猪脑心肌炎病毒3AB蛋白多克隆抗体的制备及其相互作用宿主蛋白的筛选与鉴定

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分类号：密级：硕士研究生学位论文猪脑心肌炎病毒3AB蛋白多克隆抗体的制备及其相互作用宿主蛋白的筛选与鉴定专业领域：养殖研究方向：动物疾病防控研究生：薛娟指导教师：翁长江研究员杨玉莹教授论文起止日期：2015年9月至2018年4月 分类号：密级：硕士研究生学位论文猪脑心肌炎病毒3AB蛋白多克隆抗体的制备及其相互作用宿主蛋白的筛选与鉴定专业领域：养殖研究方向：动物疾病防控研究生：薛娟指导教师：翁长江研究员杨玉莹教授论文起止日期：2015年9月至2018年4月 Preparationofpolyclonalantibodyagainstencephalomyocarditisvirus3ABproteinandscreeningandverificationoftheinteractionbetween3ABproteinandhostproteinsField：AquacultureDirectionofStudy：AnimaldiseasepreventionandcontrolGraduateStudent：XueJuanSupervisor：Prof.WengChangjiang,Prof.YangYuyingCollegeofAnimalScienceYangtzeUniversitySeptember,2015toApril,2018 摘要猪脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditisvirus，EMCV）是无囊膜单股正RNA病毒，属于小RNA病毒科，心病毒属。该病毒能感染猪、老鼠、大象、猩猩等多种动物，感染猪群后出现母猪流产、产死胎等繁殖障碍性疾病，以及仔猪突发性死亡，降低仔猪的存活率，给养猪业带来不小的经济损失。此外，EMCV还能感染人类，虽然发病率较低，但仍给公共卫生安全带来了重大隐患。EMCV常被用作研究糖尿病和病毒性心肌炎，也常作为RNA刺激物用于Toll样受体和细胞内受体的研究。EMCV编码13个病毒蛋白，其中3A蛋白约9.9KDa，3B蛋白约2.3KDa。目前研究发现EMCV3AB蛋白在EMCV复制过程中起着至关重要的作用。在病毒复制过程中位于内质网上的3A蛋白，招募磷脂酰肌醇4-激酶Ⅲα（phosphatidylinositol4-kinaseⅢα，PI4KⅢα）并与之结合，催化形成富含磷脂酰肌醇4磷酸盐脂质（phosphatidylinositol4phosphate，PI4P）的微环境，形成病毒复制细胞器（replicationorganelles，ROs），促进氧甾酮结合蛋白（oxysterol-bindingprotein，OSBP）将胆固醇运输到病毒复制细胞器上，帮助病毒基因组复制。3B蛋白则与EMCV基因组RNA共价相连。在RNA复制起始时，3B蛋白起“引物蛋白”的作用，在子代病毒组装的过程中，只有与3B蛋白相连的基因组RNA才能被装入衣壳中。在病毒复制过程中，宿主蛋白往往通过与病毒蛋白相互作用形成复杂的调控网络，直接或间接的调控病毒复制，但目前关于EMCV3AB与宿主蛋白相互作用网络的研究鲜有报道。为了进一步研究3AB蛋白的功能，本研究制备了3AB蛋白多克隆抗体。采用ELISA的方法检测血清效价，采用蛋白免疫印迹法和间接免疫荧光法检测血清特异性识别EMCV3AB蛋白的效果。结果显示所获得的五份EMCV3AB多克隆抗体效价分别为1:256000、1:256000、1:256000、1:128000、1:256000，且均能特异性识别HEK293T细胞中过度表达的3AB蛋白和EMCV感染细胞表达的3AB蛋白，并可用于间接免疫荧光检测。以上研究结果表明，我们成功制备了抗EMCV3AB蛋白的多克隆抗体。酵母双杂交系统是依据真核生物细胞转录子的特点建立的，使用该系统能够简便、快捷、高通量地筛选和鉴定与已知蛋白相互作用的蛋白。为了研究EMCV3AB蛋白与宿主蛋白相互作用网络，本研究利用EMCV3AB蛋白为诱饵蛋白，采用酵母双杂交方法筛选了BHK-21细胞cDNA表达文库，初步筛选到六个与3AB蛋白相互作用的宿主蛋白，分别是RFC5、RPS20、RPL11、LRWD1、PIH1D1和LGALS1。通过酵母回复试验进行验证，发现RFC5、RPS20、RPL11、LRWD1、LGALS1与3AB蛋白相互作用，而未能检测到PIH1D1与3AB蛋白的相互作用。I 为了进一步为了验证这些蛋白与3AB蛋白的相互作用，以小鼠腹腔巨噬细胞的cDNA为模板，通过PCR扩增RFC5、RPS20、RPL11、LRWD1和PIH1D1基因，并克隆到pCAGGS-Flag载体中，构建的重组质粒分别命名为pCAGGS-Flag-RFC5、pCAGGS-Flag-PIH1D1、pCAGGS-Flag-RPS20、pCAGGS-Flag-RPL11、pCAGGS-Flag-LRWD1和pCAGGS-Flag-LGALS1。在HEK293T细胞中分别共表达3AB蛋白与RFC5、RPS20、RPL11、LRWD1和PIH1D1蛋白，进行免疫共沉淀试验，结果显示RFC5、RPS20、RPL11、LRWD1、PIH1D1均与3AB蛋白存在相互作用，而未能检测到LGALS1与3AB蛋白的相互作用。同时通过激光共聚焦试验发现RFC5、RPS20、RPL11、LRWD1、PIH1D1均与3AB蛋白存在共定位。最后，本研究探索了RFC5、RPS20、RPL11、LRWD1、PIH1D1对EMCV复制的影响。将EMCV接种到过度表达RFC5、RPS20、RPL11、LRWD1、PIH1D1的BHK-21细胞，12h和24h后收样，采用荧光定量PCR的方法检测细胞中EMCV的mRNA水平，同时测定细胞上清中EMCV的TCID50。结果发现过度表达RFC5、RPS20、RPL11、LRWD1、PIH1D1既不影响EMCV的基因组水平，也不影响EMCV的TCID50。另外，本研究所筛选到的蛋白具有多种功能，且多数与细胞凋亡和肿瘤的发生发展有关，而且EMCV能诱导腺泡细胞发生细胞凋亡，这提示这些蛋白与EMCV3AB蛋白相互作用可能参与其他生命过程。综上所述，本研究成功制备了EMCV3AB蛋白的多克隆抗体，为进一步研究3AB蛋白的功能提供了条件；利用酵母双杂交和免疫共沉淀的方法筛选并鉴定了BHK-21细胞中与EMCV3AB蛋白相互作用的宿主蛋白，为进一步研究EMCV3AB蛋白的功能奠定了基础。关键词：猪脑心肌炎病毒，3AB蛋白，多克隆抗体，酵母双杂交系统，病毒-宿主相互作用II AbstractEncephalomyocarditisvirus(EMCV)isanon-envelopedsingle-strandedpositivechainRNAvirus,whichbelongstocardiovirusgenusinthefamilypicornavirus.EMCVcaninfectpigs,mouse,elephantsandorangutans.PigsinfectedwithEMCVwillleadtoabortion,stillbirthandotherreproductivedisorders,whilepigletsinfectedwithEMCVwillleadtosuddendeath,whichgreatlyreducethesurvivalrateofpigletsandbringhugelossestothepigindustry.Inaddition,EMCVcaninfecthumanbeings,althoughtheincidenceislow.However,itbringsgreatriskstopublichealthandsafety.Inpreviousstudies,EMCVisoftenusedasamodelvirustostudydiabetes,mellitusviralmyocarditis,tolllikereceptorsandintracellularreceptors.Emcvgenomeencodes13viralproteins,ofwhich3Aproteinisabout9.9KDaand3Bproteinisabout2.3KDa.EMCV3Aand3BproteinplaysimportantrolesduringEMCVreplication.Intheprocessofvirusreplication,3Aproteinislocatedontheendoplasmicreticulum,combineswithandrecruitesphosphatidylinositol4-kinaseⅢα(PI4KⅢα)tocatalyzetheformationofamicroenvironmentrichinphosphatidylinositol4phosphate(PI4P)lipidswhichisviralreplicationorganelles,whichhelpsviralgenomereplicationbypromotingoxysterol-bindingprotein(OSBP)totransportcholesteroltoviralreplicationorganelles.EMCV3BproteiniscovalentlylinkedtogenomicRNA.AtthestartofviralRNAreplication,3Bproteinactsasaprimerprotein.OnlythegenomeRNAoftheoffspringlinkedto3BproteincanbepackedintothecapsidduringEMCVassembly.Duringvirusreplication,hostproteinsoftenregulateviralreplicationbyinteractingwithviralproteins.However,therearefewreportsontheinteractionnetworkbetween3ABproteinandhostproteins.Inordertofurtherstudythefunctionof3ABprotein,themousepolyclonalantibodyagainst3ABproteinwasprepared.AndthetiterofthemousepolyclonalwasdetectedbyELISAmethod.Westernblottingandindirectimmunofluorescence(IFA)wereusedtoanalyzethespecificeffectofrecognitionEMCV3ABprotein.TheresultsshowedthatthepolyclonalantibodyofagainstEMCV3ABhadsignificanthighertiter.Thetitersofthefiveantibodieswere1:256000,1:256000,1:256000,1:128000,1:256000respectively.Allofthemcouldspecificallyidentifytheoverexpressed3ABproteinandthe3ABproteinencodedbyEMCVinBHK-21cells.Yeasttwo-hybrid(Y2H)systemisbasedonthecharacteristicsofeukaryotictranscriptionfactor.TheY2Hsystemcanbeusedtoscreenthebindingpartnersoftheknownproteinandidentifytheinteractionbetweenprotein-proteininasimple,fastandhigh-throughputway.TofurtherstudythefunctionofEMCV3ABprotein,EMCV3ABwasusedas“bait”andY2HsystemwasusedtoscreenbindingproteinsofEMCV3ABinthisstudy.SixhostproteinsinteractingwithEMCV3ABproteinwereidentified,includingRFC5,RPS20,RPL11,LRWD1,PIH1D1andLGALS1.TheresultswereverifiedbyY2Hretest.Wefoundthat3ABproteininteractedwithRFC5,RPS20,III RPL11,LRWD1andLGALS1butnotPIH1D1.Then,thetotalRNAwereextractedofmouseperitonealmacrophagesandRT-PCRwasperformedtoamplifythecDNAsofRFC5,RPS20,RPL11,LRWD1,PIH1D1andLGALS1genes.ThesegeneswerefurtherclonedintopCAGGS-Flag(pFlag)vector.TheinteractionsbetweenEMCV3ABproteinandhostproteinswereverifiedbyco-immunoprecipitation.TheresultsshowedthatRFC5,RPS20,RPL11,LRWD1,PIH1D1interactedwith3ABprotein.However,theinteractionbetweenLGALS1and3ABproteinwasnotdetectable.RFC5,RPS20,RPL11,LRWD1andPIH1D1arecolocatedwith3ABprotein.Finally,weinvestigatedtheeffectofRFC5,RPS20,RPL11,LRWD1andPIH1D1onthereplicationofEMCV.BHK-21cellstransfectedwithplasmidsexpressingRFC5,RPS20,RPL11,LRWD1andPIH1D1wereinfectedwithEMCVfor12hor24handgenomiccopiesandtiterofEMCVweredetectedbyqPCRandTCID50.TheresultsshowedthatoverexpressedRFC5,RPS20,RPL11,LRWD1andPIH1D1neitheraffectedthegenomiccopynorthetiterofEMCV.IthasbeenreportedthatRFC5,PIH1D1,RPS20,LGALS1andRPL11areinvolvedinapoptosisandtumorigenesis.Ofnote,EMCVcaninduceapoptosisandnecrosisofacinarcellsintissues,suggestingthattheinteractionbetweentheseproteinsandEMCV3ABproteinsmaybeinvolvedinothercellularprocesses.Inconclusion,thepolyclonalantibodyofEMCV3ABproteinwassuccessfullyprepared,whichprovidedatooltofurtherstudythefunctionof3ABprotein.AndsixproteinsinteractingwithEMCV3ABproteinwerescreenedandidentified,whichlaysafoundationforfurtherresearchontheinteractionnetworkbetweenEMCV3ABproteinandthesehostproteins.Keywords:Encephalomyocarditisvirus,3ABprotein,polyclonalantibody,yeasttwo-hybridsystem,Virus-hostinteractionIV 