猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2主要抗原位点区的表达及抗体检测方法的建立

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密级：论文编号：中国农业科学院学位论文猪繁殖与呼吸综合征病毒ＮＳＰ２主要抗原位点区的表达及抗体检测方法的建立ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＭａｏｒＥｉｔｏｅＲｅｉｏｎｓｉｎＮＳＰ２ｊｐｐｇｏｆＰｏｒｃｉｎｅａｎｄＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄＲｅｓｉｒａｔｏｒＳｎｄｒｏｍｅＶｉｒｕｓｐｙｙａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎＥＬＩＳＡｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙ硕士研究生：胡荣指导教师：李冬研究员？申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：兰州兽医研究所—研究生院２０１７年５月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationProkaryoticExpressionoftheMajorEpitopeRegionsinNSP2ofPorcineandReproductiveandRespiratorySyndromeVirusandDevelopmentofanELISAforDetectionofAntibodyM.S.Candidate：HuRongSupervisor：ProfessorLiDongMajor：MasterofVeterinarianSpecialty:VeterinarianMay2017 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名:讠时间:冫丨年月丨R象1ζ7日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定,即:中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。时时间间:'η年5饴C汩:彡研7旰V日 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2主要抗原位点区的表达及抗体检测方法的建立动物传染病及论文作者胡荣专业领域兽医硕士研究方向其分子流行病学指导教师李冬培养单位(研究所)兰州兽医研究所硕姓名职称单位专业签名(博)评硕导□甘肃农业大学曾巧英教授预防兽医学阅博导田动物医学院人硕导田中国农业科学院独军政副研究员预防兽医学博导□兰州兽医研究所答辩主硕导田甘肃农业大学刘磊教授预防兽医学席博导□动物医学院刊勿硕导田兰州理工大学王鸣刚教授分子生物学博导□生命科学与工程学院仞咖刎'列骊岁硕导田西北民族大学刘翊中教授预防兽医学博导□生命科学与工程学院^笨硕导□中国农业科学院王永录研究员预防兽医学{讧博导田兰州兽医研究所0础辩硕导曰中国农业科学院ˇ孙世琪研究员预防兽医学博导□兰州兽医研究所侧俨犹委硕导□博导□员硕导□博导□硕导□博导□会议记录(秘书)彡鼎⒛17年5归17日中国农业科学院兰州兽医研究所论文答辩时间地点家畜疫病病原生物学国家重点实验室大楼3楼会议室 摘要猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种以后备母猪流产以及新生仔猪严重肺炎为特征的重要传染病，致病病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），是一种正链RNA病毒。非结构蛋白2（NSP2）是PRRSV最大的非结构蛋白，可分为四个功能区，中间的高变区是富含B细胞表位的区域，有研究表明缺失高变区的部分B细胞表位对PRRSV的复制能力并无影响，因而，可以通过缺失这些区域制备表位缺失标记病毒疫苗，为PRRSV感染动物与免疫动物鉴别诊断提供依据。本研究表达了两种PRRSVGSWW毒株的NSP2主要抗原表位区蛋白，以其中一种纯化的重组蛋白为抗原，初步建立了检测PRRSV血清抗体的间接ELISA方法；并利用另一种分子量较大的表达蛋白研制NSP2单克隆抗体，为建立表位缺失标记病毒疫苗的配套诊断方法奠定基础。以克隆获得的PRRSV/GSWW/15毒株的NSP2基因为模板，设计特异性PCR扩增引物，扩增获得750bp的NSP2第2010-2759bp区域（命名为EF2），将EF2片段亚克隆入pET-28a表达载体；同时，委托公司合成了NSP2第2226-3110bp片段（命名为GD2），并将其亚克隆入表达载体pET-30a，重组表达载体转化大肠杆菌，分别表达获得了大小为29ku、47ku的EF2和GD2重组蛋白；免疫印迹结果证实表达的蛋白能被PRRSV阳性血清识别，具有良好的反应活性。以纯化复性后的EF2重组蛋白包被酶标板，初步建立了检测PRRSVNSP2抗体的间接ELISA方法，该间接ELISA方法的主要参数为最佳抗原包被浓度1μɡ/mL，最佳血清稀释度1∶20，兔抗猪IgG酶标二抗体稀释度1∶2000。通过检测30份健康猪血清，确定了间接ELISA方法的判定标准为：S/P＞0.17，为PRRSVNSP2抗体阳性；S/P≤0.17，为PRRSV阴性。以此判定标准，检测猪瘟病毒阳性血清、猪伪狂犬病毒阳性血清、口蹄疫病毒阳性血清各1份均为阴性，检测30份PRRSV非免疫健康猪血清，均为阴性；检测133份PRRSV感染后PPRSV猪血清，敏感性为88.7%，表明该方法具有良好的特异性与敏感性。方法重复性检测，批内变异系数为3.8％~6.8％；批间变异系数为4％~8.6％，具有很好的重复性。与法国LSI商品化试剂盒对比，符合率为73.1%；与北京世纪元亨试剂盒相比，符合率为77.2%。结果表明，所建立的ELISA方法可用做PRRSV抗体的临床检测。利用表达纯化的GD2蛋白免疫小鼠，制备了9株NSP2的单克隆抗体，叠加ELISA试验证明，9株单抗识别NSP2蛋白4个不同的抗原表位。选择针对4个表位的效价最高的4株单抗杂交瘤制备了腹水抗体，免疫印迹试验证明，4株单抗均可特异性识别EF2和GD2重组蛋白，这为建立基于单克隆抗体的ELISA抗体检测方法奠定了基础。关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒，NSP2，间接ELISA，单克隆抗体I AbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS),characterizedbyrespiratorydiseaseinneonatalpigsandreproductivefailureinpregnantsows.Thecausativeagentisporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV),whichisapositive-senseRNAvirus.NSP2isthebiggestnon-structuralproteinofPRRSV;itisdividedintofourfunctionalregions,themiddlehypervariableregionisrichinBcellepitopes,andpreviousresearcheshadshownthatdeletionofsomeBcellepitopesinthisregionhadnoeffectonPRRSVreplication.SodeletiontheepitopesinNSP2regionwillbeagoodstrategytodevelopnegativemarkervirusvaccinetosupporttheactionfordifferentiatingdiagnosisofthevirusinfectedfromvaccinatedpigs.Inthispaper,twomajorBcellepitoperegionsofNSP2wereexpressedinE.coli,andoneofthepurifiedrecombinantproteinwasusedasthecoatedantigentoestablishanindirectELISAmethodforthedetectionofPRRSVantibody.BasedontheclonedNSP2geneofGSWWstrain,theNSP2fragmentof2010-2759bp(namedEF2)wasamplifiedusingapairofspecificprimers，andthensubclonedintopET-28avectorforexpression.ThefragmentcorrespondingtoNSP22226-3110bp(namedGD2)wassynthesizedandsubclonedintopET-30aforproteinexpression.TworecombinantvectorweretransformedintoEscherichiacoliforproteinexpression.ThemolecularweightofexpressedEF2andGD2are29and47ku,respectively.WesternblottingshowedthattherecombinantproteinshavehighreactionactivityandcouldberecognizedbypositiveserumofPRRSV.EF2proteinwasusedtocoatingELISAplatetodevelopanindirectELISAfordetectionantibodiesagainstNSP2ofPRRSV.ThekeyparametersofthisELISAareasfollowing:optimalcoatingconcentrationofEF2is1μɡ/mL,theoptimalofdilutionoftheserumandHRPlabeledRabbitanti-PigIgGis1∶20and1∶2000,respectively.Bydetectionof30serumsamplesfromPRRSVuninfectedpigs,thecut-offvaluewasdeterminedbycalculatingtheratioofODvalueofsampletopositivecontrol(S/P).IftheS/Pvalueismorethan0.17,itisconsideredtobepositiveforNSP2antibody;iftheS/Pvalueislessthanorequalto0.17,itisconsideredtobenegativeforNSP2antibody.Accordingtoabovecriteria,thisEF2-ELISAtestshowagoodspecificityfordetecting30samplesfromPRRSVuninfectedpigsandnocrossreactivitywithCSFV,PRV,FMDVpositiveserum.Bydetectcting133serafromPRRSVinfectedpigs,theantibodypositiveratiois88.7%,indicatingagoodsensitivityandspecificityoftheEF2-ELISA.Thecoefficientsofvariationforintra-assayandinter-assayis3.8%~6.8%and4%~8.6%respectively.Totalof365serumsamplesfrominfectedpigsweredetectedbythisELISAandcomparedwithtwocommercialELISAkits,thetotalcoincidencerateis73.1%；(LSI)and77.2%(Yuanheng),respectively.Ninemonoclonalantibodies(MAbs)werepreparedusingtheGD2proteinasantigen.These9MAbsweredetectedtorecognize4epitopesinGD2proteinbysuperpositionELISA.FourMAbswerepreparedinmousethatrecognize4differentepitopesinNSP2.Westernblottingshowedthese4MAbscanrecognizebothEF2andGD2proteins.ThepreparationofMAbsmakeagoodfoundationforestablishingELISAbasedontheseMAbsinthefutureresearch.KeyWords:porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV),non-structuralprotein2,indirectELISA,monoclonalantibodies.II 