病的危险因素，其中以LDL-C最为主要。LDL-C在血管内膜的异常沉积是动脉硬化形成的始动因素。因此治疗血脂异常是预防及治疗冠心病的主要措施之一。近年来Lp(a)水平增高在动脉粥样硬化形成中的作用越来越受到人们的重视。研究[110-112]表明血浆Lp(a)水平增高是导致冠心病发病的独立危险因素。免疫学定位显示Lp(a)存在于纤维帽、细胞外基质、内皮细胞和内皮下层等部位，通过多种机制参与动脉粥样斑块的形成。而Lp(a)的分子结构决定了其生物学功能。Lp(a)是由富含胆固醇的LDL[18]微粒通过apoB100与apo(a)形成二硫键组成。因此其生物学特点与LDL相似。[49-51]血浆中Lp(a)水平主要受基因水平的调控，其中主要取决于遗传因素中apo(a)基因多态性。apo(a)是Lp(a)的主要蛋白成分。apo(a)基因LPA位于染色体6q26-2736 [52]区域，血浆Lp(a)水平90%由LPA决定。研究发现，影响Lp(a)血浆水平的LPA基[58]因主要受SNP和kringleIV-2的拷贝数的影响。研究发现决定apo(a)颗粒大小的基因[33]多态性可预测血浆Lp(a)水平，rs3798220和rs10455872与低kringleIV-2拷贝数相关，其中rs3798220解释了8%的Lp(a)水平的变异，rs10455872解释了25%的变异，联合二[58]者可解释36%的Lp(a)水平变异。但是血浆Lp(a)水平并不完全与apo(a)颗粒大小有关。人们研究发现与apo(a)颗粒大小无关的基因多态性也可能影响血浆Lp(a)水平。GWAS研究发现位于染色体6q26-27区域包括LPA基因在内的SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇与冠心病发病有很强关联性。SLC22A3是编码有机阳离子转运蛋白（Organiccationtransporters,OCT）的基因，与肝脏代谢有关，影响肝脏对各[113]种食物、药物等化合物的生物转化与代谢作用。LPAL2属于LPA伪基因范畴。LPA是编码apo(a)的主要基因。2009年，Tregouet等人最早在Naturegenetic上发表了SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上由4个SNPsrs2048327、rs3127599、rs7767084和[40]rs10755578构成的单体型与冠心病的发病风险有显性关联。随后Clarke等人对该基因簇上的近30个SNPs进行危险基因型评分（genotypescore）后，不仅证实了该区域的遗[15]传变异与心血管疾病发病的关系，也发现了其与血浆Lp(a)水平有显性关联。之后KochW等在欧洲人群中分析rs3798220和rs10455872位点与冠心病的关系，结果显示在欧洲人群中上述2个位点仍然与冠心病发病风险相关（rs3798220-C:P=0.00080;rs10455872-G:P<0.00001），但单倍型分析结果显示9种单倍型均未与冠心病发病风险[62][59]相关。2011年StanleyY.Shaw等科学家的研究对此基因群进行DNA分析，发现此位点基因多态性可增加心肌梗死的危险性。但Lp(a)水平分布存在种族特异性。在非西班牙白人、非西班牙黑人、墨西哥美国人3个亚群中进行LPA变异与Lp(a)水平的关联试验，对7159个参与者用19个LPA的标签SNP进行基因分型后，发现15个SNP至少在一个亚群中与Lp(a)水平有很强的相关性，有6个SNP分别在两个亚群与Lp(a)水平相关，但没有一个SNP分别在3个亚群[68]中都与Lp(a)水平相关。Lp(a)颗粒大小由kringleIV-2拷贝数决定，而Lp(a)颗粒大小又决定了其分泌速度乃至Lp(a)血浆浓度，因而kringleIV-2拷贝数直接影响Lp(a)的血[71,72]浆水平。在南亚、中国、欧洲高加索等多民族进行的研究发现SNP与kringleIV-2拷贝数共同解释了高加索人种36%Lp(a)水平变异，中国人Lp(a)水平的27%变异，南亚[69]人种21%的Lp(a)水平变异。近期国内专家也在中国西南部汉族人群中对此基因位点37 多态性进行分析，发现SLC22A3基因SNPrs2048327（A/G）、LPAL2基因SNPrs3127599（A/G）和LPA基因SNPrs7767084（C/T）位点可能与中国西南地区汉族人群的CAD[114][75]发生相关。但对此基因簇功能方面的研究较少，周莉等应用双荧光素酶报告基因功能实验的方法间接评价rs3088442位点对SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上的mRNA稳定性的影响以及基因表达的影响，但其影响冠心病的发病风险的具体机制尚不明确。本部分研究对中国东北部汉族人群SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇的7个SNPs位点进行基因分型，并评价上述SNPs位点与冠心病的关系。结果显示在中国东北部汉族人群中位于LPA基因上的rs9364559位点与冠心病发病风险相关。进一步对上述7个位点进行单倍型分析，结果显示7个位点分别进行随机组合后，共152种单倍型与冠心病发病风险相关，其中74种单倍型可增加冠心病发病风险，78种单倍型可降低冠心病发病风险。上述结果再次证实在中国东北部汉族人群中SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇与冠心病发病风险相关，并且位于LPA基因上的rs9364559位点可能参与冠心病的发生与发展。多个SNPs位点同时存在可能对冠心病发病风险有不同的影响。另外，我们根据SNPs基因分型对病例组患者进行分组，进一步比较不同基因型患者间血脂水平的关系。结果显示位于SLC22A3基因上的rs9346816位点不同基因型患者间LDL-C、TC水平存在显著差异，LPA基因上的rs6415085位点不同基因型患者间Lp(a)、LDL-C水平存在显著差异。因此该结果证实在中国东北部汉族人群中SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇与血浆Lp(a)、LDL-C、TC水平增高有关。但是基因型分析结果显示的与冠心病发病风险相关的rs9364559位点与血脂水平无关，因此SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇是否通过影响血脂水平而导致冠心病发病风险增高尚不清楚，有待于进一步研究。2.4小结1.吸烟、高血压、糖尿病、TC、LDL-C、Lp(a)可能与冠心病发病风险相关。2.