目录第1章绪论.............................................................................................11.1猪脑心肌炎病毒................................................................................................11.23AB蛋白的研究概况.........................................................................................41.3RFC5的生物学特性及其功能...........................................................................61.4LRWD1的生物学特性及其功能.......................................................................71.5RPS20的生物学特性及其功能.........................................................................71.6RPL11的生物学特性及其功能.........................................................................81.7LGALS1的生物学特性及其功能.....................................................................91.8PIH1D1的生物学特性及其功能.......................................................................91.9酵母双杂交系统研究进展..............................................................................101.10研究的目的和意义.........................................................................................11第2章EMCV3AB蛋白多克隆抗体的制备......................................122.1材料..................................................................................................................122.2实验方法..........................................................................................................132.3实验结果..........................................................................................................172.4讨论..................................................................................................................20第3章与3AB蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选和鉴定.................223.1材料..................................................................................................................223.2实验方法..........................................................................................................233.3实验结果..........................................................................................................303.4讨论..................................................................................................................40第4章结论...........................................................................................43致谢.........................................................................................................44参考文献...............................................................................................46个人简介...............................................................................................52V 英文缩略词英文缩写英文全称中文名称EMCVEncephalomyocarditisvirus脑心肌炎病毒PMSFPhenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟化物PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应ReverseTranscribedPolymeraseChain反转录-聚合酶链式反RT-PCRReaction应bpBasePair碱基对E.coliEscherichiacoli大肠杆菌LBLuia-Bertani/lysogenyBrothMedium溶菌酶肉汤培养基SDSyntheticDropoutMedium酵母基础培养基aaaminoacid氨基酸IPTGisopropylthiogalactoside异丙基硫代半乳糖苷DMSODimethylSulphoxide二甲基亚砜PI4KⅢαphosphatidylinositol4-kinaseIIIα磷脂酰肌醇4-激酶ⅢαPI4Pphosphatidylinositol4phosphate磷脂酰肌醇4磷酸盐OSBPoxysterol-bindingprotein氧甾酮结合蛋白ROsreplicationorganelles复制细胞器RFC5ReplicationfactorCsubunit5复制因子C亚基5RPS2040SribosomalproteinS20核糖体蛋白S20RPL1160SribosomalproteinL11核糖体蛋白L11富含亮氨酸重复序列和Leucine-richrepeatandWDrepeat-containingLRWD1色氨酸-天冬氨酸重复protein1序列的蛋白质1PIH1D1PIH1domain-containingprotein1含PIH1域的蛋白质1LGALS1Galectin-1半乳凝集素-1IFAindirectimmunofluorescenceanalysis间接免疫荧光分析ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验IRESinternalribosomeentrysite核糖体结合位点VI 第1章绪论1.1猪脑心肌炎病毒猪脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditisvirus，EMCV）是单股正链无囊膜的小RNA病毒，属于心病毒属，病毒粒子直径约为30nm，其基因组编码一个多聚蛋白（L-1ABCD-2ABC-3ABCD），最终加工成13个成熟的病毒蛋白，即前导蛋白L、衣壳蛋白1A（VP4）、1B（VP2）、1C（VP3）和1D（VP1），非结构蛋白2A、2B、2C、2B*、3A、3B（也称为VPg）、3C蛋白酶和RNA聚合酶3D。该病毒感染动物可以引起以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为特征的多种疾病，还能引起哺乳动物的繁殖障碍和糖尿病，是一种重要的人畜共患病病原，其宿主范围广泛，啮齿动物被认为是EMCV的自然宿主。EMCV经常被作为糖尿病和病毒性心肌炎的模式病毒而被广泛应用于Toll样受体和天然免疫信号通路的研究中[1]。1.1.1EMCV分子生物学特征EMCV基因组长约7.8kb，中间是一个独特的编码区（L蛋白、P1区、P2区、P3区），两端是两个非编码区（untranslatedregions，UTR），即5'UTR与3'UTR。5'UTR长约800-1200个核苷酸，可以与一个含有20个氨基酸的VPg蛋白（也称为3B蛋白）以共价键相结合。5'UTR下游有一个大约150个核苷酸的poly（C）区域，该区域与病毒的毒力相关，是EMCV和口疮病毒所特有的，poly（C）区域的下游是核糖体结合位点（IRES）。3'UTR长约120个核苷酸，由一个短漏斗循环结构组成，下游是长度约20-70nt的poly（A）尾（图1-1）[1,2]。EMCV的基因组是正链RNA，具有mRNA的功能，可直接翻译成多聚蛋白，且不依赖病毒蛋白的参与，因此，将病毒RNA转染到细胞中同样能产生完整的病毒粒子。图1-1脑心肌炎病毒基因组结构[1]Fig1-1ThegenomicorganizationofEMCVEMCV有一个Ⅱ型IRES，大约450个核苷酸，是一个高度有序的发夹环结构，能识别起始密码子AUG上游富含嘧啶的序列[3]。IRES与核糖体结合，起始了开放阅读框（openreadingframe，ORF）的翻译。EMCV的开放阅读框编码含2,292个1 氨基酸的多聚蛋白。有研究发现，核糖体移码导致了2B*蛋白的产生[4]，这表明EMCV基因组至少有两个ORF。EMCV先翻译出多聚蛋白，再由蛋白酶将其分解成L蛋白和前体蛋白。前体蛋白包括P1、P2、P3，前体蛋白再次被切割成12个成熟的蛋白，其中P1被切割成VP4（1A）、VP2（1B）、VP3（1C）和VP1（1D）；P2被切割成2A、2B、2C，以及核糖体移码产生的2B*；P3被切割成3A、3B、3C、3D[2]。L蛋白由67个aa组成，含有一个非典型的锌指结构域和一个酸性结构域。L蛋白被称为“病毒安全蛋白”，能对抗宿主的防御，促进病毒在宿主体内的传播。有研究报道，L蛋白能抑制I型干扰素、细胞因子和趋化因子基因的转录，从而破坏细胞核与细胞质之间的运输通路和抑制感染所导致的应激颗粒聚集，还能抑制细胞凋亡[5-15]。P1区的VP4、VP2、VP3和VP1蛋白是病毒的结构蛋白，共同组成病毒衣壳，其大小分别为70个aa、256个aa、231个aa和277个aa，并包含病毒的主要抗原结构域。VP1是病毒粒子最表面的蛋白，其抗原性最强，被认为是最可能存在中和性抗原表位的蛋白，而且该蛋白与病毒受体相互作用，参与病毒吸附过程。此外，在病毒感染细胞后，VP1还与LC3共定位，参与细胞自噬[16]。VP2与VP1在病毒衣壳上形成“凹陷”结构，该结构被认为是最有可能的病毒受体结合位点。VP3可能参与新生病毒RNA的组装。VP4位于病毒衣壳的内表面，与VP2一起形成VP0，在病毒成熟的过程中被切割成VP2与VP4。另外，VP4可能参与病毒感染细胞的早期阶段[1]。P2区的2A、2B、2B*和2C是病毒的非结构蛋白，其大小分别为143个aa、151个aa、129个aa和325个aa。2A蛋白是EMCV的“毒力蛋白”，能抑制Caspase-3的活化，从而阻碍了细胞凋亡的发生，进而促进病毒粒子大量快速的产生和释放，引起更严重的组织损伤和更强的免疫反应[17]。此外，2A还能与核糖体40S亚基和eIF4E相互作用，并使4E-BP1去磷酸化，抑制eIF4E的功能，从而抑制宿主细胞内依赖帽子结构的翻译过程，进而抑制了宿主细胞分子信号的合成，干扰了细胞的正常功能，有利于病毒蛋白的产生[6,18-22]。2B蛋白至少存在一个疏水区，与脊髓灰质炎病毒不同，EMCV的2B蛋白能降低内质网中的Ca2+含量，但不会降低高尔基体中的Ca2+含量，也不会阻断内质网到高尔基体的蛋白运输通路。2B蛋白与2C蛋白共同作用能诱导膜的重新排列，增加膜的渗透性，并且促进囊泡的形成[23,24]。另外，EMCV2B蛋白还能激活NLRP3炎症反应[25]。2B*是由于核糖体移码而形成的非结构蛋白，目前的研究还不能明确其功能[4]。2C蛋白具有ATP酶活性，参与病毒RNA的复制过程和衣壳化[26,27]。P3区的3A、3B（VPg）、3C和3D蛋白是EMCV的非结构蛋白，分别由88个aa、20个aa、205个aa和460个aa组成。3A蛋白是跨膜蛋白，与LC3定位在2 细胞质膜复合物上，但不会抑制蛋白的分泌通路[16,28,29]。有研究表明，3A蛋白能够与内质网上的磷脂酰肌醇4激酶Ⅲα（phosphatidylinositol4-kinaseIIIα，PI4KⅢα）相互作用，形成富含磷脂酰肌醇4磷酸盐（phosphatidylinositol4-phosphate，PI4P）脂质的膜结构，即病毒复制细胞器（replicationorganelles，ROs），进而招募氧甾酮结合蛋白（oxysterol-bindingprotein，OSBP）将胆固醇运输到复制细胞器上，促进EMCV的复制[30]。3B蛋白富含亲水性氨基酸，在病毒粒子中，与病毒RNA的5’末端共价相连，病毒RNA进入细胞起始翻译时，3B蛋白在细胞内酶的作用下从病毒RNA上脱离。在病毒RNA复制时，3B蛋白参与病毒正链和负链RNA合成的启动过程，因此又称为“引物蛋白”。另外，3B蛋白也参与病毒粒子的装配，且病毒RNA只有与3B蛋白结合后，才能够被装入病毒衣壳[1]。3C蛋白具有蛋白酶活性，能催化病毒多聚蛋白的切割，从而形成成熟的病毒蛋白。此外，3C还能切割RIG-I和TANK[31-33]。3D蛋白是病毒的RNA聚合酶，参与病毒RNA的复制过程[34]。1.1.2流行病学1945年，在弗罗里达州从长臂猿中分离出EMCV。