《~1壮通饮对冠心病心肌梗死大鼠相关炎症及神经体液因子影响的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：R541.4学校代码：10599密级：公开学号：20151002009硕士学位论文1壮通饮对冠心病心肌梗死大鼠相关炎症及神经体液因子影响的研究学位申请人：张世田导师姓名：黄岑汉专业名称：内科学研究方向：冠心病的基础研究所在院系：临床医学院申请学位类型：学术学位完成日期：2018年06月01日广西﹒百色【基金项目】国家自然科学基金（合同编号：81460658）：从RAAS激活通路探讨壮药壮通饮干预冠心病心肌缺血血瘀证模型大鼠的分子靶点 嗲佚铪弍雇刳嚇声明本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果Ｄ尽我所知了沦文中特别加以标注和致谢的地方外，，除江论文屮不包含苏他人己经发农或撰写过的研宄成果，也不包含為获得右民族医学院或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明《－。屮请学位论文与资料若有不实之处，本人承担切相关贵任：作者签名：说世ＪＳ日期年６月穸曰考佚铪弍阪私使用教私冬本学位论文作者和指导教师完全了解右江民族医学院有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的■复印件和电丫版：ｆ本人允许本学位瞼文被査阅和借阅学校可以将木学位论义的全部或部分内容编入存关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明，：张£函导师签名ｔ作者签名—＞Ｘ６月：日期：ＭｉｌＬ年」月日曰朗＃ｒＲ？ｉ－？ 目录摘要………………………………………………………………………………………1ABSTRACT………………….………………………………………………………………3英汉缩略词对照表……………………………….……………………………………………7前言……………………………………………………………………………………………81材料与方法…...……………………………………………………………………………101.1实验动物……………………………………………………………………………….101.2主要仪器与设备……………………………………………………………...………..101.3主要药品、试剂…………………………………………………………………………101.4实验耗材…………………………………………………………………………………111.5实验方法…………………………………………………………………………………111.6数据记录与测量…………………………………………………………………………161.7统计学分析…………………………………………………………….………………202结果……………………………………………………………………………...…………202.1各组大鼠存活情况及死亡原因分析……………………………………………………202.2大鼠一般情况比较………………………………………………………...…………….212.3各组大鼠心率（HR）的变化…………………………………………………..…………212.4心肌组织HE染色结果……………………………………………………...………….232.5血清炎症因子、ET-1、SNS和RAAS相关因子的ELISA检测结果……………………232.6心肌组织ET-1的WB检测结果………….……………………….………...………….272.7心肌组织TGF-β1的免疫组化和RT-PCR检测结果…………………………………..283讨论……………………………………..………………………….………………………323.1大鼠心肌梗死动物疾病模型与临床冠心病的区别与联系…………………...…….…323.2大鼠心肌梗死动物疾病模型的可靠性分析……………………..……..………………333.3壮通饮组方及现代研究…………………………………………………………..……..33 3.4心肌梗死炎症过程及ZTY干预后的影响…………...…………………….…….……..343.5心肌梗死后的继发性病变及ZTY对SNS、RAAS相关因子的影响……..……………373.6ZTY对心肌梗死大鼠心肌ET-1、TGF-β1水平的影响……………………..……………393.7炎症与抗炎的思考………………………………………………..……………………..403.8临床冠心病抗炎治疗的依据……………….…………………..……………………..413.9ZTY量-效关系及作用机制的探讨……………………………………………………...424不足与展望……………………………………………………………………….…..……43结论………..………………………………………………………………….………………44参考文献………………………………...……………………………………………………45综述…………………………………………………………………………………………51致谢……………………………………………....…………………………………………63攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果………………………………………64 壮通饮对冠心病心肌梗死大鼠相关炎症及神经体液因子影响的研究摘要目的：通过观察壮通饮对冠心病心肌梗死大鼠TNF-α、IL-6、IL-10、NE、REN、AngⅡ、ALD、ET-1、TGF-β1水平的影响，探讨该方对冠心病心肌梗死大鼠的干预机制及防治作用，为壮通饮治疗冠心病心肌梗死的临床应用提供理论依据。同时，为开发治疗冠心病心肌梗死的广西特色壮药提供研究思路或策略。方法：将SPF级SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、壮通饮（低、中、高）剂量组和阳性药物对照组，共7个组，其中模型组、壮通饮（低、中、高）剂量组和阳性药物对照组采用手术方法结扎心脏左冠状动脉前降支末梢建立大鼠冠心病心肌梗死模型，假手术组只开胸不结扎，造模后，壮通饮组按照低（6.8g/kg）、中（13.6g/kg）、高（27.2g/kg）不同剂量灌胃给药，阳性药物对照用复方丹参滴丸（80mg/kg）灌胃给药。给药4周后，取血清和心肌。(1)给药过程中，观察并记录大鼠死亡情况和一般情况。（2）通过心电图分析心率变化情况。(3)通过HE染色观察心肌病理变化。(4)通过酶联反应吸附测定法（ELISA）检测血清TNF-α、IL-6、IL-10、REN、AngII、ALD、NE、ET-1水平。(5)通过蛋白印迹法（Westernblot）检测心肌组织ET-1蛋白表达。(6)通过免疫组化（IHC）和荧光实时定量（RT-PCR）方法检测心肌组织TGF-β1的表达。数据按照“均数±标准差（x±s）”表示，组间比较采用SPSS21.0统计学软件进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。结果：(1)一般情况比较：模型组大鼠出现饮食明显减少，精神差，活动度少，毛色干枯、无光泽，消瘦明显，呼吸深快等表现，药物干预后，ZTY(低、中、高)剂量组、阳性药物对照组上述现象均有不同程度改善，且ZTY低、中剂量组、阳性药物对照组改善相对明显。(2)心率变化情况：模型组大鼠心率明显增高，药物干预后心率明显好转，组间差异无统计学意义（P>0.05）。(3)HE染色：模型组炎症细胞浸润、心肌纤维化、胶原沉积明显，药物干预后，ZTY(低、中、高)剂量组、阳性药物对照组上述现象1 均明显好转,且中剂量组效果显著。(4)酶联反应吸附法（ELISA）：与空白组、假手术组相比，模型组血清TNF-α、IL-6、IL-10、REN、AngII、ALD、NE、ET-1水平明显升高（P<0.05）；与模型组相比，ZTY（低、中、高剂量）组、阳性药物对照组TNF-α、IL-6、REN、AngII、ALD、NE、ET-1水平明显降低（P<0.05），IL-10明显升高（P<0.05），差异均有统计学意义；与低剂量组比较，中、高、阳性药物对照组TNF-α、IL-6、REN、AngII、ALD、NE、ET-1水平明显降低（P<0.05），差异有统计学意义，IL-10的表达无明显变化（P>0.05），差异无统计学意义；中、高、阳性药物对照组间比较，TNF-α、IL-6、IL-10、REN、AngII、ALD、NE、ET-1的变化无意义（P>0.05），差异无统计学意义。(5)蛋白印迹法（Westernblot）：模型组ET-1蛋白相对表达量明显高于空白组和假手术组，药物干预后，ZTY（低、中、高剂量）组、阳性药物对照组均降低，且中剂量组降低相对明显。(6)TGF-β1免疫组化（IHC）：模型组呈强阳性表现，药物干预后，ZTY(低、中、高)剂量组、阳性对照组呈阳性表现。