猪繁殖与呼吸综合征病毒GP2蛋白B细胞表位和T细胞表位筛选

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学校代码１０４５９？学号或申请号２０１５２２１６２０４３密级公开专业硕士学位论文猪繁殖与呼吸综合征病毒ＧＰ２蛋白Ｂ细胞表位和Ｔ细胞表位筛选国家自然科学基金面上项目（３１４７２１７７）资助一作者姓名：轰守导师姓名：张改平院士专业学位名称：生物工程培养院系：生命科学学院完成时间：２０１８年５月 Ａｔｈｅｓｉｓｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｓｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏ（）ＺｈｅｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｆｏｒｔｈｅｄｅｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｇ－Ｌｏｃａ－ｔｉｏｎｏｆＢｃｅｌｌＥｐｉｔｏｐｅｓａｎｄＴｃｅｌｌＥｐｉｔｏｅｓｉｎｐＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ２ｏｆＰｏｒｃｉｎｅＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｎｄｒｏｍｅＶｉｒｕｓｙＢＳｈｏｕｉＮｉｅｙｙＳｕｅｒｖｉｓｏｒ：Ａｃａｄｅｍｉｃｉａｎ，ＧａｉｉｎＺｈａｎｐｐｇｇＭａｏｒ：ＢｉｏｌｏｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｊｇｇＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＭａ２０１８ｙ， 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果，。对本文的研宄作出重要贡献的个人和集体均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。、学位论文作者日期讲学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学，意学校保留或向国家关部门位论文的规定同有复印件电版，允许论文被查阅和借阅人授郑州学或机构送交论文的和子；本权大以学位论的全或入有关据进行检索，可以采用影印、缩印可将本文部部分编数库。人、论者其他制论和汇论文本离校发表使用学位文或复手段储存文编本学位后一然为。与该学论文直接相关的学术论文或成果时，第署名单位郑大或位仍州学。保密论文在解密后应遵守此规定学位论文作者＂：曰年月曰期£＞５＇－ｔｒ． 摘要摘要猪繁殖与呼吸综合征是动物二类传染病，俗称蓝耳病，可通过个体接触、污染物和空气传播。PRRS现已成为规模化养猪场的主要疫病之一，给世界养猪产业造成了重大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒颗粒呈椭球体，由囊膜包裹，直径在50~74nm之间。根据病毒基因序列和抗原性等方面的差异，又将其分为基因Ⅰ型和基因Ⅱ型。PRRSV因其抑制先天性免疫应答的能力，目前仍然是严重危胁养猪业安全的病原之一。研究表明，获得性免疫应答反应在PRRSV感染的机体内起着关键性的免疫保护作用，而PRRSVGP2蛋白不仅是病毒侵染宿主细胞的必要结构蛋白，还能引起宿主产生明显的获得性免疫应答。本研究通过合成GP2蛋白的重叠多肽，采用间接ELISA和IFN-γELISPOT的方法筛选并得到了GP2蛋白3个B细胞表位和6个T细胞表位，为新型表位疫苗的研究提供帮助。将实验室保存的PRRSVJXA1-R毒株进行扩增，根据Reed-Muench两氏法6.6TCID测定其病毒滴度为1050/mL。提取JXA1-R毒株总RNA并逆转录成cDNA，以cDNA为模板扩增得到了ORF2基因序列全长，并成功构建了pMD19-T-ORF2克隆载体。根据ORF2目的基因测序结果推导出JXA1-R毒株GP2蛋白氨基酸序列。以pMD19-T-ORF2为模板，PCR扩增GP2蛋白胞外区基因序列，与pET-32a表达载体连接后转化到Rosetta(DE3)表达菌中构建GP2蛋白重组表达菌pET-32a-GP2-Rosetta(DE3)。GP2重组蛋白以包涵体形式表达，分子量约为36kDa。经WesternBlot鉴定，GP2重组蛋白具有良好的反应原性。以收集得到的PRRSVJXA1-R病毒液作为免疫原，采用肌肉注射的方法对试验组5头PRRSV抗体阴性试验猪进行两次免疫，免疫间隔时间为两周，免疫6TCID剂量为3×1050。以细胞破碎后上清液为免疫原，免疫对照组3头试验猪，采用相同的免疫方式进行免疫。免疫后每周对试验猪采血，分离血清样品。免疫12周后，大量采血分离外周血单核细胞。经PRRSV抗体检测试纸检测，试验组动物首次免疫3周后血清中就能检测到PRRSV特异性抗体。通过间接ELISA测定，试验组5头猪在首次免疫后第4周开始出现GP2蛋白抗体，第8~9周抗体水平达到顶峰并趋于平稳。将GP2蛋白氨基酸序列按照重叠多肽法设计并成功合成了22条长度为18I 摘要个氨基酸残基的重叠多肽段，相邻肽段重叠9个氨基酸。以合成的GP2蛋白重叠多肽为包被原，首次免疫12周后分离得到的猪阳性血清为一抗，采用间接ELISA的方法检测血清中抗体与重叠多肽的反应性，从而对GP2蛋白B细胞表位进行筛选。最终筛选得到GP2蛋白3个免疫显性的B细胞表位，分别是77~94aa、113~130aa、131~148aa，氨基酸序列比对结果显示筛选到的3个B细胞表位在北美洲型毒株间的同源性达到92%以上。将分离得到的猪外周血单核细胞进行体外培养，并用重叠多肽进行刺激，采用ELISPOT方法检测猪外周血单核细胞所分泌的IFN-γ，记录不同试验组所呈现的斑点数，若斑点数大于等于阳性判定临界值，则判定该多肽为阳性多肽。经肽库和单肽两轮筛选，最终筛选出GP2蛋白6个T细胞表位，分别是86~103aa、95~112aa、104~121aa、113~130aa、140~157aa和185~202aa。II AbstractAbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)iscommonlyknownasblue-earpigdiseaseandisdefinedthesecondclassanimalepidemicdiseases,whichcanbetransmittedthroughpersonalcontact,contaminants,andairbornespread.PRRSischaracterizedbyreproductiveproblemsinpregnantsows(abortion,stillbirth,mummy)andrespiratorydiseasesinpigsofallages,especiallypiglets.Ithasnowbecomeoneofthemajordiseasesinlarge-scalepigfarmsandhascausedgreateconomicslossestoporcineindustryintheworld.PRRSVisapositive-sense,single-strandedRNAviruswithatotalgenomelengthofapproximately15kb.Thevirusencodesatleast11functionalopenreadingframes(ORFs)thatsurroundedbyenvelopesandPRRSVvirionsappearasellipsoidparticlesrangingindiameterfrom50nmto74nm.Accordingtothedifferencesinviralgenesequencesandantigenicity,theyweredividedintogenotypeIandgenotypeII.Becauseofitsantibodydependentenhancement(ADE)andabilitytosuppressinnateimmuneresponses,PRRSVisstilloneofthemostimportantpathogensthatseriouslyharmtheswineindustry.StudieshaveshownthattheacquiredimmuneresponseplaysakeyroleintheimmuneprotectionofhostagainstPRRSVinfection,andPRRSVGP2isnotonlyanessentialstructuralproteinforthevirustoinfectthehostcell,butalsocancausethehosttoproduceasignificantacquiredimmuneresponse.Inthisstudy,thereB-cellepitopesandsixT-cellepitopesofGlycoprotein2werelocatedbyindirectELISAandIFN-γELISPOTmethodsusingoverlappingpeptides,whichmayprovideassistancefortheresearchofnovelepitopevaccines.Inthisstudy,PRRSVJXA1-Rstrain,whichwaskeptinthelaboratoryinthepast,wasexpanded.AccordingtotheReed-Muench'smethod,thevirustiterofthestrainwascalculatedtobe106.6TCID50/mL.TotalRNAofJXA1-Rstrainwasextractedandreverse-transcribedintocDNA.ThefulllengthofORF2genesequencewasamplifiedbyusingcDNAasatemplate,andthepMD19-T-ORF2cloningvectorIII Abstractwasconstructed.AccordingtothesequencingresultsofORF2gene,theaminoacidsequenceofGlycoprotein2ofJXA1-Rstrainwasdeduced.ThegenesequenceofGlycoprotein2extracellularregionwasamplifiedbyusingpMD19-T-ORF2asatemplate.ThegenesequencewasclonedintothepET-32aexpressionvector.Andthen,thepET-32a-GP2expressionplasmidswastransformedintotheRosetta(DE3)prokaryoticexpressionbacterium.PRRSVGP2recombinantproteinwasexpressedbyinducingrecombinantexpressionbacteria.Themolecularweightofthetargetproteinwasdeterminedtobeapproximately36kDa,mainlyintheformofinclusionbodiesintheprecipitateaftercelldisruption.TheresultofWesternBlotshowedthatthepurifiedGP2proteinhadgoodreactogenicity.EightpigsweredeterminedtobenegativeforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusbyPRRSVantibodyteststrips.Fivepigsintheexperimentalgroupweretheninoculatedintramuscularlywith3×106TCID50ofthecollectedPRRSVJXA1-Rvirusfluid.Threepigsinthecontrolgroupwereintramuscularinoculatedwithsupernatantliquidofcelldisruption.Theseexperimentalanimalswereimmunizedtwicesuccessively.Theimmunizationintervalwastwoweeksandtheimmunizationdosewas3mL.Theexperimentalpigswerebledweeklyfor12weeks,andtheserumsampleswerecollected.Theperipheralbloodmononuclearcellswerecollectedat12thweekspost-infection.PRRSVspecificantibodiesoffivepigsintheexperimentalgroupcanbedetectedat3weekspost-infectionalreadyexisted,whichindicatedthatspecificimmuneresponsehasbeengeneratedintheanimalswhichwereimmunizedwiththevirus.ByindirectELISAassay,theanti-Glycoprotein2antibodyof5pigsintheexperimentalgroupbegantoexhibitat4thweekspost-infection.At8thand9thweekspost-infection,theantibodypeakedandthenstabilized.Accordingtotheoverlappedpeptidemethod,Twenty-twooverlappedpolypeptideswithalengthof18aminoacidresiduesweredesignedandsynthesized.Theadjacentpeptideoverlapped9aminoacids.Thesyntheticoverlappingpeptideswereusedasthecoatingantigenandthepigpositiveserumswhichwereisolatedfromexperimentalanimalsat12weekspost-infectionwereusedasprimaryantibody.TheB-cellepitopesofglycoprotein2werelocatedbyindirectELISA.ThreeIV