在中国东北部汉族人群中SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇与冠心病发病风险及血脂水平相关。3.在中国东北部汉族人群中位于LPA基因上的rs9364559位点可能参与冠心病的发生与发展。4.多个SNPs位点同时存在可能对冠心病发病风险有不同的影响。38 第3章中国东北部汉族人群SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇mRNA表达与冠心病的关系3.1材料与方法3.1.1研究对象和样本采集选择2012年在吉林大学第一医院二部心血管内科确诊并进行住院治疗的92例冠心病患者为病例组，入选标准和排除标准同第2章2.1。选择同期在吉林大学第一医院二部心血管内科进行诊治的非冠心病患者32例为对照组。入组对象均经病史询问、体检、心电图检查和其他血液生化检查无异常发现，且以前无冠心病病史的正常人。经知情同意后，采集冠心病患者和对照组入院时的新鲜静脉抗凝血2毫升用于总mRNA的提取。样本收集和检测均经吉林大学第一医院医学伦理委员会批准同意。3.1.2主要试剂和器材3.1.2.1主要试剂血液基因组DNA提取试剂盒TIANGEN，北京DNA扩增引物Invitrogen公司，美国TaqDNA聚合酶sequenom公司，美国PCR缓冲液sequenom公司，美国dNTPMixsequenom公司，美国SAP缓冲液sequenom公司，美国SAP酶sequenom公司，美国iPLEXBufferPlussequenom公司，美国iPLEXTerminationmixsequenom公司，美国iPLEXEnzymesequenom公司，美国DNAmarkerDL2000TIANGEN，北京溴酚蓝宝生物，大连溴化乙锭宝生物，大连矿物油Sigma，美国39 三羟甲基氨基甲烷Promega，美国乙二胺四乙酸Sigma，美国硼酸北京化工厂，北京红细胞裂解液鼎国，北京TrizolTakara，大连DEPC水生工，上海Primer（SLC22A3、LPAL2、LPA）宝生物，大连逆转录试剂盒宝生物，大连荧光实时定量PCR试剂盒宝生物，大连DNAmarker（DL2000）天根，北京氯仿北京化工，北京异丙醇北京化工，北京无水乙醇北京化工，北京琼脂糖BIOWEST，西班牙LordingBuffer天根，北京3.1.2.2主要器材MALDI-TOF质谱仪sequenom公司，美国分光光度计岛津，日本DNA浓度检测仪Thermo，美国凝胶成像系统BIO-RAD，美国高速台式离心机Eppendorf，德国PCR仪BIO-RAD，美国实时荧光定量PCR仪AB，美国电子分析天平BIO-RAD，美国电泳仪六一仪器厂，北京水平琼脂糖电泳槽六一仪器厂，北京恒温水浴箱上海贺德实验设备有限公司，上海高压灭菌锅SANYO，日本FSD-40B型微波炉珠海格力小家电有限公司，珠海40 烘箱黄石市恒丰医疗器械有限公司，黄石旋涡混合器北京同正生物技术发展公司-80℃冰箱SANYO，日本20μL，200μL，1000μL移液器Gilson，法国星星牌低温冷柜星星集团有限公司，浙江制冰仪Scotsman，美国微量移液器吸头江苏海门塑料厂，江苏Eppendorf离心管江苏海门塑料厂，江苏3.1.3SNPs基因分型分型方法同第2章2.1.4。3.1.4外周血中SLC22A3、LPAL2、LPA基因mRNA表达水平检测3.1.4.1外周血总RNA的提取为了避免RNA酶污染降解RNA，实验中所使用的所有器具采用0.1%DEPC水处理24h后，高温高压灭菌30min并烤干。采用Trizol方法提取外周血中总RNA，提取步骤如下：（1）取2mL新鲜血于离心管内，加入6mL红细胞裂解液，混匀后冰上裂解15min，期间摇匀2次；（2）4℃12000rpm离心2min，弃去上层红色液体；（3）向沉淀中加入4mL红细胞裂解液，轻轻；（4）4℃12000rpm离心2min，弃去上层液体；（5）加入4mLPBS溶液，吹打混匀，4℃12000rpm离心2min，弃去上层液体；（6）加入1mLtrizol，混匀使细胞充分裂解，室温下静置5min；（7）加入0.2mL氯仿（三氯甲烷），剧烈震荡15s，室温静置5min；（8）4℃12000rpm离心15min。（9）小心吸出上清水相约600μL移入另一新离心管（不要抽到蛋白层），加入600μL异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min。（10）4℃12000rpm离心10min，倒去上清液，底部可见针尖大小白色物质。（11）加入1mL现用现配的70%乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇，轻轻振荡离心管，悬浮沉淀。（12）4℃7500rpm离心5min，去除乙醇（尽量用枪头吸干净）后晾5-10min，使乙醇完全挥发；41 （13）加入DEPC水30µL，吹打融解沉淀。3.1.4.2提取的总RNA的质检（1）纯度检测：取2μLRNA样品，用紫外分光光度计测定OD260和OD280值。OD260/OD280=1.8~2.0时，RNA纯度能够满足本实验要求。（2）完整性检测：取RNA样品5μL进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果出现28S、18S、5S三条特征性条带，表明RNA完整。3.1.4.3cDNA合成反转录体系如下：5×PrimeScriptTMBuffer（forRealTime）4µLOligodTPrimer（50μM）1μLPrimeScriptTMRTEnzymeMixI1µLRandom6mers（100μM）1μLTotalRNA500ngRNaseFreedH2Oupto20μL按上述比例混匀后，进行逆转录反应。反应条件为：37℃15min；85℃5s；4℃。反应管中得到cDNA。3.1.4.4引物设计与合成选择SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上对应的3个候选基因，以β-actin作为内参基因，通过检索http://www.ncbi.nlm.nih.gov和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/获取待测基因的mRNA序列，采用primer5.0软件进行引物设计，通过http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行blast比对，引物序列见表2.1。引物由大连宝生物公司合成。