荧光实时定量法（RT-PCR）测TGF-β1：与空白组、假手术组相比，模型组心肌组织TGF-β1水平明显升高（P<0.05），差异有统计学意义；与模型组相比，ZTY（低、中、高剂量）组、阳性药物对照组TGF-β1水平明显降低（P<0.05），差异有统计学意义；与低剂量组比较，中、高、阳性药物对照组TGF-β1水平明显降低（P<0.05），差异有统计学意义；中、高、阳性药物对照组间比较（P>0.05），TGF-β1差异无统计学意义。结论：(1)壮通饮具有改善大鼠一般状况，降低心肌炎症细胞聚集、减少炎症因子（TNF-α、IL-6、ET-1、TGF-β1）及神经体液相关因子（NE、REN、AngII、ALD）释放，对冠心病心肌梗死有一定治疗作用。(2)壮通饮干预冠心病心肌梗死大鼠的作用机制可能与其减少炎症细胞聚集、炎症因子（TNF-α、IL-6、ET-1、TGF-β1）及神经体液因子（NE、REN、AngII、ALD）释放或干扰其合成有关，且以中剂量组效果最佳。关键词:壮通饮；冠心病；心肌梗死；炎症；神经体液；因子2 EffectofZhuangtongyinonRelatedInflammationandNeurohumoralFactorsinCoronaryHeartDiseaseRatswithMyocardialInfarctionABSTRACTObjective:Toinvestigatetheinterventionmechanismandpreventioneffectofthisprescriptiononcoronaryheartdiseaseratswithmyocardialinfarction,andtoprovideatheoreticalbasisfortheclinicalapplicationofZhuangtongyininthetreatmentofmyocardialinfarctionincoronaryheartdisease.ThroughtheobservationofZhuangtongyininthecoronaryheartdiseaseratswithTNF-α,IL-6,IL-10,NE,REN,AngII,ALD,ET-1,TGF-β1levels,atthesametime,itprovidesresearchideasorstrategiesforthedevelopmentofGuangxiZhuang-medicinewiththecharacteristicsofmyocardialinfarctionincoronaryheartdisease.Methods:SPFSDratswererandomlydividedintoblankgroup,shamoperationgroup,modelgroup,Zhuangtongyin(low,middle,high)dosegroupandpositivedrugcontrolgroup,atotalof7groups.Themodelgroup,Zhuangtongyin(low,medium,high)dosegroupandpositivedrugcontrolgroupweresurgicallyligatedtotheleftanteriordescendingbranchoftheleftcoronaryarterytoestablishamyocardialinfarctionmodelofcoronaryheartdisease.Theshamoperationgrouponlyopenedthechestwithoutligation.TheZhuangtongyingroupwasgivenintragastricadministrationaccordingtolow(6.8g/kg),middle(13.6g/kg)andhigh(27.2g/kg)doses,thepositivedrugswereadministeredwithCompoundDanshenDrippingPills(80mg/kg)aftermodeling,serumandmyocardiumweretakenafter4weeksofadministration.(1)Thedeathsituationandgeneralconditionoftheratswereobservedandrecordedintheprocessofdrugdelivery.(2)Heartratechangeswereanalyzedbyelectrocardiogram.(3)MyocardialpathologicalchangeswereobservedbyHEstaining.(4)ThelevelsofserumTNF-α,IL-6,IL-10,REN,AngII,ALD,NEandET-1weredetectedbyenzymelinkedadsorption3 assay(ELISA).(5)TheexpressionofET-1proteininthemyocardiumofWesternblotwasexpressedbythemethodofWesternblot.(6)TheexpressionofTGF-β1inmyocardialtissuewasdetectedbyimmunohistochemistry(IHC)andfluorescencereal-timequantitative(RT-PCR)method.Thedatawereexpressedas"mean±standarddeviation（x±s）".SPSS21.0statisticalsoftwarewasusedtoanalyzethedatabetweengroupsusingone-wayanalysisofvariance(ANOVA),P<0.05wasconsideredstatisticallysignificant.Results:(1)Comparisonofthegeneralsituation:Theratsinthemodelgroupshowedamarkeddecreaseindiet,poorspirit,lessactivity,drycoat,dullness,obviousweightloss,andrapidbreathing,etc.Afterdrugintervention,ZTY(low,medium,andhigh)dosegroups,Theabove-mentionedphenomenainthepositivedrugcontrolgroupwereimprovedtovaryingdegrees,andtheZTYlow,middledosegroup,andpositivedrugcontrolgroupshowedrelativelyobviousimprovement.(2)Heartratechanges:Theheartrateofratsinthemodelgroupwassignificanthigher,andtheheartratewassignificantlyimprovedafterdrugintervention.Therewasnosignificantdifferencebetweengroups(P>0.05).(3)HEstaining:Inflammatorycellinfiltration,myocardialfibrosisandcollagendepositionwereobviousinthemodelgroup,afterthetreatmentofdrugs,theabovephenomenaintheZTY(low,middle,high)dosegroupandthepositivedrugcontrolgroupallimprovedobviously,andtheeffectofmiddledosegroupwasobvious.