左卡尼汀胃肠道给药对2型糖尿病小鼠治疗作用的实验研究

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分类号：一：密级学校代码：硕士学位论文左卡尼汀胃肠道给药对型糖尿病小鼠治疗作用的实验研究夏蕴秋指导敉师王春波教授董静副教授学科专业名称药理学论文提夂期年月论文答辩《期年月日张岫美教授答辩委会席 摘要目的：复制高脂高糖链脲佐菌素(诱导的型糖尿病小鼠模型,建立型糖尿病模型小鼠血浆和肝脏组织中卡尼汀群柱前衍生化荧光高效液相色谱检测方法,从坐骨神经和肝脏的角度筛选并确定左卡尼汀灌胃给药对型糖尿病小鼠治疗作用的有效剂量及作用机制。方法：①复制型糖尿病小鼠模型：周龄高脂高糖喂养的雄性昆明种小鼠分别于周龄、周龄时两次腹腔注射后非空腹血糖高于者为型糖尿病模型。②实验设计：雄性昆明种小鼠分为对照组、型糖尿病模型组、卡尼汀给药组(、、次天,,每周测量非空腹血糖(周后酶法测定血浆和肝脏组织匀浆中含量,肝脏、脂肪称重,计算肝指数(肝脏与体重比值),肉眼及光镜下观察肝脏脂肪变性程度,电镜观察坐骨神经、肝脏超微结构,法测量血浆胰岛素、含量、坐骨神经匀浆含量、肝脏组织匀浆含量。将小鼠尾部末端浸入温度为±°的水中,记录连续灌胃周各组小鼠甩尾潜伏期,及成模周后连续中剂量卡尼汀给药周小鼠甩尾潜伏期。③法检测各组小鼠血浆和肝脏组织中卡尼汀群含量。样本经蛋白沉淀处理后,用氨基蒽将样本荧光衍生化,荧光高效液相色谱方法测定,血浆和肝脏组织匀浆中左卡尼汀(、乙酰左卡尼汀、丙酰左卡尼汀含量。采用软件对实验数据进行分析。结果：①高脂高糖喂养联合两次腹腔注射低剂量诱导正常小鼠成为型糖尿病动物模型,第次注射后血糖高于为复制模型成功。②型糖尿病小鼠肝指数高于对照小鼠,血浆、肝脏内水平显著高于对照小鼠(,肝脏水平高于对照小鼠(,肝脏可见明显脂肪病变,超微结构肝脏线粒体肿胀、粗面内质网扩张,坐骨神经髓鞘结构模糊、髓鞘板层分离、轴突萎缩,血浆胰岛素、、坐骨神经匀浆水平与对照小鼠无明显差异(〉。经、治疗后,小鼠肝指数下降(,血浆、肝脏内水平下降(,血浆胰岛素水平显著升高(肝脏线粒体形态基本正常,粗面内质网清晰,脂肪滴减少；坐骨神经髓鞘结构较完整,少量纤维髓鞘板层结构疏松,轴突形态 饱满。型糖尿病小鼠的甩尾潜伏期在成模周时低于对照组小鼠(,、剂量组甩尾潜伏期在整个过程中均无变化,与模型组相比其周的甩尾潜伏期明显延长(治疗组在成模周时甩尾潜伏期短于正常小鼠(,但与模型组小鼠相比程度明显较轻(。延迟给药组在成模周时,甩尾潜伏期明显低于对照组,经治疗周后,与模型组相比甩尾潜伏期延长治疗周时,甩尾潜伏期与对照组差异无显著性,长于模型组③荧光高效液相色谱法可同时检测型糖尿病小鼠血浆和组织匀浆中、和的含量,其中含量低于样品的线性范围。型糖尿病小鼠血浆中、的含量、肝脏中的含量均明显降低(,口服后小鼠血浆中的、明显升高(,。结论：成功复制型糖尿病小鼠模型。建立型糖尿病模型小鼠血桨和肝脏组织中卡尼汀群柱前衍生化荧光高效液相色谱检测方法。并发坐骨神经、肝脏病变的型糖尿病小鼠血浆、、肝脏水平明显降低。灌胃给药通过升高血浆、、胰岛素水平,降低含量改善型糖尿病小鼠坐骨神经、肝脏病变。硕士研究生夏蕴秋(药理学)导师王春波教授董静副教授关键词：型糖尿病；左卡尼汀；外周神经病变；脂肪肝；脂代谢 ExperimentalStudyontheEffectionofL-carnitineonType2DiabeticmicebygastrointestinaladministrationABSTRACTSubjectrToreplicateatype2diabeticmicemodelinducedbyhigh-fathigh-glucosedietandstreptozotocin(STZ).TodevelopaHPLC-FLmethoddetermineL-carnitine(LC)anditsacylesterslevelsintype2diabeticmiceplasmaandliverhomogenate.ToselecttheeffectivedoseofL-carnitineontype2diabeticmicebygastrointestinaladministrationandexplorethemechanismbystudyingneuropathyandliverdisease.Methods:①°① ②、丄, Postgraduatestudent:Yun-QiuXia(pharmacology)DirectedbyProf.Chun— 目录弓言第一章试验材料仪器实验药品和试剂试验动物第二章试验方法试验设计血糖的测定血浆采集组织低温匀浆制备法测定血浆、肝组织匀桨中卡尼汀群含量法测定血衆中胰岛素含量小鼠甩尾潜伏期测量坐骨神经、肝组织电镜处理法测定含量肝组织切片油红染色血浆和肝脏匀浆中含量测定含量测定图像处理与统计学分析第三章试验结果型糖尿病小鼠成模率及稳定性 3.2HPLC-FL法测量血浆、肝脏(匀浆)中卡尼汀群含量对型搪尿病小鼠血桨中胰岛素含量的影响对型糖尿病小鼠厄尾潜伏期的影响对型搪尿病小鼠坐骨神经超微结构的影响对型搪尿病小鼠血桨、坐骨神经中含量影响对型搪尿病小鼠肝脏形态的影响对型搪尿病小鼠肝脏重量及肝脏指数的影响对型塘尿病小鼠脂肪代谢的影响第四章讨论结论参考文献文献综述综述参考文献攻读硕士学位期间的研究成果附录学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明 左卡尼汀胃肠道给药对型糖尿病小鼠治疗作用的实验研究流行病学调查发现,我国型糖尿病的年增患病率超过了,由年的、年的,增加到年。糖尿病神经病变(是糖尿病最常见和最复杂的并发症之一,大约发生在近的糖尿病患者中。目前还没有针对糖尿病神经病变的有效药物。最早将或其酰化物一乙酰化左卡尼汀(,用于临床治疗的是意大利科学家和,他们发现可提高糖尿病患者的神经传导速度、改善痛觉感知异常等症状,且具有良好的耐受性。但缺乏对型糖尿病治疗作用的实验研究。关于及其酰化物对的作用机制,目前有诸多观点,但尚无确切证据支持,而胰岛素样生长因子(,包括胰岛素、及对的作用及机制已有较深入的研究。故在科技部支撑计划和山东省自然科学基金的资助下,开展对型糖尿病小鼠量效关系的实验研究,特将临床用量按体表面积折算,确定口服的治疗量；并进行与的相关性研究,探讨的作用机制。周知,脂肪代谢紊乱主要发生于肥胖者和型糖尿病患者。持续的游离脂肪酸增加导致胰岛细胞和肝细胞的损伤。的型糖尿病患者患有非酒精性脂肪肝而在肥胖的型糖尿病患者中患病率更是高达。是一种自然存在于所有哺乳动物体内的一种小型极性分子,能激活脂肪代谢的限速酶,将长链脂酰导入线粒体内,进行氧化。转运脂肪进入线粒体的同时,在肉碱乙酰转移酶(的作用下,与乙酰基结合生成,减少乙酰基在线粒体中与游离的结合,从而提高线粒体中与乙酰的比例,增加丙酮酸脱氢酶(的活性和促进糖代谢,最终有利于脂肪的进一歩分解。年韩国科学家等将用于患者的临床治疗,发现能改善患者的肝功能。鉴于肝脏卡尼汀群含量和超微形态的相关性研究未见报道,本次研究旨在建立型糖尿病小鼠模型的基础上,探究对型糖尿病小鼠血脂的影响和肝脏的形态学变化。早在年,法国科学家等就研究了左卡尼汀对糖尿病体液平衡变化的作用。其后左卡尼汀及其酰化物对糖尿病的治疗研究在国外陆续开展,但未见卡尼汀尤其是卡尼汀群在型糖尿病小鼠血漿及组织中含量的相关性研究。本实验通过建立荧光衍生化高效液相色谱同时测定血衆和组织匀装中的、及浓度的检测方法,为将及其酰化物用于糖尿病治疗研究,提供确切的药物浓度参数和试验依据。 