AbstractimmunodominantB-cellepitopesofglycoprotein2werescreenedout,whichwere77~94aa,113~130aa,and131~148aa.AlignmentsofepitopesequencesrevealedthatthethreeB-cellepitopesonglycoprotein2weremorethan92%homologousamongtheNorthAmerican-typestrains.Theperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)wereculturedinvitro.PBMCswerestimulatedwithoverlappingpolypeptides.TheIFN-gammaELISPOTmethodwasusedtodetectthespotsassociatedwithIFN-gammasecretionfromperipheralbloodmononuclearcells.Thenumberofspotspresentedindifferentexperimentalgroupswasrecorded.Ifthenumberofspotswasgreaterthanorequaltothepositivedeterminationthreshold,thepolypeptidewasscoredaspositive.Aftertworoundsofpeptidelibraryandsinglepeptidescreening,6T-cellepitopesofGP2proteinwerescreenedout,whichwere86~103aa,95~112aa,104~121aa,113~130aa,140~157aa,and185~202aa.Keywords:PRRSVGlycoprotein2OverlappingpolypeptidesB-cellepitopesT-cellepitopesV 目录目录摘要........................................................................................................................IAbstract.............................................................................................................III1文献综述.........................................................................................................11.1PRRSV的危害.....................................................................................11.2PRRSV的分子病原学概述.................................................................11.2.1PRRSV的形态结构及理化性质..............................................11.2.2PRRSV的基因组构成..............................................................21.2.3PRRSV的主要结构蛋白..........................................................31.2.4PRRSV的次要囊膜蛋白..........................................................41.3PRRSV的流行病学概述.....................................................................51.3.1PRRSV的传播途径..................................................................51.3.2PRRSV的宿主特异性..............................................................61.3.3PRRSV的感染特征..................................................................61.4PRRSV感染诱导的特异性免疫应答反应.........................................71.4.1体液免疫...................................................................................71.4.2细胞免疫...................................................................................81.5PRRS的防控及诊断............................................................................81.5.1PRRS的防控.............................................................................81.5.2PRRS的诊断.............................................................................81.6抗原表位研究进展..............................................................................91.6.1PRRSV结构蛋白T细胞表位研究现状.................................91.6.2PRRSV结构蛋白B细胞表位研究现状...............................101.7研究目的及意义................................................................................102PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达......................................................122.1试验材料............................................................................................122.1.1病毒株、载体、菌株和细胞.................................................122.1.2试验试剂及试剂盒.................................................................12VI 目录2.1.3主要试验仪器与耗材.............................................................132.1.4试剂配制方法.........................................................................132.2试验方法............................................................................................162.2.1PRRSVJXA1-R毒株扩繁.....................................................162.2.2病毒感染力测定.....................................................................162.2.3ORF2目的基因获取...............................................................182.2.4克隆载体构建并回收测序.....................................................202.2.5GP2蛋白原核表达载体构建.................................................222.2.6GP2蛋白的表达纯化与鉴定.................................................232.3试验结果............................................................................................252.3.1病毒感染力测定.....................................................................252.3.2ORF2目的基因获取...............................................................262.3.3ORF2克隆载体鉴定并测序...................................................262.3.4GP2蛋白表达载体构建.........................................................272.3.5GP2蛋白的表达纯化及WesternBlot鉴定..........................282.4讨论....................................................................................................292.5小结....................................................................................................303PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选.............................................313.1试验材料............................................................................................313.1.1病毒株和试验动物.................................................................313.1.2试验试剂及试剂盒.................................................................313.1.3主要试验仪器与耗材.............................................................323.1.4试剂配制方法.........................................................................323.2试验方法............................................................................................333.2.1试验猪PRRSV抗体检测.......................................................333.2.2试验动物免疫.........................................................................333.2.3分离血清样品与外周血单核细胞.........................................343.2.4GP2蛋白抗体检测.................................................................353.2.5GP2蛋白重叠多肽设计.........................................................353.2.6GP2蛋白B细胞表位筛选.....................................................363.2.7B细胞表位保守性分析..........................................................36VII 目录3.2.8GP2蛋白T细胞表位筛选.....................................................373.3试验结果............................................................................................373.3.1试验猪PRRSV抗体检测.......................................................373.3.2GP2蛋白抗体水平检测.........................................................383.3.3GP2蛋白重叠多肽合成.........................................................393.3.4GP2蛋白B细胞表位筛选.....................................................393.3.5B细胞表位保守性分析..........................................................393.3.6GP2蛋白T细胞表位筛选.....................................................443.4讨论....................................................................................................463.5小结....................................................................................................484结论...............................................................................................................49参考文献.............................................................................................................50附录英文缩略词表.........................................................................................58致谢.....................................................................................................................59个人简历.............................................................................................................60VIII 1文献综述1文献综述1.1PRRSV的危害猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome,PRRS)是一种以妊娠母猪的繁殖障碍（流产、死胎、木乃伊胎）及各年龄段猪特别是仔猪的呼吸道疾病为主要特征的传染性疾病，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus,PRRSV)所引起[1]。