目录第一章引言.......................................................................................................................11.1PRRS概述..................................................................................................................11.2PRRSV基因组结构...................................................................................................11.3PRRS的致病机理......................................................................................................11.4PRRSV感染的临床症状...........................................................................................21.5PRRSV的传播...........................................................................................................21.6PRRSVNSP1的结构与功能....................................................................................31.7PRRSVNSP2的结构与功能....................................................................................31.8PRRSV的主要结构蛋白...........................................................................................41.9PRRSV的检测手段...................................................................................................51.9.1酶联免疫吸附实验..............................................................................................51.9.2反转录-聚合酶链反应.........................................................................................51.9.3间接免疫荧光实验..............................................................................................51.9.4血清中和实验......................................................................................................61.9.5原位杂交技术......................................................................................................61.9.6环介导等温扩增技术..........................................................................................61.10PRRSV疫苗研究进展.............................................................................................61.11本研究的目的和意义...............................................................................................7第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立..........................................82.1实验材料....................................................................................................................82.1.1质粒、载体与主要试剂......................................................................................82.1.2血清样本..............................................................................................................82.1.3主要仪器设备......................................................................................................82.2实验方法....................................................................................................................9III 2.2.1引物的设计与合成..............................................................................................92.2.2重组质粒pET-28a-EF2的构建..........................................................................92.2.3EF2蛋白的表达................................................................................................122.2.4EF2蛋白的纯化与鉴定....................................................................................142.2.5EF2蛋白间接ELISA方法的建立...................................................................152.3结果..........................................................................................................................162.3.1目的片段的扩增................................................................................................172.3.2重组质粒的鉴定................................................................................................172.3.3EF2蛋白的表达................................................................................................172.3.4EF2蛋白的纯化及Westernblot检测分析......................................................192.3.5重组蛋白最佳包被浓度以及最佳血清稀释度的确定....................................192.3.6抗原抗体作用时间的选定................................................................................202.3.7酶标抗体最佳稀释度的确定............................................................................202.3.8重复性实验........................................................................................................212.3.9阴阳性临界值的确定........................................................................................222.3.10特异性分析结果..............................................................................................222.3.11敏感性分析结果..............................................................................................222.3.12符合性实验结果...............................................................................................222.4讨论..........................................................................................................................24第三章GD2蛋白的诱导表达及单克隆抗体制备..........................................................263.1材料..........................................................................................................................263.2方法..........................................................................................................................263.2.1基因合成............................................................................................................263.2.2GD2蛋白的表达...............................................................................................263.2.3GD2蛋白表达的形式确定...............................................................................263.2.4GD2蛋白的纯化与鉴定...................................................................................27IV 