fr岛火学硕十学位论文第一章试验材料仪器快速血糖测定仪(德国贝朗高效液相色谱仪(美国双通道紫外检测器(美国荧光检测器(美国电热恒温箱(北京八方世纪科技技术有限公司)离心机(德国雅培公司)离心机(上海手术器械厂)涡旋振荡器(公司)超声振荡器(昆山市超声仪器有限公司)型酸度计(美国纯水发生器(密理博上海公司)冰冻切片机(德国电动匀衆器(德国酶标仪(北京技术有限公司)全自动生化分析仪(意大利,电子显微镜―(光学显微镜(德国电子天平(梅特勒托利多上海仪器公司)分析天平(梅特勒托利多上海仪器公司)微量加样器(德国实验药品和试剂链脲佐菌素(公司血糖试纸(德国贝朗柠檬酸分析纯)(天津广成化学试剂有限公司柠檬酸钠分析纯)(天津广成化学试剂有限公司胰岛素测定试剂盒(南京建成生物工程研究所游离脂肪酸测定试剂盒(南京建成生物工程研究所胰岛素样生长因子测定试剂盒(南京建成生物工程研究所甘油三酯测定试剂(上海复星长征医学科学有限公司油红饱和液(上海迈坤化工有限公司 笫一章试验材料氏苏木素(北京益利精细化学品有限公司甘油(上海圣亚化工有限公司左卡尼汀标准品(东北制药总厂批号乙酰左卡尼汀标准品(东北制药总厂批号丙酰左卡尼汀标准品(沈阳东宇精细化工有限公司批号对溴苯甲酰甲基溴化物色谱纯)(公司)四丁胺,色谱纯)(公司)氨基蒽(公司)乙基二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(公司)甲醇色谱纯)(美国批号乙腈色谱纯)(美国批号异丙醇色谱纯)(天津四友生物医学技术公司丙酮分析纯)(山东莱阳精细化工厂乙醚分析纯)(山东莱阳精细化工厂氯仿分析纯)(山东莱阳精细化工厂乙酸铵分析纯)(北京化工厂三乙醇胺色谱纯)(镇江化剂厂盐酸分析纯)(连云港化学试剂厂冰醋酸分析纯)(美国磯酸分析纯)(连云港化学试剂厂憐酸二氢钠(分析纯)(广东省金砂化工厂瞵酸氢二钠(分析纯)(上海市化学试剂公司氢氧化钠(分析纯)(青岛市海滨化学试剂总厂超纯水(青岛大学医学院附属医院)试验动物昆明种小鼠,级,雄性,周龄,,由青岛市药品检验所提供。饲养于温度°°：,湿度,风速,气流》次时环境中。高脂高糖饲料由糖、脂肪、蛋黄、基础饲料组成,实验过程中小鼠自由摄食、饮水。第二章试验方法试验设计诱导型糖尿病小鼠模型制备：小鼠周龄时给予高脂高糖饲料喂养, 靑岛人学硕士学位论文周龄和周龄时分别空腹腹腔注射溶液(溶于的枸橼酸、枸橼酸钠缓冲液。于第二次注射后测非空腹血糖(,的即为型糖尿病小鼠。雄性昆明种小鼠被随机分为组,对照组：仅高脂高糖词料喂养,血糖正常小鼠只(,次天,型糖尿病模型组只(,次天,型糖尿病高、中、低剂量治疗组各只,于成模当天开始给予、、次天,。实验持续周,每周测量血糖,末次给药后禁食,称量动物体重,内眦取血,剖取肝脏、脂肪称重,计算肝指数(肝脏与体重比值),肉眼及光镜下观察肝脏脂肪变性程度,电镜观察坐骨神经、肝脏超微结构,法测量血装中、胰岛素含量、坐骨神经匀柴含量、肝脏组织匀浆游离脂肪酸(含量,酶法测定血浆和肝脏组织匀浆中甘油三酯(含量。柱前衍生化荧光高效液相色谱法检测血浆和肝脏组织匀浆中和含量。雄性昆明种小鼠被随机分为组,对照组：仅高脂高糖饲料喂养,血糖正常小鼠只(,次天,型糖尿病模型组只(,次天,型糖尿病高、中、低剂量治疗组各只,于成模当天开始给予、次天,,延迟给药只(待糖尿病小鼠出现痛觉异常时再给药),于成模周时给予,次天,。实验持续周,每周测量小鼠甩尾潜伏期。血糖的测定―将血糖测定仪打开,插入血糖试纸,备用。将小鼠装入鼠固定器中固定,用尖锐针头刺破小鼠尾静脉,血液迅速流出,约左右时,将血糖试纸测试部位放于血滴上,使血覆盖住测试部分,读数,记录。血柴采集小鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯(麻醉,以左手拇指、食指握住小鼠头部,暴露一侧眼球,取长约的毛细玻璃管,与鼠面成°夹角,由内眦刺入,感到有阻力时停止推进,轻轻旋转毛细管,血液便自动流进毛细管中。将血液收集于抗凝管中,分离血衆。组织低温匀衆制备每只小鼠各取肝组织,在冰冷的生理盐水中漂洗,去血液,滤纸擦干称重。放入的大试管中,加入倍于肝脏重量的生理盐水,配制成肝组织混合物。用组织匀柴机将上述配好的混合物捣碎,,, 第二章试验方法次。组织匀装的过程要在冰水浴中进行。勾浆后的组织液用移液枪移取上清液入大离心管中,,。取离心后的上清液加入管中,标记名称、浓度,时间。另取上清备份,封口膜封口,装入塑料袋储存于冰箱待用。按上法,制备坐骨神经组织匀浆。法测定血装、肝组织匀浆中卡尼汀群含量色谱条件：色谱柱：,流动相：乙腈—乙酸铵流速：检测波长：,进样量：贮备溶液和标准溶液的制备衍生化试剂的配制：精密称取丙酮溶解并定容至,得贮备液；溶液用前配制：用磷酸二氖钠溶解并定容至。标准贮备液和混合标准液：分别精密称取标准品,和和、分别用水溶解并定容至得浓度分别为、、—备溶液,分别精密量取：、和备液、、混合,用水定容至即为混合标准液,其、和的浓度分别为—、冷藏保存。标准样品：分别精密量取混合标准液、、、、用水定容至,配置标准样品、和的浓度系列分别为：、、、、、、—、、、、、、—七和、、、、、、冷藏保存。血装及肝组织匀浆样品处理取血漿样品,加入乙腈,涡旋混合,—离心,取上清液,依次加入磯酸缓冲液—盐酸涡旋混合,加入溶液,然后边涡旋边缓缓加入溶液,混匀后避光、室温反应。衍生化完成后,用乙醚洗涤两次,每次,取出乙醚相,然后在水相中加入磯酸缓冲液,涡旋混合,用三氯甲烷洗涤两次,每次,取水 靑岛大学硕士学位论文相,加磯酸缓冲液,涡旋混合,取进样分析。肝组织匀浆样品处理同血柴样品处理。标准曲线的绘制不同浓度的标准样品溶液,按方法处理,以样品峰面积为横坐标,样品浓度(—为纵坐标作线性回归。得标准样品的线性回归方程。法测定血柴中胰岛素含量试验原理：应用双抗体夹心法测定标本中小鼠胰岛素水平。用纯化的小鼠抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入再与标记的抗体结合,形成抗体抗原酶标抗体复合物,经过彻底洗漆后加底物显色。在酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的呈正相关。用酶标仪在波长下测定吸光度(值),通过标准曲线计算样品中小鼠浓度。试验方法：配置标准品：用试剂盒提供的标准品,按说明书进行稀释。配制成浓度分别为的标准品。分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上准确加样标准品,待测样品孔中先加样品稀释液,然后再加待测样品样品最终稀释度为倍)。将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置°温育分钟。将倍浓缩洗潘液用蒸馏水倍稀释后备用。小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置秒后弃去,如此重复次,拍干。每孔加入酶标试剂,空白孔除外。用封板膜封板后置°温育分钟。小心揭掉封板膜,弃去液体,鬼干,每孔加满洗漆液,静置秒后弃去,如此重复次,拍干。每孔先加入显色剂人,再加入显色剂,轻轻震荡混匀,°避光显色分钟。每孔加终止液,终止反应(此时蓝色立转黄色)。在加终止液后分钟以内进行。以空白空孔调零,波长依序测量各孔的吸光度(值)。以标准物的浓度为横坐标,值为纵坐标,计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。小鼠甩尾潜伏期测量测量小鼠的鬼尾潜伏期是为衡量糖尿病对小鼠坐骨神经的痛阈改变。将小鼠尾 第二章试验方法部末端(厘米左右)伸入温度为±°的水中,用秒表记录小鼠尾端进入水中到第一次明显鬼动的时间。小鼠甩尾潜伏期的测量从第二次注射后次开始,每隔测量次。坐骨神经、肝组织电镜处理各小鼠在冰块上用锋利的刀快速取坐骨神经、肝组织左右,立即放入戊二酸固定液中。戊二酸固定后充分浸洗,然后转入锇酸固定。脱水：乙醇分钟一乙醇分钟一乙醇分钟一乙醇分钟一乙醇分钟一乙醇分钟浸透和包埋：脱水后的组织入丙酮、环氧丙烷等量混合液分钟,再依次置于环氧丙浣分钟、环氧丙烧分钟、环氧丙垸、包埋剂(环氧树脂包埋剂)等量混合液数小时、纯包埋剂数小时,烘干包埋板,将包埋的组织进行超薄切片。