随后，1958年，在巴拿马发生了一场流行病后，从猪体内分离出该病毒。猪感染EMCV会发生急性病毒性疾病，一般哺乳仔猪易感染EMCV，且易传染给同圈的仔猪。仔猪感染EMCV后会出现发热、精神萎靡、猝死和一些神经症状等。母猪感染EMCV后，通常会引起怀孕母猪流产、早产，发生产死胎、弱仔、木乃伊胎等繁殖障碍。EMCV能持续感染非人类灵长类动物的心肌、中枢神经系统和脾脏等，并引发急性疾病。体外试验发现，EMCV能够感染人心肌细胞[35]。迄今为止，已在欧洲、加拿大、南美洲、澳大利亚、中国等地区，从许多野生动物和家畜体内检测到EMCV。据不完全统计，已从包括田鼠、松鼠、大象、猪、野猪、浣熊、羚羊、狮子、鸟类和几种非人类灵长类动物体内分离到EMCV，也有人感染EMCV的报道[36,37]。这些研究表明，EMCV可感染的宿主种类多且分布广泛。包括小鼠和大鼠在内的啮齿动物被认为是EMCV的自然宿主。事实表明，EMCV能够感染大鼠，通常无临床症状表现，但感染后可以在大鼠体内复制，并在感染后29天检测到EMCV的排出[38]。在感染EMCV的猪场附近有被感染的啮齿动物出现，且EMCV在猪与猪之间的横向传播能力有限，这表明包括鼠在内的啮齿动物在该病毒传播中起着重要作用[39]。另外，有研究表明，EMCV能通过胎盘进行垂直传播。EMCV感染是由于摄入受EMCV污染的食物、水或患病的肉质而引起的。EMCV对外界环境具有很强的抵抗力，即使在恶劣的环境中也能维续几天的传染性。EMCV在pH大幅度变化的环境中或者用乙醚处理后也是相当稳定的。经60℃处理30min，或用含氯0.5ppm的氯水，含碘的消毒剂和氯化汞处理后能使该病毒灭活。最近还提出了一种非侵入性、环保型的飞秒激光灭活方法[40]。3 EMCV是一种潜在的人畜共患病。有研究明确指出人类细胞对EMCV敏感。在早先的一项研究中，在菲律宾马尼拉的17名士兵体内发现了抗EMCV的中和抗体。对健康人进行的血清学研究显示，接触动物的职业人群中EMCV血清学阳性率为5%，其中猎人达到了15%[41,42]。有报道称从秘鲁的两位出现发热、恶心头痛及呼吸困难等症状的患者体内分离出了EMCV病毒，且除EMCV外没有发现其他病毒[43]。这表明EMCV能感染人类并导致疾病。在秘鲁，大约1%的发热疾病是由EMCV引起的。调查发现，6%到17%的秘鲁城镇居民EMCV血清学检测呈阳性，可见人类感染EMCV相当普遍[44]。1.1.3EMCV诊断与检测方法随着分子生物学的快速发展，EMCV的临床诊断以实验室检测为主。EMCV的检测主要是病原检测，其中有病毒分离法、间接免疫荧光法、免疫组化试验、核酸原位杂交技术、荧光定量PCR和琼脂免疫扩散试验等。早期检测EMCV主要是采用病毒分离鉴定的方法[45]，从病料中分离出病毒，再接种在易感细胞中，然后通过观察病变情况进行判定[46]。该方法耗时长，难以快速做出诊断。比较常用的方法是间接免疫荧光法，利用EMCV特异性抗体与抗原结合，再孵育荧光素标记的二抗，然后利用荧光显微镜观察。Vlemmas等建立的免疫组化法，可对不同组织中的EMCV进行定性、定位和定量，但该方法操作复杂，要求组织病理切片的质量高，还要求病毒的活性不被破坏[47]。Meng等建立的核酸探针原位杂交技术灵敏度高，但费时费力还存在放射污染。施开创等建立的荧光定量PCR的方法，灵敏度高、操作简便、诊断快速，还能对病毒进行定量[48]。此外，还有一些血清学的方法用于EMCV的检测，例如中和试验、血凝抑制试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）等。中和试验要求有特异性较高的中和性抗体。研究发现，在缺乏EMCV抗体的情况下，取猪的死胎胸腔积水进行血凝抑制试验，可检测到EMCV[45]。因为ELISA具有耗时短、灵敏度高、操作简便、结果准确和要求条件简单等特点，研究者们针对EMCV开发了多种ELISA检测试剂盒。陈兴慧等将重组的结构蛋白VP1作为包被抗原，用来检测EMCV抗体，建立了阻断ELISA检测方法[49]。刘兰亚等将重组的非结构蛋白2C作为包被抗原，用于检测EMCV抗体，建立了间接ELISA方法[50]。樊得英等将重组的VP1蛋白、VP2蛋白和2C蛋白作为包被抗原、EMCV多克隆抗体作为一抗、EMCV标记作酶标抗原，建立了双抗原夹心ELISA方法[51]。1.23AB蛋白的研究概况3AB蛋白会被分割成3A蛋白和3B蛋白。3A蛋白非常小，分子质量约9.9KDa，约含88个aa，其中氨基末端结构域约含58个aa，具有可溶性；羧基端结构域是疏水区，具有将3A蛋白或3AB蛋白锚定在膜囊泡的表面功能。3B蛋白比3A蛋白更小，又被称为VPg，分子质量约2.3KDa，约含20个aa，其二级结构由一个4 长环和一个短的羧基端螺旋结构组成。3A蛋白与3B蛋白二级结构示意图如图1-2所示[52]。研究表明，3A蛋白与3B蛋白在病毒的复制过程中起着至关重要的作用。图1-23A蛋白和3B蛋白的二级结构[52]A：3A蛋白的二级结构；B：3B蛋白的二级结构Fig1-2Secondarystructureof3Aproteinand3BproteinA:Secondarystructureof3Aprotein;B:Secondarystructureof3BproteinRNA病毒通过改造细胞器的膜结构形成病毒复制结构来复制病毒的基因组，而3A蛋白和3AB蛋白在这个过程中起着重要的作用。3A蛋白和3AB蛋白锚定在细胞器膜上发挥功能，3AB蛋白通过3A蛋白的疏水结构域与膜相互作用而锚定在膜上，3B蛋白一旦被切割释放，3A蛋白则以跨膜或非跨膜形式锚定在膜上，其锚定形式如图1-3所示[52]。DorobantuCM等发现EMCV的非结构蛋白3A能够与定位在内质网上的PI4KⅢα相互作用并招募该蛋白，从而在内质网上形成富含PI4P的ROs，ROs上的PI4P招募OSBP运输胆固醇到ROs上，而PI4P和胆固醇是ROs复制病毒所必需的成分[30]。而同为小RNA病毒科的肠道病毒，例如柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒，其3A蛋白则是通过结合高尔基体特异抗布雷菲德菌素A的鸟苷酸交换因子1（Golgi-specificbrefeldinA-resistanceguaninenucleotideexchangefactor1，GBF1）来阻断ADP-核糖基化因子1（ADP-ribosylationfactor1，Arf1）招募外被蛋白Ⅰ（CoatProteinⅠ，COPⅠ），而促进膜双层吸收磷脂酰肌醇4激酶Ⅲβ（phosphatidylinositol-4-kinaseIIIβ，PI4KⅢβ），PI4KⅢβ催化产生PI4P脂质微环境，进而促进3Dpol从细胞液中向膜内吸收，并促进病毒RNA的合成[53]。也因为心病毒与肠道病毒的3A蛋白在形成ROs过程中的作用点不同，也使得这两种病毒的3A蛋白功能有所不同。心病毒的3A蛋白不会机制宿主本身蛋白质的转运，而肠道病毒的3A蛋白则会抑制宿主的蛋白质转运过程。3A蛋白改造细胞器膜和ROs发挥功能均离不开3B蛋白。3A蛋白和3B蛋白在被分割前是3AB蛋白，该蛋白具有破坏双螺旋稳定性的功能，还能激活病毒的RNA依赖5 的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRp）3D蛋白，而两蛋白单独存在时不具备这些功能。另外，RdRp可以将3B作为RNA合成的引物，启动病毒RNA的复制[52]。图1-33AB蛋白和3A蛋白在膜上的锚定形式[52]A：3A蛋白的二级结构；B：3B蛋白的二级结构Fig1-3Modelfor3ABand3AtopologiesonmembranesA:Secondarystructureof3Aprotein;B:Secondarystructureof3Bprotein基于3AB蛋白的以上功能，研究人员在开发抗病毒药物、防控和诊断疾病方面做了许多尝试。BramhadevPattnaik等通过反向遗传方法开发了口蹄疫病毒O型疫苗(疫苗株OINDR2/1975)，该疫苗株分别缺失了非结构蛋白3A蛋白的93aa-143aa和3B蛋白的10aa-37aa，同时还建立了针对3A蛋白和3B蛋白缺失区域的间接ELISA检测方法，该方法可作为辅助鉴别诊断的方法，其诊断敏感性和特异性分别为95.5%和96%[54]。姜平等[55]评估了采用腺病毒介导的小RNA干扰EMCV3AB蛋白对感染EMCV小鼠的保护作用，发现实验组小鼠的病毒产率明显下降90.0%以上，且相对应的病理变化也明显比对照组轻，这些结果表明，腺病毒介导的siRNAs对小鼠EMCV的攻击具有保护作用，为对抗EMCV提供了一种潜在的策略。1.3RFC5的生物学特性及其功能复制因子RFC（replicationfactorC，RFC）又称为激活因子1（activator1），含有5个亚基，分别为RFC1、RFC2、RFC3、RFC4和RFC5。RFC及其五个亚基在真核生物中都具有重要的生物学功能。RFC能结合结构特异性的DNA，优先选择结合附着在模板DNA上的引物，能识别DNA聚合酶ε和δ。RFC通过结合到由聚合酶α合成的引物上，同时增强聚合酶δ（或聚合酶ε）对引物的亲和力，来阻止聚合酶α继续延伸引物。DNA复制起始，RFC以依赖ATP的方式催化分生细胞核抗原（proliferating-cellnuclearantigen，PCNA）围绕引物DNA形成环状结构，而DNA聚合酶δ和ε与蛋白-DNA复合物结合，并且与PCNA相互作用而被限制6 在DNA引物-模板结合部，从而形成DNA-RFC-PCNA-DNA聚合酶δ或ε复合物，该复合物通过单链DNA结合蛋白（single-strandedDNAbindingprotein，SSB）利用脱氧核糖核苷酸有效延伸DNA复制链[56,57]。在这个过程中，RFC1与DNA结合而RFC2与ATP结合，RFC5与PCNA的C末端相结合，协助打开DNA复制夹PCNA[58]。RFC除了具有激活聚合酶进行组装的作用外，其在SV40的复制起点、DNA起始合成时聚合酶α转换成聚合酶δ的过程中，以及DNA链延伸时合成冈崎片段的过程中都起着尤为重要的作用[59-61]。另外，RFC5与Ctfl8相互作用形成Ctfl8-RFC5复合物，该复合物不仅在DNA复制和姐妹染色体配对中起着重要的作用，而且在稳定基因组方面也起着重要作用[62-64]。综上所述，RFC5参与DNA的复制和DNA聚合酶的转换过程，能正调控DNA聚合酶活性，且在DNA修复、细胞周期控制、细胞分裂增殖及抗逆性生长等方面起着重要的作用。1.4LRWD1的生物学特性及其功能LRWD1含有4个连续重复的LRR结构域与多个连续重复的WD40结构域，不同物种WD40结构域的重复个数不一样，其中人类的LRWD1含有7个WD40，鼠的LRWD1含有5个WD40。LRWD1是复合物ORC的成分，能与CDT1、GMNN和ORC2直接相互作用。其中，只有未泛素化的LRWD1能与ORC2相互作用，进而抑制了LRWD1的泛素化和降解。LRWD1与ORC1的相互作用主要发生在有丝分裂的G1期，并不能与磷酸化的ORC1相互作用，而与CDT1的相互作用同样发生在G1期，但能与磷酸化的CDT1相互作用，与GMNN的相互作用发生在有丝分裂的G1/S期，与ORC2的相互作用贯穿于整个细胞周期。另外，LRWD1与CUL4A和DDB1相互作用能导致LRWD1发生泛素化。LRWD1能与H3K9me3，H3K27me3和H4K20me3相互作用，其中LRWD1通过与H3K9me3直接结合而被招募到异染色质周围。从功能上来说，这些相互作用有助于维持异染色质的沉默。进一步的研究表明LRWD1能稳定ORC与染色质的结合，特别是异染色质[65-69]。另外，LRWD1还参与细胞有丝分裂，调控细胞从G1期到S期的转换，与染色质结合参与DNA的复制[65,67]。1.5RPS20的生物学特性及其功能40S核糖体蛋白S20（RPS20）是核糖体小亚基的组成部分，属于核糖体蛋白S10P家族，亚细胞定位于细胞质中，参与蛋白质的合成[70]。在大肠杆菌中，RPS20是30S核糖体小亚基的组分，位于其底部。大肠杆菌的RPS20含有大量α螺旋结构，其与16SrRNA结合形成复合物，该复合物防止了RPS20被酶解。大肠杆菌细胞内的RPS20与RPL34具有抑制鸟氨酸脱羧酶和精氨酸脱羧酶活性，能降低多胺的生成。另外，大肠杆菌中的RPS20基因能改变自身的转录效率，进而影响自7 身mRNA的表达水平，以此来实现对自身合成的转录后调节。在真核生物中，果蝇的RPS20基因是单一拷贝基因，位于92F-93A染色体上，广泛表达于果蝇的胚胎中，在果蝇中肠表达水平也较高[71]。在大西洋鲑鱼的不同组织之间，RPS20的转录水平差异较小，说明RPS20基因具有较高的稳定性，因此，被作为内参应用于相关研究中。在1993年，人类的RPS20的cDNA序列被克隆出来，该基因位于人类染色体的8q11.2-q13位点上。人类的RPS20的cDNA序列含有505个核苷酸，其中5’末端非编码区含113个核苷酸，3’末端非编码区含32个核苷酸，中间的开放阅读框含360个核苷酸[72]。有研究报道RPS20与一些疾病的发生有关。例如，突变RPS19与RPS20会引发p53介导的小鼠黑皮病。诱导人白血病细胞株CEMC7发生细胞凋亡时，发现在细胞出现凋亡形态变化时，RPS20mRNA水平发生了下降，这说明在细胞凋亡的早期阶段有RPS20的参与。系统性红斑狼疮患者的血清中的RPS20含量比正常机体少20%，这提示在自身免疫性疾病患者机体中，RPS20可能会被当作抗原[73]。另外，感染柯萨奇B3型病毒（CVB3）引发心肌炎的组织中RPS20的mRNA表达水平下降，提示RPS20可能参与病毒性心肌炎的发生。1.6RPL11的生物学特性及其功能核糖体蛋白L11（ribosomalproteinL11，RPL11）是核糖体大亚基的重要组分，高度保守，负责细胞中蛋白的合成。RPL11在细胞质中合成后，经核孔运输到细胞核仁中，与RPL5、5srRNA组装成核糖体组装中间体核糖体核蛋白粒子（5SRNP），进而再组装成核糖体，因此细胞核仁是RPL11的富集区，故RPL11主要定位于核仁[74]。研究发现，RPL11与MDM2共定位在核仁上，存在直接相互作用。当核糖体合成受阻时，过量的RPL11与MDM2结合，抑制MDM2自身的E3泛素连接酶活性，稳定p53并激活p53，进而激活依赖p53的细胞周期阻滞[75]。以上功能在5SrRNA的介导下，RPL11与RPL5发生协同作用形成5SRNP后能得到加强。有研究表明，RPL11也具有稳定MDM2功能。RPL11能促进MDM2泛素化，并能阻止26S蛋白酶体对泛素化的MDM2进行降解，进而稳定了MDM2[74]。另外，过量的表达c-Myc会导致核糖体合成发生异常，从而引起细胞生长异常与肿瘤的发生，因此对c-Myc的表达量及其活性的控制尤为重要。有研究表明，RPL11参与对c-Myc的调控过程。RPL11能被c-Myc诱导转录，而过量表达的RPL11与MycboxⅡ（MBⅡ）相互作用，阻碍c-Myc与其激活剂转化/转录相关蛋白（transformation/transcriptiondomain-associatedprotein，TRRAP）结合，从而降低了c-Myc基因启动子处组蛋白H4的乙酰化水平，进而抑制c-Myc的转录，相反，敲低细胞中的RPL11表达量能增强c-Myc的转录活性[76,77]。8 1.7LGALS1的生物学特性及其功能半乳糖凝集素-1（LGALS1）是半乳凝集素家族中的一员，又称为Galectin1，由两个碳水化合物识别结构域（CRD）组成，能识别β-半乳糖苷，在调节细胞凋亡、细胞增殖和细胞分化中起着重要作用，还能通过抑制CD45蛋白磷酸酶活性，来抑制Lyn激酶的去磷酸化。