猪繁殖与呼吸综合征病毒受体唾液酸粘附素V-set结构域的真核细胞表达及结构预测

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河南农业大学学术硕士学位论文题目：猪繁殖与呼吸综合征病毒受体唾液酸粘附素V-set结构域的真核细胞表达及结构预测学位申请人姓名侯婕导师姓名张改平院士学科专业预防兽医学研究方向畜禽疫病病原与分子免疫学中国郑州2016年6月 分类号密级河南农业大学硕士学位论文论文题目：猪繁殖与呼吸综合征病毒受体唾液酸粘附素V-set结构域的真核细胞表达及结构预测英文题目：EukaryoticExpressionandStructuralPredictionofSialoadhesinV-setIg-likeDomainDerivedfromSwineandAssociatedwithPRRSVInfection学位申请人：侯婕导师：张改平院士专业：预防兽医学研究方向：畜禽疫病病原与分子免疫学论文提交学位授予日期：日期： 可南农业学学位论文独创性声明、使用授权知识产权归属承诺书＾＾学位论猪繁殖与呼吸综合征病毒受体唾液酸粘附ｉ文题目Ｖ－ｓｅｔ结构域的真核细胞表达及结构预测级别农学硕±学生学科导师侯键预防兽医学张改平＋。姓名专业姓名ＩＩ学位■论文否如需保密，解密时间年月日是否保密独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特别加Ｗｔ亦注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一同工作的同志对本研究所做的任何贡献，指导教师对此进行了审定。与我均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。＾特此声明。乃夕研究生签名；导师签名円期月去巧曰期月＾己円＾对終＾ｔ＾￥位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须ｆ按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印、刷本和电子版本，并提供目录检索和阅党服务，可Ｗ采用影印缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可用不同方式在不同Ｐ上发表、传播学位论文的全部或部分。；媒体内容人全解《河南农业大学知识产权保护办法》，ｒ本完了的有关规定在毕业离一＊业署开河后，就在间从事的科发表的所有论，第名单南农大学校期研工作文＇位为河南农业大学，验材料、原始数据、报的专利等知识产权均归河南农实申。业，否，承大学所有则粗相应的法律责任注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。＾研究尘签签；导院领导签名名师＾＝巧鬥口：月円＝日円期＾《父期年《＆期年月》成句＾ｆ 致谢本课题研究是在导师张改平院士的严格要求和悉心指导下完成的。张老师在实验选题、实验方案设计以及本人在实验过程中遇到问题的分析和解决等方面都给予了启发性的指导和帮助。在三年的学习过程中，张老师渊博的学识、科学的思维方式、广阔的思想、精益求精的治学态度、开拓创新的进取精神，不仅培养了我对科学研究的热情和兴趣，更让我学会了做人要有宽广的胸怀和广阔的气度。尤其是他崇高的敬业精神、忘我的工作作风和不懈的执着追求，给我树立了学习的榜样，将使我终生受益，在此表示深深的敬意和由衷的感谢！本研究工作具体在河南省动物免疫学重点实验室开展。感谢实验室提供优良的实验条件、学习机会和研究环境。本实验是在乔松林研究员和李睿助理研究员的悉心指导下完成的。乔松林老师严谨的科研态度和科研作风对我产生了深远的影响，衷心感谢乔老师在实验研究和论文撰写中给予的指导。感谢李睿老师在学术上的谆谆教导以及在生活中的关怀和帮助。李老师渊博的学识，严谨求实的治学态度，对科研敏锐的洞察力，与时俱进的科学思想，高昂的工作热情和锲而不舍、百折不挠的坚韧毅力都深深影响和教育了我，使我受益匪浅。非常感谢邓瑞广研究员、李秀杰书记在实验研究和生活中的关心和帮助。感谢郭军庆、邢广旭、罗俊、郅玉宝、赵东、李青梅、杨艳艳、卢清侠、刘运超、郝慧芳、程娜、杨继飞、柴书军、李学伍、郭成留、谢伟涛、胡骁飞、滕蔓、王丽、王方雨、史西保、杨苏珍、孙亚宁、何萍、陈鑫鑫、王建中、刘艳梅等老师在实验中给予的热情帮助和大力支持。感谢河南农业大学牧医工程学院宁长申教授、王川庆教授、王亚宾教授、夏平安教授、许兰菊教授、赵军教授、陈红英教授、魏战勇老师、胡慧老师、金钺老师、李新生老师、张红英老师、杨玉荣老师、张光辉老师等在学习期间给予的支持和帮助。感谢动物免疫学重点实验室的师兄赵孟孟、万博、鲍登克、王寅彪、杨兴东、赵朴、李任峰、王超、孙彦刚、刘肖、王耀、蒋大伟、王国强、王彦伟、阮涛、常咏哲、刘儒彪、贾国超；师姐张二芹、迟佳琦、王瑞宁、陈玉梅、李华玮、陈静、殷萌琪、刘畅、马红芳、宋亚鹏；感谢实验室同学丁培阳、谷雨、邓歌、王晶等及师弟师妹张腾、张冲、赵宝磊、王林建、王聚才、李会珍、田书苗、谢莎、许倩茹等在生活和实验中给予的帮助及美好回忆。感谢我在河南农业大学牧医工程学院的同学韩志霞、周金龙、崔朝辉、韩斐、I 敬文宪、冯亚琼、胡安君、张玉娟、曹树轩、张伟强、张亚楠、乔艳艳、冯艳红、何潇湘、武二丽、马金玉、马文昭、宋玉慧、崔春晓、曹贝贝、李晓静、郭天准、卢彩景、刘金玲、韩莎莎、顾阳等在文献查阅过中提供的帮助，在学习和生活中对我的关心和照顾并及时帮我传递学校最新信息。感谢参加我论文评阅和答辩的各位专家教授的指导。深深感谢我的父母含辛茹苦的养育之恩及亲戚、朋友多年来对我学业和生活上无私的支持、鼓励和关怀。再次感谢所有关心、支持、帮助我的领导、老师、同学和亲友。侯婕2016年5月II 目录中文摘要..........................................................................................................................................VAbstract...........................................................................................................................................VI第一部分文献综述.........................................................................................................................11猪繁殖与呼吸综合征概述............................................................................................................12PRRSV研究进展..........................................................................................................................12.1PRRSV的基因组特性.......................................................................................................12.2PRRSV的结构蛋白和非结构蛋白...................................................................................22.3PRRSV临床症状及病理学特征.......................................................................................32.4PRRSV流行病学...............................................................................................................42.5PRRSV致病机制研究进展...............................................................................................42.6PRRSV疫苗研究进展与防控...........................................................................................73PRRSV细胞受体研究进展..........................................................................................................83.1唾液酸粘附素概述.............................................................................................................83.2其它受体蛋白概述.............................................................................................................94蛋白质结构预测研究进展..........................................................................................................104.1蛋白质结构预测应用......................................................................................................104.2蛋白质结构预测研究方法..............................................................................................115研究目的及意义..........................................................................................................................12第二部分研究内容.......................................................................................................................13第一章SnV-setIg-like结构域在毕式酵母克隆与表达..............................................................131引言.............................................................................................................................................132材料与方法..................................................................................................................................132.1基因、菌株及载体...........................................................................................................132.2酶及主要试剂..................................................................................................................142.3试剂盒..............................................................................................................................142.4主要试剂的配制..............................................................................................................142.5主要仪器设备..................................................................................................................172.6SnV-setIg-like结构域重组载体的构建.........................................................................17III 