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分类号：R741密级：公开UDC：610学校代码：11065硕士专业学位论文中国汉族人群VEGF基因多态性与帕金森病的相关性研究吴玉斌指导教师谢安木（教授）学位类别临床医学硕士专业领域神经病学答辩日期2017年5月20日 中国汉族人群VEGF基因多态性与帕金森病的相关性研究摘要目的：研究表明血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）可以保护多巴胺能神经元，帕金森氏病（Parkinson’sdisease，PD）是因为脑黑质纹状体多巴胺能神经元变性导致的进行性神经系统变性疾病。本研究旨在探讨VEGF（rs699947,rs2010963及rs3025039）基因多态性与中国汉族人群散发PD（sporadicPD）易感性之间的关系。方法：应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术、基因测序法检测400例中国汉族散发PD患者与400例正常对照者的VEGF（rs699947,rs2010963及rs3025039）的基因型。结果：对于rs699947及rs2010963来说，两位点的基因型和等位基因频率分布在PD组与对照组间无显著差异。且在三种遗传模型下分析及将发病年龄与性别进行各亚组间分析后均未发现有显著的差异。rs3025039位点在PD组与对照组间基因型分布频率上存在显著差异(p=0.035)。PD组的T等位基因显著高于对照组(OR1.497,95%CI1.099–2.040,P=0.013)。同时，在加性模型(TTvs.CTvs.CC:OR1.489,95%CI1.018–2.177,P=0.040)以及显性模型(TT+CTvs.CC:OR1.538,95%CI1.068–2.216,P=0.021)均发现rs3025039位点基因多态性与PD易感性存在相关性。在亚组分析中：在男性PD与健康对照组之间的基因型分布频率存在显著差异（P=0.028），除此外，男性PD患者T等位基因频率较对照组显著增加(OR1.721,95%CI1.148–2.579,P=0.008)；在晚发PD（发病年龄大于50岁）与健康对照组之间的基因型分布频率存在显著差异（P=0.006），晚发PD患者T等位基因频率较对照组显著增加(OR1.678,95%CI1.217–2.314,P=0.002)。基于性别及早晚发与对照组遗传模型分析中，在男性PD、晚发PD也发现显著相关性。在我们研究的中，由VEGF三位点（rs699947andrs2010963,D’=0.531,r²=0.073;rs699947andrs3025039，D’=0.121,r²=0.008;rs2010963andrs3025039,D’=0.355,r²=0.017）构建的单倍体模型中不存在强连锁不平衡，并且，在PD组与对照组未发现存在统计学意义。结论：VEGF基因可能影响中国汉族人群散发PD的发病，rs3025039位点基因多态性是散发PD（sporadicPD）的危险性因素。硕士研究生：吴玉斌（神经病学）指导教师：谢安木（教授）关键词：VEGF；帕金森氏病；单核苷酸多态性；单倍型I AssociationofVEGFgenepolymorphismswithsporadicParkinson'sdiseaseinChineseHanpopulationAbstractObjective:Recentevidenceindicatesthatvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)iscapableofprotectingdopaminergic(DA)neurons.Parkinson’sdisease(PD)isaprogressiveneurodegenerativediseasecausedbythedegenerationofnigrostriataldopaminergicneurons.ThepresentstudyaimedtoevaluatewhetherVEGFgenepolymorphismwasassociatedwithPDsusceptibilityinHanChinesepopulation.Methods:ToevaluatetheroleofVEGFsinglenucleotidepolymorphisms(SNPs)andhaplotypesinPD,weperformedacase–controlstudyincluding400PDpatientsand400healthy-matchedcontrols.Polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism(PCR–RFLP)analysisandDNAsequencingwereusedtodetectthers699947,rs2010963andrs3025039polymorphismsoftheVEGFgeneincasesandcontrols.Results:OurstudyrevealedthatTallelicfrequencyofrs3025039polymorphismwassignificantlyhigherinPDsubjects(OR1.497,95%CI1.099–2.040,P=0.013)thanthatincontrols.Significantassociationforrs3025039couldbefoundinadditivemodel(TTvs.CTvs.CC:OR1.489,95%CI1.018–2.177,P=0.040)anddominantmodel(TT+CTvs.CC:OR1.538,95%CI1.068–2.216,P=0.021).Subgroupanalysesperformedbygendersuggestedthatthisassociationcouldbefoundinmale,butnotinfemale.Moreover,italsodemonstratedasignificantassociationinthesubgroupoflate-onsetPD(LOPD).However,forrs699947andrs2010963polymorphisms,genotypeorallelefrequenciesdidnotdifferbetweengroups.Nosignificantassociationcouldbefoundbetweenrs699947andrs2010963polymorphismandPDrisk.NoneoftheobservedhaplotypesshowedsignificantassociationwithPD.Conclusions:TheseresultssuggestedthattheVEGFgenemightbeassociatedwithriskofdevelopingsporadicPDinHanChineseandthers3025039polymorphismmaybeariskfactorforsporadicPD.Postgraduate:Wuyubin(Neurology)DirectedbyProfessor:XieanmuKeywords:Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF);Parkinson’sdisease(PD);Single-nucleotidepolymorphisms(SNPs);HaplotypesII 目录引言······································································································1研究对象与方法·······················································································31研究对象··························································································32仪器、材料与实验试剂········································································42.1主要仪器························································································42.2主要试剂························································································43实验方法··························································································53.1标本收集························································································53.2DNA提取·······················································································53.3测定DNA提取的OD值····································································63.4引物设计与合成···············································································63.5PCR反应与酶切结果·········································································73.6基因测序验证RFLP结果···································································84统计学处理·······················································································8结果······································································································91Hardy-Weinberg平衡检验结果································································92VEGF基因三位点基因型检测结果及测序图··············································93VEGF基因多态性检测结果(rs699947,rs2010963及rs3025039)·····················12讨论·····································································································17结论·····································································································20参考文献·······························································································21综述·····································································································24综述参考文献·························································································31攻读学位期间的研究成果··········································································38致谢·····································································································39学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明········································40III 引言引言帕金森氏病（Parkinson'sdisease，PD)是发病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimerdisease，AD）的中枢神经系统退行性疾病，它的主要临床表现特点是：运动症状包含肌强直、运动迟缓、姿势平衡障碍及静止性震颤，非运动症状包含嗅觉减退、便[1]秘、睡眠行为异常和焦虑抑郁等。PD主要的病理变化是黑质多巴胺神经元逐渐丢失及后续纹状体多巴胺的损耗导致了上述临床症状发生及发展，帕金森病发病机制[2]不甚清楚，目前一般认为是基因、环境等因素相互作用共同导致的结果。随着人口的老龄化，PD的发病率日趋增高，上述症状严重影响了患者的生活质量，给家庭和社会带来了巨大的经济和精神负担。