(4)Enzyme-linkedadsorption(ELISA):Comparedwiththeblankgroupandtheshamoperationgroup,thelevelofserumTNF-α,IL-6,IL-10,REN,AngII,ALD,NEandET-1inthemodelgroupincreasedsignificantly(P<0.05);Comparedwiththemodelgroup,thelevelsofTNF-α,IL-6,REN,AngII,ALD,NEandET-1inZTY(low,middleandhigh-dose)groupandpositivedrugcontrolgroupweresignificantdecreased(P<0.05),andIL-10significantincreased(P<0.05),thedifferencewasstatisticallysignificant;Comparedwithlowdosegroup,thelevelsofTNF-α,IL-6,REN,AngII,ALD,NEandET-1inmiddle,highandpositivedrugcontrolgroupweresignificantdecreased(P<0.05),thedifferencewasstatisticallysignificant,TherewasnosignificantchangeintheexpressionofIL-10(P>0.05),4 andtherewasnosignificantdifferenceinthedifference;ThechangesofTNF-α,IL-6,IL-10,REN,AngII,ALD,NEandET-1werenotsignificant(P>0.05),butthedifferencewasnotstatisticallysignificant.(5)Westernblot:TherelativeexpressionofET-1proteininthemodelgroupwassignificanthigherthanthatintheblankgroupandtheshamoperationgroup,afterthetreatmentofdrugs,theZTY(low,middleandhighdose)groupandthepositivedrugcontrolgroupwerealldecreased,andthedecreaseofthemiddledosegroupwasrelativelyobvious.(6)TGF-β1immunohistochemistry(IHC):Themodelgroupshowedstrongpositiveperformance.Afterdrugintervention,ZTY(low,medium,high)dosegroupandpositivecontrolgroupshowedpositiveperformance.TGF-β1measuredbyRT-PCR:Comparedwiththeblankgroupandtheshamoperationgroup,thelevelofTGF-β1inthemyocardialtissueofthemodelgroupwassignificantincreased(P<0.05),andthedifferencewasstatisticallysignificant;Comparedwiththemodelgroup,thelevelofTGF-β1intheZTY(low,middle,highdose)groupandthepositivedrugcontrolgroupdecreasedsignificantly(P<0.05),andthedifferencewasstatisticallysignificant;Comparedwiththelowdosegroup,thelevelofTGF-β1inthemiddle,highandpositivecontrolgroupswassignificantdecreased(P<0.05),andthedifferencewasstatisticallysignificant;TherewasnosignificantdifferenceinTGF-β1betweenthemiddle,highandpositivecontrolgroups(P>0.05).Conclusion:(1)Zhuangtongyincanimprovethegeneralconditionofrats,reduceinflammatorycellaggregation,inflammationfactors（TNF-α、IL-6、ET-1、TGF-β1）andneurohumoralfactors（NE、REN、AngII、ALD）relatedtotherelease,therearesometherapeuticeffectonmyocardialischemiawithcoronaryheartdisease.(2)ThemechanismofZhuangtongyinforthetreatmentofmyocardialischemiainratswithcoronaryheartdisease,maybecorrelatedwiththedecreasedaccumulationofinflammatorycells,inflammatory（TNF-α、IL-6、ET-1、TGF-β1）andhumoralfactors（NE、REN、AngII、ALD）releasedorinterferewiththesynthesis,andtheeffectofmiddledosegroupwasthebest.5 Keywords:Zhuangtongyin;Coronaryheartdisease;Myocardialinfarction;Inflammation;Neurohumoralfluid;Factor6 英汉缩略词对照表英文缩写英文全称中文全称ALDAldosterone醛固酮AMIAcuteMyocardialInfarction急性心肌梗死AngⅡAngiotensinⅡ血管紧张素ⅡASAtherosclerosis冠状动脉粥样硬化CHDCoronaryHeartDisease冠心病ET-1Endothelin-1内皮素-1ILInterleukin白介素IODIntegratedOpticalDensity积分光密度MIFMacrophageMigrationInhibitoryFactor巨噬细胞迁移抑制因子MMPsMatrixmetalloproteinase基质金属蛋白酶NENormethyleneRenin去甲肾上肾素NF-κBNuclearTranscriptionFactorkappaB核转录因子kappaBPKCProteinkinaseC蛋白激酶CRAASReninAngiotensinAldosteroneSystem肾素-血管紧张素-醛固酮系统RENRenin肾素ROSReactiveOxygenSpecies活性氧SNSSympatheticNervousSystem交感神经系统TGF-β1TransformingGrowthFactorbeta1转化生长因子-β1TNF-αTumorNecrosisFactor-α肿瘤坏死因子-αWBWesternblot蛋白印迹法ZTYZhuangtongyin壮通饮7 前言冠状动脉粥样硬化性心脏病，简称冠心病（coronaryheartdisease,CHD），是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化或痉挛病变而引起血管腔狭窄或闭塞，造成心肌缺血、缺氧甚[1]至坏死而导致的心脏病。冠心病的发生与遗传和环境因素密切相关，严重危害人类健康和生活质量，在我国，随着社会经济发展，人们生活水平不断提高，生活习惯发生改变，冠心病发病人群呈年轻化趋势，尽管对冠心病的发生发展提供了有效的预防和治疗策略，但我国社会老龄化进程加快，患者危险因素控制不佳等原因，冠心病的发病率逐年增加，缺血性心脏病的患病率、急性心肌梗死（acutemyocardialinfarction,AMI）死亡[2]率总体呈上升态势，心血管病死亡率仍居首位，冠心病中最严重的当属AMI，AMI及[3]其并发症的治疗给家庭和社会造成了沉重的医疗负担，因此，对冠心病AMI发病机制及防治的研究仍是心血管病研究的重要课题。冠状动脉粥样硬化形成的机制有多种研究和学说，目前多数学者支持“内皮损伤-[4]炎症”学说，患者在多种危险因素影响下，血管内皮细胞损伤或功能障碍，炎症细胞募集到血管壁，引起冠状动脉粥样病变，炎症发展到一定程度，粥样斑块破裂，血栓形成，造成血流中断引起心肌急性缺血坏死，引发AMI的发生。在梗死心肌中，坏死细胞释放的损伤相关类型分子触发心肌局部和全身炎症反应，诱导多种趋化因子、炎症因子并上调内皮粘附分子介导梗死区心肌炎性细胞募集和炎症因子释放，清除梗死区坏死细胞和基质碎片并激活肌成纤维细胞和血管内皮细胞的修复，但过度、长期失控的炎症反[5]应，可引起心肌纤维无序生成、纤维化严重和不良重塑，参与心肌梗死后心衰的发展。大量研究发现，针对特定的炎症通路及信号网络分子（如补体级联、趋化因子、细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-10、ET-1、TGF-β1）、蛋白酶和白细胞整合素、选择素等）进行有效的药物干预，不仅有助于改善心肌梗死后炎症反应，还能减轻心肌不良重塑，稳定动脉粥样硬化斑块，控制心衰的发展。