2.7SnV-setIg-like结构域的表达.........................................................................................223结果与分析.................................................................................................................................253.1SnV-setIg-like结构域的PCR扩增结果......................................................................253.2SnV-setIg-like结构域重组载体的菌落PCR鉴定结果..............................................253.3SnV-setIg-like结构域重组菌株的菌落PCR鉴定结果..............................................263.4SnV-setIg-like结构域westernblotting鉴定................................................................273.5SnV-setIg-like结构域的大量表达................................................................................274结论与讨论.................................................................................................................................27第二章SnV-setIg-like结构域在果蝇S2细胞克隆，表达，纯化，结晶及结构预测...........291引言............................................................................................................................................292材料与方法.................................................................................................................................292.1细胞及载体.......................................................................................................................292.2酶及主要试剂...................................................................................................................292.3试剂盒...............................................................................................................................292.4主要仪器设备..................................................................................................................302.5SnV-setIg-like结构域重组载体的构建.........................................................................302.6SnV-setIg-like结构域的表达.........................................................................................333结果与分析.................................................................................................................................353.1SnV-setIg-like结构域重组载体的构建........................................................................353.2SnV-setIg-like结构域重组蛋白的鉴定.........................................................................363.3SnV-setIg-like结构域重组蛋白的纯化及结晶.............................................................373.4SnV-setIg-like结构域蛋白的结构预测.........................................................................374讨论............................................................................................................................................40全文总结.........................................................................................................................................41参考文献.........................................................................................................................................42附录................................................................................................................................................49IV 中文摘要猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）引起的高度接触性传染性疾病，其主要特征是妊娠母猪的繁殖障碍和各年龄阶段猪的呼吸系统疾病，给养猪业带来了巨大的经济损失。PRRSV的入侵机制一直是研究热点，包括许多对其宿主和受体的研究。猪是PRRSV唯一的天然宿主。分化的单核细胞、尤其是肺泡巨噬细胞，是其主要的宿主细胞。大量研究已证实，PRRSV是通过宿主细胞表面的受体分子介导入侵的。目前国内外已鉴定多种与PRRSV入侵相关受体，如唾液酸粘附素（Sialoadhesin,Sn）、CD163（Clusterofdifferentiation163）和硫酸乙酰肝素（Heparinsulphate,HS）等，它们共同协助完成PRRSV的入侵和复制增殖过程。其中，唾液酸粘附素（Sn），也被称作CD169或Siglec-1（sialicacidbindingimmunoglobulin-typelectin-1），是在巨噬细胞表面特异表达的凝集素并在PRRSV感染靶细胞的吸附和内吞过程中发挥着重要作用。进一步研究发现，Sn的V-setIg-like结构域在PRRSV入侵过程中起主要作用，但目前其结构生物学机制尚不清楚。为了探究PRRSV受体Sn的结构信息及其在病毒入侵过程中所发挥的作用，本试验首先采用毕氏酵母表达系统，成功克隆及表达了猪源SnV-setIg-like结构域重组蛋白。但因其表达量过低，不利于其结构生物学研究，因此继续采用昆虫表达系统（果蝇胚胎DrosophilaSchneider-2,S2细胞）克隆表达了猪源SnV-setIg-like结构域重组蛋白，并对其进行了westernblotting检测、质谱检测及镍柱纯化等试验，结晶并预测了其空间结构。最终得到的重组蛋白序列与SnV-setIg-like结构域目的蛋白序列100%匹配，具有生物学活性，纯度高达99%。这些结果为研究SnV-setIg-like结构域结构，揭示其参与病毒相互作用的重要作用位点和关键氨基酸，促进理解其在PRRSV入侵过程中的作用，并为深入探究PRRSV入侵机制奠定了分子基础，同时为PRRSV疫苗及临床药物的研发提供了结构生物学理论依据。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪唾液酸粘附素；V-setIg-like结构域；毕氏酵母表达系统；S2细胞；结构预测V EukaryoticExpressionandStructuralPredictionofSialoadhesinV-setIg-likeDomainDerivedfromSwineandAssociatedwithPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus(PRRSV)InfectionSupervisor:Prof.ZhangGaipingMaster’sCandidate:HouJieAbstract:Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)ischaracterizedbyreproductivefailuresinsowsandrespiratorydiseasesinpigsofallages.PRRSvirus(PRRSV)isitscausativeagentandhascausedhugeeconomiclossesintheswineindustry.Therearemanystudiesfocusingonitsinfectionmechanism,includingitshostandreceptors.SwinearetheonlyknownnaturalhostofPRRSV,withthedifferentiatedmonocytes,particularlyporcinealveolarmacrophages(PAMs),beingtheprimarypermissivecells.Virusinvasionhasbeenfurthershowntobemediatedbythehostcellsurfacereceptors.Currently,sixputativereceptorsassociatedwithPRRSVinvasionhavebeenidentified,includingsialoadhesin(Sn),clusterofdifferentiation163(CD163)andheparinsulfate(HS).Sn,alsoreferredtoCD169orSiglec-1(sialicacidbindingimmunoglobulin-typelectin-1),isamacrophage-restrictedlectin.Porcinesialoadhesin(pSn)isaputativereceptorofPRRSV.PreviousstudieshaveshownthatapSnV-setIg-likedomainissignificantinPRRSVinfection.However,itsstructuraldetailsarenotfullyknown.InordertoexplorethestructuralinformationandthespecificroleofSninPRRSVinfection,thisstudyfirstlycloned,expressedSnV-setIg-likedomaininPichiapastorisexpressionsystem.However,itslowexpressionlevelwasnothelpfulforfurtherstructuralstudy.Therefore,SnV-setIg-likedomainwasthenclonedandexpressedinDrosophilaS2cells,andwesternblotting,massspectrometryandNi-sepharosepurificationwerethencarriedout.Itscrystallizationandstructuralpredictionwerefinallyperformed.TheresultsofthestudyshowedthatthesequenceoftherecombinantproteintotallymatchedthetargetSnV-setIg-likedomain.Thepurityofthebiologicallyactivetargetproteinwas99%.ThiswillestablishthefoundationforthefurtherstructuralstudyofVI pSn,deepenourunderstandingoftheinvasionmechanismofPRRSVandsupportthestructuralinformationforthedevelopmentofclinicaldrugsandvaccinesagainstPRRSV.Keywords:PRRSV;sialoadhesin;V-setIg-likedomain;Pichiapastorisexpressionsystem;DrosophilaS2cells;structuralpredictionVII 第一部分文献综述1猪繁殖与呼吸综合征概述猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）曾经被称为猪地方性流产和呼吸综合征（Porcineepidemicabortionandrespiratorysyndrome,PEARS），[1-2]神秘猪疾病（Mysteryswinedisease,MSD）和蓝耳病（Blueeardisease）等，PRRS于上世纪80年代后期首次在美国发现，之后在世界范围内广泛传播和流行，严重影响了养猪业的[3]健康发展。PRRS主要以妊娠母猪的繁殖障碍和各年龄阶段猪的呼吸系统疾病为特征，还[4]会引起严重的免疫抑制。我国学者郭宝清等于1996年首次从流产胎儿中分离到PRRSV[5]。到目前为止，该病已在我国广泛流行，成了影响我国养猪业的重要猪病之一。1992年，世界动物卫生组织（OfficeInternationalDesEpizooties,OIE）将PRRS列为B类动物疫病。PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,[6]PRRSV）引起的。PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。该病毒与马动脉炎病毒（Equinearteritisvirus）、小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒（Lactatedehydrogenase-elevatingvirusofmice）和猴出血热病毒（Simianhemorrhagicfevervirus）同属于动脉炎病毒科（Arteriviridae）[7]。