因此，对PD的发生及发展进行探讨具有重要的意义。血管内皮生长因子（VEGF，vascularendothelialgrowthfactor）特异性作用于血管内皮细胞。不仅促进了内皮细胞增殖、分化及血管形成，而且参与了血管通透性[3]调节，是一种的强效血管生成及存活因子。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盘生长因子（placentalgrowthfactor，pgf）等。它们与VEGF一起共同发挥作用。近年来研究表明，VEGF在神经保护和[4]神经元的增殖、存活、突触生长过程中均发挥着重要的作用。VEGF通过多种机制来实现神经保护作用，诸如：抑制细胞程序性凋亡、促进神经细胞突触生长、促进[5-8]血管生成、增强葡萄糖血脑屏障的通透性及抗氧化应激等。通过上述机制，VEGF能促进神经元和胶质细胞的存活，不仅在缺氧缺血介导的神经疾病中发挥重要作用，而且在神经变性疾病如帕金森氏病（Parkinson'sdisease，PD)，阿尔茨海默病(Alzhermeidisease，AD)，肌萎缩侧锁硬化症（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）[9,10]等的病理生理过程中，VEGF可能都具有重要的意义。另，有研究揭示：VEGF能够明显地减少由6-OHDA诱导产生的PD模型中多巴胺能神经元的死亡,促进血管的生成以及神经胶质的细胞增殖，而且，VEGF通过直接或间接刺激神经胶质细胞[11-15]增生和促进血管生成的机制来保护多巴胺能神经元。但是，VEGF对多巴胺能细胞的作用途径还有待进一步更深入的研究。研究发现在VEGF基因存在多个多态性位点，包含这三个（rs699947,rs2010963及rs3025039）在内的至少30种单核苷酸多态性（Single-nucleotidepolymorphisms）[16-18]位点影响VEGF转录活性及蛋白合成。这三个常见的VEGF基因功能区位点不[19]仅能调控基因的表达，而且，在某些疾病易感性方面也发挥了一定的作用。研究表明，在神经系统变性疾病如阿尔茨海默病(Alzhermeidisease,AD)，肌萎缩性侧锁硬化症（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）发生发展中，VEGF基因功能区位点的[20,21]多态性可能具有十分重要的意义。在对土耳其人群的一项研究中，发现VEGF1 青岛大学硕士学位论文[22]基因rs699947,rs2010963及rs3025039多态性与散发PD的发病无关。但是，考虑到相对较小的样本量及种族的差异的影响，在亚洲人口中，三个位点的多态性与散发PD发病之间的关系尚不清楚。因此，在我们的研究中，再次选取了这三个位点rs699947,rs2010963及rs3025039来探讨它们是否与中国汉族人群散发PD（sporadicPD）发病的危险性有关。2 研究对象与方法研究对象与方法1研究对象我们选取了400例（230位男性和170位女性，平均年龄59.0±10.32）均为青岛大学附属医院神经内科诊断为散发型PD的患者（2010年4月至2014年7月期间），诊断均符合英国脑库帕金森氏病的临床诊断标准。同时，有PD家族史的患者、继发性PD患者、帕金森氏综合征以及神经或精神性疾病的患者完全排除在外。选取性别及年龄相匹配的健康对照组400例（248例男性，152例女性，平均年龄65.9±7.45）均来自青岛大学附属医院健康查体中心。我们的研究通过了伦理委员会的批准。所有研究对象知情同意并签署知情同意书。研究对象的筛选和入组标准如下：（1）PD患者的入组标准：①汉族，中老年起病，缓慢进行性发展病程。②必备运动迟缓、肌强直，至少具备静止性震颤、姿势平衡障碍中的一项。③对左旋多巴药物治疗敏感。（2）PD患者的排除标准：①血管源性帕金森综合征②反复脑外伤病史③确切的脑膜脑炎史④有眼动危象⑤病理征：Babinski征阳性⑥病情出现逐渐缓解或迅速发展⑦家族中一个以上的亲属患有PD或神经退行性病变⑧核上性眼肌麻痹⑨小脑性共济失调等体征⑩早期出现比较严重的自主神经系统受累（3）对照组的入组标准：①通过询问病史、查体及相关辅助检查等手段排除已知的脑卒中、神经系统变性疾病等人群②年龄、性别均匹配的中老年人③汉族3 青岛大学硕士学位论文2仪器、材料与实验试剂2.1主要仪器（1）PCR反应仪(德国,GeneAmpPCRsystem9700)（2）微量移液器（2ul、10ul、100ul、200ul）（Eppendorf）（3）紫外线分光光度计（Dynamica）（4）电泳仪（BIORANpowernpac300）（5）1.5ml,15ml离心管（美国CORNING）（6）电子分析天平（德国Sartorius，BP3100型）（7）微波炉（韩国，LG）（8）常温离心机（ThermoFisher，PICO17）（9）-70℃、-20℃、4℃冰箱（青岛海尔）（10）高压消毒柜（HealForce，Hfsafe-1200）（11）电热恒温干烤箱（杭州奥盛）（12）紫外线凝胶成像分析仪（法国vilberlourmat，FLX-20-M型）（13）制冰机（SCOTSMAN，AF10型）（14）振荡器（ThermoFisher）（15）超纯水系统（北京诺赛基因）（16）卧式圆形压力蒸汽灭菌器（上海博讯）2.2主要试剂（1）DNA提取：DNA提取试剂盒（美国Roche）无水乙醇（北京诺赛基因）（2）PCR反应用试剂：HotstarTaqDNA聚合酶（含buffer，MgCl2）（美国Hyclone）dNTP（北京Solarbio）引物合成（北京诺赛基因）（3）凝胶电泳试剂：DNAMarker（北京鼎国生物）琼脂糖溴化乙锭Tris4 研究对象与方法EDTA冰乙酸上样缓冲液：1×溴酚兰，6×溴酚兰限制性内切酶（BglⅡ，NlaⅢ，BsmFi）（北京，NewEnglandBiolabs，NEB）应用主要试剂的配制：①配制溴化乙锭先取50ml（0.5mg/ml）浓缩母液EB，后加入超纯水至标度100ml,置于4℃闭光条件下保存备用。②配制电泳缓冲液10×TAE的配制：先称量48.4gTris碱，后量取11.42ml冰乙酸及20mlEDTA(0.5mol/L)，加水稀释至1000ml。③配制2.0%琼脂糖凝胶将把称量的2.8g琼脂糖粉加入到140ml已配制好的1×TAE液中，然后摇匀后置于微波炉中煮沸，冷却至约70℃后，加入5ul溴化乙锭，后摇匀倒入制胶板中，直至冷却，配制成2.0%的琼脂糖凝胶。3实验方法3.1标本收集于早上空腹采集3ml静脉外周血,将其加入到无菌无酶的EDTA抗凝试管中，并将其离心，将分离的血浆和血细胞分别保存备用，在4℃条件下保存装有血细胞的试管备用，并在48h内提取DNA，-70℃条件下保存装有血浆的试管备用。3.2DNA的提取（应用美国Roche公司DNA提取试剂盒）（1）向4×BP液里面加入双蒸水，并将其稀释成1×BP液，并放于冰上预冷。（2）将上述预冷的1×BP液3ml加入1ml血中，将其混匀，然后冰浴10分钟，将其置于离心机中，4500转，离心2分钟后，吸出上层液体，下层沉淀为无色或者淡红色，否则再需向预冷的1×BP液加入0.5ml再洗涤一次。（3）将250ulLBBuffer加入白细胞沉淀中,充分震荡混匀上述液体15秒，然后加入10PKSolution,再次充分震荡混匀，于56℃条件下温育25分钟。（4）将100ulGBindingBuffer加入后,再将200ul无水乙醇加入后充分震荡混匀15-20秒。（5）将含有上述混匀液体的套有收集管的Spincolumn静置5分钟，后置于离心机5 青岛大学硕士学位论文中，10000转，离心1分钟，将套管中液体弃去。（6）向Spincolumn加入600ulWABuffer。将其置于离心机中，10000转，离心1分钟，将套管中液体弃去。（7）向Spincolumn加入600ulWBBuffer。将其置于离心机中，10000转，离心1分钟，将套管中液体弃去。（8）把Spincolumn转移到一干净的1.5ml离心管中。（9）将100ul—200ulElutionBuffer加入离心柱中,并在其放在室温条件下静置10分钟。置于离心机中，13000转，离心2分钟，将Spincolumn丢弃，将含有基因组DNA的离心管保存于-70℃冰箱中。3.3测定提取的DNA的OD值将5ulDNA提取液用超纯水稀释至200ml，取适量置于紫外分光光度仪中，分别测定在260/280nm下的A260值和A280值，然后计算A260/A280比值（OD值）。A260×50×稀释倍数/1000得到DNA的浓度（单位：ug/ul）。提取的DNA纯度可用OD值表示，测得的OD值均在1.8-2.0之间（所有提取的DNA），证明样本没有蛋白质和RNA污染。将合格DNA与TrisEDTAbuffer(pH8.0)混合后置于−70℃冰箱中保存备用。3.4引物设计与合成（1）引物的设计：我们按照文献相关实验设计引物及反应条件，引物由北京诺赛基因公司合成提供。用于扩增rs3025039位点多态性的引物序列为：F:5’-AAGGAAGAGGAGACTCTGCGCAGAGC-3’R:5’-TAAATGTATGTATGTGGGTGGGTGTGTCTACAGG-3’用于扩增rs2010963位点多态性的引物序列为:F:5’-ATTTATTTTTGCTTGCCATT-3’R:5’-GTCTGTCTGTCTGTCCGTCA-3’用于扩增rs699947位点多态性的引物序列为:F:5’-GGATGGGGCTGACTAGGTAAGC-3’R:5’-AGCCCCCTTTTCCTCCAAC-3’6 研究对象与方法（2）引物的稀释：OD×33/分子量﹦60uM×Xy亦即X﹦OD×33/60×分子量（X为加水量），按照以上公式向引物中加入超纯水稀释引物，配成母液，然后取出10ul母液，加90ul纯水，稀释10倍。3.5PCR反应与酶切结果PCR反应体系均为10ul,包括37.5ng基因组DNA,0.25UTaqDNA酶,正反引物各2pmol,0.8ul的dNTP(2.5Mm)混合物和1ul的10×PCRHsbuffer。rs3025039位点的扩增条件是：95℃预变性5min,94℃变性30s,68℃退火30s，72℃延伸60s,35个循环后72℃延伸7min。rs2010963位点的扩增条件是：94℃预变性5min,94℃变性30s,63℃退火30s，72℃延伸30s,10个循环后，再次94℃变性30s,58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸7min。rs699947位点的扩增条件是：95℃预变性5min,94℃变性45s,60℃退火45s，72℃延伸40s,35个循环后72℃延伸7min。获得PCR产物后应用限制性内切酶进行消化，分别为：NlaⅢ，BsmFi，BglⅡ(NewEnglandBioLabsNEB,Beijing)。酶切体系为分别在37℃温水浴2h，65℃温水浴2h，37℃温水浴2h。酶切产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳，并将其用凝胶图像分析系统分析。表1显示了基因型和酶切片段的长度。表1VEGF基因rs699947,rs2010963andrs3025039位点检测的主要信息(PrimaryinformationongenotypingassaysforthreeSNPsofVEGFgene)位点引物序列产物长限制性内切片段长度(bp)度(bp)酶rs699947F:GGATGGGGCTGACTAGGTA325BglⅡ325=CCAGC325,202,123=ACR:AGCCCCCTTTTCCTCCAAC202,123=AArs3025039F:AAGGAAGAGGAGACTCTGC208NlaⅢ208=CCGCAGAGC208,122,86=TCR:TAAATGTATGTATGTGGGT122,86=TTGGGTGTGTCTACAGGrs2010963F:ATTTATTTTTGCTTGCCATT304BsmFi304=CCR:GTCTGTCTGTCTGTCCGTCA304,193,111=CG193,111=GG7 青岛大学硕士学位论文3.6应用基因测序方法验证RFLP结果我们抽取了10%的样本进行DNA测序以证实结果的准确性，测序结果与酶切结果相符合。基因酶切及测序图见图1-6。4统计学方法使用软件SPSS19.0软件计算PD组和对照组等位基因频率和基因型频率；单体型构建采用HaploView软件进行构建分析；卡方检验两组间等位基因频率和基因型频率的分布差异；Hardy—Weinberg平衡检验采用卡方检验；logistic回归分析计算OR值和95％可信区间（CI）（校正年龄及性别）；在相关统计中，P<0.05表示差异有统计学意义。8 结果结果1Hardy-Weinberg平衡检验结果VEGF基因（rs699947,rs2010963及rs3025039）多态性均符合Hardy—Weinberg平衡（p﹥0.05）。2三个位点的基因型酶切图及测序图1234567891011121314151617图1示rs3025039位点PCR产物电泳图1、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16为CC基因型2、3、4、7为CT基因型5为TT基因型图2示rs3025039位点酶切后测序图箭头所示为TC基因型9 青岛大学硕士学位论文1234567891011121314151617图3示rs2010963位点PCR产物电泳图5、16为CC基因型1、4、7、8、10、13、14、15为GC基因型2、3、6、9、11、12为GG基因型图4示rs2010963位点酶切后测序图箭头所示为GC基因型10 结果1234567891011121314151617图5示rs699947位点PCR产物电泳图1、2、4、5、6、7、8、10、12、13、14、16为CC基因型3、9为AC基因型11、15为AA基因型图6示rs699947位点酶切后测序图箭头所示为AC基因型11 青岛大学硕士学位论文3VEGF基因多态性检测结果(rs699947,rs2010963及rs3025039)我们将PD组和健康对照组进行了亚组分析：晚发型PD组（LOPD，发病的年龄>50岁）和早发型PD组（EOPD，发病的年龄≤50岁），晚发型PD与健康对照组，早发型PD与健康对照组，男性PD组与女性PD组，男性PD和男性健康对照组，女性PD组及女性健康对照组。