自主跑轮运动通过抑制NF-κB通路改善阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力

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分类号：R322学校代码：10114密级：学号：041410123硕士学位论文自主跑轮运动通过抑制NF-κB通路改善阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力VoluntaryWheelRunningImproveLearningandMemoryAbilityofAlzheimer’sDiseaseMicebyInhibitingNF-κBPathway研究生：王莉智指导教师：和荣丽副教授专业名称：人体解剖与组织胚胎学研究方向：衰老及衰老相关疾病的机制与防治学位类型：学术学位所在学院：基础医学院中国山西二〇一七年五月二十日 分类号：R322学校代码：10114密级：学号：041410123自主跑轮运动通过抑制NF-κB通路改善阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力VoluntaryWheelRunningImproveLearningandMemoryAbilityofAlzheimer’sDiseaseMicebyInhibitingNF-κBPathway研究生：王莉智指导教师：和荣丽副教授专业名称：人体解剖与组织胚胎学研究方向：衰老及衰老相关疾病的机制与防治学位类型：学术学位所在学院：基础医学院中国山西二〇一七年五月二十日 ，学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师和荣丽指导下，本人独立完成的研究成果。文中任何引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果：１、交回学校授予的学位证书；２、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报；３、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道歉．；４、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。＂论文作者签名：日期ｉ：ｗ年ｃ月＞日）学位论文版权使用授权书本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山西医科大学。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名：立茶｜略日期：別丨１年亏月鉍円＂ｌ指导教师签名：日期：Ｃ＾年夕月日］（本声明的版权归山西医科大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用） 目录中文摘要.................................................................................................................................I英文摘要..............................................................................................................................III前言................................................................................................................................11材料与方法........................................................................................................................31.1实验主要试剂..............................................................................................................31.2主要仪器设备..............................................................................................................41.3实验动物与分组..........................................................................................................41.4制作AD模型..............................................................................................................41.5建立自主跑轮运动模型..............................................................................................51.6Morris水迷宫实验......................................................................................................51.7免疫荧光染色实验......................................................................................................61.8免疫印迹......................................................................................................................71.9统计学分析..................................................................................................................92结果................................................................................................................................102.1自主跑轮运动改善了AD模型小鼠的学习记忆能力............................................102.2NF-κB、TNF-α、IL-10免疫荧光染色结果............................................................112.3WesternBlot结果......................................................................................................153讨论................................................................................................................................183.1阿尔茨海默病与脑内炎症表达水平密切相关........................................................183.2自主跑轮运动改善AD模型小鼠的学习记忆能力................................................183.3自主跑轮运动对海马CA1区和CA3区炎症表达的影响.....................................193.4NF-κB通路的抑制是自主跑轮运动改善AD小鼠学习记忆能力的关键因素....204结论................................................................................................................................21参考文献..............................................................................................................................22综述..............................................................................................................................22致谢..............................................................................................................................33个人简历..............................................................................................................................38 