目前国际上将PRRSV分成2种类型：欧洲型和美洲型。欧洲型的代表毒株为Lelystad[8][9]virus，美洲型的代表毒株为VR-2332。不同基因型毒株之间遗传性、抗原性、致病性存在着差异，基因序列的相似度大概只有70%，每个基因型毒株也存在着广泛的变异，以美[10][11]洲型毒株变异性更大。我国分离到的毒株大部分为美洲型，但也存在少量的欧洲型。2PRRSV研究进展2.1PRRSV的基因组特性PRRSV在分类学中归属于套式病毒目（Nidovirales）动脉炎病毒科（Arteriviridae），为不分节的RNA病毒。全长约15.1kb，有9个开放阅读框（Openreadingframe,ORF），分别为ORF1a、ORF1b、ORF2-7。ORF1a和ORF1b编码参与病毒复制有关的酶，包括PRRSV的RNA依赖的RNA聚合酶，主要参与病毒基因组复制及亚基因组mRNA转录，占基因组大小的80%左右。ORF2a、ORF2b及ORF3-7分别编码病毒结构蛋白：GP2、GP3、GP4、1 [12]GP5、M及N蛋白。PRRSV的基因组有感染性，与同属的其他动脉炎病毒的基因结构和[13]组成基本相同。PRRSV基因组长度约15kb，含有9个开放阅读框（ORF）。基因组5’端有帽子结构；3’图1-1PRRSV基因组结构及其编码的主要蛋白Fig.1-1PRRSVgenomestructureanditsmajorproteins2.2PRRSV的结构蛋白和非结构蛋白与病毒复制有关的蛋白基因位于ORF1a和ORF1b，其编码pp1a和pp1ab蛋白，pp1a经酶切裂解为9个非结构蛋白，分别为：nsp1α、nsp1β、nsp2到nsp8，其主要功能是参与[14]其他nsp蛋白的加工；而pp1ab最终经酶切裂解为nsp9到nsp12，其主要功能是参与病毒[15]的转录与复制。Nsp1具有木瓜蛋白酶样半胱氨酸酶活性，它能介导nsp1从多聚体pp1a中切割出来。Nsp2的N端有一个半胱氨酸蛋白酶活性中心。Nsp4具有丝氨酸蛋白酶样的活性，可以发挥剪切作用。Nsp9为RNA依赖的RNA聚合酶，是RNA复制和转录的引擎；nsp10包含多个功能区域，具有ATP酶和解旋酶的活性；nsp12变异较大，它仅仅存在于冠[16,17]状病毒及动脉炎病毒中。PRRSV主要的结构蛋白有GP5蛋白、M蛋白和N蛋白，大小分别约为30kDa、19kDa、15kDa，分别由ORF5-7编码，另外由ORF2-4编码的次要结构蛋白GP2、GP3及GP4蛋白[18][19]分别大小约为30kDa、48kDa、35kDa。纳尔逊等研究了猪体对美国株PRRSV体液免疫的动态学特征，发现在猪体内抗N蛋白的抗体最早产生，其次是针对M蛋白的抗体，之后针对是GP5蛋白的抗体。N蛋白由ORF7编码生成，病毒粒子中含量最高，以二聚物形式存在。该蛋白有多种功能，且具有最高免疫原性，与病毒的RNA相互作用后形成核衣壳。欧洲株N蛋白含有128[20]个氨基酸，美洲株含有123个氨基酸。它能够在感染的细胞中大量表达，主要分布在细2 胞的核周区，SDS-PAGE及westernblotting分析得知N蛋白占病毒粒子蛋白成分的[21]20%-40%。ORF6编码M蛋白是非糖基化蛋白，是该病毒中保守性最高的蛋白。与冠状病毒的M蛋白相比，PRRSV的M蛋白的N端跨膜三次且仅在病毒粒子表面留一段短至10-18个氨基[22]酸的序列。Snijder研究表明该蛋白在感染细胞的内质网聚集，与主要糖蛋白GP5交联形[23]成异源二聚体，同样也会形成M/M蛋白同源二聚体，但不会存在于病毒中。目前，关于M蛋白的功能，认识尚不充分，可能在自身组装及维持形态和出芽等方面发挥作用。GP5蛋白由PRRSV的ORF5编码，是PRRSV的主要囊膜蛋白，3次跨膜，其胞外区[24-26]与M蛋白的胞外区通过二硫键交联。Verheije等研究发现GP5与M蛋白分别通过第50位和第8位半胱氨酸残基形成二硫键。突变任意位点的半胱氨酸残基都能完全抑制病毒的包装，这说明二者之间形成的二硫键不仅是病毒本身必需，而且对于病毒包装也是必不可少的[27][28]。PRRSV的ADE已被证明是由抗GP5蛋白的抗体所介导。所有研究结果都说明GP5蛋白是构建重组疫苗的良好靶标。2.3PRRSV临床症状及病理学特征PRRSV感染后有一段潜伏期，且不同猪群间差异较大，时长从3d到37d不等。发病初期病猪体温明显升高，在40.8～41.5℃间，精神沉郁，食欲下降。发病个体在外观上主要表现为眼睛水肿、充血，并伴有结膜炎；皮肤出现红肿、梗死疹块；耳边、耳尖充血、发紫。[29]病猪出现咳嗽，气喘，呼吸困难，伴有喷嚏、流涕。怀孕母猪出现严重的繁殖障碍如：流产、早产、死胎、木乃伊胎等。公猪在发病期精子质量下降及精液减少。感染仔猪主要出现呼吸系统疾病、发育迟缓，大量死亡等现象。育肥阶段的猪主要出现短时的采食量下降，[30]伴有轻度的呼吸道症状，与其他病原混合感染后可使病情加重甚至死亡。PRRS解剖学的病变主要集中在肺部，出现弥漫性间质性肺炎、肺心叶、尖叶出现“肝样”或“胰样”病灶，间隔出现增厚、出血等病变，触感软硬不均。肝脏显黄色、肿胀、出血，细胞脂肪变性,部分细胞变脆。肾脏现土黄色、肿胀。胸腔、心包腔、腹腔出现澄色积液。皮下、膀胱、扁桃体、淋巴结有不同程度肿胀、出血、淤血，呈褐色，易与其他细菌、支原体、病毒等病原体发生继发混合感染。组织学病理变化可见鼻粘膜上皮纤毛变性、脱落、肿胀，下层出现淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞浸润现象。肺泡出现Ⅱ型上皮细胞增生、间隔增厚，肺泡腔内出现碎片。单核巨噬3 细胞系统、巨噬细胞和血管内皮细胞的超微结构观察中发现，各种细胞器膜结构存在普遍性的破裂穿孔，其中线粒体和粗面内质网的损伤最为严重。另外，在单核细胞胞质、脊髓中央管、中脑导水管的检测中发现呈PRRSV强阳性，这也说明了该病毒对脑等神经组织的亲嗜性较强。在细胞水平上，病猪的淋巴细胞比例有较大程度的下降，并且出现膜破裂、变形，[31,32]细胞崩解等病理学的凋亡现象，淋巴细胞的凋亡，进一步降低了感染动物的免疫力。2.4PRRSV流行病学1987年，PRRS首次于美国报道爆发，到目前为止已将近30年。荷兰学者Wensvoort[33]于1991年，首次从病猪的肺泡巨噬细胞中分离得到了PRRSV。该病具有发病快、持续时间长、死亡率高，易发生混合感染等特点。目前该病毒已呈现世界性流行分布，世界主要养猪区，例如北美、亚太地区、欧洲都有该病流行。我国在1996年首次报道发现，随后很快传播蔓延到全国各地。近年来在我国出现一种致死率极高的高致病性毒株（HP-PRRSV），[32]其爆发和流行以来致使大量感染猪群死亡，给肉制品供给和食品安全造成了极大的威胁。PRRSV能够感染品系、日龄不相同的猪群，而且以仔猪及繁殖期母猪最为易感。目前还没有发现PRRSV有跨物种传播的案例。但有报道称，在一些飞禽的排泄物和一些昆虫体[34]内发现有该病毒的存在，故推测飞禽和昆虫可能为其传染源。而本病毒主要传染源是病猪及带毒猪，主要通过空气传播、直接或间接接触传播。空气传播主要与空气中该病毒的量、存在形式、活力、环境温度和季节等因素有相关联系。直接或间接接触传播主要通过唾液和[31]排泄物等途径。垂直传播主要途径是通过胎盘或精液由亲代传递给子代。2.5PRRSV致病机制研究进展2.5.1PRRSV入侵细胞的过程PRRSV在体内主要感染猪肺泡巨噬细胞（Porcinealveolarmacrophages,PAM），也能感染外周血单核细胞和精子细胞；体外主要感染非洲绿猴肾细胞系MA104及其衍生细胞系[35]MARC-145。研究发现，PAM上主要存在PRRSV的3种受体，HS，Sn和CD163。PRRSV首先与HS吸附，然后通过和Sn更加稳定的相互作用形成病毒受体复合物黏附到病毒表面，在网格蛋白的介导下，内吞进入到早期的胞内体中，病毒基因组紧接着被释放到细胞质中[36][37]。该过程依赖于胞内体的酸化作用和CD163。目前关于PRRSV3种受体病毒入侵过程中所发挥的作用见图1-2。4 图1-2PRRSV侵入猪肺泡巨噬细胞模式A.PAM表面的硫酸乙酰肝素受体吸附病毒粒子；B.唾液酸黏附素吸附病毒粒子；C.在唾液酸黏附素的介导下病毒受体复合体被内吞入包涵体；D.CD163分子介导PRRSV基因组释放入胞质Fig.1-2ModelofPRRSVentryintotheporcinealveolarmacrophagePRRSVvirionattachestoheparansulphatepresentonthemacrophagesurface;B.Subsequently,thevirusbindstothesialoadhesinreceptor;C.Uponattachmenttosialoadhesin,thevirus-receptorcomplexisinternalizedintotheendosome;D.TheviralgenomeisreleasedintothecytoplasmviaCD163.2.5.2PRRSV对天然免疫的抑制干扰素（Interferon,IFN）是机体抗病毒免疫的重要组成部分，而PRRSV既不能诱导IFN[38][39]的分泌，也不能活化自然杀伤细胞（Naturalkiller,NK）。L.K.Beura等研究发现nsp1α、nsp1β和nsp11抑制IFNβ启动子的激活，nsp1β阻遏IFN调控因子3（IRF3）的磷酸化及其向细胞核的迁移。另外，有学者发现nsp2N端半胱氨酸蛋白酶结构域能够抑制Ⅰ型干扰素的产生，是因为干扰了IκBα的泛素化，使NF-κB的激活受到了抑制。IFN无法直接灭活病毒，而是通过JAK-STAT通路，作用于干扰素受体，刺激了IFN基因（ISG）转录的上调，增加了抗病毒[40]蛋白的表达，继而完成对病毒的抑制作用。PRRSV抑制IFN的产生及JAK-STAT通路。5 [41]Z.Chen等研究发现，nsp1在JAK-STAT通路中发挥着重要的作用，与STAT1抑制子PIAS1相互作用，抑制STAT1细胞核的移位及ISG转录。此外，在肺泡巨噬细胞和MARC-145细胞中，nsp1β抑制IFNα通路及其调控基因的表达，是通过阻遏STAT1/STAT2/IRF9异源三聚体[42]（ISGF3）向细胞核的移位来实现的。2.5.3中和抗体产生延迟[43]许多学者对中和抗体延迟产生的原因进行了探索。F.A.Osorio等发现GP5蛋白的胞外区含有1个免疫显性表位（引诱表位或表位A），在早期感染时会诱导产生强大的非中和抗体免疫反应，使位于下游的中和表位（表位B）减弱或被屏蔽而无法引起免疫应答。另外，中和表位内或附近的糖基化位点对表位有屏蔽作用，降低了PRRSV的免疫原性。在2006年，[44]I.H.Ansari等对缺乏不同糖基化位点的突变株和野生株，进行了中和抗体诱导试验，结果表明野生株感染猪的血清中和抗体滴度低于突变株，并且发现Ⅱ型PRRSV的GP5的第51位氨基酸和GP3的第131位氨基酸N端糖基化，对PRRSV中和抗体的延迟产生和逃避机体的中和抗体有重要作用。2.5.4PRRSV抗体依赖性增强（ADE）抗体依赖性增强作用（Antibodydependentenhancement,ADE）是指在抗体水平较低时，病毒与相应抗体相互作用后，病毒的感染或复制能力显著增强的一种现象。ADE是病毒入侵宿主细胞的一种特殊方式，到目前为止，许多病毒中都发现了此现象。研究发现PRRSV也具有ADE作用。妊娠母猪在怀孕后期发生流产，可能与妊娠期间胎儿的主动免疫应答产生抗体及与PRRSV病毒之间的ADE效应有紧密联系；另外仔猪的易感性与亚中水平母源抗[45]体相关，这都表明PRRSV的致病机制与ADE存在许多有待研究的关系。ADE是PRRSV的[46]重要生物学特性之一，也可能是PRRSV的致病机理之一。PRRSV的感染能引起猪产生低滴度的中和抗体，这些抗体不但不能有效地清除病毒，且能与病毒结合产生抗原抗体复合物，借助抗体Fc段与细胞表面Fc受体（主要是FcγR，即IgG的Fc受体）结合，通过内吞进入宿主细胞。Fc和FcR的结合引起了细胞信号转导途径的改变，使抗病毒模式转换为易于病毒入侵[47]的模式，不仅利于病毒入侵细胞，还能对抗病毒机制进行改变和适应。PRRSV的这些特点不利于该病的预防和控制。有研究表明，PRRSV的ADE是由ORF5所编码的GP5蛋白所介导的，而该蛋白也能诱导机体产生中和抗体，可能ADE作用是在其诱导的抗体处于亚中和[48]水平时出现的。2.5.5PRRSV基因变异PRRSV另一个重要的生物学特性是基因变异。经对比不同分离株可知，仅PRRSV基质6 蛋白M和核衣壳蛋白N的基因保守性较高，其他基因变异性均较高。不同分离株免疫原性及毒力存在显著区别，出现的病变情况、繁殖障碍及呼吸系统疾病也不尽相同。这使得机体的主动及被动免疫系统对病毒的识别能力降低，病毒就可借此逃避免疫系统的识别及细胞毒性T细胞或中和抗体的杀伤作用。目前，美洲地区流行株为美洲株，欧洲地区流行株为欧洲株，二者若同时感染同一猪群，两种病毒RNA在细胞中增殖时就很有可能发生基因重组，导致[49]新型PRRSV基因型的产生。2.6PRRSV疫苗研究进展与防控2.6.1疫苗研究进展在现有条件下，对PRRSV的防治还无特异性的治疗药物，对其防治仍主要依赖疫苗免疫。目前在市面的PRRSV疫苗主要是弱毒疫苗和灭活疫苗，而像亚单位疫苗、DNA疫苗、[50,51]重组病毒载体疫苗等一些新型疫苗的研发也在进行中。PRRSV弱毒疫苗，是将该病毒在易感细胞上传代多次后，成为不再具有致病性同时又保持较好抗原性的弱毒株系。1995年，由德国的勃林格公司第一个推出了商品化的PRRSV[52,53]弱毒疫苗，用于3到18周猪的免疫。目前在市面上，国产弱毒疫苗分别采用R98株、CH-1[54][55]株、JXA1-R等制备。临床应用及实验表明该类疫苗具备强抗原性、效果持久等优点。然而，也有不少报道显示，此类疫苗会产生负面效果，其中一直存在弱毒株毒力返强的风险[56]。有研究者从应用了该病毒弱毒疫苗的猪群分离得到了基因测序与疫苗株同源，但具有[57,58][59]疫苗株没有的致病性。Mortensen等的研究报道发现，应用了PRRSV弱毒疫苗的母猪，可经子宫感染子代，并且对自身繁殖能力有害。PRRSV灭活疫苗，是将该病毒大量增殖后，采用适当措施将病毒失去感染活性，但保持其抗原性而制成的。在灭活过程中，病毒已经被杀死，所以其最大优势为生物安全性高、[60,61]不存在散毒及毒力返强的风险。在上世纪90年代，拜耳首次推出PRRSV灭活苗。目前我国被批准生产PRRSV灭活苗的企业众多，其中主要是以CH-1a株和NVDC-JXA1株制备开[62,63]发。但因在灭活过程中存在抗原丢失等问题，使灭活疫苗出现了免疫原性弱、免疫效[64,65]果不佳等问题。常规疫苗都存在某些不足，迫切需要开发更加高效、安全的新型PRRSV疫苗。核酸疫[66]苗、亚单位疫苗和活载体疫苗等是主要的研发方向。