在表2中显示rs699947,rs2010963及rs3025039三位点在PD组与对照组的基因型和等位基因频率。在表3中显示rs699947,rs2010963及rs3025039三位点在遗传模型下（加性、显性、隐性）的相关性分析。对于rs699947及rs2010963来说，两位点的基因型和等位基因频率分布在PD组与对照组间无显著差异（表2）。且在三种遗传模型下分析及将发病年龄与性别进行各亚组间分析后均未发现有显著的差异（表3，表4，表5）。rs3025039位点在PD组与对照组间基因型分布频率上存在显著差异(p=0.035)。PD组的T等位基因显著高于对照组(OR1.497,95%CI1.099–2.040,P=0.013)。同时，在加性模型(TTvs.CTvs.CC:OR1.489,95%CI1.018–2.177,P=0.040)以及显性模型(TT+CTvs.CC:OR1.538,95%CI1.068–2.216,P=0.021)均发现rs3025039位点基因多态性与PD易感性存在相关性。在亚组分析中：在男性PD与健康对照组之间的基因型分布频率存在显著差异（P=0.028），除此外，男性PD患者T等位基因频率较对照组显著增加(OR1.721,95%CI1.148–2.579,P=0.008)；在晚发PD（发病年龄大于50岁）与健康对照组之间的基因型分布频率存在显著差异（P=0.006），晚发PD患者T等位基因频率较对照组显著增加(OR1.678,95%CI1.217–2.314,P=0.002)（表6）。基于性别及早晚发与对照组遗传模型分析中，在男性PD、晚发PD也发现显著相关性（表7）。在我们研究的中，由VEGF三位点（rs699947andrs2010963,D’=0.531,r²=0.073;rs699947andrs3025039，D’=0.121,r²=0.008;rs2010963andrs3025039,D’=0.355,r²=0.017）构建的单倍体模型中不存在强连锁不平衡，并且，在PD组与对照组未发现存在统计学意义（表8）。12 结果表2VEGF基因rs699947、rs2010963、rs3025039位点基因型与等位基因频率(GenotypeandallelefrequenciesofVEGFgeneinpatientsandcontrols)rs699947基因型等位基因NAA(%)CA(%)CC(%)PC(%)A(%)PPD组40010(2.5)134(33.5)256(64.0)0.5076461540.264对照组40013(3.2)146(36.5)241(60.3)628172rs3025039基因型等位基因NTT(%)CT(%)CC(%)PC(%)T(%)PPD组40010(2.5)90(22.5)300(75.0)0.0356901100.013对照组4007(1.7)63(15.8)330(82.5)72377rs3025039基因型等位基因NTT+CT(%)CT(%)CC(%)PC(%)T(%)PPD组400100(25.0)0300(75.0)0.010000对照组40070(17.5)0330(82.5)00rs2010963基因型等位基因NGG(%)CG(%)CC(%)PC(%)G(%)PPD组40097(24.2)199(49.8)104(26.0)0.4184073930.582对照组400111(27.8)182(45.5)107(26.7)396404表3rs699947、rs2010963、rs3025039位点三种模型下分析(AnalysisofthethreeSNPsbasedonthreegeneticmodels)加性显性隐性位点基因型PD对照OR(95%CI)POR(95%CI)POR(95%CI)Prs699947AA10130.926(0.676-1.269)0.6330.910(0.670-1.237)0.5480.756(0.307-1.861)0.543CA134146CC256241rs3025039TT1071.489(1.018-2.177)0.0401.538(1.068-2.216)0.0211.911(0.676-5.406)0.222CT9063CC300330rs2010963CC1041071.228(0.854-1.768)0.2681.156(0.822-1.625)0.4050.904(0.644-1.268)0.55813 青岛大学硕士学位论文CG199182GG97111表4VEGF基因rs699947位点亚组基因型及等位基因频率(Distributionofrs699947polymorphismsobservedineveryPDpatientsandeachhealthy-matchedcontrolssubgroup)rs699947基因型等位基因NAA(%)CA(%)CC(%)PC(%)A(%)P男PD2306(2.6)83(36.1)141(61.3)0.423365(79.3)95(20.7)0.242女PD1704(2.4)51(30.0)115(67.6)281(82.6)59(17.4)女PD1704(2.4)51(30.0)115(67.6)0.125281(82.6)59(17.4)0.050女对照1527(4.6)58(38.2)87(47.2)232(76.3)72(23.7)男PD2306(2.6)83(36.1)141(61.3)0.980365(79.3)95(20.7)0.851男对照2486(2.4)88(35.5)154(62.1)396(79.8)100(20.2)早发PD903(3.3)28(31.1)59(65.6)0.625146(81.1)34(18.9)0.438对照40013(3.2)146(36.5)241(60.3)628(78.5)172(21.5)晚发PD3107(2.3)106(34.2)197(63.5)0.554500(80.6)120(19.4)0.321对照40013(3.2)146(36.5)241(60.3)628(78.5)172(21.5)早发PD903(3.3)28(31.1)59(65.6)0.754146(81.1)34(18.9)0.889晚发PD3107(2.3)106(34.2)197(63.5)500(80.6)120(19.4)表5VEGF基因rs2010963位点亚组基因型及等位基因频率(Distributionofrs2010963polymorphismsobservedineveryPDpatientsandeachhealthy-matchedcontrolssubgroup)rs2010963基因型等位基因NCC(%)CG(%)GG(%)PC(%)G(%)P男PD23056(24.3)120(52.2)54(23.5)0.512232(50.4)228(49.6)0.772女PD17048(28.2)79(46.5)43(25.3)175(51.5)165(48.5)女PD17048(28.2)79(46.5)43(25.3)0.270175(51.5)165(48.5)0.105女对照15232(21.1)73(48.0)47(30.9)137(45.1)167(54.9)男PD23056(24.3)120(52.2)54(23.5)0.177232(50.4)228(49.6)0.582男对照24875(30.2)109(44.0)64(25.8)259(52.2)237(47.8)早发PD9025(27.8)43(47.8)22(24.4)0.81693(51.7)87(48.3)0.59914 结果对照400107(26.8)182(45.5)111(27.8)396(49.5)404(50.5)晚发PD31079(25.5)156(50.3)75(24.2)0.406314(50.6)306(49.4)0.669对照400107(26.8)182(45.5)111(27.8)396(49.5)404(50.5)早发PD9025(27.8)43(47.8)22(24.4)0.89093(51.7)87(48.3)0.809晚发PD31079(25.5)156(50.3)75(24.2)314(50.6)306(49.4)表6VEGF基因rs3025039位点亚组基因型及等位基因频率(Distributionofrs3025039polymorphismsobservedineveryPDpatientsandeachhealthy-matchedcontrolssubgroup)rs3025039基因型等位基因NTT(%)CT(%)CC(%)PC(%)T(%)P男PD2306(2.6)54(23.5)170(73.9)0.843394(85.7)66(14.3)0.568女PD1704(2.4)36(21.2)130(76.5)296(87.1)44(12.9)女PD1704(2.4)36(21.2)130(76.5)0.712296(87.1)44(12.9)0.416女对照1523(2.0)27(17.8)122(80.3)271(89.1)33(10.9)男PD2306(2.6)54(23.5)170(73.9)0.028394(85.7)66(14.3)0.008男对照2484(1.6)36(14.5)208(83.9)452(91.1)44(8.9)早发PD901(1.1)14(15.6)75(83.3)0.909164(91.1)16(8.9)0.761对照4007(1.8)63(15.8)330(82.5)723(90.4)77(9.6)晚发PD3109(2.9)76(24.5)225(72.6)0.006526(84.8)94(15.2)0.002对照4007(1.8)63(15.8)330(82.5)723(90.4)77(9.6)早发PD901(1.1)14(15.6)75(83.3)0.108164(91.1)16(8.9)0.036晚发PD3109(2.9)76(24.5)225(72.6)526(84.8)94(15.2)表7rs3025039位点亚组三种模型下分析.(Analysisofthers3025039polymorphismsubgroupbasedonthreegeneticmodels)基因型加性显性隐性rs3025039TTCTCCOR(95%CI)POR(95%CI)POR(95%CI)P女PD4361301.157(0.638-2.097)0.6321.234(0.697-2.185)0.4702.134(0.452-10.717)0.357女对照327122男PD6541701.786(1.078-2.899)0.0241.789(1.113-2.874)0.0160.562(0.145-2.184)0.40515 青岛大学硕士学位论文男对照436208早发PD114750.687(0.204-2.318)0.5450.685(0.218-2.150)0.5170.714(0.043-11.805)0.814对照763330晚发PD9762251.624(1.108-2.380)0.0131.663(1.153-2.937)0.0061.853(0.666-5.157)0.237对照763330表8rs699947、rs2010963、rs3025039三个位点单倍型分析.(FrequencydistributionoftheVEGFhaplotypeallelesbetweencasesandcontrolsFrequency≤0.03wasignoredinanalysis)基因型PD对照Chi-squareP值(频率)(频率)CCC339.8330.20.2370.626(0.425)(0.413)CGC231.0242.60.4090.522(0.289)(0.303)AGC89.6107.81.9150.166(0.112)(0.135)CGT39.933.70.5420.462(0.050)(0.042)ACC29.642.42.3550.125(0.037)(0.053)CCT35.421.53.5230.061(0.044)(0.027)AGT32.519.83.1990.074(0.041)(0.025)（频率≤0.03不列入统计）16 讨论讨论在本研究中，我们对VEGF基因（rs3025039,rs699947及rs2010963）多态性与中国汉族人群散发性PD（sporadicPD）之间的关系的进行了探讨，发现rs3025039多态性可能影响中国汉族人群散发性PD的发展。研究结果表明rs3025039位点基因多态性可能增加散发性PD发展的风险，rs3025039T等位基因可能是汉族人群散发性PD的危险因素。但对rs699947及rs2010963位点多态性分析中，未发现有统计意义的结果。在亚组分析中，rs3025039位点的基因型及等位基因在男性PD组与男性对照组间存在差异显著，男性PD组rs3025039T等位基因明显高于男性对照组。基于我们的数据推断，男性PD和女性PD的发病机制可能不同，rs3025039T等位基因可能是男性PD的危险因素。具有rs3025039C/T位点错义突变的雄性可能更易患PD。除此以外，在年龄的亚组分析中，发现晚发PD与对照组间存在显著差异，推测遗传因素可能影响了晚发PD的发展。目前对于PD的病理生理学机制仍然知之甚少，基因多态性、氧化损伤、灌注缺陷、炎症反应和神经元细胞凋亡等机制均可发挥作用。PD主要有两大病理特征：其一是黑质多巴胺能神经元的大量变性及丢失，尤其以黑质致密区的多巴胺能神经元丢失最为严重，另外还包括蓝斑、脑干的中缝核、迷走神经背核等的多巴胺能神经元也会有明显丢失；其二在残留的神经元胞质内出现嗜酸性包涵体，即我们所熟知的路易小体，α-突触核蛋白、泛素、热休克蛋白是形成路易小体的重要成分。