此外，LGALS1还能诱导T细胞发生强烈的细胞凋亡[78-80]。研究发现，肌肉中的LGALS1的表达量与肌纤维的形成呈正相关，这表明LGALS1可能在肌肉的发育过程中发挥作用。研究发现，LGALS1与肿瘤密切相关。在肿瘤细胞中，降低LGALS1的表达能抑制恶性肿瘤的发展。在临床上，甲状腺上皮性恶性肿瘤和子宫内膜癌中LGALS1的表达量显著增加。在膀胱癌中，LGALS1mRNA表达的增加与组织学分级和临床分期呈正相关。在小鼠黑色素瘤模型中，LGALS1具有很强的免疫调节作用，靶向性抑制LGALS1与增强T细胞介导的肿瘤清除率有关，这表明LGALS1对T细胞有较强的免疫抑制作用。在临床研究中，有报道称白血病患者的癌细胞中，LGALS1水平升高，LGALS1的增加促进了Treg细胞的Th2反应或增殖，抑制了其他类型的T细胞增殖，而在实体肿瘤中，LGALS1的表达与头颈部鳞状细胞癌组织中CD3T细胞的数量呈负相关[81-85]。以往的研究表明，化疗药物阿霉素和伊马替尼能促进慢性粒细胞白血病细胞中LGALS1的表达。LGALS1通过诱导MDR蛋白1的表达而产生耐药性，而MDR蛋白1的表达又有助于肿瘤细胞排出细胞毒性药物[86,87]。1.8PIH1D1的生物学特性及其功能在酿酒酵母中，PIH1D1又称为Pih1，Pih1的C末端与Tah1的C末端结合，N端与Rvb1/2结合，同时还能与Hsp90相结合，而Tah1的两个TRR结构域与Hsp90的MEEVD结构域结合，目前无证据表明Tah1能与Rvb1/2结合[88]，另外，酵母的Pih1不稳定，在体内易被定向降解，在体外易聚集，而Pih1与Hsp90和Tah1结合后能够稳定存在。与酵母R2TP-Hsp90复合物不同的是，人类的R2TP-Hsp90复合物中，RPAP3分子远远大于酵母的Tah1，且RPAP3能与Hsp90和PIH1D1相结合，并能与RuvBL1直接结合，与RuvBL2间接结合。RuvBL2能增加PIH1D1与RuvBL1的相互作用，促进PIH1D1-RuvBL1/RuvBL2复合物的形成。然而，ATP会抑制PIH1D1-RuvBL1和PIH1D1-RuvBL1/RuvBL2复合物的形成[89]。PIH1D1与snoRNP/核糖体生物发生相关蛋白相互作用，例如Rrp43、Nop58、Nop53、Cwc24等，参与C/Dbox小核仁核糖核蛋白粒子（snoRNP）的装配，且敲除Pih1会导致R2TP复合物解聚，从而降低boxC/DsnoRNAs的生成并导致boxC/DsnoRNA成分异常。PIH1D1还能将SWI/SNF复合物招募到rRNA基因核心启动子上并促进rRNA前体的转录，介导TELO2与R2TP复合物之间的相互作用，9 能正向调控mTORC1复合物的装配及其活性[90,91]。另外，PIH1D1参与合成R2TP-Hsp90复合物，该复合物在真核细胞中非常保守，并参与许多细胞过程，如染色质的重塑，转录，端粒酶复合物的组装，核仁小核糖核蛋白（snoRNP）的生物合成，磷脂酰肌醇-3激酶相关蛋白激酶（PIKK）的信号传导，RNA聚合酶II（RNAPII）的组装，有丝分裂纺锤体的组装与细胞凋亡等[88]。此外，越来越多关于R2TP的研究表明，该复合物与肿瘤发生有关。1.9酵母双杂交系统研究进展目前为止，筛选和分析蛋白之间相互作用的方法有许多种，其中应用比较广泛的有免疫共沉淀联合质谱技术，噬菌体展示技术和酵母双杂交技术等。其中，酵母双杂交技术因为具有高效的筛选能力而得到广泛使用。1.3.1酵母双杂交系统的原理1989年，Fields等提出并建立了酵母双杂交系统，该系统是基于真核生物转录子结构特点建立的。可使用该系统筛选与目的蛋白相互作用的未知蛋白和分析已知蛋白间的相互作用。该系统检测蛋白间的相互作用是在真核细胞内进行，在核酸水平上进行检测，无需纯化蛋白且保证了蛋白的活性，可简便、有效、高通量地筛选与目的蛋白相互作用的蛋白。在真核细胞中，其转录因子一般含有两个不同的结构域：DNA结合结构域（DNA-bindingdomain，BD）和转录激活结构域（transcription-activatingdomain，AD）。BD能特异性识别DNA上的序列，使AD定位与其所调节基因的上游，从而招募其他转录复合体的组分，进而启动基因的转录。在酵母细胞中，其转录因子GAL4同样含有BD和AD。BD可以是识别并结合GAL4效应基因的上游激活序列（Upstreamactivatingsequence，UAS），AD则能与转录复合物的其他成分结合，启动UAS下游基因的转录。BD与AD在结构上是独立分开的，且他们单独作用并不能激活转录反应，只有采用某种方式使BD与AD在空间上充分接近，才具有转录活性并激活UAS下游的启动子，进而启动转录。Fields建立的酵母双杂交系统便是将两个蛋白分别与BD、AD在酵母细胞内进行融合表达，当两个蛋白发生相互作用时，BD与AD便会相互靠近，形成具有活性的GAL4转录因子，进而启动转录，表达启动子调控的报告基因（LacZ、His、Leu、Trp、ADE等），使得酵母能在His、Leu、Trp、ADE等营养缺陷的培养基上生长，并且表达LacZ能使酵母分泌β-半乳糖苷酶，该酶能作用于X-gal，使其呈蓝色，从而阳性菌落呈蓝色，再进行质粒提取和序列分析便能筛选出相互作用的蛋白[92]。1.3.2酵母双杂交系统的改进酵母双杂交技术操作简便、易于筛选、灵敏度高，同样也存在一些缺陷，例如出现假阳性、假阴性结果，另外，使用酵母双杂交系统研究的蛋白必须是定位10 在细胞核内的蛋白，这限制了定位在细胞质中的蛋白的研究[92]。针对以上缺陷，继Fields之后的研究者对酵母双杂交系统进行了改进。1996年Vidal等通过在酵母中插入表达后能抑制酵母生长的报告基因，建立了反向酵母双杂交系统，该系统可用于研究蛋白的功能、结构等，是酵母双杂交系统的补充和延续[93]。1997年Aronheim等为了研究细胞核外蛋白之间的相互作用，建立了一种核外双杂交系统，又称为Sos招募系统，该系统可用于研究膜蛋白间的相互作用[94]。另外，Johnsson等利用分裂泛素的原理建立了分裂-泛素酵母双杂交系统，该系统也能用于筛选膜蛋白间的相互作用，且能避免假阳性的出现[95,96]。受酵母双杂交系统的启发，研究者们又建立了哺乳动物杂交系统，该系统能够用于依赖翻译后修饰的蛋白之间相互作用的检测[97]。1.10研究的目的和意义我国是养猪大国，EMCV感染后能引起母猪发生流产、死胎等繁殖障碍性疾病，感染仔猪引发脑炎、心肌炎等疾病，造成仔猪存活率大大降低，给养猪产业造成了巨大经济损失。目前对EMCV的研究主要集中于该病的诊断、病毒的致病机制、病毒的复制等。例如，DorobantuCM等[30]发现EMCV的3A蛋白在内质网上形成病毒复制细胞器，而3B又是病毒RNA复制的“引物蛋白”[1]，但关于与3AB相互作用的其他宿主蛋白促进或抑制EMCV复制及其分子机制的研究鲜有报道。本研究制备了EMCV3AB多克隆抗体，并采用ELISA、蛋白印记法和间接免疫荧光法进行了检测，结果显示获得的抗体效价高、特异性好，为进一步研究EMCV3AB蛋白的功能奠定了基础。另外，本研究还构建了BHK-21细胞cDNA文库，利用酵母双杂交技术筛选出了BHK-21细胞中与EMCV3AB蛋白相互作用的蛋白，并利用免疫共沉淀试验和激光共聚焦试验验证了这些蛋白的相互作用，为进一步研究宿主蛋白在抵抗EMCV感染过程中发挥的作用奠定了基础，为研究宿主抵抗EMCV感染的分子机制提供理论依据和基础。11 第2章EMCV3AB蛋白多克隆抗体的制备2.1材料2.1.1细胞、载体、质粒及实验动物EMCV-HB10、E.coliDH5α和BL21（DE3）感受态细胞、BHK-21细胞、HEK293T细胞、pET-28a-3AB、pET-28a载体、pCAGGS-HA载体、pCMV-Flag载体、pCAGGS-HA-3AB和pCMV-Flag-3AB均由本实验室保存；6周龄～8周龄BALB/c小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。2.1.2主要试剂质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；尿素、Trisbase、甘油、脱氧胆酸钠、β-巯基乙醇、EDTA、MgCl2、TritonX-100、NaCl、NP-40、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、琼脂糖、胰蛋白胨和酵母浸出物、HRP标记的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）、羊抗鼠IgG-FITC、4',6'-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、IPTG购自Sigma公司；氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）购自Biosharp公司；胎牛血清、无血清培养基OPTI-MEM、DMEM培养基均购自Gibco公司；脂质体转染试剂盒LipofectAMINETM2000购自Invitrogen公司；ECL发光检测试剂盒和蛋白预染Marker购自Thermo公司；小鼠抗Flag单克隆抗体（mAb）、小鼠抗HAmAb购自Abmart公司；NiSepharose6FastFlow蛋白纯化柱购自GEHealtheare公司；溶菌酶购自Amresco公司；无菌PBS缓冲液和EDTA-胰酶购自哈尔滨兽医研究所国科生物公司；蛋白酶抑制剂Cocktail购自Roche公司；蛋白酶抑制剂PMSF购自碧云天公司；鼠抗HismAb由本实验室制备并保存；医用X光片购自日本富士康公司；其它分析纯试剂购自天津市富宇精细化工有限公司。2.1.3主要实验仪器常温高速离心机、微量移液器购自Eppendorf公司；蛋白电泳仪购自Bio-Rad公司；37℃恒温培养箱（QYC200RockingIncubator）购自上海福玛实验设备有限公司；-80℃冰箱、生物安全柜和37℃CO2培养箱均购自ThermoScientific公司；6孔细胞培养板购自Corning公司；冷冻高速离心机购自Beckman公司；JY92-超声波破碎仪购自上海新芝生物技术研究所；EVOSF1型倒置荧光显微镜购自AMG公司；水平摇床购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司；震荡涡旋仪购自IKA公司；4℃冰柜和-20℃冰箱均购自海尔公司；电热恒温水浴锅购自上海精宏仪器设备有限公司。2.1.4培养基、抗生素和缓冲液的配制LB液体培养基：称量5g酵母浸出粉、10g蛋白胨、10gNaCl，用900mL蒸馏水充分溶解后，再定容到1L并混匀，按需要分装后灭菌。12 LB固体培养基：按液体培养基的配方配好后，每升加入15g琼脂粉，再灭菌，待冷却至40℃左右后铺板，或加入卡那霉素（终浓度为0.05mg/mL）或加入氨苄青霉素（终浓度为0.1mg/mL）混匀后铺板，待凝固后，将板封好放4℃冰箱保存。氨苄青霉素(Amp)：称取5g氨苄青霉素粉剂溶于50mL蒸馏水中，充分溶解后用0.22μm滤器过滤，分装成每管1mL，放于-20℃冰箱保存。卡那霉素(Kan)：称取2.5g卡那霉素粉剂溶于100mL蒸馏水中，充分溶解后用0.22μm滤器过滤，分装成每管1mL，放-20℃冰箱保存。细胞裂解液：先配制1mol/LTris-HCl(称取60.57gTrisbase，用400mL蒸馏水溶解，用盐酸调pH至7.4，定容至500mL)，0.5mol/LEDTA(称取29.224gEDTA，用100mL蒸馏水溶解，用NaOH调pH至8.0，定容至200mL)，5mol/LNaCl(称取146.1gNaCl，用400mL蒸馏水溶解，定容至500mL)，2mol/LMgCl2(称取95.21gMgCl2，用400mL蒸馏水溶解，定容至500mL)；然后分别加入50mL1mol/LTris-HCl、2mL0.5mol/LEDTA、30mL5mol/LNaCl、2.5mL2mol/LMgCl2、100mL甘油、l0mLTritonX-100，再加入蒸馏水充分溶解后定容至lL，放于4℃冰箱备用。Inoue转化缓冲液：先配制0.5mol/LPIPES，用5mol/LKOH调pH至6.7，然后称10.88gMnCl2·4H2O，2.2gCaCl2·2H2O，18.65gKCl，再加入10mL0.5mol/LPIPES，最后定容至1L，用0.22μM滤膜过滤，存储于-20℃冰箱。菌体洗涤缓冲液：称量1.5137gTrisbase、0.15gEDTA、1.5gNaCl，用200mL蒸馏水溶解，调PH至8.0后，定容至250mL。菌体裂解缓冲液：称取1.5137gTrisbase、0.15gEDTA、1.5gNaCl，加入5mLNP-40，用200mL蒸馏水溶解，调PH至8.0后，定容至250mL。包涵体蛋白溶解缓冲液：称取120g尿素、0.2gβ-巯基乙醇、3.0274gTrisbase、0.15gEDTA、0.2072g脱氧胆酸钠，加入1.25mLTritionX-100，用200mL蒸馏水溶解，定容至250mL。不同浓度的咪唑洗脱液：用包涵体蛋白溶解缓冲液配制。5×SDS-PAGEloadingbuffer：称取5gSDS、250mgBPB，再加入12.5mL1MTris-HCl（pH为6.8）、25mL甘油，加入蒸馏水溶解后定容至50mL，再分装成1mL/管，使用前每管加入50µLβ-巯基乙醇。10×TBST洗膜液：称取88gNaCl，再加入200mL1MTris-HCl（PH8.0）、800mL去离子水将其充分溶解后加入5mLTween20充分混匀，定容至1L。使用时取100mL母液，加蒸馏水将其稀释至1L即可。2.2实验方法2.2.1感受态细胞的制备13 取一支感受态细胞，在无菌条件下，于无抗生素的平板上划线，37℃培养倒置过夜（12-16h直到长出单菌落）；第二天，挑取单菌落接种到1mLLB液体培养基中，于37℃摇床上230rpm振荡培养4-5h；然后取500μL菌液加入到500mLLB培养基中，37℃230rpm振荡培养至OD600约为0.5-0.6后，在超净台中，将菌液转移至预冷的50mL无菌离心管中，冰浴10min；于4℃离心机中，4500rpm离心10min，弃上清，每管加入30mL预冷无菌的Inoue转化缓冲液，上下颠倒重悬菌体，冰浴20min；于4℃下，4500rpm离心10min，弃上清，每管加入10mL预冷无菌的Inoue转化缓冲液，重悬菌体，每管加入750μLDMSO混匀，冰浴10min后，分装成100μL/管，保存于-80℃。2.2.2质粒的转化取制备好的感受态细胞(BL21)于冰上融化，待感受态细胞融化后加入100-20ngpET-28a-3AB质粒，冰浴30min后，42℃热激90s，再冰浴3min，在无菌环境下，加入500μL无抗生素LB，然后于37℃220rpm条件下振荡培养1h；同时，取含卡那霉素的LB固体培养基平板置于37℃培养箱中预热，待1h后，将培养好的菌3000rpm离心5min，留100μL上清，重悬沉淀，涂布在平板上，于37℃培养箱中，倒置培养过夜（12-16h直到长出单菌落）。