猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立

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AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立学位申请人：魏艳秋指导教师：宋勤叶教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期二〇一五年五月二十四日 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文屮作了明确的说明丼表示谢意。学位论文作者签名:签字n期：办/s•年（月jH学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解、河jt:农业大学存关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权、河北农业大学可以将学位元论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。c保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字H期：械年/月3H签字F1期：冲年/月3R学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话:通讯地址：邮编: 分类号：S855.3单位代码：10086密级：公开学号：2012363猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立PreparationofaColloidalGoldImmunochromatographyforDetectionofPorcineEpidemicDiarrheaVirususingMonoclonalAntibodies学位申请人：魏艳秋指导教师：宋勤叶教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月二十四日 摘要猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。其临床症状与猪传染性胃肠炎、轮状病毒感染等其他肠道传染病极易混淆，制备PEDV特异性诊断试剂，并建立快速检测方法具有重要的实践意义。核蛋白（nucleoprotein,N蛋白）是PEDV的主要结构蛋白，保守性强，是病毒感染早期诊断和疫病监测的主要靶蛋白。本论文应用杂交瘤技术，制备针对N蛋白的特异性单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb），旨在以McAb为材料建立检测PEDV的胶体金免疫层析检测方法，为进一步研发特异、便捷的诊断工具搭建必要的技术平台。本研究以纯化的重组N蛋白作为抗原，免疫4只雌性BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术，经过3~5次亚克隆和筛选，获得了4株分泌抗PEDVMcAb的杂交瘤细胞，分别命名为A7、E10、F7、C1株杂交瘤细胞，其染色体数目在97~103之间。经亚类鉴定，4株杂交瘤细胞分泌的McAb均为IgM类，其轻链均为κ链，分别识别4个不同的抗原表位。Westernblot和免疫组化鉴定显示，4株McAb均能够与PEDVN蛋白，或与PEDV感染猪小肠绒毛上皮细胞内的PEDV特异结合。A7、E10、F7和C1株杂交瘤细胞的培养上清抗体效价分别为1:1600、1:100、1:100和1:100，腹水抗体6532效价分别为1:10、1:10、1:10和1:10。将4株杂交瘤细胞连续传代30代，具有良好的抗体分泌稳定性。应用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20nm的酒红色胶体金悬液，用其标记纯化的McAbA7。将40μg/mLpH8.0的胶体金标记抗体McAbA7吸附于玻璃纤维素膜上，制备金标垫；以1mg/mL的McAbF7和羊抗鼠IgM，按照5μL/cm的包被量，印迹于硝酸纤维膜，分别作为检测线与质控线，组装试纸条。该试纸条能够特异地与PEDV感染猪小肠组织中的病毒反应，在检测线与质控线处分别出现一条红色线。同时用组装的试纸条和RT-PCR检测13份来自不同猪场的腹泻仔猪小肠内容物，试纸条与RT-PCR的阳性检出率分别为38.46%（5/13）和46.15%（6/13），两者的总符合率为83.3%，表明利用抗PEDVN蛋白单克隆抗体建立的PEDV胶体金免疫层析试纸条能够快速、特异地检测PEDV，为进一步开发应用PEDV胶体金免疫层析试纸条检测试剂盒搭建了必要的技术平台。关键词：猪流行性腹泻病毒；N蛋白；单克隆抗体；胶体金免疫层析检测法 PreparationofaColloidalGoldImmunochromatographyforDetectionofPorcineEpidemicDiarrheaVirususingMonoclonalAntibodiesAbstractPorcineepidemicdiarrhea(PED),causedbyporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV),isahighlycontagiousintestinalinfectiousdiseasescharacterizedbywaterydiarrhea,womiting,dehydration,andhighmotalityinsuckingpiglets.PEDareeasilyconfusedwithtransmissiblegastroenteritisandrotavirusinfectionwhileclinicaldiagnosis.AndthepreparationofspecificdiagnositicreagentsanddevelopmentarapiddetectionmethodforPEDVareveryimportant.Nucleoprotein(N),ahighlyconservedprotein,isamajorstructuralproteinofPEDVandthemaintargetforearlydiagonosisanddiseasemornitoring.Inordertoprovideanecessarytechnicalplatformfordevelopmentofspecificandconvenientdiagnostictool,PEDVNproteinmonoclonalantibodies(McAb)werepreparedbyhybridomatechniqueandcolloidalgoldimmunochromatographymethodwasestablishedusingtheMcAb.FourBALB/cmicewereimmunizedwiththepurifiedrecombinantNproteinofPEDV.Byhybridomatechnique,fourstrainsofhybridomacells,namedA7,E10,F7andC1,secretingMcAbagainstNproteinwereobtainedthrough3~5timesofsubcloningandscreening.McAbssecretedby4hybridomacells,owned97~103chromosomes,belongedtoisotypeofIgMwithkappa(κ)lightchain,andtheytargetedfourdifferentantigenepitopsofNprotein.FourMcAbscombinedspecificallywithNproteinbywesternblotandwithPEDVinintestinalepithelialcellsfromPEDV-infectedpigletsbyimmunohistochemistryassay,respectively.TheantibodytitersofstrainA7,E10,F7andC1inculturalsupernatantofhybridomasandinmousesciteswere1:1600,1:100,1:100,65321:100,and1:10,1:10,1:10,1:10,respectively.AlloffourhydbridomaswereabletokeepstablysecretingMcAbsatleast30generationsbycontinuouspassage.Colloialgoldwithabout20nmparticlediameterwerepreparedusingtrisodiumcitratecreduction.McAbofA7strainwaslabeledusingcolloidalgold.Colloidalgold-labeledMcAbpadwith40μg/mLofMcAbA7(pH8.0)weremadebyabsorbingcolloidalgold-labeledMcAbtotheglasscellulosemembrane.McAbF7andgoatanti-mouseIgMof5μLwererespectivelysprayedonthenitrocellulosemembraneeachcmataconcentrationof1mg/mLasatestlineandaqualitycontrolline.Thenthecolloidalgold-labeledMcAbpadandthenitolcellulosemembranewiththetestlineandthequalitycontrollinewereassembledintoacolloidalgoldteststrip.PEDVinporcineintestinalcontentcouldbeidentifiedspecificallyusingtheteststrip,andmeanwhilearedlineatthetestlineandatthequalitycontrollinewaspresentrespectively.Furthermore,13samplesofintestinalcontentfromvariouspigfarmswerecheckedusingtheteststripandRT-PCR simutaneously.Thepositivepercentsofdetectionwere38.46%and46.15%usingteststripandRT-PCR,respectively,andthecoincidencerateoftwomethodswas83.3%.TheresultsofsampledetectionindicatedthatthecolloidalgoldteststripwasabletospecificallyandrapidlydetectPEDV.Keywords:Porcineepidemicdiarrheavirus;Nprotein;Monoclonalantibodies;Goldimmunochromatographyassay 缩略词表LISTOFABBREVIATION英文缩写英文全称中文全称PED（V）Porcineepidemicdiarrhea(virus)猪流行性腹泻（病毒）TGE（V）Transmissblegastroenteritis(virus)猪传染性胃肠炎（病毒）ORFsOpenreadingframes开放阅读框ntNucleotide核苷酸KDaKilodalton千道尔顿HTHypoxantin&thymidin次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷HATHypoxantin&aminopterin&thymidin次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷DAB3,3’-diaminobenzidine3,3’-二氨基联苯胺DTTDithiothreitol二硫苏糖醇IPTGβ-D-thiogalactopyranoside异丙基硫代半乳糖苷EDTAEthylenediaminetetraacetaticacid乙二胺四乙酸PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白PEGPolyethylene聚乙二醇SDS-PAGESDS-PolyacrylamidegelelectrophoresisSDS聚丙烯酞胺凝胶电泳ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附实验RT-PCRReversetranscription-PCR逆转录-PCRMcAbMonoclonalAntibody单克隆抗体NCNitrocellulosemembrane硝酸纤维膜FCAFreud’scompleteadjuvant佛氏完全佐剂FIAFreud’sincompleteadjuvant佛氏不完全佐剂IgGImmunoglobulinG免疫球蛋白GIgMImmunoglobulinM免疫球蛋白MHRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶TrisTrishydroxymethhylaminomethane三羧甲基氨基甲烷DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜ODOpticaldensity光密度MWCOMolecularWeightCutoff截留分子量 目录1引言........................................................................................................................................................11.1猪流行性腹泻.............................................................11.1.1PEDV的形态与分类..................................................11.1.2PEDV的理化与培养特性..............................................21.1.3PEDV的基因组结构..................................................21.1.4PEDV编码的主要结构蛋白............................................21.1.5流行特点...........................................................31.1.6临床症状与病理变化.................................................31.1.7PEDV的实验室检测技术..............................................41.1.8疫苗...............................................................41.1.9防治...............................................................51.2胶体金免疫层析技术.......................................................61.2.1胶体金的特性及制备.................................................61.2.2免疫胶体金的制备...................................................61.2.3胶体金免疫层析技术在兽医传染病诊断中的应用.........................71.3研究内容与技术路线.......................................................81.3.1研究内容...........................................................81.3.2技术路线...........................................................81.4研究目的与意义...........................................................82材料......................................................................................