主要临床表现是肌强直、运动缓慢、静止性震颤及姿势步态障碍等，就目前的研究尚不能完全揭示其根本的病因和发病机制。现在内科治疗上仍以增加体内多巴胺含量、对多巴胺受体进行增敏等替代的疗法，不能从根本上解决帕金森病的整体的病理变化过程和发病的机制，我们迫切需求能从改善多巴胺能神经元病理状态的点出发，[1,2]获得控制疾病进程及治疗效果的新途径。由于研究已表明VEGF能促进神经元和胶质细胞的成活，促进神经细胞的突触生长。基于VEGF在黑质多巴胺能神经元进行性损伤中的关键作用，推测VEGF基因多态性可能参与了PD的发生及发展。据我们所知，这篇文章是rs3025039位点基因多态性与中国汉族人群散发性PD的发生、发展风险之间存在显着关联的第一次描述。关于rs3025039位点基因多态性如何影响VEGF水平和表达的机制仍不清楚。我们推测的机制：rs3025039C等位基因携带激活蛋白4（AP-4）的潜在结合位点，其在rs3025039T等位基因中被消除；AP-4作为一种转录因子，可以通过结合到特定位点来增强基因的表达；T等位基因这种[17,19]潜在结合位点的缺乏可能减少了VEGF表达；失调的VEGF表达可能在PD的发生及发展过程中起到了重要作用。因此，rs3025039位点基因多态性可能有助于中国汉族散发性PD（sporadicPD）易感性的研究。17 青岛大学硕士学位论文另外两项研究也探讨了VEGF基因多态性与PD的相关性：Mihci等在具有散发性PD（n=126）和对照（n=88）土耳其人群研究中发现，无论是VEGF基因(rs3025039,rs699947及rs2010963)多态性，还是血清VEGF水平的降低都与散发性PD的发病[22]不存在相关性。在对韩国患者的PD（n=188）和肺癌（n=321）之间研究发现，[23]VEGF基因多态性可能有助于了解PD患者肺癌的低发病率。考虑到种族、年龄、性别等因素都可能会影响疾病易感性，所以，仍需进一步研究来阐述VEGF基因多态性与PD相关性。在神经系统疾病如阿尔茨海默病(Alzhermeidisease，AD)，肌萎缩侧锁硬化症（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）、缺血性脑损伤等的病理生理过程中，VEGF可能都起到重要的作用。诸如：在一项病例对照（case-control）研究中，AD患者的血清中的VEGF含量明显低于正常对照组，并且VEGF减少的水平与AD的病情严重程度存在一定相关性，随着VEGF含量的越低,AD的神经变性过程可能发展的越[10]快。VEGF会与β-淀粉样蛋白（Aβ）相互聚集，并沉积在淀粉样蛋白斑处缓慢释放，进而可能导致脑组织VEGF产量不足，进一步可能导致了AD发病过程中的神[24]经退行性病变。进一步揭示了VEGF表达调控的分子生物学机制可能参与了AD病情的进展。另，VEGF-B（186）和flt-1相结合来保护脊髓运动神经元。当缺乏VEGF-B的小鼠与SOD1基因突变型所致ALS的小鼠杂交时会出现更加为严重的运动神经元变性，进而可出现四肢无力、神经肌肉萎缩、肌电图的去神经及失神经[25]状态等。VEGF对缺血脑细胞起到了神经保护的作用，并在新生血管形成之前就[26]产生了神经保护的作用，这有助于细胞的存活时间延长，直至新血管的生成。由于VEGF可以促进血管新生，可以发生在脑缺血后半暗带区，可能增加缺血半暗带区组织的血流量。因此，对于可能改善缺血事件预后来说，VEGF可以参与到对缺血半暗带区组织的拯救具有重要意义。综合上述结果，我们推测VEGF可能在上述疾病的发生及发展中起到一定作用。近年来，越来越多的研究在探讨VEGF基因多态性和AD、ALS之间的关系。VEGFrs699947（-2578A/A）基因型与意大利人群中散发性AD的风险增加可能存在[20,27]相关性，独立于ApoEe4基因。类似地，另外一项研究得出，在不存在ApoEe4的情况下，-1154G等位基因和VEGF启动子区-2549D/-1154G单倍型可能增加中国[28]北方汉族人群散发AD的风险。相反的是，在法国以及西班牙人群的研究中，未[29,30]发现VEGF启动子区基因多态性与AD发病存在相关性。同时，VEGF基因多态性与ALS发病相关性分析中也存在矛盾。一项病例对照研究中，发现对于VEGF（-2578C/A，-1154G/A，-634G/C）AAG或AGG单倍体纯合的个体来说，ALS发[21]病风险增加了三倍。但是，VanVught等研究者未发现VEGF基因多态性与ALS[31]发病存在相关性。18 讨论基于我们研究的样本量相对较小，增加样本量可能更能真实反映VEGF基因多态性与PD相关性，因此，需要更大的研究人群、在不同的种族、地区中进行研究。19 青岛大学硕士学位论文结论1.VEGF基因rs3025039位点多态性可能与中国汉族人群散发PD易感性相关，rs3025039T等位基因是散发PD的危险性因素。2.VEGF基因rs699947、rs2010963位点基因多态性与中国汉族人群散发PD易感性无相关性。20 参考文献参考文献[1]DexterDTandJennerP.Parkinsondisease:frompathologytomoleculardiseasemechanisms[J].Freeradicalbiology&medicine,2013,62(132-44.[2]BartelsALandLeendersKL.Parkinson'sdisease:Thesyndrome,thepathogenesisandpathophysiology[J].Cortex,2009,45(8):915-21.[3]RosensteinJMandKrumJM.NewrolesforVEGFinnervoustissue--beyondbloodvessels[J].Experimentalneurology,2004,187(2):246-53.[4]StorkebaumEandCarmelietP.VEGF:acriticalplayerinneurodegeneration[J].JournalofClinicalInvestigation,2004,113(1):14-8.[5]QuittetMS,TouzaniO,SindjiL,etal.Effectsofmesenchymalstemcelltherapy,inassociationwithpharmacologicallyactivemicrocarriersreleasingVEGF,inanischaemicstrokemodelintherat[J].Actabiomaterialia,2015,15(77-88.[6]KrumJM,ManiNandRosensteinJM.RolesoftheendogenousVEGFreceptorsflt-1andflk-1inastroglialandvascularremodelingafterbraininjury[J].Experimentalneurology,2008,212(1):108-17.[7]NowackaMMandObuchowiczE.Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)anditsroleinthecentralnervoussystem:anewelementintheneurotrophichypothesisofantidepressantdrugaction[J].Neuropeptides,2012,46(1):1-10.[8]ZacharyI.Neuroprotectiveroleofvascularendothelialgrowthfactor:signallingmechanisms,biologicalfunction,andtherapeuticpotential[J].Neuro-Signals,2005,14(5):207-21.[9]WangY,OuMaoX,XieL,etal.VascularEndothelialGrowthFactorOverexpressionDelaysNeurodegenerationandProlongsSurvivalinAmyotrophicLateralSclerosisMice[J].JournalofNeuroscience,2007,27(2):304-7.[10]MateoI,LlorcaJ,InfanteJ,etal.LowserumVEGFlevelsareassociatedwithAlzheimer'sdisease[J].ActaneurologicaScandinavica,2007,116(1):56-8.[11]FalkT,YueX,ZhangS,etal.Vascularendothelialgrowthfactor-BisneuroprotectiveinaninvivoratmodelofParkinson'sdisease[J].Neuroscienceletters,2011,496(1):43-7.[12]PiltonenM,PlankenA,LeskelaO,etal.VascularendothelialgrowthfactorCactsasaneurotrophicfactorfordopamineneuronsinvitroandinvivo[J].Neuroscience,2011,192(550-63.[13]YasuharaT,ShingoT,MuraokaK,etal.Thedifferencesbetweenhighandlow-dose21 青岛大学硕士学位论文administrationofVEGFtodopaminergicneuronsofinvitroandinvivoParkinson'sdiseasemodel[J].Brainresearch,2005,1038(1):1-10.[14]YasudaT,Fukuda-TaniM,NihiraT,etal.Correlationbetweenlevelsofpigmentepithelium-derivedfactorandvascularendothelialgrowthfactorinthestriatumofpatientswithParkinson'sdisease[J].Experimentalneurology,2007,206(2):308-17.[15]YasuharaT,ShingoT,MuraokaK,etal.NeurorescueeffectsofVEGFonaratmodelofParkinson'sdisease[J].Brainresearch,2005,1053(1-2):10-8.[16]KoukourakisMI,PapazoglouD,GiatromanolakiA,etal.VEGFgenesequencevariationdefinesVEGFgeneexpressionstatusandangiogenicactivityinnon-smallcelllungcancer[J].Lungcancer,2004,46(3):293-8.[17]SamliH,DemirBC,OzgozA,etal.Vascularendothelialgrowthfactorgene1154G/A,2578C/A,460C/T,936C/Tpolymorphismsandassociationwithrecurrentpregnancylosses[J].Geneticsandmolecularresearch:GMR,2012,11(4):4739-45.[18]WatsonCJ,WebbNJ,BottomleyMJ,etal.Identificationofpolymorphismswithinthevascularendothelialgrowthfactor(VEGF)gene:correlationwithvariationinVEGFproteinproduction[J].Cytokine,2000,12(8):1232-5.[19]KripplP,LangsenlehnerU,RennerW,etal.Acommon936C/Tgenepolymorphismofvascularendothelialgrowthfactorisassociatedwithdecreasedbreastcancerrisk[J].Internationaljournalofcancer,2003,106(4):468-71.[20]DelBoR,ScarlatoM,GhezziS,etal.VascularendothelialgrowthfactorgenevariabilityisassociatedwithincreasedriskforAD[J].Annalsofneurology,2005,57(3):373-80.[21]TerryPD,KamelF,UmbachDM,etal.VEGFpromoterhaplotypeandamyotrophiclateralsclerosis(ALS)[J].Journalofneurogenetics,2004,18(2):429-34.[22]MihciE,OzkaynakSS,SallakciN,etal.VEGFpolymorphismsandserumVEGFlevelsinParkinson'sdisease[J].Neuroscienceletters,2011,494(1):1-5.[23]KimJS,YimSV,KohIS,etal.Single-nucleotidepolymorphisms(SNPs)andhaplotypeanalysisinvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)geneinthepatientswithParkinsondiseaseandlungcancer[J].Archivesofgerontologyandgeriatrics,2009,48(3):287-90.