山西医科大学硕士学位论文自主跑轮运动通过抑制NF-κB通路改善阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力中文摘要目的：观察自主跑轮运动对阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）模型小鼠学习记忆能力和海马内炎性细胞因子表达的影响，探讨自主跑轮运动改善AD学习记忆能力和神经炎症的机制，为神经退行性疾病的防治提供新思路。方法：选取体重为30~35g的三月龄雄性昆明小鼠45只，由山西医科大学实验动物中心提供，随机分成三组：（1）DMSO对照组；（2）AD安静组；（3）AD运动组。每组15只。用3.5％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,根据小鼠脑图谱，采用脑立体定位仪，对DMSO对照组进行侧脑室注射DMSO，AD安静组和AD运动组进行侧脑室注射Aβ1-42寡聚体。侧脑室注射1周后，AD运动组小鼠进行为期6周的自主跑轮运动，DMSO对照组和AD安静组进行正常饲养，不运动。6周自主跑轮运动结束后，采用Morris水迷宫实验，评估自主跑轮运动对AD模型小鼠学习记忆能力的影响。采用免疫荧光染色方法检测小鼠海马内肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白介素10（Interleukin10，IL-10）、核转录因子κB（NuclearfactorKappaB，NF-κB）的阳性表达率变化。采用蛋白印迹方法（Westernblot）检测小鼠海马内上述指标的蛋白表达变化。结果：Morris水迷宫实验结果显示，6周自主跑轮运动结束后，AD运动组的逃避潜伏期（12.10±1.26）显著低于AD安静组（27.75±3.88）（P﹤0.01），提示6周的自I 山西医科大学硕士学位论文主跑轮运动有效改善了AD模型小鼠的学习记忆能力。免疫荧光染色结果显示，NF-κB、TNF-α和IL-10在DMSO对照组、AD安静组和AD运动组海马CA1区和CA3区均有表达，且各自在两区表达趋势一致。在海马CA1区和CA3区，NF-κB和促炎细胞因子TNF-α在AD安静组的阳性表达率均明显高于其他两组（P﹤0.05）；而IL-10在AD安静组的阳性表达率明显低于AD运动组和DMSO对照组（P﹤0.05）；而上述指标在AD运动组和DMSO对照组的阳性表达率无明显差异（P﹥0.05）。Westernblot结果显示，在小鼠海马中，NF-κB和促炎细胞因子TNF-α在AD安静组的蛋白表达量最高，与其余两组均具有统计学差异（P﹤0.05）；IL-10在AD安静组的蛋白表达量最低，在AD运动组和DMSO对照组表达较高，且后两者表达量较为接近，都与AD安静组存在统计学差异（P﹤0.05）。结论：(1)自主跑轮运动有效改善了AD模型小鼠的学习记忆能力。(2)自主跑轮运动明显下调了AD模型小鼠海马内促炎细胞因子TNF-α的释放；上调了抗炎细胞因子IL-10的表达。(3)NF-κB通路的抑制在自主跑轮运动改善AD模型小鼠学习记忆能力方面起到关键作用。自主跑轮运动能够显著抑制过度活化的NF-κB、TNF-α级联炎症反应，并通过调控海马内炎症反应失衡状态，改善AD模型小鼠学习记忆能力。关键词:阿尔茨海默病；自主跑轮运动；NF-κB；TNF-α；IL-10II 山西医科大学硕士学位论文VoluntaryWheelRunningImproveLearningandMemoryAbilityofAlzheimer’sDiseaseMicebyInhibitingNF-κBPathwayAbstractObjective：ToobservetheeffectofthelearningandmemoryabilityandtheexpressionofinflammatorycytokinesinthehippocampusofAlzheimer'sdiseaseaftervoluntaryrunningwheel,investigatethemechanismofvoluntaryrunningtoADlearningandmemoryabilityandnerveinflammation,andtoprovidenewideasforthepreventionandtreatmentofneurodegenerativediseases.Methods:45maleKunmingmiceweighing30~35gwereselected,WhichwereprovidedbyExperimentalAnimalCenterofShanxiMedicalUniversityandwererandomlydividedintothefollowinggroups:(1)DMSOcontrolgroup,(2)ADquietgroup,(3)ADexercisegroup.Themicewereanesthetizedwithanintraperitonealinjectionof3.5%chloralhydrate,themiceinDMSOcontrolgroupwasperformedbyintracerebroventricularinjectionofDMSO,themiceinADexercisegroupandADquietgroupwasperformedbyintracerebroventricularinjectionofAβ1-42oligomersbybrainstereotaxicapparatusandaccordingtothebrainatlas.Sevendayafteri.c.v.Aβ1-42orDMSOinjection,themiceinADexercisegroupwereappliedvoluntarywheelrunningfor6weeks,themiceinDMSOcontrolgroupandADquietgroupwerekeptnormalfeedingandnoexercise.Attheendof6weeksofvoluntarywheelrunning,theMorriswatermazetestwasusedtoevaluatetheeffectofvoluntarywheelrunningonlearningandmemoryabilityofallmice.TheIII 山西医科大学硕士学位论文positiveexpressionrateofTNF-α,IL-10,NF-κBinhippocampusofmicewasbyImmunofluorescencestaining.TheproteinexpressionofinflammatorycytokinesinhippocampusofmicewasdetectedbyWesternblot.Results:Morriswatermazetestshowedthatafter6weeksofexercise,theescapelatencyintheADexercisegroup(12.10±1.26)wassignificantlylowerthanthatintheADquietgroup(27.75±3.88)(P<0.01),suggestedthatthe6-weekvoluntarywheelrunningimprovedthelearningandmemoryabilityoftheADmodel.ImmunofluorescenceresultsshowedthatNF-κB,TNF-αandIL-10wereexpressedinhippocampalCA1andCA3regionsofDMSOcontrolgroup,ADexercisegroupandADquietgroup,andtheexpressiontrendofeachonewereconsistent.ThepositiveexpressionratesofNF-κBandTNF-αintheADquietgroupweresignificantlyhigherthanothertwogroups(P<0.05),thepositiveexpressionrateofIL-10inADquietgroupwassignificantlylowerthanothertwogroups(P<0.05),buttherewasnosignificantdifferencebetweenADexercisegroupandDMSOcontrolgroup(P>0.05).WesternblotanalysisshowedthatNF-κBandTNF-αhadthehighestproteinexpressionintheADquietgroup,andtheothertwogroupsweresignificantdifference(P<0.05),TheexpressionofIL-10inADquietgroupwasthelowest,anditwashigherinADexercisegroupandDMSOcontrolgroup,andthelattertwoaremoreclose(P<0.05),andhavestatisticallysignificantdifferencewiththeADquietgroup(P<0.05).Conclusions:(1)VoluntarywheelrunningcanimprovethelearningandmemoryabilityofADmodelmice.(2)Voluntarywheelrunningdown-regulatedthereleaseofproinflammatorycytokineTNF-αandup-regulatedtheexpressionofanti-inflammatorycytokineIL-10inthehippocampusofADmodelmice.IV 山西医科大学硕士学位论文(3)InhibitionofNF-κBpathwayplayakeyroleinvoluntarywheelrunningimprovesthelearningandmemoryabilityofADmodelmice.Voluntarywheelrunningcansignificantlyinhibitover-activationofNF-κB,TNF-αcascadeinflammationandregulatethehippocampusinflammatoryresponseimbalancetoimprovethelearningandmemoryabilityofADmodelmice.Keywords:Alzheimer’sdisease;Voluntaryrunningwheel;NF-κB;TNF-α;IL-10V 山西医科大学硕士学位论文前言随着人类寿命的延长，生活质量水平的提高被认为是不可忽视的部分。然而，随着人口老龄化的加剧，衰老相关疾病已成为一个严重的健康问题。阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）作为一种愈发严重的神经退行性疾病，脑功能的丧失和认知功能衰退严重威胁着人类的健康，高的致残率和死亡率已成为严重的社会问题和医学负担[2]。研究表明[3]，在全球≥65岁的人口中，有10%的人口患有AD。据评估，到2014年全球已有超过4.4千万人患AD，预计到2030年患病人口数量将会翻倍。目前关于AD的确切发病机制仍然是未知的，且尚未找到其预防和根治的有效措施。为了降低AD的发病率，临床采用了多种药物缓解和延迟AD的发生发展，但是这些药物的疗效都是暂时的。近年来，“炎症学说”被认为是AD的重要发病机制之一。β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)在脑内大量异样沉积是AD的主要病变之一，能够在短期内引起局部炎症[4-6]。据报道，在AD患者和AD实验动物模型脑内，炎性细胞因子的水平都较正常大大增加[7-9]。近年来，越来越多的人参与到体育锻炼中，适宜的运动不仅能改善身体素质，而且能通过对抗衰老性氧化应激、细胞凋亡和炎症应激的发生对大脑功能产生一些有益的影响[10]。早期研究表明[11]，长期低炎症状态普遍存在于老年人机体中。近期研究发现[12]，运动具有抗炎作用。定期适量的运动可以缓解慢性低炎症状态,防止相关疾病的产生[13,14]。Donmez等[15]研究表明，运动通过激活Sirt1蛋白表达提高α分泌酶的活性，降低β分泌酶的表达，抑制Aβ生成，而且Sirt1的激活也增加了脑内神经元的发生，提高了神经保护作用，双重抑制了Aβ的产生。Aβ生成减少能够改善脑内的炎症表达状态。因此，运动可被称作是一种无需药物治疗便可防治AD的简便治疗策略。核转录因子κB（NuclearfactorKappaB，NF-κB）是小胶质细胞内重要的多功能转录因子，通过参与小胶质细胞的活化和炎症性脑损伤的诱导[16]，介导许多免疫反应及炎症反应，其活性程度与机体的炎症反应状态有直接联系。细胞在静息状态下，NF-κB处于低活性、低活化、低表达的状态，于胞浆中与特定抑制蛋白IκB结合；当受到氧自由基、炎性细胞因子、钙超载等刺激，通过特定蛋白激酶，导致IκB磷酸化并得到降解，由胞浆快速易位进入胞核，释放IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子,1 山西医科大学硕士学位论文改变脑内炎症状态。过度活化的NF-κB具有神经损伤作用，在发生神经退行性病变的部位均可检测到[17]。肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisfactor-α,TNF-α）是一个重要的促炎细胞因子，是Aβ诱导炎症反应和认知障碍的传递者[18]。在AD的发病过程中，TNF-α通过调节炎症的表达，能够削弱AD发病过程中的保护性因素，诱导神经元损伤，增强炎症级联反应,加速AD的发生发展过程。白介素10（Interleukin10,IL-10）是一种多细胞源、多功能的细胞因子,起到调节细胞生长与分化的作用，作为炎性反应和免疫反应的主要参与者，是目前公认的炎症与免疫抑制因子。IL-10作为一个经典的抗炎细胞因子，能够有效抑制促炎标记物表达的升高,减少在AD病理进程中经Aβ诱导的促炎标记物的分泌[19]。关于AD的发病机制及其防治措施，人们进行了很多尝试和研究。目前，已证实植物激素Osmotin[20]、喹硫平[21]、冬凌草甲素[22]等药物可能通过抑制NF-κB途径达到改善AD神经炎症和认知障碍的目的。而适宜的运动可对抗炎症应激的发生[23]，亦可促进脑衰老、AD等认知功能的恢复[24,25]。NF-κB不仅可调控各种炎症细胞因子的表达，同时又是一个运动敏感因子。本研究对AD模型小鼠施加6周的自主跑轮运动干预，通过观察其学习记忆能力和海马内CA1区和CA3区NF-κB、促炎细胞因子TNF-α和抗炎细胞因子IL-10的表达变化，以验证适宜的有氧运动可通过改善AD小鼠海马内炎症反应失衡的状态，发挥其脑保护作用，进而改善AD的学习记忆能力，且NF-κB信号通路的抑制在其中起到重要作用。2 山西医科大学硕士学位论文1材料与方法1.1实验主要试剂表1-1主要实验试剂试剂名称试剂名称Aβ1-42Abcam二甲基亚砜（DMSO）Sigma山羊抗兔单克隆抗体NF-κBp65CellSignaling山羊抗兔多克隆抗体TNF-αAbcam大鼠单克隆抗体IL-10Abcam山羊抗兔IgG(H+L),Cy3康为世纪FITC标记山羊抗大鼠IgG（H+L）中杉金桥抗β-actin鼠单克隆抗体康为世纪FITC标记山羊抗小鼠IgG（H+L）中杉金桥FITC标记山羊抗兔IgG（H+L）中杉金桥DAPISalarbio小牛血清Sanland封片剂普利莱基因科技TritonX-100SalarbioBCA蛋白定量试剂盒康为世纪蛋白MarkerThermoscientificABC发光液全式金TEMEDAmrescoSDSSigmaβ-巯基乙醇BiotechAPSolarbilPVDF膜TransferMembranesX-光片EastmanKodakCompany3 山西医科大学硕士学位论文1.2主要仪器设备表1-2主要仪器设备仪器名称购买公司-80℃冰箱EPpendorf,德国Morris水迷宫成都泰盟科技有限公司SMART3.0软件系统panlab,西班牙冰冻切片机CM1850-1-1Leica,德国BX51荧光显微系统OLYMPUS,日本C-5050ZOOM数码相机OLYMPUS,日本Metamorph软件MolecularDevices,美国高速冷冻离心机Thermoscientific,美国SPECTRAMax-M2e自动板式酶标仪MD公司,美国双垂直板电泳槽BIO-RAD,美国摩尔实验室超纯水仪摩勒生物有限公司恒温金属浴杭州博日科技有限公司ZX-CXG-250型层析实验冷柜上海知信实验仪器科技有限公司超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司1.3实验动物与分组实验动物：3月龄雄性昆明小鼠45只，体重30～35g，清洁级，由山西医科大学实验动物中心提供。