因此，抗炎症治疗是改善AMI预后的重要治疗靶[6]点。冠心病慢性心肌缺血及心肌梗死的持续发展，均可引起心脏结构、功能及形态学的8 改变，使心肌收缩无力，心功能不全，排血量不足，甚至发生心律失常、心衰等严重并发症。心衰发生后，机体供血不足，会导致神经体液机制的激活，使交感神经系统(SNS)兴奋和肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）激活，并释放NE、REN、AngⅡ、ALD[7]等细胞因子，在心肌梗死后的病理生理调节中发挥着关键作用，神经体液活动增强可以在短期内维持心肌收缩力和心功能的改变，血流动力学得以改善，症状得到暂时缓解，产生有利效应，但持续过度的神经兴奋性增强，体液分子过多分泌和长期炎症刺激，可引起心肌和管壁的纤维化和重构，影响心脏收缩和舒张功能，进一步加重心衰的发展，并产生不利影响，严重影响患者的生活质量和预后。基于上述心肌梗死中相关炎症和神经体液机制的激活进行抑制，对改善冠心病心肌梗死患者的预后具重要临床意义。壮药壮通饮（Zhuangtongyin,ZTY）是由“扶芳藤、参三七、黄花倒水莲”三味广西特色壮药配伍而成的经验用方，具有“行气活血、止血消瘀、利湿止泻、补虚活血、散瘀通络”之功效，根据目前临床应用情况及相关文献和实验研究，其可用于治疗“胸[8]闷、心悸、气短”等临床心肌缺血症状的冠心病，疗效确切。本研究通过建立大鼠心肌梗死模型，用ZTY进行干预，利用现代先进的仪器设备，探讨ZTY对冠心病心肌梗死的保护作用和分子靶点机制，为临床应用提供实验依据，并为开发广西特色中药提供理论依据。9 1材料与方法1.1实验动物SPF级健康SD（Sprague-Dawley）大鼠100只，日龄90天，雌雄不拘，体重280±20g，由右江民族医学院实验动物中心提供，动物许可证号【SCXK-2012-0003】。1.2主要仪器与设备(见表1-1)表1-1主要仪器、设备Table1-1Maininstrumentsandequipment序号设备名称产地或产商1V-100动物呼吸机上海玉研科学仪器有限公司2ECG-6511心电图机上海光电医用电子仪器有限公司3YDS-6便携式液氮罐成都金凤液氮容器有限公司4KDC━2046低速冷冻离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司56K15高速冷冻离心机博励行仪器有限公司（德国）6MDF-U72V（-80℃）超低温冰箱日本三洋公司7Eppendorfresearchplus移液枪德国艾本德公司8HH-2K4电热恒温水浴锅巩义英峪高科仪器厂9DZG-303A纯水机爱莫电气科技（上海）有限公司10SIM-F124制冰机日本三洋公司11RT-6000多功能酶标仪深圳雷杜生命科学股份有限公司12BS/BT223S电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司13PR0200手持台式两用均质器弗鲁克流体机械制造有限公司14G80F23CN2P-Q5(RO)微波炉格兰仕集团15QL-861漩涡混合机海门市其林贝儿仪器制造有限公司16CL-40L高压蒸汽灭菌器日本ALP公司17DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱郑州南北仪器设备有限公司18DYY-6D电脑三恒电泳仪电源北京市六一仪器厂19DYCP-31DN琼脂糖水平电泳槽北京市六一仪器厂20A2二级生物安全柜上海振样创空气净化设备有限公司21PTC-200普通梯度PCR仪美国BIO-RAO公司22罗氏LightCycler96实时荧光定量PCR仪美国罗氏公司1.3主要药品、试剂(见表1-2)10 表1-2主要药品、试剂Table1-2Majordrugsandreagents序号药品、试剂批号产地或产商1水合氯醛2015031101成都市科龙化工试剂厂210%中性缓冲福尔马林固定液16070301广州维格斯生物科技有限公司3TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒E-EL-R0019c伊莱瑞特生物科技有限公司4IL-6酶联免疫吸附测定试剂盒E-EL-R0015c伊莱瑞特生物科技有限公司5IL-10酶联免疫吸附测定试剂盒E-EL-R0016c伊莱瑞特生物科技有限公司6NE酶联免疫吸附测定试剂盒E-EL-0047c伊莱瑞特生物科技有限公司7REN酶联免疫吸附测定试剂盒E-EL-R0030伊莱瑞特生物科技有限公司8AngII酶联免疫吸附测定试剂盒E-EL-R0197c伊莱瑞特生物科技有限公司9ALD酶联免疫吸附测定试剂盒E-EL-0070c伊莱瑞特生物科技有限公司10ET-1酶联免疫吸附测定试剂盒E-EL-R0167c伊莱瑞特生物科技有限公司11BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）060216160810上海碧云天生物技术有限公司12Anti-Endothelin1抗体ab117757abcam13TGF-beta1PolyclonalNTIBODY18978-1APwww.ptgcn.com14三氯甲烷20160929西陇科学股份有限公司15琼脂糖（分子生物学）0000328796美国Invitrogen公司165×TBEBufferN2105天根生化科技有限公司17500bpMarkerV201606da宝生物工程（大连）有限公司18核酸染料GBY-9北京金博益生物技术有限公司196×loadingbufferD604宝生物工程(大连)有限公司20超纯RNA提取试剂盒UltrapureRNACW0550康为世纪Kit21反转录试剂盒HiFiScriptgDNACWS018康为世纪RemovalcDNASynthesisKit22荧光染料UltraSYBRMixtureCW0682B康为世纪23壮通饮（ZTY）中药饮片(三七、扶芳121002右江民族医学院门诊藤、黄花倒水莲)24复方丹参滴丸151115天士力制药股份有限公司1.4实验耗材手术器械、消毒棉签、皮筋、大头针、碘伏、一次性注射器、大鼠灌胃器、手术手套、口罩、帽子、离心管、冻存管、八连管、枪头、镊子、研钵、刮匙、液氮等。1.5实验方法1.5.1实验分组11 将上述100只大鼠适应性喂养一周后称重，根据预实验的死亡情况选择各组的数量，按照数字表法进行随机分为空白对照组（10只），假手术组（10只），造模组（80只）。造模组造模后，再按照上述方法将造模组完全随机分为模型组（16只），壮通饮（低、中、高剂量组）各16只大鼠，阳性药物对照组（16只）。经过以上2次完全随机分组后，共分7组，分别是：空白组（10只），假手术组（10只），模型组（16只），壮通饮组（低、中、高剂量组各16只），阳性药物对照组（16只）。1.5.2动物模型的建立[9,10]动物模型制备的步骤如下（1）术前准备：手术器械酒精常规消毒，用备皮工具于气管切开部位和开胸部位备皮，碘伏常规手术区域消毒。（2）麻醉：术前称重，按照0.35ml/100g，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，1-2min之后，判断大鼠意识和麻醉程度，然后在解剖板上固定四肢，四肢连接心电图机，记录Ⅱ导联心电图。（3）气管插管：用手术剪在颈部正中，做一纵行1cm切口（切口尽量要小），逐层分离皮肤浅筋膜，筋膜下组织（注意保护甲状腺组织，以防不利于切口缝合）、颈前肌肉，暴露气管，用两把小的止血钳固定气管，用大号注射器针头开口或者眼科剪在第2、3软骨环处做一横向切口（切口尽量要小于气管插管，以防漏气），行气管插管（可用静脉留置针作气管插管，以便调节深度），达到合适的深度，打开调整好的呼吸机（频率80次/min，吸呼比1:1，潮气量3-4ml/100g），插管用胶布固定（不用手术线固定），切口敷以生理盐水纱布保护伤口。（4）开胸结扎：气管插管后，在心脏波动最明显处，胸骨左缘1cm处作纵行切口，逐层钝性分离胸大肌和前锯肌，暴露3、4肋间，顺肋间隙方向用止血钳钝性分离至胸腔，用开口器（回形针自制或开睑器）撑开两肋骨，看到柔软海绵状的肺脏和跳动的心脏，如果不在结扎部位，可剪断附近肋骨，寻找结扎部位。用镊子剥离心包膜，用湿生理盐水棉签分离心脏附近心包及肺组织，寻找左冠状动脉前降支末梢，用手指挤压胸廓固定心脏，用6-0的手术缝合线结扎包含末梢血管的心肌组织(宽度和深度约12 0.10cm×0.15cm)，结扎心肌周围颜色变暗，留线在心脏。（5）闭胸，缝合气管：用4-0线迅速缝合肋骨，并挤压排除胸腔内空气，缝合切开肌肉和皮肤，消毒切口。拔出气管插管，逐层缝合气管前肌、皮肤浅筋膜和皮肤，消毒手术切口（造模总过程约20min左右）。（6）术后处理：术后完成Ⅱ导联心电图记录，肌内注射10万U青霉素预防感染，标号后将大鼠放笼中室温饲养，待其苏醒。