亚单位疫苗，主要是利用PRRSV中的特定蛋白（如：M蛋白、N蛋白、GP3、GP5），可以刺激免疫系统产生中和抗体和免疫保7 [67,68][69]护这一特性，表达相关蛋白制成疫苗免疫动物。Plana等人研究表明用杆状病毒表达系统表达的ORF3和ORF5都能产生免疫保护。核酸疫苗，是利用质粒作为载体将一个或多个保护性抗原的基因导入到宿主的细胞内，然后依赖宿主的转录系统产生保护性抗原，从而刺[70]激机体产生相应的中和抗体。已有ORF5等多个基因构建的PRRSV核酸疫苗在小鼠或猪的动物实验中取得了初步的免疫效果。PRRSV活载体疫苗在以传染性胃肠炎病毒（TGEV）活[71-74]病毒、鸡痘病毒等为载体的疫苗研究中，免疫动物产生了一定的免疫保护。2.6.2PRRSV的综合防控PRRSV在我国长时间、大规模流行，其最有效的防治措施还是疫苗免疫。但仅依靠疫[75]苗免疫并非万全之策，只有采取积极的综合防控措施才能有效遏制PRRSV的爆发。首先，要严格把控种猪引进，严禁从疫区引种；引种前必须经过严格的检测，引入血清学检测阴性的种猪；引进的种猪要严格进行隔离观察，并使用PRRSV灭活疫苗进行免疫。其次，在生产过程中要严格管理，进出不同生产区的人员和器械要严格消毒；合理安排人员，专人专事；[76]按期进行免疫与检测；规范猪场建筑设计，合理安排生产。3.PRRSV细胞受体研究进展病毒一个完整的生命周期包括：吸附、侵入、脱壳、合成、装配、释放等一系列过程。病毒侵入细胞，先与细胞表面的受体相互识别完成吸附，然后才能继续生命周期。吸附这一步非常关键，因此探究与吸附作用密切相关的受体，对揭示病毒的入侵机制及其防控治疗具[77]有重大意义。猪肺泡巨噬细胞上与PRRSV识别密切相关的主要受体有：唾液酸粘附素[78]（Sialoadhesin,Sn）、硫酸乙酰肝素（Heparinsulphate,HS）、清道夫蛋白（CD163）等。3.1唾液酸粘附素概述3.1.1唾液酸粘附素的结构与功能Sn，也被称作CD169或Siglec-1（Sialicacidbindingimmunoglobulin-typelectin-1），于1985[79]年首次在与绵羊红细胞相互作用中被发现，为一种在巨噬细胞表面特异表达的凝集素。它是唾液酸粘附素家族成员，属于免疫球蛋白超家族；在结构上是Ⅰ型跨膜糖蛋白，由胞外[80]区、跨膜区和胞质尾区构成。其胞外区又分为16个C2-set结构域和一个N端V-setIg-like结[81]构域。研究表明，Sn不仅参与细胞与病毒之间或细胞之间的多种相互作用，而且调节免[82,83]疫应答、红细胞生成及炎症反应。8 3.1.2唾液酸粘附素是PRRSV入侵的受体[84]Duan等用猪肺泡巨噬细胞（Porcinealveolarmacrophage,PAM）细胞的膜蛋白作为免疫原免疫小鼠筛选得到了一株单克隆抗体并命名为MAb41D3，该单抗可以保护PAM细胞完全不受PRRSV感染。利用单克隆抗体MAb41D3进行免疫共沉淀从PAM细胞中分离出一条分子量大小约210kDa的蛋白并命名为p210蛋白。他们对纯化后的p210蛋白进行质谱分析得到其肽段氨基酸序列，根据BLAST比对结果设计特异引物，以猪全血及BAC文库为模板经PCR得到Sn的全基因序列。Duan等发现Sn在PRRSV吸附和内吞进入宿主细胞[85]的过程中，发挥着非常重要的作用。因此猪源Sn（pSn）被认为是PRRSV感染靶细胞的受体。3.1.3唾液酸粘附素与PRRSV的相互作用自猪源Sn（pSn）作为PRRSV感染靶细胞的受体发现以来，研究学者采用多种方式和方[86]法对PRRSV与Sn相互作用进行了研究。Delputte等研究发现在PRRSV入侵过程中Sn和HS的协调作用：PRRSV首先与HS相互作用使病毒聚集到细胞表面，但是这一作用十分微弱，随后PRRSV与Sn相互结合增强了第一步结合，然后经网格蛋白的介导，病毒受体复合物内化进入细胞内。这一过程中，Sn可单独完成病毒内吞，但是在HS存在时会更利于Sn介导的病毒结合与内吞过程。VanBreedam等进一步证明了PRRSV结构蛋白GP5与pSn在体外的相互作用，通过GP5与PAM细胞表面受体Sn相互作用介导PRRSV形成内吞小体，然后在CD163受体协助下内吞。他们还发现PRRSV与Sn的结合依赖于GP5蛋白上的唾液酸，而且pSn的[87]V-setIg-like结构域介导这一结合。3.2其他受体蛋白概述3.2.1硫酸乙酰肝素1997年，日本学者在研究中发现，MARC-145和PAM细胞上的肝素样分子参与了PRRSV侵染细胞的过程，从而硫酸乙酰肝素（HS）成为第一个被发现的PRRSV受体蛋白。硫酸乙酰肝素作为一种糖胺聚糖（GAGs），往往以聚合物的形式存在于各种细胞表面，具有很强[88]的粘附性。报道证实，HS受体特异性不强，与多种病原的细胞粘附侵染有关。2002年，[89]Delputte等的研究发现不同来源的PRRSV毒株与HS的结合强度不同，并且发现了HS受体主要结合PRRSV的M/GP5蛋白。实验表明，在用过硫酸乙酰肝素处理后，PAM细胞明显不易被PRRSV感染，而且随着硫酸乙酰肝素用量的增加病毒的感染性进一步下降，但在硫酸乙酰肝素达到一定使用浓度时，病毒的感染性不会再继续下降。因此，推测HS与PRRSV在PAM的聚集、粘附有关，是9 病毒在细胞表面的粘附因子，为病毒进一步侵染细胞做准备。但它并非该病毒感染的必要条[90]件，PRRSV入侵细胞还需多种其他特异性粘附因子参与。3.2.2波形蛋白波形蛋白（Vimentin,Vim）作为一种细胞骨架蛋白，在多种细胞和组织中均有分布，如：肌肉细胞、巨噬细胞、单核细胞等。在早期的研究中发现，HS和Sn参与PRRSV侵染PAM的过程，但是在Marc-145细胞表面却不表达HS和Sn，由此推断在Marc-145细胞上存在有其他可以介导该病毒侵染的因子。直到2006年，Kim等在制备了一株能够阻断PRRSV感染Marc-145细胞的单克隆抗体后，利用此单克隆抗体通过病毒铺覆蛋白印迹技术[91]（VOPBA）发现能与PRRSV结合的波形蛋白。研究表明，波形蛋白主要结合PRRSV的核衣壳蛋白N蛋白，而且可被不同的蛋白激酶磷酸化，其磷酸化可能与PRRSV对细胞严[92]格的偏嗜性相关。3.2.3CD163（Clusterofdifferentiation163）CD163主要存在于巨噬细胞表面，属I型糖基化膜蛋白，属于清道夫受体（SR）家族。在2005年的国际猪蓝耳病会议上，Welch等首次提出存在于PAM细胞和Marc-145细胞表[93]面的CD163可以介导PRRSV的吸附及内吞作用。在一些PRRSV非感染性细胞系（如：PK-15细胞、BHK-21细胞等）中转染含有CD163cDNA的重组载体，使其在细胞表面表达CD163分子，可使这些细胞具有感染PRRSV并产生子代病毒的能力，并且子代病毒可以在该细胞系上稳定传至60代。但是，在Vero细胞上含有CD163，但PRRSV却不能感染复制，[94-97]这可能与该细胞上CD163缺少羧基端跨膜区有关。4蛋白质结构预测研究进展4.1蛋白质结构预测应用在当今蛋白质的研究中，蛋白质的空间结构及其功能研究无疑是最具挑战性的问题之一。虽然蛋白质是由氨基酸组成的，但只有它们折叠成正确的空间构象时，才具备相应的活性及生物学功能。认识蛋白质的功能及其作用过程可以从了解其空间结构入手。由于三维空间结构较为复杂，利用传统的分析技术如核磁共振、X射线衍射法等既费时又费力，因而逐渐发展起来了对蛋白质结构的预测。蛋白质结构预测就是利用氨基酸序列来预测其空间构象，对于临床实践和基础理论都有重大意义。理论上，若弄清蛋白质的高级结构是如何由一级结构决定的，将利于人们更系统10 和完整地认识生物信息从DNA到蛋白质的传递过程，中心法将阐明的更完整，继而深刻了解生命过程中各种现象，最终推动生命科学的快速发展。应用上，蛋白质结构预测使人们更有能力解决疾病等诸多问题，研发具有新型生物学功能的蛋白质，极大促进医药、畜牧业的[98]发展。4.2蛋白质结构预测研究方法（1）同源建模法。目前主要是指同源结构预测，即在有同源结构的情况下，预测未知蛋白质结构的技术，为现在最成熟也最常用的预测方法。一般认为不同蛋白质的序列相似度大于30%时，它们可能有共同的祖先，称为同源蛋白质，应具有相似的结构和功能。同源建模过程包括六部分：目标序列与模板序列匹配；依据同源蛋白质多重序列的匹配结果，确定结构保守区和框架结构；对目的蛋白质的保守区主链进行建模；对目的蛋白质的变异区主链进[99]行建模；侧链的安装和优化；优化评估建模结构。著名的免费服务器Swiss-model就是依据同源建模的原理工作的。该模型采用SIM、BLAST和FASTA在PDB中查找序列相似性>35%的模板，对齐二者的序列，然后基于结构重叠法进行线性匹配，构建框架结构，建立原子间相互作用，忽略缺失及插入成分，依据5肽库构建主链。加入侧链等生化功能基团后，CHAMM[100]多次优化最小能量，最终实现了结构预测。（2）反向折叠法。尽管蛋白质的氨基酸序列差异很大，却常有相同的折叠类型，通过识别折叠，能够构建三维结构。该方法是在没有同源结构时直接进行预测，主要原理是通过未知的蛋白质序列与已知的结构进行匹配，找出匹配度最高的一种或几种预测结构作为目的蛋白的结构。该方法是总结已知蛋白质的结构模式作为模板，然后研究现有的数据库，选择出最佳匹配方式，但假定的蛋白质折叠类型是有限的。因此只有未知蛋白质结构与已知蛋白质相似的时候，才会有预测出未知蛋白质结构的可能。该方法已成为较成熟的预测蛋白质结构[101]的方法，已经从理论转向了临床应用。（3）从头预测法。该方法是不基于相似结构的信息，而只是利用氨基酸一级序列，经生物计算得出高级模型，但目前为止还不能完全实现。因此目前的方法采用了许多已知蛋白质的结构数据，如设立评分标准来鉴别预测正确与否、插入片段于模型中等。从头预测方法又详细划分为二级结构预测、超二级结构预测、蛋白质结构类型预测、蛋白质折叠模式预测、详细的三维结构的直接预测等。从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构是结构预测的终极目标。从头预测法预测蛋白质的结构,最常用的方法就是依据原子的物理化学性质，利用分子11 动力学方法模拟蛋白质的折叠。但是这种方法存在一些问题：首先，分子动力学法计算全原子模型需要大量的计算。其次，大分子在液体环境中的势能函数表示的问题一直没有一个一[102]致认同的解决方法。因此需要对模型进行相应的简化。5研究目的及意义自1987年猪繁殖与呼吸综合征发现以来，该病在全球迅速蔓延分布，给我国的养猪业带来了巨大的影响。PAM是PRRSV的主要靶细胞，这与该细胞表面存在特异性的病毒受体有关。目前国内外已鉴定多种与PRRSV入侵相关受体，如唾液酸粘附素（Sialoadhesin,Sn）、CD163（Clusterofdifferentiation163）和硫酸乙酰肝素（Heparinsulphate,HS）等，三者在PRRSV感染过程中相互关系是：PRRSV吸附到宿主细胞表面主要是HS的作用，Sn介导PRRSV内吞形成内吞小体。PRRSV入侵PAM细胞的第一环节主要由HS和Sn完成，而内吞的必须步骤是与Sn的结合。在HS存在时，Sn更容易介导病毒的结合与内吞。CD163的主要功能可能是协助Sn的内吞，促进PRRSV的脱衣壳及释放病毒基因组的RNA到细胞浆中进行复制。Sn是在巨噬细胞表面特异表达的凝集素，是唾液粘附素家族成员，属于免疫球蛋白超家族，参与细胞与病毒之间或细胞之间的相互作用。自1985年Sn首次被发现于绵羊红细胞，特别是发现猪源Sn作为PRRSV感染靶细胞的入侵受体以来，研究学者采用多种方式和方法对PRRSV与Sn相互作用进行了研究。Sn在PRRSV感染靶细胞的吸附和内吞过程中发挥着重要作用。进一步研究发现，SnV-setIg-like结构域在PRRSV入侵过程[8]中起主要作用，但目前其结构生物学信息尚不清楚，这对深入理解Sn的作用机制和PRRSV的入侵过程造成了阻碍。为进一步探究PRRSV受体Sn在病毒感染过程中的具体作用和PRRSV的致病机制，本试验克隆、表达、纯化了SnV-setIg-like结构域，并对其进行了结晶及结构预测，以期从结构生物学角度，阐明Sn的作用机制，为进一步探究PRRSV的致病机理，研发新型疫苗、免疫佐剂和抗病毒药物提供重要的结构理论依据。12 第二部分研究内容第一章SnV-setIg-like结构域在毕式酵母克隆与表达1引言酵母是一种低等单细胞真核生物。酵母表达系统既具有原核表达系统操作简单、成本低、生长速度快、易于培养、表达量高等优点,还具有真核表达系统蛋白质的加工、折叠、[103]翻译后修饰,如糖基化、磷酸化等特点。目前酵母表达系统菌株主要有酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)以及耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统为最近几年迅速发展起来的第二代酵母外源蛋白质表达系统，属于甲醇酵母基因表达系统,具有稳定遗传、发酵密度高、表达量高且便于纯化的优点。另外这套表达系统还改善了酿酒酵母分泌效率差、表达不够稳定、质粒容易丢失等缺陷,因此该表达系统很快成为目前应用[104]最为广泛的外源基因表达系统之一。猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）是一种引起猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）的高度接触性传染性疾病，主要以妊娠母猪的繁殖障碍和各年龄阶段猪的呼吸系统疾病为特征，对养猪业造成了巨大的经济损失，加之本身具有易变异和持续性感染等特性，一直是兽医领域的重点研究对象，其中PRRSV的入侵机制一直是研究热点。大量研究已证实PRRSV是经宿主细胞表面的受体介导病毒入侵细胞的。目前国内外已鉴定多种与PRRSV入侵相关受体，其中，唾液酸粘附素（Sialoadhesin,Sn）是一种在巨噬细胞表面特异表达的凝集素，是唾液粘附素家族成员，属于免疫球蛋白超家族，参与细胞与病毒之间或细胞之间的相互作用。有研究证实，Sn在PRRSV感染靶细胞吸附和内吞过程中发挥着重要作用。其中V-setIg-like结构域在病毒入侵过程中起主要作用。但是SnV-setIg-like结构域的结构生物学信息目前尚不清楚，阻碍了对PRRSV入侵机制的深入了解。本部分研究利用巴斯德毕式酵母表达系统克隆和表达SnV-setIg-like结构域重组蛋白，为进一步研究SnV-setIg-like结构域奠定了分子基础。2材料与方法2.1基因、菌株及载体pcDNA3.1-Sn质粒由本实验室保存；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自大连TaKaRa公司；13 pPICZαA载体及巴斯德毕氏酵母X-33感受态菌株均由中国科学院福建物质结构研究所黄明东研究员无偿馈赠。