Table3.1theprimersequencesofthegenesGeneSequenceβ-actinForward5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3’Reverse5’-CGGCCACATTGTGAACTTTG-3’LPAForward5’-GGGACAAATAAATGGGCAGGT-3’Reverse5’-AATGAAGAGGATGCACAGAGAGG-3’SLC22A3Forward5’-CCAGAGACAGTGGATGATGTAGAAA-3’Reverse5’-CAAAGGTGAGAGCGGGAAAC-3’LPAL2Forward5’-CAAGAATGGACTGCCCAAGAG-3’Reverse5’-GTTTGCTGAGGATGATGGTTTC-3’42 3.1.4.5PCR扩增PCR扩增体系如下：SYBRPremixExTaqTM（2×）12.5µLPCRReversePrimer（10µM）0.5μLROXReferenceDyeII（50×）0.5μLPCRForwardPrimer（10µM）0.5µL模板（cDNA溶液）2μLdH2O9μLTotal25μL按上述比例混匀后，在ABIPrism7300实时荧光PCR扩增仪中进行PCR反应，反应条件为95℃30s；95℃5s，60℃20s，循环40次，测定样本中基因的表达量。3.1.5数据处理与分析-C△t目的基因的相对表达水平采用相对定量PCR的2计算，其中△Ct=Ct目的基因－Ct内参基因。采用SPSS16.0进行统计分析。非正态分布资料采用M±Q表示，并且采用秩和检验；正态分布资料采用x±S表示，采用F检验或t检验进行数据分析。3.2实验结果3.2.1总RNA质检结果3.2.1.1纯度检测纯度检测结果显示，本实验所提取的总RNA纯度较高，所有样本的RNAOD260/OD280值均位于1.8~2.0之间，符合后续实验要求。3.2.1.2完整度检测如图3.1所示，提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳后，出现28S、18S、5S三条特征性条带，表明RNA完整。43 Fig.3.1IntegrityofRNAidentifiedbyagarosegelelectrophoresis3.2.2基本资料的比较表3.2中显示病例组与对照组年龄、性别、BMI、饮酒人数、DM人数均无明显差异，但病例组中吸烟、高血压病人数均高于对照组，病例组LDL-C、HDL-C、Lp(a)水平高于对照组，并且以上差异具有统计学意义（P<0.05）。血清TC、TG、apoA、apoB水平在两组间无明显差异（P>0.05）。Table3.2BasecharacteristicsofcasegroupandcontrolgroupVariableCasegroup(n=92)Controlgroup(n=32)PAge(year)66.34±11.8362.18±11.070.296Sex(%)58.775.00.100Smoking(%)37.518.10.021Drinking(%)20.019.20.842Hypertension(%)49.428.10.037Diabetesmellitus(%)25.821.90.656TC(mmol/L)5.09±0.884.77±1.070.143TG(mmol/L)2.26±1.391.77±1.010.074LDL-C3.08±0.842.74±0.820.021HDL-C1.21±0.321.16±0.240.032Lp(a)226.34±123.25195.96±117.190.000apoA1.12±0.261.18±0.340.124apoB0.87±0.180.82±0.140.2762BMI(kg/m)24.19±2.6824.01±3.310.43144 3.2.3目的基因mRNA表达量与冠心病的关系对病例组和对照组人群外周血中LPA基因mRNA的表达水平进行分析，结果显示与对照组人群相比，冠心病患者外周血中LPA基因mRNA的表达水平显著增高（P<0.05），见图3.2。并且经校正吸烟、高血压、LDL-C、HDL-C、Lp(a)等危险因素后，上述结果仍存在显著差异。**afteradjustmentofthepresenceofsmoking,hypertension,LDL-C、HDL-C、Lp(a)bylogisticregressionanalysis,P<0.05,comparedwithcontrolsFig.3.2ThemRNAexpressionlevelsofLPAgeneincaseandcontrolgroups(M±Q)对病例组和对照组人群外周血中LPAL2mRNA的表达水平进行分析，结果显示病例组和对照组之间外周血中LPAL2mRNA的表达水平无显著差异（P>0.05），见图3.3。Fig.3.3ThemRNAexpressionlevelsofLPAL2geneincaseandcontrolgroups(M±Q)45 对病例组和对照组人群外周血中SLC22A3mRNA的表达水平进行分析，结果显示与对照组人群相比，冠心病患者外周血中SLC22A3mRNA的表达水平显著增高（P<0.05），见图3.4。并且经校正吸烟、高血压、LDL-C、HDL-C、Lp(a)等危险因素后，上述结果仍存在显著差异。**afteradjustmentofthepresenceofsmoking,hypertension,LDL-C、HDL-C、Lp(a)bylogisticregressionanalysis,P<0.05,comparedwithcontrolsFig.3.4ThemRNAexpressionlevelsofSLC22A3geneincaseandcontrolgroups(M±Q)3.2.4冠心病患者基因分型与目的基因mRNA表达量的关系3.2.4.1冠心病患者SNPs基因分型与LPA基因mRNA表达量的关系以β-Actin为内参，对目的基因的mRNA表达水平进行统计分析。结果显示7个SNPs位点不同基因型之间患者外周血LPA基因mRNA表达水平无显著差异（P>0.05），见表3.3。