3.3结果..........................................................................................................................283.3.1GD2蛋白的纯化及Westernblot检测分析.....................................................283.3.2单克隆抗体鉴定结果........................................................................................293.3.3单克隆抗体的Westernblot检测.....................................................................303.4讨论..........................................................................................................................30第四章全文结论...............................................................................................................30参考文献.............................................................................................................................32致谢...................................................................................................................................39作者简介.............................................................................................................................40V 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称DTTDL-Dithiothreitol二硫苏糖醇EAVEquinearteritisvirus马动脉炎病毒EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸二钠IBInclusionbody包涵体ILInterleukin白细胞介素INFInterferon干扰素IPTGIsopropylβ-D-Thiogalactoside异丙基硫代半乳糖苷LDVLactatedehydrogenase-elevatingvirus小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒NSPNonstructuralprotein非结构蛋白ORFOpenreadingframe开放性阅读框PAMPorcinealveolarmacrophage猪肺泡巨噬细胞PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PCPPapain-likecysteineprotease木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PRRSVPorcinereproductiveandrespiratory猪繁殖与呼吸综合征病毒syndromevirusSDASodiumdodecylsulfate,sodiumsalt十二烷基硫酸钠SHFVSimianhemorrhagicfevervirus猴出血热病毒VI 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1PRRS概述猪繁殖与呼吸综合征（porcineandreproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）引起的以后备母猪流产以及新生仔猪严重肺炎为主要特征的高度性传染性疾病（Hopperetetal.,1992;Wensvoort,1993;Wensvoortetal.,1991;Russelletal.,1980）。1987年该病首次出现在美国，其病原在1991年在荷兰被分离鉴定(Collinsetal.,1992)。自爆发PRRS以来，每年在美国造成的经济损失将近60亿美元（Neumannetal.,2005）。郭宝清等人于1996年证实了我国存在PRRSV阳性抗体，并且首次在我国分离到了PRRS病毒（郭宝清等，1996）。2006年，我国南方地区猪群爆发了猪的“高热病”，发病猪的主要特点是：体温高、发病率高、死亡率高，该病后来被证实为高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Highlypathogenicporcineandreproductiveandrespiratorysyndrome,HP-PRRS)（童光志等，2007）。与普通PRRS相比，HP-PRRSV的主要特征是其NSP2上存在30个不连续性氨基酸的缺失，但是这种缺失与HP-PRRS的致病力并不相关（Zhouetal.,2009）。1.2PRRSV基因组结构PRRSV是单股正链有囊膜的RNA病毒，它与马动脉炎病毒（EAV）、猴出血热病毒（SHFV）、小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒（LDV）同属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属（Cavanagh,1997;Benfieldetal.,1992）。PPRS病毒的粒子是一个光滑的椭圆体，直径大小约为50-65nm（Talbotetal.,1995;Dokland,2010）。它的核衣壳蛋白包被着PRRS基因组RNA，糖蛋白以及膜蛋白插入到病毒的磷脂双分子层，一起构成了PRRS病毒粒子。PRRSV全长约15kb，包含至少10个开放性阅读框：ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-7以及ORF5a。ORF1a与ORF1b位于PRRSV基因组的5端，占整个基因组全长的80%（Snijderetal.,1998）。ORF1（ORF1a、ORF1b）编码两个非结构多聚蛋白pp1a和pp1b，pp1a自我剪切成10个非结构蛋白，NSP1-8，其中，NSP1内部裂解成为NSP1α、NSP1β，NSP7裂解为NSP7α以及NSP7β；pp1b水解为NSP9-12（denBoonetal.,1995;vanAkenetal.,2006;Ziebuhretal.,2000）。ORF1b相对ORF1a来说，是比较保守的，原因是ORF1a编码的NSP2蛋白的中间区域变异性大。1.3PRRS的致病机理PRRSV具有严格的单核巨噬细胞嗜性，PRRSV在体内的初始靶细胞为充分分化的猪肺泡巨噬细胞，除此之外，树突状细胞可以支持PRRSV的复制（Duanetal.,1997;Lovingetal.,2007）。在众多不同的细胞系中，只有非洲绿猴肾细胞MA-104、CL262、MARC-145细胞才能完全满足PRRSV在体外的增殖（Kimetal.,1993）。PRRSV是通过网格蛋白介导的内吞作用进入宿主细胞，发生膜融合后在细胞质中释放病毒基因组（Nauwyncketal.,1999）。CD163被认为是介导了PRRSV1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言的侵入以及分解的主要受体，通过建立猪巨噬细胞cDNA文库发现，CD163在PRRSV初始感染中起着关键性作用，过表达CD163能影响PRRSV对细胞的感染能力；除此之外，PRRSV的次要结构蛋白GP2a以及GP4与CD163相互作用，也介导病毒的侵入（Welchetal.,2010;Calvertetal.,2007;Dasetal.,2010;Tianetal.,2012）。PRRSV的感染至少分为三个明显的阶段：急性感染、持续感染以及病毒的消退阶段（Lunneyetal.,201）。第一阶段为急性感染阶段，在此阶段，肺作为优先感染部位，PRRSV主要在猪的肺以及上呼吸道的巨噬细胞以及树突状细胞上增殖,在PRRSV感染6-12h后，机体出现病毒血症，并且病毒血症可以持续数周。在持续性感染阶段，病毒的复制能力减弱，病毒主要在淋巴器官包括扁桃体以及淋巴结中增殖；在这一阶段在机体血液以及肺脏中检测不到病毒，猪群也不会表现出明显的临床症状（Willsetal.,1997;Allendeetal.,2000;Rowlandetal.,2003）。第三阶段为病毒的消退阶段，病毒具体消退的时间目前尚不明确，但在PRRSV感染宿主250天左右，机体依然能检测到PRRS病毒，PRRS病毒的消退是渐进性的（Willsetal.,2003）。1.4PRRSV感染的临床症状PRRSV主要特征是导致妊娠母猪的流产、出现木乃伊胎，造成仔猪呼吸障碍以及降低育肥猪的生产性能等，但是PRRSV感染的临床症状表现不尽相同。一方面取决于猪群的本身特点，包括感染猪的日龄、母猪的妊娠状态；另一方面与PRRSV毒株的种类、致病力的强弱有关。这些不同主要体现在感染PRRSV的猪群体温、组织病变以及病毒血症等方面；有研究表明，感染普通致病力PRRSV的猪群表现出轻微的呼吸困难、发热等，而感染高致病性毒株的猪群会出现呼吸急促、发热、嗜睡、耳部出现蓝紫色斑块症状等。最近的一项研究表明高致性病毒株PRRSV感染的猪群血液中病毒载量、发病率与死亡率都会显著增高，耐过猪的病毒血症持续时间也会延长（Johnsonetal.,2004）。1.5PRRSV的传播PRRSV的传播方式包括直接传播与间接传播，直接传播是PRRSV传播的最有效的传播方式（Christiansonetal.,199;Zimmermanetal.,1997;Willsetal.,1997）。直接传播主要是通过PRRSV阳性猪的分泌物以及排泄物传播，包括鼻液、唾液、乳汁以及精液等，这些液体中含有大量的PRRSV，易感猪在接触这些病毒后，病毒便可经过口腔、皮肤创口、子宫等多种途径感染易感猪（Wagstrometal.,2001Rossowetal.,1994）。由于一些猪群在感染PRRSV后并不表现出临床症状，并且感染猪的抗体水平不同，一些PRRSV检测手段并不能把所有PRRSV感染的猪群检测出来，容易造成混群感染。此外，带毒公猪的精液可以通过人工授精的方式传播PRRSV，由于PRRSV的持续隐形感染，所以在购买公猪精液时，尽量不要从有PRRSV感染史的猪场购买（Christopher-Henningsetal.,1995;Swensonetal.,1994）。PRRSV的间接传播主要是通过PPRSV污染物以及运输工具的传播（Deeetal.,2004;Deeetal.,2009）。污染物包括受污染的饲料、饮水、工作服以及接种时所用的针头等；运输工具主要是运猪的车辆以及器具，在出售猪只时，要对运输的车辆进行清洗、消毒，对随车人员也要做好消毒措施。2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.6PRRSVNSP1的结构与功能NSP1是一个多功能蛋白，有383个氨基酸，位于pp1a的末端，包含了木瓜样半胱氨酸酶区（PCPα以及PCPβ）以及亚基因组mRNA转录所需的锌指结构。NSP1在180位氨基酸处裂解为NSP1α以及NSP1β（denBoonetal.,1995;Chenetal.,2010）。在大肠杆菌中表达NSP1α/β融合蛋白可以导致在NSP1α/β连接处的自我剪切,在Ⅱ型PRRSVXH-GD株中，这种剪切发生在180位的甲硫氨酸值后，而在Ⅰ型PRRSV毒株中，这种剪切发生在180的组氨酸之后（Sunetal.,2009）。NSP1α有183个氨基酸残基，它在可溶性条件下以及晶体结构中均以二聚体的形式存在。NSP1α包含N-末端的锌指结构（1-55aa），这在转录因子中是一种常见的的基序，推测这个结构可能与NSP1α作为一个转录因子的生物学功能相关；紧随其后，在66-166aa中存在一个半胱氨酸蛋白激酶结构域，这个区域使得NSP1α从多聚蛋白链上自我剪切下来；最后是一个C末端的延伸区（Sunetal.,2009;Sunetal.,2012;Tijmsetal.,2007;Tijmsetal.,2003;Kroeseetal.,2008）。最近NSP1β的晶体结构也得到了解析，NSP1βN末端第1-49氨基酸残基包含了一个核酸酶结构域，这个区域在SSRNA以及dsRNA都具有活性；第85-181位氨基酸残基包含了一个半胱氨酸酶结构域（PCPβ），这个结构域使它自身从NSP2上剪切下来（Xueetal.,2010）。PCPβ活性位点由第90位的半胱氨酸以及第159位的组氨酸形成，NSP1β同NSP1α一样在可溶性条件下以及晶体结构中都以二聚体的形式存在。NSP1具有免疫抑制的作用，它能通过抑制NF-KB以及IR3这两条信号通路从而抑制Ⅰ型干扰素的产生，周业飞等人研究表明，NSP1能显著降低γ干扰素的产生以及淋巴细胞的增殖，同时还可以诱导产生较强的IL-10反应；对免疫猪瘟疫苗的猪群接种NSP1重组腺病毒后，猪瘟抗体水平显著降低，从而证实了NSP1确实存在免疫抑制作用。1.7PRRSVNSP2的结构与功能NSP2是PRRSV中最大的非结构蛋白，由ORF1a编码，大小在1168-1196aa之间（Allendeetal.,1999;Fangetal.,2004;Roppetal.,2004）。NSP2也是PRRSV中变异性最强的非结构蛋白，在各亚型之间，NSP2的同源性不到40%（Allendeetal.,1999;Nelsonetal.,1999）。NSP2在结构上大致分为四个区域：N端的半胱氨酸酶结构域（PL2），包含大约500-700个氨基酸；中间高变区、近C端的跨膜区以及功能有待验证的C端保守区（Hanetal.,2006;Hanetal.,2007）。PL2蛋白酶的活性负责NSP2与NSP3连接处的剪切。这个活性区域的催化位点由第55位的半胱氨酸、89位的天冬氨酸以及124位的组氨酸组成。