2.2酶及主要试剂Phusion高保真DNA聚合酶购自NEB公司；XholI、SalI和SacI内切酶、T4DNA连接酶、DNAMarkerDL2000均购自大连TaKaRa公司；彩虹246广谱蛋白Marker（5-246kDa）购自北京索莱宝科技有限公司；抗组氨酸（His）标签抗体和羊抗鼠酶标二抗购自河南华美®公司；博来霉素（Zeocin）购自美国Invitrogen公司；氨苄青霉素购自Sigma公司；酵母提取物（Yeastextract）、胰蛋白胨（Tryptone）购自英国OXOID公司；磷酸二氢钾（KH2PO4）、磷酸氢二钾（K2HPO4）、乙酸钾、山梨醇、葡萄糖及甲醇均购自上海国药集团化学试剂有限公司。2.3试剂盒AEC底物显色试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒均购自北京天根生化科技公司。2.4主要试剂的配制2.4.1LB培养基的配制LB液体培养基：称取酵母提取物（Yeastextract）5g，胰蛋白胨（Tryptone）10g及氯化钠（NaCl）10g，置于1L烧杯中，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解，调节pH至7.0，加去离子水将培养基定容至1L，121°C灭菌20min后，置于4°C冰箱保存备用。LB固体培养基：在液体LB培养基中每升加20g琼脂粉，121°C灭菌20min，冷却后加入1mL氨苄青霉素（100mg/mL），放4°C冰箱加封口膜倒置保存备用。2.4.2LLB培养基的配制LLB液体培养基：称取酵母提取物（Yeastextract）5g，胰蛋白胨（Tryptone）10g及氯化钠（NaCl）5g，置于1L烧杯中，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解，调节pH至7.0，加去离子水将培养基定容至1L，121°C灭菌20min后，置于4°C冰箱保存备用。LLB固体培养基：在液体LLB培养基中每升加20g琼脂粉，121°C灭菌20min，冷却®后加入300μLZeocin（100mg/mL），放4°C冰箱加封口膜倒置保存备用。2.4.3YPD培养基的配制YPD液体培养基：称取酵母提取物（Yeastextract）10g，胰蛋白胨（Tryptone）20g，14 葡萄糖20g，置于1L烧杯中，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解，加去离子水将培养基定容至1L，115°C灭菌15min后，置于4°C冰箱保存备用。YPD固体培养基：在液体YPD培养基中每升加20g琼脂粉（Agar），115°C灭菌15min，®冷却至60°C后，加入1mLZeocin（100mg/mL），放4°C冰箱加封口膜倒置保存备用。2.4.4BMGY培养基的配制称取酵母提取物（Yeastextract）10g，胰蛋白胨（Tryptone）20g，磷酸二氢钾（KH2PO4）12g，磷酸氢二钾（K2HPO4）3g，乙酸钾29.442g，10mL甘油，置于1L烧杯中，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解，加去离子水将培养基定容至1L，121°C灭菌20min后，置于4°C冰箱保存备用。2.4.5BMMY培养基的配制称取酵母提取物（Yeastextract）10g，胰蛋白胨（Tryptone）20g，磷酸二氢钾（KH2PO4）12g，磷酸氢二钾（K2HPO4）3g，置于1L烧杯中，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解，加去离子水将培养基定容至1L，121°C灭菌20min后，置于4°C冰箱保存备用，使用前按1%比例加入甲醇。2.4.61×PBS缓冲液（pH7.0）称取KCl0.2g，NaCl8g，KH2PO40.27g，Na2HPO4·12H2O1.58g，加双蒸水定容至1L，调pH至7.0，搅拌使之完全溶解，121°C灭菌20min后，室温保存备用。2.4.7溴化乙锭(EB)储存液（10mg/mL）用10mL去离子水完全溶解100mgEB，使终浓度为10mg/mL，室温避光保存，使用时稀释EB至工作浓度为0.5μg/mL。2.4.85×TAE电泳缓冲液（pH8.0）称取EDTA3.72g，Tris24.2g，完全溶解于900mL去离子水中，然后加入冰醋酸5.71mL，加水定容至1000mL，保存备用，使用时加去离子水稀释成1倍。2.4.91%琼脂糖凝胶的配制称取琼脂糖1.0g加入到100mL1×TAE缓冲液中，加热使之完全溶解，冷却至60°C左右加入10mg/mL的EB5μL使其终浓度为0.5μg/mL。2.4.10SDS‐PAGE电泳相关试剂10%SDS：称取SDS粉末10g，加双蒸水至100mL，使用前温浴助溶，常温贮存。10%过硫酸铵：称取10g过硫酸铵，双蒸水定容至100mL，分装，-20°C贮存备用。30%聚丙烯酰（w/v）：称取N’-N’甲叉双丙烯酰胺固体1g、固体丙烯酰胺29g，双蒸水15 水定容至100mL，调节pH至7.0，0.22μm的滤器过滤，4°C保存备用。1mol/LTris-HCl（pH6.8）：称取Tris12g，溶于80mL去离子水中，盐酸调pH至6.8，用双蒸水定容至100mL，4°C保存备用。1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）：称取Tris18g，溶于80mL去离子水中，盐酸调pH至8.8，用双蒸水定容至100mL，4℃保存备用。5×SDS-PAGE电泳缓冲液：分别称取SDS5g、Tris15.1g、甘氨酸94g，溶于800mL双蒸水中，搅拌、温浴使溶解完全，定容至1000mL，室温贮存备用。2×蛋白上样缓冲液（20mL）：0.5mol/LTris-HCl（pH6.8）4mL，20%SDS4mL，1%溴酚蓝1mL，甘油4mL，2mLβ-巯基乙醇，分装，-20°C贮藏。考马斯亮蓝R-250染色液（1L）：考马斯亮蓝R-2501g，异丙醇250mL，冰醋酸100mL，搅拌均匀，加双蒸水定容至1000mL。考马斯亮蓝脱色液（1L）：冰醋酸100mL，无水乙醇50mL，双蒸水850mL，混匀备用。2.4.11SDS-PAGE蛋白电泳胶的制备15%SDS-PAGE分离胶（10mL）：双蒸水2.3mL，30%聚丙烯酰胺5.0mL，1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）2.5mL，10%SDS0.1mL，10%过硫酸铵0.1mL，TEMED0.004mL。5%SDS-PAGE浓缩胶（3mL）：双蒸水2.1mL，30%聚丙烯酰胺0.5mL，1mol/LTris-HCl（pH6.8）0.38mL，10%SDS0.03mL，10%过硫酸铵0.03mL，TEMED0.003mL。2.4.12Westernblotting相关试剂转膜缓冲液（1L）：称取SDS1g，甘氨酸9g，Tris2g，溶于适量单蒸水中，混匀，加入甲醇200mL，单蒸水定容至1000mL。PBST（10L）：10000mLPBS，加Tween-205mL，混合均匀，室温贮存备用。封闭液（5%脱脂奶，100mL）：称取脱脂奶粉5g，用配制好的PBST定容至100mL，4°C贮存备用。2.4.1350%甘油去离子水与丙三醇1:1均匀混合，121°C灭菌20min后，放4°C冰箱保存备用。2.4.14氨苄青霉素储存液的配制称量5g氨苄青霉素粉末于50mL离心管中，加入40mL灭菌水，充分混合溶解后，定容至50mL，使终浓度为100mg/mL，然后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，小份分装后，-20°C16 冷冻保存备用。2.5主要仪器设备HH-4数显恒温水浴锅常州国华电器有限公司HeraeusPico17微型离心机美国Thermo公司电子分析天平梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司ZS-2200型凝胶成像仪美国基因工程公司PTC-200型梯度PCR仪美国基因工程公司半干转膜仪美国BIO-RAD公司®Mini-PROTEANTetra电泳槽美国BIO-RAD公司美国BIO-RAD公司PowerPac电泳仪电转仪美国BIO-RAD公司®IKAMS3basic小型振荡器德国IKA公司-80℃超低温冰箱日本三洋公司SIM-F124型制冰机日本三洋公司-20°C冰箱青岛海尔股份有限公司CR21GII高速台式离心机日本HITACHI公司电热恒温培养箱（DH6000AB型）天津市泰斯特仪器有限公司电泳槽（DYCP-31A型）北京市六一仪器厂电泳仪北京市六一仪器厂2.6SnV-setIg-like结构域重组载体的构建2.6.1pcDNA3.1-Sn质粒的提取挑取本课题组构建并保存的pcDNA3.1-Sn大肠杆菌DH5α菌种于10mL含终浓度100μg/mLAmp的LB液体培养基中，37°C、210rpm过夜培养后，使用质粒抽提试剂盒提取pcDNA3.1-Sn质粒，最终加100μL无菌水溶解作为PCR扩增基因的模板。pcDNA3.1-Sn质粒提取步骤如下：1.将10mL培养过液的pcDNA3.1-Sn菌液，12000rpm室温离心1min，弃去上清液；2.用已加入RNaseA的BufferS1500µL充分悬浮菌液，悬浮均匀，不留小的菌块；17 3.加入500µLBufferS2温和上下翻转混合6次左右，使菌体裂解充分直至变成粘稠透亮的溶液，此步在5min内完成；4.加入700µLBufferS3上下翻转6-8次终止裂解，12000rpm室温离心10min；5.吸取上清液转移至DNA制备管，再放入2mL的离心管中，12000rpm室温离心1min，此步骤再重复一次；6.弃去滤液，将DNA制备管重新放至离心管后加入500µLBufferW1，12000rpm室温离心1min；7.弃去滤液，将DNA制备管重新放至离心管后加入700µLBufferW2，12000rpm室温离心1min，此步重复一次，第三次空甩2min；8.将制备管放入新的1.5mL离心管中，在膜正中央加50°C温浴双蒸水50µL，室温静置1min充分溶解质粒，12000rpm室温离心1min，此步重复一次。9.使用紫外分光光度计（Nanodrop1000）测定所提取的质粒含量，置于-20°C保存。2.6.2引物的设计与合成依据GenBank中发表的猪源Sn序列（DQ176853）设计1对引物，分别引入XholI和SalI酶切位点（表1.1下划线表示），用以扩增SnV-setIg-like结构域（Val23-Val135）蛋白基因片段。引物序列见表1.1，上海生工生物工程股份有限公司合成。表1.1试验所用PCR引物Table1.1PCRprimers基因名称序列（5’-3’）扩增长度/bpCCGCTCGAGAAAAGAGTTTCCAGCCCCGAGACSnV-setIg-like结构域339ACGCGTCGACCACGGTGACAACTGTGCCT2.6.3SnV-setIg-like结构域的PCR扩增以pcDNA3.1-Sn为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶扩增目的基因，反应体系如下：无菌水29.5μL5×HFbuffer10μL2.5mMdNTPs4μL正向引物（10μM）2.5μL反向引物（10μM）2.5μLpcDNA3.1-Sn1μLPhusionDNA聚合酶0.5μL18 反应条件为：98°C预变性2min，98°C变性25s，54°C退火25s，72°C延伸15s，循环30次，之后72°C再延伸10min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。2.6.4SnV-setIg-like结构域PCR扩增产物的回收配制1%琼脂糖凝胶，将目的扩增条带剩余样品全部进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，使用DNA纯化回收试剂盒回收PCR扩增产物，最终加100μL无菌水溶解回收片段。回收步骤如下：1.琼脂糖凝胶电泳后，用洁净刀片切出含目的DNA片段的凝胶，切碎后放入离心管中。2.称取胶块重量，计算胶块体积（以1mg=1μL计算）。向胶块中加入等体积的Bindingbuffer（XP2），55°C-60°C放置7min，并间断震荡混合使胶块充分融化。3.pH观察：若上述混合物为橙色或红色；加入5μL，5mol/L醋酸钠pH5.2以降低其pH值；正常颜色应为淡黄色。4.取1个HiBindDNA结合柱，置于2mL收集管中；吸取200μL的BufferGPS平衡缓冲液于柱子中；室温放置3-5min。5.室温下以10000g离心2min；倒弃收集管中的滤液，把HiBindDNA结合柱置回收集管中，加入700μL灭菌水于柱子中，同上离心。6.弃滤液，将HiBindDNA结合柱置回收集管中；取700μL含目的基因的凝胶溶液加入DNA结合柱中，10000g室温离心1min，弃滤液。7.将HiBindDNA结合柱置回收集管中，若凝胶溶液体积大于700μL，则取剩余溶液同步骤4离心操作（每个柱子的最大DNA吸附量为25μg；若大量回收，则应把样品分装离心）。8.将HiBindDNA结合柱置回收集管中，加300µLXP2于HiBindDNA结合柱中，10000g室温离心1min弃滤液；9.将HiBindDNA结合柱置回收集管中，加700µLSPWWashBuffer于HiBindDNA结合柱中，10000g离心1min，弃滤液，重复此步骤。10.将HiBindDNA结合柱置回收集管中，以大于13000g离心2min，以除去乙醇。o11.将HiBindDNA结合柱置于1.5mL的微离心管中，加入60µL，60C预热超纯水至膜上静置1min；以大于13000g离心1min。12.使用紫外分光光度计（Nanodrop1000）测定回收的DNA含量；-20°C保存。19 2.6.5pPICZαA载体的提取®挑取适量pPICZαA大肠杆菌菌株于10mL含终浓度30μg/mLZeocin的LLB液体培养基中，37°C、210rpm培养过夜，待菌液活化好后，使用质粒抽提试剂盒提取pPICZαA质粒，最终加100μL无菌水溶解用于下一步酶切反应。2.6.6SnV-setIg-like结构域扩增回收产物与pPICZαA载体的双酶切将纯化回收的SnV-setIg-like结构域扩增回收产物和pPICZαA载体分别用XholI和SalI酶双酶切。将SnV-setIg-like结构域扩增回收产物用XholI和SalI酶双酶切，具体反应体系如下：PCR基因扩增回收产物42μL10×Hbuffer5μLXholI1.5μLSalI1.5μlL将pPICZαA载体用XholI和SalI酶双酶切，具体反应体系如下：pPICZαA质粒42μL10×Hbuffer5μLXholI1.5μLSalI1.5μL混匀后37°C酶切过夜。