二十世纪八十年代末，美国东南部的北卡罗来纳州首次出现该疾病，但查不出该病的发病原因，而且患病猪的耳朵呈青紫色或蓝红色，所以又称其为“猪神秘病”或“猪蓝耳病”等。中国于上世纪九十年代初发生该疾病，在1996年郭宝清等从疑似PRRS流产胎儿中分离到PRRSV毒株[2]，从而证实了PRRSV在我国的存在。据统计，2005年，美国养猪业因PRRS所造成的直接经济损失为5.6亿美元，其中妊娠母猪繁育期所造成损失为6,700万美元，仔猪死亡损失了2.01亿美元，而育肥猪死亡造成的损失最大，达到了2.92亿美元[3]。2013年，Holtkamp等[4]统计了PRRS对美国养猪业造成的经济损失达到了6.63亿美元，与2005年相比高出了10%。2012年，欧洲统计的数据[5]显示了因PRRS导致的经济损失是126欧元/头，比较2005年美国统计的数据（121美元/头）还要高。目前，中国已超过25个省市有PRRS发生的报道[6]。2006年，我国江西发生高致病性蓝耳病的爆发，2007年开始蔓延到全国，最终查明是由PRRSV经典毒株突变株所引起的，Nsp2基因的缺失和GP5基因的点突变是其突变的主要表现，此次爆发给中国生猪养殖产业造成了巨额损失，时刻威胁中国生猪养殖产业正常发展[7]。30多年来，PRRS给全球养猪产业带来了严重的经济损失，引起了全球各国学者的高度关注和大量研究，被世界动物卫生组织(Officeinternationaldesépizooties,OIE)列为B类传染病。1.2PRRSV的分子病原学1.2.1形态结构及理化性质PRRSV是由囊膜包裹的正股RNA病毒[8]。PRRSV病毒颗粒呈椭球体，直径在50~74nm之间，由双层脂质膜包围，厚度约4.5nm，而且膜的表面光滑，1 1文献综述衣壳蛋白呈20面立体对称，直径在25~35nm之间，核衣壳表面有5nm的突起[9]。有机溶剂处理后可有效的破坏PRRSV的囊膜，并使病毒粒子丧失感染性。湿润的环境有益于PRRSV的生存并保留其感染性。pH在6.5~7.5之间时，最适宜PRRSV增殖，对酸性或碱性的耐受性均较差。对温度也非常敏感，通常56℃加热40min就能使其完全灭活，室温条件下，随着放置天数的增加，PRRSV的病毒滴度呈现成倍的下降，所以PRRSV通常储存在-70℃条件下，可保存4个月以上[10]。经过碘(0.0075%)或季铵盐化合物(0.0063%)处理60s可以快速完全灭活病毒[11]。1.2.2PRRSV的基因组构成PRRSV的基因组全长约为14.9~15.5kb，含有11个开放阅读框(openreadingframes,ORFs)，而且各个阅读框相邻区域相互重叠，分别编码不同的病毒蛋白[12]。ORF1由ORF1a和ORF1b两部分构成，约为基因组全长的75%，对应编码多聚蛋白(polyprotein,pp)1a和1ab，经蛋白酶切割后可形成14个非结构蛋白(non-structuralproteins,NSP)[12]。ORFs2~5分别对应编码病毒囊膜上的糖蛋白(Glycoprotein,GP)，分别对应的是GP2~GP5。ORF6和ORF7分别编码PRRSV非糖基化基质(matrix,M)蛋白和核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白。ORF2b在ORF2中间，编码非糖基化蛋白GP2b[13]。ORF5中含有一个ORF5a，负责编码GP5a蛋白（图1.1）。存在大量的包膜蛋白是套式病毒目的基本特征，并且所有的结构蛋白都是传染性病毒所必需的[14,15]。通过比较PRRSV的基因序列和抗原性等方面的差异将PRRSV分成两大类，依据在不同地区发现的先后顺序而进行命名，一类是欧洲型，又称为基因Ⅰ型，代表毒株为LV株，另一类是北美洲型，又称为基因Ⅱ型，代表毒株为VR-2332株[16]，而我国PRRSV流行毒株大多属于北美洲型[17,18]。由于PRRSV是单链RNA病毒，碱基序列极易发生突变，会诱发亚群或亚种的产生。2 1文献综述图1.1PRRSV基因组的转录和翻译[12]1.2.3PRRSV的主要结构蛋白N蛋白、M蛋白和GP5蛋白是PRRSV的主要结构蛋白，参与组建基本的结构形态，对于病毒增殖和免疫逃逸等方面至关重要[19]。GP5蛋白又称为E蛋白，分子量为24.5~26kDa，含有200个氨基酸残基(aminoacidresidue,aa)（欧洲型含有201个aa），是包膜的主要构成组分，含有糖基化位点4个，其中N-端的2个位点高度保守，而且N端有一个疏水区域，是蛋白的前导链[20]。GP5蛋白有一段胞外区，其中含有中和表位[33]，而且在Ⅰ型和Ⅱ型毒株中都存在[21-23]。有研究报告，GP5蛋白N端的前119个aa能诱使肺部巨噬细胞和淋巴细胞凋亡[24]。M蛋白又称为基质蛋白，分子量为18~19kDa，含有174个aa（欧洲型含有173个aa），是PRRSV最为保守的蛋白中。M蛋白的N端跨膜3次，且胞外有一段10~18个aa[25]。在PRRSV侵染细胞中发现M/M同源蛋白二聚体[26]，而乳酸盐脱氢酶提升病毒(lactatedehydrogenase-elevatingvirus,LDEV)的M蛋白则是与GP5蛋白构成异源二聚体，两者相似的是均依靠二硫键进行连接，而且破坏二硫键会减弱病毒侵染力[27]。N蛋白又称为衣壳蛋白，分子量为14~15kDa，含有123个aa（欧洲型含有128个aa），是PRRSV结构蛋白中分子量最小的。N蛋白在同一基因型毒株间3 1文献综述较保守，同源性高达96%，但在不同基因型毒株间N蛋白的同源性仅为57~64%。N蛋白在宿主细胞中表达量最高，大约为病毒蛋白总量的20~40%[28]。1.2.4PRRSV的次要囊膜蛋白PRRSVGP2a、GP2b、GP3和GP4能够在包膜表面组装形成异源多聚体，对于病毒感染非常关键。也有研究报道，GP2、GP3和GP4与GP5相互影响，与CD163受体相识别，介导PRRSV侵染宿主细胞。模式图如下图1.2所示。图1.2PRRSV膜蛋白与宿主CD163受体相互识别[29]GP2蛋白的分子量约为29~30kDa，由256个aa组成（欧洲型由253个aa组成），可能与马动脉炎病毒(equinearteritisvirus,EAV)中小囊膜蛋白Gs相似[30,31]。Ⅱ型毒株GP2蛋白包含糖基化位点2个，分别是第171和178位aa。Ⅰ型与Ⅱ型毒株的GP2蛋白差异显著，疏水基团和糖基化位点都不一样。Bautista等研究表明用痘病毒表达得到GP2蛋白能诱导T淋巴细胞增殖[32]，而且GP2蛋白能与PRRSV的重要受体CD163结合[33]。PRRSV一旦失去GP2蛋白就无法在MARC-145细胞上增殖，而C端缺失10个氨基酸并不影响其增殖，病毒的抗原表位也不改变[34]，推断GP2蛋白可能与PRRSV侵染宿主细胞和调控宿主免疫反应有关。GP2b是非糖基化蛋白，由ORF2b编码，分子量约为10kDa，由73个aa组成（欧洲型由70个aa组成），且保守性较高。GP2b蛋白含有单独的TM循环，4 1文献综述推断其构成了低聚物的离子通道[35]，但在PRRSV感染中的作用尚不清楚。GP3蛋白由ORF3编码，分子量为42~50kDa，由254个aa构成（欧洲型由265个aa构成），含有糖基化位点7个[36-38]。在不同基因型毒株间GP3蛋白差异较大，同源性仅有54~60%，但GP3蛋白的7个糖基化位点是高度保守的。同时，GP3蛋白拥有显著的免疫反应原性，在机体的免疫保护方面存在重要的作用[39]。GP4蛋白由ORF4编码，分子量约为31~35kDa，由178个aa构成（欧洲型由183个aa构成）。研究报道，Ⅰ型PRRSVGP4蛋白能诱导具有中和活性的抗体产生[40]。GP4蛋白包含糖基化蛋白位点4个，并且相对比较保守[41]。N端的1~22位aa和C端的162-178位aa是信号肽。但Ⅱ型LV毒株未发现信号肽位点[42,43]，但却能诱导具有中和活性的抗体产生，其中和表位在N末端亲水区的40~79位aa。其中59~67位aa是构成了中和位点的核心[44]。1.3PRRSV的流行病学概述1.3.1PRRSV的传播途径PRRSV的传染通常发生在暴露的粘膜和皮肤。传播方式分为空气传播、性传播、血液接触和垂直传播。PRRSV的传播特点是高传染性，最小感染剂量(minimuminfectivedose,MID)较低，而PRRSVMID与传播方式和毒株都有关系。Hermann等[45]对PRRSV-2型病毒VR-2332进行研究，结果表明VR-2332毒株通过口腔和鼻腔传播的半数最小感染剂量(medianminimuminfectivedose,MID5.34.050)分别是10和10TCID50；而通过肌肉注射接种疫苗传播的MID50是102.2TCID[46]50。相比之下，Yoon等研究PRRSV-2型ISU-P毒株时，通过接种疫苗进行传播仅需小于10个拷贝就可。Cutler等[47]报道了PRRSV-2型病毒MN-184通过空气传播的MID[48]50是2TCID50，这比Hermann等报道的病毒VR-2332通3.1TCID过空气感染的MID50(1050)要低很多。从报道中不难发现血液接触是主要传播方式。病毒血症高峰时发病猪血液中的病毒载量起码是103~104TCID[49][50]50/mL，这样仅需1~10μL的血液就能轻松传播疾病。2002年，Otake试验证实了病毒污染的注射器针头就能传播PRRSV。同时，猪群中一些正常活动，如撞伤、摔伤或者个体之间的争斗等也会导致病毒的传播。Bierk[51]证实了猪群间的打斗行为有利于PRRSV在患病猪与正常猪之间的传播。5 1文献综述1.3.2PRRSV的宿主特异性PRRSV具有宿主特异性，主要侵染的细胞类型是猪肺泡巨噬细胞(PorcineAlveolarMacrophage,PAM)和外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)等巨噬细胞。PRRSV感染细胞依靠的是抗原表位与细胞受体识别所引起的胞吞作用，并最终使细胞发生病变。研究发现，PRRSV基因组转化到非敏感细胞中，虽然基因可以扩增，但没有子代病毒装配产生，推测可能与敏感细胞表面的受体种类有关。研究发现PRRSV包膜表面的M-GP5异源二聚体能和PAM表面硫酸乙酰肝素受体相互识别[52]。唾液酸粘附素能与糖脂的寡糖末端唾液酸序列特异性结合，PRRSV拥有多种糖基化蛋白，都有可能含有唾液酸序列。有研究表明，PAM表面的CD163受体能与唾液酸粘附素受体一起结合病毒侵染细胞，是病毒侵染细胞的受体，主要功能是协助病毒粒子脱壳和释放[53]。对于免疫组织内的单核细胞和睾丸内的精细胞等较敏感的宿主细胞，PRRSV只在细胞浆中生存，通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidasemonolayerassay,IPMA)和免疫荧光试验(Immunofluorescenceassay,IFA)就可在细胞浆中检测到该病毒。MARC-145细胞含有1种波形蛋白，可以与N蛋白结合，从而使其被PRRSV感染。1.3.3PRRSV的感染特征1.3.3.1持续性感染持续性感染是指PRRSV侵染机体后，宿主细胞内病毒持续增殖，使含有敏感细胞的组织或器官长期被感染，造成被侵染机体长期携带病毒。研究表明，最初PRRSV感染机体时，最先识别PAM细胞表面的受体并与之结合，通过细胞内吞作用感染细胞，在宿主细胞内完成增殖并释放后进入体液循环系统，并引起严重的病毒血症[54]。动物感染PRRSV12h后就能在血液中检测出病毒，6周左右仍能在肺泡中检查出病毒，淋巴组织中可能会持续更长时间。同时，PRRSV能诱导肺部和免疫组织产生凋亡，造成肺泡毛细血管大面积损伤，临床表现为呼吸困难并伴随皮肤发蓝。一旦感染，病毒经血液循环系统快速分布到机体的各个部位，而市面上的肥育猪感染PRRSV后，病毒将终身携带，使得PRRSV在猪群中持续存在[55]。6 1文献综述1.3.3.2抗体依赖性增强作用PRRSV侵染宿主之后能诱导机体产生体液免疫应答反应，没有中和活性的特异性抗体能加强PRRSV的侵染过程，加快病毒在机体内侵染宿主细胞的速率。抗体依赖性增强作用(Antibodydependentenhancement,ADE)产生的主要原因是病毒特异性抗体（一般多为非中和抗体）与病毒识别并结合后，利用抗体Fc段与宿主表面表达的FcR识别，促使病毒进入宿主，从而加强了侵染过程。1.3.3.3先天性免疫抑制机体感染PRRSV后，被侵染的PBMCs和PAMs将大量凋亡，产生的IFN-γ和TNF-γ浓度降低，从而不能阻止PRRSV在宿主内的增殖，随着淋巴结和免疫器官中巨噬细胞的损伤，机体先天性免疫应答将进一步被削弱，机体的免疫系统响应时间也将滞后或产生免疫耐受。同样的，免疫应答能力的下降，使得宿主出现共感染或继发感染其他病原体的状况，从而造成更大的危害，但仍要进一步的实验验证[56]。有研究报道，基因Ⅱ型PRRSVN蛋白间的非共价作用对于上调IL-10的表达起到关键作用[57]。1.4PRRSV感染诱导的特异性免疫应答反应1.4.1体液免疫PRRSV侵染机体一周左右就可以在血清当中检测到针对病毒的特异性抗体。N蛋白抗体的产生时间最早且抗体水平最高，其次是M蛋白抗体，最后是GP5蛋白抗体[58-60]。由于N蛋白抗体产生最早，且持续时间较长，所以通常使用N蛋白抗体的试剂盒来诊断病毒感染。一般情况下，中和抗体在动脉炎病毒感染机体2周后就能产生，而PRRSV中和抗体的产生较为滞后且抗体滴度较低，不能完全中和病毒[61]。中和抗体的存在能有效预防PRRSV的侵染[62-64]。GP5蛋白含有中和活性表位，但体外合成的短肽却不能诱导中和抗体产生，表明结构特征对于决定蛋白的抗原性尤为重要[65,66]。有研究报道，动脉炎病毒中和抗体的产生速率与GP5蛋白糖基化有关[67]。非糖基化GP5蛋白能有效提高机体内中和抗体的滴度[68]。7 1文献综述1.4.2细胞免疫机体感染PRRSV后，由T淋巴细胞介导的获得性免疫应答反应对机体起到了关键的保护[69]，主要参与细胞免疫应答反应的淋巴细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTlymphocytecell,CTL)[70][71]。Samsom等研究表明PRRSV侵染猪后，肺泡中CTL所占百分比的增高与肺泡中PRRSV的减少呈正相关[72]。