................................................................102.1单克隆抗体制备用材料....................................................102.1.1细胞、毒株及蛋白..................................................102.1.2实验动物..........................................................102.1.3主要试剂与试剂盒..................................................102.1.4细胞培养用液......................................................102.1.5酶联免疫吸附试验（ELISA）相关试剂及配制...........................112.1.6SDS-PAGE电泳用溶液..............................................112.1.7Western-Blotting用溶液..............................................122.1.8免疫组织化学试验所用试剂..........................................122.2胶体金免疫层析检测方法建立用材料........................................132.2.1血清与临床检测样品................................................132.2.2免疫层析材料......................................................132.2.3胶体金常用溶液....................................................132.3主要仪器设备............................................................143方法......................................................................................................................................................153.1猪流行性腹泻单克隆抗体的制备............................................153.1.1单克隆抗体筛选间接ELISA方法的建立................................153.1.2PEDVN蛋白的表达与纯化...........................................163.1.3动物的免疫........................................................163.1.4SP2/0细胞的准备...................................................173.1.5饲养细胞的制备....................................................173.1.6免疫脾细胞的制备..................................................173.1.7细胞融合..........................................................173.1.8阳性杂交瘤细胞的筛选、克隆........................................18 3.1.9阳性杂交瘤细胞的冻存与复苏.........................................183.1.10杂交瘤细胞染色体分析..............................................193.1.11单克隆抗体的鉴定..................................................193.1.12单克隆抗体的大量制备..............................................203.1.13单克隆抗体效价检测................................................213.1.14腹水中单克隆抗体的纯化及蛋白含量的测定............................213.2胶体金免疫层析检测方法的建立.............................................213.2.1金颗粒的制备.......................................................213.2.2单克隆抗体的胶体金标记.............................................223.2.3金标垫的制备.......................................................243.2.4印膜..............................................................243.2.5试纸条的组装与结果判定标准.........................................243.2.6试纸条的特异性与敏感性.............................................253.2.7初步应用...........................................................254结果.....................................................................................................................................................264.1PEDV抗体检测间接ELISA方法............................................264.1.1最适抗原包被浓度与封闭液...........................................264.1.2最适待检血清与酶标抗体浓度.........................................264.1.3显色时间...........................................................274.1.4判定标准...........................................................274.1.5特异性与敏感性.....................................................284.2PEDVN蛋白的表达与纯化.................................................294.3免疫小鼠的血清PEDV抗体................................................304.4细胞融合与杂交瘤细胞的筛选...............................................304.5杂交瘤细胞的染色体.......................................................314.6单克隆抗体的类型.........................................................314.7单克隆抗体识别的抗原表位.................................................324.8单克隆抗体的免疫活性.....................................................334.9单克隆抗体效价...........................................................344.10杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性..............................................354.11腹水的纯化及其蛋白含量..................................................364.12制备的胶体金及其质量....................................................364.13胶体金标记抗体的最适稳定量..............................................374.14胶体金标记抗体的最适pH值..............................................384.15检测线的抗体包被浓度....................................................394.16质控线的抗体包被浓度....................................................394.17包被液.................................................................404.18试纸条的特异性与敏感性..................................................404.19初步应用...............................................................415讨论.....................................................................................................................................................425.1单克隆抗体的制备.........................................................425.2金标抗体的制备...........................................................435.3胶体金免疫层析检测方法的建立.............................................435.4试纸条的检测效果及存在问题...............................................446结论.....................................................................................................................................................45参考文献.................................................................................................................................................46在读期间发表的学术论文......................................................................................................................53作者简介.................................................................................................................................................54致谢.......................................................................................................................................................55 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立1引言1.1猪流行性腹泻猪流行性腹泻（PorcineEpidemicDiarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）引起的以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接[1]触性的肠道传染病。1971年PED在英国首次被发现，其主要引起育肥猪和架子猪的急性腹泻，[2]当时被称为“流行性病毒性腹泻”。1977年比利时首次报到可以侵害哺乳仔猪的类似TGE的急性腹泻，在排除了TGEV和其他已知的肠道致病性病原后，将该病称为“2型PEDV”以区别于早期发现的1型腹泻，随后分离到该病毒命名为“CV777”。1982年将该病统一称为“猪流行性腹泻”。此后该病在欧洲和亚洲广泛而迅速地传播，比利时、荷兰、加拿大、匈牙利、德国、[3]法国、日本、韩国、中国等多个国家相继报道PED的发生,造成严重的经济损失。中国自20[4]世纪80年代初以来陆续有本病发生的相关报道，并分离到该病毒。2010年以来，我国大部分地区爆发了由PEDV变异毒株引起的腹泻，此次疫情的临床症状较以往的流行严重，初生仔猪发[5]病率达90%～100%，死亡率为70%～100%，给养猪业造成了沉重打击。2013年，美国爆发[6]该病，并迅速传播，据统计2013年～2014年间，约50%的猪场遭受了该病的危害。1.1.1PEDV的形态与分类PEDV粒子大小为95-190nm，平均直径为130nm（包括纤突）。病毒粒子呈多形性，大多呈球形，粒子中心有电子不透明区域，棒状纤突从核心向四周呈放射性分布，长度约为18-23nm[7-8](图1-1)。此病毒结构与猪传染性胃肠炎病毒在形态学上很难区别。2008年国际病毒分类委员会（InternationgalCommitteeonTaxonomyofviruses,ICTV）第八次报告中将PEDV划分为尼多病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、α﹣冠状病毒属（Alphacoronavirus）的成员。与其同属的还有猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪呼吸道冠状病毒PRC0V等。图1-1PEDV结构示意图Fig.1-1TheschematicdiagramofPEDV1 河北农业大学硕士学位（毕业）论文1.1.2PEDV的理化与培养特性PEDV对氯仿和乙醚较为敏感，其庶糖悬浮密度为1.18g/mL。在60℃以上的条件下处理30min，PEDV失去感染细胞的能力，但在4℃pH5.0-9.0或在37℃pH6.5-7.5条件下，病毒可以[9]稳定存在。PEDV没有血凝性。1988年Hofinann等在Vero细胞上成功增殖了PEDV，并认为此次成功主要依赖Vero细胞[10]培养基中添加的胰酶，胰酶对PEDV纤突糖蛋白的切割作用，增强了PEDV对细胞的感染能力[11][12]。此后该方法在PEDV的分离培养及疫苗开发研究中被广泛应用。随着各国研究者对PEDV的深入研究，发现在仔猪膀胱及肾脏原代细胞上可以成功培养出PEDV，同时在MA104、KSEK6、[13-14]IB-RS-2、ESK、CPK等传代细胞上也可以成功地培养出PEDV。1.1.3PEDV的基因组结构PEDV基因组大小约为28nt，为有囊膜的、不分节段的、单股正链RNA病毒。病毒基因组[15]具有5'端帽子结构，3'端polyA尾巴；由5'端非翻译区（5’untranslatedregion,UTR）、7个开放阅读框（openreadingframes，ORFs）和3'端UTR组成，共编码3个非结构蛋白（复制酶1a、1b以及ORF3）和4个结构蛋白[纤突（spike,S）蛋白、膜（membrane,M）蛋白、核衣壳（nucleocapsid,N）蛋白与囊膜（envelope,E）蛋白]。编码蛋白的排列顺序为5'—多聚复制酶（la/lb）[16-17]—S—ORF3—E—M—N—3'。复制酶基因涵盖了全基因组的三分之二，编码复制酶la和lb的两个ORFs之间有46nt的重叠序列，该序列中有滑动序列（UUUAAAC）和假结结构。