2.6.7SnV-setIg-like结构域扩增回收产物和pPICZαA载体酶切产物的回收配制1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后使用DNA纯化回收试剂盒回收双酶切产物，最终加100μL无菌水溶解回收片段用于下一步反应。2.6.8SnV-setIg-like结构域与pPICZαA载体的连接将酶切回收的SnV-setIg-like结构域基因片段与pPICZαA载体片段连接，在16°C水浴中反应连接过夜。10µL连接反应体系为：20 SnV-setIg-like结构域酶切回收产物5μLpPICZαA载体酶切回收产物3μL10×T4DNA连接酶Buffer1μLT4DNA连接酶1μL混匀后16°C连接过夜。2.6.9SnV-setIg-like结构域重组载体的转化1.于-80°C冰箱取出DH5α感受态细胞，置于冰上，将10μL连接产物加到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻吹打混匀，在冰浴上静置30min。2.42°C水浴热激90s，然后将其迅速置于冰水中静置5min。3.向感受态细胞中加入900μLLLB液体培养基，混匀后，37°C、120rpm振荡培养45-60min。®4.4000rpm离心4min，然后将沉淀吹打混匀后取一半涂含终浓度30μg/mLZeocin的LLB平板，用无菌弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开，室温下至液体完全吸收，倒置平板，37°C温箱中培养12-16h。2.6.10SnV-setIg-like结构域重组载体的筛选与鉴定®挑取10个平板上长出的单菌落于150μL含30μg/mLZeocin的LLB液体培养基中，37°C、250rpm培养3h后进行菌落PCR。20μL菌落PCR体系为：PremixExTaq10μL无菌水8μL培养菌液1μL正向引物/3’AOX通用引物1μL反应条件为：94°C预变性3min；94°C变性40s，54°C退火40s，72°C延伸30s，循环35次；之后72°C再延伸10min。取5μl菌落PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳以检测重组载体是否构建成功。注：3’AOX通用引物：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’5’AOX通用引物：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’21 2.6.11SnV-setIg-like结构域菌落PCR检测阳性菌株的活化测序®吸取20μL经菌落PCR检测呈阳性的菌液至2mL含终浓度30μg/mLZeocin的LLB液体培养基中，37°C、210rpm培养过夜，然后取1mL活化菌液送到上海生工生物技术有限公司，以5’AOX，3’AOX为引物进行测序，以鉴定SnV-setIg-like结构域重组载体构建是否正确。2.6.12SnV-setIg-like结构域测序后的菌种保存吸取50μL经测序鉴定构建正确的SnV-setIg-like结构域重组载体DH5α菌液至10mL®含30μg/mLZeocin的LLB液体培养基中，37°C、210rpm过夜培养后，700μL菌液与300μL50%灭菌后甘油混匀，-80°C长期保存。2.7SnV-setIg-like结构域的表达2.7.1SnV-setIg-like结构域重组载体质粒的提取®将构建好的SnV-setIg-like结构域重组载体DH5α菌株至10mL含30μg/mLZeocin的LLB液体培养基中，37°C、210rpm培养过夜，过夜活化后使用质粒抽提试剂盒提取质粒，最终加100μL无菌水溶解。2.7.2SnV-setIg-like结构域重组载体的SacⅠ酶切将提取的SnV-setIg-like结构域重组载体用SacⅠ酶酶切进行线性化，50μL酶切体系为：SnV-setIg-like结构域重组载体质粒43μL10×bufferL5μLSacⅠ2μL混匀后37℃酶切过夜。2.7.3SnV-setIg-like结构域重组载体酶切产物的回收配制1%琼脂糖凝胶，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后使用DNA纯化回收试剂盒回收SacⅠ酶酶切产物，最终加100μL无菌水溶解回收片段用于下一步反应。22 2.7.4巴斯德毕氏酵母X-33感受态细胞的制备1.取适量巴斯德毕氏酵母X-33感受态菌株，使用YPD液体培养基稀释至适宜浓度，涂不含任何抗性的YPD平板，30°C倒置培养。2.挑单菌落于2mLYPD培养液中，210rpm、30°C培养，直至达到饱和状态（约1d）。3.按照0.1%的接种量，将500μL菌液接种至500mLYPD培养液中，210rpm、30°C培养约12h。4.将培养菌液按每管50mL，分装至预冷的灭菌离心管中，4°C、4000rpm离心5min，弃去上清。5.每管加入预冷无菌水20mL重悬，并将每两管合为一管，4°C、4000rpm离心5min，弃去上清。6.每管加入预冷无菌水40mL重悬沉淀的菌体，4°C、4000rpm离心5min，弃去上清。7.每管加入预冷1mol/L山梨醇10mL重悬沉淀的菌体，4°C、4000rpm离心5min，弃去上清。8.每管加入预冷1mol/L山梨醇2mL重悬沉淀的菌体，4°C、4000rpm离心5min，弃去上清。9.每管加入预冷1mol/L山梨醇约100µL重悬沉淀的菌体，然后以每管80µL分装于预冷灭菌的1.5mL离心管中，然后冻存于-80°C待用。2.7.5线性化SnV-setIg-like结构域重组载体的转化取酵母感受态细胞，加入20μL线性化后的SnV-setIg-like结构域重组载体，混匀后，置于预冷的0.2cm电转杯中，冰浴5min。用电转仪电击转化（电压：1.5kV，电阻：200Ω，电容：25μF，电击6ms）后，迅速加入1mL灭菌过预冷的1M山梨醇。混匀后，转至1.5mL无菌的Eppendorf离心管中，30℃培养2h后，室温4000rpm离心5min，去除绝大部分®上清液后，将沉淀吹打混匀，取一半菌液涂含100μg/mLZeocin的YPD平板，30°C倒置培养2-3d。23 2.7.6SnV-setIg-like结构域重组菌株的筛选与鉴定®用灭菌牙签随机挑取单菌落至含终浓度100μg/mLZeocin的2mLYPD培养液中，210rpm、30°C培养至OD值约为10。取1mLYPD菌液，室温，7500rpm离心5min，弃去上清，加入0.5mL0.1mol/LNaOH重悬沉淀，离心5min后，弃去上清，加入1mL的无菌水重悬沉淀，室温7500rpm离心5min，弃去上清，加入50μL的无菌水重悬沉淀，100°C水浴10min，取1μL做模板进行酵母菌落PCR检测。20μL菌落PCR体系为：PremixExTaq10μL无菌水8μL处理后菌液1μL正向引物/3’AOX通用引物1μL反应条件为：94°C预变性3min；94°C变性40s，54°C退火40s，72°C延伸30s，循环35次，之后72°C再延伸10min。取5μL菌落PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。2.7.7SnV-setIg-like结构域重组蛋白的小量诱导表达将菌落PCR检测结果呈阳性的200μLYPD菌液接种至2mLBMGY培养液中，210rpm、28°C培养至OD值约为5后，转移至8mLBMMY培养液中，210rpm、28°C诱导，每天补加甲醇至终浓度为1%，诱导表达4d。2.7.8SnV-setIg-like结构域重组蛋白小量诱导表达的鉴定取小量诱导表达液，室温7000rpm离心5min，取上清用15%SDS-PAGE鉴定SnV-setIg-like结构域的小量诱导表达情况，同时，将上清液浓缩后进行westernblotting鉴定。2.7.9SnV-setIg-like结构域重组蛋白小量诱导表达鉴定后的菌种保存吸取200μL经鉴定能够表达SnV-setIg-like结构域的重组酵母表达菌至2mL含100μg®/mLZeocin的YPD液体培养基中，30°C、210rpm培养1d，取700μl培养菌液，加入300μL灭菌的50%甘油，混匀后-80°C长期保存。2.7.10SnV-setIg-like结构域重组蛋白的大量表达挑取适量SnV-setIg-like结构域巴斯德毕氏酵母X-33保存菌种于10mL含终浓度10024 μg/mLZeocin®的YPD培养液中，210rpm、30°C培养2d。然后将其转移至200mLBMGY培养液中，210rpm、28°C继续培养至OD值约为5后，将其转至800mLBMMY培养液中，210rpm、28°C继续培养。每隔24h，补加甲醇至终浓度为1%。诱导表达4d。3结果与分析3.1SnV-setIg-like结构域的PCR扩增结果以pcDNA3.1-Sn为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR，Phusion高保真DNA聚合酶扩增SnV-setIg-like结构域目的基因片段，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如结果所示扩增出了与预期大小相同的339bp条带，表明应扩增出目的基因片段（图1.1）。图1.1SnV-setIg-like结构域的PCR扩增。箭头指示SnV-setIg-like结构域（339bp）目的基因。M.DL2000Marker；1.SnV-setIg-like结构域扩增产物。Fig.1.1PCRamplificationofSnV-setIg-likedomain.ThearrowindicatesthetargetgeneofSnV-setIg-likedomain(339bp).M:DL2000Marker;1:ThePCRproductofSnV-setIg-likedomain.3.2SnV-setIg-like结构域重组载体的菌落PCR鉴定结果将构建的SnV-setIg-like结构域重组载体转化克隆菌大肠杆菌DH5α，经菌落PCR筛选阳性重组子，此结果显示目的基因片段（339bp）已插入表达载体，重组载体应构建成功（图1.2）。后经测序鉴定，插入目的基因片段正确。25 图1.2SnV-setIg-like结构域重组载体的菌落PCR鉴定M.DL2000Marker；1-2.SnV-setIg-like结构域。Fig.1.2ColonyPCRverificationofSnV-setIg-likedomainrecombinantexpressionvectorM:DL2000Marker;1–2:colonyPCRverificationofSnV-setIg-likedomaininthevector;thearrowindicatesthetargetgeneofSnV-setIg-likedomain(339bp).3.3SnV-setIg-like结构域重组菌株的菌落PCR鉴定结果将线性化后的SnV-setIg-like结构域重组载体转化酵母X-33感受态细胞，经菌落PCR筛选阳性重组子，此结果显示目的基因片段（339bp）已插入表达载体，重组载体应构建成功（图1.3）。图1.3SnV-setIg-like结构域重组菌株的菌落PCR鉴定M.DL2000Marker；1-5.SnV-setIg-like结构域。Fig.1.3ColonyPCRverificationofSnV-setIg-likedomainrecombinantyeaststrainsM.DL2000Marker;1–5.ColonyPCRverificationofSnV-setIg-likedomaininthevector;thearrowindicatesthetargetgeneofSnV-setIg-likedomain(339bp).26 3.4SnV-setIg-like结构域westernblotting鉴定本实验对重组酵母菌株小量诱导表达上清进行了抗组氨酸标签westernblotting检测，如电泳结果所示，在15kDa出现了一条明显的条带，该条带的相对分子质量大小与理论计算值相符，确定该细胞表达了带有组氨酸标签的重组蛋白。结果表明，稳定重组细胞应表达了SnV-setIg-like结构域目的蛋白（图1.4）。图1.4SnV-setIg-like结构域的westernblotting检测Fig.1.4westernblottingtestofSnV-setIg-likedomain3.5SnV-setIg-like结构域的大量表达大量诱导表达后，SDS-PAGE未看到目的条带，结果表明，稳定重组细胞表达的SnV-setIg-like结构域目的蛋白量低，不利于后续深入研究。4结论与讨论本部分研究中，SnV-setIg-like结构域表达量较低。酵母表达系统表达外源蛋白质水平的高低与多种因素有关,只有对各方面因素进行全面了解和优化,才能提高外源蛋白质的表达量。影响因素主要有：（1）外源基因特性。对于外源基因mRNA5′端非翻译区(5′-UTR)，一个适当长度的5′非翻译区能促进mRNA有效翻译，因此使外源基因5′-UTR和AOX1mRNA5′-UTR尽量相同；许多A+T含量高的基因常由于提前终止而不能进行有效的转录，此时应重新设计序列，将含量保持在30%-55%范围内；采用酵母偏爱的密码子。在所有密码子中[105]酵母偏爱25个。（2）启动子的影响。外源基因转录水平与蛋白的表达量高低有密切关系，27 选择强的启动子有利于外源蛋白的高效表达。巴斯德毕赤酵母表达系统最常用的是乙醇氧化酶AOX1、AOX2，最近发现一个组成型三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PGAG，该启动子无需[106]甲醇的诱导，发酵工艺更方便，同时产量更高，成为最具潜力的启动子；（3）外源基因[107]的整合拷贝数越高，蛋白质的表达量越大，然而高的拷贝数也可能会对产量没有效果；（4）优化表达条件。主要包括培养基、摇菌密度、蛋白酶、通气量、诱导剂含量等。应保证充足的通气量；选择营养丰富的培养基，如BMGY/BMMY培养基含有蛋白胨和酵母提取物，更利于菌体的生长，同时也增加了生物量；调整培养基的pH值；将1%酪氨酸蛋白水解物等加入到培养基中以抑制蛋白酶的活性，也可最低化降解程度；OD值愈高，生物量就愈大，总的表达量就越高，但是培养基中的营养和氧含量会受到限制；诱导表达期间定期补充[108]诱导剂，如甲醇等。酵母作为最简单真核微生物,已成为现代分子生物学重要的模式工具以及外源基因的表达宿主。尽管已经有许多蛋白可以在酵母中得到高效的表达,但是还有一些不够完善的方面，酵母系统表达外源基因的规律还有很多没有被认识,某个基因是否能在酵母中得到表达,是否高效表达还存在很大的随机性,表达产物与天然蛋白质在结构上还有差异。