[24]YangS-P,BaeD-G,KangHJ,etal.Co-accumulationofvascularendothelialgrowthfactorwithβ-amyloidinthebrainofpatientswithAlzheimer’sdisease[J].Neurobiologyofaging,2004,25(3):283-90.[25]PoesenK,LambrechtsD,VanDammeP,etal.Novelroleforvascularendothelial22 参考文献growthfactor(VEGF)receptor-1anditsligandVEGF-Binmotorneurondegeneration[J].TheJournalofneuroscience:theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience,2008,28(42):10451-9.[26]MaY,ZechariahA,QuY,etal.Effectsofvascularendothelialgrowthfactorinischemicstroke[J].Journalofneuroscienceresearch,2012,90(10):1873-82.[27]DelBoR,GhezziS,ScarpiniE,etal.VEGFgeneticvariabilityisassociatedwithincreasedriskofdevelopingAlzheimer'sdisease[J].Journaloftheneurologicalsciences,2009,283(1-2):66-8.[28]YuanQ,ZuoXandJiaJ.AssociationbetweenpromoterpolymorphismsofvascularendothelialgrowthfactorgeneandsporadicAlzheimer'sdiseaseamongNorthernChineseHan[J].Neuroscienceletters,2009,457(3):133-6.[29]ChapuisJ,TianJ,ShiJ,etal.AssociationstudyofthevascularendothelialgrowthfactorgenewiththeriskofdevelopingAlzheimer'sdisease[J].Neurobiologyofaging,2006,27(9):1212-5.[30]MateoI,LlorcaJ,InfanteJ,etal.Case-controlstudyofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)geneticvariabilityinAlzheimer'sdisease[J].Neuroscienceletters,2006,401(1-2):171-3.[31]Vught.PWV,Sutedja.NA,Veldink.JH,etal.LackofassociationbetweenVEGFpolymorphismsandALSinaDutchpopulation[J].Neurology,2005,22(1643-5.23 青岛大学硕士学位论文综述VEGF与神经系统疾病的研究进展【摘要】:帕金森氏病（Parkinson'sdisease，PD)是目前发病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimerdisease，AD）的年龄相关性中枢神经系统退行性疾病。PD的主要病理变化是黑质纹状体多巴胺能神经元的不可逆性进行性变性死亡,主要临床表现是肌强直、运动迟缓、静止性震颤及姿势步态障碍等，就目前的研究尚不能完全揭示其根本的病因和发病机制。基于目前内科治疗上仍以增加体内多巴胺含量、对多巴胺受体进行增敏等替代疗法，不能从根本上解决帕金森病的整体的病理变化过程和发病机制，我们迫切需求能从改善多巴胺能神经元病理状态的点出发，获得控制疾病进程及治疗效果的新途径。近年来，由于VEGF的神经保护作用，VEGF在神经保护和神经元的增殖、存活、突触生长过程中起到重要的作用。越来越多的研究在探讨VEGF与神经疾病的关系，有研究揭示：VEGF通过直接或间接刺激神经胶质细胞增生和促进血管生成的机制来保护多巴胺能神经元。本综述着重从VEGF在神经系统疾病中的作用，VEGF的基因多态性及生物学特性等方面加以论述，以期为探讨PD的发病机制及治疗方法提供新的思路。关键词:VEGF，神经系统疾病，帕金森氏病（PD）帕金森氏病（Parkinson'sdisease，PD)临床上运动症状主要是肌强直、运动迟缓、静止性震颤及姿势步态障碍等特征，非运动症状主要有嗅觉减退、失眠、便秘、焦[1-4]虑抑郁等。PD的发病机制不甚清楚，目前主要包括遗传因素，环境因素及其交[5,6]互作用。有研究揭示帕金森病病人的90%是散发、迟发性的。另，一部分表现出阳性家族史。如α-syn，Parkin，LRRK2，PINK1和DJ-1等基因已被证实在PD发病[7-9]中占有重要作用。近年来，大量研究证实，VEGF通过多种机制来实现神经保护作用，诸如：抑制细胞程序性凋亡、促进神经细胞突触生长、促进血管生成、增强[10,11]葡萄糖血脑屏障的通透性及抗氧化应激等。1.VEGF概述1.1VEGF生物学结构血管内皮生长因子（VEGF，vascularendothelialgrowthfactor）是一种特异性作用于血管内皮细胞的生长因子，它能特异性作用于内皮细胞促进内皮细胞增殖分化和血管生成。由于其还具有增加血管通透性的作用，因而又被为血管通透因子（vascularpeameabilityfactor，vpf），是一种通过二硫键将两个相同的多肽链联接[12,13]而成的二聚体糖蛋白。并且，VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盘生长因子（placentalgrowthfactor，pgf）等，24 综述它们是与VEGF结构、功能相似的多肽，能够与不同的受体结合，增加了血管通透性，刺激脉管形成。人类VEGF基因位于染色体6p21.3，包括7个内含子和8个外显子。由于VEGF基因剪切方式的不同可形成多种多肽产物,主要有VEGF165、VEGF121、VEGF189及VEGF206。另，VEGF165在细胞中含量最丰富,脑组织中以[14]VEGF165量最多；VEGF165和VEGF121有很强的促进内皮细胞分裂、增殖能力。1.2VEGF主要受体VEGF的受体主要有VEGFR-1/flt-1,VEGFR-2/flk-1/kdr和VEGFR-3/flt-4：①fam样酪氨酸激酶受体(fam-liketyrosinekinasereceptor，又称flt-1/VEGFR-1)，主要与内皮细胞形态有关；②激酶插入域或胎-肝激酶受体(kinaseinsertdomain-containingreceptor/fetalliverkinase,又称kdr/flk-1/VEGFR-2)，主要是调节内皮细胞及神经细胞的分裂、增殖及血管壁通透性；③VEGFR-3/flt-4，激活此受体后可以促进淋巴管内皮细胞的增生；除此之外，neuropilin-1（npn-1）介导flk-1与配[15-17]体VEGF165相连,可以起到调节内皮和神经细胞功能的作用。1.3VEGF功能VEGF作为熟知的一种多功能细胞因子，参与多种生理、病理过程。其主要生物学功能包含：1、增加了血管的通透性，通过增加血管内皮细胞的胞饮作用和小泡运输功能发挥、渗透作用增加Ca2+内流、激活前列腺环素及血小板活化因子等，可以使血管通透性发生改变，使血浆蛋白发生渗漏。2、促进了血管生长，VEGF可通过与其受体结合，激活酪氨酸蛋白激酶，以此来催化其自身及底物蛋白的酪氨酸残基磷酸化，传递信息并产生生物学效应。发挥本身特异的内皮细胞分裂原的活性，诱导血管内皮细胞增殖，从而促进血管的形成。3、促进了内皮细胞的增殖。4、改变了细胞外基质，VEGF不仅可以诱导内皮细胞表达纤溶酶原激活物及纤溶酶原激活物抑制剂-1，而且可以诱导基质胶原酶、组织因子等在内皮细胞的表达，激活VIII因子从内皮细胞释放，这样可以改变细胞外基质，有利于血管生长。5、血管维持功能，VEGF可刺激内皮细胞产生一氧化氮，随着VEGF的增加，NO浓度可逐渐升[13,15,18-20]高，起到维持血管的作用。6、促进了细胞质的钙聚集作用。1.4VEGF在神经系统的作用越来越多的研究表明，VEGF可以在神经保护和神经元的增殖、存活、突触生[21-23]长过程中均起到着重要的作用。VEGF通过多种机制来实现神经保护作用，诸如：抑制细胞程序性凋亡、促进神经细胞突触生长、促进血管生成、增强葡萄糖血[22,24]脑屏障的通透性及抗氧化应激等，通过上述机制，VEGF能促进神经元和胶质细胞的存活，促进突触生长，不仅在缺氧缺血介导的神经系统疾病中发挥重要作用，而且在神经变性疾病如帕金森氏病（Parkinson'sdisease，PD)，阿尔茨海默病25 青岛大学硕士学位论文(Alzhermeidisease，AD)，肌萎缩侧锁硬化症（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）[25-28]等的病理生理过程中，VEGF可能都具有重要的意义。近年来，关于基因多态性的研究越来越多，基因多态性是指在一个正常人群中，某一基因位点上存在两个或两个以上不同的等位基因,其原因可以是由于单个碱基改变(单核苷酸多态，SNP)、碱基DNA片段的插入或缺失、基因的重复等造成的，其本质是指各种原因引起染色体DNA中核苷酸排序变化，最常见的是单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）。现有研究发现在VEGF基因存在多[29-31]个多态性位点，至少30种单核苷酸多态性位点影响VEGF转录活性及蛋白合成。VEGF基因功能区位点不仅能调控基因的表达，基因的表达进一步影响了蛋白质合[32]成及水平，而且，在疾病易感性方面也可能发挥一定作用。已有研究表明，在神经系统变性疾病如阿尔茨海默病(Alzhermeidisease,AD)，肌萎缩侧锁硬化症（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）发生发展中，VEGF基因功能区位点的多态性可能具有十分重要的意义。2.VEGF与帕金森病帕金森氏病（Parkinson'sdisease，PD)主要有两大病理特征：其一是黑质多巴胺能神经元大量变性及丢失，尤其以黑质致密区的多巴胺能神经元丢失最为严重，另外还包括蓝斑、脑干的中缝核、迷走神经背核等的多巴胺能神经元也会有明显丢失；其二在残留的神经元胞质内出现嗜酸性包涵体，即我们熟知的路易小体，α-突触核[1,5]蛋白、泛素、热休克蛋白是构成路易小体的重要成分。目前对于PD的具体病理生理学机制仍然知之甚少，基因多态性、氧化损伤、灌注缺陷、炎症反应和神经元细胞凋亡等机制均可发挥作用。有研究揭示：VEGF通过直接或间接刺激神经胶质[33-39]细胞增生和促进血管生成的机制来保护多巴胺能神经元。研究者发现，VEGF能有效地减少由6-OHDA（6-羟基多巴胺）诱导产生的PD模型中多巴胺能神经元的死[40]亡,促进了血管生成以及神经胶质细胞的增殖，以此来保护多巴胺神经元，但VEGF对PD作用机制尚不明确，仍需更加深入的阐述。在VEGF基因多态性方面，Mihci等在具有PD（n=126）和对照（n=88）土耳其人群研究中发现，无论是VEGF基因(rs3025039,rs699947及rs2010963)多态性，还是血清VEGF水平的降低都与散发[41]性PD的发病不存在相关性。在对韩国患者的PD（n=188）和肺癌（n=321）之[42]间研究发现，VEGF基因多态性可能有助于了解PD患者肺癌的低发病率。因此，VEGF基因多态性与PD易感性间是否存在联系仍需进一步研究。通过对VEGF相关机制研究，可能对于PD的发病机理提供重要线索。3.VEGF与阿尔茨海默病阿尔茨海默病(Alzhermeidisease,AD)是发生于中老年的最常见的神经系统退26 综述行性疾病，以进行性认知功能障碍和行为损害为主要的临床特征。阿尔茨海默病（AD）是老年人痴呆类型中最常见的，以进行性痴呆为主的临床症状给患者个人[43]及家庭生活带来了严重的损害。目前AD的病因不明，男女发病率未见明显差异。随着人口老龄化趋势的发展，AD的患病率逐渐上升，给家庭和社会带来了巨大的精神和经济负担。因此，对AD的发病机制及发病过程研究具有重要意义。目前，AD可分为家族性及散发性。家族性AD是常染色体显性遗传，常见的是21号染色体的淀粉样前体蛋白（amyloidprecursorprotein，APP）基因、位于染色体14号的跨膜蛋白早老素1（presenilin1，PS1）基因以及1号染色体的跨膜蛋白早老素2（presenilin2，PS2）基因突变。遗传因素可改变AD易感性，一般不直接致病。19号染色体上的载脂蛋白E-4（apolipoproteinE4，APOE4）基因与AD的患病风险相关，ApoEe4基因携带者增加了散发性AD的发病风险。另，有关AD的发病机制有多种学说，一重要学说是β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）生成及清除失衡是导致神经元变性及记忆、认知障碍发生的起始事件；另一重要学说为tau蛋白学说，过度磷酸化的tau蛋白通过逐级作用，最终影响了神经元及突触的功能行使。AD特征性病理变化是额、颞叶、海马、杏仁核等的神经炎性斑（Aβ被嗜银神经轴索突起包绕而形成）、神经元纤维缠结（由过度磷酸化的微管tau蛋白于神经元内高度螺旋化而形成）、神经元缺失及胶质增生。除此之外，环境因素的影响如文化程度、年龄、吸[44-46]烟、头部外伤等也参与了AD的发生及发展。由于VEGF能通过抑制细胞程序性凋亡、促进神经细胞突触生长、促进血管生成等方面来实现对神经元细胞的保护，因此，有关越来越多的研究正在阐述VEGF[47]和AD相关性。