1.5PRRS的防控及诊断1.5.1PRRS的防控PRRS对生猪养殖产业的危害巨大，所以对PRRS的防控就显得极其重要。目前预防PRRSV的感染，主要以接种疫苗和加强养殖管理为主。PRRSV灭活疫苗主要是将病毒灭活后与佐剂共同乳化后制成，安全性较高但保护性较差。弱毒活疫苗能起到更好的保护作用，但在使用中存在逆反现象。PRRSV的DNA疫苗是将表达病毒蛋白的重组表达载体注射到免疫动物体内，使外源基因能够在宿主细胞中表达，并诱导免疫应答反应，包括体液免疫和细胞免疫。PRRSV的亚单位疫苗主要是将M蛋白、GP5、GP4和GP3等结构蛋白接种到机体内，使机体产生获得性免疫应答[73]。表位疫苗的出现为PRRS的防控提供了新的研究思路，表位疫苗是利用具有免疫活性的抗原表位制成的疫苗。主要的技术要点是将多个T细胞表位连接到多聚赖氨酸分支骨架上，形成特有的三维结构的大分子抗原肽疫苗[74]。1.5.2PRRS的诊断1.5.2.1分子生物学方法分子诊断是一种快速灵敏的检测技术，近年来得到了广泛的应用，可以直接检测PRRSV的基因[77,78]。1.5.2.2血清学方法血清学方法是在实验室级别应用最广泛的的病毒检测方法。近年来，N蛋白所构建的ELISA检测试剂大量应用于猪群初筛和检查，GP5蛋白作为诊断抗原进行抗体补充性检测。2004年，方莹等首次将胶体金技术运用到PRRSV检测中8 1文献综述去[79]。王忠等建立的乳胶凝集试验技术是将M蛋白纯化后制成乳胶抗原来检测血清中抗PRRSVM蛋白抗体的方法[80]。1.5.2.3病原学法首先将疑似病原样本接种到易感细胞上进行培养，利用显微镜观察细胞是否发生病变，或者根据抗PRRSV阳性血清是否能中和该病毒，以此来判定PRRSV的存在。由于制备PAM的方法较为困难，步骤繁琐，所以难以推广普及[81]。1.6抗原表位研究进展抗原表位是指抗原独有的化学基团，能确定其抗原特异性。抗原表位能激活淋巴细胞的增殖和分化，并诱导免疫应答反应。抗原的特异性是由表位的特性、数量以及结构来决定的。在免疫应答的过程中，B细胞表位是指能被B细胞抗原受体(Bcellreceptor,BCR)识别的表位，T细胞表位是指能被T细胞抗原受体(Tcellreceptor,TCR)识别的表位。1.6.1PRRSV结构蛋白T细胞表位研究现状筛选能诱导细胞免疫反应的T细胞表位，对于研究该抗原的细胞免疫过程并开发表位疫苗和亚单位疫苗是十分有利的。目前常用重叠多肽法和生物信息预测法来筛选T细胞表位。重叠多肽法是按照抗原的氨基酸序列设计多肽段，然后进行多肽的合成。生物信息学预测是根据T细胞表面受体特征，参照已有的表位类型来预测新的T细胞表位，将预测得到的肽段进行合成，经过T细胞功能性试验来最终确定抗原表位。而生物信息学预测可能存在表位遗漏[83]。早期常用的T细胞功能性测定的方法是淋巴细胞增殖法，现在常用方法是IFN-γELISPOT测定法。ELISPOT是用包被的抗体捕获细胞刺激后分泌的细胞因子，并最终以酶联斑点显色的形式将其呈现出来。用ELISPOT法的优点很多：一是灵敏度高；二是单一活细胞的功能性测定；三是操作快捷轻松，可以进行高通量筛选。IFN-γELISPOT法筛选T细胞表位的原理是：经病毒或者蛋白免疫动物后其外周血单个核细胞产生记忆性T细胞，此时再经病毒抗原或者相应的T细胞抗原表位肽刺激，就会分泌IFN-γ。9 1文献综述目前，筛选到GP5蛋白的T细胞表位为117~131aa，149~163aa[84]；M蛋白的T细胞表位氨基酸位置为9~23aa，33~47aa，57~71aa，93~107aa[85,86]。筛选到N蛋白的T细胞表位是50~58aa，64~72aa，105~113aa，113~121aa；GP4蛋白的T细胞表位氨基酸序列为7~15aa，175~183aa[82]。1.6.2PRRSV结构蛋白B细胞表位研究现状B细胞表位是指抗原直接或经抗原呈递细胞处理后与BCR结合，刺激B细胞分化成效应细胞并释放抗体，引起体液免疫应答，识别的靶点主要集中于抗原分子的表面，在蛋白一级结构上呈现连续或三维结构上相近的氨基酸残基构成的表位分别是线性表位或构象表位。预测法是近年来才建立起来的一种比较先进的研究表位的方法[87][88]。化学或生物学方法是利用化学方法或酶来切割抗原，获得多个肽段，然后再使用单抗筛选能与其反应的肽段，从而确定蛋白的抗原表位[89]。肽探针扫描技术是应用多肽合成技术合成连续重叠的5~7肽，然后与相应的抗体进行反应，根据阳性多肽的判定标准，分析试验结果以确定阳性反应多肽段[88]。近年来在抗原表位的研究中发现了模拟表位，研究者通过噬菌体随机肽库筛选获得的表位即为模拟表位。其基本原理是生物淘洗[90]。PRRSVGP5蛋白拥有B细胞表位6个[52]，表位的关键区段在33~47aa，117~131aa，149~163aa之间[91]，不仅能与有中和作用的单抗相互识别，还能与猪源抗PPRSV的多抗血清反应。GP5蛋白N末端27~31aa具有与人免疫缺陷病毒Ⅰ型相似的诱导表位，能有效影响机体的免疫应答反应，使得具有中和活性的抗体出现时间滞后[91]。鉴定GP3蛋白的58~72aa、73~87aa、88~101aa、102~115aa、50~65aa、66~81aa、80~95aa和94~109aa等多肽段能被识别[92]；GP3蛋白含有1个高度保守的B细胞表位87~94aa[93][94]，非保守表位区域为59~71aa[95]。基因Ⅰ型PRRSVM蛋白的表位区域是138~159aa[96][95]。1.7研究目的及意义GP2蛋白作为PRRSV重要的次要结构蛋白，大量研究表明了GP2蛋白对形成具有感染能力的病毒粒子是非常关键的，对于介导PRRSV感染宿主细胞必不可少，同时在调控宿主免疫方面也发挥重要作用。本研究通过合成GP2蛋白的10 1文献综述重叠多肽，采用间接ELISA和IFN-γELISPOT的方法对GP2蛋白的B细胞表位和T细胞表位进行了初步筛选，为新型表位疫苗的研究提供帮助。11 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达2.1试验材料2.1.1病毒株、载体、菌株和细胞PRRSVJXA1-R毒株由本实验室保存；pMD19-T克隆载体、pET-32a表达载体、DH5α感受态细胞和Rosetta(DE3)感受态细胞购自TakaRa公司；MARC-145细胞和猪源抗PRRSV的阳性血清由河南省动物免疫重点实验室馈赠。2.1.2试验试剂及试剂盒表2.1主要试验试剂与试剂盒试剂名称生产厂家AmpicillinSolarbioFetalBovineSerumGibcoDulbecco'sModifiedEagleMediumGibco胰蛋白酶Solarbio台盼蓝SolarbioRNAisoPlusTakaRa无酶水SolarbioRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKitThermofisherPremixTaq™(ExTaq™Version2.0)TakaRaT4DNALigaseTakaRaXhoⅠTaKaRaNcolⅠTaKaRa核酸MarkerTIANGEN蛋白MarkerThermofisherChloromycetinSolarbioIPTGSolarbioTIANprepMiniPlasmidKitTIANGENUniversalDNAPurifcationKitTIANGENAEC酶底物试剂盒北京中杉金桥琼脂糖VETECGoatanti-SwineIgG/HRPAbbkine12 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达2.1.3主要试验仪器与耗材表2.2主要试验仪器与耗材名称生产厂家TP-214分析天平Denver高压灭菌锅SanyopH计MettlerToledo恒温培养振荡器上海智城Mini-PROTEANTetraSystem电泳仪Bio-Rad高速冷冻离心机EppendorfGelDocTMXR+凝胶成像系统Bio-RadNanoDrop2000c分光光度计Thermofisher单道可调量程移液器Eppendorf电动移液辅助器EppendorfCMAGHS4加热磁力搅拌器IKA超低温冰箱Thermofisher液氮存储罐Thermofisher二氧化碳细胞培养箱Thermofisher超净工作台苏州安泰荧光倒置显微镜Olympus水平离心机Sigma纯水仪Thermofisher干烤箱上海一恒恒温培养箱上海一恒细胞培养板/培养瓶CorningCoster不同规格无菌滤头CorningCoster无RNase离心管Axygen透析袋Solarbio2.1.4试剂配制方法（1）基础培养基DMEM/完全培养基DMEM/10：按照说明书，取1袋DMEM粉末溶于水中，添加2.7gNaHCO3混匀，用1mol/LHCl调节pH到7.2，终体积为1,000mL，0.22µm无菌滤头过滤，4℃储存。基础培养基DMEM中添加胎牛血清（工作浓度为10%(v/v)）即为完全培养基DMEM。（2）病毒培养液：基础培养基DMEM加入2%(v/v)胎牛血清。（3）液体LB培养基：胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，氯化钠5g，用水13 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达溶解，最终容积为500mL，湿热灭菌后，室温储存备用。上述培养基配方内添加1.5%琼脂粉(Agar)，制备固体LB培养基，湿热灭菌后，4℃条件下储存。（4）氨苄青霉素(ampicillin,Amp+)溶液：氨苄西林粉末0.5g，溶于水中，终体积为10mL，0.22μm滤头用来过滤去除细菌，并分装存储于-20℃备用，贮存浓度为50mg/mL，工作浓度为100μg/mL。（5）氯霉素溶液(Chloromycetin,C+)：氯霉素粉末0.34g，无水酒精混匀溶解，终体积为10mL，0.22µm滤头用来过滤去除细菌，-20℃储存，贮存浓度为34mg/mL。（6）磷酸盐缓冲(PBS)溶液：称取氯化钾(KCl)0.1g，氯化钠(NaCl)4g，十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)1.79g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.135g，用去离子水溶解后，用1mol/LHCl调节pH至7.4，并定容至500mL。（7）IPTG溶液：IPTG粉末4.8g，溶于水中，终体积为20mL，0.22μm滤头用来去除细菌，存储于-20℃备用。（8）PBST缓冲溶液：在PBS缓冲溶液中滴加工作浓度为0.05%(v/v)吐温(Tween-20)，混匀后室温储存。（9）台盼蓝染液：称取台盼蓝0.4g，加入100mLPBS缓冲溶液，充分溶解并混合均匀，室温条件下储存备用。（10）50×TAE(pH8.5)：取三羟甲基氨基甲烷(Tris)121g，Na2EDTA▪H2O18.6g，溶解到400mL纯水中，并使用醋酸调pH，最终体积为500mL。（11）1%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖加入100mL1×TAE，加热沸腾至澄清透明，再加入8μLGelRed，混合均匀后倒入模板中冷却。（12）30%(w/v)丙烯酰胺(Acrylamide,Acr)溶液：丙烯酰胺145g，N,N′-亚甲基双丙烯酰胺5g，加水溶解，终体积为500mL，用0.45μm滤头去除杂质，4℃避光储存。（13）1.5mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.8)：称取Tris36.34g，溶于水中，pH值为8.8，终体积为200mL，用0.45μm滤头去除杂质，室温储存。（14）1mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH6.8)：Tris12.11g，溶于水中，pH值为6.8，终体积为100mL，用0.45μm滤头去除杂质，室温储存。（15）10%(w/v)过硫酸铵(Ammoniumpersulphate,AP)溶液：称取过硫酸铵1g，溶于水中，终体积为10mL，用0.45μm滤头去除杂质，并分成小管每管200μL，-20℃储存。14 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达（16）10%(w/v)十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate,SDS）溶液：SDS10g，溶于水中并加热，pH值为7.2，终体积为100mL，用0.45μm滤头去除杂质，常温储存。（17）5×蛋白凝胶电泳缓冲液：Tris7.55g，甘氨酸47g，SDS2.5g，加水溶解，最终容积为500mL，常温储存。（18）染色液：考马斯亮蓝R-2500.5g，异丙醇125mL，冰醋酸50mL，溶于水中，最终容积为500mL，通过滤纸去除颗粒物质，常温储存。（19）5×蛋白样品缓冲液：SDS0.5g，溴酚蓝25mg，去离子水溶解，1mol/LTris-HCl(pH6.8)1.25mL，丙三醇2.5mL，终体积为5mL，每管装500μL并储存于4℃，使用前每管加入25μLβ-巯基乙醇。（20）12%分离胶体系5mL10mL去离子水1.6mL3.3mL30%Acr2.0mL4.0mL1.5MTris-HCl(pH8.8)1.3mL2.5mL10%SDS50μL100μL10%AP50μL100μLTEMED2μL4μL（21）5%浓缩胶体系2mL5mL去离子水1.4mL3.4mL30%Acr330μL830μL1.5MTris-HCl(pH6.8)250μL630μL10%SDS20μL50μL10%AP20μL50μLTEMED2μL4μL（22）脱色液：冰醋酸50mL，无水乙醇25mL，溶于水中，最终容积为500mL，常温储存。（23）转膜缓冲溶液：Glycine1.45g，Tris2.9g，SDS0.185g，溶于300mL水中，加入100mL甲醇，终体积为500mL。（24）裂解缓冲液：氯化钠1.76g，Tris0.242g，EDTA0.584g，加水溶解，加入20mL甘油，调节pH8.0，终体积为200mL。使用时加入工作浓度为1mmol/L的PMSF。15 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达（25）洗涤缓冲液：氯化钠0.58g，Tris0.6g，乙二胺四乙酸二钠0.372g，加水溶解，终体积为100mL，调节pH至8.0。（26）2mol/L尿素变性液：称取NaCl5.8g，Tris0.6g，乙二胺四乙酸二钠0.372g，尿素24g，去离子水溶解，终体积为200mL，pH值为8.0。（27）8mol/L尿素变性液：称取NaCl5.8g，Tris0.6g，乙二胺四乙酸二钠0.372g，尿素96g，去离子水溶解，终体积为200mL，pH值为8.0。（28）复性稀释液：溶液中各试剂浓度分别为Tris0.02mol/L，乙二胺四乙酸二钠0.002mol/L，尿素8mmol/L，还原型谷胱甘肽(GSH)1mmol/L，氧化型谷胱甘肽(GSSG)0.1mmol/L，pH值为8.0。（29）20mmol/LTris-HCl缓冲溶液：称取Tris2.42g，溶于水中，pH值为8.0，最终容积为1L。2.2试验方法2.2.1PRRSVJXA1-R毒株扩繁将液氮中冻存的MARC-145细胞取出，并在37℃条件下快速解冻，待细胞充分解冻后，转移到无菌的玻璃离心瓶中，添加10mLDMEM完全培养基。