电子染色：醋酸铀滴注染色分钟,清洗次,再柠檬酸铅滴注染色分钟。完成染色的切片电镜下观察,拍片存档。法测定含量试验原理：应用固相夹心法测定样品中的含量。先将和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过的。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物、,和酶结合物同时作用,产生颜色。颜色的深浅和样品中的浓度呈比例关系。用酶标仪在波长下测定吸光度(值),通过标准曲线计算样品中浓度。试验方法：用试剂盒提供的标准品,按说明书进行稀释。配制成浓度分别为、的标准品。将洗漆缓冲液用蒸馏水稀释倍,备用。分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上准确加样标准品,待测样品用标本稀释液稀释后加入于反应孔内。立即加入的生物素标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,°温育小时。甩去孔内液体,每孔加满洗漆液,振荡秒,鬼去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作次。如果用洗板机洗涤,洗漆次数增加一次。每孔加入的亲和链酶素,轻轻振荡混匀,温育分钟。甩去孔内液体,每孔加满洗漆液,振荡秒,甩去洗漆液,用吸水纸拍干。重复此操作次。每孔加入底物、各,轻轻振荡混匀,°温育分钟。避免光照。取 靑岛大学硕士学位论文出酶标板,迅速加入终止液,加入终止液后应立即测定结果。在波长处测定各孔的值。以标准物的浓度为横坐标,值为纵坐标,计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。肝组织切片油红染色各小鼠肝左叶同一部位剖取部分肝组织,包埋,°冷冻。肝组织冰冻切片。蒸馆水充分洗漆分钟。油红稀释液染分钟,避光、密封。(油红稀释液的配制：取油红饱和液毫升,加蒸馏水毫升,静置分钟后过滤后使用)乙醇镜下分化至间质清晰(秒)。水先。氏苏木素复染核(分钟)。水洗秒。甘油明胶封片。镜下观察,拍片。染色结果：脂肪呈鲜红色,细胞核呈蓝色,间质无色。血浆和肝脏匀浆中含量测定试验原理：应用酶比色法测定样品中的含量。样品中的甘油三酯经下述反应,产生醌亚胺。甘油三酯甘油脂肪酸甘油—磷酸甘油憐酸甘油憐酸二羟丙酮氨基安替比林醌亚胺醌亚胺为红色化合物,在波长处测量吸光度,其大小与样品中含量成正比。试验方法使用全自动生化分析仪,设置检测条件为温度°,反应时间波长。含量测定试验原理：应用双抗体体夹心酶标免疫法测定标本中含量。用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入抗原、生物素化的抗体、标记的亲和素,经过彻底系的后用底物显色。在酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的呈正相关。用酶标仪在波长下测定吸光度(值),通过标准曲线计算样品中浓度。试验方法：用试剂盒提供的标准品,按说明书以样品稀释液进行倍比稀释。配置浓度分别 第二章试验方法为的标准品,样品稀释液直接作为标准浓度临用前分钟内配制。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液,余孔分别加标准品或待测样品,加样时将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,°反应分钟。弃去液体,鬼干,不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液取生物素标记抗体加生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),：温存分钟。弃去孔内液体,鬼干,洗板次,每次浸泡分钟,每孔,甩干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液),°温育分钟。弃去孔内液体,甩干,洗板次,每次浸泡分钟,每孔,甩干。依序每孔加底物溶液,°避光显色分钟内,此时肉眼可见标准品的前孔有明显的梯度蓝色,后孔梯度不明显,即可终止。依序每孔加终止溶液,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应与底物液的加入顺序相同。在加终止液后分钟以内进行检测。用酶联仪在波长依序测量各孔的光密度(值)。以标准物的浓度为横坐标,值为纵坐标,计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的值代入方程式,计算出样品浓度。图像处理与统计学分析用对肝组织切片油红染色照片进行图像处理厂计算呈鲜红色的脂滴面积占整个切片面积的百分比。计量资料用土表示,软件进行单因素方差分析及检验,被认为具有统计学意义,具有显著统计学意义。第三章试验结果型糖尿病小鼠成模率及稳定性只造模小鼠在第二次注射后有只,不符合动物模型标准。成模率为。实验过程中模型组小鼠始终保持在以上,远远高于对照组小鼠的值。第二次注射后各周模型组小鼠显著高于第二次注射前,但成模后各周模型组小鼠水平无差异性(。见表。 靑岛人学硕士学位论文表高脂高糖喂养联合两次低剂量注射对小鼠值作用士,第二次注射分组—前对照高脂高±±±±±±糖)模型高脂高士士土士土糖―■与对照相比,与第二次注射前相比法测量血衆、肝脏(匀浆)中卡尼汀群含量法色谱图；分别取标准样品、血衆、肝组织匀衆,按项下方法处理,得标准样品、血衆和肝组织匀浆色谱图,见图,图,结果显示,在测定时间范围内,血衆和肝组织色谱图无测定成分的干扰峰,标准样品色谱图和峰形良好,分离完全。血浆、肝组织匀衆在对应的时间分别检测出：、。部分样本中的含量低于检测线,故不予统计。嶋■■議叫；贿—图标准样品高效液相色谱图■ 第二章试验结果——…———■■：■露」蘭—乂、八一、入八—■一―：囊图血浆高效液相色谱图标准曲线不同浓度的标准溶液,按方法处理,以样品浓度(为纵坐标,样品峰面积为横坐标作线性回归。得、、的线性回归方程和标准曲线,见表和图。表、和回归方程与线性范围纸分冋归方程相关系数线性范—山纏 青岛人学硕士学位论文―山續浓度标准曲线：峰面积图：、、标准曲线图精密度试验在标准曲线范围内选择高、中、低浓度的标准溶液,每一个浓度依次测定次,得、、血衆浓度的精密度,结果均小于。测定结果见表。表、和精密度结果(三士测定浓度浓度(％浓度浓度(％浓度浓度(％±±±±士±±±±对型糖尿病小鼠血浆、水平的影响 第二章试验结果型糖尿病小鼠血衆中,含量为±,明显低于对照组±；的含量为±也低于对照组±。经治疗后,各剂量组小鼠血浆的和含量均显著高于模型组(,,详见表。表治疗周对型糖尿病小鼠血衆与的含量的影响士分组对照高脂高糖)±±模高脂高糖±±±±严±±±±与对照相比,与模型组相比,对型糖尿病小鼠肝脏、水平的影响型糖尿病小鼠肝脏中含量明显低于对照组(,治疗周后,各治疗组小鼠的肝脏含量有所提高,但无统计学意义(。型糖尿病小鼠肝脏中含量与对照组小鼠水平差异无显著性(治疗周后,高剂量组小鼠肝脏水平明显提高(,中、低剂量组小鼠的肝脏含量有所提高,但无统计学意义(〉。型糖尿病小鼠肝脏中比值与正常小鼠水平差异无显著性(,治疗周后,高剂量组小鼠肝脏比值明显降低(,中、低剂量组小鼠的肝脏比值降低(。详见表。表治疗周对型糖尿病小鼠肝脏与含量及比值的影响±肝脏匀装分组对照高脂高糖)±士士模高脂高糖±±±±±±±±±±±±与正常对照相比,与模型组相比,对型糖尿病小鼠血浆中胰岛素含量的影响糖尿病模型小鼠血漿胰岛素水平与对照组小鼠略有降低,但差异无显著性( 靑岛人学硕士学位论文〉。经治疗后,中剂量组小鼠血浆胰岛素水平显著升高(、低剂量组小鼠血装胰岛素水平也有所提高(,高剂量组小鼠血衆胰岛素水平有所升高,但无统计学意义(〉,详见表。