编码结构蛋白S（150-220kDa）、E（7kDa）、M（20-30kDa）和N（58kDa）的基因依次排列于多[18]聚蛋白酶基因下游。ORF3基因作为一个附属基因，其位于结构蛋白基因之间，编码附属蛋白（图1-2）。图1-2PEDV基因组结构Fig.1-2GenomestructureofPEDV1.1.4PEDV编码的主要结构蛋白1.1.4.1S蛋白PEDVS蛋白由1383个氨基酸（aa）组成，属于I型糖蛋白。该蛋白包含信号肽（l-18aa），中和表位（499-638，748-755，764-771和1368-1374aa），—个跨膜区（1334-1356aa）和一个[19]较短的胞浆区。与其他冠状病毒S蛋白类似，PEDVS蛋白是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白[20][21-22]，分为Sl区（l-789aa）和S2区（790-1383aa）。S蛋白在免疫反应过程中起识别靶细胞、[23-24]促进病毒和细胞膜融合、介导中和抗体的产生等作用，因此，S蛋白被认为是有效抵抗冠状2 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立[25-26]病毒的主要靶抗原，对新型疫苗设计与研究具有重要意义。另有研究表明，S蛋白与病毒在[27-28]体外培养的适应性和体内感染过程中的毒力减弱有关。此外，S蛋白容易发生变异，对该蛋[29]白结构的研究可以帮助鉴别区分毒株的变异与其流行情况。1.1.4.2M蛋白[30]M蛋白是由226aa组成的跨膜糖蛋白，对病毒粒子的出芽和组装起重要的作用。M蛋白由病毒囊膜内较长的C末端区、中间的α螺旋区与暴露于病毒囊膜外较短的糖基化N末端区，3[31][32]个结构域组成。M蛋白可以诱导产生中和抗体，介导机体产生α-干扰素（α-IFN）。体外共[33-34]表达M蛋白和E蛋白时，能够形成具有与完整病毒相似活性的类病毒样颗粒。所以M蛋白[35-36]可以作为基因工程疫苗研究候选蛋白。1.1.4.3N蛋白[37]N蛋白是由441aa组成，其与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳。N蛋白有3个[38]相对保守的结构域，位于中间的是一个与病毒RNA前导序列相结合的RNA结合域。在病毒[39]RNA合成过程中，N蛋白与细胞膜和磷脂结合，从而促进病毒的组装和RNA复制体的形成。N蛋白有6~7个潜在的磷酸化位点，在pH9.0低渗非离子溶剂中的溶解度最大。N蛋白在感染的[40-41]细胞中能够大量的表达，猪在感染PEDV的早期，体内就能产生高水平抗N蛋白的抗体。同时，在PEDV的结构蛋白中，N蛋白是主要的结构蛋白，保守性强，是PEDV感染早期诊断与疫[42-43]病监测的重要靶蛋白，因此，利用N蛋白建立PEDV诊断技术具有良好的开发应用前景。1.1.4.4E蛋白E蛋白是由76aa组成，位于病毒囊膜的小包膜蛋白，在病毒的出芽和组装过程中起重要的作用。有研究学者将PEDVE和M基因转入到甲病毒载体中（pSFV），并在BHK21细胞中得[44]到成功表达，该方法为更深入地研究PEDVE蛋白和M蛋白的抗病毒作用奠定了基础。1.1.5流行特点本病毒通过病猪排泄的粪便及污染饮水、饲料和环境散播。病猪是本病的主要传染源。粪－口途径是该病毒传播的主要方式，健康猪群经口接种含PEDV的粪便即可发生自然感染。本病多[45]发生在寒冷的秋冬季节，但偶尔也会发生于夏季，可感染各年龄阶段的猪，其中母猪的发病率[46]为15%~90%，育成猪和仔猪较高为100%。虽然，PED是在世界范围内发生的猪传染性疾病，[47]但是其在亚洲的严重程度及爆发频率已经超过了欧洲。近年，PEDV的爆发相对集中在养猪业[48-49][50]发达的国家，如韩国，菲律宾和中国。2013年来，本病在美国多个州的养猪场爆发流行。1.1.6临床症状与病理变化PED最明显症状是水样腹泻，并伴有呕吐，呕吐多发于进食后。该病在不同年龄阶段猪的潜伏期不同，新生仔猪为24~36小时，育肥猪为48小时以上，人工感染PED为8~24小时。随着猪只年龄大小的不同，临床症状也有一定的差异，一般情况下年龄越小，症状越重。病猪体温3 河北农业大学硕士学位（毕业）论文正常或稍高，精神沉郁、食欲减退或消失、消瘦。新生仔猪在发生腹泻后3~4天出现严重的脱水[51]而死亡，死亡率可高达100%。育肥猪在育肥后期对本病毒的易感性高，且比TGEV引起的腹泻严重，一旦发病，发病率最高达100%。成年猪的临床症状较轻，死亡率较低为1%~3%。轻者仅表现为呕吐，重者则出现严重的水样腹泻，少数猪可自愈，但会导致生长发育不良的现象。自然感染和人工感染PEDV的仔猪均可引起明显的病理变化，主要表现为：小肠鼓气，肠壁变薄，肠内充满大量黄色液体。攻毒后24h，在仔猪小肠绒毛上皮细胞上出现空泡化、变短、脱[52]落等组织学的变化，此组织学变化与仔猪腹泻发生的时间相吻合。PEDV感染引起的肠道病理[53]变化与TGEV的十分相似，但在PEDV感染猪的结肠中未能观察到相应的病理变化。经超微结构观察，发现病变主要发生于小肠上皮细胞的胞浆中，其细胞器减少，微绒毛和末端网状结构[54]消失，小肠细胞间连接消失，细胞脱落并进入肠腔。在结肠细胞中，虽然发现一些病理变化，但未见细胞的脱落。1.1.7PEDV的实验室检测技术导致猪腹泻的病原较多，并且临床症状和病理变化相似，因此PED的诊断不能仅以临床症状和病理切片作为判断的依据。为了鉴别区分PEDV与其他病原引起的腹泻，需要使用实验室检[55-56]测技术。目前，免疫电镜观察、免疫组织化学、免疫荧光试验（IF）及酶联免疫吸附试验（ELISA）等多种技术用于PEDV的检测。这些方法能够准确的诊断出PEDV，但操作复杂且耗时较长。Kim等（2001）比较了RT-PCR、免疫组织化学和原位杂交三种PEDV检测技术，发现RT-PCR方法[57-58]检出率最高。已有多种针对PEDV基因组不同区段的RT-PCR技术，用于该病毒的检测。以[59]PEDV前导区基因序列为基础而建立的RT-PCR方法，可以成功检测到实验室毒株和野毒株。以M基因设计的引物应用于PEDV的RT-PCR检测，同时建立了多重RT-PCR用以鉴别PEDV和TGEV。多重RT-PCR方法具有快速、灵敏和经济实用等优点，被应用于混合感染中PEDV的[60]检测。另外，商业化双启动寡聚核苷酸系统，采用单管一步多重RT-PCR技术已应用于PEDV[61]检测中。RodakL等（2005）建立了用PEDVM蛋白的McAb检测病毒的ELISA方法，该方法具有[62]较高的敏感性和特异性，适于PEDV的流行病学调查；Oh等（2005）和Hou等（2007）建[63-64]立了检测血清中PEDV抗体的间接ELISA方法，其为PEDV的血清学监测提供了必要的技术手段。免疫层析试纸检测技术以其快速、便捷的特点倍受临床工作者青睐。现有针对PEDVM蛋白、[65]PEDV血清抗体快速检测试纸的相关报道。胶体金免疫层技术相对于RT-PCR和ELISA准确性较低，但其可以在l5min内做出快速的诊断。在疫情爆发时，免疫层析方法具有其明显的优越性。当前，由于PEDV的广泛流行，无论科研院所，还是企业都非常重视PEDV快速检测技术的研究与开发。1.1.8疫苗目前用于临床或处于研究阶段的PED疫苗主要包括3类：灭活疫苗、减毒疫苗和基因工程疫苗。4 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立1.1.8.1灭活疫苗王明等（1993）将PEDV沪毒株（S株）口服接种仔猪，然后采集发病仔猪的肠内容物和小肠组织，制成乳剂，以氢氧化铝为佐剂制成组织灭活苗，经过后海穴注射免疫母猪。接种后的2[66]周开始产生免疫力，免疫周期可达六个月。虽然该疫苗的免疫效果比较好，但其产品质量难以控制和保证，且生产成本偏高。因此，马思奇等（1994）将CV777毒株适应于Vero细胞培养后，[67]以28代毒用氢氧化铝灭活后制成疫苗。该方法制备的细胞灭活疫苗可用于PEDV的预防控制。1.1.8.2弱毒苗灭活疫苗虽然安全、稳定，但不适合紧急预防接种，而且成本高，所以有必要研究开发PED弱毒疫苗。目前，PED商品化的弱毒疫苗主要有来自日本的P-5V株、韩国的KPED-9株和DR13株以及中国的CV777株。P-5V疫苗株于1997年开始用于日本和韩国的母猪PED预防。CV777[68]弱毒疫苗株是将适应于Vero细胞的CV777毒株连续传至90代弱化制成的，经6代次的返祖传代，未见其毒力返强仍稳定，并且克隆后的弱毒株仍保持良好的免疫原性，主动免疫的保护率为95.92%，被动免疫的保护率为96.2%。KPEDV-9毒株是从新生患病仔猪分离的，通过Vero[69]细胞连续传代93代后弱化而成韩国的KPED-9疫苗株。DR13强毒是从仔猪小肠内容物分离得[70]到的，其在Vero细胞连续传代至100代制成DR13疫苗株。DR13疫苗株口服免疫怀孕母猪能够降低新生仔猪的死亡率，免疫效果比注射接种更有效，由该毒株生产的弱毒疫苗自2004年在韩国开始用于PED预防。2011年DR13口服疫苗在菲律宾商品化大规模生产，并用于当地的PED[71]预防。1.1.8.3基因工程疫苗粘膜免疫在病毒性腹泻的免疫机制中起重要的作用，于是一些学者应用转基因烟草和乳酸杆菌进行PEDV口服疫苗的研究。研究表达PEDV抗原的转基因烟草，能够诱导产生理想的粘膜免[72]疫反应，达到了预防猪流行性腹泻的目的，但外源抗原在烟草中表达水平较低，而限制转基因[73]疫苗的发展。另有使用乳酸杆菌表达重组PEDVN蛋白进行粘膜免疫的报道，发现重组PEDVN蛋白能诱导产生高水平的粘膜型的IgA和循环性IgG的免疫应答，但在小鼠或仔猪体内都没有[74]检测到中和抗体。1.1.9防治[75]病猪和人的流动是PED传播的主要原因。因此，在本病的防治中，除加强饲养管理，改善卫生条件和定期的消毒外，还要严格限制工作人员出入，防止病毒侵入猪场内。坚持自繁自养，引进猪必须隔离观察21天，避免从疫区引进。针对本病无特效药物，发生疫情时，需提供自由饮水。对于病猪应使其口服或腹腔注射补液盐，以减少脱水的发生，同时，应停止喂料。此外，[76]可以将腹泻仔猪的粪样或病死猪的小肠匀浆人工感染妊娠母猪，使母猪产生特异性免疫力，仔猪吃奶时便获得被动免疫。免疫接种是预防本病的重要手段，我国采用的疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗。目前应用的疫苗有“猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联弱毒疫苗”和“猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二5 河北农业大学硕士学位（毕业）论文[77-78]联灭活疫苗”。在母猪产前6周、2周接种，能明显的降低猪流行性腹泻及猪传染性胃肠炎[79]的发生率。1.2胶体金免疫层析技术[80-81]免疫层析技术是上世纪八十年代初建立的一种重要的免疫分析方法。而胶体金免疫层析技术是在抗原和抗体特异性结合的基础上，将胶体金标记技术、免疫层析分析技术有机结合在一起的一种固相标记免疫检测技术。1971年，Faulk和Tayla用兔抗沙门氏菌血清与制备的胶体金悬液结合，作为新型标记物制成胶体金标记抗体，标志着胶体金技术在免疫分析领域的成功应用[82]。随后胶体金技术得到了快速发展，进入到免疫诊断领域。胶体金应用于免疫层析诊断技术，检测速度大大提高，同时具有成本低廉，操作简单，无需附加设备等优点，得到了广泛的推广应用。1.2.1胶体金的特性及制备1857年Faraday发现了胶体金，胶体金是利用还原剂将氯金酸还原为带负电的金原子，以一-+个金核为中心，其周围环绕负离子（AuCl2），另外，在外层离子层则环绕有H，具有很高的电子密度，以维持悬浮状态的一种胶体悬液。在电子显微镜下能够清晰地观察到胶体金的颗粒形态：其形状是多样的，直径小的金颗粒呈圆球形，直径大的（一般指大于30nm）的则呈椭圆形。不同直径大小的胶体金颗粒呈现的颜色也不同，直径30-80nm的胶体金呈紫红色，10-20nm的胶[83]体金呈酒红色，2-5nm的胶体金呈橙黄色。因此，肉眼可以粗略估计所制胶体金颗粒直径。目前为止，除经典的Frens法外，己经发展了多种制备胶体金的方法。不同用途、不同大小[84]的胶体金颗粒需用不同的方法来制备。化学还原法是最为简单和常用的制备方法，其基本原理3+是向一定浓度的氯金酸溶液中加入还原剂使Au还原成金原子。随着溶液中的金原子的增多，当达到了饱和状态时，会析出纳米级的小金粒子，其余的金原子则依附于小金粒子上而使其长大。通过改变还原剂的种类和剂量来控制所产生的金颗粒大小。还原剂的浓度越高，产生金粒子的数量越多，粒径也就越小。目前比较常用还原剂有：柠檬酸三钠、乙醇、白磷、硼氢化钠、过氧化氢、鞣酸、抗坏血酸等。其中柠檬酸三钠的应用最普遍，本实验也选择了柠檬酸三钠作为还原剂。1.2.2免疫胶体金的制备胶体金标记是胶体金颗粒表面吸附蛋白质等生物大分子物质的过程。由氯金酸制备出的不同大小粒径的金颗粒对蛋白质具有很强的吸附功能。金颗粒可以与免疫球蛋白、葡萄球菌A蛋白、毒素、酶、抗生素、激素、糖蛋白、牛血清白蛋白等非共价结合。在免疫组织化学中，蛋白质与胶体金结合的复合物称为金探针，该复合物用于免疫检测时简称为免疫金（inununogold）或免疫[85]胶体金（immuno-colloidalgold）。胶体金标记蛋白质的基本原理，是由于蛋白质在其pH值稍高于或等于其等电点时与金颗粒之间的静电力最小，蛋白质分子表面张力最大，处于微弱的水化状态，容易吸附在金颗粒表面。1999年Constacen指出胶体金靠静电引力（a）、疏水作用（b）和配位键（c）三种作用力与抗体6 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立[86]结合（图1-3）。胶体金标记主要是其疏水区域与蛋白的亲水性基团的结合，胶体金是带负电的疏水性胶体，在标记时要降低电荷引力，使疏水作用力占有利的地位。通过调节蛋白质pH值使其净电荷数略带负电或接近零，从而促使蛋白质和胶体金的结合，同时阻止了蛋白质因为静电引力聚集的现象，也保留了其亲水作用。结合过程中主要利用的是物理作用力，因此不会使其变[87]性。图1-3胶体金与抗体结合力示意图（摘自Chandleretal.2000）Fig.1-3Bandingforcesbetweencolloidalgoldparticleandantibody(Chandleretal.2000)多种因素影响免疫胶体金制备的质量，如金颗粒大小、离子强度、蛋白质用量及标记pH值等。选择实验需要大小的金颗粒，一般在胶体金免疫层析试验中，都选择粒径在20-40nm的金颗粒（胶体金颗粒与柠檬酸三钠加入量的关系见表1-1）。pH值是影响蛋白质能否成功标记的关键，蛋白质在其等电点或稍偏碱的情况下与金颗粒结合的最牢固。所以，标记之前需要用0.2mol/LK2CO3或0.lmol/LHCl调节胶体金悬液的pH值到该蛋白质的等电点或稍偏碱状态。表1-1胶体金粒径与柠檬酸三钠加入量的关系Tab.1-1Correlationbetweentheamountofsodiumcitrateandthediameterofcolloidalgoldparticle胶体金颗粒直径1%柠檬酸三钠加入量(mL)胶体金的颜色(nm)Volumeof1%trisodiumcitrateColorofcolloidalGoldpartilediameter(mL)gold(nm)16.02.0橙色24.51.5橙红41.01.0红色71.50.7紫色1.2.3胶体金免疫层析技术在兽医传染病诊断中的应用1.2.3.1动物细菌病诊断中的应用7 河北农业大学硕士学位（毕业）论文胶体金免疫层析技术在动物细菌性疾病的快速检测研究与应用中被广泛应用。张书环等[88]（2007）成功的建立了抗牛结核病抗体的检测试方法；朱明东等（2008）和孙洋等（2008）分[89-90]别研制了的快速诊断布鲁菌病和大肠杆菌O157的胶体金试纸条；刘洪贵等（2009）利用双抗[91]夹心方法建立了检测金黄色葡萄球菌的免疫层析方法；冯向辉等（2010）建立了牛结核胶体金[92][93]金免疫层析方法；陈素娟等（2012）建立了检测鸭疫里默杆菌的免疫层析方法。1.2.3.2动物病毒病诊断中的应用[94]Joon等（2004）建立了检测伪狂犬病病毒（PRV）抗原的胶体金免疫层析方法；Oh等（2006）[95]建立了检测犬瘟热病毒抗体的免疫层析方法；Kameyama等（2006）研制了快速检测BVDV抗[96]原的胶体金试纸条；李希友等（2006）研制了半定量检测新城疫抗体的胶体金免疫层析试纸条[97][98]；Cui等（2008）制备了快速检测H5亚型禽流感病毒抗体的试纸条；张利勃等（2011）建[99]立了检测抗猪流行性腹泻病毒（PEDV）M蛋白血清抗体的免疫层析方法；张鑫宇等（2014）[100]制备了非洲猪瘟病毒p54抗体胶体金检测试纸条。1.3研究内容与技术路线1.3.1研究内容1.3.1.1以PEDV为抗原，经过对抗原包被浓度、包被条件及抗体反应浓度等工作浓度和工作条件的筛选，建立检测PEDVN蛋白抗体的间接ELISA方法。