所有小鼠均在动物房通风、室温保持20±2℃、自由进食进水的环境下适应性饲养7天，动物饲养和操作均按照实验动物操作标准进行。分组：将实验小鼠随机分成三组：（1）DMSO对照组；（2）AD安静组；（3）AD运动组。每组15只。1.4制作AD模型根据Aβ1-42使用说明书，在分装好的Aβ1-42EP管内加入适量的DMSO溶液,将其终浓度稀释至2.25μg/μl[1]，置于37℃恒温金属浴中孵育36h，使其变为Aβ1-424 山西医科大学硕士学位论文寡聚体。用3.5％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，并固定于脑立体定位仪，用75%酒精擦拭头部，并将头部毛发去除，将头部皮肤剪开露出颅骨。根据小鼠脑图谱，进行侧脑室注射，注射用时8min，注射完毕留针5min，促进注射物的吸收，注射药物和拔针时要缓慢匀速，避免药物渗出，拔针后要在针孔处涂抹青霉素，缝合头皮，缝合线置于用青霉素和0.9%生理盐水配制的液体中浸泡湿透，防治伤口感染。DMSO对照组小鼠给予侧脑室（以前囟为0点，前囟后0.5mm，旁开1mm，硬脑膜下2.3mm）一次性注射DMSO4μl，AD运动组和AD安静组在相同部位一次性注射Aβ1-42寡聚体4μl。1.5建立自主跑轮运动模型侧脑室注射1周后，将AD运动组小鼠放入带有跑轮的鼠笼中，且小鼠可在里面自由活动。所有小鼠均在相同的生存环境下饲养。1.6Morris水迷宫实验Morris水迷宫为黑色圆柱形水池，直径为120cm，高度为50cm，平均分为四个象限，在第一象限内放置一个直径约为10cm的平台。水池中注入22℃±2℃的温水，水面超过平台1cm即可。Morris水迷宫上方固定一个摄像头采集小鼠的运动轨迹,通过Ethovision3.0软件处理和分析所获得的信息。Morris水迷宫实验要在避光和安静的环境下操作,以免外界对小鼠的行为造成干扰。6周自主跑轮运动结束后，三组小鼠进行Morris水迷宫实验，进行学习记忆能力的检测。Morris水迷宫实验周期为六天，前五天为定位航行实验，第六天为空间探索实验。定位航行实验：每天特定时间一次，将小鼠依次从四个象限的任意点面朝池壁放入水中，记录小鼠在60s内找到并爬到平台停留5s所用的时间；如果小鼠在60s内未能找到平台，人工将小鼠引导至平台并停留10s，并将其用时记录为60s。小鼠到达平台的时间即为逃避潜伏期,逃避潜伏期越短，说明小鼠的空间学习能力越强，以此评估AD模型小鼠的空间学习能力。空间探索实验：第六天将平台撤离，将小鼠依次从四个象限的任意点面朝池壁放入水中，记录小鼠在60s内穿越平台所在区域的次数，穿越平台次数越多，说明小鼠的空间探索能力越强,以此评估AD模型小鼠的空间记忆能力。5 山西医科大学硕士学位论文1.7免疫荧光染色实验（1）灌注固定取材：Morris水迷宫实验结束后，每组随机选取7只小鼠，使用3.5%的水合氯醛进行麻醉，按10ml/kg的剂量进行腹腔注射。麻醉后，将小鼠固定在操作台上，打开胸腔，将心脏彻底暴露出来，将针头经左心室刺入，在右心耳处剪口，血液和灌注液体从此处流出。将0.9%生理盐水经心-升主动脉注入，将血液从右心耳出流出，直至流出的液体清澈为止。再注入4%多聚甲醛PBS溶液，直到小鼠肝脏变白变硬为止，开颅取脑，将脑组织放入4%多聚甲醛PBS溶液中进行再次固定，过夜后取出依次放入15%和30%的蔗糖PBS溶液中进行梯度充分脱水，直到小鼠脑组织完全沉底。（2）冰冻切片：将充分脱水后的脑组织进行包埋，放入-20℃冰箱冻存2h，参照小鼠脑图谱，确定海马位置，于冰冻切片机上进行切片，片厚约16µm，隔五取一，编号，风干。（3）染色：将切片置于-20℃丙酮中固定20min，取出后置于空气中使丙酮完全挥发。在0.3%Triton-PBS中充分漂洗5min×2次，1×PBS中充分漂洗5min。在组织上滴加5%的小牛血清，放入37℃温箱封闭1h。滴加一抗山羊抗兔单克隆抗体NF-κBp65（1:400）或山羊抗兔多克隆抗体TNF-α（1:200）或大鼠单克隆抗体IL-10（1:100）结合抗原，4℃过夜。过夜后在0.3%Triton-PBS中充分漂洗5min×2次，1×PBS中充分漂洗5min，在避光环境下滴加二抗辣根酶标记山羊抗大鼠IgG（1:200）或山羊抗兔IgG，Cy3（1:200）结合一抗，并置于37℃湿盒内孵育2h。在0.3%Triton-PBS中充分漂洗5min×2次，1×PBS中充分漂洗5min。滴加DAPI进行细胞核着色，37℃浮箱避光孵育10min，使用1×PBS充分漂洗5min。用封片剂封片，不能有气泡产生，盖好盖玻片，避光晾干。（4）图像分析与数据处理采用OlympusBX51型荧光显微镜观察NF-κB、TNF-α、IL-10在海马CA1区和CA3区的表达和分布情况。每只小鼠脑组织选取5张脑片，每张脑片上随机选取4-6个视野观察目的炎性细胞因子的表达及分布情况，采用DP71照相系统于镜下40倍进行拍照。通过Metamorph软件计算检测指标阳性表达率。6 山西医科大学硕士学位论文1.8免疫印迹1.8.1新鲜取材Morris水迷宫实验结束后，断头处死小鼠，在冰上分离新鲜的海马组织，放入对应的1.5mlEP管内，迅速置于液氮中速冻并转入-80℃冰箱保存。1.8.2提取海马总蛋白在装有海马组织的EP管内加入200ulbuffer裂解液，使用研磨棒在冰上进行组织研磨，待组织充分研磨，使用细胞超声破碎仪进行进一步裂解，待充分裂解后，将EP管置于低温高速离心机4℃12000rpm高速离心15min，取上清即样本蛋白于另一个EP管内保存。1.8.3蛋白浓度的测定取5ul样本蛋白，用PBS溶液稀释10倍，采用BCA法测蛋白浓度，用此结果计算原样本蛋白浓度。1.8.4SDS—PAGE电泳（1）将洗净烘干的玻璃板于制胶架上固定。（2）配置10%分离胶（配方见下表）于小量杯中，迅速摇匀后用移液枪将分离胶加入玻璃槽间，之后加异丙醇封闭液面，37℃浮箱放置大约20min。（3）配置4%浓缩胶（配方见下表）待分离胶聚合，取出胶架倒掉异丙醇，用滤纸将残留液体吸干，立即将浓缩胶从玻璃槽一侧加入，不要产生气泡，缓慢插入梳子，再次放入37℃浮箱大约30min。待浓缩胶彻底凝固后，将梳子轻轻拔出。表1-3凝胶配方药品名称分离胶(10%)浓缩胶(5%)ddH2O1.9ml2.1ml30%丙烯酰胺1.7ml0.5ml1.0mol/LTris(8.8)1.3ml－1.0mol/LTris(6.8)－0.38ml10%SDS0.05ml0.03ml10%过硫酰胺0.05ml0.03mlTEMED0.002ml0.003ml（4）配置上样样本根据目的蛋白浓度计算出含20μg蛋白的溶液体积，由于样本蛋7 山西医科大学硕士学位论文白浓度过大，将样本蛋白根据实验需要进行2倍或4倍稀释，加4μl的含β巯基乙醇的5×loudingbuffer，体积不足20μl的用1×PBS补齐。将配置好的上样样本置于加热至95℃的金属浴板孔中10min，使上样样本中的蛋白变性。（5）电泳槽内加入电泳液至高于薄玻璃板，用微量进样器分别吸取样本，缓慢注入到对应的加样孔中，要由低到高缓慢加入，避免因速度过快产生气泡使样本随气泡溢出造成蛋白损耗。用同样的方法在边缘空白加样孔中加入Marker。每次加样后要充分冲洗微量进样器，避免不同样本蛋白之间互相污染。（6）上样结束后盖上电泳槽盖子，接通电源，设置电泳的电压和跑胶时间：浓缩胶电压为80V，跑胶时间约30～45min，当溴酚蓝被压成一条直线时，切换分离胶电压和时间，分离胶电压为110V，时间为60～120min，根据目的蛋白的分子量选择合适的电泳时间。1.8.5转膜（1）电泳结束后卸下胶板，刮去上方的浓缩胶和多余的空白泳道，在凝胶右上方切掉一小块作为蛋白加样顺序的标志，将所需凝胶置于转移液中。（2）裁剪大小合适的PVDF膜，将其放入甲醛溶液中浸润激活，激活后捞出放入转移液中浸泡。裁剪6张与PVDF膜尺寸相同的滤纸，放入转移液中浸润，转膜孔板由正极到负极按照薄海绵垫、3张滤纸、凝胶、PVDF膜、3张滤纸、薄海绵垫的顺序依次铺设，每层之间都不能出现气泡，防止影响转膜效果。若转膜板闭合不紧，可适当增加滤纸张数或更换厚海绵垫，以使PVDF膜和凝胶能够充分紧贴。（3）将转膜孔板放到转移槽内，注意正负极对应，在转移槽内放入冰槽，在转移槽内加转移液至凝胶的最高点。在转移槽周围放置冰袋冷却降温，以防转膜过程中温度过高降解蛋白。设置转膜电流为200mA，转膜时间为45～60min，根据目的蛋白的分子量选择合适的转膜时间。