有研究报道，AD患者的血清中的VEGF含量明显低于正常对照组，并且VEGF减少的水平与AD的病情严重程度存在一定相关性，随着VEGF含量的越低,AD的神经变性过程可能发展的越快，进一步揭示了VEGF表达调控的分[27]子生物学机制可能参与了AD病情的进展。另外，有研究揭示：VEGF会与β-淀粉样蛋白（Aβ）相互聚集，并沉积在淀粉样蛋白斑处缓慢释放，进而可能导致脑组[48]织VEGF产量不足，进一步可能导致了AD发病过程中的神经退行性病变。另，在VEGF基因多态性方面，已有报道表明VEGFrs699947（-2578A/A）基因型与意[49,50]大利人群中散发性AD的风险增加可能存在相关性，独立于ApoEe4基因。在不存在ApoEe4的情况下，-1154G等位基因和VEGF启动子区-2549D/-1154G单倍[51]型可能增加中国北方汉族人群散发AD的风险。相反的是，在对法国以及西班牙[52,53]人群的研究中，未发现VEGF启动子区基因多态性与AD发病存在相关性。鉴于对VEGF相关机制的研究可能对于AD发病机理有意义，深一步的研究是必须的。27 青岛大学硕士学位论文4.VEGF与肌萎缩性侧索硬化症肌萎缩侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)是一种渐进性神经系统变性疾病，它能够累及上、下运动神经元，为运动神经元病（motorneurondisease，MND）最多见类型。男性患者多见,发病年龄多在30-60岁之间，多数在45岁以上起病。主要临床特点为肌无力及萎缩、脑干延髓麻痹，并出现锥体束征，往往感觉系统及括约肌的功能不受累。关于ALS的病因及发病机制尚不清楚，目前存在多种可能：感染和免疫、遗传因素、神经递质和自由基损害等因素，但尚未完全阐明。到目前为止，比较认可的机制：遗传加氧化应激及兴奋性毒性作用导致了运动神经元的变性脱失。ALS大多为散发，有家族史者主要是常染色体显性遗传。最常见的致病基因：铜（锌）超氧化物岐化酶(Cu/Znsuperoxidedismutase1,SOD1)基因，一[54-56]部分家族性ALS和一部分散发性ALS均与此基因的突变有关。有关越来越多[57-66]的研究正在阐述VEGF和ALS相关性。Poesen等研究了VEGF-B和flt-1在铜锌超氧化物岐化酶SODl基因突变而致ALS的转基因鼠模型中的作用。而且，VEGF-B（186）和flt-1相结合来保护脊髓运动神经元。当缺乏VEGF-B的小鼠与SOD1基因突变型所致ALS的小鼠杂交时会出现更加为严重的运动神经元变性，进[67]而可出现四肢无力、神经肌肉萎缩、肌电图的去神经及失神经状态等。另，VEGF有助于脊髓运动神经元的存活，是通过VEGF165及neuropilin-1（Npn-1）共同实现的。因此，我们推断VEGF可能在ALS的发病及进展过程中扮演着重要的角色。在VEGF基因多态性与ALS发病相关性方面也进行了探究，一项病例对照研究中，发现对于VEGF（-2578C/A，-1154G/A，-634G/C）AAG或AGG单倍体纯合的个体，[68]ALS发病风险增加了三倍。在对俄罗斯人群的一项研究中，选取了192例ALS[69]患者和128例健康对照，发现VEGF-2578A/A增加了ALS发病的危险性。但，[70]VanVught等未发现VEGF基因多态性与ALS发病存在相关性。鉴于对VEGF相关机制的研究可能对于明确ALS发病机理有重要意义，更深一步的研究是必须的。5.VEGF与缺血性脑卒中脑缺血性卒中是一种致残、致死率均高的疾病，目前该病的发生率呈逐渐上升[71]趋势，给整个家庭及社会带来极大的经济负担和精神痛苦。目前，脑卒中发病机制不甚清楚，某些常见危险因素及遗传因素联合作用可导致该病的发生。常见的危险性因素包含高血压、糖尿病、吸烟、肥胖、血脂异常、高同型半胱氨酸等。此病的病理生理过程主要为：（1）氧化应激反应：脑组织缺血再灌注中氧自由基的过度形成，对脑组织及其功能产生有害的影响，而且，对细胞也会产生严重的损害。（2）谷氨酸参与并介导了细胞的兴奋性毒性：脑组织缺血后导致了谷氨酸的大量释放，细胞摄取的谷氨酸的量会进一步达到饱和，造成谷氨酸大量蓄积，谷氨酸受体进一步被激活，从而引起离子通透性发生改变，细胞内的钙超载，导致细胞膜、细胞骨28 综述架及DNA的崩解，细胞变性死亡。（3）炎症反应：促进炎性因子表达、内皮细胞趋化因子与粘附分子的表达增加、巨噬细胞与小胶质细胞的活化，以及白细胞的浸[72-75]润等。这一系列的进程导致了脑卒中进一步加重。有研究报道：VEGF对缺血脑细胞起到了神经保护的作用，并在新生血管形成之前就产生了神经保护的作用，这有助于细胞的存活时间延长，直至新血管的生成，而且VEGF在促进神经细胞再生以及新生血管形成这两方面，其作用机制可能是互不影响的。更进一步研究表明，在发生缺血性脑卒中事件后，VEGF起到神经保护作用的可能机制是：缺氧诱导因子1（HIF1）为关键因素，它被缺血/缺氧激活，并进一步诱导VEGF及其相关受体的表达。VEGF在缺血事件中主要可能通过以下途径起到神经保护的作用：（1）降低caspase-3（细胞凋亡起到关键作用的效应蛋白酶）活性，抑制神经元凋亡；（2）激活PI3K/Akt/NF-KB信号通路，从而激活酪氨酸磷酸化的钾离子通道，进而抑制外向的钾离子流，使细胞死亡量减少；（3）促进了侧脑室下区和海马齿状回颗粒下区神经干细胞的增殖和迁移，并促进纹状体的神经发[76-80]生和存活，从而提高神经损伤修复。由于VEGF可以促进血管新生，可以发生在脑缺血后半暗带区，可增加缺血半暗带区组织的血流量。因此，对于可能改善缺血事件预后来说，VEGF可以参与到对缺血半暗带区组织的拯救具有重要意义。但是，VEGF对脑缺血损伤也会有一些不利的结果，基于VEGF增加了血管的通透性，如果在缺血性脑卒中的早期VEGF表达增多,可能会使得血脑屏障（BBB）被破坏造[81]成脑组织水肿。另，在VEGF基因多态性方面，在韩国人做的研究发现，对于缺血性脑卒中病人，VEGF基因-2578A，-1154A，-634G，和936T等位基因在多个小[82]动脉闭塞频率明显高于在单一小动脉闭塞。在一项中国人的研究中，发现VEGF[83]基因rs3025029位点的基因多态性可能影响了缺血性卒中的预后。由此，VEGF基因的多态性可能有助于了解缺血性脑卒中的发病机制。鉴于对VEGF相关机制的研究可能对于明确缺血性脑卒中发病机制有重要意义，更深一步的研究是必须的。6.VEGF与脊髓损伤VEGF主要表达于脊髓前角运动神经元,表达的受体主要是VEGFR-1和VEGFR-2。脊髓损伤后，VEGF及其受体在损伤局部的表达会升高。其主要机制是由于缺氧、炎症、氧化应激等来提高内源性VEGF的表达。VEGF增加后进而促进[84,85]了血管生成，改善局部微循环从而起到保护脊髓。因此，在脊髓损伤研究中，VEGF可能扮演一定重要角色，为该疾病的治疗提供帮助。7、小结与展望综上，无论是神经系统变性疾病（如：PD、AD、ALS等）或缺血性脑损伤疾病（如：Stroke等），到目前为止，上述疾病的病因及发病机制不明确。对于神经29 青岛大学硕士学位论文系统退行性疾病的临床治疗仅仅是对症或者延缓疾病的进展，尚不能治愈，不仅使患者的生活质量不断下降，而且给整个家庭乃至社会带来巨大的经济、精神负担。近年来，关于VEGF神经保护的机制也得到了发展，研究发现VEGF能够抑制细胞程序性凋亡、促进神经细胞突触生长、促进血管生成、增强葡萄糖血脑屏障的通透性、提高细胞抗氧化应激的能力、促进神经元及胶质细胞存活。这些研究高度提示VEGF与神经系统退行性疾病发病可能存在相关关系。而且，VEGF通过刺激神经胶质细胞增生和促进血管生成的机制来保护多巴胺能神经元。另，在基因层面，也有大量研究表明VEGF多个位点的基因多态性与包括帕金森病在内的多种神经变性疾病存在关联。因此，适时的合理利用VEGF在疾病不同发展阶段发挥介导的效应，适时的进行干预、处理，可能对疾病的治疗产生一定的价值。由此，更多探讨关于VEGF在PD发生及发展过程中的作用机制可能为PD的治疗提供新的靶向，可能能够实现改善患者的症状，提高患者的生活质量，对PD发病的危险因素进行早期的预防控制，并采取积极有效的治疗。30 综述参考文献参考文献[1]BartelsALandLeendersKL.Parkinson'sdisease:Thesyndrome,thepathogenesisandpathophysiology[J].Cortex,2009,45(8):915-21.[2]AdlerCH.PremotorsymptomsandearlydiagnosisofParkinson'sdisease[J].TheInternationaljournalofneuroscience,2011,121Suppl2(3-8.[3]GoldmanJGandPostumaR.PremotorandnonmotorfeaturesofParkinson'sdisease[J].Currentopinioninneurology,2014,27(4):434-41.[4]YangY,TangBSandGuoJF.Parkinson'sDiseaseandCognitiveImpairment[J].Parkinson'sdisease,2016,2016(6734678.[5]DexterDTandJennerP.Parkinsondisease:frompathologytomoleculardiseasemechanisms[J].Freeradicalbiology&medicine,2013,62(132-44.[6]HouldenHandSingletonAB.ThegeneticsandneuropathologyofParkinson'sdisease[J].Actaneuropathologica,2012,124(3):325-38.[7]Yonova-DoingE,AtadzhanovM,QuadriM,etal.AnalysisofLRRK2,SNCA,Parkin,PINK1,andDJ-1inZambianpatientswithParkinson'sdisease[J].Parkinsonism&relateddisorders,2012,18(5):567-71.[8]ChaiCandLimKL.GeneticinsightsintosporadicParkinson'sdiseasepathogenesis[J].Currentgenomics,2013,14(8):486-501.[9]BonifatiV.GeneticsofParkinson'sdisease–stateoftheart,2013[J].Parkinsonism&relateddisorders,2014,20(S23-S8.[10]QuittetMS,TouzaniO,SindjiL,etal.Effectsofmesenchymalstemcelltherapy,inassociationwithpharmacologicallyactivemicrocarriersreleasingVEGF,inanischaemicstrokemodelintherat[J].Actabiomaterialia,2015,15(77-88.[11]NowackaMMandObuchowiczE.Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)anditsroleinthecentralnervoussystem:anewelementintheneurotrophichypothesisofantidepressantdrugaction[J].Neuropeptides,2012,46(1):1-10.[12]RosensteinJMandKrumJM.NewrolesforVEGFinnervoustissue--beyondbloodvessels[J].Experimentalneurology,2004,187(2):246-53.[13]OtrockZK,MakaremJAandShamseddineAI.Vascularendothelialgrowthfactorfamilyofligandsandreceptors:review[J].Bloodcells,molecules&diseases,2007,38(3):258-68.[14]RoskoskiR,Jr.VEGFreceptorprotein-tyrosinekinases:structureandregulation[J].Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2008,375(3):31 青岛大学硕士学位论文287-91.[15]CrossMJ,DixeliusJ,MatsumotoT,etal.VEGF-receptorsignaltransduction[J].TrendsinBiochemicalSciences,2003,28(9):488-94.[16]ShinkarukS,BayleM,LainG,etal.Vascularendothelialcellgrowthfactor(VEGF),anemergingtargetforcancerchemotherapy[J].CurrentmedicinalchemistryAnti-canceragents,2003,3(2):95-117.[17]GilleH,KowalskiJ,LiB,etal.AnalysisofbiologicaleffectsandsignalingpropertiesofFlt-1(VEGFR-1)andKDR(VEGFR-2).Areassessmentusingnovelreceptor-specificvascularendothelialgrowthfactormutants[J].TheJournalofbiologicalchemistry,2001,276(5):3222-30.[18]ShibuyaMandClaessonwelshL.SignaltransductionbyVEGFreceptorsinregulationofangiogenesisandlymphangiogenesis[J].ExperimentalCellResearch,2006,312(5):549-60.