1.3.1.2用纯化的PEDVN蛋白免疫BALB/c小鼠脾脏，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选、鉴定分泌PEDVN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，确定单克隆抗体亚型。1.3.1.3将筛选的分泌PEDVN蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆，腹腔注射小鼠，制备并纯化腹水。1.3.1.4用柠檬酸三钠法，制备直径为20nm的胶体金颗粒，通过透射电镜观察，对金颗粒质量进行鉴定。1.3.1.5用金标单克隆抗体A7包被玻璃纤维素膜，制备金标垫，用单克隆抗体F7和抗羊抗鼠IgM印记硝酸纤维素膜，分别作为检测线和质控线，组装成试纸条，建立检测胶体金免疫层析方法。1.3.1.6用建立的胶体金免疫层析方法，检测临床采集的腹泻仔猪肠内容物样品。1.3.2技术路线（见下页）8 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立1.4研究目的与意义本研究首先制备PEDVN蛋白单克隆抗体，然后以单克隆抗体为实验材料，建立监测PEDV的胶体金免疫层析方法，旨在为PED的快速临床诊断和有效治疗，提供重要的技术手段。技术路线：SP2/0骨髓瘤细胞PEDVN蛋白免疫BALB/c小鼠脾细胞杂交瘤细胞间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞亚克隆细胞染色体分析Western-Blot鉴定单克隆抗体的特异单抗识别表位分析免疫组织化学鉴定性鉴定单抗亚类鉴定分泌抗体稳定性腹水的制备、纯化及含量测定金颗粒的制备与质量试纸条的制备及金标抗体的制备鉴定组装检测临床样品9 河北农业大学硕士学位（毕业）论文2材料2.1单克隆抗体制备用材料2.1.1细胞、毒株及蛋白Vero细胞系、SP2/0骨髓瘤细胞系，购于中国兽药监察所；猪流行性腹泻病毒HBMC-2012株，由河北农业大学传染病实验室分离及保存；E.ColiBL21感受态细胞、表达PEDVN蛋白的重组质粒（PET32a-PEDV-N）及相应菌液，由河北农业大学传染病实验室制备及保存。2.1.2实验动物BALB/c小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。2.1.3主要试剂与试剂盒HAT选择培养基、HT选择培养基、弗氏不完全佐剂和弗氏不完全佐剂，均购自Sigma公司；1640粉末，购自GIBCO公司；胎牛血清，购自Hyclone公司；秋水仙素，购自上海华舜生物工程有限公司；台盼蓝、吉姆萨染液、牛血清白蛋白（BSA），购自Solarbio公司；聚乙二醇(PEG4000)、十二烷基磺酸钠（SDS），购自Solarbio公司；二甲基亚砜（DMSO），购自天津市华东试剂厂。小鼠抗PEDVN蛋白多克隆抗体，由本实验室制备并保存；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG（H+L），购自康为世纪生物科技有限公司；HRP标记山羊抗小鼠IgM，购自武汉博士徳生物工程有限公司。Ni-AgaroseHis标签蛋白纯化试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司；PierceRapidELISAMousemAbIsotypingKit，购自Thermo公司；IgM类单克隆抗体纯化试剂盒，购自北京博奥龙免疫技术有限公司；生物素-链霉卵白素免疫组织检测试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。2.1.4细胞培养用液4×RPMI-1640浓缩液：将4包（10.4g/包）1640粉剂溶解于1000mL灭菌三蒸水中，过滤除菌，置-4℃保存，使用时作1:4倍稀释。胎牛血清：56℃30min灭活，4℃保存备用。500mmol/LHepes贮存液：12gHepes溶于100mL三蒸水中，经121℃高压灭菌30min，分装后，-20℃保存备用。462×10U/mL链霉素-青霉素液（双抗）：取链霉素、青霉素各2×10U溶解于100mL灭菌三蒸水中，过滤除菌，-20℃保存备用。-35×10mol/Lβ-巯基乙醇（β-Me）：取30μLβ-Me，加1×RPMI-1640至100mL，分装后，-20℃10 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立保存备用。7.5%NaHCO3：7.5gNaHCO3溶解于100mL三蒸水中，高压灭菌20min，分装后，4℃保存备用。4-31×RPMI-1640营养液：4×RPMI-1640浓缩液100mL，2×10U/mL双抗4mL，5×10mol/Lβ-Me4mL，500mmol/LHepes4mL，灭活胎牛血清40mL，灭菌三蒸水245mL，混匀，7.5%NaHCO3溶液调节pH值至7.2，4℃保存备用。HAT选择培养基：每瓶HAT培养基粉末，加入5mL1×RPMI-1640营养液，充分溶解，-20℃保存备用。使用时每100mL1×RPMI-1640营养液中加入1mLHAT培养基，4℃保存备用。HT选择培养基：每瓶HT培养基粉末，加入5mL1×RPMI-1640营养液，充分溶解，-20℃保存备用。使用时每100mL1×RPMI-1640营养液中加入1mLHT培养基，4℃保存备用。0.5%台盼蓝溶液：0.5g台盼蓝溶解于100ml0.9%NaCl溶液中，6000r/min离心10min后，取上清，分装后，4℃保存备用。融合剂：取1gPEG-4000于试管内封口，121℃高压灭菌30min，待冷却至80℃左右时取出，加入1mL1×RPMI-1640营养液混匀使用。冻存液：1×RPMI-1640营养液50mL，胎牛血清40mL，DMSO10mL，HAT1mL，pH值7.2左右，4℃保存备用。2.1.5酶联免疫吸附试验（ELISA）相关试剂及配制包被液（0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液）：NaHCO32.93g，Na2CO31.59g，溶于蒸馏水中，调pH值为9.6，定容到1L。洗涤液（0.01MpH7.4的PBST溶液）：KH2PO40.2g，Na2HPO41.44g，KCl0.2g，NaCl8g，Tween-200.5mL，定容至1L。封闭液（稀释液）：2gBSA溶于100mLPBST。底物缓冲液（pH5.5）：0.1M柠檬酸12.15mL，0.2M磷酸氢二钠12.85mL，蒸馏水25mL。TMB使用液（现用现配）：底物缓冲液10mL，TMB（2mg/1mL无水乙醇）500μL，H20232μL。终止液（2MH2SO4）：蒸馏水177.8mL，浓硫酸22.2mL混和。2.1.6SDS-PAGE电泳用溶液30%丙烯酞胺（W/V）：丙烯酞胺145g，N’N’-甲叉双丙烯酞胺5g，蒸馏水定容至500mL，pH≤8.8，过滤于棕色玻璃瓶中，4℃保存备用。1mol/LTris-HCl（pH6.8）：24.2gTris-碱溶于蒸馏水中，浓盐酸调pH至6.8，定容至200mL，室温保存备用。1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）：36.34gTris-碱溶于蒸馏水中，浓盐酸调pH至8.8，定容至200mL，室温保存。10%过硫酸胺：过硫酸胺1g，溶于蒸馏水中，定容至10mL，4℃保存。11 河北农业大学硕士学位（毕业）论文10%SDS：10gSDS溶于蒸馏水中，加热至65℃助溶，定容至100mL，室温保存。5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液贮存液（pH8.3）：15.1gTris碱，94g甘氮酸，100mL10%（W/V）的SDS电泳贮存液，然后用蒸馏水溶解，定容至1000mL，室温保存。考马斯亮蓝染色液：冰醋酸10mL、甲醇90mL、H2O90mL，考马斯亮蓝R2500.25g，混匀溶解，去除颗粒状物质滤纸过滤，室温保存。脱色液：冰醋酸：甲醇：蒸馏水，按1:3:6的体积配制，室温保存。2×SDS上样缓冲液：200mmol/L硫苏糖醇（DTT）100mmol/LTris-HCl（pH6.8）4%SDS20%甘油0.2%溴酚蓝-20℃保存备用。2.1.7Western-Blotting用溶液蛋白转印缓冲液：Tris碱3.03g甘氨酸14.3g甲醇200mL蒸馏水定容至1000mL，4℃保存。10×TBS：Tris碱24.2gNaCl80g浓盐酸调pH至7.5，蒸馏水定容至1L。使用时1：10稀释。TBST洗涤液：每1000mL1×TBS中加入0.5mLTween-20。封闭液（血清稀释液）：在TBST中加入5%脱脂奶粉，4℃保存备用。10×DAB：50mgDAB溶于10mLTris-HCl（0.1MpH7.4），分装，-20℃保存。底物溶液：10×DAB100μL，Tris-HCl900μL，30%H2023μL，混合使用。2.1.8免疫组织化学试验所用试剂石蜡：熔点为52℃~54℃的新购石蜡，经反复熔炼8次以上除去石蜡中的水分，经四层纱布过滤后使用。4%多聚甲醛磷酸缓冲液：称取多聚甲醛40g溶于PBS（0.1M，pH7.4）中，完全溶解后，用NaOH调pH7.4，定容至1000mL，4℃保存备用。伊红染液：取伊红（水溶性）0.5g溶于75mL蒸馏水中，待伊红完全溶解后，加入95%乙醇25mL，最后加入5%冰乙酸1mL，密封保存。12 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立1%盐酸酒精溶液：浓盐酸5mL加入到495mL75%乙醇中即可。10×PBS（10mmol/LpH7.2）：称取NaCl80g，KCl2g，Na2HPO4•12H2O28.62g，KH2PO42g，溶于蒸馏水中，完全溶解后调整pH至7.2，定容至1000mL，120℃高压灭菌。洗涤液（PBS溶液）：取50mL10×PBS加入至450mL蒸馏水中，混匀。0.1mol/LHCl：取4.31mL浓盐酸，加蒸馏水定容至500mL，备用。Tris-HCl缓冲液（0.1mol/L，pH7.4）：称取Tris1.21g，0.1mol/LHCl83.33g，蒸馏水定溶至100mL，4℃保存备用。10×DAB贮存液：取50mgDAB溶于10mLTris-HCl缓冲液（0.1mol/L，pH7.4）中，贮于-20℃备用。DAB显色使用液：10×DAB1mL，Tris-HCl9mL，30%H20230μL，混合使用。2.2胶体金免疫层析检测方法建立用材料2.2.1血清与临床检测样品PEDVN蛋白单克隆抗体（A7/F7株、亚型IgM），抗猪流行性腹泻病毒（PEDV）的阳性血清、阴性血清，以及抗PEDVN蛋白阳性血清，均为本实验室制备并鉴定；临床腹泻仔猪肠内容物，来自于保定、秦皇岛和石家庄地区的不同猪场。2.2.2免疫层析材料硝酸纤维素膜M135，购自美国Millipore公司；玻璃纤维Alstrom8964，购自美国Alstrom公司；吸水滤纸H5072，购自美国Whatman公司；氯金酸，购自SIGMA公司；羊抗鼠IgG与羊抗鼠IgM，购自北京博奥森生物技术有限公司；TRIS碱和BSA，购自Solarbio公司；PEG20000，购自北京博奥拓达科技有限公司；柠檬酸三钠、碳酸钾等化学试剂，购自天津市瑞金特化学品有限公司。2.2.3胶体金常用溶液1%氯金酸溶液：1gHAuCl4，三蒸水定容至100mL，在室温下溶解，0.22μm微膜过滤，保存棕色瓶中，置4℃备用。1%柠檬酸三钠：称0.5g柠檬酸三钠，加三蒸水溶解后，定容至50mL，0.22μm微膜过滤，注意现用现配。0.2mol/LK2CO3溶液：称K2CO31.38g，加三蒸水定容至50mL，0.22μm微膜过滤，置4℃保存备用。20mmol/LTris-HCl缓冲液：称取Tris碱2.42g溶解于三蒸水中，用HCl调pH至8.0，定容至1000mL。高压灭菌，4℃备用。10%BSA：牛血清白蛋白（BSA）5g，加入Tris-HCl缓冲液中溶解，最后定容至50mL。13 河北农业大学硕士学位（毕业）论文0.45μm滤膜过滤，分装保存至-20℃。10%PEG20000溶液：称取PEG200005g，溶解于Tris-HCl缓冲液中，定容至50mL，0.45μm微膜过滤，置4℃保存备用。10%NaCl：NaCl10g,三蒸水溶解，定容至10mL，0.22μm微膜过滤。封闭液：称BSA3g，蔗糖4g，加Tris-HCl缓冲液溶解，定容至100mL，4℃备用。金标垫处理液：BSA0.3%，蔗糖4%，Tween-200.2%，溶于Tris-HCl缓冲液，4℃备用。2.3主要仪器设备台式离心机上海安亭科学仪器厂普通低速离心机上海安亭科学仪器厂SIGMA3-18K高速冷冻离心机德国SIGMA公司倒置显微镜日本OLYMPUS公司H-600透射电子显微镜日立高新技术公司CO2INCUBATORMCO-15AC日本SANYOElectricCO.公司圆筒式不锈钢过滤器绍兴市卫星医疗设备制造有限公司全自动高压灭菌器日本SANYOElectricCO.公司Kadakr凝胶成像分析系统美国Kodak公司MultiskanFC型酶联仪器ThermoScientific公司NanoDrop2000超微量分光光度计ThermoScientific公司DH2500A型电热恒温培养箱天津市泰斯特仪器有限公司电子天平TB-215赛多利斯科学仪器有限公司滤器天津市津腾实验设备有限公司SP-2102UV型紫外分光光度仪上海光谱仪器有限公司高速冷冻离心机CT14RD日本Techcomp公司恒温磁力搅拌器金坛市荣华仪器有限公司14 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立3方法3.1猪流行性腹泻单克隆抗体的制备3.1.1单克隆抗体筛选间接ELISA方法的建立3.1.1.1包被抗原的制备取猪流行性腹泻病毒（HBMC-2012）F2代细胞培养液10mL，于离心过滤器（MWCO30KD）中，10000r/min离心15min。重复上述步骤3次，收集病毒测定浓度。3.1.1.2最适抗原包被浓度与封闭液的确定以浓缩的PEDV作为包被抗原，分别以1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL浓度加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜。弃去包被液，每孔用280μLPBST洗涤三次，3min/次，拍干。加入封闭液，分别用2%BSA、1%明胶、5%脱脂奶粉、5%马血清、5%犊牛血清作为反应的封闭液及抗体稀释液组成方阵，100μL/孔，37℃1h，拍干。分别用上述抗体稀释液稀释1:40倍的待检血清，100μL/孔，37℃1h，同上洗涤，拍干。将HRP-羊抗鼠IgG同样分别用上述抗体稀释液以1:2000倍稀释，100μL/孔，37℃45min，同上洗涤，拍干。新鲜配制的TMB底物溶液，100μL/孔，室温，避光反应15min。2MH2SO4，50μL/孔，终止反应。用自动酶联检测仪测定OD450nm值。选择阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值（P/N）比值最大时的抗原包被浓度和封闭液为最佳选择。3.1.1.3最适待检血清与酶标抗体浓度的确定以上述已确定好的PEDV最适包被浓度包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜。弃去包被液，拍干，每孔用280μLPBST洗涤三次，3min/次，拍干。加入筛选的封闭液及抗体稀释液，100μL/孔，37℃1h，拍干。每孔加入100μL用抗体稀释液作1:40、1:80、1:160、1:320倍稀释的阴阳性血清，37℃1h，同上洗涤，拍干。HRP-羊抗鼠IgG以1:1000、1:2000、1:4000倍稀释浓度组成方阵，100μL/孔，37℃45min，洗涤，拍干。TMB底物溶液，100μL/孔，室温，避光反应15min。2MH2SO4，50μL/孔，终止反应。用自动酶联检测仪测定OD450nm值。选择阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值（P/N）比值最大时的待检血清浓度和酶标抗体浓度为最佳工作浓度。3.1.1.4显色时间的确定在酶标二抗与一抗反应后，每孔加入100μL底物显色液，室温避光显色10、15、20、25、30min，终止反应，测定OD450nm值，计算P/N值，确定最佳显色时间。3.1.1.5间接ELISA判定标准的确定用建立的ELISA检测30份PEDV抗体阴性血清，计算30份血清的平均OD值及其标准方差。计算公式如下：15 河北农业大学硕士学位（毕业）论文阴阳性临界值=阴性样本平均OD值（X）十3×标准方差（SD）。根据统计学分析，当被检样品OD值≥X+3SD时，可以在99.9%的水平上判定为阳性。因此，当被检血清的OD值≥X+3SD时判定为阳性，当OD值＜X+3SD时判定为阴性。3.1.1.6特异性与敏感性试验用建立的间接ELISA方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪伪狂犬病毒（PRV）、及猪流行性腹泻病毒（PEDV）抗体，判定方法的特异性。