PL2具有去泛素化的活性，这个区域相当于SARS病毒的木瓜样蛋白酶结构域（Frias-Stahelietal.,2007）；马动脉炎病毒的NSP2已经被证实参与了膜的重排（Snijderetal.,2001;Pedersenetal.,1999）。PRRSV靠近C末端的位置存在一个亲水性区域。NSP2的中间区域最近被证实在调节宿主天然免疫应答的过程中起着非常重要的作用。研究发现，缺失ES3（这个表位位于NSP2的中间区域）的PRRSV毒株，相比于亲代病毒，能显著提高宿主细胞的杀伤效应以及能够产生更强的病毒滴度，并且这个区域能减少宿主机体诱导产生IL-1β以及TNF-α的水平（Chenetal.,2010）。NSP2中具有多个结构域，并且这些结构域功能有3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言所不同。在Hela细胞中，NSP2可能激活NF-kB通路；这可能与NSP2的高变区有关（Fangetal.,2012）。PRRSVNSP2的N末端的PLP2可以抑制维甲酸诱导基因1-a模式识别受体的去泛素化。除了参与调节宿主的天然免疫应答，NSP2还参与调节宿主的体液免疫应答。目前NSP2上鉴定出了许多B细胞线性表位，Oleksiewicz等利用噬菌体展示技术在PRRSV欧洲型111/92株NSP2中鉴定出6个线性表位；De在PRRSVNVSL97-7985株NSP2上鉴定出18个线性表位，这些线性表位都能与大约50％的实验血清样本反应，其中有10个线性表位能与80％~100％的实验血清样本反应；YulinYan等利用肽扫描技术、单克隆抗体筛选在BJ-4株NSP2中鉴定出4个新的线性表位；祖春波等利用肽扫描技术在TPP60株NSP2中筛选到了2个线性表位（deLimaetal.,2006;祖春波等2010;Oleksiewiczetal.,2001;Yanetal.,2007）。其中的一些线性表位包含着许多亲水性的氨基酸，这些氨基酸可以提高PRRSV识别B淋巴细胞的能力；还有一些表位位于NSP2的非必需区，这些区域的缺失不会影响到病毒的复制能力。在PRRSV感染的最处阶段，血清动力学表明，产生针对NSP2抗体的水平与针对N蛋白的抗体水平相似，但是前者抗体水平持续时间更长。虽然PRRSV的产生中和抗体以及细胞免疫应答较迟，但是有研究表明，NSP2上的一些肽段可以诱导IFN-γ的应答，在回忆应答中，它还能够诱导IL-10的应答（Burgara-Estrellaetal.,2013）。1.8PRRSV的主要结构蛋白N蛋白：PRRSV的N蛋白由ORF7编码，是一个非糖基化蛋白，为PRRSV的核衣壳蛋白。大小约为15kDa，在Ⅰ型毒株氨基酸数目为128个，而在北美型中，氨基酸数目为123个（Musicetal.,2010,）。N蛋白在PRRSV含量最丰富，是PRRSV的主要结构蛋白，约占整个病毒的40%。N蛋白在病毒粒子中以同源二聚体的形式存在，它的共价键以及非共价键都参与形成了同源二聚体（Woottonetal.,2003）。N蛋白非共价键与共价间的锚定作用目前尚不清楚。N蛋白在结构上划分为N末端的RNA结合域以及C端的二聚化结构域，北美型毒株中N末端结构域的第21-33aa是一个高疏水性的序列，这个序列可能形成一个α螺旋，在病毒的组装中起着非常重要的作用（Pereraetal.,2001;Rowlandetal.,2003）。N蛋白是PRRSV中主要的免疫原性蛋白，但是针对N蛋白的抗体没有中和病毒的能力，对机体并不产生保护作用（Deaetal.,2000;Meulenbergetal.,1995）。在北美洲毒株的N蛋白目前已经鉴定出5个B细胞表位，其中四个为线性表位，剩余的一个为构象表位；线性表位aa37~52在两种基因型中高度保守（Rodriguezetal.,1997）。GP5蛋白:GP5蛋白由PRRSV基因组的ORF5编码，是一个糖基化的跨膜蛋白，大小约为25kDa。它具有一个假定的N末端的信号肽段，并且存在三个糖基化位点，这三个糖基化位点位于GP5的胞外区。GP5蛋白与M蛋白通过二硫键形成异源二聚体，这个异源二聚体可能在PRRSV的组装过程中起着非常重要的作用（vanBreedametal.,2010）。GP5介导病毒进入宿主细胞，并且被认为是与唾液酸粘附素相互作用从而使PRRSV进入猪的肺泡巨噬细胞。GP5在受体识别过程中起作用，主要靠它的N末端胞外区上的中和表位的支持，这个中和表位可以诱导宿主产生中和性抗体（Ostrowskietal.,2002）。GP5蛋白N端的糖基化修饰在蛋白的正确折叠、生物活性上发挥着重要的作用；有研究表明，GP5蛋白的糖基化可以引起宿主免疫逃避，以及可以最小化病毒的中和抗体应答。4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.9PRRSV的检测手段通过观察感染猪群典型的临床症状以及组织病变可以大致判断猪群是否感染PRRSV，如果要进一步确诊，还需要借助其他的诊断方法。1.9.1酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验（Enzyme-LinkedImmuno-SorbentAssay,ELISA）具有特异性、敏感性强、检测速度快、易于标准化等优点，广泛应用PRRSV的检测。ELISA检测所用的酶标板有96个孔，除去阴阳性对照，在一个板子上至少可以检测92份样品，如果同时用两块以上酶标板做检测，那么可以在短时间完成大量临床样品的检测。最早用于检测PRRSV抗体的间接ELISA方法是由Albina.E建立的，他们将PRRSV接种至PAM细胞上制备病毒抗原，对血清样本进行检测；该方法具有良好的敏感性和特异性(Albinaetal.,1992)。我国学者王刚等用差速离心的方法提纯PRRV病毒，在世界上首次成功建立了PRRSV血清抗体的斑点酶联免疫吸附实验（王刚等，1996）。目前用于检测PRRSV抗体的ELISA方法所用的包被抗原有全病毒以及PRRSVN蛋白，但是纯化全病毒难度大，成本高，近些年来国内学者把包被抗原的重点放在结构蛋白N蛋白、GP5蛋白，非结构蛋白NSP7以及NSP2上。1.9.2反转录-聚合酶链反应RT-PCR（ReverseTranscription,PolymeraseChainReaction）是当前实验室检测PRRSV病毒最常用的方法。它的原理是提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR的灵敏度特别高，能检测出样品中含量极低的病毒。1994年Suarez等首次建立了检测PRRSV的RT-PCR方法（Suarezetal.,1994）。2003年赵耕等建立的套式RT-PCR方法能检测不同亚群的PRRSV，比一步法RT-PCR的灵敏度提高了1000倍（赵耘等，2003）。2006年我国爆发了HP-PRRSV，随后周丹等人根据NSP2基因序列设计了3条引物，建立了能够区分PRRSV变异株与普通株的RT-PCR法。RT-PCR法虽然灵敏度高，但是容易因实验室污染造成检测的结果呈假阳性（周丹等，2012）。1.9.3间接免疫荧光实验IFA（indirectimmunofluorescence）是直接免疫荧光的改进，它是将荧光色素标到抗球蛋白抗体(第二抗体)上用来鉴定或检测未知抗原或抗体。其特征是快速、敏感、特异。美国首先建立此方法，目前已在检测PRRSV抗体上得到广泛应用。2009年陈仕龙建立的IFA不仅能区分PRRSV美洲株与欧洲株，还能区分HP-PRRSV毒株，这为确诊我国流行的高致病性PRRSV毒株提供了可靠的验证手段（陈仕龙等，2009）。5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.9.4血清中和实验血清中和实验（serumneutralizationassay，SN）是病毒或毒素与相应的血清抗体结合后，失去对易感动物的致病力的实验方法。SN主要是检测PRRSV的中和抗体，能确定病毒的滴度，具有良好的特异性。但是PRRSV感染的一个特点是中和抗体应答延迟，感染数周后才能检测到中和抗体的产生，所以SN作为不能作为PRRSV的早期诊断。1.9.5原位杂交技术PRRSV的原位杂交技术（Insituhybridization，ISH）于1994年问世，主要是根据PRRSV的ORF7为模板，通过反转录的手段得到cDNA，并用地高辛标记cDNA制备探针，用来检测PRRSV的RNA。该技术是用来检测病毒中的RNA，灵敏度高，所以要尽量避免RNA的污染。李雪梅等以美洲株ATCCVR-2332株材料，设计了针对ORF6以及ORF7的寡核苷酸探针，建立了原位检测石蜡包埋PRRSV核酸的方法，该方法可以用于PRRSV感染组织定位的研究（李雪梅，2005）。1.9.6环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是由日本学者发明，是能在等温（60-65℃）条件下，短时间内进行核酸扩增。由于其扩增产物为焦磷酸镁白色沉淀，用肉眼即可观察到结果，不需要借助电泳仪以及凝胶成像仪等设备，所以对仪器设备的要求比较低。而且与普通的PCR相比，它还不需要变性、循环等过程，能实现快速对核酸的扩增，比较简单、快捷。Chen等建立了针对高致病性蓝耳病的ORF1a阅读框的LAMP方法，检测了11株PRRSV毒株以及122份阳性样本，所得的结果与RT-PCR相符。LAMP的快捷、简单等优点符合基层检测PRRSV的要求（Chenetal.,2008）。除以上几种方法外，用于检测PRRSV的还有免疫组化、米氏散射免疫凝集实验等。1.10PRRSV疫苗研究进展1995年PRRSV疫苗于美国问世，我国也于2000年研发出了国内第一株PRRSV灭活疫苗（郭宝清等，2000）。PRRSV灭活疫苗是PRRS病毒用加热的方法或者用化学剂处理灭活而成，它的优点是比较安全并且不存在散毒的危险，便于储存与运输。但灭活疫苗需要多次接种，单次接种不会产生免疫保护效力，需要定期加强接种；这种接种方式容易造成猪机体应激，并且灭活疫苗引起的是宿主的体液免疫应答，几乎不会引起细胞免疫应答，所以利用灭活疫苗接种清除PRRSV感染的巨噬细胞可行性不强。虽然我国研制的出来的CH-1a等灭活疫苗在临床实践中取得较好的免疫效果，但是有研究表明，PRRSV灭活疫苗对仔猪的保护效果并不是很理想，接种灭活疫苗的仔猪病毒血症持续时间并没有缩短，在荷兰、美国等国家研制出的灭活疫苗主要针对的是后备母猪的接种，所以灭活疫苗在PRRSV的应用还是具有一定的局限性。6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言商用的PRRSV弱毒疫苗是将病毒毒株接种到易感细胞上，在细胞上经过多次传代，使病毒毒株的毒力不具备致病性，但是能引进宿主的免疫反应，并且能产生大量的抗体，从而对机体起到保护作用的一种疫苗。由于弱毒疫苗能刺激机体产生大量的抗体，所以弱毒疫苗被认为是有效防控PRRSV感染的途径之一。美国基于PRRSVⅡ型毒株研制出来的弱毒疫苗具有异源保护作用，接种PRRSV-MLV的猪群，在再次感染PRRSV后，临床症状得以减轻、体重得到了恢复、并且肺部组织病变减少。我国研制出的CH-1R弱毒疫苗以及针对HP-PRRSV的弱毒疫苗JXA1-R、TJM-F92在临床应用中都取得了良好的免疫保护效果。针对PRRSVⅠ型毒株的弱毒疫苗在欧洲也被研制出来，免疫效果与北美毒株的相似。PRRSV弱毒疫苗虽然免疫效果好，但是由于接种弱毒疫苗后，病毒株在宿主体内增殖，存在散毒以及毒力返强的危险，所以在PRRSV阴性猪群中不宜使用。不论是接种PRRSV灭活疫苗还是弱毒疫苗，都不能区分自然感染PRRSV以及疫苗免疫猪。标记疫苗（DIVA-differentiatinginfectedfromvaccinatedindividuals，即从免疫个体区分自然感染个体），它的基本原理就是在弱毒疫苗中插入或者删除一定的区域。作为标记疫苗必须具备以下两个特点：一是这个标记物必须是具有较强的免疫原性并且能被大多数群体识别；二是缺失或者插入的分子标记不会影响病毒的复制以及病毒的毒力（Welchetal.,2004等）。2008年YingFang等人以PRRSVpSD01-08为基础，构建pSD01-08-GFP/ΔES4，拯救出亲代以及重组病毒后，分别用这两个病毒感染PRRSV阴性猪，结合ELISA的方法检测血清中的抗体，发现GFP-ELISA结果呈阳性表明疫苗毒株感染；ES4-ELISA结果呈阳性表明野毒株感染；两种ELISA结果都呈阳性，就证明是疫苗毒株与野毒株的混合感染，表明重组病毒能区分PRRSVⅠ型野毒株与疫苗毒株的感染（Fangetal.,2008）。同年，Marcelodelima等选择了NSP2上已经鉴定的表位PPPPPRVQPRKTKSV431-445，发现该表位的缺失不会影响病毒的复制能力以及免疫原性，并且在实验血清中检测发现，感染缺失该表位的病毒株血清不会产生针对该表位的抗体，也达到了区分免疫个体与感染个体的效果（deLimaetal.,2008）。2009年Kim等人在NSP2的高变区缺失了含有131aa的大肽段，这个肽段能被感染野毒株的猪血清识别，但不能被感染缺失该肽段的疫苗株的血清识别。上述的研究结果都表明了NSP2是一个耐碱基插入以及缺失的非结构蛋白，同时也是重要的研发PRRSV标记疫苗的候选基因（Kimetal.,2009）。1.11本研究的目的和意义猪繁殖与呼吸综合症是严重危害世界养猪业的疾病，各国在防控该病上仍然面临着巨大的挑战。NSP2是PRRSV上高度变异的非结构蛋白，它能耐受碱基插入与缺失，研究NSP2对PRRSV的监测以及研发PRRSV标记疫苗有重要的意义（Fangetal.,2008）。