2.2.3EMCV3AB蛋白的原核表达从培养过夜的平板中挑取单菌落于5mL含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃摇床上220rpm振荡培养过夜(12h)；第二天，取培养过夜的菌液400μL平均加入两个装有5mL含卡那霉素的LB液体培养基的干净灭菌试管中，于37℃摇床上220rpm振荡培养约3h（OD600约为0.6），往其中一个试管中加入IPTG，终浓度为1mM，做好标记，与未加IPTG的试管一同在16℃摇床上220rpm培养16h；第三天，从两个试管中各取200μL菌液，7000rpm离心3min，弃上清，加入40μL2×SDS-PAGEloadingbuffer，震荡混匀，100℃煮样10min，12000rpm离心2min，置于室温用于后续的SDS-PAGE和蛋白免疫印迹分析。2.2.4SDS-PAGE分析首先根据蛋白大小配置合适浓度的蛋白胶，待样品制备好后，将蛋白胶安装在电泳槽中，注意电极方向，倒入适量的电泳液，然后根据需要加入适量的样品和蛋白Marker；电泳时，起始电压为80V，待样品跑到分离胶时将电压加至120V，直到电泳结束；电泳结束后，将蛋白胶取出放入容器中，倒入适量的考马斯亮蓝染色液，染色1-2h，然后将染色液回收，用清水清洗残留的染色液，再加入适量的考马斯亮蓝脱色液，待脱色液变蓝后再换新的脱色液，更换多次，直到胶上无蛋白的地方变成透明，再利用0dyssey9120双色红外激光成像系统扫描成图并分析SDS-PAGE电泳结果。14 2.2.5蛋白免疫印记分析待电泳结束后，将PVDF膜用甲醇预先浸泡1min，在此期间，取出蛋白胶，收好电泳液，将蛋白胶浸泡于转膜液中；待PVDF膜用甲醇处理好后，将PVDF膜浸泡在转膜液中，将黑色的阴极板置于桌上，然后依次放置海绵、厚滤纸、薄滤纸、蛋白胶、PVDF膜、薄滤纸、厚滤纸、海绵，再夹好白色的阳极板，插入转膜槽中，注意电极方向，然后在冰上恒流转膜：240mA，90min，可根据蛋白胶浓度和目的蛋白大小设定转膜电流和转膜时间；待转膜结束后，用TBST清洗转有目的蛋白的PVDF膜3min，再加入用TBST配制的5%脱脂乳室温封闭2h，2h后用TBST清洗膜三次，每次10min；封闭结束后，用TBST配制的5%脱脂乳以适当比例稀释抗体，将稀释好的抗体在室温孵育PVDF膜2h，再用TBST清洗膜三次，每次10min；一抗孵育结束后，用TBST配制的5%脱脂乳按1:10000稀释HRP标记的二抗，将稀释好的抗体在室温孵育PVDF膜1h，再用TBST清洗膜三次，每次10min；二抗孵育结束后，在暗室摆好显影液和定影液，再将膜放置在透明的曝光夹里，加入显色液，然后在暗室曝光，曝光适当时间后，先将X光片置于显影液中，待显影结束，再将X光片置于定影液中，然后用水清洗片子，晾干后扫描并分析实验结果。2.2.6EMCV3AB蛋白的纯化将经过IPTG诱导培养16h的1L菌液置于4℃离心机中，8000rpm离心15min，弃上清，收集菌体，然后用菌体洗涤缓冲液重悬，再次置于4℃离心机中，8000rpm离心15min，弃上清，收集菌体；将菌体用80mL菌体裂解缓冲液重悬，再加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL和PMSF至终浓度为1mM，在冰上冰浴30min后，置于冰上进行超声破碎20min；将超声破碎过的菌液在4℃离心机中12000rpm离心20min；将上清转移至新的离心管中，加入30mL包涵体蛋白溶解缓冲液于沉淀中，将沉淀溶解后在4℃离心机中12000rpm离心20min，将上清用0.45μM滤膜过滤，即为蛋白液，置于冰上；处理好空柱子，加入1mLNiSepharose填料，加入15个柱体积的双蒸水清洗，加入15个柱体积的包涵体蛋白溶解缓冲液平衡，将平衡好的NiSepharose填料与蛋白液在4℃结合4h；将结合后的NiSepharose填料与蛋白液装入柱子，收集流出液并取40µL样品，用10个柱体积的10mM咪唑、5个柱体积的20mM咪唑、5个柱体积的50mM咪唑、3个柱体积的100mM咪唑、3个柱体积的150mM咪唑、3个柱体积的200mM咪唑、3个柱体积的250mM咪唑、10个柱体积的500mM咪唑依次洗脱，流速为1mL/min，以每管1mL的方式收集流出液，并每管取40µL样品；用15个柱体积的500mM/L咪唑、50个柱体积的双蒸水依次清洗，加满20%的乙醇，封好柱子，存于4℃冰箱中；将纯化好的蛋白样品通过SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白纯度，再利用紫外分光光度法测定蛋白浓度，然后保存于-80℃备用。15 2.2.7免疫BALB/c小鼠将纯化好的His-3AB蛋白与弗氏完全佐剂以体积比1:1的比例混合进行乳化；皮下注射免疫6～8周龄的BALB/c小鼠，每只小鼠注射100μg；随后间隔两周将His-3AB蛋白与弗氏不完全佐剂以体积比1:1混合进行乳化，以相同剂量免疫小鼠，每隔两周免疫一次，连续免疫三次。第三次免疫一周后采血分离血清进行检测。2.2.8EMCV3AB多克隆抗体的检测ELISA检测：将His-3AB蛋白用0.05M碳酸盐缓冲液按一定比例进行稀释，将稀释液加至96孔板中，每孔100µL，放置4℃冰箱内过夜（12h）后，用加入200µL/孔PBST（PBS中加入0.5‰tween-20）洗涤3次，每次洗5min；每孔加入200µL用PBST配制的5%脱脂乳，在37℃恒温箱中封闭2h，然后用PBST洗涤3次，每次洗5min；将获得的小鼠血清用PBST配制的5%脱脂乳按一定比例稀释，每孔加入100µL，同时设立空白对照、阴性对照和阳性对照，然后在37℃恒温箱中孵育2h，再用PBST洗涤3次，每次洗5min；将HRP标记的二抗用PBST配制的5%脱脂乳按一定比例进行稀释，然后每孔加入100µL，在37℃恒温箱中孵育1h，用PBST洗涤3次，每次洗5min；将残留的PBST弃尽后，每孔加入100µLTMB，在室温下避光显色15min；然后每孔加入50µL2MH2SO4终止显色反应，再用酶标仪在OD450读数。蛋白免疫印记法分析：将pCAGGS-HA-3AB质粒、pCMV-Flag-3AB质粒、pCAGGS-HA空载体和pCMV-Flag空载体分别转染至HEK293T细胞，24h后收集细胞，或用EMCV(MOI=0.01)感染BHK-21细胞，并设置未接毒对照，12h后收集细胞，分别加入适量的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂进行裂解，在冰上裂解30min，然后在4℃离心机中12000rpm离心20min，将上清转移至新的EP管中，并加入适量的5×loadingbuffer于转移的上清中，100℃煮样7min，再12000rpm离心1min；随后按照2.2.4所述内容进行电泳，再按照2.2.5所述内容进行蛋白免疫印记法分析。间接免疫荧光分析：在48孔板中加入多聚赖氨酸，每孔300µL，在37℃培养箱中孵育2h，然后用灭菌水洗3次，将板晾干，再将HEK293T细胞或BHK-21细胞传至处理好的48孔板中，待细胞生长到60％左右，将pCAGGS-HA-3AB质粒、pCMV-Flag-3AB质粒转染至HEK293T细胞，24h后处理细胞；另用EMCV(MOI=0.01)感染BHK-21细胞，并设置未接毒对照，12h后处理细胞；待转染24h或接毒12h后，弃去细胞培养液，用PBS清洗3次，每次洗5min，每孔加入300µL含4%多聚甲醛的PBS，室温固定30min；弃去固定液，用清PBS洗3次，每次洗5min；然后加入300µL含0.3%TritonX-100的PBS，室温透膜20min；弃去透膜液，用PBS清洗3次，每次洗5min；然后每孔加300µL含10%FBS的PBS室温封闭30min；弃掉血清，PBS清洗3次，每次洗5min；封闭结束后，将16 获得的多克隆抗体用含10%FBS的PBS按一定的比例稀释，每孔加200μL稀释的抗体，室温作用2h，然后回收一抗，用PBS清洗细胞3次，每次洗5min；再用含10%FBS的PBS按一定的比例稀释荧光二抗，每孔加200μL，室温避光作用1h；回收二抗，用PBS洗3次，每次5min；加入200µLDAPI稀释液(1μg/mL)，室温作用10min；弃DAPI稀释液，用PBS清洗3次，每次洗5min；燃后在荧光显微镜下观察并拍照后分析结果。2.3实验结果2.3.1EMCV3AB蛋白的原核表达及纯化结果将实验室保存的重组质粒pET-28a-3AB转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，在37℃恒温箱中倒置培养16h，直到长出单菌落，再挑取单菌落接种于5mlLB/Kan培养基中，在37℃摇床上培养过夜，然后按1:100的比例将菌液接种到1L的LB/Kan培养基中，培养到OD600≈0.6时用IPTG进行诱导表达，再利用Ni-NTA纯化系统纯化重组的3AB蛋白。重组3AB蛋白诱导表达、纯化结果见图2-1。图2-1重组3AB蛋白的诱导表达及纯化Fig2-1Theprocaryoticexpressionandpurificationof3ABproteinM：蛋白质分子质量标准；1：纯化后的3AB蛋白；2、6：未诱导的细菌（pET-28a-3AB）裂解液；3、7：IPTG诱导的细菌（pET-28a-3AB）裂解液；4：IPTG诱导后的细菌（pET-28a-3AB）上清；5：IPTG诱导后的细菌（pET-28a-3AB）包涵体LaneM:Pre-strainedProteinMarker;Lane1:Purified3ABprotein;Lane2,6:Lysatesfromrecombinantbacteria;Lane3,7:LysatesfromrecombinantbacteriainducedbyIPTG;Lane4:SupernatantfromrecombinantbacteriainducedbyIPTG;Lane5:InclusionbodiesfromrecombinantbacteriainducedbyIPTG17 2.3.2EMCV3AB多克隆抗体的检测结果ELISA检测EMCV3AB多克隆抗体效价：为了检测所获得的EMCV3AB多克隆抗体，将采的血置于37℃恒温箱中，1h后放置于4℃冰箱内，12h后，12000rpm离心10min，取上清进行ELISA检测，检测结果见表2-1。表2-1EMCV3AB多克隆抗体的效价Table2-1ThetiterofpolyclonalantibodyagainstEMCV3AB小鼠编号抗体效价1#1:2560002#1:2560003#1:2560004#1:1280005#1:256000Westernblot分析EMCV3AB多克隆抗体特异性：为了检测所获得的EMCV3AB多克隆抗体的特异性，用LipofectAMINETM2000转染试剂将pCAGGS-HA-3AB质粒、pCMV-Flag-3AB质粒、pCAGGS-HA空载体和pCMV-Flag空载体分别转染至HEK293T细胞，转染24h后收集细胞并用1%TritonX-100细胞裂解液进行裂解。同时用EMCV(MOI=0.01)感染BHK-21细胞，并设置未感染对照，12h后收集细胞，再用细胞裂解液进行裂解，通过蛋白免疫印记法检测，结果如图2-2所示，使用EMCV3AB多克隆抗体能特异性的检测到3AB蛋白。18 图2-2利用蛋白免疫印记方法鉴定抗EMCV3AB多克隆抗体Fig2-2Anti-EMCV3ABpolyclonalantibodieswereidentifiedbyWesternblottinga、g、m：1#号小鼠血清；b、h、n：2#号小鼠血清；c、i、o：3#号小鼠血清；d、j、p：4#号小鼠血清；e、k、q：5#号小鼠血清；f：鼠抗HA抗体作为阳性对照；l：鼠抗Flag抗体作为阳性对照；r：鼠抗EMCVVP1抗体作为阳性对照a,g,m:serumfromthe1#mouse;b,h,n:serumfromthe2#mouse;c,i,o:serumfromthe3#mouse;d,j,p:serumfromthe4#mouse;e,k,q:serumfromthe5#mouse;f:mouseanti-HAmAbaspositivecontrol;l:mouseanti-FlagmAbaspositivecontrol;r:mouseanti-EMCVVP1mAbaspositivecontrol间接免疫荧光分析EMCV3AB多克隆抗体特异性：用多聚赖氨酸包被48孔板，洗完晾干后，再将细胞传至处理好的48孔板中，待细胞生长到60％左右，将pCAGGS-HA-3AB质粒、pCMV-Flag-3AB质粒分别转染至HEK293T细胞，24h后按2.2.5所述的间接免疫荧光分析步骤处理细胞。同时用EMCV（MOI=0.01）感染BHK-21细胞，并设置未接毒对照，12h后按2.2.5所述的间接免疫荧光分析步骤处理细胞，通过倒置荧光显微镜进行观察并拍照分析结果。结果显示，所获得的EMCV3AB多克隆抗体能够识别pCAGGS-HA-3AB质粒、pCMV-Flag-3AB质粒转染的HE293T细胞表达的HA-3AB融合蛋白、Flag-3AB融合蛋白和EMCV感19 染BHK-21细胞表达的3AB蛋白，结果见图2-3。图2-3利用间接免疫荧光方法分析抗EMCV3AB多克隆抗体Fig2-3Anti-EMCV3ABpolyclonalantibodiesweretestedbyIFAa-c：1#号小鼠血清；d-f：2#号小鼠血清；g-i：3#号小鼠血清；j-l：4#号小鼠血清；m-o：5#号小鼠血清；p-r：鼠阴性血清作为阴性对照；s：鼠抗Flag抗体作为阳性对照；t：鼠抗HA抗体作为阳性对照；u：鼠抗EMCVVP1抗体作为阳性对照a-c:serumfromthe1#mouse;d-f:serumfromthe2#mouse;g-i:serumfromthe3#mouse;j-l:serumfromthe4#mouse;m-o:serumfromthe5#mouse;p-r:serumfromthenegativemouseasnegativecontrol;s:mouseanti-FlagmAbaspositivecontrol;t:mouseanti-HAmAbaspositivecontrol;u:mouseanti-EMCVVP1mAbaspositivecontrol.2.4讨论EMCV是一种人畜共患病病原。该病毒感染猪能引起仔猪发生脑炎、心肌炎、猝死等症状，导致仔猪成活率降低，还会引起怀孕母猪流产、产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍性疾病。人类也普遍存在EMCV的感染，并有出现临床症状的报道。该病毒能感染的宿主种类繁多，分布广泛，这导致该病毒易于传播，难以防控，给养猪业和公共卫生安全带来重大隐患[1]。为了能更好地防控该病毒，对EMCV的致病机理、病毒的复制机制、病毒与宿主之间相互作用的研究显得尤为重要。3AB蛋白在小RNA病毒的复制过程中起着重要的作用，其参与病毒复制细胞器的形成，帮助病毒复制。为了更好的研究EMCV3AB蛋白与宿主蛋白之间的相互作用，本研究制备了3AB蛋白的多克隆抗体。多克隆抗体能识别多个抗原表位，可用于临床诊断，也可在科学研究中用于蛋白免疫印记法、Co-IP等。目前国内外建立的该病原检测方法都是针对EMCV全病毒或其结构蛋白，鲜有针对其非结构蛋白建立检测方法的研究。针对与EMCV同属于小RNA病毒的口蹄疫病毒开发的3AB、3ABCELISA检测方法，能有效的检测病毒的感染水平，还能区别自然感染和疫苗免疫。沈芳等[98]制备了EMCV3AB单克隆抗体，尝试开发EMCV3AB20 ELISA检测方法，以期达到区分疫苗免疫和自然感染的目的。