假手术组：只开胸不结扎左冠状动脉末梢，其他步骤均同模型组。大鼠心肌梗死成功的标准：（1）手术过程中准确结扎左冠状动脉前降支末梢。（2）心电图证实ST段抬高和病理性Q波（见图1-1、1-2、1-3）。图1-1大鼠正常心电图（50mm/sECGHUM20mm/V(x1)）Figure1-1Normalelectrocardiogramofrats（50mm/sECGHUM20mm/V(x1)）注：图中箭头表示ST段抬高图1-2大鼠冠脉结扎5min后心电图（50mm/sECGHUM20mm/V(x1)）Note:thearrowinthefigurerepresentstheSTsegmentelevationFigure1-2Electrocardiogramofratsafter5minutescoronaryarteryligation（50mm/sECGHUM20mm/V(x1)）13 注：图中箭头表示病理性Q波图1-3大鼠冠脉结扎16天后心电图（50mm/sECGHUM20mm/V(x1)）Note:thearrowsinthepictureindicatethepathologicalQwaveFigure1-3Electrocardiograminratsafter16daysofcoronaryarteryligation（50mm/sECGHUM20mm/V(x1)）造模完成后观察并记录大鼠的饮食、精神状态（反应、活动度）、毛色（柔顺、有光泽）消瘦、呼吸（频率、深度），剔除死亡大鼠，术后喂养一周后麻醉重新测量心电图，确定造模成功的大鼠，按照分组要求重新分组饲养。1.5.3ZTY煎剂制备按照中医药服用剂量和实验动物学的要求作为参考标准，根据成人（60kg左右）ZTY的服用剂量应为：扶芳藤30g，黄花倒水莲20g，参三七15g为参考剂量。本实验[11]以动物与人体的每千克体重剂量折算系数表中的折算系数6.25为换算标准，换算大鼠给药剂量，并考虑大鼠的数量，最终称取扶芳藤230g、黄花倒水莲154g、参三七115g，其中参三七为粉末状并用纱袋包好。将以上三味药加蒸馏水浸泡过夜后，加热至沸腾后改用文火煎煮1h，过滤去渣，再次加入蒸馏水沸腾后同样用文火煎煮1h，合并水煎液。将水煎液水浴浓缩至2.72g/ml，认为此浓度即为ZTY高剂量组浓度。用蒸馏水倍比稀释至1.36g/ml为中剂量组，0.68g/ml为低剂量组，分装灭菌后4℃保存备用。1.5.4复方丹参滴丸液体（阳性药物）制备服用剂量约8100mg/60kg（参考说明书），按照大鼠代谢比人高6.25倍的折算系数折算后，每千克大鼠需服用80mg，即每只大鼠服用量约为25mg。采购的复方丹参滴丸规格为：27mg/丸，每丸则为一只大鼠的服用剂量。取10丸复方丹参滴丸研磨，待成粉末状后，加入蒸馏水，按8mg/ml的浓度配制，现用现配。14 1.5.5给药方法先将已制备好的不同剂量的ZTY水煎液水浴加热至温热，复方丹参滴丸液体现配现用，用注射器通过灌胃针给药，按照下表相应的浓度配成等体积（3ml）药液进行灌胃，假手术组和模型组用相同体积（3ml）蒸馏水灌胃，空白组不予灌胃处理（见表1-4）。每天上午9:00灌胃，连续给药4周，并记录大鼠的一般情况、存活情况。表1-3各组大鼠的每日灌胃给药量Table1-3Dailyintragastricdosageofratsineachgroup组别n剂量给药体积给药浓度空白组——0假手术组—3ml0模型组—3ml0ZTY(低)6.8g/kg3ml0.68g/mlZTY(中)13.6g/kg3ml1.36g/mlZTY(高)27.2g/kg3ml2.72g/ml对照组0.08g/kg3ml0.008g/ml1.5.6标本采集给药4周结束后，用10%水合氯醛按照0.35ml/100g的浓度进行腹腔麻醉，打开腹腔，找到腹主动脉用普通采血管取血，每只取血量约5ml，并于室温下静置1h-2h后离心，取血清分装冻存。随后打开胸腔，观察心肌坏死情况，暴露心脏后取出、拍照（见图1-4），造模组、用药组剪取正常与缺血交界区心肌组织，空白组和假手术组取相应部位的心肌组织。取出的心肌组织先用生理盐水漂洗，吸水纸吸干后，取相应大小组织（约150mg）放入冻存管中，标记编号并迅速置于液氮罐中保存，另取部分上述心肌放于固定液中(10％福尔马林)。标本收集完毕后，及时转入-80℃超低温冰箱保存，行后续的HE染色、免疫组化、ELISA、WB、RT-PCR数据检测。15 图1-4心肌坏死图Figure1-4Myocardialnecrosispicture1.6数据记录与测量1.6.1观察并记录大鼠的一般情况、存活情况每日观察并记录大鼠的饮食、精神活动、反应、活动度、毛色（柔顺、色泽）、消瘦、呼吸（频率、深度）爪甲颜色、死亡情况等，并分析其原因。1.6.2记录各组大鼠心电图并统计心率1.6.3心肌组织HE染色及免疫组化检测TGF-β1（1）HE染色：用10％福尔马林固定经生理盐水冲洗过的新鲜心肌组织，放入包埋筐中经乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、5μm切片，放入自动染色机中染色。染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，标记编号及组号，病理HE染色切片制作完成，可于显微镜观察拍照。（2）免疫组化检测TGF-β1：将病理用过的石蜡重新切片、脱蜡、水化（按以下顺序：a.切片放入盛有二甲苯的染缸中，清洗10min×2；b.无水乙醇：10min×2；c.90%乙醇：5min；d.80%乙醇：5min；e.70%乙醇：5min；f.将切片放入盆中，水轻轻冲洗至无酒精味），抗原修复（将玻片放在双蒸水的染缸中5min；然后将玻片放在抗原修复液中，沸水中煮沸10-30min，修复抗原，注意观察，小心组织脱落），拿出玻片，冷却至常温，ddH2O中清洗3min，再用PBS清洗3min。去除PBS液，每张玻片滴加1滴过氧化物酶阻断溶液（试剂A），室温放置10min，阻断内源性过氧化物酶活性，PBS10min×3。去除PBS，滴加一滴正常非免疫动物血清（试剂B）,室温孵育10min。除去试剂，加一抗（选用TGF-β1抗体，用量参照以上试剂用量），4℃过夜。PBS清洗3min×3,除去PBS,每张玻片滴加生物素标记的二抗，室温下孵育10min，PBS清洗10min×3。除去PBS液，16 每张滴加100微升新配的DAB，3-10min，自来水冲洗，苏木素复染1min，自来水冲洗反蓝。玻片经过酒精梯度脱水干燥、二甲苯透明，最后用中性树脂胶封闭，37℃孵育1-3小时，使其凝固，IHC切片制作完成，干燥后于显微镜观察拍照。1.6.4酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清TNF-α、IL-6、IL-10、NE、REN、AngII、ALD、ET-1（1）实验前准备将试剂盒、血清标本提前20分钟取出平衡至室温、解冻。（2）用双蒸水按1：25的比例稀释浓缩洗涤液，未用完的放回4℃冰箱保存。（3）将标准品放入离心机中离心1min,转速为10000转。离心后加入标准品&样品稀释液1ml于冻干标准品中静置10min后颠倒数次直至充分溶解混匀，此时浓度为1000pg/mL。（4）按照说明书步骤配置8个浓度梯度的标准品，分别为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0pg/mL，注意要充分混匀。其中标准品&样品稀释液直接作为空白孔0pg/mL。（5）以1:100的倍数，将生物素化抗体稀释液加入生物素化抗体中配制生物素化抗体工作液。已知实验大鼠7个组，每组取10只大鼠，计算得到需要64个孔，按说明书每孔加入50μl生物素化抗体工作液，得出需要配制3200μl，按实际配制时应多配制100-200μl，最后确定配制3400μl。（注意配制时间与加样之后加入时间差不大于15min），加样：在酶标板上设空白孔（操作中注意不要加样品和酶标试剂）、标准孔、待测样品孔。空白孔加入标准品&样品稀释液50μl体积，标准孔加标准品50μl体积，待测样品孔加入大鼠血清50μl。每个孔加完后覆膜，放入37℃的温育器中孵育45min。注意每次加样时间控制在10分钟内，过程中务必加入酶标板底部并保证尽量不要有气泡，轻轻晃动混匀。（6）洗涤：弃去孔内液体后甩尽孔内液体,在洁净的吸水纸上拍干后每孔再加入350μl洗涤液，浸泡120min，再次甩掉孔内液体，拍干。反复洗板3次。注意吸水纸每次要换新，不能重复利用，整个过程中保证不触及板壁。（7）加酶：先配制酶结合物工作液，以说明书要求每孔加100μl计算，并加预防耗17 损多配置200μl，最终计算出所需6600μl。以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。将配置好的酶结合工作液加入孔中（100μl/孔）。