1,000rpm离心10min，弃上清，打散细胞团。添加10mLDMEM完全培养基到玻璃离心瓶中，与MARC-145细胞混合均匀后转移到细胞培养瓶中，放于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养。待MARC-145细胞密度达到90%时，弃去细胞培养基，加入10mL用病毒培养液稀释10倍的PRRSVJXA1-R毒株，继续置于37℃、5%CO2培养箱进行培养，每间隔12h观察一次细胞的病变情况。接毒72h后，病变细胞数达到70%以上，此时将病变细胞放于-80℃冰箱中，待完全凝固后取出融化，反复3次，使细胞充分破碎。然后将病毒液转移到离心瓶中进行离心，4℃条件下，5,000rpm离心10min，弃去细胞碎片，上清液即为病毒液。将病毒液进行分装并放入-80℃冰箱保存。2.2.2病毒感染力测定2.2.2.1细胞准备选取生长状态良好的MARC-145细胞，用胰蛋白酶将贴壁细胞从细胞培养16 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达瓶底部消化下来，用DMEM完全培养基终止消化反应，吹打细胞使其均匀分散并进行细胞计数。用DMEM完全培养基调整细胞浓度为1×105/mL，然后加到96孔细胞培养板中，每孔100μL，即每孔含有约104个细胞。放于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养过夜(12~16h)，待细胞铺满细胞培养板底部时，用于测定病毒滴度。试验中细胞计数的具体步骤是：（1）将血球计数板与盖玻片用擦镜纸擦拭干净，然后将盖玻片覆于计数板中。（2）吸取50μL均匀分散的细胞悬液（可根据细胞密度进行适当稀释）加入到1.5mL离心管中，再加入50μL台盼蓝染液与细胞悬液充分混合均匀。吸取少量细胞染液加入到盖玻片边缘位置，使细胞悬液充满血球计数板与盖玻片之间的空隙。（3）静置1min，将计数板放于显微镜下进行细胞观察，由于细胞膜的选择透过性，活细胞呈圆形透亮，死细胞被染成蓝色。计录四个大方格内的细胞数量（当细胞处于分割线，只计上线和左线上的细胞），除以4，再乘以稀释倍数（细胞悬液与台盼蓝染液按1:1混合，应乘以2），最后再乘以104，即为每毫升细胞悬液中的细胞数量。2.2.2.2接种病毒（1）将扩繁后收集冻存的病毒液取出后自然解冻，用DMEM培养基将病毒液进行10倍倍比稀释，最大稀释度为10-10。（2）将准备好的铺有MARC-145细胞的培养板取出，弃去细胞培养基，并用DMEM培养基洗涤细胞1次，充分去除残留胎牛血清。（3）将倍比稀释后的病毒液接种到细胞板中，每孔100μL，不同稀释度设立8个平行对照孔，并设立阴性对照。将接毒后的细胞继续放入细胞培养箱中培养，孵育1h。（4）取出细胞培养板，弃去病毒液，加入病毒培养液，每孔200μL，继续培养，每天观察细胞病变情况，并记录出现细胞病变效应（Cytopathiceffect，CPE）的细胞孔数。17 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达2.2.3ORF2目的基因获取2.2.3.1JXA1-R疫苗毒株总RNA提取按照RNAisoPlus试剂盒操作说明完成下列步骤，保证所用试剂和耗材无RNase：（1）将PRRSVJXA1-R病毒感染的贴壁细胞用PBS缓冲液洗涤1次。按照每10cm2添加1mLRNAisoPlus的比例均匀滴加，充分破碎细胞直至溶液清澈透亮，将破碎后细胞液转移到无RNase离心管中。（2）滴加200μLCHCl4，剧烈震荡混合均匀，4℃、12,000rpm离心15min。轻轻拿出离心管，吸取无色透明的上清液（含RNA）至新的离心管中。（3）滴加1mL的异丙醇，混合均匀，静置10min，4℃、12,000rpm离心10min，轻轻弃掉上清液。（4）滴加1mL75%乙醇，轻轻转动离心管，清洗离心管壁，4℃、12,000rpm离心5min，轻轻弃掉上清液。（5）揭开离心管盖，室温干燥几分钟。乙醇完全挥发后，加入20μL无酶水溶解，-20℃储存。2.2.3.2RT-PCR获取cDNA依照RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒操作说明将病毒总RNA进行反转录，反应体系和过程如下：表2.3反应液A成分表样品体积totalRNA4.0μLOligo(dT)18primer1.0μL无酶水7.0μL表2.4反应液B成分表样品体积5×ReactionBuffer4μLRiboLockRNaseInhibitor1μL10mMdNTPMix2μLReverAidM-MuLVRT1μL把反应液A（表2.3）加入到无RNA酶管中，离心混匀，65℃反应5min；18 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达再将反应液B（表2.4）加入到上述管中，离心混匀，42℃条件下反应1h，70℃终止反应，即获得PRRSVJXA1-R病毒株cDNA，-20℃储存。2.2.3.3ORF2引物设计与合成根据GenBank数据库中发表的PRRSVJXA1-P80(GenBank:FJ548853.1)ORF2的基因序列，设计1对针对ORF2序列全长的特异性引物，上游引物为ORF2-F:5’-GCCCTGTCATTGAACCAACTTTA-3’，下游引物为ORF2-R:5’-CAAGTGGCCTTCGCTGGAGA-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。2.2.3.4PCR扩增ORF2目的基因根据PremixTaqTM操作说明进行常规PCR扩增ORF2目的基因，反应体系如表2.5：表2.5PCR反应体系成分样品50μLcDNA2.0μLORF2-F1.5μLORF2-R1.5μLExTaq酶25μL去离子水20μL设置PCR反应参数如表2.6：表2.6PCR反应条件步骤温度时间194℃30s256℃30s372℃1min430次循环572℃7min64℃保存2.2.3.5目的基因片段回收切下目的基因条带凝胶，按照UniversalDNAPurifcationKit试剂盒操作说明对DNA片段进行回收，步骤如下：19 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达（1）柱平衡步骤：添加500μL平衡液BL到吸附柱中，12,000rpm离心1min，将过滤后废液弃掉。（2）离心管中加与凝胶相同体积的PC溶液，50℃加热10min，轻轻地翻转离心管，使其充分溶解。（3）融化后凝胶滴加到上述吸附柱中，12,000rpm离心1min，弃去废液。（4）加入600μL漂洗液PW到吸附柱中，静置2~5min，12,000rpm离心1min，弃去废液。（5）重复操作步骤4。（6）12,000rpm离心2min，充分去除漂洗液。室温条件下风干吸附柱，彻底挥发乙醇。（7）将30μL65℃预热后的去离子水滴加到吸附柱中间的膜上，静置2min，充分溶解DNA。12,000rpm离心2min，收集DNA溶液。2.2.4克隆载体构建并回收测序2.2.4.1目的基因与载体连接并转化回收的ORF2目的基因与pMD19-T克隆载体连接，参照TaKaRaT-VectorpMD19操作说明完成连接，连接体系如表2.7：表2.7连接体系成分样品10μLORF2基因片段1μLpMD19-T载体1μLT4DNALigase1μL去离子水7μL将上述混合物16℃连接30min，将10μL连接后产物与50μLDH5α细胞轻柔混合，然后在冰水中静置30min。42℃反应45s，立即低温终止。添加LB液体培养基到细胞中，37℃、220rpm培养1h。取100μL转化产物涂布到含有Amp+的LB固体培养基平板上，37℃培养10h。2.2.4.2阳性克隆菌筛选挑取转化后涂板长出的单菌落，然后将其接种到含有Amp+的LB液体培养基中37℃、220rpm培养10h，然后按照PremixTaq™操作说明进行菌液PCR20 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达鉴定，反应体系如表2.8：表2.8菌液PCR反应体系成分样品体积菌液2.0μLORF2-F1.5μLORF2-R1.5μLPremixTaq25μL去离子水20μL菌液PCR反应条件同2.2.3.4。2.2.4.3克隆载体回收并测序依照TIANprepMiniPlasmidKit的使用说明进行如下操作：（1）将500μL平衡液BL滴加到吸附柱中，12,000rpm离心1min，弃掉收集管中废液。（2）将4mL扩大培养的阳性单克隆菌液进行离心，收集菌体沉淀。（3）向菌体中滴加250μL溶液P1（含有RNaseA），剧烈振荡使菌体充分破碎。（4）再加入250μL溶液P2，缓慢地颠倒8次使菌体充分破碎，不超过5min。（5）加入350μL溶液P3，快速地轻轻上下颠倒8次，使其混合均匀，此刻将出现白色絮状物。12,000rpm离心10min。（6）将离心管中的上清液缓缓转移到吸附柱CP3中，切记不要有沉淀。12,000rpm离心60s，将管中过滤后溶液弃除。（7）600μL漂洗液PW添加到吸附柱中，12,000rpm离心60s，将洗涤溶液弃掉。（8）重复操作步骤7。（9）再次12,000rpm离心2min，彻底去除漂洗液。静置5min，使漂洗液完全挥发。（10）吸附柱CP3放置到新的离心管中，缓慢滴加50μL去离子水到吸附膜中央，静置2min，12,000rpm离心2min，最终收集的溶液即为克隆载体溶液。然后将回收的载体送至测序公司进行碱基测序。21 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达2.2.5GP2蛋白原核表达载体构建2.2.5.1引物设计根据PRRSVJXA1-R毒株ORF2的测序结果，设计1对针对GP2蛋白胞外区基因序列的特异性引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。上游引物GP2-F：5’-CCATGGGCTTACAATTGCCGGTTGGCT-3’；下游引物GP2-R：5’-CTCGAGCATTGCTGAAAATCATTAAGCTTTG-3’。其中倾斜加粗的碱基为保护碱基，下划线标记的碱基为所用的限制酶序列。2.2.5.2扩增GP2胞外区目的基因以pMD19-T-ORF2为模板，通过PCR方法扩增GP2蛋白胞外区目的基因，方法同2.2.3.4。2.2.5.3重组表达载体鉴定将回收的GP2胞外区目的基因与pET-32a载体用限制性内切酶分别进行酶切反应。酶切体系如表2.9所示，37℃条件下反应4h。将酶切后的基因与载体分别进行回收并连接，连接后的GP2蛋白表达载体转化到Rosetta(DE3)表达菌中，构建GP2蛋白表达菌株pET-32a-GP2-Rosetta(DE3)，方法同2.2.4.1。通过菌液PCR的方法鉴定筛选阳性表达菌株，方法同2.2.4.2。表2.9双酶切反应体系样品体积XhoⅠ1.5μLNcoⅠ1.5μL10×Kbuffer6μL目的基因或质粒载体6μg去离子水定容至60μL22 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达2.2.6GP2蛋白的表达纯化与鉴定2.2.6.1GP2蛋白的诱导表达将筛选到的GP2重组蛋白阳性表达菌株pET-32a-GP2-Rosetta(DE3)接种到5mLLB液体培养基（含有Amp+和C+）中，37℃、220rpm培养10h。将培养后的菌液1:100接种于100mLLB液体培养基（含有Amp+和C+）中，37℃、220rpm培养大概2h，待OD600值置于0.6~0.8之间时，按1:1,000加入配好的IPTG溶液，37℃、220rpm震荡培养8h，4℃、5,000rpm离心收集菌体。采用SDS-PAGE凝胶电泳分析的方法鉴定GP2蛋白的表达情况，具体步骤如下：（1）取100μL菌液12,000rpm离心5min收集菌体，弃上清。（2）滴加20μLPBS使沉淀混合均匀，并添加5μL预热的5×SDS-PAGE样品缓冲溶液，沸水浴10min。（3）将样品12,000rpm离心5min，收集上清进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，电泳电压先90V、30min，然后120V约1.5h。（4）关闭电泳仪，将凝胶取出并染色2h。使用脱色液脱色，每隔4h换一次，直至在凝胶成像系统上能清楚的观察到条带为止。2.2.6.2GP2蛋白的纯化（1）包涵体的洗涤与变性20mL裂解缓冲溶液重新悬浮收集的菌体，并充分破碎菌体，4℃、12,000rpm离心20min，保留沉淀；20mL洗涤缓冲液洗涤沉淀并混匀，再次离心15min，保留沉淀；加入20mL2mol/L尿素变性液使沉淀混合均匀，再离心15min，保留沉淀；滴加10mL8mol/L尿素变性液使沉淀重悬起来，冰水中静置30min，再次离心15min，保留上清，即为蛋白变性液。（2）包涵体的复性将蛋白变性液缓慢滴加到4℃预冷的蛋白复性稀释液中，不断搅拌混匀，使尿素的终浓度低于1mol/L，且蛋白浓度低于100μg/mL，4℃，放置24h。用10kDa超滤离心管对复性蛋白液浓缩后透析，透析液(20mmol/LTris-HCl,pH8.0)应及时更换。收集透析好的蛋白，使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，使用SDS-PAGE凝胶电泳分析蛋白纯度。23 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达2.2.6.3GP2蛋白浓度测定采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定纯化后GP2蛋白浓度，具体步骤如下：（1）充分溶解牛血清白蛋白标准品，将标准蛋白的工作浓度稀释至0.2mg/mL；（2）将标准品按0μL，2μL，4μL，6μL，8μL，12μL，16μL，20μL分别加入到96孔板中，用PBS稀释液补足到20μL；（3）蛋白样品按适当倍数进行等比稀释，20μL/孔加到96孔酶标板中；（4）每孔滴加200μL1×G250染色液，常温静置5min，测定570nm条件下OD值；（5）绘制标准曲线图，并依照标准曲线回归方程计算蛋白样品的浓度。2.2.6.4GP2蛋白的反应原性鉴定纯化后的GP2重组蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳层析后，采用WesternBlot方法分析其反应原性，详细步骤如下：（1）将凝胶与厚滤纸完全浸入转膜缓冲液中10min。（2）取PVDF膜，标记正面，先在甲醇中处理30s，然后浸入转膜缓冲液中5min。（3）然后在半干的转膜仪上，按照滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸的顺序依次平铺上去，并用玻璃棒擀出气泡。打开电源开关，调整电压为15V，约1h后转膜结束。（4）取出PVDF膜，浸入封闭液中，室温条件下，轻轻晃动封闭1h。（5）弃去封闭液，PBST洗涤膜3次，将PVDF膜放入1:100稀释的猪源抗PRRSV的多抗血清中，常温条件下，轻轻晃动孵育1h。（6）PBST洗涤膜4次，将PVDF膜放入1:1,000稀释的酶标抗体(Goatanti-SwineIgG/HRP)中，室温孵育1h。