本研究采用原核表达系统对EMCV3AB进行表达。大肠杆菌表达系统具有操作程序简单、蛋白产出量高、生产成本低等优势。将实验室保存的pET-28a-3AB重组质粒，转化到BL21感受态细胞中，待长出单菌落后，挑取单菌落摇菌，并用1mMIPTG在16℃条件下诱导表达16h，通过超声破碎细胞，离心之后将沉淀和上清分开，采用SDS-PAGE分析方法进行检测，发现3AB蛋白表达在包涵体中。为了提高蛋白的纯度，增加蛋白的免疫效果，本实验使用购自GE公司的Ni-NTA蛋白纯化系统纯化His-3AB。将纯化好的His-3AB蛋白与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂乳化后免疫小鼠，免疫三次后采血分离血清，采用ELISA、蛋白免疫印记法和IFA等方法进行检测，结果显示获得的EMCV3AB多克隆抗体能够特异性识别EMCV3AB蛋白，且获得的抗体效价高、特异性好，可应用于EMCV3AB蛋白的相关研究中，为以后研究EMCV3AB蛋白的功能奠定了基础。21 第3章与3AB蛋白相互作用的宿主蛋白的筛选和鉴定3.1材料3.1.1细胞、载体、质粒及引物酵母菌株Y2HGold和Y187均购自Clontech公司；pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-Lam、pGBKT7-53、pGADT7-T质粒均由本实验室保存；其他同2.1.1；本实验所使用的引物根据GenBank中登录的小鼠RFC5cDNA序列（NM_028128.1）、PIH1D1cDNA序列（NM_029406.4）、RPS20cDNA序列（NM_026147.6）、RPL11cDNA序列（NM_025919.2）、LRWD1cDNA序列（NM_027891.4）、RPL11cDNA序列（NM_008495.2）设计，引物由博士生物公司合成，F为上游引物，R为下游引物，见表3-1。表3-1实验所用的引物Table3-1Primersusedinthisstudy质粒名称引物名称引物序列（5´-3´）RFC5-EcoRⅠ-FCGGGAATTCATGACGGCGGCCGCGCCTTCGpCAGGS-Flag-RFC5RFC5-KpnⅠ-RCGGGGTACCCTAGGCCTCTGCAACTATCAGPIH1D1-EcoRⅠ-CGGGAATTCATGGCGGACTCGACGTTTTTGpCAGGS-Flag-PIH1D1FPIH1D1-KpnⅠ-RCGGGGTACCTCAAGAAGACGCTGTCAGGAGRPS20-KpnⅠ-FCGGGGTACCATGGCATTTAAAGATACCGGApCAGGS-Flag-RPS20RPS20-XhoⅠ-RCGGCTCGAGTTAGGCATCTGCAATGGTGACRPL11-KpnⅠ-FCGGGGTACCATGGCGCAAGATCAAGGGGAApCAGGS-Flag-RPL11RPL11-XhoⅠ-RCGGCTCGAGTTATTTTCCAGGAAGGATGATLRWD1-EcoRⅠ-CGGGAATTCATGGCTCCTCTCACGCCGCAApCAGGS-Flag-LRWD1FLRWD1-SphⅠ-RCGGGCATGCCTAGCATCTCCTCCAGATGGALGALS1-KpnⅠ-CGGGGTACCATGGCCTGTGGTCTGGTCGCCFpCAGGS-Flag-LGALS1LGALS1-XhoⅠ-CGGCTCGAGTCACTCAAAGGCCACGCACTTR3.1.2主要试剂DNAMarker、PrimeScript™RTMasterMix、PremixExTaq均购自大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）；各种限制性核酸内切酶购自NewEnglandBiolabs（NEB）公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Qiagen公司；琼脂糖购自OXOID公司；22 YeastTransformationKit、SD/-TrpDOSupplement、SD/-LeuDOSupplement、SD/-Trp/-LeuDOSupplement、SD/-Trp/-Leu/-His/-AdeDOSupplement、X-α-gal、AureobasidinA(AbA)均购自Clontech公司；兔抗RFC5多克隆抗体（pAb）、兔抗PIH1D1pAb、兔抗RPS20pAb、兔抗RPL11pAb、兔抗LRWD1pAb均购自武汉三鹰生物技术有限公司；TRIzol购自lifetechnologies公司；Flag-Beads（鼠抗FlagM2）购自Sigma公司；质粒小量提取试剂盒和T4DNA连接酶购自Thermoscientific公司；KOD-Plus-NeoPCR试剂盒购自TOYOBO公司；反转录试剂盒购自Invitrogen公司；其他同2.1.2。3.1.3主要实验仪器Real-timePCR定量仪Mx3005PTM购自美国STRATAGENE公司；PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司；微量核酸定量仪购自NanoDrop公司；核酸电泳仪购自北京六一厂公司；凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司；激光扫描成像系统购自GeneCompanyLimited公司；其他同2.1.3。3.1.4培养基、抗生素和缓冲液的配制YPDA液体培养基：称量10g酵母浸出粉、20g蛋白胨、0.04g腺嘌呤，用950mL蒸馏水充分溶解，定容到1L，按需要分装后于115℃进行蒸汽灭菌。YPDA固体培养基：按液体培养基方法配制成液体培养基后，每1L培养基中加入15g琼脂粉，在115℃温度下进行蒸汽灭菌，待灭菌结束，冷却到55℃左右后，加入卡那霉素（终浓度为50mg/mL）混匀铺板，封口后存储于4℃冰箱中。SD/-Trp/-Leu：称量0.32gSD（-Trp/-Leu）DOSupplement、13.35gMinimalSDAgarBase，加入到500mL蒸馏水中，待充分溶解后，再于121℃中进行蒸汽灭菌。SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade：称取0.3gSD（-Trp/-Leu/-His/-Ade）DOSupplement、13.35gMinimalSDAgarBase，加入到500mL蒸馏水中，待充分溶解后，再于121℃中进行蒸汽灭菌。50×TAE缓冲液：称取242gTrisbase、27.2gNa2EDTA·2H2O，加入到800mL蒸馏水中，再加入57.1mL冰乙酸，待充分溶解混匀后，调pH至8.5，然后定容到1L。3.2实验方法3.2.1酵母感受态细胞的制备用接种环沾取少量冻存的酵母细胞，在YPDA固体培养基上划线，然后在30℃恒温箱中倒置培养至长出单菌落（约3d)；待长出单菌落后，挑取一个单菌落接种于3mLYPDA液体培养基中，在30℃条件下振荡培养8h；然后取5μL上述菌液接种于装有50mLYPDA液体培养基的250mL烧瓶中，在30℃条件下250rpm23 振荡培养2-3h，直到OD600达到0.4-0.6左右，然后收集菌液，在室温以离心力为3000g离心5min，弃去上清，再加入30mL无菌去离子水重悬细胞沉淀，在室温以离心力为3000g离心5min，弃去上清，再加入1.5mL1.l×TE/LiAc溶液重悬细胞，将细胞悬液分装至1.5mL无菌离心管中，高速离心15sec，然后弃去上清，再加入600μL1.1×TE/LiAc溶液重悬细胞，置于冰上备用。3.2.2质粒转化酵母感受态细胞取1μg质粒DNA和0.lmgCarrierDNA加入到50μL酵母感受态细胞中，混匀后加入0.5mL无菌PEG/LiAc，再轻轻混匀后，在30℃恒温箱中孵育30min，每10min混匀1次；再加入20μLDMSO，轻轻颠倒混匀，然后在42℃水浴锅中水浴热激15min，每隔5min混匀1次；热激结束后，再高速离心15s，弃上清，然后加入1mLYPDA液体培养基，在30℃摇床上，250rpm振荡培养1h；1h后再高速离心15s，然后用0.9%的NaCl重悬细胞，再取15μL涂于相应营养缺陷型的SD固体培养基中。3.2.3EMCV3AB蛋白“诱饵”质粒自激活活性检测将EMCV3AB的诱饵质粒和pGADT7空载体共同转化至酵母GOLD菌株，转化产物分别涂于SD/-Trp/-Leu（SD/-2）、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade（SD/-4）、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/Aba（SD/-4/X/A）平皿，30℃培养3-5天，观察菌落的生长情况。3.2.4与EMCV3AB蛋白相互作用宿主蛋白的筛选将pGBKT7-3AB质粒转化酵母菌并涂布于SD/-Trp琼脂培养基平板上，待长出单菌落后，挑取单菌落接种至SD/-Trp液体培养基中，在30℃摇床上以250rpm的转速振荡培养2-3h，直到OD600达到0.4～0.6左右，再加入BHK-21cDNA酵母表达文库进行杂交，杂交完成后取适量菌液涂布于SD/-2、SD/-4和SD/-4/X/A营养缺陷型固体培养基上，然后在30℃恒温箱中培养2d，呈蓝色者为筛选得到的阳性菌落，将阳性菌落进行菌落PCR扩增后测序，并比对核酸序列与氨基酸序列。3.2.5酵母共转化试验从筛选到的酵母阳性克隆中提取质粒，再将提取的质粒分别与pGBKT7-3AB共转化到酵母感受态细胞中，设立阳性对照为pGBKT7-p53和pGADT7-T质粒共转化、阴性对照为pGBKT7-Lam和pGADT7-T质粒共转化、及自激活对照为pGBKT7和捕获的重组质粒共转化，然后涂布于SD/-2、SD/-4和SD/-4/X/A营养缺陷型固体培养基上，在30℃恒温箱中培养2d，观察菌落生长情况，并拍照分析结果。3.2.6提取小鼠腹腔巨噬细胞总RNA24 将1mLTrizol加入到200μL样品中，轻轻颠倒混匀，在室温下静置10min，加入200μL三氯甲烷，震荡混匀后在室温放置10min，并在4℃12000rpm离心15min。将上清转移到一个新的1.5mLEP管中，以1:1体积比加入异丙醇(约600μL)，轻摇混匀，并在-20℃冰箱中静置1h，在4℃离心机中以12000rpm的转速室温离心10min。弃掉上清，用lmL70%乙醇洗沉淀，在4℃8000rpm离心5min。弃掉上清，在室温干燥。待完全干燥以后，加入20μLDEPC水溶解RNA。3.2.7RT-PCR扩增以从小鼠腹腔巨噬细胞中提取的总RNA为模板，加入相应的引物，通过RT-PCR扩增小鼠腹腔巨噬细胞cDNA。步骤如下：取5μg总RNA，1μL50ng/μLrandomhexamers，1μL10mMdNTPmix，加DEPC处理水至总体积为10μL混匀，65℃5min，冰浴2min；加入2μL10×RTbuffer，4μL25mMMgCl2，2μL0.1MDTT，1μLRNaseOUT™(40U/μL)，1μLSuperScript®IIIRT(200U/μL)，混匀，25℃10min，50℃50min，85℃5min，冰浴2min；加入1μLRNaseH(2U/μL)，混匀，37℃20min终止反应。3.2.8PCR扩增目的基因以小鼠腹腔巨噬细胞cDNA为模板，利用特异性引物，通过PCR扩增目的片段，反应条件为：94℃2min；98℃10s，68℃30sec/kb，35个循环；72℃10min。PCR反应体系见表3-2。表3-2PCR扩增目的基因的反应体系Table3-2PCRamplicationsystemoftargetgenes成分体积终浓度ddH2O32μL10×PCRBufferforKOD-Plus-Neo5μL1×2mMdNTPs5μL0.2mM25mMMgSO43μL1.5mM上游引物(10μM)1.5μL0.3μM下游引物(10μM)1.5μL0.3μMcDNA1μL200ng/50μLKOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL1U/50μL总体积50μLPCR扩增结束后通过核酸电泳检测目的基因片段，将称取好的1g琼脂糖溶于1×TAE缓冲液中，到终浓度为1.5﹪，加热溶解，待琼脂糖溶液冷却到50℃左右，加入溴化乙锭（EB）替代物，至终浓度为0.05﹪，混匀后将其注入凝胶板中，待琼脂糖胶凝固后，把胶放入电泳槽中，加入1×TAE缓冲液至缓冲液覆盖过胶表面，25 然后在加样孔中分别加3µLDNAMarker和50µLPCR产物，150V电压电泳20min后，利用紫外检测仪检测结果。3.2.9PCR产物和载体酶切回收将目的基因片段的PCR扩增产物分别用KpnⅠ和XhoⅠ、EcoRⅠ和SphⅠ、EcoRⅠ和KpnⅠ进行双酶切，同时将pCAGGS-Flag载体用这三组酶分别进行双酶切，在37℃水浴锅中水浴酶切2h。然后利用购自Qiagen公司的胶回收试剂盒回收酶切产物，其具体操作步骤参照试剂盒说明进行。酶切反应体系见表3-3所示。表3-3PCR产物及质粒双酶切反应体系Table3-3DoubledigestionsystemofplasmidandPCRproduct成分体积终浓度酶12μL40U/50μL酶22μL40U/50μL10×CutsmartBuffer5μL1×PCR产物/载体6μL3μg/50μLddH2O35μL总体积50μL3.2.10目的片段与载体连接将目的基因的酶切胶回收产物分别与酶切后的pCAGGS-Flag载体连接，10µL反应体系，混匀后，在25℃条件下反应30min，反应体系见表3-4所示。连接完成后，将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞中。表3-4连接体系Table3-4T4DNAligaseconnectionsystem成分体积终浓度T4DNALigase(5U/μL)1μL5U/10μL5×RapidLigationBuffer2μL1×目的基因5μL600ng/10μL载体2μL200ng/10μL总体积10μL3.2.11菌液PCR鉴定阳性克隆从每个平板中各挑6个单菌落接种到1mLLB/Amp液体培养基中，在37℃摇床上以250rpm的转速振荡培养约7h后，进行菌液PCR鉴定阳性克隆，反应条件为：98℃30sec；98℃10sec，58℃30sec，72℃1min/kb，35个循环；72℃26 10min终止反应。反应体系见表3-5。PCR扩增结束后通过核酸电泳检测目的基因片段。表3-5菌液PCR鉴定体系Table3-5PCRamplicationsystemusingbacterialiquid成分体积终浓度PremixTaq10μL0.5U/20μL上游引物(10μM)1μL0.5μM下游引物(10μM)1μL0.5μM菌液1μLddH2O7μL总体积20μL3.2.12双酶切鉴定阳性克隆分别选取3个菌液PCR为阳性的菌株，接种到5mLLB/Amp液体培养基中，在37℃摇床上以250rpm转速振荡培养约12h后，利用质粒小量提取试剂盒提取质粒并测定质粒浓度。将获得的重组质粒用对应的内切酶进行双酶切，反应体系同表3-3所示。然后在37℃水浴锅中水浴酶切2h，再用1.5﹪琼脂糖凝胶进行电泳，最后用凝胶成像仪拍照并分析结果。