温育、洗涤：加好酶结合工作液后覆膜，放入37℃温育器中孵育30min。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。（8）显色：每孔加底物溶液(TMB)90μl，用同样的方法覆膜后放入避光袋中，37℃孵育15min左右，观察标准孔是否出现明显梯度来确定终止时间。（9）终止反应：每孔依次加入终止液50μl。注意观察反应液的颜色，可以看到蓝色转成黄色。（10）测定OD值：为保证在加入终止液后15min内测定，在进行显色孵育的时候应提前打开酶标仪进行预热。在空白孔调零的状态下，用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。（11）计算浓度：以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，运用excel软件绘制标准曲线，再由标准曲线和已知实验样品的OD值来求出相应浓度并进行分析。每个试剂盒均严格参照其说明书进行，步骤如上述。1.6.5蛋白印迹杂交分析（WesternBlot）法检测心肌组织ET-1（1）制胶：根据目的蛋白分子量大小的不同，配制不同浓度的分离胶；待分离胶凝胶以后，配制凝缩胶；根据样本的数量选择不同孔数梳子。（制胶过程中不能产生气泡）（2）上样：蛋白变性前加入适量的loadingbuffer和DTT,充分混匀，100℃水浴锅中煮沸10min。心肌细胞和心肌组织的正常上样量蛋白含量分别为50μg左右；加入蛋白mark标记。（3）电泳：80V电泳开始，当样品在凝缩胶内成水平线状进入分离胶时（约20min），电压调至100-130V，待溴酚蓝接近分离胶部时停止电泳（也可根据目的蛋白和内参蛋白分子量的大小设定电泳时间长短），总计约1.5小时；（4）电转膜：在电泳结束前准备好滤纸和NC摸；电泳结束后，按照相应的顺序将膜和胶放置在电转膜系统中。电压100V，冰浴下电转1.5小时（根据目的蛋白分子量大18 小自行调节时间）。（6）封闭：将电转完成的NC膜放在预先配制好的5%的脱脂奶粉中封闭90-120min。（7）加一抗：TBST摇床洗膜5min×3次，根据蛋白Marker将NC膜剪开，加一抗，4℃摇床过夜。（8）加二抗：TBST摇床洗膜10min×3次。加HRP耦联的第二抗体（1:100-2000），室温摇床1.5小时。（根据室温自行调节时间）（9）显影：用TBST摇洗NC膜10min×3次。取等量ECL发光试剂A液和B液混合，暗室曝光或放入化学放光成像仪内进行扫描成像。（10）半定量分析：用光学发光成像仪所带软件对蛋白条带进行密度定量分析。以目的蛋白条带密度值/β-actin条带密度值来纠正上样量的偏差，用二者密度比值的高低表示各样本目的蛋白表达量的多少。1.6.6实时荧光定量（RT-PCR）法检测心肌组织TGF-β1（1）将研钵、研棒用清水洗干净后用双蒸水冲洗3次以上，晾干水分，用锡箔纸将研钵、研棒包裹严实，放入高温高压灭菌器中灭菌，灭菌结束放入干燥箱干燥备用。（2）将不锈钢饭盒、镊子、手术剪等实验器械浸泡在1‰DEPC水（6L）中过夜后同不同规格的一次性枪头和无酶EP管一起放入高温高压灭菌器中灭菌、干燥备用。注意标明灭菌日期，以防过期。（3）引物的设计与合成：根据NCBI数据库查询大鼠TGF-β1的基因序列后，由华大基因代为设计合成。引物序列基因（见表1-4）。表1-4TGF-β1、β-actin引物基因序列Table1-4SequenceofTGF-beta1andbeta-actinprimergene基因名称引物引物序列扩增产物长度ForwardAGCCCTGTATTCCGTCTCCTTTGF-β1125bpReverseCAACAATTCCTGGCGTTACCTForwardGAGAGGGAAATCGTGCGTβ-actin93bpReverseGGAGGAAGAGGATGCGG（4）提取总RNA并用超微量分光光度计检测所提RNA浓度及纯度19 RNA纯度鉴定标准①A260/A280比值:pH=7-8.5时，纯RNA的A260与A280的比值≈2.0，A260与A280的比值大于1.8说明样品较纯净，若比值低于1.8，表明样品存在蛋白质或酚类物质的影响，需被纯化。②A260/A230比值:pH=7-8.5时，纯RNA的A260与A230的比值≈2.5，A260与A230的比值大于2.0说明样品较纯净，若比值低于2.0表明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需被纯化。（5）逆转录反应（具体步骤依说明书操作、下同）（6）RT-PCR反应（8）扩增产物特异性验证（9）相对表达量计算步骤①计算校准样品和检测样品的△CT值：△CT（校准样品）=CT（目的基因）-CT（内参基因）；△CT（检测样品）=CT（目的基因）-CT（参照基因）。②计算△△CT：△△CT=△CT（检测样品）-△CT（校准样品）。③计算相对表达量：计算2-△△CT的值。1.7统计学分析采用SPSS21.0统计学分析软件进行数据分析，以均数±标准差（xs）表示，多样本比较采用单因素方差分析，多组计量资料采用ANOVA检验，多样本均数的两两比较采用SNK检验。检验标准为α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠存活情况及死亡原因分析造模和灌胃过程中，大鼠最容易死亡，造模过程中死亡大鼠用造模成活大鼠代替，保证灌胃前的总量。灌胃完成后存活、死亡大鼠统计（见表2-1）：20 表2-1各组大鼠的存活、死亡统计Table2-1Survivalanddeathstatisticsofratsineachgroup空白组假手术组模型组ZTY(低)ZTY(中)ZTY(高)对照组总量（只）10101616161616存活（只）10101112111113死亡（只）0054453其死亡原因分析如下：（1）左冠状动脉结扎时刺破动脉，心脏出血过多死亡。（2）冠状动脉结扎时，靠近主干或结扎面积和深度过大死亡。（3）灌胃时，误入到气管内窒息死亡。（4）胸部或气管切口感染或裂开，影响结果而剔除。（5）无明确原因的其它死亡，如并发症（肺水肿、心衰、过度的炎症反应等）、药物的个体耐受差等。2.2大鼠一般情况比较实验中观察各组大鼠的一般情况（饮食、精神、活动度、毛色（松散、光泽度）、消瘦、呼吸）并记录（见表2-2）：表2-2各组大鼠的一般情况Table2-2Generalsituationofratsineachgroup分组饮食精神、活动度毛色消瘦呼吸空白组正常正常正常无正常假手术组正常正常正常无正常模型组很少差，精神萎靡差明显快、大ZTY(低)偏少可，无嗜睡可稍明显偏正常ZTY(中)偏少可，无嗜睡可稍明显偏正常ZTY(高)较少差，精神萎靡较差明显偏快、大对照组偏少可，无嗜睡可稍明显偏正常2.3各组大鼠心率（HR）的变化实验结束取材时，各组大鼠心率（HR）统计（见表2-3，图2-1）：21 表2-3各组大鼠心率（HR；xs）Table2-3Heartrateofratsineachgroup（HR；xs）组别n剂量心率（HR）空白组10—275±48假手术组10—283±56模型组10—562±78aZTY(低)106.8348±65bcZTY(中)1013.6322±52bcZTY(高)1027.2345±47bc对照组100.08336±51bc注：与空白组、假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；低、中、高、对照组间比较，cP>0.05。Note:Comparedwiththeblankgroupandtheshamoperationgroup,aP<0.05;Comparedwithmodelgroup,bP<0.05,Comparedwiththelowdosegroup,cP<0.05;Thecomparedbetweenthemiddle,highandcontrolgroups,dP>0.05.图2-1各组大鼠心率Figure2-1Heartrateofratsineachgroup假手术组与空白组相比，心率无明显变化（P>0.05），差异无统计学意义；模型组心率比空白组、假手术组明显升高（P<0.05），差异有统计学意义；ZTY（低、中、高剂量）组、对照组心率与模型组相比，次数明显降低（P<0.05），差异有统计学意义；低、中、高、对照组心率变化不明显（P>0.05），差异无统计学意义。22 2.4心肌组织HE染色结果各组大鼠心肌组织HE染色结果（见图2-2），空白组、假手术组（图A、图B）：心肌细胞排列整齐，层次清楚，染色、胞质均匀，细胞核清晰可见，未见炎症细胞浸润。模型组（图C）：心肌细胞溶解坏死、肿胀、断裂、淡染，大量纤维组织增生、结构排列紊乱，并有大量炎症细胞浸润。