取已知PEDV抗体阳性血清和阴性血清做1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560倍比稀释，每个稀释度做3个重复，同时设立3个稀释液对照和3个空白孔对照。根据OD450nm值计算能够检测到抗体的最低稀释倍数，然后根据血清中总蛋白含量得出建立的ELISA方法能够检测到的最低蛋白量，判断其敏感性。3.1.2PEDVN蛋白的表达与纯化将PET32a-PEDV-N重组质粒转化到E.ColiBL21感受态细胞，然后挑取阳性单个菌落接种+到Amp/LB培养基中，37℃200r/min，培养至对数生长期（OD600nm=0.6～0.8），再加入IPTG使其终浓度为0.5mmol/L，35℃230r/min，诱导5h。于4℃冰浴下超声裂解，收集上清。按照Ni-AgaroseHis标签蛋白纯化试剂盒纯化表达产物，操作如下：组装层析柱，将菌体裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时；然后使用15倍柱体积的SolubleBingingBuffer冲洗柱子；最后使用5倍体积的SolubleElutionBuffer洗脱，收集洗脱峰，即为纯化的蛋白；将其放入透析袋中，4℃搅拌透析，期间换透析液PBS3次，每次透析2小时。使用NanoDrop2000超微量分光光度计，测定纯化后的蛋白含量，将其作为抗原免疫BALB/c小鼠。3.1.3动物的免疫用纯化的PEDV-N重组蛋白作为免疫抗原，免疫6周龄左右的4只BALB/c小鼠，免疫次数、间隔时间、剂量、途径和佐剂见表3-1。三免后10d尾静脉采血，用建立的间接ELISA方法测其血清抗体水平，若合格，在融合前3d加强免疫，具体免疫程序见表3-1。表3-1小鼠免疫程序Tab.3-1Mouseimmunizationprocedures免疫次数间隔时间(d)免疫途径抗原剂量(μg)佐剂ImmunetimesIntervaltimeImmunizationroutesAntigenAdjuvant首免14颈背部多点皮下注射100等量弗氏完全佐剂二免14颈背部多点皮下注射300等量弗氏不完全佐剂三免14颈背部多点皮下注射300等量弗氏不完全佐剂强免3腹腔注射400不加佐剂16 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立3.1.4SP2/0细胞的准备于融合前48~36h，将SP2/0骨髓细胞扩大培养。融合时将细胞轻轻吹下来，收集于50mL离心管中。1000r/min离心10min，弃上清。加入30mL含3%胎牛血清的1640培养液，离心，洗涤一次。然后用10mL含3%胎牛血清的1640培养液将细胞重悬，混匀。用0.5%台盼蓝溶液作活细胞计数，备用。3.1.5饲养细胞的制备融合前1d制备饲养细胞，具体操作如下：摘除眼球采血后，拉颈处死小鼠，75%酒精浸泡消毒5~10min。用手术剪将小鼠腹部剪开，剥开皮肤，露出腹膜。用无菌的注射器将3~4mL无血清的1640培养液注入腹腔，再用酒精棉轻揉1min随后回抽腹腔液体，放入离心管，反复3~4次即可。取收集的细胞悬液，1000r/min10min，离心，弃上清。用5mLHAT培养液将细胞悬浮，5细胞计数，调整细胞浓度为2×10个/mL。将上述悬液加入96孔板中，100μL/孔，于37℃5%CO2培养箱中培养。3.1.6免疫脾细胞的制备取加强免疫后3d的小鼠，摘除眼球，采血收集血清，拉颈处死小鼠，75%酒精浸泡消毒5~10min。无菌条件下取出脾脏，置于已盛有10mL含3%胎牛血清的1640培养液的平皿中，洗涤，剥去周围结缔组织。将脾脏转入另一个盛有10mL含3%胎牛血清的1640培养液的平皿中，用注射器抽取1mL营养液后，将针头插入脾中，不断地吹吸，使脾细胞进入平皿中的含3%胎牛血清的1640培养液。用吸管吹打几次，除去脾细胞悬液中的大团块，用200目铜网过滤。收获脾细胞悬液，1000r/min离心10min，用含3%胎牛血清的1640培养液离心洗涤一次，将细胞重悬于10mL含3%胎牛血清的1640培养液中，混匀。取上述细胞悬液，用0.5%台盼蓝溶液作活细胞计数，备用。3.1.7细胞融合取脾细胞与骨髓瘤细胞，按5：1比例加入到50mL离心管中，混匀。1000r/min10min离心，弃上清。将细胞沉淀用手指轻轻弹起，使其均匀松散成糊状。吸取含10%胎牛血清的1640培养液1mL加入1g灭菌的PEG4000中，再用7.5%NaHCO3调节pH值至7.5，快速混匀。边加边转动离心管，60s内将预热的PEG4000缓缓加入（从侧壁滑下来）到骨髓瘤细胞与脾细胞的混合悬液内。在30s内用吸管将所有的液体吸入吸管中，静置30s，然后30s内重新滴17 河北农业大学硕士学位（毕业）论文到离心管中。向离心管内加入预热的25mL含10%胎牛血清的1640培养液终止PEG的作用：第1min缓缓加入1mL含10%胎牛血清的1640培养液，第2min加入1mL含10%胎牛血清的1640培养液，第3min加入3mL含10%胎牛血清的1640培养液，然后在3min内加完剩下的20mL含10%胎牛血清的1640培养液。边加边转动离心管，使终止液从侧壁滑下来。然后再将离心管置于37℃水浴5min，使培养液充分终止融合。1000r/min10min离心，弃上清。先用20mL含1%HAT的1640培养液将细胞轻轻混悬，不可用力吹打，以免融合好的细胞再散开。将上述细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板中，100μl/孔，37℃、5%CO2培养箱中培养。观察记录细胞生长状况，在融合后的第3d、6d用含1%HAT的1640培养液半量换液，第9d改用含1%HT的1640培养液半量换液。第14d后用含10%胎牛血清的1640培养液半量换液。3.1.8阳性杂交瘤细胞的筛选、克隆在融合细胞克隆生长到细胞培养板孔底部的1/4~1/3时，取杂交瘤细胞培养上清，用建立的间接ELISA方法筛检。连续筛选2次，阴性孔的弃之，阳性孔细胞，采用有限稀释法进行再次克隆。克隆前一天，制备饲养细胞，方法同3.1.5。用含1%HT的1640培养液将阳性孔的细胞轻轻吹打下来，至细胞悬液达1mL，细胞计数。用含1%HT的1640培养液将上述细胞依次稀释为20个/mL、10个/mL和5个/mL三个稀释度。100μL/孔，每个稀释度的细胞重复32孔，加入到含有饲养细胞的96孔板中，观察记录杂交瘤细胞的生长状况。对只有一个细胞克隆生长的细胞孔，进行半量换液，当细胞孔内单个细胞的克隆覆盖孔底部1/4~1/3时，取出细胞培养上清进行检测。对只有一个单克隆细胞生长的阳性孔，进行再次克隆。用上述方法，进行3~4次亚克隆，当间接ELISA方法检测克隆株的所有细胞孔上清结果均为阳性时，即可扩大培养阳性杂交瘤细胞，并冻存。3.1.9阳性杂交瘤细胞的冻存与复苏3.1.9.1细胞的冻存将处于对数生长期的阳性杂交瘤细胞（命名为A7、E10、C1和F7株），从瓶壁上轻轻吹下，1000r/min离心10min，弃上清，用冻存液轻轻重悬细胞沉淀后，分装于冻存管中。注明细胞名称、冻存时间。将冻存管置于4℃2h，-202℃h，-80℃2h或过夜，再将其放到液氮灌中长期保存。18 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立3.1.9.2细胞的复苏从液氮灌中取出冻存的细胞，立即置于37℃水浴中，轻轻摇动使其迅速融化，1000r/min10min离心，弃上清。用含10%胎牛血清的1640培养液重悬细胞沉淀，然后移入细胞培养瓶中，置37℃，5%CO2细胞培养箱内培养。3.1.10杂交瘤细胞染色体分析选取生长状态良好，形态正常的阳性杂交瘤细胞，将其从细胞瓶中吹下来。传代24h后，向细胞瓶中加入秋水仙素使其终浓度为0.01μg/mL。轻轻摇匀，继续培养6h。将细胞轻轻吹下来，离心。用加入37℃预热的0.075mol/LKCl溶液轻轻重悬（先加入1mL弹匀，再加至10mL），37℃水浴30min。加入新配制的固定液（甲醇：冰乙酸为3：1）1mL，混匀，固定2min，1000r/min离心10min，弃上清。加入新配制的固定液5mL，边加边振荡，混匀，室温静置30min，离心，弃上清。重复操作一次。离心，留下0.5mL左右的固定液重悬细胞，吸取一滴细胞悬液于载玻片上方约30cm高度，将细胞滴在载玻片上。取载玻片在70℃水浴锅上方来回过两次，使染色体充分展开，火焰固定。用新配制的10%Giemsa染液染色10min。选择染色体散开、无重叠的单个细胞进行观察，并拍照保存。3.1.11单克隆抗体的鉴定3.1.11.1单克隆抗体的类型鉴定按照PierceRapidELISAMousemAbIsotypingKit(ThermoScientific)试剂盒的说明书进行抗体类型鉴定，操作如下：将TMB底物缓冲液与条形孔放置室温，使其温度恢复至室温；每8个条形孔中加入1:50倍稀释的同一株的杂交瘤细胞培养上清，50μL/孔；然后再加入HRP标记的羊抗鼠IgG+IgA+IgM三者混合的二抗，50μL/孔，震荡混匀，室温孵育1h；弃液，用洗涤液250μL/孔，洗板3次，3min/次，拍干；再加入TMB底物缓冲液75μL/孔，室温，避光反应10min；终止液75μL/孔，终止反应。于450nm处读取OD值，OD450nm≥0.2判为阳性反应。3.1.11.2单克隆抗体识别抗原表位鉴定用间接ELISA方法，测四株杂交瘤细胞的饱和稀释度。取1μg/mL的PEDV病毒包被ELISA板，洗涤封闭后，加入饱和稀释度的单抗，100μL/孔，3730℃min，洗涤后再加入两两组合的另一株单抗，100μL/孔，3730℃min。洗涤后加入HRP标记山羊抗小鼠IgM（1:5000倍稀释），100μL/孔，37℃1h。洗涤后加入TMB底物溶液，100μL/孔，避光反应15min。2MH2SO4100μL/孔，终止反应，测450nm处的OD值。采用相加指数法（additivityindex,AI），按以下公式计算两种单抗叠加的AI值：19 河北农业大学硕士学位（毕业）论文AI=(A1.2-A1)/A2×100%(A1：代表一株单抗自身叠加OD值；A2：代表另一株单抗自身叠加OD值；A1.2：代表两株单抗叠加的OD值)。当AI的绝对值>10%时，为两株单克隆抗体识别不同的抗原位点，当AI的绝对值≤10%时，为两株单克隆抗体识别同一抗原位点。3.1.11.3单克隆抗体免疫活性鉴定Westernblot鉴定：PEDV-N重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，Westernblot分析4株单克隆抗体的免疫活性,Westernblot具体操作程序如下：SDS-PAGE电泳后，将海绵、滤纸、分离胶浸泡于转膜液中15min,取下凝胶，并在胶的右上角做标记，根据胶的大小剪取PVDF膜。将PVDF膜放在100%甲醇中浸泡5min，20%甲醇溶液中浸泡2min，从负极开始依次将海绵、滤纸、分离胶、PVDF膜、滤纸、海绵装到电泳槽中，130V转印2~3h。转印结束后，取出PVDF膜（在膜的右上角做标记）放入5%的脱脂奶粉封闭液中，4℃过夜。次日将封闭液移去，分别加入1∶400稀释的获取的4株单克隆抗体腹水（一抗），室温，摇床上摇动1h。TBST洗膜3次，6min/次，然后加入14∶000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgM（二抗），室温振荡1~2h，洗涤同上。最后将PEDV膜放入DAB底物显色液中显色3~10min，边显色边观察，条带清晰后用去离子水终止反应，拍照记录结果。免疫组化鉴定：取PEDV感染仔猪的肠道组织，4%多聚甲醛固定后，制成石蜡切片，进行免疫组化试验。具体操作如下：将石蜡切片，脱蜡至水（二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各放置15min，100%、95%、85%、70%的乙醇各2min，蒸馏水2min）；将切片浸于0.01M枸橼酸盐缓冲液煮沸10min，修复抗原；在3%H2O2去离子水中孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性；滴加试剂A（正常山羊血清工作液）室温孵育15min，倾去液体，勿洗；分别滴加1∶300稀释的腹水（单抗），37℃孵育3h。PBS冲洗，3min×3次；滴加试剂B（生物素标记山羊抗小鼠IgG），37℃孵育15min；PBS冲洗，3min×3次；滴加试剂C（HRP标记链霉卵白素工作液），37℃孵育15min；PBS冲洗，3min×3次；DAB显色15min，冲洗，终止反应。苏木精瞬时复染，自来水冲洗。1%盐酸酒精分化，自来水冲洗，封片。拍照记录结果。凡被检肠组织细胞胞浆，出现棕黄色者判为阳性，否则判为阴性。3.1.11.4杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性试验复苏冻存的A7，E10，C1，F7四株杂交瘤细胞，进行传代培养。分别收集第2、5、10、15、20、25、30代的细胞培养上清，用标题3.1.1中建立的间接ELISA法检测细胞分泌的抗体水平，以评价四株杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。3.1.12单克隆抗体的大量制备采用体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体。即挑选大龄（≥12周龄）的雌性或经产BALB/c小6鼠，每只小鼠腹腔注射灭菌的石蜡油0.5mL；10~14d后，腹腔注射杂交瘤细胞1~5×10个/只。约7~10d后，小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，8000r/min10min，离心，收集上清，重复离心一次，收集上清，-20℃保存。20 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立3.1.13单克隆抗体效价检测取1μg/mL的PEDV病毒包被ELISA板，100μL/孔；用封闭液（抗体稀释液）将杂交瘤细胞培养上清作1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200倍比稀释，用间接ELISA方法7测其效价。检测腹水中单克隆抗体效价时，将腹水从1:10开始作10倍系列稀释至1:10，然后用间接ELISA测定其效价。3.1.14腹水中单克隆抗体的纯化及蛋白含量的测定按照IgM类单克隆抗体纯化试剂盒的说明书进行腹水的纯化，操作如下：取出试剂盒放置室温，将冻存的单克隆腹水取出、解冻，室温避光复温15min。10mL腹水，12000r/min室温离心20min；吸弃上层油脂，然后将上清液转移到另一个干净的离心管；加入10mL纯化液A，室温避光倒转20min。8000r/min室温离心20min，沉淀加入5mL纯化液B溶解；再加入5mL纯化液C，室温避光倒转10min。8000r/min室温离心20min，弃沉淀收集上清；加入10mL纯化液D,室温避光倒转20min。8000r/min室温离心20min，收集沉淀加入5mL纯化液B溶解沉淀。将纯化好的抗体放入透析袋中，4℃搅拌透析，期间换透析液PBS3次，每次透析2小时。将透析好的抗体12000r/min，4℃离心20min，收集上清液，0.22μm微膜过滤除菌，使用NanoDrop2000超微量分光光度计，测定纯化后腹水的蛋白含量后，分装，置4℃备用。3.2胶体金免疫层析检测方法的建立3.2.1金颗粒的制备3.2.1.1胶体金制备前器皿的清洁将烧杯、锥形瓶等制备胶体金的玻璃器皿，用自来水洗涤干净，烘干后置清洁液中（重铬酸钾1kg，浓硫酸2.5L，加入蒸馏水至10L）浸泡48h以上。再用自来水冲洗5~10次直至洗净清洁液，然后用一次蒸馏水洗8次，二次蒸馏水洗8次，最后用三次蒸水把每个器皿洗7~8次，直至器皿四壁没有水珠，器内的水面平齐，没有凹面，然后将器皿置烤箱，干燥后备用。3.2.1.2胶体金悬液的制备取1mL1%氯金酸溶液，于250mL的三角瓶中，加入三蒸水至100mL。煮沸2min后，快速加入1.8mL新配的1%柠檬酸三钠溶液（37℃预温），在剧烈搅拌下继续煮沸8min。待溶液冷却后，用0.2mol/L碳酸钾调pH至7.2（中性），加入三蒸水使溶液恢复到原体积。用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。21 河北农业大学硕士学位（毕业）论文3.2.1.3胶体金质量鉴定将制备的胶体金悬液滴于覆有Formvar膜的铜网上，干燥。通过透射电镜观察颗粒粒径的大小、形状（椭圆形、三角形或多角形）、均一性以及有无聚集现象等。同时，任意选取50个胶体金颗粒，使用电镜的统计功能计算其平均直径。3.2.2单克隆抗体的胶体金标记3.2.2.1待标记单克隆抗体的准备将单克隆抗体置于离心管中，12000r/min4℃离心20min，取其上清液。使用NanoDrop2000超微量分光光度计测蛋白浓度，最后用PBS调整抗体的浓度至1mg/mL，用于标记。3.2.2.2胶体金标记抗体最适稳定量的测定A.