（7）PBST洗5次，最后一次使用去离子水冲洗，然后按照AEC底物显色试剂的使用说明，进行显色，并记录显色结果。24 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达2.3试验结果2.3.1病毒感染力测定病毒扩增后收集的PRRSVJXA1-R毒株经倍比稀释后接种细胞，并统计出现CPE的细胞孔数，如表2.10所示。本试验中阴性对照组中的细胞无任何病变且生长状态良好（图2.1），最小稀释度(10-1)的病毒接种细胞后，细胞孔均出现明显细胞病变（图2.2），病变率达到100%，最大稀释度(10-10)的病毒接种细胞后，细胞孔均没有出现细胞病变，所以本次病毒感染力测定试验数据有效。按照Reed-Muench两氏法计算PRRSVJXA1-R毒株的TCID50。经计算可得该毒株6.6TCID的病毒滴度为1050/mL。表2.10细胞CPE效应情况病毒稀出现CPE累计出现CPE孔的百无CPE孔数释度孔数CPE孔数无CPE孔数分比(%)10-18041010010-28033010010-38025010010-48017010010-571919010-6262722.210-708015010-808023010-908031010-10080390图2.1未发生病变的MARC-145细胞图2.2发生病变的MARC-145细胞25 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达2.3.2ORF2目的基因获取将提取到的PRRSVJXA1-R毒株总RNA反转录为cDNA，PCR扩增ORF2目的基因，经琼脂糖凝胶电泳鉴定（图2.3），得到一条约为770bp的明亮条带，与ORF2基因大小相一致，表明ORF2目的基因成功扩增。图2.3扩增ORF2目的基因M：Maker(DL15000)；a：ORF2目的基因；b：阴性对照2.3.3ORF2克隆载体鉴定并测序将目的基因与克隆载体pMD19-T连接，构建pMD19-T-ORF2克隆载体，并转化到DH5α克隆菌中。经菌液PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定（图2.4），结果显示挑取的5个单克隆菌株均能扩增出与ORF2基因大小相一致的单一目的条带，表明pMD19-T-ORF2重组克隆载体构建成功。经载体测序，得到ORF2目的基因碱基序列结果（图2.5）。并通过使用DNASTARMegAlign软件(DNASTARInc.,Madison,WI,USA)推导出对应的GP2蛋白氨基酸序列（图2.6）。图2.4重组克隆菌PCR鉴定结果26 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达图2.5ORF2测序结果图2.6GP2蛋白氨基酸序列红色区域为信号肽；绿色区域为胞外域氨基酸；黄色区域为跨膜氨基酸；蓝色区域为胞内氨基酸2.3.4GP2蛋白表达载体构建以pMD19-T-ORF2克隆载体为模板，PCR扩增GP2蛋白胞外区基因序列，经琼脂糖凝胶电泳鉴定（图2.7），基因条带大小约为518bp，与预期结果相一致，表明GP2蛋白胞外区的基因序列扩增成功。挑取单克隆菌株，经菌液PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定（图2.8），结果显示挑取的3个单克隆菌株均能扩增出与目的基因大小相一致的单一条带，表明GP2蛋白重组表达载体pET-32a-GP2构建成功。图2.7扩增GP2蛋白胞外区基因序列M：Maker(DL2000)；a：GP2胞外区基因；b：阴性对照27 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达图2.8菌液PCR鉴定GP2重组表达载体2.3.5GP2蛋白的表达纯化及WesternBlot鉴定GP2蛋白表达菌pET-32a-GP2-Rosetta(DE3)经IPTG诱导表达8h，收集菌体进行超声破碎，经鉴定GP2蛋白主要以包涵体的形式存在于菌体破碎后的沉淀中，蛋白分子量约为36kDa。对GP2蛋白包涵体进行纯化，最终得到了条带单一的目的蛋白，SDS-PAGE电泳结果如图2.9所示。用猪源抗PRRSV特异性血清做一抗，WesternBlot鉴定纯化复性的GP2蛋白（图2.10），显色条带与目的蛋白分子量相一致，表明复性的GP2蛋白具有较好的反应原性。根据Bradford法蛋白浓度试剂盒绘制标准曲线（图2.11），线性回归方程为：y=0.1258x+0.6218，判定系数2=0.9974。经计算，纯化后GP2蛋白的浓度为：0.354μg/μL。图2.9GP2蛋白的诱导表达及纯化M：marker；a：重组菌诱导前；b：重组菌诱导后；c：菌体超声破碎上清；d：菌体超声破碎沉淀；e：2M尿素变性后沉淀；f：8M尿素变性后上清；g：目的蛋白复性28 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达图2.10GP2重组蛋白WesternBlot鉴定结果M：marker；a：复性后GP2蛋白；b：重组菌诱导前图2.11Bradford法BSA蛋白标准曲线2.4讨论猪繁殖与呼吸综合征病毒能够引起一种高度接触性传染疾病，即猪繁殖与呼吸综合征。该疾病又被称为“猪蓝耳病”和“猪神秘病”，被我国列为二类传染病。临床表现为妊娠母猪的发热、厌食、繁殖障碍，以及育肥猪特别是仔猪的呼吸困难等症状。PRRSV表现出的一个明显生物学特性是对巨噬细胞的亲嗜性，巨噬细胞是首选细胞，占肺部被感染细胞的80%~94%。PRRSV在细胞中复制并杀死靶细胞，引起典型的细胞病理变化(CPE)，表现为在被感染的细胞单层表面形成细胞团，细胞变圆，细胞核固缩、脱落、溶解。但也有极个别毒株在细胞上不出现CPE。PRRSV能在PAM上生长，在传代的CRL1171细胞系、非洲绿猴肾细胞MA-104及其衍生细胞系CL2621和MARC-145细胞上生长，在这些细胞系上均能产生明显的细胞病变(CPE)。LV在PAM生长较好，而在其29 2PRRSVGP2蛋白基因扩增及原核表达它细胞系上培养则病毒滴度很低，而北美洲型株在所有细胞系上生长都较好。本试验选择MARC-145细胞作为PRRSVJXA1-R毒株的培养细胞，感染细胞能出现明显的细胞病变，且病毒的感染力较高，满足后续试验要求研究己经证明GP2蛋白参与病毒粒子囊膜的组装，对形成感染性病毒颗粒是至关重要的。GP2蛋白与受体CD163分子相互识别，参与病毒粒子侵染宿主细胞的过程。基因Ⅱ型PRRSV毒株GP2蛋白由256个氨基酸构成，其中1~40aa为信号肽区域，41~208aa为蛋白胞外域，209~235aa为跨膜域，235~256aa为胞内疏水区[12]。目前，关于PRRSV主要结构蛋白（N蛋白、M蛋白和GP5）和非结构蛋白（NSP1、NSP2、NSP4、NSP7和NSP8）的抗体水平变化趋势的研究已有报道[58,97]，而针对GP2蛋白的抗体水平变化趋势还不是很清楚。为了利于后续试验过程中能直观的评价试验动物的免疫效果，测定不同感染时间段内猪的血清中GP2蛋白抗体水平的变化趋势，本试验构建了GP2蛋白表达载体，并成功表达纯化得到了具有良好反应原性的GP2蛋白。大多数B细胞表位是由抗原分子表面裸露的亲水性氨基酸残基构成。根据B细胞表位的特性和被识别特点，所以本试验在构建GP2蛋白重组表达载体时，重点选择研究的抗原区域是GP2蛋白的胞外域41~208位氨基酸残基。2.5小结（1）PRRSVJXA1-R毒株扩增后，根据Reed-Muench两氏法计算出该毒株的病毒滴度为106.6TCID50/mL。（2）扩增得到了ORF2基因序列全长，并成功构建了pMD19-T-ORF2克隆载体。（3）成功构建GP2蛋白重组表达菌pET-32a-GP2-Rosetta(DE3)。经表达纯化后得到具有良好的反应原性的GP2重组蛋白，分子量约为36kDa，纯化后得到的蛋白浓度为0.354mg/mL。30 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选3.1试验材料3.1.1病毒株和试验动物PRRSVJXA1-R毒株由本实验室保存；8头试验猪从河南省南阳市方城县鸿旺牧业购进。3.1.2试验试剂及试剂盒表3.1主要试验试剂与试剂盒试剂名称生产厂家ChemicallyDefined,Serum-FreeMediumLonzaMonoclonalantibodiestoPorcineInterferon-γMabtechMonoclonalantibodiestoPorcineInterferon-γ(Biotinylated)MabtechStreptavidin-HorseRadishPeroxidaseMabtechELISPOT显色液MabtechConcanavalinASigmaDMSOSigma猪外周血淋巴细胞分离液天津灏洋无血清细胞冻存液北京达科为PRRSV抗体检测试纸河南百奥脱脂奶粉BBIGoatAnti-SwineIgG/HRPAbbkine过氧化脲Aldrich非那西汀国药试剂TMB国药试剂31 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选3.1.3主要试验仪器与耗材表3.2主要试验仪器与耗材名称生产厂家超净工作台苏州安泰磁力搅拌器IKA超低温冰箱ThermofisherTP-214分析天平Denver可调式微量移液器Eppendorf低温冷冻离心机Sigma荧光倒置显微镜Olympus酶标仪Bio-RadFilterPlatesMerckmillipore促凝管山东奥赛特抗凝管江苏康健采血针山东成武赛诺一次性注射器河南曙光汇知康程序降温盒Nalgene3.1.4试剂配制方法（1）碳酸盐缓冲溶液(CBS)：称取碳酸钠（Na2CO3）0.795g，碳酸氢钠(NaHCO3)1.47g，加水溶解，终体积为500mL，调整pH值为9.6。（2）磷酸盐缓冲溶液(PBS)：称取氯化钾(KCl)0.1g，氯化钠(NaCl)4g，十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)1.79g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.135g，用去离子水溶解后，用1mol/LHCl调节pH至7.4，并定容至500mL。（3）PBST缓冲溶液：在PBS缓冲溶液中滴加工作浓度为0.05%(v/v)吐温(Tween-20)，混匀后室温储存。（4）封闭液：脱脂奶粉10g，溶于PBST缓冲溶液，最终容积为100mL，4℃储存。（5）显色液：3号液为供氢体，4号液为显色剂，使用前将3号与4号液等体积混合。3号液：0.5g过氧化脲加入1,000mL0.1mol/L醋酸钠/柠檬酸缓冲液（取0.1mol/L的柠檬酸溶液150mL加入到0.1mol/L醋酸钠溶液850mL中，pH5.0）中溶解，再加入非那西汀溶液（0.08g预先加热溶于15mL水中），4℃条件下32 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选储存。4号液：TMB1.27g，加入500mL甲醇溶解并加热，与500mL丙三醇混合，4℃避光储存。（6）终止液(2mol/LH2SO4)：取21.7mL98%的浓H2SO4缓慢滴加到178.3mL的去离子水中，并不停的用玻璃棒进行搅拌，混合均匀后置于常温保存。3.2试验方法3.2.1试验猪PRRSV抗体检测使用PRRSV抗体检测试纸对8头试验猪采集到的血清样品进行鉴定，根据试纸检测说明书进行如下操作，具体步骤为：（1）对待测不同试验猪的血清样品进行编号，取1μL待测血清样品与200μL稀释液混合均匀；（2）取出抗体检测试纸并对其进行编号，将稀释后的样品溶液加入到相应试纸条样品孔中进行检测，每孔100μL。（3）静置10min，观察显色情况。在质控线处出现红色线，说明试纸有效。若在质控线和检测线处出现2条红色线，说明血清样品中存在PRRSV抗体。若只有质控线处出现1条红色线，说明血清样品中不存在PRRSV抗体。3.2.2试验动物免疫将8头试验猪随机分成两组，试验组5头，对照组3头，并分别将两组试验动物隔离饲养，避免组间的相互感染。两组试验动物均采用耳根后肌肉注射的方法进行免疫，具体免疫原和免疫剂量如表3.3所示。表3.3试验动物免疫方案分组免疫次数免疫原免疫剂量/头免疫时间首免JXA1-R病毒液3×106TCID508周龄试验组二免JXA1-R病毒液3×106TCID5010周龄首免细胞破碎后上清3mL8周龄对照组二免细胞破碎后上清3mL10周龄33 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选3.2.3分离血清样品与外周血单核细胞3.2.3.1血清样品分离使用5mL一次性使用真空促凝采血管（含促凝剂和分离胶），通过前腔静脉采血的方法对8头试验猪分别进行采血，试验动物免疫后每周采血一次。将采血管置于水平离心机中，对血液样品进行离心，3,500rpm离心10min，收集分离胶上层血清，对血清样品分别进行标记后分装，并保存于-80℃冰箱备用。3.2.3.2外周血单核细胞分离使用10mL一次性使用真空抗凝采血管（含EDTA-K2抗凝剂），对免疫12周后的8头试验猪，通过前腔静脉采血的方法对其分别进行采血。采集后的血液样品在采血管中上下颠倒，与抗凝剂充分混合均匀，并将血液样品置于冰中进行低温保存，采血过程中应尽量保证无菌，并避免溶血发生。将采集到的抗凝血按照猪外周血淋巴细胞分离试剂盒的操作说明进行外周血单核细胞分离，具体分离步骤如下：（1）将采集到的抗凝血收集到50mL玻璃离心管中，加入与血液样品等体积的稀释液进行等比稀释，充分混合均匀。（2）取10mL无菌玻璃离心管，先在试管底部加入5mL细胞分离液。再将等体积稀释后的血液样品沿试管壁缓慢加入，使其处于分离液液面上方（避免剧烈晃动），两种溶液间具有明显分层。（3）玻璃试管封口后，将其置于水平离心机中进行离心。25℃条件下，1,000g，离心30min，离心结束后，离心机降速过程应适当缓慢。离心后，离心管中呈现明显的四层溶液。从上至下依次为血浆层、环状乳白色淋巴细胞层、分离液层、红细胞层。（5）用吸管将环状乳白色淋巴细胞层小心吸取到新的50mL无菌离心管中，加入细胞清洗液，最终体积为40mL，与细胞液充分混合均匀（充分稀释分离液）。（6）4℃条件下，250g，水平离心10min。（7）弃去离心后上清，轻轻打散离心管中细胞团，并加入4℃预冷后红细胞裂解液2mL，置于冰中，反应2min，然后再加入细胞清洗液，终体积为40mL，与细胞液充分混合均匀（稀释红细胞裂解液）。（8）4℃条件下，250g，水平离心10min。34 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选（9）弃去离心后上清，轻轻打散离心管中细胞团，加入细胞清洗液，终体积为40mL，与细胞液充分混合均匀。（10）重复试验步骤（8），弃上清，轻轻打散离心管中细胞团，加入3mL无血清细胞培养基充分混合均匀，然后对分离到的淋巴细胞进行细胞计数，方法同。（11）在分离的淋巴细胞悬液中加入等体积的无血清细胞冻存液，分装到细胞冻存管中并标记，每管分装1mL。放入程序降温盒中，置于-80℃冰箱冷冻10h，最后将细胞冻存管放于液氮中长期保存备用。