表对型糖尿病小鼠血楽胰岛素含量的影响(孓±,分组对照高胎高糖)±模？高脂高糖±±±±与模型组相比,,对型糖尿病小鼠思尾潜伏期的影响型糖尿病小鼠的甩尾潜伏期在成模周时低于对照组小鼠(,、周时差异更加明显(周时尼尾潜伏期有所延长但仍低于对照组小鼠,周时甩尾潜伏期与正常对照小鼠差异无显著性(〉。经高、中剂量治疗的小鼠,鬼尾潜伏期在整个过程中均无变化,与型糖尿病小鼠相比其周的鬼尾潜伏期明显延长(低剂量治疗组小鼠在成模周时甩尾潜伏期短于正常小鼠(,但与型糖尿病小鼠相比程度明显较轻(。延迟给药组糖尿病小鼠在成模时,甩尾潜伏期明显低于正常小鼠(,成模周后给予治疗,周时(成模周),甩尾潜伏期虽短于正常小鼠(,但长于型糖尿病小鼠(治疗周时,甩尾潜伏期与正常小鼠差异无显著性(〉,长于型糖尿病小鼠(。详见表,图、。表对成模周型糖尿病小鼠甩尾潜伏期的影响(孓±,成模大成模周成模周成模周成模周对照高胎高糖)±±±±±±±±±±±±±±±±±±±± 第二章试验结果表对成模周型糖尿病小鼠甩尾潜伏期的影响(土成校周成投周成模周成模周对照高脂高糖)±模型高脂高糖丄；土±±±±±±±：±±±±±±±±周±±±±与对照相比,与模型相比,：——对照：模型、高剂量。——中剂量一一一——低剂量《成模吋间(周)图口服不同剂量对型糖尿病小鼠甩尾潜伏期的影响—；模型、延迟给药■一一一―吋间周)图对已出现痛觉敏感型糖尿病小鼠甩尾潜伏期的作用对型糖尿病小鼠坐骨神经超微结构的影响：对照组小鼠坐骨神经有髓神经纤维形状近似圆形,排列规则；髓鞘清晰完整、 青岛大学硕士学位论文厚度均匀、板层结构呈同心圆形紧密排列；轴突形态完整且可见神经微丝；神经纤维间可见雪旺氏细胞分布,其形态结构正常,神经丝丰富；仅少量神经纤维的髓鞘；结构疏松、有空泡状缺损(图—、。成模后周的型糖尿病小鼠坐骨神经,大量有髓神经纤维髓鞘结构模糊、松散、排列紊乱,髓鞘板层分离,出现空泡状缺损；有的髓鞘出现板块状脱髓和节段性脱髓鞘；轴突萎缩,甚至完全消失；无髓神经减少(图—、高剂量治疗周的糖尿病小鼠坐骨神经有髓神经饱满,髓鞘结构基本完整,厚薄较均匀,偶见空泡状缺损；雪旺氏细胞形态正常(图—、中剂量治疗周的糖尿病小鼠坐骨神经有髓神经纤维排列较整齐,髓鞘结构较完整,少量纤维髓鞘板层结构疏松；轴突形态较完整；雪旺氏细胞形态基本正常(图—、。低剂量治疗周的糖尿病小鼠有髓神经纤维髓鞘结构模糊、松散、排列紊乱,部分髓鞘脱失；轴突面积缩小；无髓神经减少图—、。■ 第二章试验结果图对型糖尿病小鼠坐骨神经超微结构的影响,—对照组,,—模型组,—高剂量治疗组,,—中剂量治疗组,： 青岛人学硕士学位论文】,—低剂量治疗组图中标示：―,轴突―,髓鞘无髓神经纤维(雪旺氏细胞)对型糖尿病小鼠血浆、坐骨神经中含量影响成模周时,型糖尿病小鼠血衆、坐骨神经中的含量与对照组小鼠含量差异无显著性(。经口服治疗后,各剂量组小鼠血浆、坐骨神经中的含量与模型组小鼠含量差异也无显著性(〉,详见表。表对型糖尿病小鼠血浆、坐骨神经中含量影响(三士坐骨神经对照仅高脂)±模型高脂±±±±±±±±对型糖尿病小鼠肝脏形态的影响肉眼观察小鼠肝脏外观对照组小鼠肝脏呈红褐色,质地柔软,表面光滑而富有弹性,边缘锐利(图。型糖尿病小鼠的肝脏体积明显增大,颜色呈灰黄色,表面现粗糙颗粒状、肝叶边缘圆钝,呈典型肝脂肪变现象(图。高、中剂量治疗组小鼠的肝脏表面较光滑,体积略有增大,肝叶边缘锐利,较糖尿病组有明显改善(图、。低剂量治疗组小鼠的肝脏表面虽可见颗粒,但明显少于模型组,体积有所增大,较糖尿病组有部分改善(图。 第二章试验结果图对型糖尿病小鼠肝脏外观改变的作用对照组模型组高剂量治疗组中剂量治疗组低剂量治疗组对型糖尿病小鼠肝脏切片显微图像的影响油红染色后显微镜观察结果显示,型糖尿病小鼠肝脏脂肪病变明显加重,显微镜下可见肝细胞大泡性脂变和零星的肝细胞坏死,经图像处理,脂肪面积占整个面积的±,远高于对照组小鼠的±随着左卡尼汀用药浓度的增加,小鼠肝脏脂肪病变依次减轻。治疗周后,低剂量组小鼠肝脏切片中的脂肪面积为±,虽较正常对照小鼠有所增高(,但已低于型糖尿病小鼠(。中剂量组小鼠肝脏切片脂肪面积±,高剂量组小鼠肝脏切片脂肪面积±,均明显低于型糖尿病小鼠(,与对照组小鼠无显著差异(。见图。■ 靑岛人学硕士学位论文：默套：變,■纖图对型糖尿病小鼠肝脏切片油红染色后显微镜下图像影响对照组模型组高剂量治疗组中剂量治疗组低剂量治疗组对型糖尿病小鼠肝脏超微结构变化的作用电镜图像显示,对照组小鼠肝脏细胞器完整,线粒体形态基本正常,仅有少量线粒体嵴消失,可见清晰的粗面内质网、致密的核膜(图。成模周的型糖尿病小鼠肝细胞出现明显的线粒体肿胀,大部分的线粒体嵴和膜融合,电子密度增加,提示代谢障碍,粗面内质网扩张,并有明显的脱颗粒现象,可见细胞质糖原颗粒增加,这是型糖尿病的特征性病变(图。经高剂量左卡尼汀治疗后,糖尿病小鼠肝细胞的线粒体形态趋于正常,可见清晰的线粒体嵴、粗面内质网(图。中剂量治疗组小鼠线粒体形态基本正常,粗面内质网清晰,可见糖原颗粒(图。低剂量治疗小组小鼠线粒体基本正常,有少量线粒体嵴消失,部分粗面内质网有脱颗粒现象,核膜致密(图。■ 第二章试验结果；—―图对型糖尿病小鼠肝脏超微结构的作用对照组模型组高剂量治疗组中剂量治疗组低剂量治疗组对型糖尿病小鼠肝脏重量及肝脏指数的影响型糖尿病小鼠的肝脏重量及肝指数均显著高于对照小鼠,高剂量治疗组小鼠肝脏重量、肝脏指数显著降低、中剂量治疗组小鼠肝脏重量及肝指数均有所下降(,低剂量治疗组小鼠肝脏重量及肝指数略有降低,但无统计学意义(。成模周的型糖尿病小鼠体重比对照组小鼠体重有所下降,但无统计学意义(。详见表。 靑岛人学硕士学位论文表口服周对型糖尿病小鼠肝脏重量及肝脏指数的影响(士体重肝脏指数对照高脂高糖)模型高船高糖±±±±±±±±±±±对照组相比,；与模型组相比,对型糖尿病小鼠脂肪代谢的影响对型糖尿病小鼠体内脂肪含量的影响型糖尿病小鼠体内脂肪重量比对照组小鼠明显减少(,口服治疗周后,各剂量治疗组小鼠脂肪重量与模型组相比无统计学意义(〉。详见表。对型糖尿病小鼠血浆及肝脏匀柴中的含量的影响型糖尿病小鼠血衆、肝脏内水平显著高于对照组小鼠(。各剂量治疗组小鼠血衆、肝脏内水平均低于模型组小鼠(、。详见表。对型糖尿病小鼠肝脏匀浆中的含量的影响型糖尿病小鼠肝脏水平高于对照组小鼠(。低剂量治疗组小鼠肝脏水平低于模型组小鼠(,高、中剂量治疗组小鼠肝脏水平有所下降,但无统计学意义(〉。详见表。表对型糖尿病小鼠体内脂肪重量、血浆及肝脏匀衆中、含量的影响；±血浆肝脏匀衆肝脏匀漿分组对照高脂高糖)模巧月阿糖±士±±±±±±±±±±±±±±常对照组相比与模型组相比, 第四章讨论第四章讨论型糖尿病是一种慢性代谢性疾病,表现为胰岛素分泌相对不足或产生胰岛素抵抗。大部分型糖尿病患者有不同程度的肥胖,肥胖会导致胰岛素抵抗。目前复制型糖尿病动物模型的方法主要有以下几类：自发性糖尿病模型,这种模型遗传因素占主导地位,不能体现环境因素在型糖尿病发病中的诱导因素,且来源少,价格昂贵。化学药物如链脲佐菌素(损伤模型,胰岛细胞损伤的程度取决于的用量,小剂量可用于型糖尿病模型的诱导,但该模型胰岛素分泌缺乏的特点与型糖尿病病理特征不符。特殊膳食诱导法,以高脂高糖饲料使动物细胞负荷过重而萎缩,这种模型与人类型糖尿病发病情况接近,模型较稳定,但造模过程长、成本高。特殊膳食联合化学药物损伤模型是目前最为常用的型糖尿病模型。在本实验中,选用了高能量喂养联合低剂量诱导的糖尿病模型的造模方法。先以高糖高脂饮食周诱导小鼠产生胰岛素抵抗,再以两次低剂量腹腔注射造成胰岛细胞轻度损伤,该方法既有显著胰岛素抵抗又有胰岛细胞部分受损,很好的模拟了人类型糖尿病发病机的特点。在试验中,造模的成功率高达,且稳定性好,型糖尿病小鼠实验中血糖始终维持较高的水平。该方法比特殊膳食诱导法所需时间短,比自发性糖尿病模型费用低,是一种较为理想的型糖尿病小鼠模型造模方式。