1.8.6免疫反应（1）转膜结束后，将转好蛋白的PVDF膜放入5%脱脂奶粉TBST封闭液中，在37℃环境下封闭1h。（2）根据Marker条带，将封闭充分的PVDF膜按照目的蛋白所在位置进行裁剪。（3）将裁剪好的PVDF膜放入一次性EP手套，按照目的蛋白所在条带分别加入一抗山羊抗兔单克隆抗体NF-κBp65(1:1000)或山羊抗兔多克隆抗体TNF-α(1:1500)或大8 山西医科大学硕士学位论文鼠单克隆抗体IL-10(1:500)或抗β-actin鼠单克隆抗体(1:3000)于摇床上4℃过夜。（4）第二天将PVDF膜放入0.01mol/LTBST液中漂洗3次，每次10min，加入二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG（1:4000）或辣根酶标记山羊抗大鼠IgG(1:4000)或辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(1:5000)，于37℃孵箱中孵育2h，再次用0.01mol/LTBST液漂洗3次，每次10min。1.8.7化学发光、显影、定影化学发光试剂盒A、B、C三种试剂按照1000、1000、1的比例混匀。将PVDF膜放入X-光片夹内，蛋白朝上的一面均匀滴加发光液，使发光液充分浸润膜表面，充分反应至膜上出现发光条带，用滤纸吸取膜周边多余的发光液，把一次性保鲜膜覆盖在PVDF膜上，排尽气泡，将X-光片置于PVDF膜所在区域的保鲜膜上，各层之间不可以移动，将X-光片夹盖紧曝光，根据条带的发光亮度调节X-光片曝光时间。曝光结束，将X-光片取出依次放入显影液、定影液中显影、定影，取出后用蒸馏水冲洗干净，即可在通风厨晾干。1.8.8结果分析待胶片彻底晾干后进行电子扫描，将所扫描图片用图像分析软件ImageJ2x分析目的条带和内参β-actin的灰度值，并计算目的蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值。1.9统计学分析所有数据采用SPSS22.0软件进行统计学分析，用x±s表示，6周自主跑轮运动结束后，DMSO对照组、AD安静组、AD运动组之间的逃避潜伏期、穿越平台次数、炎性细胞因子阳性表达率和炎性细胞因子蛋白表达之间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为具有统计学差异。9 山西医科大学硕士学位论文2结果2.1自主跑轮运动改善了AD模型小鼠的学习记忆能力（1）定位航行实验6周跑轮运动结束后，Morris水迷宫检测结果显示，AD运动组的逃避潜伏期（12.10±1.26）显著低于AD安静组（27.75±3.88）（P﹤0.01），提示6周的自主跑轮运动有效改善了AD模型小鼠的学习记忆能力（图2-1）。）秒（***逃避潜伏期时间(天)图2-1Morris水迷宫检测运动后各组逃避潜伏期*P﹤0.05，**P﹤0.01：AD安静组与AD运动组相比（2）空间探索实验6周自主跑轮运动结束后，Morris水迷宫检测结果显示，所有小鼠的游动轨迹均具有目标趋向性（图2-2A）。AD安静组在60S内穿越平台所在区域的次数（6.25±2.63）明显少于AD运动组（10.86±3.94）和DMSO对照组（9.67±3.32），均具有统计学差异（P﹤0.05），而AD运动组和DMSO对照组相比,无统计学差异（P﹥0.05）（图2-2B）。10 山西医科大学硕士学位论文DMSO对照组AD安静组AD运动组图2-2A自主跑轮运动6周后各组小鼠游动轨迹穿越平台次数图2-2B6周自主跑轮运动后各组小鼠穿越平台次数注：#P﹤0.05:AD安静组与AD运动组相比2.2NF-κB、TNF-α、IL-10免疫荧光染色结果2.2.1NF-κB免疫荧光染色结果各组小鼠在海马CA1区和CA3区均可发现NF-κB阳性细胞（图2-3A）。统计结果显示，在海马CA1区和CA3区，NF-κB在AD安静组的阳性表达率（63.17±4.17&75.10±1.14）较高，与DMSO对照组（37.55±4.38&60.34±1.25）和AD运动组（30.69±4.34&57.80±2.31）相比均具有统计学差异（P﹤0.05）。DMSO对照组和AD运动组相比，不具有统计学差异（P﹥0.05）（图2-3B）。11 山西医科大学硕士学位论文CA1CA3DMSO对照组AD安静组AD运动组图2-3ANF-κB在各组小鼠海马CA1、CA3区免疫荧光染色结果注：bar=50μm((率%)*阳*区性表达CA在1NF-kB((率%##)阳区性表达CA在3NF-kB图2-3BNF-κB在各组小鼠海马CA1、CA3区阳性表达率注：*P﹤0.05，#P﹤0.05，在海马CA1、CA3区，与AD安静组相比12 山西医科大学硕士学位论文2.2.2TNF-α免疫荧光染色结果各组小鼠在海马CA1区和CA3区均可发现TNF-α阳性细胞，且表达趋势与NF-κB一致，以胞浆染为红色，胞核染为紫色作为阳性细胞作数（图2-4A）。统计结果显示，在海马CA1区和CA3区，AD安静组的阳性表达率（55.97±5.56&59.22±4.29）较高，与DMSO对照组（40.90±2.46&43.98±2.67）和AD运动组（35.52±0.88&46.39±4.52）相比均具有统计学差异（P﹤0.05）。DMSO对照组和AD运动组相比，不具有统计学差异（P﹥0.05）（图2-4B）。CA1CA3AD运动组DMSO对照组AD安静组图2-4ATNF-α在各组小鼠海马CA1、CA3区免疫荧光染色结果注：bar=50μm((率%)**阳区性表达CA在1αTNF-13 山西医科大学硕士学位论文((率%)##阳区性表达CA在3αTNF-图2-4BTNF-α在各组小鼠海马CA1、CA3区阳性表达率注：*P﹤0.05，#P﹤0.05，在海马CA1、CA3区，与AD安静组相比2.2.3IL-10免疫荧光染色结果在海马CA1区和CA3区，各组小鼠均可发现IL-10阳性细胞，以胞浆染为绿色，胞核被DAPI染为紫色作为阳性细胞作数（图2-5A）。统计结果显示，在各组海马CA1区和CA3区，DMSO对照组（62.80±2.79&70.36±3.62）和AD运动组（59.21±1.69&67.50±2.26）的阳性表达率较高，明显多于AD安静组（44.06±4.19&59.49±1.07），与AD安静组相比均具有统计学差异（P﹤0.05）。DMSO对照组和AD运动组相比，不具有统计学差异（P﹥0.05）（图2-5B）。CA1CA3DMSO对照组AD安静组AD运动组图2-5AIL-10在各组小鼠海马CA1、CA3区免疫荧光染色结果注：bar=50μm14 山西医科大学硕士学位论文**((率%)阳区性表达CA在11L-10##((率%)阳区性表达CA在31L-10图2-5B1L-10在各组小鼠海马CA1、CA3区阳性表达率注：*P﹤0.05，#P﹤0.05，在海马CA1、CA3区，与AD安静组相比2.3WesternBlot结果在小鼠海马中，NF-κB在AD安静组的蛋白表达量（1.88±0.13）明显高于AD运动组（1.09±0.13）和DMSO对照组。经统计学分析，AD安静组的蛋白表达量与其它两组均具有统计学意义（P﹤0.05），AD运动组和DMSO对照组的蛋白表达量较为接近，不具有统计学意义（P﹥0.05）（图2-6）。15 山西医科大学硕士学位论文*ac/β*tinBκNF-图2-6NF-κB在各组小鼠海马中的蛋白表达注:*P﹤0.05：AD安静组与AD运动组和DMSO对照组相比促炎细胞因子TNF-α和NF-κB的蛋白表达量趋势一致。TNF-α在AD安静组的蛋白表达量(1.635±0.03)明显高于AD运动组（0.965±0.10）和DMSO对照组。经统计学分析，AD安静组的蛋白表达量与其它两组均具有统计学意义（P﹤0.05），AD运动组和DMSO对照组的蛋白表达量较为接近，不具有统计学意义（P﹥0.05）（图2-7）。**ac/βtiαnTNF-图2-7TNF-α在各组小鼠海马中的蛋白表达注:*P﹤0.05:AD安静组与AD运动组和DMSO对照组相比在小鼠海马中，抗炎细胞因子IL-10的蛋白量表达趋势与NF-κB和TNF-α的表达趋势相反。IL-10在AD运动组(0.9932±0.19)和DMSO对照组表达量升高，在AD安16 山西医科大学硕士学位论文静组的蛋白表达量(0.5267±0.07)降低，经统计学分析，AD安静组与其他两组均具有统计学意义（P﹤0.05），AD运动组和DMSO对照组表达较为接近，不具有统计学意义（P﹥0.05）（图2-8）。**ac/βtinIL-10图2-8IL-10在各组小鼠海马中的蛋白表达注:*P﹤0.05：AD安静组与AD运动组和DMSO对照组相比17 山西医科大学硕士学位论文3讨论3.1阿尔茨海默病与脑内炎症表达水平密切相关随着全球人口老龄化现象的日渐加剧，AD、帕金森氏病(Parkinson’sDisease，PD)等神经退行性疾病已经发展成为不容小觑的社会问题，其病程症状对高龄群体的生存质量产生极大的负面效应。