3.2.4GP2蛋白抗体检测使用间接ELISA检测8头试验猪免疫后血清中GP2蛋白抗体水平变化趋势，具体方法如下：（1）使用CBS缓冲溶液将GP2蛋白稀释到2ng/μL，然后加到酶标反应板中，100μL/孔，4℃包被10h；（2）PBST洗板3次，每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h；（3）用封闭液将8头试验猪每周采血分离得到的血清样品按照1:100的比例分别进行稀释；（4）弃去封闭液，将稀释好的血清样品加入到相应的酶标板中，每孔100μL，37℃条件下孵育1h。不同血清样品设立3个平行对照，每组试验设立空白对照；（5）用PBST缓冲液洗涤酶标板5次，将1:5,000稀释的酶标抗体(Goatanti-SwineIgG/HRP)添加到相应的酶标板中，每孔100μL，37℃孵育1h；（6）用PBST缓冲液洗涤板子7次，滴加100μL/孔显色液，常温避光条件下显色5min，每孔加入100μL终止液，450nm条件下测定OD值。3.2.5GP2蛋白重叠多肽设计根据ORF2测序结果推导出GP2蛋白氨基酸序列，按照重叠多肽法设计并合成23条18个氨基酸长度的重叠多肽段，相邻肽段重叠9个氨基酸残基，由上海吉尔生化有限公司合成重叠多肽。GP2结构蛋白N端前40个氨基酸序列为信号肽序列，设计重叠多肽段时将信号肽序列截去。35 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选3.2.6GP2蛋白B细胞表位筛选将最终合成的22条重叠多肽作为包被抗原，以免疫前和免疫后12周内采集并分离的猪源多抗血清作为一抗，采用间接ELISA方法对GP2蛋白重叠多肽进行筛选。同时，包被GP2蛋白用来作为阳性对照。间接ELISA筛选B细胞表位具体操作步骤如下：（1）用50μLDMSO溶解1mg的重叠多肽干粉，每5μL分装后并分别标记，冻存于-80℃冰箱，储存浓度为20μg/μL。（1）用CBS缓冲溶液将溶解后的重叠多肽进行稀释，包被浓度为10ng/μL，GP2蛋白包被浓度为2ng/μL。将包被原加到96孔酶标板中，每孔100μL，并设立3个平行对照，4℃包被10h。（2）弃去包被液，PBST洗板3次，每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h；（3）用封闭液将8头试验猪免疫前和免疫后12周内采集并分离的猪源多抗血清按照1:100的比例分别进行稀释。（4）后续操作步骤同3.2.4。3.2.7B细胞表位保守性分析从美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)GenBank数据库获取国内外不同地区PRRSV毒株的氨基酸序列。通过使用DNASTARMegAlign软件(DNASTARInc.,Madison,WI,USA)对GP2蛋白中与表位区域相对应的氨基酸序列进行比对分析。其中基因Ⅱ型PRRSV毒株包括中国分离到的17株(GenBank:AF331831.1,AY150312.1,EU360129.1,KY761966.1,KJ546412.1,JQ308798.1,JX880029.1,JF748718.1,KY495781.1,KY495780.1,AY457635.1,GQ857656.1,GQ359108.1,KJ609517.1,JN662424.1,EU807840.1,JF748717.1)，美国分离到的4株(GenBank:EF536003.1,AF159149.1,AF325691.1,KF632717.1)，加拿大分离到的1株(GenBank:AF176348.2)，欧洲分离到的1株(GenBank:KM514315.1)。基因Ⅰ型PRRSV毒株包括欧洲分离到的8株(GenBank:M96262.2,KC862570.1,KC862574.1,KF991509.2,AY588319.1,KT159249.1,JF802085.1,KY767026.1)，韩国分离到的2株(GenBank:FJ349261.1,KT033457.1)。36 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选3.2.8GP2蛋白T细胞表位筛选采用IFN-γELISPOT试验方法，以重叠多肽为刺激物，以PRRSVJXA1-R毒株接种12周后分离的猪外周血单核细胞(PeripheralBloodMononuclearCell,PBMC)为效应细胞，对GP2蛋白重叠多肽进行筛选，具体试验步骤如下：（1）无菌条件下，每孔15μL35%乙醇水溶液润湿ELISPOT板底部MSIP膜，最长不超过1min，然后无菌水洗膜5次，每孔200μL。（2）用无菌PBS稀释包被原(pIFNγ-Ⅰ)，工作浓度为10μg/mL，每孔需加入100μL，4℃包板过夜。（3）弃掉包被液，无菌PBS溶液洗板5次，每孔200μL。用无血清细胞培养基封闭，每孔200μL，室温封闭30min。（4）复苏冻存的猪外周血单核细胞，并使细胞数达到5×106/mL。弃封闭液，每孔加入100μLPBMC，再加入10μL肽段或阳性刺激物，刺激物终浓度为10μg/mL，放置到37℃、5%CO2培养箱孵育30h，期间不要移动ELISPOT板子。（5）弃细胞，用PBS洗板5次，每孔200μL。用无血清细胞培养基稀释生物素标记的抗IFN-γ的单克隆抗体，终浓度为0.5μg/mL，每孔100μL，室温2h。（6）用PBS洗板5次，每孔200μL。无血清培养基按1:500稀释Streptavidin-HRP，每孔加入100μL，室温孵育1h。（7）用PBS洗7次，每孔200μL。甩干后加入100μLTMB，37℃避光显色15min，用去离子水终止显色，风干，记斑点数。3.3试验结果3.3.1试验猪PRRSV抗体检测用PRRSV抗体检测试纸对免疫前8头试验猪进行PRRSV抗体检测，结果如图3.1a所示，从图中可以看出10条检测试纸在质控线处均出现红色线，说明检测试纸有效。除阳性对照血清样品的检测试纸在检测线处出现红色线，其余血清样品的检测试纸在检测线处均未出现红色线，说明8头试验猪血清样品中均不含PRRSV抗体，即8头试验猪均未感染PRRSV，满足后续试验要求。用PRRSV抗体检测试纸对免疫后4周8头试验猪进行PRRSV抗体检测，结果如图3.1b所示，从图中可以看出10条检测试纸在质控线处均出现红色线，37 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选说明检测试纸有效。试验组9400号猪、9411号猪、9427号猪、9437号猪和9464号猪的血清样品以及阳性对照血清样品的检测试纸在检测线处出现红色线，对照组9390号猪、9425号猪和9379号猪的血清样品以及阴性血清样品的检测试纸在检测线处均未出现红色线。与免疫前血清样品检测试纸结果相比较，表明用JXA1-R毒株免疫后的试验组5头试验猪机体内均产生获得性免疫应答反应，并产生PRRSV特异性抗体。图3.1血清样品中PRRSV抗体检测a为免疫前试验猪的血清样品检测结果；b为免疫3周后试验猪的血清样品检测结果。3.3.2GP2蛋白抗体水平检测间接ELISA检测免疫前与免疫后血清中GP2蛋白抗体水平变化趋势，结果如图3.2所示，从趋势图中可以看出，试验组5头猪的血清中的GP2蛋白抗体在首次免疫4周后开始出现，首次免疫8、9周后抗体水平逐渐趋于稳定。毒株免疫后，不同试验猪的抗体水平存在差异性，9427号猪与9437号猪的抗体水平最高，测定其血清中GP2蛋白抗体OD450值最大能达到1.5左右，而9400号猪、9411号猪和9464号猪的抗体水平稍弱，测定其血清中GP2蛋白抗体OD450值最大仅在1.0左右。表明试验组5头试验猪免疫成功，并获得针对PRRSVGP2蛋白的特异性免疫应答，对照组试验猪机体内未检测到GP2蛋白抗体。38 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选图3.2GP2蛋白抗体水平测定3.3.3GP2蛋白重叠多肽合成最终成功得到22条重叠多肽（表3.5），其中21号重叠多肽未成功合成，除20号肽外，其余各个多肽纯度均能达到95%以上，满足后续的试验要求。3.3.4GP2蛋白B细胞表位筛选以22条重叠多肽为包被原，试验组免疫12周后采血分离得到的血清为一抗，通过间接ELISA的方法对抗体与多肽间的反应进行测定，从而确定GP2蛋白的B细胞表位，ELISA结果如图3.3所示。从图中可以看出，5号、9号和11号重叠多肽与试验组5头猪的血清样品均有明显的阳性反应；8号重叠多肽与9400号猪和9411号猪的血清样品有较弱的阳性反应；6号重叠多肽与9437号猪的血清样品有较弱的阳性反应；其余重叠多肽与试验组5头猪的血清样品均没有阳性反应。最终筛选出GP2蛋白3个免疫显性的B细胞表位（表3.6），分别是A(77)FLSQCQVDIPTWGVKHP(94)、R(113)RMYRVMEKAGQAAWKQV(130)、V(131)SEATLSRISGLDVVAHF(148)。表3.6GP2蛋白B细胞表位筛选结果阳性肽段编号氨基酸位置氨基酸序列577~94AFLSQCQVDIPTWGVKHP9113~130RRMYRVMEKAGQAAWKQV11131~148VSEATLSRISGLDVVAHF3.3.5B细胞表位保守性分析将筛选到的B细胞表位与其他33株不同的PRRSV的氨基酸序列进行比对（表3.8），从表3.7中可以看出，筛选得到的GP2蛋白3个B细胞表位在北美洲型毒株间的同源性达到92%以上。5号肽段与23株基因Ⅱ型PRRSV毒株相39 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选应氨基酸序列进行比对，其中6株PRRSV毒株没有氨基酸残基替换，同源性为92.3%，与10株基因Ⅰ型PRRSV毒株比对，同源性仅为40.5%。9号肽段与23株基因Ⅱ型PRRSV毒株相应氨基酸序列进行比对，其中2株PRRSV毒株没有氨基酸残基替换，其余毒株存在1~2个氨基酸残基替换，同源性为93.0%，与10株基因Ⅰ型PRRSV毒株比对，同源性为71.2%。11号肽段与23株基因Ⅱ型PRRSV毒株相应氨基酸序列进行比对，其中12株PRRSV毒株没有氨基酸残基替换，其余毒株存在1~2个氨基酸残基替换，同源性为96.9%，与10株基因Ⅰ型PRRSV毒株比对，同源性为66.1%。表3.7GP2蛋白B细胞表位保守性分析阳性肽段编号基因型病毒数量同源性基因Ⅱ型2392.3%5基因Ⅰ型1040.5%基因Ⅱ型2393.0%9基因Ⅰ型1071.2%基因Ⅱ型2396.9%11基因Ⅰ型1066.1%40 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选图3.3GP2蛋白B细胞表位筛选a~e分别为9400号猪、9411号猪、9427号猪、9437号猪和9464号猪与22条重叠多肽的间接ELISA检测结果；PC表示用GP2蛋白作包被原41 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选毒株名称基因库编号基因型5号肽段9号肽段11号肽段JXA1-RⅡ型AFLSQCQVDIPTWGVKHPRRMYRVMEKAGQAAWKQVVSEATLSRISGLDVVAHFBJ-4AF331831.1Ⅱ型··············T········I···S··················S·······HB-1(sh)/2002AY150312.1Ⅱ型·······················I······················S·······rV63EU360129.1Ⅱ型··············T········I···S··················S·······FZ16AKY761966.1Ⅱ型······················································HeNan-A9KJ546412.1Ⅱ型·Y············S········T······························QYYZJQ308798.1Ⅱ型·Y············S········T······························NJ-1106JX880029.1Ⅱ型·······················I······························DCJF748718.1Ⅱ型·······A···············I······························SH/CH/2016KY495781.1Ⅱ型·Y·····G······I········I·D···········T················JX/CH/2016KY495780.1Ⅱ型·Y·····G······I········I·D···········T·········X······HN1AY457635.1Ⅱ型··············T········I···S··················S·······SX-1GQ857656.1Ⅱ型·······················I······························SD-CXA/2008GQ359108.1Ⅱ型·······················I······························MY-376KJ609517.1Ⅱ型·Y············S········T······························PA8AF176348.2Ⅱ型··············T········I······················S·······GM2JN662424.1Ⅱ型·Y····RG···············I·D····························CH-1REU807840.1Ⅱ型··············F········T······························YDJF748717.1Ⅱ型······················································VR2332EF536003.1Ⅱ型··············T········I······················S·······表3.8GP2蛋白B细胞表位序列比对结果42 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选续表3.8GP2蛋白B细胞表位序列比对结果毒株名称基因库编号基因型5号肽段9号肽段11号肽段JXA1-RⅡ型AFLSQCQVDIPTWGVKHPRRMYRVMEKAGQAAWKQVVSEATLSRISGLDVVAHFMLVRespRRS/ReproAF159149.1Ⅱ型··············T········I···S··················S·······NVSL97-7985IA1-4-2AF325691.1Ⅱ型··············T········I······························XW001KF632717.1Ⅱ型·Y····R····S··M········T··N···················S·······PRRSV-2_Hungary_102_KM514315.1Ⅱ型······KA···A··G········T·············T········S·······2012LelystadM96262.2Ⅰ型GL·PN·RP·V·QFA······I·QT··HS········G····TKL····I·T··KNU-07FJ349261.1Ⅰ型GL·PN·KP·V·QFAF·····I·QT··HS········G····TKL·K··I·T··ESP-1991-Olot91KC862570.1Ⅰ型SL·PN·RP·V·QFAF·····I··T··HSS············TKL····I·T··DK-2012-01-05-2KC862574.1Ⅰ型GL·PN·RP·V·QFAL·····I·QTL·HS·······A·G····TKL·R··I·T··DVKF991509.2Ⅰ型GL·PN·RP·V·QFAF·····I·QT··HS·······A·G····TKL·R··I·T··PRRSVLV4.2.1AY588319.1Ⅰ型GL·PN·RP·V·QFAF·····I·QT··HS·········G····TKL····I·T··13V117KT159249.1Ⅰ型GL·PN·RP·V·QFAF·····I·QT··HS··············TKL·N··I·L··E38KT033457.1Ⅰ型GL·PN·RP·V·QFAF·····I·QT··HS·········G····TKL·K··I·T··LenaJF802085.1Ⅰ型GL·PN·RP···QFA······I·QT··HS··············TKL·K··I····PRRS-FR-2014-56-11-1KY767026.1Ⅰ型SL·PN·RP·V·QFAF·····I··T··HS··············TKL····I·T··43 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选3.3.6GP2蛋白T细胞表位筛选3.3.6.1重叠多肽构建肽库将合成的重叠多肽溶解在DMSO中，多肽储存浓度为20mg/mL，分装后-80℃储存备用。