本文选择了NSP2抗原性较好的片段进行原核表达并纯化，建立了基于NSP2的间接ELISA方法，可以用作PRRSV血清抗体的临床检测；同时利用表达的GD2蛋白制备了NSP2的单克隆抗体，为后续NSP2表位鉴定和建立检测优势表位抗体的阻断ELISA方法奠定了基础。7 中国农业科学院硕士及学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立NSP2的主要抗原表位区位于该蛋白的中部，位置约为NSP2第100-800aa之间，目前在该区域已鉴定出多个免疫优势抗原表位，包括ECVQGCCEHKSGLGP（141–155aa）、LCQVVEECCCHQNKT（231–245aa）、PPPPPRVQPRKTKSV（431–445aa）、KTKSVKSLPGNKPVP（441–455aa）等，这些表位大多都有良好的反应性。部分表位具有毒株特异性，但通过多序列比对，仍然可以发现个别表位具有一定的保守性。本试验在前人研究的基础，结合对PRRSVGSWW毒株NSP2的序列分析，选取NSP2第2010-2759bp（226-475aa）表位区域进行PCR扩增，连接pET-28a(+)表达载体后，转化大肠杆菌中进行原核表达，并纯化出所表达的蛋白，随后以该蛋白为包被抗原，建立检测NSP2抗体的间接ELISA方法，评价利用该表达蛋白检测PRRSV抗体的敏感性与特异性，为临床检测PRRSV检测诊断提供参考。2.1实验材料2.1.1质粒、载体与主要试剂含有NSP2基因的pGEM-T-NSP2质粒模板为本实验室构建，该NSP2基因克隆来自本实验室2015年分离的高致病性PRRSVGSWW毒株（GenBank登陆号：KX767091）；限制性内切酶BamHI、NcoI以及小提质粒试剂盒购自大连宝生物公司；DNA简易纯化回收试剂盒购自AXYgen公司、DNA分子质量标准购自于北京全式金生物技术有限公司。pET-28a(+)表达载体、Rosetta-gami2（DE3）pLys宿主菌由本实验室保存。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、十二烷基硫酸钠（SDS）、硫酸卡那霉素、二硫苏糖醇（DTT）均购于Amresco公司蛋白分子质量标准购自于塞默飞世尔科技公司。2.1.2血清样本PRRSV阳性对照血清由本实验室保存，来自PRRSV感染猪；PRRSV阴性对照血清，来自经RT-PCR检测无PRRSV感染的健康仔猪；猪瘟病毒（CSFV）阳性血清、猪伪狂犬病毒（PRV）阳性血清、O型口蹄疫病毒（FMDV）阳性血清各1份为本实验室保存。30份PRRSV未感染健康猪血清为本实验室保存，365份血清采自GSWW毒株攻毒后第3天-第126天猪，检测敏感性的133份猪血清来自365份血清中出现病毒血症，且经N蛋白抗体检测为阳性的血清，2.1.3主要仪器设备超净工作台，天津钧星瑞科技有限公司超声破碎仪，美国SONICS有限公司高速冷冻离心机，德国eppendorf有限公司蛋白电泳仪，伯乐生命医学产品有限公司8 中国农业科学院硕士及学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立凝胶成像系统，香港基因有限公司2.2实验方法2.2.1引物的设计与合成根据实验室保存的GSWW毒株序列（GenBank登陆号：KX767091），设计一对特异性引物,送至上海英潍捷基公司合成，引物序列见表2.1。P1为上游引物，P2为下游引物，加粗部分为酶切位点，上游引物序列含NcoI酶切位点，下游引物序列含BamHI酶切位点。表2.1扩增EF2的特异性引物Table2.1PrimersforamplificationofEF2引物名称引物序列（5’-3’）P1AAAGAACCATGGGGAAAATCATCAGCCTTTGTCAAGP2AAAGATGGATCCAATGGTATGGTGATGGTGGACATTGTCGCCCATCAAACTAG2.2.2重组质粒pET-28a-EF2的构建2.2.2.1目的基因的扩增根据实验室保存的GSWW毒株序列（GenBank登陆号：KX767091），设计一对特异性引物扩增NSP2第2010-2759bp区域（NSP2第226-475位氨基酸，命名为EF2）,以GSWW毒株pGEM-T-NSP2质粒为模板进行扩增。反应步骤为：94℃预变性5min，94℃变性30s,60℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环，之后72℃完全延伸10min，反应组分见下表：表2.2EF2的PCR扩增体系Table2.2PCRamplificationsystemofEF2组分constituents体积（μL）10×PCRbuffer52.5MdNTPmix8Forwardprimer1Reverseprimer1cDNA5LATaq0.5RNase-FreeWater29.5Total50将扩增出来的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，将凝胶放入紫外灯下，用干净的刀片切下目的条带，将目的条带转移至1.5mL的离心管中，按照AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收，回收步骤如下：(1)向离心管中加入3个凝胶体积的bufferDE-A，上下颠倒混匀后，放入75℃中的金属浴9 中国农业科学院硕士及学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立锅加热，为保证胶完全熔化，需要每间隔几分钟将离心管拿出，上下混匀以后再次加热，直至凝胶完全融化。(2)加入0.5倍bufferDE-A的BufferDE-B，混合均匀。(3)用移液枪将（2）中的混合液吸入到DNA制备管中，将DNA制备管置于2mL离心管中，12000rpm离心1min中，弃滤液，若混合液过多，需分次离心。(4)向DNA制备管中加入500μL的BufferW1，12000rpm离心1min，弃滤液。(5)加入700μL的BufferW2，12000rpm离心1min中，弃滤液，重复操作一次。(6)不加任何液体，12000rpm空甩2min，此时将无RNase酶的去离子水放入65℃的金属浴锅中加热。(7)将DNA制备管放入新的1.5mL离心管中。加入预热的无RNase酶的去离子水25~50μL，静止1min后，12000rpm离心1min，吸取滤液，重新加入DNA制备管，12000rpm离心1min，保留滤液。(8)DNA凝胶电泳检查目的片段是否回收成功。2.2.2.2目的片段与载体pET-28a(+)的双酶切以及连接将回收的目的片段与pET-28a(+)表达载体分别用限制性内切酶NCOI、BamHI双酶切，37℃酶切3h，酶切体系见下表：表2.3EF2的酶切体系Table2.3RestrictiondigestionsystemofEF2组分constituents体积volume(μL)10×Kbuffer610×BSA6NcoI3BamHI3RNase-FreeWater18PCRfragment24Total50表2.4pET-28a(+)载体的酶切体系Table2.4RestrictiondigestionsystemofpET-28a(+)vector组分constituents体积volume(μL)10×Kbuffer1010×BSA10NcoI5BamHI5RNase-FreeWater45pET-28aplasmid25Total100酶切反应结束后，跑凝胶电泳对目的条带进行胶回收（胶回收方法见2.2.2.1），回收后将目10 中国农业科学院硕士及学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立的片段与载体相连接。连接体系为20μL，组成体系为：T410×buffer2μL，T4Ligase2μL，目的片段12μL，载体片段4μL。置于4℃冰箱过夜连接，次日进行转化。2.2.2.3连接产物的转化(1)事先准备一个冰桶，将从-70℃冰箱取出来的DH5α感受态放入到冰桶中，待其慢慢融化。(2)在超净台中，将连接产物加入感受态中，混匀后，冰浴30min。(3)将混合溶液迅速放入42℃水浴锅中热激90s，立即冰浴2min。(4)在超净台中，将500mL无抗LB液体培养基加入混合液中，将混合液置于37℃摇床，220rpm，1h。(5)从摇床上取出混合液，将其放入离心机，12000rpm离心1min，在超净台中倒出部分上清，将沉淀用剩余上清液重悬，用移液枪将悬液转至含100μg/ml的Kana抗性平板上，用无菌棒将混合液涂布均匀，将平板正放入37℃温箱1h，之后将平板倒置，培养过夜。2.2.2.4重组质粒的鉴定挑取平板上的单个菌落至含100μg/ml的KanaLB液体培养基中，37℃摇菌过夜，参照全式金公司小提质粒盒说明书提取重组质粒，步骤如下：(1)取1mL菌液于1.5mL的离心管中，12000rpm离心1min，尽可能全部弃去上清。(2)加入250μLRB溶液，将菌体沉淀吹打均匀。(3)加入250μLLB溶液，小心的将混合液上下颠倒混匀，直至混合液颜色变成清亮的蓝色。(4)加入350μLNB溶液，小心的将混合液上下颠倒混匀，然后将混合液静止1min，放入离心机，12000rpm离心5min。(5)小心吸取上清液至DNA制备管中，将DNA制备管放入干净的2mL离心管中，12000rpm离心1min，弃去下液。(6)加入650μL的WB溶液，12000rpm离心1min，弃去液体。(7)不加任何液体，12000rpm空甩1min。(8)将DNA制备管放入新的1.5mL的离心管中，加入35μL的去离子水，静止1min后，12000rpm离心1min洗脱DNA，于-20℃保存。将提取的质粒跑凝胶电泳，看质粒是提取成功。将提取成功的质粒进行酶切鉴定，37℃作用2h，酶切体系见下表：11 中国农业科学院硕士及学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立表2.5pET-28a-EF2酶切鉴定体系Table2.5RestrictiondigestionsystemofpET-28a-EF2组分constituents体积volume(μL)10×Kbuffer210×BSA2NcoI1BamHI1RNase-FreeWater8plasmid6Total202.2.3EF2蛋白的表达2.2.3.1感受态的制备(1)按照宝生物感受态试剂盒的步骤制备感受态。(2)参照2.2.2.3的步骤对保存的Rosetta-gami2（DE3）pLys质粒进行转化，37℃过夜培养后，挑斑，接种到液体培养基中过夜培养。(3)将过夜培养的菌液以1:100接种到新鲜LB液体培养基中，活化其OD值达到0.5时，停止培养。(4)将菌液转移至1.5mL无菌的预冷的离心管中，4000rpm，4℃离心5min，尽可能多的去除上清。(5)将试剂盒中预冷的A液加入至离心管中，每管加100μL，用移液枪轻轻的将沉淀混匀，4000rpm，4℃离心5min，尽可能多的去除上清。(6)将预冷的B液加入离心管中，每管加100μL，用移液枪轻轻的将沉淀混匀，即制成了感受态。(7)将制备好的感受态储存在-70℃冰箱中，或者直接用于重组质粒的转化。2.2.3.2EF2蛋白的诱导表达将鉴定正确的pET-28a-EF2重组质粒按照2.2.2.3的方法转入Rosetta-gami2（DE3）pLys宿主菌中。次日挑取平板上的单菌落于含100μg/ml的KanaLB液体培养基中，37℃220rpm过夜培养。将过夜培养的重组菌液分别以1:100的比例接种到新鲜的KanaLB液体培养基中，将培养基置于摇床37℃、220rpm培养其OD值达到0.6，各取1mL菌液作为阴性对照，剩余菌液加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃、220rpm摇菌5h，收菌。2.2.3.3表达产物的SDS-PAGE分析12 中国农业科学院硕士及学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立(1)蛋白样品的处理：将收集的诱导前与诱导后的各1mL菌液，12000rpm离心1min，弃去上清，菌体沉淀用100μL1×PBS重悬，然后加入约33μL的4×lodingbuffer（含β巯基乙醇），放入锅中煮沸，时间约为10min。将样品放入离心机中，12000rpm离心1min，准备上样。(2)SDS-PAGE凝胶电泳：洗净玻璃板，晾干。夹好玻璃板，将制好的12%的SDS丙烯酰胺分离胶约7mL迅速灌入玻离板的间隙中，加入无水乙醇将胶液面压平。室温静置30min左右，待分离胶凝固后，倒出无水乙醇，用纸巾吸尽残留的液体。再用移液枪将2.5M的5%浓缩胶灌入分离胶上，迅速插入样梳，室温静止直至胶凝固。拔出样梳，将其放入电泳槽中，固定好电泳装置，向电泳槽中加入1×Tris甘氨酸电泳缓冲液。用微量移液器分别取10μL的样品与蛋白质分子质量标准加入到不同的样孔中，接通电源后，以恒压80V使溴酚蓝跑出浓缩胶，再调电压至120V，待溴酚蓝跑至胶底部，断开电源，取出凝胶。用小刀轻轻将玻璃板撬开，并将浓缩胶刮去，然后将其放入到150mL培养皿中，加入考马斯亮蓝R-250染色2h后，倒掉染色液；加入脱色液，脱色1h，弃去脱色液，换入新的脱色液继续脱色直至出现清晰的条带，取出凝胶，放入凝胶成像系统的暗箱，拍照并保存图片。