AD的病因有多种学说，但近年研究发现，AD发病伴随着脑内各种促炎细胞因子的大量分泌[33]。神经炎症急性发作并及时采取有效措施解决时，神经炎症可起到对抗病原体和组织修复的作用，但慢性炎症的发作却助长了神经退行性疾病的发生[34]。因此，“炎症学说”逐渐成为研究AD病理机制的热点。在AD患者尸检过程中发现，脑组织Aβ斑块沉积的周围，NF-κB在神经元和星形胶质细胞中的免疫反应异常活跃[35]。WUD[36]等研究发现，当Aβ在大脑沉积，促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的表达水平随之上升，而随着炎性因子表达的异常增高，Aβ1-42表达量也不断增多，Aβ和促炎细胞因子之间形成一种正反馈恶性循环，可能促进了AD的发生发展。本研究中免疫荧光染色和WesternBlot结果也证实，AD安静组小鼠海马内NF-κB和促炎细胞因子TNF-α的表达明显增高并伴随学习记忆障碍。3.2自主跑轮运动改善AD模型小鼠的学习记忆能力AD是老年痴呆的最常见形式，记忆缺失是AD最早期的临床症状，随着病程进展，脑部神经细胞逐渐衰亡，并最终导致其学习能力和记忆能力的损伤。近年来，运动作为一种干预AD的健康新手段出现在大家的视野中。Sun[37]提到，运动能够减弱脑损伤和延迟被各种因素引起的神经退化。Kang等研究表明[38]，运动对防治AD患者认知水平减退的现象有积极作用。规律的有氧运动可促进神经元的存活和新生，减缓AD患者记忆力和注意力等脑功能的下降[10]。多数研究已通过Morris水迷宫实验[39]、Y迷宫自由穿梭实验[40]等证实，适宜的运动可以显著改善AD模型鼠的学习记忆能力。本研究中，对自主跑轮运动6周的AD模型小鼠进行Morris水迷宫实验检测，AD运动组小鼠的逃避潜伏期明显短于AD安静组，到达平台所在区域的次数明显多于AD安静组，AD运动组的实验数据接近DMSO对照组，表明自主跑轮运动能够显著改善AD模型小鼠的学习记忆能力。18 山西医科大学硕士学位论文3.3自主跑轮运动对海马CA1区和CA3区炎症表达的影响Kalesnykas[41]等人提到，大脑皮质和海马作为大脑两大记忆区，在AD的发病过程中也是最易受到侵害的部位。海马的损伤在AD患者记忆能力损伤的过程中起到更加关键的作用，因此，本研究将海马作为重点研究区域。机体在健康状态下，脑内产生的多余物质将会被小胶质细胞（MG）吞噬，维持脑内平衡稳定状态。在AD发病前期，MG可以清除脑内少量沉积的Aβ，随着病情恶化，Aβ在脑内大量沉积，远远超过了MG吞噬功能，MG被过度活化，NF-κB作为小胶质细胞内重要的核转录因子和炎症级联反应的启动因子，被过度活化的MG所激活，导致促炎细胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α的过量表达，促炎细胞因子的过量表达打破脑内炎症平衡状态，再次加剧了Aβ的异常沉积，削弱了MG的吞噬功能，从而形成炎症反应的恶性循环,加速AD的病理进程。在临床治疗中，药物对AD的治疗并没有起到预期效果，而体育锻炼作为一个干预神经退行性疾病的有效措施逐渐出现在人们的视野中，能达到衰减或限制疾病发展的目的[42]。在医学研究领域已经证实,适宜的运动具有抗炎效应[12],在炎症诱导的各种慢性疾病中，规律的体育锻炼能够抑制促炎信号通路的激活，产生抗炎效应，对机体发挥保护作用。本课题组前期研究已证实[43,44]，持续有效的有氧游泳运动不仅可以改善衰老大鼠模型的学习记忆能力，而且改善了海马区和下丘脑区炎症反应失衡的现象。NF-κB是一个运动敏感因子，Choi等[3]研究表明，6周的跑台运动使AD大鼠大脑皮质中NF-κB、TLR4、TNF-α、IL-1α的表达水平明显降低。本研究也通过对AD模型小鼠施加运动干预，证实了自主跑轮运动不仅具有抗炎效应，而且可能对海马内促炎-抗炎平衡的恢复起到重要作用[12]。本研究中免疫荧光染色和蛋白免疫印迹实验检测结果显示，经过6周的自主跑轮运动，NF-κB在AD运动组的表达明显低于AD安静组。过度活化的NF-κB受到抑制，促炎细胞因子TNF-α的表达也随之降低，而抗炎细胞因子IL-10在AD运动组的表达明显高于AD安静组，且AD运动组和DMSO对照组的炎症表达无明显差异。提示6周的自主跑轮运动可能通过抑制NF-κB通路减少TNF-α的表达，同时上调了AD模型小鼠海马内IL-10的表达。由此推断，自主跑轮运动的干预可能通过影响AD模型小鼠海马内的炎症反应失衡状态，使得脑内促炎-抗炎平衡得到一定程度的恢复，从而有望延缓AD进程。19 山西医科大学硕士学位论文3.4NF-κB通路的抑制是自主跑轮运动改善AD小鼠学习记忆能力的关键因素AD、PD和亨廷顿舞蹈病等疾病均与神经炎症有着密不可分的关系，Badshah[20]研究表明，脂多糖（LPS）诱导了神经退行性疾病的神经炎症和记忆损伤，采用植物激素Osmotin对其进行干预，通过抑制TLR4/NF-κB通路阻止了LPS诱导的神经炎症和记忆障碍。在Zhu[21]的研究中指出,喹硫平作为NF-κB活化的抑制剂，改善了APP/PS1转基因小鼠的认知能力，同时衰减小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，减少炎症细胞因子体内和体外的表达水平，这可能与其抑制NF-κB激活有关。以上信息表明，NF-κB可能是改善AD神经炎症和记忆损伤的重要机制之一。NF-κB是一个运动敏感因子。基于其他学者的前期研究，本研究对AD模型小鼠实施运动干预，经过6周的自主跑轮运动，发现过度激活的NF-κB通路被抑制，导致促炎细胞因子TNF-α的表达减少，而抗炎细胞因子IL-10的表达增多，且AD运动组小鼠的学习记忆能力得到明显改善，由此我们推断，促炎信号通路NF-κB的抑制可能是自主跑轮运动改善AD模型小鼠脑内炎症和学习记忆障碍的重要机制之一。20 山西医科大学硕士学位论文4结论(1)自主跑轮运动有效改善了AD模型小鼠的学习记忆能力。(2)自主跑轮运动明显下调了AD模型小鼠海马内促炎细胞因子TNF-α的释放；上调了抗炎细胞因子IL-10的表达。(3)NF-κB通路的抑制在自主跑轮运动改善AD模型小鼠学习记忆能力方面起到关键作用。自主跑轮运动能够显著抑制过度活化的NF-κB、TNF-α级联炎症反应，并通过调控海马内炎症反应失衡状态，改善AD模型小鼠学习记忆能力。21 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山西医科大学硕士学位论文综述运动通过抑制NF-κB防治阿尔茨海默病阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)作为一种愈发严重的神经退行性疾病，其发病机制一直不明了，至今仍无法找到其预防和根治的有效措施。近年来，关于AD发病机制的研究多集中在β淀粉样蛋白（β-amyloidprotein,Aβ）沉淀和Tau蛋白异常磷酸化（TauhyperphoSPhorylation）两方面。一些研究表明，核转录因子κB（NuclearfactorKappaB，NF-κB）是控制多种基因表达的主要调控因子，在AD的病理进程中起到关键作用，抑制NF-κB的表达或通路的激活可达到减轻Aβ沉积[1]和Tau蛋白过度磷酸化水平[2]的目的；适宜的运动对AD有一定的预防和缓解作用，起到抑制Aβ沉积[3,4]和Tau蛋白过度磷酸化水平[5]的作用，但其分子生物学机制尚不清楚。那么适宜的运动能否通过调控NF-κB的过度活化可达到防治AD的目的。本文综述了近年来运动干预、NF-κB与AD相关机制的研究进展。1.AD随着人类寿命的延长,生活质量水平的提高被认为是不可忽视的部分。然而，随着人口老龄化的加剧，衰老相关疾病已成为一个严重的健康问题。AD作为一种愈发严重的神经退行性疾病，其主要病理学特征是细胞外老年斑的形成和细胞内神经元纤维缠结，Aβ的大量异常沉积导致细胞外老年斑的形成，神经元纤维缠结是Tau蛋白过度磷酸化的结果[6]，逐渐性记忆功能障碍和认知功能障碍等神经精神症状对高龄群体的生存质量已经产生了极大的负面影响，高的致残率和死亡率已成为严重的社会问题和医学负担[7]。研究表明[8],在全球≥65岁的人口中,有10%的人口患有AD。据评估,到2014全球已有超过4.4千万人患AD，预计到2030年,患病人口数量将会翻倍。随着研究的不断深入，AD的发病机制已经被提出多种学说，但近年研究发现，AD发病伴随着各种促炎细胞因子的大量分泌[9]，因此，“炎性学说”逐渐成为AD发病机制的研究热点。为了降低AD的发病率，临床上采用他汀类药物[10]、白藜芦醇[11]、雷公藤内酯醇[12]等药物来降低神经炎症，期望通过抑制炎症通路减少Aβ沉积和Tau蛋白过度磷酸化，达到预防和延缓AD发病的目的，然而这些药物的疗效都是暂时的[3]。在近期研究中发现，适宜的运动具有抗炎作用[13]。定期适量的运动可以缓解慢性低炎25 山西医科大学硕士学位论文症状态，防止相关疾病的出现[14,15]。