Table3.3TheassociationbetweenSNPsandthemRNAexpressionleveloftheLPAgene(M±Q)LPAmRNAlevel2GeneSNPsχPAAAGGG-2-2-2SLC22A3rs22217503.492×10±11.293×10±7.204×10±1.7250.422-2-2-25.617×10(5)41.188×10(24)22.845×10(54)-2-2-2rs93468163.774×10±7.861×10±8.597×10±1.0690.586-2-2-232.332×10(35)28.727×10(36)23.139×10(13)46 续表：Table3.3TheassociationbetweenSNPsandthemRNAexpressionleveloftheLPAgene(M±Q)LPAmRNAlevel2GeneSNPsχPAAAGGGLPA-2-2-2rs13672110.642×10±6.093×10±7.106×10±3.8170.148-2-2-20.124×10(3)14.488×10(29)31.599×10(60)-2-2-2rs31275965.751×10±8.133×10±1.332×10±1.4380.487-2-2-214.300×10(65)32.541×10(24)0.128×10(4)-2-2-2rs93645596.983×10±4.867×10±2.911×10±0.9010.637-2-2-21.133×10(39)1.500×10(38)4.010×10(13)GG(58)GT(18)TT(13)-2-2-2rs64150857.204×10±6.081×10±5.183×10±0.1310.936-2-2-221.973×1044.888×1066.102×10CC(14)TC(43)TT(32)-2-2-2rs934743812.074×10±6.983×10±5.007×10±2.4590.292-2-2-239.650×1032.794×1010.905×103.2.4.2冠心病患者SNPs基因分型与LPAL2基因mRNA表达量的关系以β-Actin为内参，对目的基因的mRNA表达水平进行统计分析。结果显示7个SNPs位点不同基因型之间患者外周血LPAL2基因mRNA表达水平无显著差异（P>0.05），见表3.4。Table3.4TheassociationbetweenSNPsandthemRNAexpressionleveloftheLPAL2gene(M±Q)LPAL2mRNAlevel2GeneSNPsχPAAAGGG-2-2-2SLC22A3rs22217500.354×10±0.484×10±0.215×10±0.3640.696-2-2-22.638×10(5)1.273×10(25)1.081×10(56)-2-2-2rs93468160.377×10±0.484×10±0.221×10±0.2750.761-2-2-22.238×10(35)1.098×10(36)0.700×10(13)LPA-2-2-2rs13672110.118×10±0.451×10±0.377×10±0.6510.524-2-2-20.054×10(2)2.221×10(26)0.952×10(59)-2-2-2rs31275960.399×10±0.182×10±0.399×10±0.6940.502-2-2-21.105×10(63)1.228×10(22)0.095×10(3)47 续表：Table3.4TheassociationbetweenSNPsandthemRNAexpressionleveloftheLPAL2gene(M±Q)LPAL2mRNAlevel2GeneSNPsχPAAAGGG-2-2-2rs93645590.412×10±0.160×10±0.204×10±1.2630.288-2-2-21.142×10(40)0.758×10(40)2.300×10(12)GG(54)GT(17)TT(15)-2-2-2rs64150850.288×10±0.425×10±0.354×10±1.7750.176-2-2-20.809×102.682×100.710×10CC(14)TC(43)TT(31)-2-2-2rs93474380.133×10±0.613×10±0.221×10±1.2990.278-2-2-20.619×102.213×100.463×103.2.4.3冠心病患者SNPs基因分型与SLC22A3基因mRNA表达量的关系以β-Actin为内参，对目的基因的mRNA表达水平进行统计分析。结果显示7个SNPs位点不同基因型之间患者外周血SLC22A3基因mRNA表达水平无显著差异（P>0.05），见表3.5。Table3.5TheassociationbetweenSNPsandthemRNAexpressionleveloftheSLC22A3gene(M±Q)SLC22A3mRNAlevel2GeneSNPsχPAAAGGGSLC22A3rs22217500.384±2.252(5)1.444±2.151(25)1.145±1.735(56)0.6400.530rs93468160.830±1.661(35)1.312±2.931(36)1.165±1.936(13)1.9460.150LPArs13672110.382±0.356(2)1.214±2.831(26)0.927±1.544(59)0.4620.632rs31275961.145±2.071(63)0.790±1.899(22)1.454±1.266(3)0.3520.704rs93645591.133±2.006(40)1.197±2.727(40)1.328±2.069(12)0.7410.480GG(54)GT(17)TT(15)rs64150851.030±1.6281.197±1.7310.688±3.3150.2230.800CC(14)TC(43)TT(31)rs93474380.850±1.2981.516±2.9780.758±1.7060.6300.5363.3讨论本研究第一部分结果再次证实在中国东北部汉族人群中位于染色体6q26-27区域的48 SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇与冠心病发病风险及血脂水平相关，并且在中国东北部汉族人群中位于LPA基因上的rs9364559位点可能参与冠心病的发生与发展。多个位点同时存在时可能对冠心病发病风险有不同的影响。但上述位点影响冠心病发病的具体机制尚不明确。SNPs的研究属于基因组DNA多态性研究范畴。而疾病的发生可能存在于基因最终表达为功能蛋白质过程中的任何阶段。基因组RNA转录与其表达方式有可能成为疾病发[115]病机制研究的主要靶点。在人类肝细胞中存在大量SLC22A3mRNA及蛋白表达。Nies等人发现位于OCT3基因上的4个SNPs位点rs2292334,rs2048327,rs1810126,rs3088442[73]可降低肝脏SLC22A3mRNA及蛋白表达。另外，动物实验研究发现LPA转基因小鼠证实LPA启动子的-846—-814核苷酸之间的同向重复序列1作为法尼酯X受体(FXRfarnesoidXnuclearreceptor)负性反应元件。这段基因序列也能结合肝细胞核因子4α(hepatocytenuclearfactor4α,HNF4α)，后者可启动LPA的转录，FXR与HNF4α竞争结合这段基因序列[70]可抑制LPA的表达。