[19]HolmesK,RobertsOL,ThomasAM,etal.Vascularendothelialgrowthfactorreceptor-2:structure,function,intracellularsignallingandtherapeuticinhibition[J].Cellularsignalling,2007,19(10):2003-12.[20]DomiganCK,ZiyadSandIruela-ArispeML.Canonicalandnoncanonicalvascularendothelialgrowthfactorpathways:newdevelopmentsinbiologyandsignaltransduction[J].Arteriosclerosis,thrombosis,andvascularbiology,2015,35(1):30-9.[21]JinK,ZhuY,SunY,etal.Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)stimulatesneurogenesisinvitroandinvivo[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2002,99(18):11946-50.[22]StorkebaumEandCarmelietP.VEGF:acriticalplayerinneurodegeneration[J].JournalofClinicalInvestigation,2004,113(1):14-8.[23]GreenbergDAandJinK.Fromangiogenesistoneuropathology[J].Nature,2005,438(7070):954-9.[24]ZacharyI.Neuroprotectiveroleofvascularendothelialgrowthfactor:signallingmechanisms,biologicalfunction,andtherapeuticpotential[J].Neuro-Signals,2005,14(5):207-21.[25]JinKL,MaoXOandGreenbergDA.Vascularendothelialgrowthfactor:directneuroprotectiveeffectininvitroischemia[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2000,97(18):10242-7.[26]YasuharaT,ShingoT,MuraokaK,etal.NeurorescueeffectsofVEGFonaratmodelofParkinson'sdisease[J].Brainresearch,2005,1053(1-2):10-8.32 综述参考文献[27]MateoI,LlorcaJ,InfanteJ,etal.LowserumVEGFlevelsareassociatedwithAlzheimer'sdisease[J].ActaneurologicaScandinavica,2007,116(1):56-8.[28]WangY,OuMaoX,XieL,etal.VascularEndothelialGrowthFactorOverexpressionDelaysNeurodegenerationandProlongsSurvivalinAmyotrophicLateralSclerosisMice[J].JournalofNeuroscience,2007,27(2):304-7.[29]KoukourakisMI,PapazoglouD,GiatromanolakiA,etal.VEGFgenesequencevariationdefinesVEGFgeneexpressionstatusandangiogenicactivityinnon-smallcelllungcancer[J].Lungcancer,2004,46(3):293-8.[30]SamliH,DemirBC,OzgozA,etal.Vascularendothelialgrowthfactorgene1154G/A,2578C/A,460C/T,936C/Tpolymorphismsandassociationwithrecurrentpregnancylosses[J].Geneticsandmolecularresearch:GMR,2012,11(4):4739-45.[31]WatsonCJ,WebbNJ,BottomleyMJ,etal.Identificationofpolymorphismswithinthevascularendothelialgrowthfactor(VEGF)gene:correlationwithvariationinVEGFproteinproduction[J].Cytokine,2000,12(8):1232-5.[32]KripplP,LangsenlehnerU,RennerW,etal.Acommon936C/Tgenepolymorphismofvascularendothelialgrowthfactorisassociatedwithdecreasedbreastcancerrisk[J].Internationaljournalofcancer,2003,106(4):468-71.[33]FalkT,YueX,ZhangS,etal.Vascularendothelialgrowthfactor-BisneuroprotectiveinaninvivoratmodelofParkinson'sdisease[J].Neuroscienceletters,2011,496(1):43-7.[34]PiltonenM,PlankenA,LeskelaO,etal.VascularendothelialgrowthfactorCactsasaneurotrophicfactorfordopamineneuronsinvitroandinvivo[J].Neuroscience,2011,192(550-63.[35]YasudaT,Fukuda-TaniM,NihiraT,etal.Correlationbetweenlevelsofpigmentepithelium-derivedfactorandvascularendothelialgrowthfactorinthestriatumofpatientswithParkinson'sdisease[J].Experimentalneurology,2007,206(2):308-17.[36]XiongN,ZhangZ,HuangJ,etal.VEGF-expressinghumanumbilicalcordmesenchymalstemcells,animprovedtherapystrategyforParkinson'sdisease[J].Genetherapy,2011,18(4):394-402.[37]HerranE,Ruiz-OrtegaJA,AristietaA,etal.InvivoadministrationofVEGF-andGDNF-releasingbiodegradablepolymericmicrospheresinaseverelesionmodelofParkinson'sdisease[J].Europeanjournalofpharmaceuticsandbiopharmaceutics:officialjournalofArbeitsgemeinschaftfurPharmazeutischeVerfahrenstechnikeV,2013,85(3PtB):1183-90.33 青岛大学硕士学位论文[38]HerranE,RequejoC,Ruiz-OrtegaJA,etal.IncreasedantiparkinsonefficacyofthecombinedadministrationofVEGF-andGDNF-loadednanospheresinapartiallesionmodelofParkinson'sdisease[J].Internationaljournalofnanomedicine,2014,9(2677-87.[39]YueX,HaririDJ,CaballeroB,etal.ComparativestudyoftheneurotrophiceffectselicitedbyVEGF-BandGDNFinpreclinicalinvivomodelsofParkinson'sdisease[J].Neuroscience,2014,258(385-400.[40]YasuharaT,ShingoT,MuraokaK,etal.Thedifferencesbetweenhighandlow-doseadministrationofVEGFtodopaminergicneuronsofinvitroandinvivoParkinson'sdiseasemodel[J].Brainresearch,2005,1038(1):1-10.[41]MihciE,OzkaynakSS,SallakciN,etal.VEGFpolymorphismsandserumVEGFlevelsinParkinson'sdisease[J].Neuroscienceletters,2011,494(1):1-5.[42]KimJS,YimSV,KohIS,etal.Single-nucleotidepolymorphisms(SNPs)andhaplotypeanalysisinvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)geneinthepatientswithParkinsondiseaseandlungcancer[J].Archivesofgerontologyandgeriatrics,2009,48(3):287-90.[43]VagnucciAHandLiWW.Alzheimer'sdiseaseandangiogenesis[J].TheLancet,2003,361(9357):605-8.[44]McGeerPLandMcGeerEG.Theamyloidcascade-inflammatoryhypothesisofAlzheimerdisease:implicationsfortherapy[J].Actaneuropathologica,2013,126(4):479-97.[45]De-PaulaVJ,RadanovicM,DinizBS,etal.Alzheimer'sdisease[J].Sub-cellularbiochemistry,2012,65(329-52.[46]OctaveJN.[Alzheimerdisease:cellularandmolecularaspects][J].Bulletinetmemoiresdel'AcademieroyaledemedecinedeBelgique,2005,160(10-12):445-9;discussion50-1.[47]JungJ,KimS,YoonK,etal.TheeffectofdepressiononserumVEGFlevelinAlzheimer'sdisease[J].Diseasemarkers,2015,2015(742612.[48]YangS-P,BaeD-G,KangHJ,etal.Co-accumulationofvascularendothelialgrowthfactorwithβ-amyloidinthebrainofpatientswithAlzheimer’sdisease[J].Neurobiologyofaging,2004,25(3):283-90.[49]DelBoR,ScarlatoM,GhezziS,etal.VascularendothelialgrowthfactorgenevariabilityisassociatedwithincreasedriskforAD[J].Annalsofneurology,2005,57(3):373-80.[50]DelBoR,GhezziS,ScarpiniE,etal.VEGFgeneticvariabilityisassociated34 综述参考文献withincreasedriskofdevelopingAlzheimer'sdisease[J].Journaloftheneurologicalsciences,2009,283(1-2):66-8.[51]YuanQ,ZuoXandJiaJ.AssociationbetweenpromoterpolymorphismsofvascularendothelialgrowthfactorgeneandsporadicAlzheimer'sdiseaseamongNorthernChineseHan[J].Neuroscienceletters,2009,457(3):133-6.[52]ChapuisJ,TianJ,ShiJ,etal.AssociationstudyofthevascularendothelialgrowthfactorgenewiththeriskofdevelopingAlzheimer'sdisease[J].Neurobiologyofaging,2006,27(9):1212-5.[53]MateoI,LlorcaJ,InfanteJ,etal.Case-controlstudyofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)geneticvariabilityinAlzheimer'sdisease[J].Neuroscienceletters,2006,401(1-2):171-3.