抗体标记的胶体悬液的颜色判定：将制备的胶体金悬液pH调至8.0左右，分装11管，每管0.5mL；单克隆抗体A7用Tris-HCl(pH8.0)缓冲液做0、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512倍比稀释；从每个稀释度分别取50μL，加入到上述分装的10管胶体金悬液中，吹吸混匀，对照管只加50μL稀释液；室温静置5min后，往上述各管中各加入50μL10%NaCl溶液，混匀，室温静置2h，另设立胶体金悬液对照管即不加单抗也不加NaCl（表3-2）。表3-2胶体金标记抗体最适稳定量的测定Tab.3-2Determinationoftheoptimalproportionofcolloidalgoldandantibody管号抗体稀释倍数抗体浓度(μg/mL)胶体金(μL)10%NaCl(μL)TubeNo.DilutionconcentrationofA7(μg/mL)colloidalgold(μL)1010005005021:25005005031:42505005041:81255005051:1662.55005061:3231.255005071:6415.6255005081:1287.8135005091:2563.90650050101:5121.9535005011—05005012—05000结果观察与判定方法：未加抗体的对照管和加入抗体的量不足以使胶体金稳定的各管，均会出现由红变蓝的聚沉现象；加入抗体的量达到或超过最低稳定量的各管颜色保持不变（橙红色）。以稳定1mL胶体金悬液颜色不变的最低单克隆抗体A7用量，即为该抗体标记时需要的最低蛋22 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立白用量。在实际操作中，可增加30%即为稳定1mL胶体金悬液所需抗体实际用量。B.抗体标记的胶体金悬液OD530nm值的测定：分别取不同浓度抗体标记的胶体金悬液500μL，用分光光度计测定OD530nm值，绘制曲线。曲线最接近X轴时的所对应点的抗体用量即为胶体金标记所需的抗体量。3.2.2.3胶体金标记抗体最适pH值的测定A..胶体金悬液的颜色观察：取胶体金悬液置于7个离心管内，每管500μL，分别以0.1mol/LHCl、0.2mol/LK2CO3调pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，另设一管胶体金悬液对照。根据确定的金标抗体的浓度调节单克隆抗体A7的浓度，取50μL加到上述8管胶体金悬液中，混匀。室温静置5min。在上述各管（除对照管）中分别加入50μL10%NaCl溶液，混匀，室温静置2h，观察结果（表3-3）。表3-3胶体金标记抗体最适pH的测定Tab.3-3DeterminationoftheoptimalpHofcolloidalgoldandantibody管号标记pH待标抗体(μL)胶体金(μL)10%NaCl(μL)TubeNo.pHAmountofA7(μL)colloidalgold(μL)16.0505005026.5505005037.0505005047.5505005058.0505005068.5505005079.0505005087.2505000B.胶体金悬液的OD530nm值的测定：分别在不同pH值下标记胶体金悬液，测其OD530nm值，绘制曲线。曲线最接近X轴时，所对应点的pH值即为胶体金悬液抗体标记最适pH值。3.2.2.4单克隆抗体A7的胶体金标记根据已经确定的标记胶体金所需单克隆抗体A7的最低稳定量，按照最低稳定量的130%，计算标记胶体金所需要单克隆抗体用量。调整胶体金标记抗体需要的最适pH，一般为pH=pI+0.5。在磁力搅拌器搅拌下，将单抗A7逐滴、缓慢地加入到胶体金悬液中，1mg的抗体大约需要5min加完，加完后继续搅拌60min。在磁力搅拌器搅拌下，加入10%BSA溶液至其终浓度为0.4%，继续搅拌5min；加入10%PEG20000至其终浓度为0.2%，继续搅拌5min，以防止发生非特异性凝聚现象。取已标记好的胶体金悬液，以1200r/min离心30min；吸取上清液（切忌倾倒）转移至另一个离心管中，再以12000r/min离心30min；吸弃上清液，收集沉淀（切忌倾倒），加入20mL23 河北农业大学硕士学位（毕业）论文含1%BSA的Tris-HCl缓冲液，离心，洗涤两遍；用1/10原体积的含1%BSA的Tris-HCl缓冲液溶解；加入0.5mg/mLNa3N防腐，用0.45μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。3.2.3金标垫的制备将1cm×2cm大小的玻璃纤维膜Alstrom8964，浸泡于金标垫处理液中，4℃浸泡过夜；取出后，置37℃烘干（5h）。将处理过的玻璃纤维膜浸泡于A7标记的胶体金悬液中，吸附1h；将金标垫置37℃烘干，裁成0.5cm×0.5cm的小块放入封口袋中，4℃备用。3.2.4印膜3.2.4.1检测线抗体包被浓度确定将纯化的另一株单克隆抗体F7，用Tris-HCl缓冲液（pH8.0）稀释为：3.0mg/mL，2.0mg/mL，1.0mg/mL，0.5mg/mL四个不同浓度。以5μL/cm的包被量，分别印迹于硝酸纤维素膜，作为检测线。同样按照5μL/cm的包被量，将1mg/mL的羊抗鼠IgM，印迹于硝酸纤维素膜为质控线。烘干，组装试纸条，滴加用PBS缓冲液作1:5稀释的含PEDV的肠内容物50μL，室温反应15~20min，确定抗PEDV单克隆抗体F7的最适印迹量。3.2.4.2质控线抗体包被浓度确定用3.2.4.1中确定的抗PEDV单克隆抗体F7的最适浓度，包被硝酸纤维素膜作为检测线。同时用Tris-HCl缓冲液（pH8.0）将羊抗鼠IgM稀释为：1.0mg/mL、0.5mg/mL两个浓度。以5μL/cm的包被量，分别印迹于硝酸纤维素膜上为质控线。烘干，组装成试纸条，滴加用PBS缓冲液作1:5稀释的含PEDV的肠内容物50μL，室温反应15~20min，确定羊抗鼠IgM的最适印迹量。3.2.4.3包被液的选择将单抗F7及羊抗鼠IgM，分别用包被液1（3%甲醇溶于0.01MpH7.2的PBS缓冲液中）和包被液2（含4%蔗糖，0.85%NaCl和0.1%Tween-20的Tris-HCl缓冲液）稀释到最适浓度；以5μL/cm的包被量，印迹于硝酸纤维素膜，形成检测线和质控线，烘干，组装试纸条；滴加用PBS缓冲液作1:5稀释的含PEDV的肠内容物50μL，室温反应15~20min，观察质控线和检测线的线条敏感性、特异性反应程度。3.2.5试纸条的组装与结果判定标准将裁成0.5cm×2.5cm大小、印迹有检测线和质控线的硝酸纤维素膜放平，金标垫平贴于硝酸纤维素膜检测线一端，吸水垫平贴于硝酸纤维素膜质控线一端，样品垫再平贴于金标垫之上，彼此之间叠加2mm左右，密封、干燥、4℃保存（图3-1）。吸取50μL待检样品滴加到试纸条样品垫上，室温反应15~20min，观察结果。当待检样品中含有PEDV抗原时，则在试纸条的检测线（T）和质控线（C）处分别出现一条红色线；当待检样品中不含有PEDV抗原时，则只在试纸条的质控线（C）处出现一条红线（图3-2）。24 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立金标垫NC膜吸水纸样品垫质控线检测线图3-1免疫层析试纸条的示意图Fig.3-1Sketchofcolloidalgoldimmunochromatographicstrip12TC图3-2胶体金免疫层析试纸条检测结果判定标准Fig.3-2Criterionofcolloidalgoldimmunochromatographicstrip1.阳性结果；2.阴性结果.T.检测线;C.质控线1.Positiveresult;2.Negativeresult.T.Testline;C.Qualitycontrolline3.2.6试纸条的特异性与敏感性特异性检测：分别取含PRRSV、CSFV、PCV2及PRV的样品50μL，滴加到试纸条样品垫上，室温反应15~20min，判定免疫层析试纸条的特异性。敏感性检测：将待检PEDV阳性肠内容物做1:5、1:10、1:20、1:40倍比稀释，分别吸取不同稀释倍数的样品50μL，滴加到试纸条样品垫上，室温反应15~20min，观察其敏感性。3.2.7初步应用取自保定、秦皇岛和石家庄三个地区采集的13份腹泻仔猪肠内容物，用PBS缓冲液作1:5倍稀释；取50μL样品滴加到组装好的试纸条样品垫上，室温下反应15~20min，观察结果。同时用RT-PCR技术检测，比较两种方法的检测结果。25 河北农业大学硕士学位（毕业）论文4结果4.1PEDV抗体检测间接ELISA方法4.1.1最适抗原包被浓度与封闭液以浓缩的PEDV作为包被抗原，分别以不同浓度包被酶标板相应各孔，用2%BSA、1%明胶、5%脱脂奶粉、5%马血清、5%犊牛血清作为封闭液及抗体稀释液组成方阵，应用间接ELISA方法测定各孔的OD450nm值。当抗原包被浓度为1μg/mL，以2%BSA作为封闭液时，阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值（P/N）比值最大（表4-1）。表4-1封闭液与抗原包被浓度的方阵滴定试验Tab.4-1Matrixtitrationofcoatingantigenconcentrationandblockingbuffer-1阳性(+)/阴性(–)血清抗原包被浓度/μg·mL封闭液-1positiveserum(+)/Coatingconcentrationofantigen/μg·mLBlockingbuffernegativeserum(–)12345+0.7960.7830.7730.7540.7685%牛血清—0.1350.1270.1250.1200.124P/N5.8966.1656.1846.2836.194+0.8850.8770.8460.8430.8485%马血清—0.1720.1670.1590.1580.160P/N5.1455.2515.3215.3355.300+0.8640.8590.8570.8490.8545%脱脂奶粉—0.1530.1440.1450.1420.148P/N5.6475.9655.9105.9795.770+0.4280.4210.4310.4360.4271%明胶—0.1060.1090.1170.1190.112P/N4.0383.8623.6843.6643.813+0.9890.9740.9700.9640.9682%BSA—0.1580.1570.1560.1540.157P/N6.3406.2046.2186.2606.1664.1.2最适待检血清与酶标抗体浓度以0.1μg/mL的PEDV包被酶标板，用2%BSA将已知阴阳性血清作1:40、1:80、1:160、1:320倍稀释；HRP-羊抗鼠IgG作1:1000、1:2000、1:4000倍稀释，组成方阵，进行间接ELSIA试验。当阴阳性血清作1:40倍稀释，HRP-羊抗鼠IgG作1:2000倍稀释时，P/N值最大（表4-2）。26 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立表4-2待检血清与酶标二抗体最佳稀释浓度的方阵滴定试验Tab.4-2MatrixtitrationoftheoptimumdilutionofthetestedserumandIgG-HRP待检血清稀释倍数酶标二抗稀释倍数DilutionoftestedserumDilutionofIgG-HRP1:401:801:1601:320+0.8730.7560.6430.6131:1000—0.1240.1200.1010.094P/N7.0406.3006.3666.521+0.8950.8170.7380.5061:2000—0.1250.1190.1170.089P/N7.1606.8666.3085.685+0.4350.4060.3260.2561:4000—0.0860.0840.0810.081P/N5.0584.8334.0253.1604.1.3显色时间按照上述确定好的ELISA程序，在酶标抗体与血清反应后，每孔加入100μL底物显色液，室温避光显色15min，终止反应时，P/N值最大（表4-3）。表4-3显色时间的确定Tab.4-3Determinationofcolordevelopingtime抗体稀释度避光时间（min）AntibodyReactiontimeindark(min)dilution10152025301:40（+）0.9020.9260.9320.9430.9551:40（—）0.1150.1170.1290.1380.156P/N7.8437.9157.2256.8336.1224.1.4判定标准根据ELISA测定结果，可知30份PEDV抗体阴性血清OD450nm平均值X=0.161，SD=0.049，由此，可计算出阴阳性血清临界值为0.308，当待检血清的OD450≥0.308时，判定为阳性（表4-4）。27 河北农业大学硕士学位（毕业）论文表4-4间接ELISA临界值的确定Tab.4-4DeterminationofthecriticalvalueofELISA样本光密度吸收值样本光密度吸收值样本光密度吸收值SamplesOD450nmSamplesOD450nmSamplesOD450nm10.245110.206210.10920.158120.114220.15730.132130.164230.21040.234140.236240.12350.221150.135250.08360.105160.137260.12770.137170.106270.21980.160180.113280.12990.207190.256290.149100.215200.098300.1544.1.5特异性与敏感性用建立的间接ELISA方法检测PRRSV、CSFV、PCV2、PRV等病毒抗体时，OD450nm值均＜0.25（图4-1）。表明建立的ELISA方法与其他病毒血清没有交叉反应，具有良好的特异性。取已知PEDV抗体阳性血清和阴性血清做1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560倍比稀释，进行间接ELISA试验。该阳性血清的OD450nm值为阳性的最高稀释倍数是1:1280倍稀释（表4-5）,此时蛋白总量含量为0.216mg/mL。表明建立的间接ELISA方法最低可以检测到21.6μg的血清蛋白。图4-1重组N蛋白与其他病毒抗血清的交叉反应Fig.4-1CrossreactionofrecombinantNproteinwithanti-otherviralserum28 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立表4-5ELISA方法敏感性实验Tab.4-5SensitivityofELISA待检血清稀释倍数血清DilutionratiosoftestedserumSerum1:801:1601:3201:6401:12801:2560+0.723±0.0100.616±0.0070.578±0.0070.493±0.0040.345±0.0060.230±0.004—0.140±0.0060.127±0.0050.117±0.0030.106±0.0020.096±0.0010.083±0.004稀释液对照0.092±0.005\\空白对照0.086±0.004\\注：：无此项Note：：noting4.2PEDVN蛋白的表达与纯化取重组质粒PET32a-PEDV-N转化E.ColiBL21感受态细胞，挑取阳性菌落诱导表达，结果在40kDa左右出现目的条带。经Ni-AgaroseHis标签蛋白纯化试剂盒纯化表达产物，得到PEDVN蛋白，用于免疫小鼠（图4-2）。12345650kD40kD图4-2PEDVN蛋白的制备与纯化Fig.4-2PreparationandpurificationofPEDVNprotein1.Mark;2.PET32a诱导前;3.PET32a诱导后;4.PET32a-PEDV-N诱导前;5.PET32a-PEDV-N诱导后;6.PET32a-PEDV-N蛋白纯化1.Mark;2.PET-32abacteriabeforeinduced;3.PET-32abacteriainduced;4.PET-32a-PEDV-Nbacteriabeforeinduced;5.PET-32a-PEDV-Nbacteriainduced;6.purifiedPET32a-PEDV-N29 河北农业大学硕士学位（毕业）论文4.3免疫小鼠的血清PEDV抗体用纯化的PEDV-N重组蛋白作为免疫抗原，免疫6周龄左右的4只BALB/c小鼠。用间接ELISA方法，检测三免、加强免疫后小鼠的血清特异抗体水平。结果如表4-6所示，第3次免疫后，4只小鼠的血清全部转阳，但抗体OD450nm值在0.339~0.634之间，待加强免疫后，抗体水平均升高，其中2只小鼠的抗体OD450nm值均在1.1以上，故选择抗体水平高的小鼠脾脏用于细胞融合。