因此本研究部分进一步通过分析7个SNPs（rs9346816、rs2221750、rs3127596、rs9364559、rs1367211、rs6415085和rs9347438）不同基因型与外周血中SLC22A3、LPAL2、LPAmRNA表达量之间的关系来探索冠心病的发病机制。本部分实验应用荧光实时定量PCR技术检测外周血中SLC22A3、LPAL2、LPA基因mRNA表达量，分析病例组与对照组间及SNPs不同基因型之间上述基因mRNA表达量的差异。研究结果显示与对照组相比，病例组LPA和SLC22A3基因mRNA表达量明显增高，具有统计学意义。而病例组与对照组间LPAL2基因mRNA表达量无显著性差异。而上述SNPs位点不同基因型患者间SLC22A3、LPAL2、LPA基因mRNA表达量并无显著差异。根据上述结果推测LPA和SLC22A3基因mRNA表达量增加可能与冠心病的发病风险相关，但是本研究中的7个SNPs位点并不是导致LPAmRNA表达量增加的根本原因。3.4小结1.外周血LPA和SLC22A3基因mRNA表达水平升高可能与中国东北部汉族人群冠心病的发病风险相关。2.染色体6q26-27区域SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上rs9346816、rs2221750、rs3127596、rs9364559、rs1367211、rs6415085和rs9347438位点的多态性与冠心病患者外周血中SLC22A3、LPAL2、LPAmRNA的表达水平无关，因此，推测上述SNPs位点不是通过影响基因转录水平参与冠心病的发生。49 第4章SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇蛋白表达与冠心病的关系4.1.材料与方法4.1.1研究对象和样本采集选择2012年在吉林大学第一医院二部心血管内科确诊并进行住院治疗的55例冠心病患者为病例组。入选标准和排除标准同第2章2.1。选择同期在吉林大学第一医院二部心血管内科进行健康体检的正常人15例为对照组，入组对象均经病史询问、体检、心电图检查和其他血液生化检查无异常发现，且以前无冠心病病史的正常人。对照组的性别和年龄均与冠心病患者相匹配。经知情同意后，采集冠心病患者入院时和对照组体检时的新鲜静脉抗凝血5毫升用于总蛋白的提取。样本收集和检测均经吉林大学第一医院医学伦理委员会批准同意。4.1.2主要试剂和器材4.1.2.1主要试剂血液基因组DNA提取试剂盒TIANGEN，北京DNA扩增引物Invitrogen，美国TaqDNA聚合酶sequenom，美国PCR缓冲液sequenom，美国dNTPMixsequenom，美国SAP缓冲液sequenom，美国SAP酶sequenom，美国iPLEXBufferPlussequenom，美国iPLEXTerminationmixsequenom，美国iPLEXEnzymesequenom，美国DNAmarkerDL2000TIANGEN，北京溴酚蓝宝生物，大连溴化乙锭宝生物，大连矿物油Sigma，美国三羟甲基氨基甲烷Promega，美国50 乙二胺四乙酸Sigma，美国硼酸北京化工厂，北京红细胞裂解液鼎国，北京RIPA蛋白抽提试剂盒鼎国，北京BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天，上海5×上样缓冲液碧云天，上海蛋白markerThermoscientific，美国丙烯酰胺Amresco，美国TrisAmresco，美国HCl北京化工厂，北京N,N-亚甲基双丙烯酰胺科密欧，天津SDSMerck，德国过硫酸铵Amresco，美国四甲基乙二胺Amresco，美国甘氨酸Amresco，美国甲醇北京化工厂，北京吐温-20Amresco，美国脱脂奶粉伊利，内蒙古β-巯基乙醇Amresco，美国一抗Abcam，英国二抗博奥森，北京显影粉成信，天津定影粉成信，天津4.1.2.2主要器材MALDI-TOF质谱仪sequenom公司，美国分光光度计岛津，日本DNA浓度检测仪Thermo，美国凝胶成像系统BIO-RAD，美国高速台式离心机Eppendorf，德国51 PCR仪BIO-RAD，美国实时荧光定量PCR仪AB，美国电子分析天平BIO-RAD，美国电泳仪六一仪器厂，北京水平琼脂糖电泳槽六一仪器厂，北京恒温水浴箱上海贺德实验设备有限公司，上海高压灭菌锅SANYO，日本FSD-40B型微波炉珠海格力小家电有限公司，珠海烘箱黄石市恒丰医疗器械有限公司，黄石旋涡混合器北京同正生物技术发展公司，北京-80℃冰箱SANYO，日本垂直电泳槽BIO-RAD，美国转膜仪BIO-RAD，美国暗盒粤华，广东恒温振荡水浴箱常州国华电子有限公司，常州20μL，200μL，1000μL移液器Gilson，法国星星牌低温冷柜星星集团有限公司，浙江制冰仪Scotsman，美国微量移液器吸头江苏海门塑料厂，江苏Eppendorf离心管江苏海门塑料厂，江苏4.1.3SNPs基因分型同第2章2.1.4。4.1.4试剂配制（1）PBS：称取8gNaCl，0.2gKCl，2.886gNa2HPO4•12H2O和0.2gKH2PO4，加入800mL的蒸馏水中，溶解后用HCl调PH值至7.4，定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。（2）30%丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1gN,N-亚甲基双丙烯酰胺溶解于总体积100mL的蒸馏水中，过滤除菌，置棕色瓶中室温保存。52 （3）1.5mol/LTris-HCl（PH=8.8）：将45.43gTris（MW121.14）加入200mL超纯水中，溶解后用HCl调PH值至8.8，定容至250mL，高温灭菌后室温保存。（4）1.0mol/LTris-HCl（PH=6.8）：将30.29gTris（MW121.14）加入200mL超纯水中，溶解后用浓盐酸调PH值至8.8，定容至250mL，高温灭菌后室温保存。（5）10%SDS：将10gSDS加入蒸馏水中50℃水浴下溶解，并定容至100mL，室温保存。（6）10%过硫酸铵：称取0.1g过硫酸铵，溶解于1.0mL蒸馏水中，4℃保存，保存时间为1周。（7）5×电泳缓冲液：称取15.15gTris（MW121.14），93.85g甘氨酸和5gSDS，加入800mL的蒸馏水中，溶解后定容至1000mL，室温储存。使用时稀释为1×电泳缓冲液。（8）转膜缓冲液：称取14.413g甘氨酸，3.0285gTris（MW121.14）加入适量蒸馏水溶解后，加入无水甲醇200mL，定容至1000mL。（9）5×TBS：取50mL1mol/LTris-HCl（PH=7.5），44gNaCl，加入适量蒸馏水溶解后定容至1000mL。