2.2.3.4重组蛋白表达的形式确定在确定重组蛋白表达后，重新挑取平板上的单菌落，接入到含100μg/ml的卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃220rpm过夜培养，按照2.2.3.2的方法进行诱导表达，收集菌体沉淀。将收集的菌体沉淀用1×PBS重悬，置于冰上，进行超声破碎；频率为超声3s停1s，大约30min后，若溶液不粘稠并且比较透亮的时候即可停止超声。将溶液倒入离心管中，4℃12000rpm离心10min，分离上清与沉淀，进行SDS-PAGE鉴定。2.2.3.5重组蛋白诱导条件的摸索(1)重组蛋白诱导时间的优化：根据前人的研究，将IPTG的诱导浓度暂定为1mmol/L。将过夜诱导的重组菌液，以1:100的比例接种到新鲜培养基中，培养至菌液OD值达到0.6时（一般活化时间约为3h），加入IPTG至终浓度为1mmol/L，分别在诱导后0、2、4、6、8h取样，之后做SDS-PAGE分析。(2)重组蛋白IPTG诱导剂量的优化:在确定重组蛋白最佳诱导时间后，对重组蛋白IPTG诱导剂量进行优化。将过夜诱导的菌液，以1:100的比例接种到新鲜培养基中，活化3h后，用摇菌瓶分别取3mL的菌液，分别加IPTG至浓度为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1mmol/L，最佳时间诱导后，取样留作SDS-PAGE分析。2.2.3.6重组蛋白的大量表达确定重组蛋白的最佳诱导时间以及最佳诱导剂量后，对EF2蛋白进行大量表达。将过夜培养的重组菌液接入到500mL新鲜培养基中，活化3h后，分别加入IPTG至最佳诱导浓度，最佳时13 中国农业科学院硕士及学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立间诱导后收菌。12000rpm离心30min后，弃掉上清，用20mL1×PBS溶液将菌体沉淀吹打混匀，超声破碎后分离上清沉淀。2.2.4EF2蛋白的纯化与鉴定2.2.4.1包涵体的裂解用1×IB洗液（1%Triton-100,10mMEDTA,20mMTris-HclpH7.6）将包涵体反复吹洗，之后在4℃高速离心机8000rpm离心10min，弃掉上清后，用1×IB洗液重复洗涤两次，最后一次将混合液转移至事先称重的离心管中，离心后对装有包涵体的离心管称重，计算出包涵体的湿重。根据包涵体的湿重，以20：1的比例加入8M尿素溶液裂解包涵体，待混合液清亮后，离心取上清。2.2.4.2重组蛋白的纯化本文构建的pET-28a-EF2重组质粒以包涵体的形式表达，纯化方法采用NI-NTA亲和层析方法。纯化EF2蛋白的溶液:A液（20mMNaH2PO4.2H2O,0.5MNacl,8MUrea,20mMImidazole，pH7.6），B液（20mMNaH2PO4.2H2O,0.5MNacl,8MUrea,500mMImidazole，pH7.6），纯化步骤如下：(1)取离心后的包涵体裂解液，分别用0.22μL的过滤器过滤除菌。过滤后，根据上清的体积，按照4：1的比例加入NI-NTA结合树脂，将混合液置于摇床上，28℃，200rpm孵育2h。(2)将混合液装入亲和柱，静止20min后，让混合液依靠重力的作用流出。(3)将A液与B液以不同的比例相混合，配成不同浓度的咪唑溶液，并用它们对混合液进行漂洗。(4)加入洗脱缓冲液B液，将目的蛋白洗脱下来。2.2.4.3重组蛋白的Westernblot检测分析为了检测表达的EF2蛋白是否有反应活性，采用Westernblot的方法对其进行检测分析。采用的是半干转法，操作步骤如下：(1)重组蛋白经SDS-PAGE分离后，将凝胶从玻璃夹板中取出，刮除浓缩胶，并将凝胶放入转膜缓冲液中。(2)根据凝胶大小裁剪一张PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）以及两张厚约3mm的滤纸，将PVDF膜放入甲醇中活化约30s后，同滤纸一并放入转膜缓冲液中。按照滤纸(正极)-PVDF膜-凝胶-滤纸（负极）的顺序正放入半干转装置，盖上盖后，接通电源，15V转膜1h。(3)取下PVDF膜，加入约15mL的封闭液（含5%的脱脂奶粉的1×PBS溶液），4℃过夜封闭。14 中国农业科学院硕士及学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立(4)倒掉封闭液，加入用封闭液1:400倍稀释的PRRSV阳性血清，在摇床上孵育1h。(5)倒掉稀释后的PRRSV阳性血清，用1×PBST洗涤三次，每次在摇床上洗涤时间为5min。(6)加入用封闭液1:2000倍稀释的HRP标记的兔抗猪IgG，在摇床上孵育1h。(7)倒掉二抗，1×PBST洗涤三次，每次在摇床上洗涤时间为5min。(8)尽可能除去PVDF膜上的PBST，加入ECL工作液，在暗室曝光显色。(9)将膜放入凝胶成像系统暗箱，拍照，保存图片。2.2.4.4包涵体溶液的复性由于包涵体中含有8MUrea，处于变性状态，需要对其进行透析恢复其活性，采用的方法是尿素梯度透析法，步骤如下:(1)将蛋白溶液转至透析袋中（在透析袋中加入甘油，使甘油的终浓度为30％），绑好透析袋后，将透析袋放入C液中（20mMTris-Hcl,8MUrea,pH8.0）,4℃透析3h。(2)将透析袋转移至D液（20mMTris-Hcl,4MUrea,pH8.0），4℃透析3h。(3)将透析袋转移至E液（20mMTris-Hcl,4MUrea,1mMDTT，pH8.0），4℃透析3h。(4)将透析袋转移至E液（20mMTris-Hcl,2MUrea,pH8.0），4℃透析3h。(5)将透析袋转移至F液（20mMTris-Hcl,1mmol/L还原型谷胱甘肽和0.2mmol/L的氧化型谷胱甘肽，pH8.0），4℃透析3h(6)将透析袋至转移至G液（20mMTris-Hcl,pH8.0），4℃透析3h后，收集蛋白溶液。2.2.5EF2蛋白间接ELISA方法的建立2.2.5.1重组蛋白最佳包被浓度以及血清最佳稀释度的筛选用棋盘法确定重组蛋白的最佳包被浓度以及血清稀释度。重组蛋白经尿素梯度复性、Bradford法定量后，用碳酸盐包被液将其稀释成4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL四个浓度。以100μL/孔包被96孔ELISA酶标板，4℃过夜。37℃封闭1h后，用血清稀释液将阴性对照血清、阳性对照血清稀释成1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560个梯度，将各浓度抗原及不同浓度的血清做棋盘滴定。37℃孵育1h后，加入1：2000稀释的二抗，孵育30min，TMB显色液作用10min，硫酸溶液终止反应，用酶标仪测定各孔的D450值，根据P/N值最大筛选最适抗原包被浓度以及血清稀释度。2.2.5.2最佳二抗稀释度的筛选确定重组蛋白最佳包被浓度以及血清最佳稀释度后，进一步对二抗最佳浓度进行优化。按照间接ELISA的步骤，在加入二抗时，用血清稀释液将二抗稀释度稀释成1:1000、1:1500、1:2000、1:2500四个梯度，37℃温箱孵育30min，TMB显色液作用10min，硫酸溶液终止反应，测定D450值，根据P/N值最大确定二抗的最佳稀释度。15 中国农业科学院硕士及学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立2.2.5.3抗原抗体作用时间的选定按照已经优化好的间接ELISA步骤，对抗原与抗体作用时间进行摸索。在酶标板中加入一抗后，37℃分别孵育30min、60min、90min，测定D450值，按照P/N最大的原则选定抗原抗体的作用时间。2.2.5.4阴阳性临界值的确定为了确定阴阳性临界值，用初步建立的试验方法测定了30份PRRSV阴性健康猪血清，每一份血清重复检测一次，先测出每份样品的D450值，再用下列公式计算每份样本的S/P值，S/P=（待检血清的D450−阴性对照血清的D450）∕（阳性对照血清的D450−阴性对照血清的D450），之后计算出30份阴性血清的S/P的平均值（x）以及其标准差（s），根据所有血清（S/P）的平均值（x）和标准差（S）建立判定标准，把x＋2S作为判定该方法的阴阳性临界值。2.2.5.5特异性试验按以上方法确定本ELISA方法的临界值后，用本方法检测猪瘟病毒（CSFV）阳性血清、猪伪狂犬病毒（PRV）阳性血清、O型口蹄疫病毒（FMDV）阳性血清各1份，以确定EF2蛋白是否与其它病毒阳性血清存在交叉反应。并根据30份PRRSV阴性健康猪血清的检测结果，分析本方法的特异性。2.2.5.6敏感性试验用建立的ELISA方法检测133份PRRSV感染后出现病毒血症的猪血清，并且这些血清经N蛋白抗体检测为阳性，用于分析所建立ELISA检测方法的敏感性。2.2.5.7重复性试验用同一批纯化的重组蛋白包被96孔酶标板，用来检测6份抗体水平不同的猪血清，每份血清重复检测6次，计算批内重复系数；选取6份PRRSV抗体水平不同的血清，用不同批次包被的96孔酶标板检测，计算批间重复系数。2.2.5.8符合性实验用所建立的EF2-ELISA方法、法国LSI与北京世纪元亨商品化ELISA试剂盒分别检测PRRSV攻毒第3~126天共365份猪血清样本，比较EF2-ELISA检测结果与这两种商品化试剂盒检测结果的符合程度，并分析猪血清样本中PRRSV抗体水平与NSP2抗体水平的差异。16 中国农业科学院硕士及学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立2.3结果2.3.1目的片段的扩增以GSWW毒株cDNA为模板，设计一对特异性引物扩增NSP2的抗原表位区，PCR结果显示，扩增出一条750bp大小的片段,与预期结果相符。图2.1EF2的PCR扩增Fig.2.1PCRamplificationofEF2M,Trans2KplusⅡDNAMarker;1,EF2的PCR产物,2,阴性对照M,Trans2KplusⅡDNAMarker;1:PCR-amplifiedEF2gene;2:Negativecontrol2.3.2重组质粒的鉴定重组质粒经酶BamHI、NcoI双酶切后，在5271和750bp处出现单一条带，与预期结果大小相符（图2.2），表明重组质粒构建成功。图2.2pET-28a-EF2的酶切鉴定Fig.2.2RestrictiondigestionidentificationofpET-28a-EF2M,Trans2KplusⅡDNAMarker;1,pET-28a-EF2的酶切鉴定M,Trans2KplusⅡDNAMarker;1,RestrictiondigestionidentificationofpET-28a-EF22.3.3EF2蛋白的表达17 中国农业科学院硕士及学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立重组质粒pET-28a-EF2经1mmol/LIPTG诱导后，在大肠杆菌中得以表达，大小约为29ku，与预期目标大小相近。EF2蛋白最佳诱导时间是8h（图2.3），不同IPTG浓度诱导条件下，EF2表达量无明显变化（图2.4）。分离上清与沉淀，经SDS-PAGE分析，EF2蛋白以包涵体的形式表达（图2.5）。图2.3不同诱导时间下EF2重组蛋白表达的结果Fig2.3ResultofEF2indifferentinductiontimeM,MulticolorBroadRangeProteinLadder;1-5,pET-28a-EF2在大肠杆菌分别诱导8、6、4、2、0h的表达产物;M,MulticolorBroadRangeProteinLadder;1-5,pET-28a-EF2/E.coliexpressedproductsinducedfor8,6,4,2,0hrespectively图2.4不同IPTG浓度下EF2的表达的结果Fig.2.4ResultofEF2underdifferentIPTGconcentrationconditionsM,MulticolorBroadRangeProteinLadder;1-6,pET-28a-EF2在0,0.2,0.40.60.8,1mmol/LIPTG诱导下的全蛋白.M,MulticolorBroadRangeProteinLadder;1-6,pET-28a-EF2inducedbyIPTGat0,0.2,0.40.60.8,1mmol/Lconcentration.18 中国农业科学院硕士及学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立图2.5EF2蛋白的可溶性分析Fig.2.5ThesolubleanalysisofEF2proteinM,MulticolorBroadRangeProteinLadder;1,EF2上清;2,EF2沉淀M,MulticolorBroadRangeProteinLadder;1,thesupenrnatantofEF2;2,theprecipitationofEF22.3.4EF2蛋白的纯化及Westernblot检测分析重组蛋白经镍柱亲和层析纯化以后，获得了较纯的目的条带；经Westernblot检测分析，该重组蛋白能与PRRSV阳性血清发生反应，证明该重组蛋白具有良好的反应活性。