表4-6小鼠血清PEDV特异性抗体的动态Tab.4-6PEDVspecificantibodyintheserumofmicefollowingvaccination老鼠编号免疫次数MouseNo.Immunetimes1234三免0.6340.5890.3390.430强免1.1651.1550.4620.6334.4细胞融合与杂交瘤细胞的筛选免疫小鼠脾细胞和处于指数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞融合后，用建立的间接ELISA方法进行筛选，选出只有一个阳性克隆的孔（图4-3）。采用有限稀释法对阳性克隆孔，进行3~5次亚克隆，经ELISA检测和筛选，最终获得了4株能够稳定分泌抗PEDV的单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为：1G9-1G2-C2-A7（简称A7）、1D10-5E6-A8-E3-E10(简称E10)、1D10-5E6-C7-H11-G10-F7(简称F7)和1D10-5E6-C7-H11-G10-C1(简称C1)。图4-3融合后的杂交瘤细胞克隆（×100）Fig.4-3Hybridomacloneafterfusion(×100)30 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立4.5杂交瘤细胞的染色体SP2/0骨髓瘤细胞染色体数目为62~68条，小鼠脾细胞染色体数目为40条，A7、E10、F7和C1四株杂交瘤细胞株的染色体数目在97~103条之间（表4-7和图4-4）。可见，杂交瘤细胞染色体数目明显增多，接近两亲本细胞的染色体数目之和。A7E10F7C1图4-4杂交瘤细胞染色体计数（×1000）Fig.4-4Numbersofhybridomachromosome(×1000)表4-7杂交瘤染色体数目Tab.4-7Chromosomenumbersofhybridomacells细胞株染色体数目平均数CellstrainsChromosomenumbersMeansA7100909510510298.4E10105101103101105103F710210192969897.8C1103102101105102102.64.6单克隆抗体的类型A7、E10、C1和F7四株杂交瘤细胞的培养上清分别与抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM抗体及抗轻链κ、λ抗体反应，OD450nm≥0.2判为阳性反应。结果如表4-8和图4-5所示，4株抗体均与抗IgM抗体和抗κ轻链抗体反应，OD450nm>0.2，颜色呈现蓝色。此结果表明获得的4株杂交瘤细胞分泌的抗体均为IgM类，其轻链均为κ链。31 河北农业大学硕士学位（毕业）论文表4-8单抗类—亚类—型鉴定Tab.4-8Class-subclass-typeassayofMcAbs细胞株OD450nmCellstrainsIgG1IgG2aIgG2bIgG3IgAIgMKappaLambdaA70.1520.1650.1190.1040.1972.7891.9480.190E100.1060.0540.0740.0640.0622.5951.8590.064C10.1060.0520.0530.0510.0481.3161.2470.046F70.0710.0550.0520.0490.0501.2381.0760.0451234IgG1IgG2aIgG2bIgG3IgAIgMKappaLambda图4-5单抗类—亚类—型鉴定Fig.4-5Class-subclass-typeassayofMcAbs4.7单克隆抗体识别的抗原表位用间接ELISA方法，测4株杂交瘤细胞的饱和稀释度，A7株的饱和稀释度为1:400，E10、C1、F7株的饱和稀释值为1:50（表4-9）。抗体叠加试验发现，4株单克隆抗体中两两相加的AI绝对值均>10%（表4-10），表明A7、E10、F7和C1识别的抗原位点不同。表4-9四株杂交瘤细胞的饱和稀释度Tab.4-9Saturationoffourhybridomacells稀释倍数单克隆抗体DilutionratioMcAb1:501:1001:2001:4001:8001:1600A72.0781.4931.0160.8620.4910.276E100.9670.3650.1850.1740.1250.098C10.8320.3070.2040.1580.1060.093F70.8020.3280.1080.1030.0940.07232 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立表4-10四株单克隆抗体的指数相加ELISA试验Tab.4-10AdditiveIndexof4McAbsbyELISA单克隆抗体McAbMcAbA7E10F7C1A72.1391.345（29.31%）1.127（60.89%）1.288（40.82%）E101.430（59.79%）2.7091.210（90.19%）1.268（69.11%）F70.863（37.35%）0.988（24.88%）1.6621.231（20.67%）C11.488（27.91%）1.378（26.10%）1.136（57.10%）2.085注:OD450nm值,括号内为两株单抗的AI值。Note:OD450nm值,AIareshowninbrackets.4.8单克隆抗体的免疫活性Westernblot分析显示，4株单抗与PEDVN蛋白反应后，均在40kDa处出现清晰的棕黄色条带（图4-6），说明4株单克隆抗体均能够与PEDVN蛋白发生特异结合。同时，通过免疫组化，检测了PEDV感染仔猪小肠组织，如图4-7所示，4株抗体均能够与感染小肠绒毛上皮细胞中的病毒发生特异性结合，而出现棕色信号。上述实验结果表明，获得的4株单克隆抗体具有良好的免疫活性。1234540kD图4-6单克隆抗体的Western-blot鉴定Fig.4-6IdentificationofMcAbbyWestern-blot1.蛋白Marker;2.E10株;3.A7株;4.C1株;5.F7株1.PrestainedproteinMarker;2.E10;3.A7;4.C1;5.F733 河北农业大学硕士学位（毕业）论文A7E10C1F7对照图4-7四株单抗与PEDV反应免疫组化鉴定（×100）Fig.4-7Identificationof4strainsMcAbcombinedwithPEDVbyimmunohistochemistry(×100)注：箭头所指为阳性信号。Note:thearrowsshowthepositivesignals4.9单克隆抗体效价用PBST抗体稀释液将杂交瘤细胞培养上清作1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、71:3200倍比稀释，将4株杂交瘤细胞分别制备的腹水作1:10~1:10倍系列稀释，应用间接ELISA方法测其效价。从高到低，4株杂交瘤细胞分泌单抗的效价依次为：A7（1:1600）>E10（1:100）>65C1（1:100）>F7（1:100）（表4-11）。相应腹水的效价依次为：A7（1:10）>E10（1:10）>C132（1:10）>F7（1:10）（表4-12）。表4-11四株杂交瘤细胞培养上清ELISA效价Tab.4-11AntibodytitersinculturesupernatantoffourhybridomacellsbyELISA稀释倍数单克隆抗体DilutionratioMcAb1:501:1001:2001:4001:8001:16001:3200A72.4242.1361.6821.190.8410.4520.215E101.0930.3540.1790.1710.0820.0670.065C10.9450.3740.2170.1670.1130.1010.074F70.7420.3300.0970.0930.0870.0690.07034 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立表4-12腹水效价测定Tab.4-12Antibodytitersinascitesfluid稀释倍数单克隆抗体DilutionratioMcAb2345671:101:101:101:101:101:101:10A72.7192.5102.0491.1250.7630.7870.207E102.8802.5741.6760.6030.3220.1590.082C11.8111.7210.4910.1780.1100.0650.060F71.5431.1590.2490.1670.0950.1410.1084.10杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性复苏冻存的四株杂交瘤细胞，并连续传代培养至30代，用间接ELISA法检测第2、5、10、15、20、25、30代的杂交瘤细胞培养上清中的抗体效价，结果如表4-13和图4-8所示。当传代至20~30代时，A7株分泌抗体的效价在1:800左右，C1，E10，F7株的效价在1:100~1:200之间。表明4株杂交瘤细胞具有较好的抗体分泌稳定性，但不同细胞株分泌的抗体效价存在差异。表4-13杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性Tab.4-13Stabilityofthehybridomacellssecretingantibodies代次单克隆抗体GenerationsofhybridomaMcAbF2F5F10F15F20F25F30A71:8001:8001:8001:16001:8001:8001:800E101:2001:2001:2001:2001:2001:1001:100C11:2001:1001:2001:2001:1001:1001:200F71:1001:1001:1001:2001:2001:1001:100图4-8不同代次杂交瘤细胞分泌抗体的动态变化Fig.4-8DynamicsofthedifferenthybridomagenerationsecretingMcAb35 河北农业大学硕士学位（毕业）论文4.11腹水的纯化及其蛋白含量应用IgM类单克隆抗体纯化试剂盒纯化A7和F7两株杂交瘤制备的腹水，然后进行SDS-PAGE鉴定，结果如图4-9所示，纯化后电泳显示，大小不等的3个条带，即25-30kDa大小的轻链、40-50kDa的重链及大于100kDa的可能是重链与轻链复合体。纯化后A7株总蛋白含量为3.4mg/mL，F7株总蛋白含量为3.5mg/mL。12345100kD50kD40kD重链轻链25kD图4-9腹水中单克隆抗体的纯化Fig.4-9PurificationofMcAbinasceticfluid1.Marker;2~3.分别为纯化前后的A7株腹水;4~5.分别为纯化前后的F7株腹水1.Marker;2~3.A7asceticfluidbeforeandafterpurification,respectively;4~5.F7asceticfluidbeforeandafterpurification,respectively.4.12制备的胶体金及其质量当把1%柠檬酸三钠溶液溶液加入到0.01%氯金酸溶液中1~2min后，可见溶液颜色逐渐变化，即由无色—蓝色—浅蓝色—酒红色（粒径20nm）和紫色（粒径40nm）（图4-10A）。2个月后粒径40nm胶体金悬液出现沉淀；20nm的胶体金稳定性好，未出现沉淀（图4-10B）。将胶体金悬液滴于覆有Formvar膜的铜网上，电镜观察，并统计50个胶体金颗粒，计算其平均直径。结果显示，20nm的金颗粒平均直径为（184）nm，金颗粒呈圆球形、大小均一、聚集现象很少；40nm的金颗粒平均直径为（44.29.4）nm，胶体金颗粒呈椭圆形，大小不均一、聚集现象较多（图4-11）。表明20nm胶体金颗粒适合于进一步标记抗体。36 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立20nm40nmA20nm40nmB图4-10不同粒径胶体金颗粒的稳定性Fig.4-10StabilityofcolloidalgoldparticlesindifferentgraindiametersA.新制备的胶体金悬液；B.保存2个月的胶体金悬液A.Colloidalgoldnewprepared;B.ColloidalgoldtwomonthsafterbeingsavedAB图4-11胶体金的电镜观察Fig.4-11ElectronmicrographsofcolloidalgoldA.20nm金颗粒；B.40nm金颗粒A.Colloidalgoldinthesizeof20nm;B.Colloidalgoldinthesizeof40nm4.13胶体金标记抗体的最适稳定量如图4-12A所示，1-6号管胶体金的颜色与对照管（12号管）颜色基本一致，为酒红色，从7号开始到10号管胶体金悬液颜色逐渐变为淡蓝色，并有聚沉现象。表明1-6号管中加入的抗体量达到或超过了稳定胶体金的最低量，7-10号管中的抗体加入量不足以稳定胶体金。所以6号管加入的抗体量为稳定胶体金的最低量，即1:32倍稀释的A7株单克隆抗体，浓度为31.25μg/mL。另外，应用紫外分光光度计测定的胶体金悬液颜色正常的1-7号管的OD530nm值，并绘制曲线，如图4-12B所示，抗体浓度在31.25μg/mL时OD530nm值最接近X轴，为最适稳定量。37 河北农业大学硕士学位（毕业）论文由紫外分光光度计测得的结果与颜色变化结果一致。因此，在抗体最低稳定量的基础上增加30%，作为最适蛋白稳定量，即稳定1mL胶体金所需单抗A7的量为40μg。A．123456789101112B．图4-12胶体金标记抗体A7最适稳定量的测定Fig.4-12OptimalconcentrationofMcAbA7labeledbycolloidalgold4.14胶体金标记抗体的最适pH值将胶体金悬液pH值调为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，然后加入40μg/mL的A7抗体，观察各管中胶体金悬液的颜色变化。结果如图4-13A所示，与对照管比较，当pH值为6.0-7.5时，悬液颜色有微弱变化，pH8.0-9.0时颜色基本没有变化。表明胶体金标记抗体最适pH值为7.5-8.0。另外，测定各管胶体金悬液的OD530nm值，并绘制曲线，结果如图4-13B所示，当pH为8.0时，OD530nm值最接近X轴，为胶体金标记最适pH值。此结果与颜色变化一致。因此，将胶体金标记抗体A7的最适pH值为8.0。A．pH6.06.57.07.58.08.59.0对照38 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立B．图4-13胶体金标记抗体A7最适pH的测定Fig.4-13OptionalpHofA7labeledbycolloidalgold4.15检测线的抗体包被浓度将不同浓度的F7株单克隆抗体印迹于硝酸纤维素膜上作为检测线，与PEDV阳性的肠内容反应，如图4-14所示，当抗体浓度为1.0mg/mL时，检测线最清楚，可见，F7株单克隆抗体的最适印迹量是1.0mg/mL。1234TC图4-14单克隆抗体F7的最适印迹量Fig.4-14PrintingconcentrationofMcAbF71.3.0mg/mL；2.2.0mg/mL；3.1.0mg/mL；4.0.5mg/mL4.16质控线的抗体包被浓度用1.0mg/mL的单克隆抗体F7包被于硝酸纤维素膜上作为检测线。同时分别将1.0mg/mL、0.5mg/mL的羊抗鼠IgM印迹于硝酸纤维素膜上为质控线，与PEDV阳性肠内容物反应。如图4-15所示，当羊抗鼠IgM的浓度为1.0mg/mL时，质控线条带最清晰。39 河北农业大学硕士学位（毕业）论文12TC图4-15羊抗鼠IgM的最适印迹量Fig.4-15Printingconcentrationofgoatanti-mouseIgM1.1mg/mL；2.0.5mg/mL4.17包被液分别用包被液1和包被液2处理试纸条，比较反应结果。结果经包被液2处理过的试纸条，反应后检测线和质控线的条带清晰，敏感性好（图4-16）。12TC图4-16包被液的选择Fig.4-16Selectionofcoatingbuffer1.包被液1;2.包被液21.Coatingbuffer1;2.Coatingbuffer24.18试纸条的特异性与敏感性用组装的试纸条分别检测PEDV、PRRSV、CSFV、PCV2和PRV，结果如图4-17所示，试纸条仅与PEDV反应，与另外4种病毒均不发生反应。表明该试纸条具有良好的特异性。用组装的试纸条分别检测1:5~1:40倍比稀释PEDV阳性肠内容物，检测结果如图4-18所示，当样品稀释10倍时，检测线呈现红色，表明该试纸条最低可检测出1:10倍稀释的肠内容物。TC1TC12233454图4-17试纸条特异性检测结果图4-18试纸条敏感性检测结果Fig.4-17SpecificityofthestripFig.4-18Sensitivityofthestrip1.PEDV;2.PRRSV;3.CSFV;4.PCV2;5.PRV1.1:5;2.1:10;3.1:20;4.1:4040 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立4.19初步应用用组装的试纸条和RT-PCR技术同时检测13份腹泻仔猪小肠内容物，结果如表4-14所示，试纸条与RT-PCR的阳性检出率分别为38.46%（5/13）和46.15%（6/13），两者的阳性符合率为83.3%。