使用时稀释为1×TBS溶液。（10）TBST：将1.65mL20%Tween-20加入700mL1×的TBS溶液中溶解。（11）封闭液：将2g脱脂奶粉溶解于40mLTBST溶液中。（12）膜再生液：称取10gSDS和3.62gTris（MW121.14），加入适量蒸馏水溶解后调节pH值至6.7，定容至500mL后加250μLβ-巯基乙醇。4.1.5外周血中SLC22A3蛋白表达水平检测4.1.5.1外周血总蛋白的提取（1）取2mL新鲜血于离心管内，加入6mL红细胞裂解液，混匀后冰上裂解15min，期间摇匀2次；（2）4℃12000g离心2min，弃去上层红色液体；（3）向沉淀部分加入4mL红细胞裂解液，轻轻；（4）4℃12000g离心2min，弃去上层液体；（5）加入4mLPBS溶液，吹打混匀，4℃12000g离心2min，弃去上层液体；（6）加入裂解液（含1mMPMSF），冰上反复裂解30min，4℃12000g离心5min，-70℃保存。53 4.1.5.2蛋白定量（1）按照A液：B液为50:1的比例配制适量的BCA工作液，充分混匀。（2）充分溶解蛋白标准品后，使用PBS溶液稀释，使标准品的终浓度为0.5mg/mL。（3）分别取0.5mg/mL标准品0μL、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL加入96孔板的标准品孔中，再加入PBS溶液至终体积为20μL。（4）取适当体积的样品加入96孔板的样品孔中，再加入PBS溶液至终体积为20μL。（5）在各孔中均加入200μL配置好的BCA工作液，用微量移液器混匀后，37℃静置30min。（6）分别测定标准品和样品562nm波长处的光密度值。（7）根据蛋白标准品的浓度和光密度值绘制标准曲线，根据标准曲线和样品的光密度值计算蛋白样品的浓度，并调整各蛋白浓度至相同水平。4.1.5.3Westernblot（1）蛋白样品的处理：按照4：1的体积比将蛋白样品与5×上样缓冲液充分混匀后，95℃沸煮10min。待用。（2）制胶①安装玻璃板②配制分离胶和浓缩胶12%分离胶5%浓缩胶水(ml)1.61.430%丙烯酰胺(ml)2.00.331.5mmol/LTris溶液(pH8.8)(ml)1.3—1.0mmol/LTris溶液(pH6.8)(ml)—0.2510%SDS(ml)0.050.0210%过硫酸铵溶液(ml)0.050.02TEMED(ml)0.0020.002③灌胶：按顺序配制12%分离胶于15mL离心管中，混匀后迅速加入制胶板至合适位置。加入异丙醇封胶，室温放置30min。待分离胶凝固后，倒掉异丙醇，并用干净的吸水纸吸干。按顺序配制5%浓缩胶于另一15mL离心管中，混匀后迅速加满制胶板，54 并迅速插入样品梳，避免混入气泡。室温放置30min至完全聚合。（3）电泳①取下玻璃板，将短板朝内装入电泳槽，将1×电泳缓冲液注入电泳槽，电泳液要没过短板。②拔出样品梳，在加样孔中分别加入10~20μL样品（蛋白量20~40μg）和蛋白marker。③接通电源，调电压至恒压80V开始电泳，待泳带到达分离胶后调节电压至120V，指示剂跑至胶底部时停止电泳。（4）转膜①剪合适大小的8张滤纸和1张PVDF膜，在膜的一角剪角做标记。②滤纸和多孔纤维垫片浸泡于转膜缓冲液中。③将剪好的PVDF膜依次浸入甲醇（10秒）、双蒸水（5min）和转膜缓冲液（大于10min）中。④剥胶：轻轻撬开玻璃板，去掉浓缩胶，切下分离胶一角做标记，轻轻将分离凝胶从玻璃板上剥下置于转膜缓冲液中。⑤安装转膜装置：正极（红色）到负极（黑色）依次为：白色多孔边盒→多孔纤维垫片→滤纸（4张）→PVDF膜→凝胶→滤纸4张→多孔纤维垫片→黑色多孔边盒。扣好后插进转膜槽。⑥接通电源，电流100mA，冰槽内进行转膜2h。⑦转膜结束后，关闭电源，将膜取出。（5）封闭及免疫反应①用5%的脱脂奶粉封闭PVDF膜，室温轻摇2h。②将封闭好的PVDF膜置于1:1000稀释的一抗中，4℃过夜。TBST室温洗膜3次，每次10min。③加入1:1000稀释的二抗，室温轻摇孵育45min。TBST室温洗膜3次，每次10min。（6）显影①发光液、工作液的配制：在保鲜膜上等体积混合适量A液和B液。②显色反应：用平头镊子将PVDF膜夹出，用吸水纸略吸去过多的液体，将PVDF膜的蛋白面朝下置于保鲜膜上，浸入并与发光液充分均匀接触。用保鲜膜将PVDF膜包裹，去除气泡和褶皱，去除多余的发光液。55 ③压片：将包裹好的PVDF膜固定于暗盒内（蛋白面朝上），放好胶片，压片曝光。④显影：将胶片完全浸入显影液，显影1~2min。⑤定影：将胶片完全浸入定影液，定影约2min。用清水洗去定影液，晾干，并做好标记。（7）膜再生①用TBST溶液洗膜3次，每次10min。②将膜浸入膜再生液，60℃水浴30min。③再用TBST溶液洗膜3次，每次10min。④用5%的脱脂奶粉封闭PVDF膜，室温轻摇2h。（8）图像分析将所得胶片扫描至电脑，用QuantityOne软件进行半定量分析。4.1.6统计学分析采用SPSS16.0统计软件包进行统计学分析。病例组和对照组组间比较采用秩和检验或t检验；不同基因型人体间比较为非正态分布资料，采用M±Q表示，并且采用秩和检验。4.2实验结果4.2.1目的基因蛋白表达量与冠心病的关系病例组和对照组人群外周血中β-actin和SLC22A3表达情况见图4.1和4.2。CaseControlFig.4.1β-actinexpressionincasegroupandcontrolgroupCaseControlFig.4.2SLC22A3expressionincasegroupandcontrolgroup以β-Actin为参照，对两组人群外周血中SLC22A3水平进行分析，结果显示冠心病56 患者外周血中SLC22A3蛋白表达水平明显高于对照组（P﹤0.05），见图4.3。**P<0.05,comparedwithcontrolsFig.4.3ThedifferenceofSLC22A3expressionbetweencaseandcontrolgroup(M±Q)4.2.2冠心病患者基因分型与目的基因蛋白表达量的关系将病例组按照7个SNPs位点的基因型进行分组，以β-Actin为参照，对冠心病患者外周血中SLC22A3表达水平进行统计分析。结果显示不同基因型患者外周血SLC22A3水平均无统计学差异（P>0.05），见表4.1。