周知,型糖尿病又称非胰岛素依赖型糖尿病,其胰岛素绝对水平并不降低。试验中,型糖尿病小鼠胰岛素水平与正常对照小鼠胰岛素水平差异无显著性,而血糖水平明显升高。说明型糖尿病小鼠已存在胰岛素抵抗,同时出现多饮、多食、多尿等型糖尿病典型症状。成模周时型糖尿病小鼠的体重与正常小鼠相比随有所下降,但差异无显著性,其原因可能与动物数量较少有关。是因糖尿病高血糖状态及其所致各种病理改变而导致的神经损伤,包括轴突变性和节段性脱髓鞘。本次试验中,电镜观察型糖尿病小鼠坐骨神经超微结构发现,其有髓神经纤维髓鞘结构模糊、松散、排列紊乱,髓鞘板层分离,出现空泡状缺损；有的髓鞘出现板块状脱髓和节段性脱髓鞘；轴突蒌缩,甚至完全消失；无髓神经减少。的症状和体征取决于神经纤维的类型,大纤维病变影响本体感觉和光感,小纤维病变影响痛觉和温度感知,导致感觉异常和神经痛【。在本次试验中,观察到型糖尿病小鼠在成模周时出现了明显的甩尾潜伏期缩短。热痛阈是糖尿病小鼠的常见检测指标,、等都在实验性的研究中将热痛阈作为检测指标。等人在研究中发现诱导的型糖尿病小鼠在成模后周时出现痛觉敏感,而在周时出现了痛觉减退。而在本次试验中,并未 靑岛火学硕士学位论文观察到型糖尿病小鼠的痛觉减退,笔者认为可能源于糖尿病模型类型的差别。观点与等人吻合,他们在长达年的临床研究中发现,虽然型糖尿病患者中的发病率更高,但型糖尿病的发生和进展更为严重,其原因可能与型糖尿病发生时,胰岛素、和肽的缺失与型糖尿病有所不同,型糖尿病所致的痛觉减退通常出现在患者晚期。型糖尿病多伴有脂代谢异常,其原因在于胰岛素分泌相对不足导致抑制脂肪分解的作用减低,外周脂肪的消耗加大,使血液中和水平上升；大量的脂肪酸汇集到肝脏,同时型糖尿病所致的减少使的活性降低,不能将大量的脂肪酸转运入线粒体,使得肝脏中和明显增加。故型糖尿病患者常伴有、水平升高。本次实验中,型糖尿病小鼠成模四周时,血浆中的、肝脏内的和水平高于对照小鼠；同时外周脂肪重量减少,肝脏质量增加。型糖尿病小鼠肝脏肉眼观察可见表面粗糙颗粒、颜色异常；油红染色光镜下观察可见肝细胞大泡性脂变和零星的肝细胞坏死,脂肪滴明显增多；电镜下肝细胞出现明显的线粒体肿胀,大部分的线粒体嵴和膜融合,电子密度增加,粗面内质网扩张,并有明显的脱颗粒现象,都证明了型糖尿病所致的肝脂肪变。本次试验建立的型糖尿病模型小鼠血浆和肝脏组织中卡尼汀群柱前衍生化荧光高效液相色谱方法,在课题组以前建立的人体血浆卡尼汀群检测方法的基础上加以改进,能同时检测小鼠血衆和肝脏组织中、和的含量。该方法具有灵敏度、准确度较高,特异性较强的特点。检测结果发现含量低于检测线,故未进统计。型糖尿病小鼠血漿中,！：含量为±,明显低于对照组±；的含量为±—也低于对照组±笔者认为型糖尿病并发症的产生与体内的缺乏有关,临床研究也发现,糖尿病患者(型和型)体内存在缺乏的现象,当糖尿病并发视网膜病变、高血脂症及神经病变时,血衆中游离的左卡尼汀含量和左卡尼汀总量更加低于无并发症的糖尿病患者。此前,已有报道对患者的临床治疗作用,可减轻患者疼痛、提高身价传导速度、促进神经再生等—。但尚无用于型糖尿病的实验研究。本次研究发现,对于型糖尿病小鼠来说,不论是在痛觉敏感出现前给药(成模后立即给药)、还是已经出现痛觉敏感再给药(成模周后给药),都能改善其痛觉异常,使其的鬼尾潜伏期趋于正常,其中高、中剂量效果(、更为显著。电镜下首次观察对型糖尿病所致坐骨神经超微结构变化的作用,发现灌胃给药、周后,型糖尿病小鼠坐骨神经有髓神经纤维排列较整齐,髓鞘板层结构基本完整,厚薄较均勾,偶见空泡状缺损,轴突形态完整,雪旺氏细胞形态正常。首次发现对型糖尿病神经病变的治疗作用。推算在糖尿病 第四章讨论患者在尚未并发神经病变时或神经病变的早期,口服可用于的临床治疗。关于及其酰化物、对的作用机制,尚无明确说法,具有较大的争议。等人发现也可以增加糖尿病大鼠肌醇和游离卡尼汀的含量,但对山梨醇含量没有影响,推测对的作用与改变多元醇通路活性有关。但等人发现,不能改变诱导的糖尿病大鼠神经和视网膜中山梨醇和肌醇含量,认为对糖尿病神经病变和视网膜病变的改善作用并不通过影响多元醇通路。等人发现能有效防止糖尿病大鼠神经中脂质过氧化反应产物所致的硫代巴比妥反应物质(升高,认为对的作用可能与阻止脂质过氧化反应有关。等人发现能增加糖尿病大鼠酶活性,增加神经纤维再生能力。目前胰岛素样生长因子(包括胰岛素、及对的作用已有较深入的研究,能支持神经元和雪旺氏细胞的生存,调节神经元分化,刺激神经突生长,促进神经系统的髓鞘生成及减少神经元的凋亡等。而在型糖尿病大鼠中基因表达是减少的。因此,在本次试验中进行了与的相关性研究。发现给予、周后,小鼠血衆中的胰岛素含量明显升高。因此推测对的治疗作用与促进糖尿病小鼠体内胰岛素分泌有关。周知,当胰岛素分泌的同时,能产生等分子的肽,而肽对有着重要的作用,在型糖尿病大鼠模型中,肽可剂量依赖性的修正酶和的缺陷,能改善外周神经机能,预防或逆转外周神经结构异常。本次研究,各组小鼠血衆和坐骨神经中的的含量没有变化。不仅给药组的没有升高,而且型糖尿病小鼠的含量也没有降低,与此前等人所报道相悖。由此笔者认为,虽然不能直接升高含量,但其对的作用机制还与肽对的允许作用有关。肽能提高胰岛素的作用,使胰岛素受体磷酸化,还能使外周及中枢神经及其受体的表达正常化。本文研究了型糖尿病小鼠的特征,型糖尿病小鼠肝脏肉眼观察可见表面粗糙颗粒、颜色异常,油红染色光镜下观察可见肝细胞大泡性脂变和零星的肝细胞坏死,脂肪滴明显增多；电镜下肝细胞出现明显的线粒体肿胀,大部分的线粒体嵴和膜融合,电子密度增加,粗面内质网扩张,并有明显的脱颗粒现象,细胞质中可见大量糖原颗粒,这是型糖尿病的特征性超显微结构改变。而能改善所致的肝脏外观改变,使肝脏体积变小,表面光滑、脂肪颗粒减少；显微镜下观察到肝脏切片中的脂滴减少。表明能改善型糖尿病引起的肝脏脂肪病变。在电镜图像中,给药组小鼠的肝脏图像中可见大量糖原颗粒附在粗面内质网上,表明对肝细胞机能的改善。 靑岛大学硕士学位论文本研究证实糖尿病小鼠肝脏中的和明显增加。随着肝脏中的的氧化增多,进一歩抑制了糖代谢,同时肝脏中大量的和加重了肝脏的负担。尽管的增加能提高脂肪酸代谢限速酶一的活性,但同时型糖尿病所致的减少使的活性降低。因此的活性不足以将大量的脂肪酸转运入线粒体。最终导致肝脏的脂肪变。而在机体脂代谢中起到了一个重要的作用,它能激活,使其将长链脂肪酸转运到线粒体内,进行氧化,。本次试验表明,型糖尿病小鼠血柴和肝脏内的水平明显降低,这与之前的研究发现也是一致的,他发现在型糖尿病大鼠的血清和肝脏内,水平明显低于正常大鼠。口服能提高型糖尿病小鼠肝脏中和的水平,使得脂肪酸的氧化增加,肝脏中的脂类蓄积减少,也就减少了转运到血衆中的。因此,可以通过降低和的水平,减少脂毒性对机体的损伤,达到改善型糖尿病小鼠脂代谢异常的作用。本次试验还首次检测了型糖尿病小鼠肝脏中与的比值。研究发现,与型糖尿病小鼠相比,各给药组的比值明显降低。现知,转运脂肪进线粒体的同时,在肉碱乙酰转移酶(的作用下,与乙酰基结合生成,即。由此笔者提出一个假设,型糖尿病小鼠补充后,可使平衡右移,减少乙酰基与游离的结合,从而了提高线粒体中与乙酰的比例。而与乙酰的比例的升高可以增加丙酮酸脱氢酶的活性,改善型糖尿病所导致的活性降低,最终有利于脂肪的进一步分解。― ^结论成功复制型糖尿病小鼠模型。建立型糖尿病模型小鼠血衆和肝脏组织中卡尼汀群柱前衍生化荧光高效液相色谱检测方法。并发坐骨神经、肝脏病变的型糖尿病小鼠血衆、、肝脏水平明显降低。灌胃给药通过升高血浆、胰岛素水平,降低含量改善型糖尿病小鼠坐骨神经、肝脏病变。 ff岛人学硕士学位论文参考文献,,,,,,,,,丄,,,,, 参考文献,,,,,：郭燈,朱波,李晨钟等自发性型糖尿病大鼠血奖低脂联素血症导致胰岛素抵抗南方医科人学学报,,,,, 靑岛人学硕士学位论文,,,,,,§,,,,, 参考文献,,, 靑岛人学硕士学位论文文献综述左卡尼汀及酰化物对糖尿病神经病变防治的研究进展摘要：外源性左卡尼汀(及酰化物乙酰左卡尼汀(和丙酰左卡尼汀(对糖尿病神经病变的防治是近年来糖尿病治疗的热点之一。