本试验研究成功构建了SnV-setIg-like结构域酵母重组表达载体，经小量诱导表达westernblotting鉴定，结果出现清晰条带；但经大量诱导表达，SDS-PAGE结果未看到目的条带。这些实验结果证明SnV-setIg-like结构域重组蛋白在酵母表达系统中确实有表达，但表达量太低，可能与SnV-setIg-like结构域密码子未优化及表达条件不适宜有关。28 第二章SnV-setIg-like结构域在果蝇S2细胞克隆，表达，纯化，结晶及结构预测1引言果蝇S2细胞表达系统（DrosophilaExpressionSystem,DES）作为昆虫表达系统，克服了采用原核表达系统的缺点。该系统表达外源蛋白后能进行正确折叠、糖基化修饰及二硫键形成等翻译后的加工过程；表达的外源蛋白的结构、功能与天然蛋白质基本相同，而且能分泌到培养基中，分离纯化相对容易。与哺乳动物细胞表达系统相比，此系统表达量相对较高。另外，S2细胞的半贴壁特点使其易于悬浮培养，对生长环境无过高要求（可在无血清、无CO2环境下生长），便于规模化生产，是一种理想的表达外源蛋白质的细胞。本研究利用昆虫表达系统（果蝇胚胎DrosophilaSchneider-2，S2细胞）克隆、表达及纯化了SnV-setIg-like结构域重组蛋白，尝试对其进行结晶并预测了其空间结构，这些研究工作为Sn的结构生物学、其在PRRSV入侵过程中的作用及PRRSV入侵机制的研究提供了分子理论基础。2材料与方法2.1细胞及载体pcDNA3.1-Sn质粒由本实验室保存；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自大连TaKaRa公司；果蝇胚胎DrosophilaSchneider-2（S2）细胞、pMT/Bip/V5-HisA载体及pCoBlast载体均由中国科学院福建物质结构研究所黄明东研究员无偿馈赠。2.2酶及主要试剂Phusion高保真DNA聚合酶和PNGaseF购自NEB公司；BglⅡ和MluⅠ内切酶、T4DNA连接酶、DNAMarkerDL2000均购自大连TaKaRa公司；彩虹246广谱蛋白Marker（5-246kDa）购自北京索莱宝科技有限公司；CellfectinII脂质体转染试剂、Schneider’sDrosophilaMedium、blasticidin均购自美国Invitrogen公司。双抗购自美国HyClone公司。2.3试剂盒AEC底物显色试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自北京天根生化科技29 公司；无内毒素质粒抽提试剂盒购自美国OMEGA公司；蛋白质结晶条件筛选试剂盒购自美国HamptonResearch公司。2.4主要仪器设备恒温振荡器美国精骐有限公司霉菌培养箱上海一恒科学仪器有限公司-20°C冰箱青岛海尔股份有限公司三用电子恒温水箱北京中兴伟业仪器有限公司CKX31倒置显微镜日本奥林巴斯公司蛋白质晶体培养箱美国MD公司2.5SnV-setIg-like结构域重组载体的构建2.5.1引物的设计与合成根据GenBank中发表的猪源Sn序列（DQ176853）设计1对引物，分别引入BglⅡ和MluⅠ酶切位点（表2.1下划线标注），用以扩增SnV-setIg-like结构域（Val23-Val135）蛋白基因片段。引物序列见表2.1，上海生工生物工程股份有限公司合成。表2.1试验所用PCR引物Table2.1PCRprimers基因名称序列（5’-3’）扩增长度/bpGAAGATCTGTTTCCAGCCCCGAGACSnV-setIg-like结构域339CGACGCGTCACGGTGACAACTGTGCCT2.5.2SnV-setIg-like结构域的PCR扩增以pcDNA3.1-Sn为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶扩增目的基因，反应体系如下：无菌水29.5μL5×HFbuffer10μL2.5mMdNTPs4μL正向引物（10μM）2.5μL反向引物（10μM）2.5μL30 pcDNA3.1-Sn1μLPhusionDNA聚合酶0.5μL反应条件为：98°C预变性2min，98°C变性25s，54°C退火25s，72°C延伸15s，循环30次，之后72°C再延伸10min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。2.5.3SnV-setIg-like结构域PCR扩增产物的回收配制1%琼脂糖凝胶，将检测出的目的扩增条带剩余样品全部进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，使用DNA纯化回收试剂盒回收PCR扩增产物，最终加100μL无菌水溶解。2.5.4pMT/Bip/V5-HisA质粒的提取挑取适量克隆有pMT/Bip/V5-HisA大肠杆菌菌株于10mL含终浓度100μg/mLAmp的LB液体培养基中，37°C、210rpm培养过夜。待该菌液活化好后，使用质粒抽提试剂盒提取pMT/Bip/V5-HisA质粒，最终加100μL无菌水溶解提取质粒以作为下一步酶切反应用。2.5.5SnV-setIg-like结构域扩增回收产物与pMT/Bip/V5-HisA载体的双酶切将纯化回收的SnV-setIg-like结构域扩增回收产物和pMT/Bip/V5-HisA载体分别用BglⅡ和MluⅠ酶双酶切。将SnV-setIg-like结构域扩增回收产物用BglⅡ和MluⅠ酶双酶切，具体反应体系如下：PCR基因扩增回收产物42μL10×Hbuffer5μLBglⅡ1.5μLMluⅠ1.5μlL将pMT/Bip/V5-HisA载体用BglⅡ和MluⅠ酶双酶切，具体反应体系如下：pPICZαA质粒42μL10×Hbuffer5μLBglⅡ1.5μLMluⅠ1.5μL31 混匀后37°C酶切过夜。2.5.6SnV-setIg-like结构域扩增回收产物和pMT/Bip/V5-HisA载体酶切产物的回收配制1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后使用DNA纯化回收试剂盒回收双酶切产物，最终加100μL无菌水溶解。2.5.7SnV-setIg-like结构域与pMT/Bip/V5-HisA载体的连接将酶切回收的SnV-setIg-like结构域基因片段与pMT/Bip/V5-HisA载体片段连接，在16°C水浴中反应连接过夜。10µL连接反应体系为：SnV-setIg-like结构域酶切回收产物5μLpMT/Bip/V5-HisA载体酶切回收产物3μL10×T4DNA连接酶Buffer1μLT4DNA连接酶1μL混匀后16°C连接过夜。2.5.8SnV-setIg-like结构域重组载体的转化1.于-80°C冰箱取出DH5α感受态细胞，置于冰上，将10μL连接产物加到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻吹打混匀，在冰浴上静置30min。2.42°C水浴热激90s，然后将其迅速置于冰水中静置5min。3.向感受态细胞中加入900μLLB液体培养基，混匀后，37°C、120rpm振荡培养45-60min。4.4000rpm离心4min，然后将沉淀吹打混匀后取一半涂含终浓度100μg/mLAmp的LB平板，用无菌弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开，室温下至液体完全吸收，倒置平板，37°C温箱中培养12-16h。2.5.9SnV-setIg-like结构域重组载体的筛选与鉴定使用无菌牙签随机挑取10个平板上长出的单菌落于150μL含100μg/mLAmp的LB液体培养基中，37°C、250rpm培养3h后进行菌落PCR。20μL菌落PCR体系为：PremixExTaq10μL无菌水8μL32 培养菌液1μL正向引物/BGH1μL反应条件为：94°C预变性3min；94°C变性40s，54°C退火40s，72°C延伸30s，循环35次；之后72°C再延伸10min。取5μl菌落PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳以检测重组载体是否构建成功。注：BGH通用引物：5’-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’MTS通用引物：5’-CATCTCAGTGCAACTAAA-3’2.5.10SnV-setIg-like结构域菌落PCR检测阳性菌株的活化测序吸取20μL经菌落PCR检测呈阳性的菌液至2mL含终浓度100μg/mLAmp的LB液体培养基中，37°C、210rpm培养过夜，然后取1mL活化菌液送到上海生工生物技术有限公司，以MTS，BGH为引物进行测序，以鉴定SnV-setIg-like结构域重组载体构建是否正确。2.5.11SnV-setIg-like结构域测序后的菌种保存吸取50μL经测序鉴定构建正确的SnV-setIg-like结构域重组载体DH5α菌液至10mL含100μg/mLAmp的LB液体培养基中，37°C、210rpm培养过夜后，700μL菌液，与300μL50%灭菌后甘油混匀，-80°C长期保存。2.6SnV-setIg-like结构域的表达2.6.1SnV-setIg-like结构域重组载体质粒的提取将构建好的SnV-setIg-like结构域重组载体DH5α菌株至10mL含100μg/mLAmp的LB液体培养基中，37°C、210rpm培养过夜，过夜活化后使用OMEGA无内毒素质粒抽提试剂盒提取质粒，最终加100μL无菌水溶解用于下一步试验。2.6.2果蝇胚胎S2空载细胞的活化、转染及筛选取两支无菌的15mL离心管，分别加入5mLSM+双抗培养液，28°C温浴30min。冻7存的S2空载细胞浓度在1-2×10个/mL，每管含1.6mL的细胞悬浮液。从保存的液氮罐中取一管快速搓动溶解后，将其转入含有5mLSM+双抗培养液的15mL离心管中，室温1000rpm离心10min，去上清，加入5mL温浴的SM+双抗培养液于沉淀中，轻轻吹打混匀后，33 6将其转入无菌的T-25Flask中，28°C静置培养约2d。取细胞浓度在6×10个/mL左右的S2空载细胞，室温1000rpm离心10min，去上清，添加4倍体积的SFM培养液，轻轻吹打悬6浮。于无菌的6孔细胞培养板中，按每孔接种的细胞总数在1.5×10个，2mL体积加入细胞悬浮液，静置培养过夜。将所要转染的SnV-setIg-like结构域重组载体质粒（4μg）+100μL®SFM，涡旋混匀，静置30min。将10μLCellfectinⅡ细胞转染试剂+100μLSFM，涡旋混匀，室温下静置30min。将以上二者混合后，轻轻涡旋混匀，再静置15-30min后，轻轻滴加到已经铺好的S2空载细胞上，28°C，静置培养8h，与此同时以空载S2细胞为对照。转染8h后，去掉溶液，添加3mLSM+双抗培养液，28°C，静置培养2d。静置培养2d后，去掉培养液，添加3mLSM+双抗培养液，另外每孔加入终浓度为25μg/mL抗生素blasticidin，轻轻混匀后继续静置培养。3d后，换新鲜的SM+双抗培养液，并继续用终浓度为25μg/mLblasticidin筛选。重复筛选，直至对照组S2空载细胞全部死亡后，添加3mLSM+双抗培养液，轻轻吹打贴壁细胞将其悬浮后转至无菌T-25Flask中，28°C静置培养。2.6.3SnV-setIg-like结构域重组蛋白的小量诱导表达鉴定取筛选出的SnV-setIg-like结构域稳定重组S2细胞，室温1000rpm离心10min，去除原有培养基后，转至5mLSFM+双抗培养液中，28°C、100rpm培养。待细胞浓度达到64-5×10个/mL时，添加终浓度为0.75mmol/L的500mmol/LCuSO4，诱导120h后离心收取诱导表达上清液。取重组细胞诱导表达上清，经15%DS-PAGE电泳及抗组氨酸标签进行westernblotting鉴定，同时将诱导表达疑似条带切下，然后送上海生工生物工程股份有限公司进行质谱检测。2.6.4SnV-setIg-like结构域重组S2细胞的冻存将经小量诱导鉴定能表达重组蛋白的SnV-setIg-like结构域重组S2细胞转入到10mL7SM+双抗培养液中。28°C、100rpm培养至浓度为1-2×10个/mL后，将其转移到15mL无菌离心管中，室温1000rpm离心10min，去掉5.5mL上清液，然后加入1mLDMSO，再添加4.5mLSM+双抗培养液，吹打混匀。将其分装到冻存管中，每支冻存管中添加1.6mL的细胞悬浮液，用程序降温盒降至-80℃后保存在液氮里。2.6.5SnV-setIg-like结构域重组蛋白的大量表达将能够表达SnV-setIg-like结构域重组蛋白的S2细胞转至SFM+双抗培养液中，28°C、6100rpm扩大培养。当扩大到1L、细胞浓度达到4-5×10个/mL时，加入终浓度为0.75mmol/L34 的500mmol/LCuSO4诱导5d。2.6.6SnV-setIg-like结构域重组蛋白的纯化、结晶及结构预测诱导表达结束后，4°C、1000rpm离心10min去细胞沉淀。使用1mol/LTris-HClpH8.0调节其pH至pH7.5，4°C、10000rpm离心40min去除沉淀。上清液经0.22μm滤膜真空抽滤后于室温流过已平衡好（20mmol/LTris-HClpH8.0，150mmol/LNaCl平衡）的镍NTA亲和柱，20mmol/LTris-HClpH8.0，150mmol/LNaCl，150mmol/L咪唑洗脱目的蛋白。然后用20mmol/LTris-HClpH8.0，20mmol/LNaCl透析并浓缩。浓缩后分别在还原和非还原条件下用15%SDS-PAGE电泳检测。同时，将目的蛋白按照说明书用PNGaseF（Peptide-N-GlycosidaseF）处理并用15%SDS-PAGE电泳检测。将目的蛋白浓缩到10mg/mL时使用结晶筛选试剂盒、气相扩散法进行初筛。基于鼠源SnV-setIg-like结构域的晶体结构（PDBcode1QFP），将SnV-setIg-like结构域氨基酸序列代入SWISS-MODEL结构预测服[109]务器（http://swissmodel.expasy.org）进行结构预测分析，结果使用PyMOL软件展示。3结果与分析3.1SnV-setIg-like结构域重组载体的构建以pcDNA3.1-Sn为模板，利用设计的上、下游引物进行PCR扩增SnV-setIg-like结构域目的基因片段，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如结果所示扩增出了与预期大小相同的339bp条带（图2.1a）。将构建好的SnV-setIg-like结构域重组载体转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR筛选阳性重组子，此结果显示目的基因片段（339bp）已插入表达载体（图2.1b）。