按十字交叉法将重叠多肽划分成9个肽库，如表3.9所示。表3.9重叠多肽肽库构建肽库abcdef12345g678910h1112131415i161718192022233.3.6.2T细胞表位肽库初筛以猪外周血单核细胞为效应细胞，构建的9个肽库为刺激物，通过ELISPOT试验方法筛选阳性肽库，记录每孔斑点数（表3.10），斑点数大于等于阳性判定临界值的肽库被认定是阳性肽库，阴性刺激物为DMSO，阳性刺激物为ConA。从表中可以看出与9400号和9437号猪的PBMC有阳性反应的肽库有：a、b、c、d、g、h和i，与9411号猪的PBMC有阳性反应的肽库有：a、b、c、d、e和g，与9427号猪的PBMC有阳性反应的肽库有：a、b、d和g，与9464号猪的PBMC有阳性反应的肽库有：a、b、g、h和i。3.3.6.3T细胞表位单肽筛选根据不同试验猪筛选到的阳性肽库，按十字交叉法确定进一步需要筛选的候选单肽。以单肽为刺激物，再次通过ELISPOT试验方法，分别刺激不同猪的PBMC，记录每孔斑点数（表3.11）。与9400号和9437号猪的PBMC有阳性反应的肽段有：6、7、8、12和17；与9411号和947号猪的PBMC有阳性反应的肽段有：7和9；与9464号猪的PBMC有阳性反应的肽段有：7和17。最终筛选出GP2蛋白6个T细胞表位，分别是86~103aa、95~112aa、104~121aa、113~130aa、140~157aa和185~202aa。44 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选表3.10T细胞表位肽库诱导PBMC分泌IFN-γ的淋巴细胞频数（斑点/106细胞）肽库94009411942794379464a32*17*25*37*15*b105*18*45*89*37*c20*10*327*2d19*30*15*17*2e1410*152f131250g56*37*42*65*12*h45*2338*8*i35*3122*23*NC5(15)2(8)1(6)4(7)1(6)PC201213205193174注：表格内数字为肽库与不同试验猪的PBMC反应后，相应试验组的斑点平均数。阳性肽库判定标准为：斑点数≥阴性刺激物斑点数的平均值+5×标准差。括号内的数字为阳性判定临界值，带*的数字表示大于等于临界值。表3.11T细胞表位单肽诱导PBMC分泌IFN-γ的淋巴细胞频数（斑点/106细胞）单肽94009437单肽9464单肽9411单肽9427620*15*636462734*27*714*716*730*815*12*11383912*924122921*22311451631052341242*30*1717*224NC2(6)1335223233PC1501434234NC3(6)1632NC2(7)PC1941730*24*PC1581822193322332334NC2(7)1(6)PC184160注：表格内数字为单肽与不同试验猪的PBMC反应后，相应试验组的斑点平均数。阳性单肽判定标准为：斑点数≥阴性刺激物斑点数的平均值+5×标准差。括号内的数字为阳性判定临界值，带*的数字表示大于等于临界值。45 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选3.4讨论PRRSV感染动物后，在感染初期就能产生较高的针对PRRSV的抗体水平。本试验利用PRRSV抗体检测试纸对首次免疫3周后动物血清中的PRRSV抗体进行了检测，结果显示试验组5头猪已产生针对PRRSV的特异性免疫应答反应。从GP2蛋白抗体水平测定的试验结果中不难看出，GP2蛋白抗体产生时间是在首次免疫后第4周，且产生的抗体水平较低。免疫后第8、9周，血清中的GP2蛋白抗体水平才达到顶峰并趋于平稳。说明GP2蛋白抗体产生的时间相对于其他一些蛋白较为滞后，与先前的一些研究报道相吻合，而且试验动物不同，接种病毒后的免疫效果也存在相应的差异。信号肽的主要功能是帮助蛋白的跨膜定位。因此本试验在设计重叠多肽筛选抗原表位时，有意将GP2蛋白的信号肽区域截取，只对41~256aa进行多肽设计与合成。多肽的分子结构复杂，每条重叠多肽的氨基酸序列都有其独特的物理化学特性，所以多肽合成具有较大难度，而且纯化困难。因此对于多肽设计应控制多肽序列长度，将氨基酸残基数控制在20以下能得到较好的结果。CD8+T细胞表位与MHC-Ⅰ结合的短肽长度一般为8~11个氨基酸残基不等，而B细胞表位的大小一般为5~15个氨基酸残基。为避免表位筛选遗漏，本试验在设计重叠多肽时，将重叠多肽的残基数设计为18个氨基酸残基，相邻肽段重叠9个氨基酸残基。最终设计出23条重叠多肽段，用于筛选GP2蛋白的B细胞表位和T细胞表位。其中第21号重叠多肽段V(221)AASCTLFVVLWLRIPML(238)未成功合成，该肽段位于跨膜区，18个氨基酸中有14个疏水性氨基酸，肽段疏水性较高，肽段合成难度较大。第20号重叠多肽A(212)VHSSIFSSVAASCTLFV(229)同样位于跨膜区，虽然成功被合成，但该多肽的纯度相对于其他多肽较低。对PRRSVB细胞表位的筛选一直是各国学者的研究重点，筛选能诱导具有中和活性抗体产生的B细胞中和表位更是研究的焦点。目前关于PRRSVGP2蛋白B细胞表位筛选的研究已有报道，Marcelo等[96]使用肽扫描技术鉴定的北美洲型的GP2B细胞表位为41~55aa、121~135aa。Oleksiewicz等[98]通过噬菌体展示技术筛选出欧洲型GP2蛋白的B细胞表位分别是36~51aa、117~139aa、120~142aa，本试验通过合成重叠多肽的方法筛选到的PRRSVJXA1-R毒株GP2蛋白的B细胞表位分别是77~94aa、113~130aa、131~148aa。虽然所采用的B46 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选细胞表位筛选的方法不同，但经过序列比对发现，本试验筛选到的B细胞表位区域与上述两篇文章所报道的B细胞表位区域存在相互重叠区域，且筛选到的3个B细胞表位在基因Ⅱ型毒株间的同源性达到92%以上。关于PRRSV结构蛋白T细胞表位筛选已有报道且研究较多的是GP5、M、N、GP4，而对GP2次要结构蛋白T细胞表位筛选的研究比较少。Chung等[99]使用重叠多肽和ELISPOT的方法筛选出北美洲型GP2蛋白的T细胞表位分别是91~110aa、163~182aa。与本试验筛选GP2蛋白的T细胞表位95~112aa存在相互重叠区域，且该T细胞表位均能成功刺激试验组5头猪的外周血单核细胞分泌IFN-γ。本试验中不同试验猪所筛选出的GP2蛋白T细胞表位不尽相同，推测可能与猪的SLA单倍型不同有关。Helen等[100]发现SLA单倍型不同的猪T淋巴细胞响应的重叠肽段不同，推测是不同单倍型的SLA所呈递的T细胞表位不同。但也发现个别细胞表位能被SLA单倍型不同的猪T淋巴细胞响应，对SLA基因簇类型进行聚合酶链式反应-单链构象多态(PolymeraseChainReaction-SingleStrandConformationPolymorphism，PCR-SSCP)分析发现，猪的单倍型不同但存在相同的等位基因位点，由此推断表达SLA分子的等位基因对呈递的T细胞表位起决定作用。不过，还需测试更多的SLA分子类型和基因位点来确认这些关联。47 3PRRSVGP2蛋白B细胞、T细胞表位筛选3.5小结（1）采用间接ELISA的方法，成功筛选得到GP2蛋白3个免疫显性的B细胞表位，分别是77~94aa、113~130aa、131~148aa。氨基酸序列比对结果显示筛选到的3个B细胞表位在北美洲型毒株间的同源性达到92%以上。（2）采用ELISPOT方法，经肽库和单肽两轮筛选，最终筛选出GP2蛋白6个T细胞表位，分别是86~103aa、95~112aa、104~121aa、113~130aa、140~157aa和185~202aa。48 4结论4结论（1）成功扩增得到PRRSVJXA1-R毒株的ORF2基因序列全长，并表达纯化得到具有良好反应原性的GP2蛋白。（2）成功筛选出GP2蛋白3个B细胞表位，分别是77~94aa、113~130aa和131~148aa，并且这3个B细胞表位在北美洲型毒株间同源性达到92%以上。（3）成功筛选得到GP2蛋白6个T细胞表位，分别是86~103aa、95~112aa、104~121aa、113~130aa、140~157aa和185~202aa。49 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附录英文缩略词表附录英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称aaAminoacide氨基酸残基APAmmoniumpersulphate过硫酸铵CBSCarbonatebufferedsaline碳酸盐缓冲液CDClusterofdifferentiation分化抗原簇cDNAcomplementaryDNA互补DNACPECytopathiceffect细胞病变效应CTLcytotoxicTlymphocytecell细胞毒性T淋巴细胞EAVEquinearteritisvirus马动脉炎病毒GSHGlutathionereduced谷胱甘肽还原型GSSGGlutathioneoxidized谷胱甘肽氧化型IFAImmunofluorescenceassay免疫荧光试验IPMAImmunoperoxidasemonolayerassay免疫过氧化物酶单层细胞试验IPTGIsopropyl-thiogalactoside异丙基硫代半乳糖苷IL-2Interleukin-2白细胞介素-2LDEVLactatedehydrogenase-elevatingvirus乳酸盐脱氢酶提升病毒MIDMinimuminfectivedose半数最低感染剂量NationalCenterforBiotechnologyNCBI美国国家生物技术信息中心InformationNSPNon-structureprotein非结构蛋白OIEOfficeInternationalDesEpizooties世界动物卫生组织PAMPorcineAlveolarMacrophages猪肺巨噬细胞PBMCPeripheralbloodmononuclearcell外周血单核细胞TCRTcellreceptorT细胞抗原受体TCID50Tissuecultureinfectivedose半数组织培养感染剂量TregsRegulatoryTcells调节性T细胞58 致谢致谢三年的硕士研究生生活，不仅仅收获了丰厚的专业知识与试验技能，更重要的是培养出严谨的思维、丰富的语言表达和敏锐的洞察力。在硕士研究生阶段，很荣幸能遇到如此多的良师益友，不仅在工作与学习上，甚至在生活上，都给予了我很大的帮助，令我三年的大学生活充满了温馨与友爱。感激之情无以言表，在此谨以最最平实的语言致以崇尚的敬意与感谢。本论文在导师张改平院士和王爱萍教授的悉心教导下完成的。张老师渊博的知识、独到的科研思维和创新的科研视角让每一个学生都如沐春风、受益匪浅。王爱萍老师是一个学识渊博，对待事业勤勤恳恳的良师，非常有幸能够成为她的学生。她不仅仅在试验方面给于我极大的指导和帮助，同时也对我在做人做事方面淳淳教导。本论文从最开始的选题一直到完成，每一步都倾注了导师无数的心血。因为有导师的耐心指导，在试验和论文写作的过程中遇到的很多问题都最终得以解决。所以在此，再次对老师道一声：老师，谢谢您！时光匆飞逝，转眼又到了毕业季。毕业日期已悄然临近，论文写作也随之进入尾声。在此向郑州大学分子免疫学实验室的周景明老师、祁艳华老师、刘红亮老师、刘燕凯老师、陈玉梅老师表达我衷心的感谢，感谢您们三年来的辛勤教诲，不仅教我们试验技能与技巧，还以身作则，给我们树立学习的榜样。本论文的整体规划以及课题的技术规范都离不开老师们详尽的指导与帮助！感谢我的栗宁师姐、蒋敏师姐、牛艳师姐、贾蕊师姐等给予我的试验指导与帮助，让我能及早地融入实验室；感谢我的同学张阳、赵军、耿玥、周人杰等对我学习和生活的关心和帮助；感谢我的师弟师妹王奇奇、陈冰、孙换平、孙国苹、马文丽、党伟华、杨庆宝、李金鸽、王琨等给予我试验中的帮助。感谢我亲爱的父母，没有您们默默的奉献与支持，我不可能享有今天这样的成绩。您们的爱与期盼，时时刻刻无不激励着我前进，千言万语也表达不了我对您们的感谢，爸爸、妈妈你们辛苦了！最后，感谢郑州大学为我提供一个如此优秀的学习平台与环境。能成为郑州大学一份子令我感到无比的光荣，不仅能有幸拜尊敬的张改平院士、王爱萍教授、周景明教授为师，而且还能认识如此多优秀的同学。三年大学时光已匆匆流逝，美好的回忆将永远回荡在我的脑海了，值得用一生去慢慢回味。聂守一2018年5月于郑州59 个人简历个人简历一聂守９９４６。，男，汉族，中共党员，１年月生，河南临颍人学习经历一２０２０１１年９月１５年７月，就读于青海大学生态环境工程学院，生物技术专业，获得理学学士学位＿。２０一１５年９月２０１８年７月，就读于郑州大学生命科学学院，动物分子免疫，生物工程专业学方向，攻读理学硕士学位。科研经历“猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋参与国家自然科学基金面上项目（３１４７２１７７）白Ｔ细胞表位”图谱的绘制子课题的研究。所获奖励２０？１５年９月２０１６年６月获郑州大学Ａ２类助研奖学金；２０￣１１６年９月２０７年６月获郑州大学Ａ２类助研奖学金；２０￣２０１７年９月１８年６月获郑州大学Ａ２类助研奖学金；“”－２０１６２０１７学年荣获郑州大学三好研究生。６０