本文主要综述及酰化物对糖尿病外周和自主神经病变的防治作用及其机制的研究进展,为研究对型糖尿病小鼠治疗作用提供参考。关键词：左卡尼汀糖尿病神经病变糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病,其临床病程持久且并发症多。糖尿病是由遗传因素与环境因素共同引起的复杂疾病,随着人民生活水平的提高,糖尿病尼其是型糖尿病发生率有上升趋势,中国卫生部疾病控制司与中华医学会糖尿病分会编写的《中国糖尿病防治指南》中指出我国型糖尿病的患病率年为、年为、年为,年增患病率超过了°。。糖尿病神经病变(是糖尿病最常见和最复杂的并发症。目前还没有针对糖尿病神经病变的有效药物,只能通过降低患者的血糖水平来控制外周神经病变的发展。因此探寻预防和治疗糖尿病神经病变的有效药物是目前提高糖尿病患者生存质量的关键问题。左卡尼汀(是一种自然存在于所有哺乳动物体内的一种小型极性分子,可用治疗多种疾病。近年来,多项动物和临床实验已证实左卡尼汀及酰化物能有效预防和治疗糖尿病神经病变所引起的疼痛、痛觉减退、神经传导速度下降等症状,为糖尿病神经病变的防治提供了新的方向。左卡尼汀概述左卡尼汀,是两位俄国科学家和于年在肌肉提取物中首次发现的,也被称为左旋肉碱,其分子结构式为羟基三甲氨丁酸,是一种存在于所有哺乳动物体内的小型极性分子。卡尼汀是一组化合物的总称,包括左卡尼汀、左乙酰卡尼汀(、乙酰左卡尼汀 文献综述和丙酰左卡尼汀等。卡尼汀有左旋和右旋两种存在形式,然而只有左旋体才具有生物活性。右旋体不仅没有生物活性而且会与左旋体竞争,潜在地增加左卡尼汀缺乏的危险。左旋卡尼汀本身并不是机体的基本营养素,但是它在脂肪酸及其他营养物质代谢中的作用不可替代。活化的长链脂酰不能直接穿过线粒体内膜,此时需要内膜上转运肉碱和脂酰肉碱的载体将分子的脂酰肉碱运进线粒体内膜,分子肉碱转运至内膜外,将长链脂肪酸介导入线粒体内,并使脂酰在线粒体醇的作用下进行氧化。当转运脂肪进入线粒体的同时,它又将仄氧化的产物一乙酰基运出线粒体,减少乙酰基在线粒体中与游离脂酰结合,从而提高线粒体中的水平,增加丙酮酸脱氢酶(的活性最终有利于脂肪的进一歩分解。左卡尼汀被认为作为重要的酰基受体来维持游离的辅酶足够的细胞水平,同时也充当器官保护作用,例如对肾脏和全身细胞膜的保护—。进一步说,卡尼汀就像一道门,控制酯类物质从线粒体内部通过线粒体膜到达外部。卡尼汀还在糖类代谢和能量生成方面起辅导作用。因左卡尼汀属内源性物质,所以不良反应也极少发生。左卡尼汀和乙酰左卡尼汀作为食品添加剂在美国已被批准为非处方药,用于帮助减轻体重和改善运动能力；丙酰左卡尼汀在欧洲已被作为治疗外周微血管疾病和糖尿病足的临床药物批准使用。―人体内的卡尼汀群来源主要有二个：一是内源性的,由赖氨酸和蛋氨酸在肝、肾和大脑中自身合成,并且大部分以游离的盐酸盐状态存在,仅少数为酰基化状态存在。氨基赖氨酸和丁基甜菜碱被认为是两种主要的介质限制卡尼汀的生物合成。增加以上两种介质中的任何一种,都将增加卡尼汀的生物合成。维生素：、维生素、烟酸及还原铁都参与的合成,当这些物质缺乏时会影响体内的水平。另一个是外源性的,主要来自肉类食品、乳制品和临床药物,正常人体内的约由自身合成,来自食物。肾脏是的排泄器官,左卡尼汀不与血衆蛋白结合,在血浆中呈游离状态,由近端肾小管回吸收,其余以原型经肾脏排泄。排出是体内减少卡尼汀的主要途径。一般来说,健康成年人不需要额外补充左卡尼汀,但是如果由于疾病等其它原因导致肾小管重吸收受损,则会导致缺乏或不足,导致游离脂肪酸在细胞内的 靑岛人学硕士学位论文沉积,产生一系列毒性反应。在实验中证实,豚鼠在食用维生素缺乏食物天后,因肾皮质刷状缘膜囊泡对的重吸收减少,导肾脏排出的卡尼汀增加,从而使体内水平降低。当左卡尼汀的饮食摄入量或者体内自身合成的量不能满足机体的需要时,可以通过外源性的左卡尼汀能够来补充。外源性补充左卡尼汀可以用于治疗某些疾病,例如：静脉注射能治疗慢性肾性贫血,提高血红蛋白水平；静脉滴注可用于心血管疾病,改善心脏功能；口月艮治疗慢性肝炎、肝硬化,可改善其临床症状—；静脉滴注或口服能治疗神经损伤,提高神经传导速度、改善痛觉异常；能作用于内分泌系统,治疗甲允、糖尿病等；亦是肠外营养不可缺少的成分；补充能减轻体重,改善运动机能；能增加精子密度,提高精子运动能力治疗不育症；治疗和预防感染患者的药源性肌病；治疗丙戊酸盐中毒以及白喉和药物造成的肉碱缺乏症等。糖尿病神经病变糖尿病神经病变是因糖尿病高血糖状态及其所致各种病理改变而导致的神经损伤。不同类型的糖尿病神经病变及其症状可发生在各种类型的糖尿病患者中,其患病率随糖尿病患病时间的延长而增长。《中国糖尿病防治指南》中指出年我国住院型和型糖尿病患者中,的患病率分别是和。值得注意的是,临床绝大多数患者都未得到及时诊断、治疗,致残率和死亡率很高,因此探寻预防和治疗的有效药物是目前的关键问题。可累及全身神经系统的任何部位,周围神经病变最为常见,常累及的有股神经、坐骨神经、正中神经、桡神经、尺神经、腓肠神经及股外侧皮神经等。其症状和体征取决于病变神经纤维的类型,大纤维病变影响本体感觉和光感,小纤维病变影响痛觉和温度感知,导致感觉异常和神经痛。周围神经病变可致进行性的感觉缺失,早期症状以感觉障碍为主,临床呈对称性疼痛和感觉异常,常有麻木、蚁走、虫爬、发热、触电样感觉,往往从远端脚趾上行可达膝上,患者有穿袜子与戴手套样感觉。晚期症状则感觉障碍严重,可出现下肢关节病及溃疡,疼痛剧烈时似乎 文献综述在骨髓深部作痛,有时如截肢痛】。当累及运动神经时,肌力常有不同程度的减退,晚期有营养不良性肌萎缩。周围神经病变可双侧,可单侧,可对称,可不对称,但以双侧对称性者多见。糖尿病神经病变还可累及任何自主神经支配的内脏器官,其对心脏系统的影响,早期症状为心动过速、体位性低血压,晚期症状为节律障碍甚至出现心性猝死；对消化系统的影响表现为胃排空延迟及腹泻或便秘；的男性糖尿病患者可出现勃起障碍；泌尿系统症状表现为尿潴留和失禁；的症状还包括神经内膜局部缺血损伤引起的痛觉减退、脑神经损伤导致的眼肌麻痹等。糖尿病神经病变的发病机制与神经内膜微血管病变导致神经营养障碍有关。神经生长因子(能选择性的影响小感觉纤维和交感神经节神经元。神经营养作用对型糖尿病的影响更重要,并且对中枢和外周神经系统都会有影响。胰岛素样生长因子(和神经生长因子(对型糖尿病大鼠脑神经的作用大于型糖尿病大鼠。型糖尿病大鼠外周神经后才出现表达的初始峰,晚于型糖尿病的,而正常大鼠出现峰值的时间为。年,提出糖尿病大鼠皮肤和肌肉的表达减少、逆向轴突转运受损使依赖的神经节细胞营养缺失,给予可使背根神经节和坐骨神经有关感受伤害的基因产物如物质、降钙素的表达正常化。年等人也发现在糖尿病大鼠肌肉中,交感神经元和背根神经节细胞的神经营养因子(表达也减少—,给予可使感觉神经传导速度正常化。此外等人也提出对感觉、运动和交感神经有营养作用的及其受体在糖尿病病人和动物模型中都有所减少,尤其在型糖尿病时,全身的水平下降,在背根神经节中,及其受体下调—,皮下注射、可阻止痛觉过敏和神经变性的发展。各项实验表明糖尿病神经病变的发生还与胰岛素及肽(的缺乏有关。胰岛素可促进轴突生长,对于感觉和交感神经的存活是所需的。年在实验中发现局部单向的对诱导的糖尿病大鼠的坐骨神经注射胰岛素可增加神经的再生,阻止神经传导速度的减慢。肽又称连接肽,是胰岛细胞的分泌产物,一个分子的胰岛素原经酶切后,裂解成一个分子的胰岛素和一个分子的肽。 靑岛大学硕十学位论文肽可增强胰岛素的降血糖作用,使胰岛素受体磯酸化以及在低胰岛素水平时与胰岛素信号转导合作协调。年等人在型糖尿病大鼠模型中,肽可剂量依赖性的修正酶和的缺陷,从而阻止早期的神经传导缺陷。肽还可使扰乱的和系统正常化。肽替代可阻止和改善神经传导缺陷,轴突变性以及郎飞氏节和节旁组织的变性。