2.NF-κB1986年，Sen和Baltimore首次从B淋巴细胞核中检测到NF-κB[16]。1993年，Rattner等首次发现NF-κB存在于神经元中[17]。核转录因子κB（nuclearfactorKappaB，NF-κB）是小胶质细胞内重要的多功能转录因子，参与了小胶质细胞的活化和炎症性脑损伤的诱导[18]，作为介导许多免疫反应及炎症反应的核心物质，其活性程度与机体的炎症反应状态有直接联系。NF-κB具有神经损伤作用，可改变脑内炎症状态,特异激活的NF-κB在发生神经退变的部位均可检测到[19]，通过参与免疫、炎症反应及凋亡的基因转录发挥作用。细胞在静息状态下，NF-κB处于低活性、低活化、低表达的状态，于胞浆中与特定抑制蛋白IκB结合，当受到氧自由基、炎性细胞因子、钙超载等刺激，通过特定蛋白激酶，导致IκB磷酸化并得到降解，由胞浆快速易位进入胞核，释放促炎因子。IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β等这些促炎因子的表达均受到NF-κB的转录调控。3NF-κB与AD在AD、中风、帕金森病等神经性疾病的致病过程中，NF-κB均呈现过度激活的状态。在AD患者尸检过程中发现，在脑组织Aβ斑块沉积的周围，神经元和星形胶质细胞中NF-κB的免疫反应异常活跃[20]。NF-κB作为小胶质细胞内重要的核转录因子和炎症级联反应的启动因子，在促成AD患者大脑中免疫炎症反应的形成和炎性产物分泌水平持续升高的过程中起到关键性作用。AD患者脑内炎症平衡状态被打破，诱使Aβ在脑内大量异常沉积，Aβ沉积再次刺激小胶质细胞活化，使NF-κB在脑内过度激活，释放一系列促炎细胞因子，形成正反馈恶性循环，对AD病理进程的发展起到催化的作用。3.1NF-κB与Aββ淀粉样前体蛋白（App）在β分泌酶和γ分泌酶的水解下生成Aβ[21]。Aβ在脑内大量异常沉积引起继发炎症反应，进而形成神经炎性斑即老年斑（SP），而后者是AD脑内重要的特征性病理变化之一[22-25]。Aβ在脑内大量异样沉积激活小胶质细胞，NF-κB作为小胶质细胞内重要的核转录因子和炎症级联反应的启动因子，小胶质细胞的活化激活了NF-κB，导致脑内炎症平衡状态被打破，失衡的炎性细胞因子通过激活的小胶质细胞又进一步刺激了NF-κB的活化，从而形成炎症反应的恶性循环，增加26 山西医科大学硕士学位论文AD患者脑中Aβ的异常沉积，加速AD的病理进程[26]。WUDan等[27]研究表明，海马神经元表面的TLp4/NF-κB信号通路被激活后，导致炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、BACE-1、pS-1、β-App表达水平的升高和Aβ1–42表达量的增加，同时，Aβ1–42的产生刺激海马神经元，引起海马神经元自身受体TLR4的升高，形成恶性循环，最终导致Aβ1–42在脑内大量沉积。Cheng等[1]研究表明，在AD模型中，抑制剂EGCG明显抑制了促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达，恢复了细胞内Nrf2的抗氧化水平，抑制了NF-κB的激活，缓解了Aβ诱导的小胶质细胞的神经炎症反应，防止间接神经毒性的发生。表明激活的NF-κB在诱导Aβ沉积引发AD的过程中起到重要作用，下调NF-κB的表达可能为防治AD提供新的治疗思路。3.2NF-κB与Tau蛋白Tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白，微管相关蛋白与微管蛋白共同组成微管。正常脑中Tau蛋白的细胞功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管，维持微管的稳定性，降低微管蛋白分子的分解[28]。在Tau蛋白与微管蛋白结合区域，存在多个磷酸点，如果Tau蛋白出现磷酸化，其正常生物功能将会丧失。与正常脑组织相比，AD患者脑组织中出现正常Tau蛋白减少而异常过度磷酸化Tau蛋白大量增加的现象，异常过度磷酸化的Tau蛋白与微管蛋白结合力仅为正常Tau蛋白结合力的十分之一，维持微管稳定性的能力也随之丧失[29,30]。Tau蛋白过度磷酸化导致细胞内神经元纤维缠结并在神经元内集聚，AD患者脑中的炎症介质诱导了Tau蛋白的过度磷酸化[31]。Lee[32]等研究发现,雷公藤红素是NF-κB的抑制剂，NF-κB位于Toll样受体4(TolllikerecEPtor4，TLＲ4)的下游，雷公藤红素同样可以抑制TLＲ4的活性。Wan[33]等人在研究中发现，雷公藤红素可以降低Tau蛋白的异常过度磷酸化水平。基于以上发现，曹帆帆[34]等人通过凝聚态Aβ1-42制作了Tau蛋白异常磷酸化细胞模型，经过雷公藤红素的干预，证实雷公藤红素可通过削弱TLR4的活化程度抑制TLR4/NF-κB通路，减弱Tau蛋白异常磷酸化细胞模型的磷酸化程度。Leem等[2]研究表明，对16周的NSE/htau23转基因AD小鼠进行为期12周的持续性跑台运动，NF-κB的活性大大降低，此外，Tau蛋白磷酸化相关的激酶活性、星形胶质细胞和小胶质细胞的活性也得到抑制，减少了TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2和iNOS的表达，这些发现提示，通过抑制NF-κB的过度活性能够减轻AD病理过程中Tau蛋白的磷酸化水平。4.运动与AD27 山西医科大学硕士学位论文在近期的AD病理研究中，体育锻炼得到更多的关注。体育锻炼已成为一个干预神经退行性疾病的有效措施，能达到衰减或限制疾病发展的目的[35]。早期研究表明[36]，长期低炎症状态普遍存在于老年人的机体中。在医学研究领域已经证实,适宜的运动具有抗炎效应，在炎症诱导的各种慢性疾病中，规律的体育锻炼能够抑制促炎信号通路的激活，产生抗炎效应，对机体发挥保护作用。研究表明，在AD、血管性痴呆、混合型痴呆、继发性痴呆等痴呆类型中，运动均能降低痴呆的长期风险，尤其对降低AD的发病率最为显著[37]。体育锻炼能够减缓AD患者身体功能下降和认知功能的减退的相关病症，是一个经济便捷、实际可行的方式，能够减少抑郁症甚至死亡的发生[35]。4.1运动与Aβα，β和γ分泌酶的表达和活性在促成Aβ的生成或抑制Aβ的沉积的过程中起到关键性作用。Donmez等[4]研究表明，运动通过激活Sirt1蛋白表达提高α分泌酶活性，降低β分泌酶的表达，抑制Aβ生成，而且Sirt1的激活也增加了脑内神经元的发生，提高了神经保护作用，双重抑制Aβ的产生。在Kang等人[38]的研究中报道，给予PS2转基因小鼠12周的跑台运动，海马内Aβ1-42和β分泌酶的表达降低，提示该AD模型小鼠通过运动的干预减少了β分泌酶的释放，进而抑制了Aβ1-42在其脑组织的蛋白表达水平。Choi等[3]研究表明，在AD大鼠模型中，6周的跑台运动改善了其学习认知能力，降低了Aβ的表达能力。Liu等[5]发现，5个月的长期跑台运动抑制了3月龄APP/PS1双转基因小鼠海马内Aβ斑块的沉积和Aβ的再生，改善了其认知缺陷。表明运动通过调控Aβ表达抑制AD的病理进程。4.2运动与Tau蛋白Leem等[2]对16周的NSE/htau23转基因AD小鼠进行为期12周的持续性跑台运动，下调了AD小鼠脑内原本升高的pKA磷酸化、ERK磷酸化、JNK磷酸化、P38磷酸化的活性表达，运动通过改善Tau蛋白磷酸化相关的激酶活性而抑制了AD小鼠脑内Tau蛋白的过度磷酸化水平。Belarbi等[39]研究表明，THY-Tau22转基因AD小鼠，从3月龄开始，进行为期9个月的自主跑轮运动，海马中Tau蛋白的浓度下降。长期的运动通过调节PI3K/GSK3β信号通路缓和了Tau蛋白的过度磷酸化水平。Liu等[5]也发现，将3月龄APP/PS1双转基因小鼠进行5个月的跑台运动，降低了海马中28 山西医科大学硕士学位论文Tau蛋白的高度磷酸化水平，APP磷酸化水平和PS1水平也随之下降。上述研究表明，适宜的运动可作为缓解AD模型鼠脑内Tau蛋白磷酸化水平过高表达的有效途径。现在,越来越多学者的研究涉及到Tau蛋白磷酸化与Aβ产生和沉积之间的关系。已有研究表明，Tau蛋白的磷酸化会促成Aβ产生和脑内淀粉样斑块的沉积[40,41]。在随后的研究报道中也指出，通过运动阻断Tau激酶引起的Tau蛋白的磷酸化，抑制了Aβ诱导的细胞死亡和Aβ的神经毒性[42-44]。基于以上研究，推测适宜的运动对Tau蛋白磷酸化的抑制会减少Aβ的产生和沉积。5.运动和NF-κBNF-κB是运动敏感因子。Choi等[3]研究发现，AD大鼠模型经过6周跑台运动，TLR4、TNF-α、IL-1α、NF-κB的表达水平明显低于AD模型组。Tuon等[45]研究表明，线粒体和海马能够对体能训练的神经保护作用做出积极回应，特别是对相关的线粒体功能、氧化应激和神经炎症。