3.2.13重组质粒的序列测定及序列分析双酶切结束后，选取酶切鉴定正确的重组质粒送往吉林库美生物有限公司进行测序，将测序得到的基因序列同GenBank中发布的标准序列进行序列比对分析。利用以上的方法，成功构建了一下质粒：pGADT7-RFC5、pGADT7-PIH1D1、pGADT7-RPS20、pGADT7-RPL11、pGADT7-LRWD1、pGADT7-LGALS1、pGBKT7-3AB、pCAGGS-Flag-RFC5、pCAGGS-Flag-PIH1D1、pCAGGS-Flag-RPS20、pCAGGS-Flag-RPL11、pCAGGS-Flag-LRWD1、pCAGGS-Flag-LGALS1。这些质粒测序正确。3.2.14免疫共沉淀试验将HEK293T细胞铺到6孔板中，当细胞生长到60%～80%时，参照LipofectAMINETM2000转染试剂说明书将pCAGGS-Flag-RFC5质粒、pCAGGS-Flag-PIH1D1质粒、pCAGGS-Flag-RPS20质粒、pCAGGS-Flag-RPL11质粒、pCAGGS-Flag-LRWD1质粒和pCAGGS-Flag-LGALS1质粒单独转染或与pCAGGS-HA-3AB共转染至HEK293T细胞；转染24h后，将6孔板内的细胞分别转移至2mLEP管中，在4℃离心机中以3000rpm的转速离心5min，弃去上清，再用1mL预冷的PBS重悬细胞，在4℃离心机中以3000rpm的转速离心5min，27 弃去上清，然后每孔加入100μL1%TritonX-100细胞裂解液（使用前加入蛋白酶抑制剂PMSF和cocktail），冰上裂解30min，每裂解10min轻弹管底重悬。裂解结束后，在4℃离心机中以12000rpm的转速离心20min，将上清转移至新的EP管，取出30μL上清加入7.5μL5×SDS-PAGEloadingbuffer，然后在100℃条件下煮10min，再以12000rpm的转速离心2min，随后做SDS-PAGE凝胶电泳，再通过蛋白免疫印记法检测目的蛋白的表达情况；而剩余的70μL上清则用于做免疫共沉淀试验。首先在上清中加入30μLanti-FlagmAb偶联的ProteinAplusGSepharose，并用预冷的1%TritonX-100细胞裂解液补足至400μL左右，将EP管固定到混匀器上于4℃冰箱内匀速旋转过夜(12h)；随后，将免疫沉淀后的样品于4℃离心机中以5000rpm的转速离心2min，弃去上清，再加入1mL1%TritonX-100细胞裂解液洗涤beads，在4℃离心机中以5000rpm的转速离心2min，弃去上清，重复此步骤6次。最后一次洗涤完毕，弃去上清，再加入30μL2×SDS-PAGEloadingbuffer混合，于100℃中煮10min，蛋白免疫印记法检测免疫共沉淀的结果。同时用EMCV（MOI=0.01）感染HEK293T细胞，并设置未接毒对照，12h后收集细胞并用细胞裂解液进行裂解，收集上清，取少量样品处理后作对照，其余样品用于Co-IP试验。Co-IP试验步骤如下：首先在剩余样品内加入ProteinA/GPLUS-Agarose，4℃感作1h后，离心，将上清转入新的EP管。接毒和未接毒的样品各平均分成两份；将鼠阴性血清和鼠抗EMCV3ABpAb分别加入两份未接毒样品中，同样将鼠阴性血清和鼠抗EMCV3AB分别加入两份接毒的样品中，4℃结合过夜（12h）后将ProteinA/GPLUS-Agarose加至上清中，4℃结合4h。以含0.5%TritonX-100的细胞裂解液洗涤6次，最后弃尽上清，加入适量2×Loadingbuffer重悬ProteinA/GPLUS-Agarose，于100℃中煮10min，蛋白免疫印记法检测免疫共沉淀的结果。3.2.15激光共聚焦试验为了研究3AB、RFC5、PIH1D1、RPS20、RPL11、LRWD1、LGALS1在真核细胞内的亚细胞定位，将pCAGGS-Flag-RFC5、pCAGGS-Flag-PIH1D1、pCAGGS-Flag-RPS20、pCAGGS-Flag-RPL11、pCAGGS-Flag-LRWD1质粒单独转染或与pCAGGS-HA-3AB共转染至HeLa细胞，细胞转染24h后，弃去细胞培养液，用PBS清洗3次，每次洗5min；然后加入1mL4%的多聚甲醛（PBS稀释），室温孵育30min，弃去多聚甲醛，再用PBS清洗3次，每次洗5min；然后加入1mL0.3%TritonX-100（PBS稀释），室温孵育20min，弃去0.3%TritonX-100，用PBS清洗3次，每次5洗min；再加入1mL10%的胎牛血清（PBS稀释），在室温孵育30min，弃10%的胎牛血清，然后用PBS清洗3次，每次洗5min；随后加入200μL用含10%的胎牛血清的PBS稀释的鼠抗FlagmAb和兔抗HAmAb28 （1:100），在室温孵育2h，孵育结束后，用PBS清洗3次，每次洗5min；再加入200μLFITC标记的羊抗鼠pAb和TRITC标记的羊抗兔pAb（1:200），室温避光孵育1h，再用PBS洗清3次，每次洗5min；然后滴加含防淬灭剂的DAPI，避光封片，最后用共聚焦激光扫描显微镜扫描拍照并分析结果。3.2.16TCID50的测定将pCAGGS-Flag-RFC5、pCAGGS-Flag-PIH1D1、pCAGGS-Flag-RPS20、pCAGGS-Flag-RPL11和pCAGGS-Flag-LRWD1质粒分别转染至BHK-21细胞，24h后接种EMCV（MOI=0.01），接毒12h和24h后分别收取上清和细胞。将BHK-21传至96孔板中，待细胞长至90%，再将收集的上清用DMEM进行倍比稀释，每个稀释度稀释900μL；然后弃去96孔板中的细胞培养液，将稀释好的上清加入到96孔板中，每孔100μL，每个稀释度加8个孔，在培养箱中感作1h后，将培养基换成含2%胎牛血清的DMEM，之后按时间点观察细胞病变情况并做好记录，待细胞病变不再增加后，用Reed-Muench方法计算TCID50。3.2.17荧光定量PCR根据TrizolRNAextractreagent（TakaraBioInc.，Japan）说明书提取3.2.17收集的细胞样品中的RNA，再用ReverseTranscriptaseM-MLV（TakaraBioInc.，Japan）反转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光定量PCR检测EMCV-3D的Ct值，所用的引物及探针序列见表3-6。荧光定量PCR反应体系如表3-7所示，反应程序参照PremixExTaq™’s（TakaraBioInc.，Japan）说明书。每个样品重复三次，得到EMCV-3D的Ct值后，采用标准曲线法计算样品中EMCV的拷贝数。表3-6荧光定量PCR所用的引物Table3-6PrimerssequenceofrealtimePCR引物序列（5´-3´）EMCVRNAforward5´-TGAGCTTAGACCGATAGA-3´EMCVRNAreverse5´-GATGCAAACTTTCCCAAC-3´EMCVprobe5´-FAM-AGGTTCAAGCCGCCAAGACA-Eclipse-3´表3-7荧光定量PCR反应体系Table3-7ReactionsystemofrealtimePCR成分体积终浓度PremixExTaq10μL上游引物(10μM)0.8μL0.4μM下游引物(10μM)0.8μL0.4μM探针(10μM)0.4μL0.2μM29 ddH2O7μLcDNA1μL50ng/20μL总体积20μL3.3实验结果3.3.1筛选与EMCV3AB相互作用的宿主蛋白在阳性对照和阴性对照均成立的前提下，将pGBKT7-3AB诱饵质粒与pGADT7空载体共转化Y2H酵母菌，转化得到酵母菌只能在SD/-2培养基上生长，不能在SD/-4及SD/-4/X/A培养基上生长，表明3AB蛋白不具备自激活酵母报告基因的活性。将pGBKT7-3AB诱饵质粒转化至酵母感受态细胞中与BHK-21细胞cDNA酵母表达文库进行杂交，再利用SD/-4、SD/-4/X/A培养基进行筛选。抽提阳性克隆的质粒，经PCR扩增后进行序列测定，结果显示有6个与EMCV3AB相互作用的宿主蛋白：RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20和LGALS1（表3-8）。表3-8酵母双杂交筛选到与EMCV3AB蛋白相互作用的宿主蛋白Table3-8EMCV3ABbindingproteinsidentifiedbyY2H蛋白名称蛋白ID同源性全长功能RFC5Q8CFZ998%333参与DNA的复制[63]LRWD1Q8BUI381%648参与细胞有丝分裂[69]RPS20P60867100%119参与细胞中蛋白的合成[99]RPL11Q9CXW4100%178参与细胞中蛋白的合成[99]LGALS1P1604591%135参与调节细胞增殖、分化和凋亡[100,101]PIH1D1Q9CQJ283%290参与核糖体RNA的转录[102]3.3.2真核表达重组质粒的构建PCR扩增结果：取小鼠腹腔巨噬细胞再用Trizol提取细胞总RNA，使用购自Invitrogen公司的反转录试剂盒将其反转录成cDNA。然后以cDNA为模板，通过设计的特异性引物，使用购自TOYOBO公司的KOD-Plus-NeoPCR试剂盒进行PCR扩增RFC5、PIH1D1、RPS20、RPL11、LRWD1、LGALS1基因，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示获得了与预期基因片段大小一致的条带（见图3-1），说明扩增所获得的基因可能是目的基因。30 图3-1RFC5、PIH1D1、RPS20、RPL11、LRWD1、LGALS1基因PCR扩增结果Fig3-1PCRamplificationofRFC5,PIH1D1,RPS20,RPL11,LRWD1andLGALS1菌落PCR鉴定结果：将PCR扩增获得的基因通过双酶切、连接，然后将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞中，待长出单菌落后，从每个平板中各选取5个单菌落进行菌落PCR鉴定，PCR扩增结束后通过核酸电泳检测目的基因片段，结果显示所选取的单菌落均能扩增出与各目的基因大小一致的片段（见图3-2），说明所选取的单菌落为阳性菌。31 图3-2重组质粒菌液PCR鉴定结果Fig3-2RecombinantplasmidswereidentifiedbyPCRA：pCAGGS-Flag-RFC5质粒的菌液PCR鉴定；B：pCAGGS-Flag-LRWD1质粒的菌液PCR鉴定；C：pCAGGS-Flag-RPS20质粒的菌液PCR鉴定；D：pCAGGS-Flag-RPL11质粒的菌液PCR鉴定；E：pCAGGS-Flag-LGALS1质粒的PCR鉴定；F：pCAGGS-Flag-PIH1D1质粒的菌液PCR鉴定A:identificationofpCAGGS-Flag-RFC5;B:identificationofpCAGGS-Flag-LRWD1;C:identificationofpCAGGS-Flag-RPS20;D:identificationofpCAGGS-Flag-RPL11;E:identificationofpCAGGS-Flag-LGALS1;F:identificationofpCAGGS-Flag-PIH1D1双酶切鉴定结果：分别选取3个菌落PCR鉴定为阳性的单菌落，接种到5mLLB/Amp液体培养基中培养，用于提取重组质粒。将获得的重组质粒用对应的内切酶进行双酶切，然后用1.5﹪琼脂糖凝胶进行电泳并拍照分析结果（见图3-3）。由结果可以初步确认所提取的质粒均为阳性重组质粒，再将阳性重组质粒送吉林省库美生物科技有限公司进行测序，测序结果经EBI中的ClustalW2比对，比对结果显示重组质粒中所插入的片段和目的基因序列一致。到此，我们获得了重组质32 粒pCAGGS-Flag-RFC5、pCAGGS-Flag-PIH1D1、pCAGGS-Flag-RPS20、pCAGGS-Flag-RPL11、pCAGGS-Flag-LRWD1和pCAGGS-Flag-LGALS1。图3-3重组质粒双酶切鉴定结果Fig3-3Recombinantplasmidswereidentidfiedbyrestrictionendonucleasedigestion3.3.3蛋白相互作用的验证酵母共转化验证相互作用：将pGADT7-RFC5质粒、pGADT7-RPS20质粒、pGADT7-RPL11质粒、pGADT7-LRWD1质粒和pGADT7-LGALS1质粒分别与pGBKT7-3AB质粒或pGBKT7空载体共转化的Y2H酵母菌在SD/-4和SD/-4/X/A培养基上培养。结果显示RFC5、RPS20、RPL11、LRWD1、LGALS1无自激活活性，只有pGADT7-RFC5、pGADT7-RPS20、pGADT7-RPL11、pGADT7-LRWD1、pGADT7-LGALS1分别与pGBKT7-3AB共转化至酵母菌中，酵母菌才能在SD/-4/X/A培养基上生长，表明3AB和RFC5、RPS20、RPL11、LRWD1、LGALS1在酵母中存在相互作用（见图3-4）。33 图3-4酵母共转化试验验证蛋白间相互作用Fig3-4Identificationoftheinteractionsbetween3ABanditsbindingproteinsbyY2Hretestassay免疫共沉淀验证相互作用：将获得的重组质粒pCAGGS-Flag-RFC5、pCAGGS-Flag-PIH1D1、pCAGGS-Flag-RPS20、pCAGGS-Flag-RPL11、pCAGGS-Flag-LRWD1和pCAGGS-Flag-LGALS1单独转染或与pCAGGS-HA-3AB质粒共转染至HEK293T细胞并进行Co-IP试验。结果显示，EMCV3AB蛋白与RFC5、PIH1D1、RPS20、RPL11、LRWD1蛋白存在特异性相互作用（见图3-5A）。另外，用0.01MOIEMCV感染HEK293T细胞，并设置未接毒对照，12h后收细胞并进行Co-IP试验。结果显示，内源性RFC5、PIH1D1、RPS20、RPL11、LRWD1蛋白与EMCV3AB蛋白存在相互作用（见图3-5B）。34 图3-5免疫共沉淀试验验证蛋白间相互作用Fig3-5Identificationoftheinteractionsbetween3ABanditsbindingproteinsbyCo-IPA：免疫共沉淀试验验证过度表达蛋白间相互作用；B：免疫共沉淀试验验证3AB蛋白与内源性蛋白间相互作用A:Identificationoftheinteractionstheinteractionsbetweenexogenous3ABanditsbindingproteinsbyCo-IP;B:Identificationoftheinteractionstheinteractionsbetween3ABandendogenousproteinsbyCo-IP激光共聚焦验证共定位：将pCAGGS-Flag-RFC5、pCAGGS-Flag-LRWD1、pCAGGS-Flag-RPS20、pCAGGS-Flag-RPL11、pCAGGS-Flag-PIH1D1和35 pCAGGS-Flag-LGALS1质粒单独转染或与pCAGGS-HA-3AB共转染至HeLa细胞，24h后，将细胞用一抗和荧光标记的二抗孵育，再利用激光共聚焦显微镜扫描拍照分析3AB和RFC5、PIH1D1、RPS20、RPL11、LRWD1的定位情况。