更重要的是,它可阻止痛觉过敏和小的感觉神经纤维的变性和损失。肽还有抗凋亡活性,对糖尿病脑病有改善作用微血管功能障碍也是糖尿病神经病变发生的重要原因之一。其部分是由于受损的内皮一氧化氮合酶(表达引起的,这种情况可以通过补充乙酰左旋卡尼汀和：肽得到纠正。等人发现和在实验性糖尿病模型的坐骨神经中表达式减少的,提出血管中的类前列腺素合成减少也是引起微小血管功能障碍的重要因素。组织和血衆中亚麻酸和花生四稀酸的减少导致了舒血管和抗血小板的前列腺素合成受损。给予月见草油、必需脂肪酸】或者乙酰左卡尼汀【可使糖尿病大鼠体内受损的类前列腺素和含量正常化。研究还发现甲基天门冬氨酸受体及受损的感觉神经纤维的钠、钾、离子通路上调,产生异位放电,一些神经调节肽,如物质,降钙素基因相关肽,去甲肾上腺素及羟色胺水平增高也可能与有关。左卡尼汀对对糖尿病神经病变防治的研究进展有证据表明糖尿病并发视网膜病变、高血脂症及神经病变时,血浆中游离的左卡尼汀含量和左卡尼汀总量均明显低于无并发症的糖尿病患者,笔者也在实验中发现并发的型糖尿病小鼠血衆内和的含量明显低于对照组小鼠,进一歩证明体内糖尿病并发症的发生与左卡尼汀缺乏存在相关性。向糖尿病患者尤其是有并发症的糖尿病患者给予左卡尼汀,具有治疗作用。糖尿病神经病变作为糖尿病最常见和最复杂的并发症,探讨左卡尼汀及其醜化物对糖尿病神经病变的防治作用,对糖尿病的治疗有着重要的意义。左卡尼汀对糖尿病外周神经病变(作用的研究左卡尼汀及其酰化物能有效防治糖尿病躯体神经病变引起的痛觉减退、疼痛、 文献综述感觉减退,提高神经传导速度,促进神经再生。痛觉减退是糖尿病严重的并发症之一。等人在研究中发现可剂量依存性地改变链脲佐菌素(诱导的糖尿病小鼠的痛觉阈。阳性对照组小鼠在注射后周,小鼠的鬼尾潜伏期较正常小鼠缩短,而周小鼠的鬼尾潜伏期较正常小鼠延长,说明糖尿病小鼠在成模后周时出现痛觉敏感,而在周时出现了痛觉减退。预防给药组小鼠在注射天后开始给药每天一次,持续周。治疗组小鼠在注射周后给药每天一次,持续周。实验结果表明预防性和治疗性给药均能使糖尿病小鼠成模周后的甩尾潜伏期缩短、痛觉阈降低,从而改善糖尿病小鼠的痛觉减退,但不能影响痛觉敏感期的糖尿病小鼠甩尾潜伏期。且并不能影响糖尿病小鼠的体重和血糖水平。笔者则在实验中发现,高脂高糖联合诱导的糖尿病小鼠(型糖尿病模型)在成模后周出现用尾潜伏期缩短、痛觉阈降低,电镜下观察到型糖尿病小鼠坐骨神经大量有髓神经髓鞘结构模糊、髓鞘板层分离、轴突萎缩。给予、后可使神经病变明显改善,不出现甩尾潜伏期缩短,且坐骨神经超微结构呈现髓鞘结构较完整,少量纤维髓鞘板层结构疏松,轴突形态饱满。实验中并未观察到型糖尿病小鼠的痛觉减退,笔者认为可能源于糖尿病模型类型的差别。等人在实验中发现,口服给药周可明显提高诱导的糖尿病大鼠尾神经运动传导速度和坐骨神经血流量。尽管对糖尿病大鼠视网膜电流通波峰潜时的缩短效果不如胰岛素(胰岛素和联合用药效果最好),但可降低血清脂质水平及增加坐骨神经左卡尼汀含量。等人用及四氧嘧啶(诱导糖尿病大鼠模型,在造模一周后,腹腔注射周。结果显示在两种模型中,均可以完全预防糖尿病所导致的肌肉神经运动传导速度下降(比正常大鼠减少。可分别部分预防、全部预防由、四氧嘧啶模拟的糖尿病引起的肌收缩力降低(与正常值相比减少。还可以改善糖尿病所致的运动能力降低。除动物实验外,很多临床实验也表明左卡尼汀及其酰化物对糖尿病神经病变有着良好的治疗作用。如等人通过肌电图描记法对例型糖尿病儿童患者进行 青岛人学硕士位论文研究,其中例被诊断为神经传导速度(是病态的,例至少一项电生理参数是异常的。结果显示在服用左卡尼汀(个月后,病理检查和神经检查为正常的病人,在所有病理参数中有得到改善和的交感神经皮肤反应(提高；病理检查和神经检查为病态的病人,也有相应的提高,但病理参数没有明显的改善。等人在例确诊为糖尿病神经病变的病例中进行了一个针对治疗效果的长期、随机、双盲的临床研究。个病例随机的分成治疗组和对照组,分别在最初的天肌肉注射和安慰剂,并持续口服和安慰剂天。在各项电生理参数的提高上,治疗组与对照组相比有显著的统计学意义,其中腓侧感觉神经、尺侧感觉神经、腓侧运动神经的神经传导速度提高在治疗组和对照组分别是与、与、、与腓侧运动神经神经传导幅度的增加在治疗组和对照组分别是与。在对痛觉的治疗上,视觉模拟标度尺(得分治疗组降低了而对照组降低了。在整个研究期间,都表现了良好的耐受性。等人也在例患病年以上糖尿病的成年病例中进行了对神经病变的双盲、随机、安慰剂对照的研究。整个研究分为高剂量组(,和低剂量组两个设计相同的持续年的研。结果显示,低剂量组腓肠神经形态活检中所有参数的分级得分、纤维数量和再生簇都明显提高,高剂量组各项数据高于对照组但无统计学意义。神经传导速度与幅度在给药组和对照组没有明显的区别。在美国和加拿大的病例中,高剂量组震动感知各项参数明显改善,低剂量组仅改善手指的振动感知。欧洲病例的手指振动感知改善明显低于美国、加拿大。虽然与对照组相比无统计学意义,但各治疗组的临床症状分级得分都得到改善。高剂量组的痛觉得分明显下降,低剂量组的得分下降没有统计学意义。认为疼痛是最令人烦恼的症状的病例中,所有临床症状、体位性眩晕和感觉异常的分级得分都得到明显的改善。等人就对感觉神经元快轴质转运的作用进行了体外实验。实验对象为三月大的雄性诱导糖尿病大鼠的背根神经节神经元,这些感觉神经元取自神经中枢,后被培养于高浓度的葡萄糖中。研究发现的可短暂恢复糖尿病所 文献综述引起的逆向转运微粒数量和平均速度的降低,并对不受糖尿病影响的顺向转运微粒数量和速度没有作用,且对对照组大鼠祌经元的双向转运微粒也没有影响。提示可能通过使退行性的轴衆转运再生,起到缓解糖尿病神经病变的作用气左卡尼汀对糖尿病自主神经病变(作用的研究糖尿病自主神经病变常伴随周围神经病变共同出现,可累及任何自主神经支配的器官,目前多为研究对心脏系统的影响。等人分析了对诱导的糖尿病大鼠模型心率变异性(的影响。与正常大鼠心率(±相比,糖尿病大鼠的心率明显减慢(±而使用治疗后,糖尿病大鼠的心率提高为±,与未治疗大鼠相比具有统计学意义。并且糖尿病能降低大鼠的时间和频率参数,其中高频功率下降约、低频功率下降约,提示了副交感神经活性的下降；而高频比和低频比的降低表明了交感神经兴奋的降低。能对抗这些参数的改变,并使心脏波谱的形状常化。研究结果表明,在诱导的大鼠中,糖尿病能明显降低心脏交感神经和副交感神经的兴奋性,而使用可以预防自主神经病变的发展。等人也发现诱导的糖尿病大鼠在服用一周后,能明显提高心电图间期变异系数。左卡尼汀对糖尿病颅神经病变作用的研究等人研究了左卡尼汀对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠脑干听神经诱导电位和躯体感觉神经诱导电位的影响。在造模三周后给予左卡尼汀,持续周,同时以无糖尿病大鼠作为对照,每周测定曲线的潜伏期和峰间潜伏期。结果显示,左卡尼汀可以明显改善糖尿病引起的潜伏期缩短但不影响体重和葡萄糖水平。提示左卡尼汀可以治疗糖尿病中枢神经病变,但不能调节葡萄糖水平【。左卡尼汀对糖尿病神经病变作用机制的研究等人进行采用对比醛糖还原酶抑制剂与卡尼汀类似物对诱导糖尿病大鼠的方法,研究在糖尿病神经病变中多元醇通路机能进与卡尼 青岛大学硕士学位论文汀代谢改变。研究发现,服用约和周均能改善糖尿病所致的大鼠运动神经传导速度下降、间期变异率降低、坐骨神经血流量减少及红细胞二磷酸甘油聚合物减少。糖尿病大鼠的血小板过度聚集活动可被减少,但对其没有作用。还能减少糖尿病大鼠神经中山梨醇的蓄积、防止肌醇的缺失和游离卡尼汀的不足。另一方面,也可以增加肌醇和游离卡尼汀的含量,但对山梨醇含量没有影响。这些结果提示在糖尿病神经病变的发展过程中多元醇通路活性的增加和卡尼汀的缺乏存在着密切的联系。但也有研究提出了不同的看法,等人发现,口服给药周不能改变诱导的糖尿病大鼠神经和视网膜中山梨醇和肌醇含量。