ZTY（低、中、高剂量）组及复方丹参滴丸对照组（图D、图Ｅ、图F、图G）：心肌细胞溶解坏死、淡染减轻，纤维组织增生不明显，炎症细胞浸润相对较少，炎症反应较模型组明显好转，中剂量组炎症反应较其他用药组好转明显。注：A:空白组；B:假手术组；C:模型组；D:ZTY(低)；E:ZTY(中)；F:ZTY(高)；G:对照组Note:A:Blankgroup;B:Shamoperationgroup;C:Modelgroup;D:ZTY(Low);E:ZTY(Middle);F:ZTY(High);G:Controlgroup图2-2各组大鼠心肌组织ＨＥ染色（10x20倍）Figure2-2HEstainingofmyocardialtissueofratsineachgroup(10x20times)2.5血清炎症因子、ET-1、SNS和RAAS相关因子的ELISA检测结果2.5.1ZTY对各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平的影响（见表2-4，图2-3）23 表2-4ZTY对各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平的影响（pg/ml;xs）Table2-4TheeffectofZTYonthelevelofTNF-alpha,IL-6andIL-10intheserumofrats（pg/ml;xs）组别n剂量TNF-αIL-6IL-10空白组10—101.18±6.5373.37±3.0222.75±3.19假手术组10—103.80±5.8474.01±3.4622.64±3.54模型组10—171.52±6.43a104.25±4.06a29.12±3.87aZTY(低)106.8134.25±5.93b91.87±3.09b36.87±2.64bZTY(中)1013.6119.57±5.64bcd81.75±3.19bcd38.12±2.85bdZTY(高)1027.2116.80±6.61bcd82.75±3.45bcd36.62±3.33bd对照组100.08121.07±5.85bcd83.52±2.45bcd40.53±3.07bd注：与空白组、假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与低剂量组比较，ｃP<0.05；中、高、对照组间比较，dP>0.05。Note:comparedwiththeblankgroupandtheshamoperationgroup,aP<0.05;Comparedwithmodelgroup,bP<0.05;Comparedwiththelowdosegroup,cP<0.05;Thecomparedbetweenthemiddle,highandcontrolgroups,dP>0.05.图2-3ZTY对各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平的影响Figure2-4TheeffectofZTYonthelevelofTNF-alpha,IL-6andIL-10intheserumofrats假手术组与空白组相比，炎症因了水平无显著变化（P>0.05）；与空白组、假手术组相比，模型组TNF-α、IL-6、IL-10水平明显升高（P<0.05）；与模型组相比，ZTY（低、中、高剂量）组、对照组TNF-α、IL-6水平明显降低（P<0.05），IL-10明显升高（P<0.05）；24 差异有统计学意义；与低剂量组比较，中、高、对照组TNF-α、IL-6水平明显降低（P<0.05），差异有统计学意义；IL-10水平无明显差异（P>0.05），差异无统计学意义；中、高、对照组间比较，TNF-α、IL-6、IL-10水平无明显变化（P>0.05），差异无统计学意义。2.5.2ZTY对各组大鼠血清ET-1、NE水平的影响（见表2-5，图2-4）表2-5ZTY对各组大鼠血清ET-1、NE水平的影响（pg/ml；xs）Table2-5TheeffectofZTYonthelevelofserumET-1andNEinratsofeachgroup（pg/ml；xs）组别n剂量ET-1NE空白组10—87.50±4.621.94±0.32假手术组10—93.32±5.942.04±0.28模型组10—140.82±6.26a6.73±1.07aZTY(低)106.8107.27±6.24b4.54±0.58bZTY(中)1013.6101.36±5.86bcd3.16±0.81bcdZTY(高)1027.2120.97±6.65bcd2.95±0.92bcd对照组100.08104.34±4.34bcd3.13±0.76bcd注：与空白组、假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与低剂量组比较，cP<0.05；中、高、对照组间比较，dP>0.05。Note:comparedwiththeblankgroupandtheshamoperationgroup,aP<0.05;Comparedwithmodelgroup,bP<0.05;Comparedwiththelowdosegroup,cP<0.05;Thecomparedbetweenthemiddle,highandcontrolgroups,dP>0.05.图2-4ZTY对各组大鼠血清ET-1、NE水平的影响Figure2-6TheeffectofZTYonthelevelofserumET-1andNEinratsofeachgroup25 假手术组与空白组相比，ET-1、NE水平无显著变化（P>0.05）；与空白组、假手术组相比，模型组ET-1、NE水平明显升高（P<0.05）；与模型组相比，ZTY（低、中、高剂量）组、对照组ET-1、NE水平明显降低（P<0.05），差异有统计学意义；与低剂量组比较，中、高、对照组ET-1、NE水平明显降低（P<0.05），差异有统计学意义；中、高、对照组间比较，ET-1、NE的变化无意义（P>0.05）。2.5.3ZTY对各组大鼠血清REN、AngII、ALD水平的影响（见表2-6，图2-5）表2-6ZTY对各组大鼠血清REN、AngII、ALD水平的影响（pg/ml；xs）Table2-6EffectsofZTYonthelevelsofserumREN,AngIIandALDinratsofeachgroup（pg/ml；xs）组别n剂量RENAngⅡALD空白组10—409.81±20.5641.34±4.32214.55±20.10假手术组10—407.85±23.3140.45±5.42206.53±23.48模型组10—559.97±21.34a81.53±7.99a604.61±35.70aZTY(低)106.8507.85±23.94b66.91±6.57b526.17±29.59bZTY(中)1013.6463.56±20.07bcd52.44±6.34bcd463.65±30.18bcdZTY(高)1027.2454.53±19.62bcd48.87±8.02bcd453.87±27.50bcd对照组100.08457.58±23.55bcd50.14±6.93bcd441.86±29.25bcd注：与空白组、假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与低剂量组比较，cP<0.05；中、高、对照组间比较，dP>0.05。Note:comparedwiththeblankgroupandtheshamoperationgroup,aP<0.05;Comparedwithmodelgroup,bP<0.05;Comparedwiththelowdosegroup,cP<0.05;Thecomparedbetweenthemiddle,highandcontrolgroups,dP>0.05.26 图2-5ZTY对各组大鼠血清REN、AngII、ALD水平的影响Figure2-5EffectsofZTYonthelevelsofserumREN,AngIIandALDinratsofeachgroup假手术组与空白组相比，REN、AngII、ALD水平无显著变化（P>0.05）；与空白组、假手术组相比，模型组REN、AngII、ALD水平明显升高（P<0.05）；与模型组相比，ZTY（低、中、高剂量）组、对照组REN、AngII、ALD水平明显降低（P<0.05），差异有统计学意义；与低剂量组比较，中、高、对照组REN、AngII、ALD水平明显降低（P<0.05）；中、高、对照组间比较，REN、AngII、ALD的变化无意义（P>0.05）。