图2.6EF2蛋白的纯化图2.7EF2Western-blot分析Fig.2.6PurificationoftheEF2proteinFig.2.7Western-blotanalysisofEF2proteinM,MulticolorBroadRangeProteinLadder;M,PageRulerprestainedProteinLadder;1-3,纯化的EF2蛋白1,EF2蛋白;2,pET-28a（+）空载体M,MulticolorBroadRangeProteinLadder;M,MulticolorBroadRangeProteinLadder1-3,ThepurifiedEF2protein1,EF2protein;2,pET-28a（+）vector2.3.5重组蛋白最佳包被浓度以及最佳血清稀释度的确定19 中国农业科学院硕士及学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立将重组蛋白分别以4μg/mL、2μgmL、1μg/mL、0.5μg/mL包被96孔酶标板，将阴阳性血清以1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280、1：2560梯度稀释，做棋盘法滴定，根据P/N最大，筛选出重组蛋白最佳包被浓度为1μg/mL、血清稀释倍数为1：20倍稀释。图2.8抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定Fig.2.8Determinationofoptimalantigencoatingconcentrationandserumdilution2.3.6抗原抗体作用时间的选定在酶标板中加入一抗，37℃孵育不同时间后，D450值也出现了不同，在这几个时间点中，抗原抗体作用时间30min时P/N值最大，选定30min为抗原抗体作用时间。表2.6抗原抗体作用时间的确定Table2.6Determinationofantigen-antibodyreactiontime反应时间（min）阳性血清D450阴性血清D450P/NReactiontimePositiveserumD450NegativeserumD450302.020.14514.0601.750.15311.44902.960.23612.542.3.7酶标抗体最佳稀释度的确定将二抗稀释成不同浓度后，加入酶标板中，与一抗反应30min，弃去反应液。用PBST溶液洗涤三遍，显色，终止，结果表明，二抗以1:1000稀释与1:2000稀释时P/N值较大，且P/N值大小相近，但当二抗以1:1000稀释时，阳性血清D450值太高（D450为3.33），并且二抗以1:2000稀释时更能节约抗体。最后确定二抗以1:2000稀释最佳。20 中国农业科学院硕士及学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立表2.7酶标抗体的最佳浓度的确定Table2.7Determinationofoptimalsecond-antibodydilution酶标二抗的稀释度阳性血清D450阴性血清D450P/NDilutionofenzyme-labelledPositiveserumD450NegativeserumD450secondaryantibody1:10003.330.21215.701:15002.210.14415.351:20001.910.12115.791:25001.490.11812.632.3.8重复性实验重复性实验结果显示，用初步建立的间接ELISA方法检测6份抗体水平不同的血清，批内重复系数在3.8%~6.8%之间，批间重复系数在4%~8.6%之间，结果表明，初步建立的间接ELISA方法重复性良好。表2.8批内重复性实验结果Table2.8Thereproducibilitytestinthesameplates血清重复次数Repetitions平均标准变异编号值差系数/%SerumxsCV123456No.11.211.151.221.111.171.141.170.0423.621.121.091.181.1321.291.261.180.8066.830.7650.7060.7820.7710.7460.6820.7420.045.441.501.461.431.461.531.371.460.0563.850.7220.7380.6830.7740.7920.7520.7430.0395.260.7200.7440.7050.7490.6580.6930.7120.0344.8表2.9批间重复实验结果Table2.9Thereproducibilitytestindifferentplates血清编号批次batch平均值标准差变异系数/%SerumNo1234xsCV11.311.111.331.241.250.0840.06721.491.311.391.401.400.0640.0530.8140.6530.7190.6780.7160.0610.08641.821.641.671.721.710.0680.0450.7430.6720.6550.6830.670.0320.04860.7820.8190.8460.8790.7820.0420.05421 中国农业科学院硕士学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立2.3.9阴阳性临界值的确定为了判定阴阳性临界值，用初步建立的实验方法测定了30份阴性血清，每一份血清重复检测一次，先测出每份样本的D450值，再用下列公式计算出每份样本的S/P值，S/P=（待检血清的D450−阴性对照血清的D450）∕（阳性对照血清的D450−阴性对照血清的D450），计算出30份阴性血清的S/P平均值（x）为0.0699，标准差（S）为0.0498，根据所有血清S/P的平均值（x）和标准差（S）建立判定标准，把x＋2S作为判定该方法的阴阳性临界值，临界值为0.17。2.3.10特异性分析结果包被的EF2蛋白只与PRRSV阳性血清发生反应，与猪瘟病毒（CSFV）阳性血清、猪伪狂犬病毒（PRV）阳性血清、口蹄疫病毒（FMDV）阳性血清的反应值都在临界值以下，检测30份PRRSV非免疫健康猪血清，均为阴性，表明本实验建立的方法具有较好的特异性。2.3.11敏感性分析结果用建立的ELISA方法检测133份出现病毒血症的PRRSV猪阳性血清，检出阳性血清样本数为118份，敏感性为88.7%。2.3.12符合性实验结果用建立的方法以及商品化试剂盒检测PRRSV攻毒后365份猪血清样本，用法国LSI商品化试剂盒检出169份阳性血清、196份阴性血清；北京世纪元亨商品化试剂盒检出162份阳性血清、203份阴性血清；而用本试验建立的EF2-ELISA检出178份阳性血清、187份阴性血清，与法国LSI商品化试剂盒相比，总体符合率为73.1%（267/365）；与北京世纪元亨商品化试剂盒相比，总体符合率为77.2%（282/365）。通过比较感染猪血清的NSP2抗体水平以及PRRSV抗体水平，发现在攻毒后第3天，2份血清出现针对NSP2的抗体，在感染后35天，8份血清出现针对NSP2的抗体（表2.10）。对比实验结果表明，本次建立的方法与商品化试剂盒检出的阳性份数相近，但是符合率并不是特别高，攻毒后的血清抗体水平呈现上升的趋势，但是由于猪体个体差异以及其他因素，抗体水平增长规律并不明显。22 中国农业科学院硕士学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立表2.10早期PRRSV抗体与NSP2蛋白抗体的对比分析结果Table2.10ComparingthecoincidenceofantibodyresponsesagainstPRRSVandNSP2intheearlytimeofPRRSVinfection感染天数血清份数EF2-ELISALSI-ELISA一一对应符合数阳性数/阴性数阳性数/阴性数阳性符合数/阴性符合数InfectiondaysNo.ofserumPositiveNo./PositiveNo./ThecoincidentNo.ofsamplesnegativeNo.bynegativeNo.byPositive/NegativeEF2-ELISALSI-ELISA0260/260/260/263262/241/250/237253/223/220/1914254/212/231/2021255/207/181/1428246/186/182/1435248/168/164/1223 中国农业科学院硕士学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立图2.9NSP2与PRRSV抗体的对比检测Fig.2.9ComparingtheantibodylevelagainstNproteinandNSP2ofPRRSVA,C:攻毒动物PRRSVNSP2抗体水平B,D:攻毒动物PRRSV抗体水平E:同居感染动物PRRSVNSP2抗体水平F:同居感染动物PRRSV抗体水平A,C:theNSP2antibodylevelofinoculatedanimals.B,D:thePRRSVantibodylevelofinoculatedanimals.E:theNSP2antibodylevelofcontactedinfectedanimals.F:thePRRSVantibodylevelofcontactedinfectedanimals.注：左侧图的cut-off值为0.17，右侧图的cut-off值为0.2Note:Thecut-offvalueofpictureontheleft/ontherightare0.17，0.2respectively2.4讨论猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2是PRRSV复制相关的最大的非结构蛋白，它具有耐受基因突变、插入以及缺失的能力（Fangetal.,2008）。由于它在各个毒株中的显著差异性，使得它在监测PRRSV的基因演变方面发挥着重要的作用。NSP2上存在着许多B细胞线性表位，Oleksiewicz等利用噬菌体展示技术在PRRSV111/92株NSP2中鉴定出6个线性表位；DeLimaM在PRRSVNVSL97-7985株NSP2上鉴定出18个线性表位，这些线性表位24 中国农业科学院硕士学位论文第二章PRRSVEF2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立都能与大约50%的试验血清样本反应，其中有10个线性表位能与80%~100%的试验血清样本反应；YulinYan等利用肽扫描技术、单克隆抗体筛选欧洲型在BJ-4株NSP2中鉴定出4个新的线性表位；祖春波等利用肽扫描技术在TPP60株NSP2中筛选到了2个线性表位（Oleksiewiczetal.,2001;deLimaetal.,2006;Yanetal.,2007；祖春波等，2010）。这些表位大多数都具有良好的免疫原性，并且其中一些表位相对保守。本文在前人的研究基础上，结合本实验室分离的PRRSV毒株特点，对GSWW毒株NSP2富含表位的区域分段扩增，并在设计引物时，引入了6个组氨酸标签，目的是便于后续蛋白的纯化。总共将NSP2分为四段（EF1:1-254aa，EF2:226-475aa，EF3:422-663aa，EF4:601-850aa），成功表达了其中两段(EF1、EF2)，剩下两段在更换载体后仍然未表达，这可能与表达的两段基因序列位于NSP2的高疏水区域有关。表达的EF2重组蛋白不管是在低温诱导还是在37℃诱导的条件下都是以包涵体的形式表达，经过Westernblot检测，该重组蛋白具有良好的反应性。蛋白纯化方法的选择要依据蛋白本身的特点以及它在大肠杆菌中表达的形式而定，但是即使选择同样的方法，不同的操作步骤结果也有所不同。在纯化EF2重组蛋白时，选择了亲和层析中咪唑梯度纯化以及pH梯度纯化的方法。咪唑梯度洗脱中，杂蛋白在20mM咪唑浓度时能大量洗脱，随着咪唑浓度的递增，目的蛋白能在80mM咪唑浓度洗脱下来；用pH梯度纯化EF2重组蛋白的效果与咪唑梯度纯化效果相似。ELISA方法具有特异性强、敏感性高、耗时短、对实验要求不高等优点，广泛应用于动物传染病流行病学调查以及动物疫病的大规模检疫。林华等在2006年以NSP2截短蛋白为抗原，建立了NSP2-ELISA方法，可用作PRRSV的流行病学监测。本实验在对表达的EF2重组蛋白复性、定量后，用重组蛋白作为包被抗原，初步建立了检测PRRS血清抗体的间接ELISA方法。笔者对抗原的包被浓度、一抗的稀释度、抗原抗体的作用时间等条件进行了筛选，发现每一个条件的改变都会导致ELISA读数的变化，影响最终结果。所以，在操作的过程中，尽量做到操作的标准化，以减少对读数的影响；同时计算样本OD值相对于阳性对照的比值作为血清抗体效价，可以一定程度上消除系统误差。本研究建立的方法具有较好的特异性、敏感性以及重复性。用建立的方法以及商品化试剂盒检测PRRSV攻毒后365份猪血清样本，用法国LSI商品化试剂盒检出169份阳性血清、196份阴性血清；北京世纪元亨商品化试剂盒检出162份阳性血清、203份阴性血清；而用本试验建立的EF2-ELISA检出178份阳性血清、187份阴性血清，与法国LSI商品化试剂盒相比，总体符合率为73.1%；与北京世纪元亨商品化试剂盒相比，总体符合率为77.2%。符合率并不是特别高，一方面可能是各个方法的判定标准不同，导致最终结果的偏差；另一方面世纪元亨以PRRSV全病毒包被，法国LSI试剂盒是以膜蛋白包被，而本研究建立的方法是以NSP2的截短片段包被，PRRSV血清抗体针对的表位以及数量不同，所以反应的血清样本数也有所不同。