而胰岛素却能明显减少山梨醇的含量和增加肌醇含量。因此他们认为对糖尿病神经病变和视网膜病变的改善作用并不通过影响多元醇通路。等人采用与酸糖还原酶抑制剂一一索比尼尔进行对比的方法来研究对多元醇通路的影响。索比尼尔可以通过降低外周神经山梨醇含量、提高肌醇含量使糖尿病大鼠山梨醇与肌醇含量正常化。与之相比,没有降低糖尿病大鼠升高的山梨醇水平,但能使坐骨神经的肌醇含量达到正常水平。索比尼尔和都可降低糖尿病引起的坐骨神经丙二醒含量升高,提示具有减少脂质氧化反应的作用。故他们认为索比尼尔与具有相似的改变外周神经机能的作用,但它们对多元醇通路的影响是不同的。在类似的实验中得到了不同的结果,他们认为索比尼尔和都能降低糖尿病大鼠坐骨神经中的山梨醇含量,但对肌醇水平都没有影响。等人研究了左卡尼汀对糖尿病大鼠躯体感觉神经诱导电位和神经中脂质过氧化反应产物—硫代巴比妥反应物质(的影响。在用四氧嘧啶造模三周后给予左卡尼汀持续周,同时以无糖尿病大鼠作为对照,每周经尾神经刺激、通过皮层记录潜伏期。糖尿病能使明显缩短,左卡尼汀能轻微地改善这种情况,但无显著意义。左卡尼汀能有效防止糖尿病所致的升高,但不影响体重和葡萄糖水平,表明左卡尼汀对糖尿病神经病变的作用与调节葡萄糖无关,但可能与阻止脂质过氧化反应有关。 文献综述等人研究了糖尿病生物育种伍斯特大鼠,给予后对外周神经多元醇、肌醇、酶、血管前列腺素、神经传导速度和病理改变存在的短期和长期作用。在糖尿病模型形成后周给药个月,与未给药的糖尿病大鼠对比,研究预防糖尿病神经病变的短期作用,发现对神经多元醇没有影响,但可纠正酶缺陷并与预防的神经传导缺陷和全部的结构变化有关。给药个月研究长期预防作用,在糖尿病模型形成后的月给予研究治疗作用。结果显示长期预防和治疗作用可以使神经数量正常化但对和数量没有影响。长期预防作用还预防了的神经传导缺陷并减弱了结构异常。治疗作用能修复的传导缺陷并能矫正患病个月的糖尿病大鼠的神经病理改变特征。使用治疗的糖尿病大鼠神经纤维再生的能力是未治疗糖尿病大鼠的两倍。整个结果表明对酶缺陷有预防作用,对有关神经传导速度和病理改变的神经数量有预防和治疗作用。等人进行了对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠体内类物质免疫反应(的轴突转运和其在胃、坐骨神经和腰脊髓的含量的影响研究。通过在坐骨神经结扎,测量小时积聚的轴突转运量,发现在成模周的糖尿病大鼠体内神经变细、顺行和逆行的明显减少。而在八治疗的糖尿病大鼠体内含量与正常数量一致。在成模周的糖尿病大鼠体内,坐骨神经、胃和腰脊髓的含量明显减少,而可以预防组织中的降低。还能明显防止糖尿病所致的坐骨神经中山梨醇增加和肌醇减少。这项研究表明对糖尿病神经病变的预防作用是通过影响代谢通路如多元醇活性、肌醇合成及防止物质合成及轴突轴突转运减少。等人也认为左卡尼汀对糖尿病神经病变的作用与预防坐骨神经和腰脊髓中的物质含量减少有关。等人研究了糖尿病自主神经病变与消化道肽改变的关系。其研究发现在四氧嘧啶诱导大鼠形成糖尿病周后,肠道内的物质和甲硫脑啡肽水平明显降低,而作用于血管的肠多肽含量明显增加,说明糖尿病大鼠的肠神经支配完全紊乱,有的系统萎缩,另一些肥大。用治疗的糖尿病大鼠从开始就能预防这些肽的改变。等人研究了卡尼汀代谢失衡在糖尿病外周神经病变机制中所起的作用。研 靑岛人学硕士学位论文究发现在诱导形成糖尿病后周,大鼠小时尿中排泄的卡尼汀增加了约倍,左卡尼汀水平在血浆中下降了、在神经内膜中下降了。这些关系到尾神经传导速度下降坐骨神经酶活性下降、酶活性下降、减少,血管白蛋白透过增加,血流量增加。用治疗的糖尿病大鼠血衆和神经内膜的左卡尼汀水平正常,并能预防除血流量和外的所有代谢和机能变化。为探究治疗的作用机制,笔者在实验中进行了与的相关性研究。发现给予、周后,型糖尿病小鼠血浆中的胰岛素含量明显升高,血浆和坐骨神经中的的含量没有变化。因此笔者认为对的治疗作用与促进糖尿病小鼠内源性胰岛素分泌有关。当胰岛素分泌的同时,能产生等分子的肽,如前所述,肽对有着重要的作用,肽可改善外周神经机能,预防或逆转外周神经结构异常。综上所述,近年来左卡尼汀及其酰化物应用于临床上糖尿病导致的的治疗与改善,收到良好的效果。但目前的研究尚不能证明其在体内的具体疗效是左卡尼汀还是其某种代谢产物所起到的。左卡尼汀对糖尿病神经病变具体作用机制尚未明了,具有较大的争议,可以明确的是左卡尼汀不能通过降低血糖来减低神经病变的发生。这些尚未解决的问题为今后的研究提供了方向。综述参考文献：,, 文献综述,：林锋左尼汀在全肠外营养中的应用中华胄肠外科杂,,,,,,：罗家琳马培龙,张洪波左卡尼汀治疗埒性贫血临床观察中国血液净化,,,：涂向阳,魏世超贝康亭泊疗例有机磷中毒心肌损害临床观察福建医学杂忠,,：,,,：,：,,,：杨金龙,夏子禹,游龙英,等复方左尼汀疗慢性病毒性肝炎中国新药与临床杂,：施健,刘芬,谢渭芬左尼汀的临床应用中国临床药学杂,林修,叶榕,王耀新卡尼汀治疗急性脑梗死中国新药与临床杂志,,：,,, 靑岛人硕十学位论文,,,,,：王咏梅,殷—富,杜荣增,左旋尼汀对糖尿病伴高血压患者血浆左尼汀浓度及血糖的影响第一军医人学学报,,：,,,,,,,,,,,,,,谷荣华,高效液相色谱法测定不育男子精浆左尼汀及其临床意义讣中国男科学杂忐,,：,,,,,,, 文献综述,,：,,,―,, 青岛人学硕学位论文,,,,,,,,,,,,,,,,,, 文献综述,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 靑岛人学硕十学位论文,§,,,,, 攻卖硕十宁位期间的研究成果攻读硕士学位期间的研究成果申请硕士学位学习期间发表和拟发表的论文收录)审稿中 附录缩略词表附录縮略词表左卡尼汀乙酰左卡尼汀丙酰左卡尼汀高效液相色谱法荧光高效液相色谱法链脲佐菌素氨基葱胰岛素样生长因子游离脂肪酸甘油三酉旨糖尿病神经病变非酒精性脂肪肝一肉碱棕榈酰转移酶肉碱乙酰转移酶丙酮酸脱氧酶非空腹血糖 M致谢我的论文是在王春波教授和董静副教授的悉心指导和亲切关怀下完成的。两位老师不仅在学业帮助我幵拓研究思路,精心点拨、热忱鼓励,而且教会我如何光明磊落的做人、做事。虽然只有短短的年,但导师一丝不苟的作风,严谨求实的态度,踏踏实实的精神,对学生无私的关爱已经深深地影响了我。我的点滴进歩,无不浸透着两位老师的心血。在此谨向两位老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。感谢实验室的各位领导、同事,给我宽松的时间和齐备的试验条件,谢谢你们在我的工作、学习与实验过程中所给予的热情指导和无私帮助。再就是要感谢各位师兄妹在实验及论文成文过程中给我大力帮助。最后要感谢我的家人,是你们的默默支持和鼓励使我最终完成学业。 学位论文独创忡声叨、学位论文知识产权权屈声学位论文独创性声明本人声明,所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成果。文中依法引用他人的成果,均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果,也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。本人如违反上述声明,愿意承担由此引发的一切责任和后果。论文作者签名：？期：年月曰学位论文知识产权权属声明本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品,知识产权归属学校。学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时,署名单位仍然为青岛大学。本学位论文属于：保密□,在年解密后适用于本声明。不保密。请在以上方框内打论文作者签名：日期：年月日导师签名：年本卢明的版权归靑岛大学所有,未经许可,任何单位及任何个人不得擅自使用)