Table4.1TherelationshipbetweengenotypingandSLC22A3expression(M±Q)SLC22A3/β-actinGeneSNPsPAAAGGGSLC22A3rs22217502.13±0.15(5)2.35±0.12(13)2.27±0.19(37)0.196rs93468162.29±0.18(24)2.28±0.16(22)2.22±0.15(9)0.517LPArs13672112.32±0.03(2)2.23±0.11(14)2.30±1.20(39)0.813rs31275962.26±0.17(39)2.32±0.17(13)2.47±0.33(3)0.178rs93645592.28±0.16(19)2.26±0.18(27)2.33±0.18(9)0.596GG(31)GT(12)TT(12)rs64150852.29±0.172.24±0.182.31±0.240.622CC(7)TC(33)TT(15)rs93474382.36±0.172.29±0.182.24±0.150.36357 4.3讨论随着人类基因组计划的完成，并且通过GWAS研究已经识别了许多复杂疾病的敏[116,117]感性SNP位点，在基因组学层面上揭示了人类疾病发生的可能机制。但是蛋白质是大部分生命活动的真正执行者。细胞内蛋白质的种类、数量、化学修饰是直接影响细胞行为的重要结构基础。因此蛋白质的研究是揭示基因与疾病发生之间关系的关键。[118-120]蛋白质种类、数量及功能的变化是引起心血管系统病理变化的主要因素。目前蛋白质表达的研究包括心血管疾病的病理机制、用于疾病诊断的标志物、药物治疗的[121]分子靶点等方面的研究。SLC22A3编码的OCT3蛋白主要在癌症及药物作用靶点等[45]方面被广泛研究。ChenL等人研究显示OCT3蛋白在人类肝脏组织中大量表达，并且不同基因型患者OCT3表达水平存在显著差异，但是癌症患者肝脏OCT3的表达水平下调。2009年，Trégouët等人首次发现SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇是冠心病的易感区域，[15]位于该区域的多个SNP位点被识别。NiesAT等人进一步对基因的转录水平进行研究，发现携带rs3088442GG基因型的个体SLC22A3基因mRNA表达水平明显高于携带[110]rs3088442AA基因型个体。因此位于SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇的SNPs可通过影响基因表达水平从而引起疾病的发生。本部分研究进一步检测人外周血中SLC22A3蛋白的表达量，分析SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上rs9346816、rs2221750、rs3127596、rs9364559、rs1367211、rs6415085和rs9347438位点不同基因型间外周血中SLC22A3蛋白表达量是否存在差异，从而进一步探索SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇在冠心病发病机制中的作用。研究结果显示与对照组相比，病例组患者外周血中SLC22A3蛋白表达水平明显增高，存在显著性差异。但不同基因型间SLC22A3蛋白表达水平无显著性差异。因此根据本实验结果推测SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇可能通过增加人外周血中SLC22A3蛋白表达水平参与冠心病发生。同时结合第二部分实验结果再一次证实SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇是冠心病的易感区域，并且可能通过增加外周血中LPA和SLC22A3基因mRNA转录水平及SLC22A3蛋白表达水平参与冠心病发病。4.4小结1.冠心病患者外周血中SLC22A3蛋白表达水平增高可能是中国东北部汉族人群冠58 心病发病机制之一。2.SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇可能通过增加外周血中LPA和SLC22A3基因mRNA转录水平及SLC22A3蛋白表达水平参与冠心病发病。59 60 第5章结论（1）在中国东北部汉族人群中SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇与冠心病发病风险及血脂水平相关。（2）位于LPA基因上的rs9364559位点可能参与冠心病的发生与发展；并且多个SNPs位点同时存在可能对冠心病发病风险有不同的影响；（3）外周血LPA和SLC22A3基因mRNA及SLC22A3蛋白表达水平增高可能与中国东北部汉族人群冠心病发病风险相关，因此，SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇可能通过增加外周血LPA和SLC22A3基因mRNA及SLC22A3蛋白表达水平参与冠心病发病。本研究的创新之处（1）本研究在中国东北部人群中对SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇遗传变异与冠心病发病风险及血脂水平的关系进行了分析，并且通过检测外周血中SLC22A3,LPAL2,LPA基因表达水平分析该基因簇基因表达与冠心病的关系，为探索冠心病的病因提供理论依据。（2）冠心病患者外周血中SLC22A3蛋白表达水平增高可能与冠心病发病风险增高相关。61 62 参考文献[1]FRANCHINIM,PEYVANDIF,MANNUCCIPM.Thegeneticbasisofcoronaryarterydisease:fromcandidategenestowholegenomeanalysis[J].Trendsincardiovascularmedicine,2008,18(5):157-162.[2]MATHERSCD,LONCARD.Projectionsofglobalmortalityandburdenofdiseasefrom2002to2030[J].PLoSmedicine,2006,3(11):e442.[3]LOPEZAD.TheevolutionoftheGlobalBurdenofDiseaseframeworkfordisease,injuryandriskfactorquantification:developingtheevidencebasefornational,regionalandglobalpublichealthaction[J].GlobalHealth,2005,1(1):5.[4]卫生部心血管病防治研究中心编写.中国心血管病报告2013[M].北京：中国大百科全书出版社,2014.[5]BROECKELU,HENGSTENBERGC,MAYERB,etal.Acomprehensivelinkageanalysisformyocardialinfarctionanditsrelatedriskfactors[J].Naturegenetics,2002,30(2):210-214.