[54]FurukawaY.Pathologicalrolesofwild-typecu,zn-superoxidedismutaseinamyotrophiclateralsclerosis[J].Neurologyresearchinternational,2012,2012(323261.[55]FoustKD,SalazarDL,LikhiteS,etal.TherapeuticAAV9-mediatedsuppressionofmutantSOD1slowsdiseaseprogressionandextendssurvivalinmodelsofinheritedALS[J].Moleculartherapy:thejournaloftheAmericanSocietyofGeneTherapy,2013,21(12):2148-59.[56]DaCruzS,BuiA,SaberiS,etal.MisfoldedSOD1isnotaprimarycomponentofsporadicALS[J].Actaneuropathologica,2017,[57]OosthuyseB,MoonsL,StorkebaumE,etal.Deletionofthehypoxia-responseelementinthevascularendothelialgrowthfactorpromotercausesmotorneurondegeneration[J].Naturegenetics,2001,28(2):131-8.[58]LiB,XuW,LuoC,etal.VEGF-inducedactivationofthePI3-K/AktpathwayreducesmutantSOD1-mediatedmotorneuroncelldeath[J].MolecularBrainResearch,2003,111(1-2):155-64.[59]AzzouzM,RalphGS,StorkebaumE,etal.VEGFdeliverywithretrogradelytransportedlentivectorprolongssurvivalinamouseALSmodel[J].Nature,2004,429(6990):413-7.[60]LambrechtsD,StorkebaumEandCarmelietP.VEGF:necessarytopreventmotoneurondegeneration,sufficienttotreatALS?[J].Trendsinmolecularmedicine,2004,10(6):275-82.[61]LambrechtsDandCarmelietP.VEGFattheneurovascularinterface:therapeuticimplicationsformotorneurondisease[J].Biochimicaetbiophysicaacta,2006,35 青岛大学硕士学位论文1762(11-12):1109-21.[62]McCloskeyDP,HintzTMandScharfmanHE.Modulationofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)expressioninmotorneuronsanditselectrophysiologicaleffects[J].Brainresearchbulletin,2008,76(1-2):36-44.[63]SathasivamS.VEGFandALS[J].Neuroscienceresearch,2008,62(2):71-7.[64]GuptaPK,PrabhakarS,SharmaS,etal.Vascularendothelialgrowthfactor-A(VEGF-A)andchemokineligand-2(CCL2)inamyotrophiclateralsclerosis(ALS)patients[J].Journalofneuroinflammation,2011,8(47.[65]KrakoraD,MulcroneP,MeyerM,etal.SynergisticeffectsofGDNFandVEGFonlifespananddiseaseprogressioninafamilialALSratmodel[J].Moleculartherapy:thejournaloftheAmericanSocietyofGeneTherapy,2013,21(8):1602-10.[66]KeiferOP,Jr.,O'ConnorDMandBoulisNM.GeneandproteintherapiesutilizingVEGFforALS[J].Pharmacology&therapeutics,2014,141(3):261-71.[67]PoesenK,LambrechtsD,VanDammeP,etal.Novelroleforvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)receptor-1anditsligandVEGF-Binmotorneurondegeneration[J].TheJournalofneuroscience:theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience,2008,28(42):10451-9.[68]TerryPD,KamelF,UmbachDM,etal.VEGFpromoterhaplotypeandamyotrophiclateralsclerosis(ALS)[J].Journalofneurogenetics,2004,18(2):429-34.[69]LysogorskaiaEV,AbramychevaN,ZakharovaMN,etal.[AssociationbetweentheVEGF-2578capitalES,Cyrillic/ApolymorphismandamyotrophiclateralsclerosisinaRussianpopulation][J].ZhurnalnevrologiiipsikhiatriiimeniSSKorsakova,2012,112(11):42-5.[70]Vught.PWV,Sutedja.NA,Veldink.JH,etal.LackofassociationbetweenVEGFpolymorphismsandALSinaDutchpopulation[J].Neurology,2005,22(1643-5.[71]FeiginVL,ForouzanfarMH,KrishnamurthiR,etal.Globalandregionalburdenofstrokeduring1990-2010:findingsfromtheGlobalBurdenofDiseaseStudy2010[J].Lancet(London,England),2014,383(9913):245-54.[72]BoehmeAK,EsenwaCandElkindMS.StrokeRiskFactors,Genetics,andPrevention[J].Circulationresearch,2017,120(3):472-95.[73]WarnerDS,ShengHandBatinic-HaberleI.Oxidants,antioxidantsandtheischemicbrain[J].TheJournalofexperimentalbiology,2004,207(Pt18):3221-31.[74]StrongAJ,AndersonPJ,WattsHR,etal.Peri-infarctdepolarizationsleadtolossofperfusioninischaemicgyrencephaliccerebralcortex[J].Brain:ajournal36 综述参考文献ofneurology,2007,130(Pt4):995-1008.[75]WangYC,LinSandYangQW.Toll-likereceptorsincerebralischemicinflammatoryinjury[J].Journalofneuroinflammation,2011,8(134.[76]HuaZ,LvQ,YeW,etal.MiRNA-directedregulationofVEGFandotherangiogenicfactorsunderhypoxia[J].PloSone,2006,1(e116.[77]KrumJM,ManiNandRosensteinJM.RolesoftheendogenousVEGFreceptorsflt-1andflk-1inastroglialandvascularremodelingafterbraininjury[J].Experimentalneurology,2008,212(1):108-17.[78]HarmsKM,LiLandCunninghamLA.Murineneuralstem/progenitorcellsprotectneuronsagainstischemiabyHIF-1alpha-regulatedVEGFsignaling[J].PloSone,2010,5(3):e9767.[79]MaY,ZechariahA,QuY,etal.Effectsofvascularendothelialgrowthfactorinischemicstroke[J].Journalofneuroscienceresearch,2012,90(10):1873-82.[80]QiuS,WuT,WangP,etal.TheAssociationbetweenVEGFRGenePolymorphismsandStroke:AMeta-Analysis[J].PloSone,2016,11(3):e0151371.[81]ZhangHT,ZhangP,GaoY,etal.EarlyVEGFinhibitionattenuatesblood-brainbarrierdisruptioninischemicratbrainsbyregulatingtheexpressionofMMPs[J].Molecularmedicinereports,2017,15(1):57-64.[82]KimOJ,HongSH,OhSH,etal.AssociationbetweenVEGFpolymorphismsandhomocysteinelevelsinpatientswithischemicstrokeandsilentbraininfarction[J].Stroke,2011,42(9):2393-402.[83]ZhaoJ,BaiY,JinL,etal.Afunctionalvariantinthe3'-UTRofVEGFpredictsthe90-dayoutcomeofischemicstrokeinChinesepatients[J].PloSone,2017,12(2):e0172709.[84]WidenfalkJ,LipsonA,JubranM,etal.Vascularendothelialgrowthfactorimprovesfunctionaloutcomeanddecreasessecondarydegenerationinexperimentalspinalcordcontusioninjury[J].Neuroscience,2003,120(4):951-60.[85]OzOyarE,KardesO,KorkmazA,etal.Effectsofvascularendothelialgrowthfactoronischemicspinalcordinjurycausedbyaorticcross-clampinginrabbits[J].TheJournalofsurgicalresearch,2009,151(1):94-9.37 青岛大学硕士学位论文攻读学位期间的研究成果[1]WuYB,ZhangY,HanX,etal.AssociationofVEGFgenepolymorphismswithsporadicParkinson'sdiseaseinChineseHanpopulation[J].Neurologicalsciences:officialjournaloftheItalianNeurologicalSocietyandoftheItalianSocietyofClinicalNeurophysiology,2016,37(12):1923-9.[2]LiXY,TengJJ,LiuY,WuYB,etal.AssociationofAKT1genepolymorphismswithsporadicParkinson'sdiseaseinChineseHanpopulation[J].Neuroscienceletters,2016,629(38-42.38 致谢致谢值此毕业论文即将完成之际，衷心地感谢所有关心、支持及帮助过我的老师、同学、朋友、家人。特别感谢我的导师谢安木教授在我研究生就读期间就课题的设计及实施、论文撰写等各方面给予的悉心指导；感谢导师在临床工作中耐心的教诲。导师严谨细致、实事求是的科学态度，认真勤奋的工作作风，精湛的医术和无私奉献精神深深地感动和影响着我，使我受益匪浅。感谢青岛大学附属医院和国家人类基因组北方研究中心实验室的各位老师在课题进行中给予的指导与帮助。感谢师姐、师哥、师弟、师妹在实验技能、论文撰写和生活中给予的指导和帮助。尤其感谢李筱媛师姐、朱孔华师姐、赵静师姐、牛梦月师姐、张晓娜师妹的大力支持和帮助。感谢青岛大学附属医院黄岛院区神经内科各位老师在临床工作及生活中给予无私的指导和帮助。感谢我家人和朋友，正因为有了他们的帮助，才会让我不断成长。39 学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明40