该结果表明，利用抗PEDVN蛋白制备的单克隆抗体建立的PEDV胶体免疫层析试纸条能够快速检测PEDV，可用于现场诊断。表4-14PEDV胶体金试纸条对临床样品的检测Tab.4-14DetectionofsamplesbyPEDVcolloidalgoldimmunochromatographicstrip病料份数试纸条RT-PCRSamplesNumbersStripRT-PCR保定51/51/5秦皇岛53/53/5石家庄31/32/3样品总数135/136/13总阳性检出率(%)38.4646.1541 河北农业大学硕士学位（毕业）论文5讨论5.1单克隆抗体的制备单克隆抗体技术已被广泛应用于临床诊断、微生物的抗原结构与中和表位分析、疾病（如肿瘤、传染病、寄生虫病等）治疗等医学、生物学、食品卫生等各个领域，成为科学研究、疾病检[101]测以及食品卫生检疫的重要工具，并被视为极其有前途的生物治疗制剂。近年来，PED在我国等亚洲国家以及美国广泛流行，其危害巨大，造成的经济损失严重，但针对该病的防治措施尚不完善，如：没有十分有效的疫苗和特异敏感的快速诊断方法。目前，国内外关于猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的研究已有相关报道，但关于以单克隆抗体为材料的胶体金免疫层析技术的研究[99]鲜有报道。胶体金免疫层析技术以其特异性强、诊断快速、携带便捷、稳定性好、结果直观、无需仪器设备等独特优势，倍受广大研究人员和临床工作者重视，具有广泛的应用价值。本实验之所以用纯化的PEDVN重组蛋白作为免疫抗原来制备抗PEDV的单克隆抗体，是因为N蛋白是PEDV的主要结构蛋白，在感染的细胞中能得到大量表达，保守性强，是病毒感染早[43]期诊断和疫病监测的主要靶蛋白。试验中N蛋白的表达，是通过原核表达载体PET32a，由于该载体上带有His标签，表达出来的PET32a-PEDV-N蛋白具有His标签结构，故在建立间接ELISA方法筛选单克隆抗体时，用猪流行性腹泻病毒作为包被抗原，筛选分泌PEDV抗体的杂交瘤细胞株。避免因为产生的抗体具有His标签，抗原抗体的反应为His标签的反应，造成假阳性结果。抗原刺激机体产生免疫反应，活化的B细胞分化为不同浆细胞克隆。不同浆细胞产生与抗原有特异性结合能力的不同类型的免疫球蛋白，包含IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类。蛋白作为免疫抗原初次进入具有应答能力的小鼠体内，需要经过一段时间的潜伏期才能出现抗体，最初体内抗体含量较低，主要成分为IgM；再经过几次免疫，刺激机体抗体含量升高，此时抗体的主[102]要成分为IgG，同时还会有少量的IgM。本实验筛选出来的四株单克隆抗体，经亚型鉴定均为IgM，原因可能是：在细胞融合过程中，融合成功的杂交瘤细胞是分泌IgM抗体的，所以经过亚克隆及筛选最后的单克隆抗体分泌IgM；另外，可能是与PEDVN蛋白结构有关，其刺激小鼠产生的免疫应答主要是分泌IgM抗体。单抗是Y型结构，由重链和轻链组成，IgM是由五个单体组成的五聚体，分子量约为900kD。在SDS-PAGE电泳过程中，蛋白质样品变性，蛋白质高级结构破坏，共价键断裂，重链和轻链分离，分子量分别是70kD和25kD。理论上，蛋白质经过变性后，轻链和重链是分离的，但是在实验中会产生聚合体，即未完全解离的IgM分子。因此，在SDS-PAGE电泳图中，重链上方也会出现蛋白条带。本实验中经过多次SDS-PAGE电泳尝试，轻链的分子量在25kD左右，而重链的分子量比70kD偏小，原因是上样缓冲液中的DTT破坏蛋白质结构，不仅使共价键断开，还可将其二硫键打断。单克隆抗体的制备就是要筛选出由一种抗原决定簇刺激机体单个B淋巴细胞克隆产生的针[102]对抗原的同一表位的抗体。筛选的针对目标抗原的不同阳性杂交瘤细胞株，其分泌的抗体可能针对不同或同一抗原表位，了解不同抗体是否针对同一抗原表位，对于后续检测方法的建立非42 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立常必要。相加ELISA方法是分析单克隆抗体识别抗原表位的常用方法，当两种单克隆抗体同时作用于相同的抗原表位时，相互之间发生空间位阻，干扰作用及竞争结合，若作用于与其无关部位则没有这种相互影响。因此，当两株针对不同表位的单克隆抗体同时作用于有限量的抗原，与一种单克隆抗体单独作用比较，表位相加后OD值变化大；反之，两株相同或邻近表位的单克隆抗体同时作用于抗原，与一种单克隆抗体单独作用比较，表位相加后OD值变化不大。一般当两株[103]单克隆抗体相加后AI值超过10%时，认为该两株抗体针对的是不同抗原表位。本试验中获得的A7、E10、C1、F7四株单抗两两相加后的AI值变化在24.88%~90.19%内，所以判定这四株单克隆抗体针对PEDVN蛋白的不同抗原表位。此结果为下一步免疫胶体金层析技术的研究提供了必要试验材料。5.2金标抗体的制备[84]自1857年Faraday发现胶体金以来，已经发展了多种方法用于制备胶体金。除经典的Frens法，化学还原法是最为简单和常用的制备方法，通过改变还原剂的种类和剂量来控制所产生的金颗粒大小。还原剂的浓度越高，产生金粒子的数量越多，粒径也就越小。目前为止，较常用还原剂有柠檬酸三钠、白磷、鞣酸、乙醇、硼氢化钠、过氧化氢、抗坏血酸等，其中柠檬酸三钠的应用最普遍，本实验也选择了柠檬酸三钠作为还原剂。氯金酸易潮解，对金属有较强的腐蚀性，因此要干燥，避光保存，配制时不能跟金属接触。制备出颗粒大小均一且稳定、高质量的胶体金悬液，受很多的因素影响。器皿的清洁度对其影响较大，制备前，所使用的有的玻璃器皿都应该绝对清洁，用前要洗净灰尘，经过酸浸泡和三蒸水的多次冲洗，有条件的可以进行硅化处理。如果玻璃器皿不干净或者在制备过程中有灰尘落入，形成的颗粒大小不一，颜色微红，无色或浑浊。本实验对玻璃器皿未进行硅化，而是用第一批制备的胶体金润洗器皿，取得了理想效果。在胶体金制备过程中，使用的水都应该是三蒸水，本实验采用的是电阻率大于18M.cm超纯水；还原剂柠檬酸三钠的加入要一次性快速，且在整个制备过程中都在加热煮沸的状态下以100~200r/min保持匀速搅拌。质量好的稳定的胶体金悬液可以在4℃条件下保存3个月甚至半年左右。本实验制备的40nm的胶体金金悬液在保存2个月后，出现聚沉的现象；20nm的胶体金悬液稳定，没有聚沉现象。20nm左右的胶体金颗粒不仅稳定，颗粒大小也适合抗体的标记，且作为金标抗体在硝酸纤维素膜上的泳动速度也适中，产生眼观最敏感的颜色。胶体金标记抗体时加入终浓度为0.4%BSA作为稳定剂，同时加入0.2%PEG20000，这样PEG20000便可吸附在金颗粒的表面形成吸附层，吸附层之间互相排斥防止金颗粒的聚集。高分子稳定剂的浓度不能过低，否则不仅起不到保护作用，还会降低胶体金标记的稳定性。5.3胶体金免疫层析检测方法的建立以针对不同表位的单克隆抗体分别作为标记抗体和检测抗体，建立的胶体金免疫层析检测方法，可以克服应用多克隆抗体时的非特异性。本实验在前期工作中制备的四株单克隆抗体虽然分43 河北农业大学硕士学位（毕业）论文别针对N蛋白的不同抗原位点，为免疫胶体金免疫层析检测方法的建立提供了必要试验材料，但它们的抗体效价、抗原亲和力不同，对玻璃纤维膜的吸附力也可能存在差异。因此，在试验过程中，我们首先根据抗体效价及两株抗体的ELISA相加指数（AI），由高到底依次试验每株抗体的标记及检测效果。最后确定以A7株作为金标单克隆抗体，包被玻璃纤维素膜，制备金标垫，用单克隆抗体F7和抗羊抗鼠IgM印记硝酸纤维素膜，分别作为检测线和质控线，组装成试纸条，建立检测胶体金免疫层析方法。该试纸条的检测全过程只需15~20min，检测结果清晰可辨，与PRRSV、CSFV、PCV2和PRV等病毒无非特异反应，当将仔猪粪便稀释5~10倍时可以检测到其内的病毒。因此，本研究建立的方法非常适合现地检测，为PEDV胶体金免疫层析试纸条的进一步开发应用搭建了必要技术平台。5.4试纸条的检测效果及存在问题本试验制备的试纸条具有良好的特异性，能够快速的诊断出PEDV，是适用于现场试验的一种新的技术手段，但是与RT-PCR方法（阳性检测率6/13）的符合率为83.3%，可见其敏感性低于RT-PCR技术。影响其检测效果的因素有很多：首先，用于金标的单克隆抗体A7的质量至关重要，单抗A7的生物活性、亲和力、纯度都将影响胶体金的标记效果。纯化过程中要尽量去除高浓度的杂质和多余离子，这些离子不仅干扰蛋白与胶体金的结合，而且破坏胶体金的稳定，导致金颗粒的凝聚；其次，标记过程中的胶体金悬液的pH值也比较关键。只有在pH值接近或稍高于该蛋白的等电点时，胶体金与蛋白的结合最强，因此对溶液pH值的测定要选用精密的酸碱试纸条。本实验采用的是普通的试纸条，精确度可能存在一定误差。另外，胶体金是以稳定的体系存在的，标记时使用的试剂最好采用国外进口，超纯水配制除菌后备用。如果试剂纯度不好、存在杂质，会破坏金标单抗复合物的稳定性。点膜过程中环境的湿度非常重要，湿度一般控制在45%~65%左右最佳。可以在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间，来保证点膜时湿度的均一性。本试验整个过程是采用手工制作，在开放式的条件下进行的，试验环境如温度、湿度都不稳定，采用微量移液器点膜，滴加量大且不均一。测试样品时，现组装试纸条，各个膜之间的结合点没有压实的过程，金标复合物在层析过程中会滞留在结合点处，从而降低了试纸条的敏感度。同时，加入的待测样品，会将衔接不好的硝酸纤维素膜冲起，引起金标抗体的滞留，影响检测结果。总之，与机器喷膜、切条相比较，手工切条时对膜的损伤较大，手工点样误差较大、耗时长。手工操作不能够保证试验操作过程中条件的稳定性，影响检测结果的准确性。因此，试纸条的制备工艺有待改进。44 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立6结论6.1应用细胞杂交瘤技术，建立了四株能够稳定分泌PEDVN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株（A7、E10、F7和C1）。四株细胞分泌的抗体均为IgM（κ），抗体分别针对N蛋白的4个不同表位。6.2应用粒径约为20nm的胶体金悬液标记单克隆抗体A7，以单克隆抗体F7和羊抗鼠IgM分别作为检测抗体和质控抗体，初步组装了特异检测PEDV的胶体金免疫层析试纸条，为PEDV胶体金免疫层析试纸条的进一步开发应用搭建了必要技术平台。45 河北农业大学硕士学位（毕业）论文参考文献[1]陈溥言,王川庆.兽医传染病学[M].北京:中国农业出版社,2006.229-231.[2]ChaseyD,CartwrightSF.Virus-likeparticlesassociatedwithporcineepidemicdiarrhoea[J].Researchinveterinaryscience,1978,25(2):255-256.[3]ParkSJ,KimHK,SongDS,etal.Molecularcharacterizationandphylogeneticanalysisofporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)fieldisolatesinKorea[J].ArchivesofVirology,2011,156(4):577-585.[4]LiZhl,ZhL,MJY,etal.Molecularcharacterizationandphylogeneticanalysisofporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)fieldstrainsinsouthChina[J].VirusGenes,2012,45(1):181-185.[5]PanYF,TianXY,LiW,etal.IsolationandcharacterizationofavariantporcineepidemicdiarrheavirusinChina[J].VirologyJournal,2012,9(195):145-150.[6]StevensonGW,HoangH,SchwartzKJ,etal.EmergenceofPorcineepidemicdiarrheavirusintheUnitedStates:clinicalsigns,lesions,andviralgenomicsequences[J].JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation,2013,25(5):649-654.[7]殷震,刘景华.动物病毒学[M].北京:科学出版社,1997.688-690.[8]HofmannM,WylerR.Quantitation,biologicalandphysicochemicalpropertiesofcellculture-adaptedporcineepidemicdiarrheacoronavirus(PEDV)[J].VeterinaryMicrobiology,1989,20(2):131-142.[9]孙东波,冯力,时艳红,等.猪流行性腹泻病毒分子生物学研究进展[J].动物医学进展,2006,27(10):11-14.[10]KweonCH,KwonBJ,LeeJG,etal.Derivationofattenuatedporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)asvaccinecandidate[J].Vaccine,1999,18(1-2):201-201.[11]HofmannM,WylerR.Propagationofthevirusofporcineepidemicdiarrheaincellculture[J].JournalofClinicalMicrobiology,1988,26(11):2235-2239.[12]马思奇,王明,周金法,等.猪流行性腹泻病毒适应Vero细胞培养及传代细胞毒制备氟氧化银灭活疫苗免疫效力试验[J].中国畜禽传染病,1994,21(2):15-19.[13]KusanagiK,KuwaharaH,KatohT,etal.IsolationandserialpropagationofporcineepidemicdiarrheavirusincellculturesandpartialcharacterizationoftheisoIate[J].TheJournalofVeterinaryMedicalScience,1992,54(2):313–318.[14]KadoiK,SugiokaH,SatohT,etal.Thepropagationofaporcineepidemicdiarrheavirusinswinecelllines[J].TheNewMicrobiologica,2002,25(3):285-290.[15]PensaertMB,deBouckP.Anewcoronavirus-likeparticleassociatedwithdiarrheainswine[J].Archivesofvirology,1978,58(3):243-247.[16]NguyenVP,HogueBG.ProteininteractionsduringcoronavirusassembIy[J].JournalofVirology,1997,71(12):9278-9284.46 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猪流行性腹泻病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测方法的建立致谢本论文是在导师宋勤叶教授的悉心指导下完成的，从论文选题到完成，每一个细节都倾注了老师大量的心血。期间遇到无数的困难和挫折，老师无时无刻不在我们身边，以严格的要求，专业的知识，和蔼的态度悉心指导，帮助我克服障碍，使我走进预防兽医的大门。还记得初进实验室时的青涩，第一次穿上白大褂“剖杀老鼠”时克服心理障碍的困难，连续熬夜付出的汗水；三年中老师勤奋的身影，严谨的治学态度，渊博的专业知识，精益求精的工作作风，这些都将时刻影响着我们在科研路上的前进方向。在此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢！感谢老师无私的付出！同时感谢预防兽医实验室的王家鑫教授、孙继国教授、张铁教授、包永占教授、秦建华教授、赵月兰教授、范京惠副教授、左玉柱副教授、袁万哲副教授、李丽敏老师在实验和学习中给予的指导与帮助。感谢王晓波、朱卫霞、张鹤、杜伟伟等同学，在三年的研究生学习期间，给予的帮助和关怀，并一起渡过了难忘的三年研究生生活，在此衷心的感谢他们。最后，向所有帮助过我的老师、同学、朋友和我亲爱的家人表示最真诚的感谢!魏艳秋2015年5月10日55 a,.