结果显示，3AB主要定位在细胞的胞质中；RFC5主要定位于细胞核，当3AB和RFC5共表达时，3AB蛋白与RFC5共定位在细胞质中（见图3-6A），表明EMCV3AB可以改变RFC5的亚细胞定位，促进RFC5出细胞核；LRWD1主要定位于细胞核，当3AB和LRWD1共同表达时，部分3AB蛋白可以和LRWD1共定位在细胞核中（见图3-6B），表明LRWD1可以改变EMCV3AB的亚细胞定位，促进3AB进入细胞核；RPS20定位在细胞质和细胞核中，当3AB和RPS20共表达时，3AB蛋白与RPS20共定位在细胞质中（见图3-6C）；RPL11主要定位于细胞核，当3AB和RPL11共表达时，部分3AB蛋白可以和RPL11共定位在细胞核中（见图3-6D），表明RPL11可以改变EMCV3AB的亚细胞定位，促进3AB进入细胞核；PIH1D1定位在细胞质和细胞核中，当3AB和PIH1D1共表达时，3AB蛋白与PIH1D1共定位在细胞质中（见图3-6E）。36 37 图3-6激光共聚焦试验检测3AB蛋白及其相互作用蛋白的亚细胞共定位Fig3-6Subcellularloclizationof3ABanditsbindingproteinsinHeLacellsbyconfocalmicroscopyA：3AB蛋白与RFC5蛋白的共定位；B：3AB蛋白与LRWD1蛋白的共定位；C：3AB蛋白与RPS20蛋白的共定位；D：3AB蛋白与RPL11蛋白的共定位；E：3AB蛋白与PIH1D1蛋白的共定位A:Colocalizationof3ABproteinandRFC5protein;B:Colocalizationof3ABproteinandLRWD1protein;C:Colocalizationof3ABproteinandRPS20protein;D:Colocalizationof3ABproteinandRPL11protein;E:Colocalizationof3ABproteinandPIH1D1protein;3.3.4过表达与EMCV3AB相互作用的宿主蛋白对病毒生长的影响将pCAGGS-Flag空载体、pCAGGS-Flag-RFC5、pCAGGS-Flag-PIH1D1、pCAGGS-Flag-RPS20、pCAGGS-Flag-RPL11和pCAGGS-Flag-LRWD1重组质粒分别转染BHK-21细胞，转染24h后感染MOI为0.01的EMCV，分别在病毒感染12h和24h后收集培养上清和细胞，首先用蛋白免疫印记法检测RFC5、PIH1D1、RPS20、RPL11、LRWD1的表达情况（见图3-7A），然后分别检测上清中的病毒滴度（TCID50）和用荧光定量PCR方法检测细胞中的病毒基因组拷贝数。荧光定量PCR检测病毒mRNA水平结果显示，与对照组相比RFC5、PIH1D1、RPS20、RPL11、LRWD1在细胞内过表达时，病毒拷贝数无明显变化（见图3-7B），表明RFC5、PIH1D1、RPS20、RPL11、LRWD1的过表达不影响病毒蛋白的翻译水平；病毒TCID50的测定结果显示，与对照组相比RFC5、PIH1D1、RPS20、RPL11、LRWD1在细胞内过表达时病毒滴度没有发生明显改变（见图3-7C），表明过表达RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20并不影响EMCV感染12h和24h的病毒复制。38 39 图3-7过表达RFC5、PIH1D1、RPS20、RPL11、LRWD1对EMCV复制的影响Fig3-7TesttheeffectofRFC5,PIH1D1,RPS20,RPL11andLRWD1proteinonEMCVreplicationA：pCAGGS-Flag-RFC5、pCAGGS-Flag-PIH1D1、pCAGGS-Flag-RPS20、pCAGGS-Flag-RPL11、pCAGGS-Flag-LRWD1重组质粒的表达情况；B：EMCV基因组拷贝数；C：EMCV的TCID50A:ExpressionofpCAGGS-Flag-RFC5,pCAGGS-Flag-PIH1D1,pCAGGS-Flag-RPS20,pCAGGS-Flag-RPL11andpCAGGS-Flag-LRWD1recombinantplasmids;B:ThegenomecopynumberofEMCV;C:EMCVgrowthinRFC5,PIH1D1,RPS20,RPL11orLRWD1-overexpressingcells3.4讨论EMCV是一种小RNA病毒。由于EMCV病毒无法利用宿主的RNA聚合酶进行复制，且病毒粒子并不携带与其复制相关的酶类，所以EMCV基因组RNA进入细胞后，首先利用宿主的翻译系统合成病毒编码的的蛋白[103,104]。随后，合成的病毒蛋白在宿主细胞内行使相应的功能，启动EMCV基因组RNA的复制。其中，EMCV3A蛋白在病毒复制细胞器的形成过程中起着重要的作用。与其他正链RNA病毒相似，EMCV也是通过将细胞内的膜改造成独特的结构来形成病毒基因组复制的微环境。越来越多的证据表明，来自不同属的小RNA病毒使用不同的策略来形成ROs。肠道病毒依赖于定位在高尔基体的PI4KⅢβ，例如脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒等，而心病毒属成员的复制则不依赖于该激酶[53]。有研究发现心病毒属成员则是操纵另一种PI4K，即定位在内质网的PI4KⅢα，来形成富含PI4P的ROs。Frank等利用siRNA介导的基因敲除和药物抑制实验，证明PI4KⅢα是EMCV基因组复制的一个重要宿主因子。随后，又证明了OSBP以一种依赖于PI4P的方式将胆固醇输送到EMCVROs，PI4P在招募OSBP方面也起着很重要的作用，而PI4P脂质和胆固醇是形成ROs和病毒基因组复制所40 必需的物质，且抑制OSBP的表达或功能，能有效地阻止EMCVRNA的复制[30]。总之，就EMCV而言，3A蛋白能够定位在内质网上，且与内质网上的PI4KⅢα相互作用，并参与招募PI4KⅢα，形成富含PI4P的膜结构，进而招募OSBP将胆固醇运输到复制细胞器上，促进EMCV的复制。3B也称为VPg，该蛋白富含亲水性氨基酸，在N端有一个酪氨酸残基，与病毒RNA相连并参与病毒的组装。综上所述，3AB蛋白不仅参与EMCVRNA的复制，还参与子代病毒的装配，在EMCV的复制过程中起着重要作用[1]。然而，本研究发现过度表达RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPS20和RPL11均不影响EMCV感染12h和24h的病毒基因组RNA的复制和子代病毒的活性，而且关于RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPS20和RPL11对病毒复制的影响鲜有报道。这表明这些蛋白与EMCV3AB蛋白相互作用可能参与其他生命过程。为了研究EMCV3AB与宿主蛋白相互作用网络，本研究利用酵母双杂交技术筛选到了六个与EMCV3AB相互作用的宿主蛋白，分别为RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPS20、LGALS1和RPL11，其中RFC5与其他RFC分子形成RFC复合物参与DNA的复制和正向调控DNA聚合酶活性，且研究发现，在人类食道癌细胞中RFC的成分异常表达，且将其敲除能抑制细胞的增殖，因此，RFC可能是一种潜在的异常致癌基因[105]；LRWD1参与细胞有丝分裂过程中从G1期到S期的转换过程，与染色质结合参与维持异染色质沉默；PIH1D1是R2TP复合物的组分，参与C/DboxsnoRNP的组装，并且越来越多与R2TP相关的研究表明，该复合物与肿瘤发生有关；RPS20参与形成核糖体，负责蛋白质的合成，而且RPS20与多种疾病的发生有关，例如，突变RPS19与RPS20会引发p53介导的小鼠黑皮病；LGALS1参与调节细胞增殖、分化和凋亡，还能强烈诱导T细胞发生细胞凋亡，且研究发现，在肿瘤细胞中，降低LGALS1的表达能损害恶性肿瘤的发展；RPL11是核糖体大亚基的组分之一，协助核糖体合成生命活动所需的蛋白，同时RPL11在rRNA的介导下与RPL5相互作用形成5SRNP/5S，与MDM2相互作用并抑制其p53的泛素化，从而激活p53促进细胞凋亡。JoaoT.Marques等发现，EMCV感染HT1080细胞后，细胞中的p53蛋白水平降低，并未阐明其机制[106]，3AB与RPL11的相互作用在其中所起的作用还有待验证。本研究所筛选到的蛋白具有多种功能，且多数与细胞凋亡和肿瘤的发生发展有关，并且有研究报道，EMCV的L蛋白和2A蛋白能抑制细胞凋亡[1]，而KunioDoi等[107]发现EMCV能诱导组织中的腺泡细胞发生细胞凋亡，那么3AB与本研究所筛选到的蛋白相互作用在此过程中是否发挥功能，发挥怎样的功能，这还有待进一步探索和验证。本研究利用EMCV3AB蛋白作“诱饵”，采用酵母双杂交系统筛选BHK-21细胞cDNA酵母表达文库，发现RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20和LGALS1能与之相互作用，并通过共转化验证、共定位检测和Co-IP试验证明EMCV3AB41 蛋白与RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20蛋白存在特异性相互作用，提示RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20可能参与3AB的生物学功能，为进一步研究RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20在EMCV感染和复制过程中的作用奠定了基础。42 第4章结论1.本研究制备了特异性的抗EMCV3AB蛋白多克隆抗体。2.发现六个与EMCV3AB蛋白相互作用的宿主蛋白。通过酵母回复试验、免疫共沉淀试验和激光共聚焦试验验证了RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20与EMCV3AB蛋白存在相互作用。3.发现过表达RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20并不影响EMCV感染12h和24h的病毒复制。43 致谢时光飞逝，硕士研究生生活已进入尾声，三年的学习让我掌握了基本的实验技术，开阔了我的科研思维，让我学会了分析问题，并寻找解决问题的方法。很感激在这三年中所认识的人和所遇到的事。首先，感谢我的导师翁长江研究员和杨玉莹教授给了我这次攻读硕士研究生的机会。感谢杨玉莹老师在我硕士一年级期间对我学习的指导和生活的关心，杨老师敬业的工作作风、严谨的科学思维和平易近人的教学态度，始终感染着我。本研究是在翁长江老师的悉心指导下完成的。在本课题研究过程中，翁长江老师用其渊博的学识为我指点迷津，老师还经常鼓励我们要不怕困难，勇于拼搏，我取得的每一点成绩都凝聚着老师的汗水和心血。翁长江老师对科研的热情、敬业的工作态度、独到的思维见解、渊博的学识和严谨的科学作风，深深的影响着我，这些都将成为我未来人生道路上学习的榜样。特别感谢翁长江老师在我生活遇到困难时给予我的帮助和理解。感谢黄丽老师在学习和生活上给予我的关心和帮助。感谢李江南老师，您对实验室的管理使得大家的实验能有序的进行。感谢实验室的孙辉女士和邢岚女士，感谢你们的辛劳与敬业维持了实验室的整洁和保证了试剂耗材的正常供应，为我们的实验开展提供了极大的便利。感谢长江大学的梁雄燕老师对实验室的管理和监督，使得我硕士一年级在长江大学的实验能够有序地进行。感谢长江大学的靳恒老师、石博妹老师和杨湘虹老师，感谢你们不辞辛劳地发送通知，使我身在学校万里之外也能及时得到通知、及时上交材料。感谢Wenglab的张昆丽师姐、李长尧师兄、王胜男师姐、毕彩鸿师兄、邱爽师姐、刘宏扬师弟、邵增玉师妹、康力师弟、王永琦师弟、刘学敏师妹、崔蒙蒙同学、张元峰同学和王晓捷同学，以及在实验室实习的燕苗苗师妹和许文杰师弟，感谢你们在不同阶段给予我的陪伴和关心，让我即使在深夜里做实验也不觉得孤单和害怕，感谢你们在我生病时给予的关心和照顾，让我在病魔缠身时倍感温暖，感谢你们对我的关心、帮助与谅解。感谢张昆丽师姐和张元峰同学教我各种实验技术，感谢你们在我实验失败和生活受挫时给予我的建议与鼓励。感谢长江大学的黄专师兄、李拓凡师兄、蔡宇威师兄、刘兰同学、邓慧芳同学、罗凯同学、周鹏同学、黄俊同学、叶丽珣同学、杨谌同学等，感谢你们在我硕士一年级时给予的陪伴和帮助。感谢刘兰同学、邓慧芳同学、罗凯同学和杨谌同学在我无法回学校时帮我上交各种材料。感谢我的同学兼密友杨搏和尹彩霞，感谢你们这三年的陪伴。感谢哈尔滨兽医研究所实验动物中心和公共仪器室的工作人员，感谢你们的辛劳付出为我的实验提供了便利。最后，感谢我的父母，感谢你们在生活困窘、病魔缠身时依然支持我继续学44 习深造，相信我们的生活会越来越好。再次感谢一路上关心帮助我的人，你们的关心和帮助让我铭记一生，我会继续传递你们的善良和热情，愿你们生活越来越美好。45 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个人简介薛娟，女，汉族，湖南宜章人，生于1992年10月，中共党员。大学生国家英语6级水平。2011年9月至2015年6月，就读于黑龙江八一农垦大学动物科技学院，攻读动物医学专业，于2015年获得农学学士学位。2015年9月至2018年6月，就读于长江大学动物科学学院，攻读养殖专业，师从翁长江研究员和杨玉莹教授，主要从事猪脑心肌炎病毒3AB蛋白与宿主蛋白的相互作用的鉴定，攻读硕士学位。在校期间的获奖情况：2015年11月获长江大学三等学业奖学金；2016年10月获长江大学“优秀研究生”荣誉称号；2016年11月获长江大学一等学业奖学金；2017年11月获长江大学二等学业奖学金。在校期间发表的主要学术论文：薛娟，张昆丽，张元峰，黄丽，杨玉莹，翁长江.2018.猪脑心肌炎病毒3AB蛋白与宿主蛋白RPL11相互作用的鉴定[J].中国预防兽医学报.录用待发.52 附件３：研究生学位论文原创性声明和版权使用授权书原创性声明我以诚信声明：本人呈交的硕士学位论文是在翁长江研究员和杨玉莹教授指“导下开展研究工作所取得的研究成果。文中关于猪脑心肌炎病毒３ＡＢ蛋白与蛋”白ＲＦＣ５、ＬＲＷＤ１、ＰＩＨ１Ｄ１、ＲＰＬ１１和ＲＰＳ２０存在特异性相互作用的结论和关“”于猪脑心肌炎病毒３ＡＢ蛋白多克隆抗体的制备及其相互作用宿主蛋白的鉴定的结果系本人独立研究得出，不包含他人研究成果。所引用他人之思路、方法、、观点认识均已在参考文献中明确标注，所引用他人之数据、图件、资料均已征得所有者同意，并且也有明确标注，对论文的完成提供过帮助的有关人员也已在文中说明并致以谢意。学位论文作者（签字签字日期：年月日版权使用授权书本人呈交的硕士学位论文是本人在长江大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的硕士学位论文。，本论文的研究成果归长江大学所有本人完全了解长江大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权长江大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库，可以采用影印、缩印、数字化在解或密其后它遵复制手段保存论文，学校也可以公布论文的全部或部分内容。（保密论文守本授权书）签学位论文作者（签字字日期：年月日