后经测序鉴定，插入目的基因片段正确。图2.1SnV-setIg-like结构域的克隆和载体构建Fig.2.1CloningandexpressionvectorconstructionofSnV-setIg-likedomain.(a)SnV-setIg-like结构域的PCR扩增；箭头指示SnV-setIg-like结构域（339bp）目的基因；M.DL200035 Marker；1.pSnV-setIg-like结构域扩增产物。(b)SnV-setIg-like结构域的载体构建和菌落PCR鉴定；M.DL2000Marker；1-2.SnV-setIg-like结构域菌落PCR鉴定.(a)PCRamplificationofpSnV-setIg-likedomain.ThearrowindicatesthetargetgeneofSnV-setIg-likedomain(339bp);M.DL2000Marker;1.ThePCRproductofSnV-setIg-likedomain;(b)ConstructionofSnV-setIg-likedomainexpressionvector(left)andthecolonyPCRidentificationoftherecombinantexpressionvector(right).M.DL2000Marker;1–2.ColonyPCRverificationofSnV-setIg-likedomaininthevector;ThearrowindicatesthetargetgeneofSnV-setIg-likedomain(339bp).3.2SnV-setIg-like结构域重组蛋白的鉴定如图2.2所示，重组载体稳定转染细胞的表达上清（泳道3和4）与未转染细胞（泳道1）及空载载体稳定转染细胞表达上清（泳道2）相比，在15kDa出现了一条明显的条带，该条带的相对分子质量大小与理论计算值相符。同时，本实验进行了抗组氨酸标签westernblotting检测，确定该细胞表达了带有组氨酸标签的重组蛋白（泳道5）。这些结果表明，稳定重组细胞应表达了SnV-setIg-like结构域目的蛋白（图2.2）。通过质谱检测，确定所诱导表达的重组蛋白的确为SnV-setIg-like结构域，进一步验证了重组昆虫细胞表达的正确性。部分序列比对结果见图2.3。图2.2SnV-setIg-like结构域的表达检测M.标准蛋白Marker；1.未转染细胞；2.空载载体转染后小量诱导表达对照；3、4.SnV-setIg-like结构域表达载体转染后小量诱导表达；5.SnV-setIg-like结构域表达载体转染后小量诱导表达抗组氨酸标签westernblottingFig.2.215%SDS-PAGEandwesternblottingidentificationofSnV-setIg-likedomainThearrowindicatesthetargetproteinofSnV-setIg-likedomain.M.Proteinmarker;1.InducibleexpressionofblankS2cellsasanegativecontrol;2.Inducibleexpressionofemptyvector-stablytransfectedS2cellsasanegativecontrol;3-4.InducibleexpressionofrecombinantSnV-setIg-likedomainexpressionvector-stablytransfectedS2cells;5.Anti-HistagWesternblottingofinducibleexpressionofrecombinantSnV-setIg-likedomainexpressionvector-stablytransfectedS2cells.36 图2.3序列比对1.目的蛋白序列；2.质谱结果；相同序列用红色标注Fig.2.3SequencealignmentofmassspectrometryandtargetSnV-setIg-likedomain.1.Sequenceofthetargetprotein;2.Massspectrometryresultoftheexpressedprotein.Thealignedsequencesarecoloredinred.3.3SnV-setIg-like结构域重组蛋白的纯化及结晶由于构建表达载体时在目的基因C端外加有6个组氨酸序列，因此本试验采用镍柱亲和纯化目的蛋白。镍柱纯化后能够将目的蛋白与杂蛋白分离开来，纯度高达99%（图2.4，泳道2）。如泳道1和泳道2所示，纯化的蛋白在还原及非还原条件下存在差异，这意味着存在二硫键。如泳道2和泳道3所示，PNGaseF处理和未处理的目的蛋白没有差异，这表明该蛋白没有N-糖基化修饰。同时，作者将该蛋白进行了结晶，但目前尚未获得晶体。图2.4SnV-setIg-like结构域的纯化、二硫键及N-糖基化修饰鉴定M.标准蛋白Marker；1.非还原条件下目的蛋白；2.还原条件下PNGaseF未处理的目的蛋白；3.还原条件下PNGaseF处理的目的蛋白。箭头指示目的蛋白。PNGaseF（~36kDa）在图中并未显示。Fig.2.4Purification,andtestingforthepresenceofdisulfidebondsandglycosylationofSnV-setIg-likedomain.ThearrowindicatesthetargetproteinofpSnV-setIg-likedomain.PNGaseF(about36kDa)isnotshowninthecurrentfigure.M.Proteinmarker;1.Thetargetproteinundernon-reducingcondition;2.Thetargetproteinunderreducingconditionwithoutdeglycosylation;3.ThePNGaseF-treatedtargetprotein.37 3.4SnV-setIg-like结构域蛋白的结构预测因为目前尚未筛选到晶体，所以作者使用蛋白质结构预测服务器对SnV-setIg-like结构域进行结构预测及分析（图2.5-2.7）。如图2.5所示，预测的SnV-setIg-like结构域由7个β股、2个螺旋组成，包含108个氨基酸，从N端23位缬氨酸（Val23）到C端130位甘氨酸（Gly130），含有一对二硫键（Cys41和Cys98）和一个游离的半胱氨酸Cys36，无糖基化位点。这些预测与其同源的鼠源Sn（UniProtentryQ62230，相似度67%）相似，并且与作者的实验结果吻合。据报道，第63位酪氨酸（Tyr63）和第116位精氨酸（Arg116）是唾液酸结合的关键氨基酸。如图2.6所示，Tyr63和Arg116突出出来形成夹型结构，这从结构方面解释了与唾液酸的结合机制。该图中，所有红色标注的氨基酸残基形成了一个界面，有利于Sn与PRRSV的GP5相互作用。图2.7中，唾液酸结合区域带正电荷和带负电荷的PRRSVGP5的唾液酸相匹配。总之，作者的结构预测和分析支持了目前Sn在PRRSV入侵过程中的作用，可能会为深入理解PRRSVGP5与SnV-setIg-like结构域相互作用提供帮助。图2.5SnV-setIg-like结构域结构预测。右侧模型是由左侧模型沿中心轴逆时针旋转90得到的（仅展示Val23-Gly130）。N端23位缬氨酸（Val23）、第36位游离半胱氨酸（Cys36）、形成二硫键的第41位半胱氨酸（Cys41）和第98位半胱氨酸（Cys98）、第63位游离酪氨酸（Tyr63）和第116位精氨酸（Arg116）在图中均已标出。Fig.2.5StructuralpredictionofSnV-setIg-likedomainTherightpanelisyieldedbyanticlockwiserotationoftheleftpanelalongalongitudinalaxisinthepage-face(onlytheresiduesfromVal23toGly130aredisplayed).N-terminalVal23,thefreecysteineCys36,thedisulfidebondformedbyCys41andCys98,andthekeyaminoacidsTyr63andArg116inthesialicacid-bindingregionarelabeled.38 图2.6SnV-setIg-like结构域唾液酸结合区域预测的SnV-setIg-like结构域用绿色标注。第122位甘氨酸（Gly122）至第126位丝氨酸（Gly122-Ser126）为唾液酸结合区域，其中第63位酪氨酸（Tyr63）和第116位精氨酸（Arg116）为唾液酸关键结合位点，均用红色标注。Fig.2.6Thesialicacid-bindingmoietyoftheSnV-setIg-likedomainThepredictedstructureoftheSnV-setIg-likedomainisshowninstructuralandsurfacerepresentation,andcoloredingreen(onlytheresiduesfromVal23toGly130aredisplayed).ResiduesfromGly122toSer126arethesialicacid-bindingregioncoloredinred.Tyr63andArg116arethekeybindingsitesandalsocoloredinred.图2.7SnV-setIg-like结构域蛋白表面电荷分析蓝色标示为带正电荷区域，红色为带负电荷区域。唾液酸结合区域用虚线圈注并用箭头指示。Fig.2.7SurfacechargeanalysisofthepSnV-setIg-likedomainThepredictedstructureoftheSnV-setIg-likedomainwasgeneratedwithvacuumelectrostatics(onlytheresiduesfromVal23toGly130aredisplayed).Themoietieswithpositivechargearecoloredinblueandthosewithnegativechargeinred.Thesialicacid-bindingregioniscircledbythedashedlineandindicatedbythearrow.39 4讨论以往研究已证实，Sn是PRRSV入侵的必需受体，但是后续研究发现，PRRSV也可感染不含Sn的非洲绿猴肾上皮细胞系MA-104和其衍生的MARC-145细胞系等，他们均没有Sn；另外CD163单独即可介导PRRSV的内吞。尤其是最近的研究表明，Sn基因敲除猪仍[110]然能够被PRRSV感染，证明Sn似乎并非是PRRSV感染的必需受体。因此对于Sn在PRRSV入侵过程中的功能，对其是否是PRRSV入侵必需受体存在争议。进一步地，即使Sn是PRRSV入侵必需受体，目前对于猪源Sn（pSn）、特别是SnV-setIg-like结构域的结构和功能及其与PRRSVGP5蛋白之间的相互作用仍缺乏深入了解。因此，对于pSn的结构生物学研究具有重大意义。本研究正是基于这一出发点，对SnV-setIg-like结构域在果蝇S2细胞中进行了克隆、表达、纯化，并对其进行了结晶及结构预测。作者预测的SnV-setIg-like结构域的结构既支持了pSn在PRRSV感染过程中的作用，同时也探索了pSn与病毒相互作用的关键区域和位点。需要指出的是，作者目前预测的结构不同于其他研究中的预测结构。这可能是因为其他预测结构包含有更多的氨基酸残基（aa1–150），这些残基可能形成了更多的β股（12个β股）。同时，作者预测的结构与mSnV-setIg-like的结构域存在一定差别。mSnV-setIg-like结构域的晶体结构包含一个β股（aa107-110），而pSn并不含有。这一区别可能是由动物种属氨基酸差异造成。当然，结构预测并不能代表目的蛋白的真实结构，因此作者正在进行SnV-setIg-like结构域的结晶以获得其结构生物学信息。这将帮助作者理解pSn在PRRSV入侵过程中的作用及PRRSV入侵的分子机制，从而为PRRSV的临床药物开发和疫苗的研制提供结构理论依据。40 全文总结作者创新性地利用毕式酵母表达系统及昆虫表达系统对SnV-setIg-like结构域进行了克隆、表达，并对其进行了纯化、结晶及结构预测。这些结果为研究SnV-setIg-like结构域结构，揭示其参与病毒相互作用的重要结构域和关键作用位点，促进理解其在PRRSV入侵过程中的作用，并为深入探究PRRSV入侵的分子机制奠定了分子基础。41 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附录参加的科研项目：1、国家自然科学基金重大项目项目名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒入侵和持续感染的分子机制项目编号：314906012、河南省基础与前沿技术研究项目项目名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒假定入侵受体唾液酸粘附素Sn结构与功能研究项目编号：162300410252硕士期间发表的论文：1、JieHou,RuiLi,HongfangMa,SonglinQiao,GaipingZhang.StructuralpredictionofporcinesialoadhesinV-setIg-likedomainshedssomelightonitsroleinporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)infection[J].Frontiersofagriculturalscienceandengineering,2016,3(1):65-71.2、侯婕,李睿,马红芳,乔松林,张改平.猪繁殖与呼吸综合征病毒入侵受体唾液酸粘附素的表达与纯化[J].河南农业科学,2016,45(3):130-134.3、YinbiaoWang,SonglinQiao,XuewuLi,WeitaoXie,JunqingGuo,QingmeiLi,XiaoLiu,JieHou,YanqiXu,LiWang,ChengliuGuo,GaipingZhang.Molecularepidemiologyofoutbreak-associatedpseudorabiesvirus(PRV)strainsincentralChina[J].VirusGenes,2015,50(3):1-9.49