[6]WILSONPW,D'AGOSTINORB,LEVYD,etal.Predictionofcoronaryheartdiseaseusingriskfactorcategories[J].Circulation,1998,97(18):37-47.[7]KHOTUN,KHOTMB,BAJZERCT,etal.Prevalenceofconventionalriskfactorsinpatientswithcoronaryheartdisease[J].Jama,2003,290(7):898-904.[8]WANGQ.Moleculargeneticsofcoronaryarterydisease[J].Currentopinionincardiology,2005,20(3):182-188.[9]WEBERC,NOELSH.Atherosclerosis:currentpathogenesisandtherapeuticoptions[J].Naturemedicine,2011,17(11):1410-1422.[10]LAWMR,WALDNJ,RUDNICKAAR.Quantifyingeffectofstatinsonlowdensitylipoproteincholesterol,ischaemicheartdisease,andstroke:systematicreviewandmeta-analysis[J].Bmj,2003,326(7404):1423.[11]CLARKER,EMBERSONJR,PARISHS,etal.Cholesterolfractionsandapolipoproteinsasriskfactorsforheartdiseasemortalityinoldermen.[J].ArchInternMed,2007,167(13):1373-1378.63 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附录冠心病病例对照研究调查表编号：基本信息姓名：体检号：性别：□男□女发病年龄：岁出生年月：年月（阳历）民族：□汉族□其他族职业：01在校学生02家务03待业04离退休人员05国家机关、党群组织、企事业单位负责人06专业技术人员07办事人员和有关人员08商业、服务人员09农林牧渔水利业生产人员10生产运输设备操作人员及有关人员11军人12其他劳动者文化程度：1未上学2小学3初中4高中/中专5大专/职大6大学及以上婚姻状况：□未婚□有配偶□离异□丧偶身高：cm体重：kg腰围：cm臀围：cm联系人姓名及电话：姓名：家庭手机居住地：□城镇□农村工作单位：既往史高血压史：□无□有有无降血压治疗：□无□有糖尿病史：□无□有中风史：□无□有有无降血脂治疗：□无□有其他疾病：家族史□血脂异常□高血压□糖尿病□冠心病□脑卒中□其他疾病生活习惯吸烟：□无□有年，平均支/日□戒烟年□不详饮酒：□无□有□戒酒年□不详75 你通常喝什么酒？□白酒□啤酒□红酒□果酒□其他：你一般多长时间喝一次酒？①每天或几乎每天②每周3-4次③每周1-2次每次喝多少？两。以下主要为病例复查内容临床检查血压(mmHg)：心率(次/分)：空腹血糖(mmol/L)：血红蛋白(g/L)：糖化血红蛋白(%)：脂蛋白(a)(mmol/L)总胆固醇(mmol/L)：甘油三酯(mmol/L)：低密度脂蛋白胆固醇(mmol/L):高密度脂蛋白胆固醇(mmol/L)：载脂蛋白A(mmol/L):载脂蛋白B(mmol/L)：尿素氮（BUN）：尿酸：心电图检查：□正常□异常（心率失常发生时间）心脏彩超（房室腔大小，FS,EF）：心功能分级：诊断：治疗：填表日期：年月日填表人：76 作者简介及在学期间所取得的科研成果姓名：宋子凯性别：女出生年月：1985年8月民族：汉1.主要学习、工作经历2012.09-2015.07吉林大学第一医院医学博士内科学（心血管内科）2008.09-2012.07吉林大学第一医院医学硕士内科学（心血管内科）2003.09-2008.07内蒙古医科大学医学学士临床医院2.在学期间发表或待发表的论文[1]SongZK,CaoH,QinL,JiangY.Acase-controlstudybetweengenepolymorphismsofpolyunsaturatedfattyacidsmetabolicrate-limitingenzymesandacutecoronarysyndromeinChineseHanpopulation.BiomedResInt.2013;2013:928178.[2]SongZK,WuHD,CaoHY,QinL.TheassociationbetweentheLPAgenepolymorphismandcoronaryarterydiseaseinChineseHanpopulation.BiomedResInt.2014;2014:370670.[3]ZhouLT,QinL,ZhengDC,SongZK,YeL.Meta-analysisofgeneticassociationofchromosome9p21withearly-onsetcoronaryarterydisease.Gene.2012Dec1;510(2):185-8.[4]Acase-controlstudybetweentheSLC22A3-LPAL2-LPAgeneclusterpolymorphismandcoronaryarterydiseaseintheHansofNortheastChina.[Submitted][5]TheeffectofLPAgeneexpressiononserumLp(a)levelandCADriskintheHansofNortheastChina.[Submitted]77 3.获奖情况（1）于2013年获得国家级奖学金（2）吉林大学优秀研究生奖学金二等奖78 致谢本课题从选题、实验设计到课题研究和论文撰写，均在导师秦玲教授的精心指导下完成。导师渊博的学识，精湛的技术，严谨的态度，务实的精神，创新的思维理念和研究生期间对我在学习、工作以及生活上的关爱，都深深激励我，使我终身受益！在本课题完成之际，向我的导师致以最深的敬意和诚挚的谢意！感谢吉林大学第一医院二部心血管内科所有老师和同学在工作、学习和生活方面给予我的支持和帮助！感谢吉林大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室叶琳老师和周丽婷同学，卫生毒理学教研室任淑萍老师和吉大一院转化医学院王晓美在实验中给予的支持和帮助！感谢我的家人在我多年求学过程中一直以来给予的无私的支持，帮助和包容！79
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