在帕金森（Parkinson’sDisease，PD）小鼠模型中，NF-κB的蛋白表达水平明显的提高，8周的跑台运动和肌力训练通过刺激Sirt1的活化降低了NF-κB的表达，调节线粒体功能和神经炎症，提高了神经保护作用。上述研究表明，适宜的运动可能通过降低NF-κB的活性对炎症细胞因子的释放起到调节作用，进而提高对大脑的神经保护作用。6.展望迄今为止，AD的发病机制仍不明确，大部分预防和治疗方案仍局限于药物模式，所需费用高且疗效有限。近年来，关于有氧运动的研究日渐增长，人们对它的关注也日益增多，运动作为一种健康的干预手段，其抗炎和神经保护作用已经得到证实。而随着NF-κB在AD中不断深入的研究，发现抑制NF-κB的过度活化可能通过多条途径遏制促炎因子的释放，保护神经元，缓解AD病程的发生发展。那么，运动是否通过抑制NF-κB通路的激活改善AD，尽管NF-κB的通路有多条，但随着研究的不断深入，这一机制将逐渐明了。29 山西医科大学硕士学位论文参考文献[1]Cheng-ChungWeiJ,HuangHC,ChenWJ,HuangCN,PengCH,LinCL.Epigallocatechingallateattenuatesamyloidβ-inducedinflammationandneurotoxicityinEOC13.31microglia[J].EurJPharmacol,2016,5(770):16-24.[2]LeemYH,LeeYI,SonHJ,LeeSH.ChronicexerciseamelioratestheNeuroinflammationinmicecarryingNSE/htau23[J].BiochemBiophysResCommun,2011,406(3):359-65.[3]ChoiDH,KwonIS,KooJH,JangYC,KangEB,ByunJE,UmHS,ParkHS,YeomDC,ChoIH,ChoJY.Theeffectoftreadmillexerciseoninflammatoryresponsesinratmodelofstreptozotocin-inducedexperimentaldementiaofAlzheimer'stype[J].JExercNutritionBiochem,2014,18(2):225-233.[4]DonmezG,WangD,CohenDE,GuarenteL.SIRT1suppressesbeta-amyloidproductionbyactivatingthealpha-secretasegeneADAM10[J].Cell,2010,142(2):320-332.[5]LiuHL,ZhaoG,ZhangH,ShiLD.Long-termtreadmillexerciseinhibitstheprogressionofAlzheimer'sdisease-likeneuropathologyinthehippocampusofApp/pS1transgenicmice[J].BehavBrainRes,2013,1(256):261-272.[6]SelkoeDJ.Alzheimer'sdisease:genes,proteins,andtherapy[J].PhysiolRev,2001,81(2):741-66.[7]Vilalta-FranchJ,López-PousaS,Calvó-PerxasL,ShiLD.PsychosisofAlzheimerdisease:prevalence,incidence,persistence,riskfactors,andmortality[J].AmJGeriatrpsychiatry,2013,21(11):1135-1143.[8]DemirciS,AynalıA,DemirciK,DemirciS,ArıdoğanBC.TheSerumLevelsofResistinandItsRelationshipwithOtherproinflammatoryCytokinesinpatientswithAlzheimer'sDisease[J].ClinPsychopharmacolNeurosci,2017,15(1):59-63.[9]Wyss-CorayT,RogersJ.InflammationinAlzheimerdisease-abriefreviewofthebasicscienceandclinicalliterature[J].ColdSpringHarbPerspectMed,2012,2(1):a006346.[10]ZhaoL,ChenT,WangC,LiG,ZhiW,YinJ,WanQ,ChenL.Atorvastatininimprovementofcognitiveimpairmentscausedbyamyloidβinmice:involvementofinflammatoryreaction[J].BMCNeurol,2016,4(16):18.[11]HuJ,LinT,GaoY,XuJ,JiangC,WangG,BuG,XuH,ChenH,ZhangYW.TheresveratroltrimermiyabenolCinhibitsβ-secretaseactivityandβ-amyloidgeneration[J].PLoSOne,2015,10(1):e0115973.[12]ChengS,LeBlancKJ,LiL.TriptolidepreservescognitivefunctionandreducesneuropathologyinamicemodelofAlzheimer'sdisease[J].PLoSOne,2014,9(9):e108845.[13]StranahanAM,MartinB,MaudsleyS.Anti-inflammatoryeffectsofphysicalactivityinrelationshiptoimprovedcognitivestatusinhumansandmicemodelsofAlzheimer'sdisease[J].CurrAlzheimerRes,2012,9(1):86-92.[14]MathurN,PedersenBK.ExerciseasaMeantoControlLow-GradeSystemicInflammation[J].MediatorsInflamm,2008,2008:109502.[15]PetersenAMW,PedersenBK.Theanti-inflammatoryeffectofexercise[J].JApplPhysiol2005,98(4):1154-1162.[16]BaldwinAS.TheNF-kBandIkBproteins:newdiscoveriesandinsights[J].AnnuRevImmunol,1996,14:649-683.30 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山西医科大学硕士学位论文致谢我要感谢，特别感谢我的导师和荣丽老师。她带人热情随和，治学严谨细心。本课题从选题、实验设计、实验的完成、论文的多次修改离不开和老师的悉心指导和全力支持。在这里，我要特别诚挚的感谢杨桂姣老师和陆利老师，您们虽然不是我的导师，但在我的整个研究生期间却起到不可或缺的作用。在我研究生期间最困难的时候给予我及时的帮助和指导，最迷茫的时候给我指点迷津，引导我度过最艰难的日子。我要感谢赵云鹤老师、刘雪芹老师，张伟师兄、杨佳超师兄，感谢你们在我实验遇到难题的时候向我伸出援助之手，给予我正确的指导，让我少走很多弯路。我要感谢生理学系的杨菊师姐和时间生物学的徐云云师姐，你们毫无保留的将我所需的实验技术教给萍水相逢的我，让我的整个实验进行的更加的顺利。我要感谢牛晓洁和蒋蓉，在我遇到难题的时候你们竭尽全力的帮助我。我要感谢我的师妹—张楠，你的到来带给我更多的感动，让我从一个人的战斗变成两个人的团队，让我不再孤单。我要感谢师妹杨娜、赵雪纯、黄菲菲、周晓芳，你们给我的研究生生活带来更多的欢乐，和你们的相处让我的生活变得更加充实。我要感谢家人对我的支持和关心，给予我勇往直前的勇气。没有华丽的语言，只想表达最真挚的感谢。三年的生活有苦有乐，感谢你们陪我一路走过！33 山西医科大学硕士学位论文个人简历一、基本情况王莉智，女，1989年生，汉族，山西省太原市清徐县人。专业：人体解剖与组织胚胎学，主要研究方向：衰老与衰老相关疾病的机制与防治。二、学习工作经历（从大学起）2010年9月-2014年7月，山西医科大学汾阳学院，护理学系，护理学专业，学士2014年9月-2017年7月，山西医科大学，基础医学院，人体解剖与组织胚胎学专业，硕士三、研究成果发表文章第一作者文章王莉智,和荣丽,杨桂姣,张楠,刘成芳.自主跑轮运动对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力和海马炎性细胞因子表达的影响[J].中国运动医学杂志,2017,36(4):328-332.（中文期刊）。34