25 中国农业科学院硕士学位论文第三章GD2蛋白的诱导表达及单克隆抗体制备第三章GD2蛋白的诱导表达及单克隆抗体制备NSP2是PRRSV最大的非结构蛋白，可以容许大片段的缺失，而对病毒复制没有影响，高致病性PRRSV存30个氨基酸的不连续缺失；最近出现的NADC30样毒株则存在110个氨基酸的连续缺失，通过反向遗传学技术也证明，NSP2区存在多个复制非必需区，是研制表位缺失标记疫苗的候选区段。在前述成功表达EF2蛋白的基础上（NSP2第226-475位氨基酸），采用基因优化合成的方法，委托公司优化合成GSWW毒株NSP2第2226-3110bp（298-592aa）区域（命名为GD2），并构建了GD2的表达载体pET-30a-GD2，以期表达更长的NSP2表位区蛋白，用于单克隆抗体的制备，为后续鉴定GSWW毒株NSP2的保守优势抗原表位以及建立基于单克隆抗体的阻断ELISA方法奠定基础。相比较EF2蛋白，GD2包含了EF2中含有的主要抗原表位，而且含有的已鉴定抗原表位更多，有利于筛选获得更多的针对不同表位的单克隆抗体。旨在为研制NSP2保守优势表位缺失疫苗毒株和配套鉴别诊断方法奠定基础。3.1材料异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、十二烷基硫酸钠（SDS）、硫酸卡那霉素、二硫苏糖醇（DTT）均购于Amresco公司蛋白分子质量标准购自于塞默飞世尔科技公司。3.2方法3.2.1基因合成表达NSP2第2226-3110bp（命名为GD2）的重组表达质粒pET-30a-GD2委托金唯智公司合成和构建，氨基酸序列参考PRRSV/GSWW/15毒株的NSP2氨基酸序列，按照大肠杆菌的密码子偏嗜性进行编码序列优化合成，合成序列通过NcoI和HindIII位点插入pET30a载体中，构建表达载体pET-30a-GD2用于表达目的蛋白。3.2.2GD2蛋白的表达将pET-30a-GD2质粒按照2.2.2.3的方法转入Rosetta-gami2（DE3）pLys宿主菌中。次日挑取平板上的单菌落接种于含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃220rpm过夜培养。将过夜培养的重组菌液分别以1:100的比例接种到新鲜的卡那抗性LB液体培养基中，将培养基置于摇床37℃、220rpm培养其OD值达到0.6，取1mL菌液作为阴性对照，剩余菌液加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃、220rpm摇菌5h，收菌。3.2.3GD2蛋白表达的形式确定26 中国农业科学院硕士学位论文第三章GD2蛋白的诱导表达及单克隆抗体制备在确定重组蛋白表达后，重新挑取平板上的单菌落，接入到含100μg/ml的卡那抗性LB液体培养基中，37℃220rpm过夜培养，按照2.2.3.2的方法进行诱导表达，收集菌体沉淀。将收集的菌体沉淀用1×PBS重悬，置于冰上，进行超声破碎；频率为超声3s停1s，大约30min后，若溶液不粘稠且较透亮的时即可停止超声。将溶液倒入离心管中，4℃12000rpm离心10min，分离上清与沉淀，进行SDS-PAGE鉴定。3.2.4GD2蛋白的纯化与鉴定3.2.4.1GD2蛋白的纯化由于pET-30a-GD2重组菌诱导后以可溶性形式表达GD2蛋白，纯化该蛋白时所用溶液应不含变性剂。纯化GD2蛋白的溶液：H液（20mMNaH2PO4.2H2O,0.5MNacl,20mMImidazole,pH7.6），I液（20mMNaH2PO4.2H2O,0.5MNacl,500mMImidazole,pH7.6），纯化步骤如下：(1)取离心后的蛋白上清溶液，用0.22μL的过滤器过滤除菌，过滤后，根据上清的体积，按照4∶1的比例加入NI-NTA结合树脂，将混合液置于摇床上，28℃，200rpm孵育2h。(2)在亲合柱中加入该混合液，静止一段时间后，让混合液依靠重力的作用流出。(3)用H液对混合液进行漂洗，再用H液与I液配成不同的咪唑梯度溶液，对混合液进行漂洗与洗脱。(4)用I液洗脱目的蛋白。3.2.4.2GD2蛋白的Westernblot检测分析为了检测表达的重组蛋白是否有反应性，采用Westernblot的方法对其进行检测分析。经SDS-PAGE分离的重组蛋白转移至经甲醇活化的PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）上，使用半干转膜仪在恒压为15V的条件转1h。取出PVDF膜，放入培养皿中，以1:200的比例加入PRRSV阳性血清，4℃孵育过夜，PBST洗涤3次；按1:2000的比例加入HRP标记的兔抗猪IgG孵育1h，PBST洗涤3次后，用去离子水尽量除去PBS，加入ECL工作液，在暗室曝光显色。3.2.4.3GD2蛋白单克隆抗体的制备将GD2纯化蛋白（纯度约为90%）2mg送武汉金开瑞生物有限公司用于小鼠免疫和单克隆抗体的制备，按小鼠单克隆抗体制备的常规方法进行，主要步骤简述如下：（1）动物的免疫：选取8只BALB/C小鼠，将纯化的GD2蛋白作为抗原，以50ug/只的剂量免疫小鼠，免疫途径为腹腔皮下注射，共免疫四次，一免抗原加入等量的完全佛氏27 中国农业科学院硕士学位论文第三章GD2蛋白的诱导表达及单克隆抗体制备佐剂，二免、三免、四免抗原加入等量的不完全佛氏佐剂。免疫程序结束后，采集血清，用间接ELISA的方法检测血清效价。（2）脾细胞与S/P20骨髓瘤细胞的融合：选取2只抗体效价较高的小鼠分离脾细胞，与骨髓瘤细胞进行融合，然后在HAT选择性培养基中生长。（3）单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选：主要的流程包括饲养细胞的制备，有限稀释法获得单细胞克隆，GD2抗原包被酶标板进行分泌抗体的单细胞克隆检测，阳性细胞克隆的扩大培养、亚型的鉴定以及腹水的制备。（4）腹水的制备与纯化：小鼠在注射杂交瘤细胞之前1~2周腹腔注射降植烷处理，然后腹腔注射1×106个细胞，饲养5~7天，每天观察腹水产生情况，采集小鼠腹水用于单抗纯化。（5）亲和层析的方法纯化腹水：采用蛋白G亲合层析柱进行腹水抗体纯化，按说明书进行。3.2.4.4单克隆抗体的鉴定利用GD2抗原包被酶标板，进行叠加间接ELISA，对筛选到的单抗进行初步归类，判断其是否识别同一表位。单克隆抗体的分类与亚类鉴定，均由武汉金开瑞公司完成。单克隆抗体的免疫印迹鉴定：将表达纯化的EF2与GD2蛋白加入SDS-PAGE胶，进行电泳后转印至PVDF膜，将转印膜切为膜条，分别与不同的单克隆抗体反应，然后加入HRP标记的抗小鼠IgG的二抗，每步之间充分洗涤，加入ECL显色液显色，然后进行压片曝光。3.3结果3.3.1GD2蛋白的纯化及Westernblot检测分析表达GD2的重组菌经1mmol/LIPTG诱导后，成功表达出了大小约为47ku的特异性蛋白，与预期目标蛋白大小相近。分离细菌裂解上清与沉淀，经SDS-PAGE分析，GD2蛋白主要以可溶性蛋白表达。GD2蛋白经镍柱亲和层析纯化以后，获得了较纯的目的条带（图3.1）；经Westernblot检测分析，该重组蛋白能与PRRSV阳性血清发生反应，证明该重组蛋白具有良好的反应活性（图3.2）。28 中国农业科学院硕士学位论文第三章GD2蛋白的诱导表达及单克隆抗体制备图3.1GD2蛋白的纯化图3.2GD2的Western-blot分析Fig.3.1PurificationoftheGD2proteinFig.3.2Western-blotanalysisofGD2proteinM,PageRulerprestainedProteinLadder;M,PageRulerprestainedProteinLadder1-3,纯化的GD2蛋白1,GD2蛋白;2,pET-30a（+）空载体M,PageRulerprestainedProteinLadder;M,PageRulerprestainedProteinLadder1-3,ThepurifiedGD2protein1,GD2protein;2,pET-30a（+）vector3.3.2单克隆抗体鉴定结果共筛出9株GD2阳性杂交瘤细胞株，细胞上清经叠加ELISA进行表位验证，9株单抗可识别4组不同表位，且亚型鉴定结果显示均为单一亚型，抗体亚型与识别表位如下表所示。2FB4（2F124B4）、10CD3（10C91D3）、F1D8（1F14D8）、G9D9（3G92D9）四个效价最高的杂交瘤细胞株用于腹水抗体制备。表3.1利用GD2蛋白制备单抗亚型与识别表位初步归类Table3.1theisotypeofMabsagainstGD2proteinandgroupingtheMabsbyrecognizedEpitope细胞株号Strains抗体亚型Isotype表位归类Epitopes2F124B4IgG2b表位34G73E5IgG1表位110C91D3IgG2b表位21F14D8IgG2a表位11A125E7IgG1表位33G92D9IgG2b表位45H102D3IgG2b表位13A51D2IgG1表位18D81D8IgG1表位13.3.3单克隆抗体的Westernblot检测29 中国农业科学院硕士学位论文第三章GD2蛋白的诱导表达及单克隆抗体制备Westernblot显示4株单克隆抗体（2FB4、10CD3、F1D8、G9D9）均能与EF2蛋白（NSP2226-475aa）以及GD2蛋白（NSP2298-592aa）反应，但反应活性有差异，说明4株单抗识别的表位位于NSP2第298~475位氨基酸之间。还需要对单抗识别的表位序列，以及是否识别自然的免疫优势表位进行进一步鉴定。图3.3EF2与不同单抗反应的结果Fig.3.3EF2withdifferentmonoclonalantibodyreactionresults图3.4GD2与不同单抗反应的结果Fig.3.4GD2withdifferentmonoclonalantibodyreactionresults3.4讨论单克隆抗体广泛应用于抗原表位鉴定、病毒的生物学特性研究中。制备NSP2单克隆抗体对NSP2表位的鉴定有着重要的意义，但是由于PRRSVNSP2太大，C端存在高疏水区，很难表达全长蛋白。本文选择对NSP2富含表位区进行表达，由于表达出来的EF2蛋白是以包涵体的形式存在，为了保证蛋白的活性，需要对其进行复性，而蛋白的复性是一个很复杂的过程，复性出来的蛋白有可能发生错误折叠，从而影响蛋白的生物学特性，进一步可能影响到单克隆抗体的制备，所以在本实验进行的中后期，委托公司优化合成GSWW毒株NSP2第2226-3110bp（298-592aa）区域（GD2），该区域较EF2长，并且与EF2有重叠的部分。GD2重组蛋白是以可溶蛋白的形式表达于大肠杆菌中，相比较而言生物活性更好，更适合用于研制单克隆抗体，进行表位鉴定。在GD2蛋白纯化时不能以变性的方式纯化，纯化的难度大于EF2重组蛋白。最初纯化该蛋白是以亲和层析的方法纯化，在用咪唑梯度去除杂蛋白的过程中，效果不理想，通过改进方法，在漂洗液与洗脱液中加入10%TritonX-100阻断杂蛋白的结合、减少了蛋白溶液与树脂结合的时间，分步多次洗涤结合蛋白，最终达到了所需要的蛋白纯度。利用可溶性的GD2蛋白制备了9株针对NSP2表位区的单抗，初步分析，9株单抗识别4个不同的抗原表位，免疫印迹检测显示4株腹水抗体与表达的EF2与GD2蛋白均有反应，说明这4株单抗识别的表位位于NSP2第298~475位氨基酸之间，但其识别表位的保守性与免疫原性还有待进一步研究。以EF2为抗原建立的间接ELISA检测结果显示，通过检测NSP2表位区抗体，可以进行PRRSV感染状况检测；在NSP2表位区是否存在基因型内或型间保守的优势抗原表位，现在还没有明确的结论，NSP2单克隆抗体的制备就为发现NSP2蛋白中保守优势抗原表位奠定了基础。NSP2的表位区存在可缺失区，是研制表位缺失标记疫苗的靶标区域，本研究也为鉴定可缺失的优势抗原表位以及标记疫苗奠定了基础，相关研究正在进行之中。30 中国农业科学院硕士学位论文第四章全文结论第四章全文结论1.成功扩增了PRRSVGSWWNSP2免疫原性较好的区域（NSP2226-475aa），并构建了pET-28a-EF2表达载体；原核表达并纯化了EF2蛋白以及GD2蛋白，蛋白免疫印迹试验表明两个蛋白具有较好的反应活性。2.以EF2重组蛋白为包被抗原，建立了检测PRRSV血清抗体的间接ELISA方法,用建立的方法检测PRRSV感染后第3～126天的365份猪血清，与LSI商品化试剂盒相比，符合率为73.1%；与世纪元亨商品化试剂盒相比，符合率为77.2%。分析血清抗体水平可知，在感染3天，即可检测到NSP2抗体，NSP2抗体应答时间较膜蛋白抗体应答时间无明显差异；结果表明，所建立的ELISA方法可用做PRRSV抗体的临床检测。3．针对GD2蛋白总共制备了9株单克隆抗体，分别识别4个表位。选择4株单抗制备腹水抗体，均能与表达的EF2和GD2蛋白反应，为后续鉴定NSP2表位、建立基于单抗的NSP2阻断ELISA抗体检测方法以及研制PRRSV表位缺失标记疫苗奠定了基础。31 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中国农业科学院硕士学位论文作者简介作者简介胡荣，女，1991年1月生，苗族，湖北恩施人。2010-2014年在青岛农业大学海都学院动物科技学院动物医学专业学习，并获得农学学士学位。2014年9月考入中国农业科学院兰州兽医研究所，攻读硕士学位，在宿主抗病毒感染与免疫生物学团队进行硕士课题研究。硕士期间发表的文章：胡荣,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2抗原位点区的原核表达及免疫原性分析.[J].中国畜牧兽医，2017，已接收。40