2.6心肌组织ET-1的WB检测结果各组大鼠心肌组织ET-1蛋白表达条带（见图2-6）及相对表达量（见表2-7）注：A:空白组；B:假手术组；C:模型组；D:ZTY(低)；E:ZTY(中)；F:ZTY(高)；G:对照组Note:A:Blankgroup;B:Shamoperationgroup;C:Modelgroup;D:ZTY(Low);E:ZTY(Middle);F:ZTY(High);G:Controlgroup图2-6各组大鼠心肌组织ET-1蛋白表达条带图Figure2-6ET-1proteinexpressionstrippictureofmyocardialtissueofratsineachgroup27 表2-7ImageJ2x分析各组大鼠WB条带平均灰度值及相对表达量（目的/内参）Table2-7WBratswiththeaveragegrayvalueandrelativeexpression(objective/reference)byImageJ2xanalysissoftware.空白组假手术组模型组ZTY(低)ZTY(中)ZTY(高)对照组β-actin227.86221.19220.73207.82204.11195.68207.81ET-1148.50131.68176.8196.0889.30133.24123.08相对表达量0.650.600.800.460.440.680.59大鼠各组心肌组织ET-1的表达如图（图2-7），平均灰度值如表（表2-8），数据结果与肉眼观察基本等同。实验ET-1条带中模型组相对表达量明显高于空白组和假手术组，说明造模后ET-1明显升高；用药后，低剂量组、中剂量、对照组相对表达量较模型组明显降低，而中剂量组降低最明显。2.7心肌组织TGF-β1的免疫组化和RT-PCR检测结果2.7.1TGF-β1免疫组化（IHC）结果图（见图2-7）及结果分析（见表2-8）注：A:空白组；B:假手术组；C:模型组；D:ZTY(低)；E:ZTY(中)；F:ZTY(高)；G:对照组Note:A:Blankgroup;B:Shamoperationgroup;C:Modelgroup;D:ZTY(Low);E:ZTY(Middle);F:ZTY(High);G:Controlgroup图2-7各组大鼠心肌组织IHC（10x20倍）Figure2-7Immunohistochemicalresultsofmyocardialtissueofratsineachgroup(10x20times)28 表2-8ZTY对各组大鼠心肌TGF-β1水平的影响Table2-8TheeffectofZTYonthelevelofTGF-beta1inmyocardiumofrats结果组别IOD(n=5,xs)阳性（+）阴性（-）空白组+-0.79±0.82假手术组+-0.57±0.67模型组+++165.49±7.45aZTY(低)+105.51±9.37bcZTY(中)+99.40±8.49bcZTY(高)+109.78±6.34bc对照组+104.86±8.12bc注：与空白组、假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；低、中、高、对照组间比较，cP>0.05。Note:Comparedwiththeblankgroupandtheshamoperationgroup,aP<0.05;Comparedwithmodelgroup,bP<0.05,Comparedwiththelowdosegroup,cP<0.05;Thecomparedbetweenthemiddle,highandcontrolgroups,dP>0.05.空白组、假手术组呈弱阳性，模型组呈强阳性，ZTY（低、中、高剂量）组、对照组呈阳性，与测量的积分光密度值（IOD）趋势相似。2.7.2TGF-β1和β-actin扩增曲线、融解曲线及产物电泳图（1）通过罗氏LightCycler96PCR仪，对各组大鼠TGF-β1基因水平和β-actin内参基因的mRNA进行RT-PCR测定。从得到的扩增曲线可以看出，基数期稳定在同一水平，拐点清晰，平行性良好。从溶解曲线可以看出，最大峰值出现于同一位置，无明显异常双峰。溶解曲线和扩增曲线均能说明各组细胞因子mRNA的扩增产物特异性良好（见图2-8、2-9、2-10）。29 图2-8扩增曲线Figure2-8Amplificationcurve图2-9溶解曲线Figure2-9Solutioncurve图2-10mRNA扩增产物电泳图Figure2-10ElectrophoreticpictureofmRNAamplificationproductsof（2）RT-PCR检测结果比较ZTY对各组大鼠心肌TGF-β1表达的影响(见表2-9，图2-11)30 表2-9ZTY对各组大鼠心肌TGF-β1表达的影响（xs）Table2-9TheeffectofZTYontheexpressionofTGF-beta1inmyocardiumofrats（xs）组别n剂量TGF-β1空白组10—1.00±0.00假手术组10—0.98±0.09模型组10—1.52±0.25aZTY(低)106.81.03±0.12bZTY(中)1013.60.72±0.18bcdZTY(高)1027.20.69±0.23bcd对照组100.080.67±0.29bcd注：与空白组、假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与低剂量组比较，cP<0.05；中、高、对照组间比较，dP>0.05。Note:comparedwiththeblankgroupandtheshamoperationgroup,aP<0.05;Comparedwithmodelgroup,bP<0.05;Comparedwiththelowdosegroup,cP<0.05;Thecomparedbetweenthemiddle,highandcontrolgroups,dP>0.05.图2-11ZTY对各组大鼠心肌TGF-β1表达的影响Figure2-11TheeffectofZTYontheexpressionofTGF-beta1inmyocardiumofrats假手术组与空白组相比，TGF-β1水平无显著变化（P>0.05）；与空白组、假手术组相比，模型组TGF-β1水平明显升高（P<0.05）；与模型组相比，ZTY（低、中、高剂量）组、对照组TGF-β1水平明显降低（P<0.05），差异有统计学意义；与低剂量组比较，中、31 高、对照组TGF-β1水平明显降低（P<0.05），差异有统计学意义；中、高、对照组间比较，TGF-β1变化无统计学意义（P>0.05）。3讨论3.1大鼠心肌梗死动物疾病模型与临床冠心病的区别与联系在动物身上复制人类疾病是现代医学研究的一种重要手段，无论是研究疾病的病因、[12]发病机制、治疗及预防，还是在药物筛选等方面，为临床研究提供了很好的参考依据。复制动物疾病虽然具有可控性、重复性、易行性、经济性等优点，但动物种类、致病因素、相似程度等方面与人类疾病有一定的区别，因此，动物疾病模型在造模方法、建模标准、模拟程度、利用价值、与人类自身疾病的相似度等方面，还需要认真思考和探讨。[13]本文中大鼠心肌梗死动物疾病模型与临床冠心病有着本质的区别与联系，大鼠心肌梗死动物疾病模型是对健康大鼠冠状动脉采取手术结扎的方法阻断冠状动脉供血，引起心肌缺血、缺氧导致部分心肌坏死，心脏功能降低而引起供血不足、血液淤积等一系列症状。其病因等同于外伤，炎症反应、心肌坏死部位相对局限，心功能与坏死面积有关，代偿能力相对强，并发症少，预后较好。临床冠心病，是在多种危险因素（年龄、吸烟、高脂血症、高血压、糖尿病、肥胖、高同型半胱氨酸血症等原因）和遗传因素影响下，冠状动脉血管内壁逐步引起冠状动脉粥样硬化病变导致血管腔狭窄、闭塞，造成心肌缺血、缺氧甚至坏死而导致的心脏病，病因复杂，病史较长，炎症反应持续，心脏功能整体受损，病情进行性发展，代偿能力相对较弱，并发症多，预后较差。因此，两者在病因、病机、演变规律、影响因素等方面有着本质的区别和联系。本实验中大鼠冠脉结扎后急性心肌梗死可出现心功能不全甚至心衰症状，与临床冠心病心肌梗死及病情进展有一定相似度，故可借此动物疾病模型模拟临床冠心病心肌梗死后病理生理过程，[14]并可进行相关转化医学的研究。在动物的选择方面亦有一定的区别，不同动脉粥样硬化动物模型各有自己的优缺点，ShimJ[15]发现，越大动物越接近人的生理特点，猪的动脉粥样硬化动物模型明显优于它动物，而本研究因实验条件有限，只能采用大鼠进行。因此，在借用该动物模型进行生物医学研究时，应该根据研究的目的和意义，正确选择和利用动物疾病模型与人类疾病的相似点作为研究的方向。32 3.2大鼠心肌梗死动物疾病模型可靠性分析本研究参考LuoL等[16]的实验方法，采用冠状动脉结扎法复制心肌梗死大鼠模型，该方法手术操作准确、造模成功率高，并可用心电图进一步确定心肌坏死情况，可靠性好，此种造模方法被国内外许多学者使用。本实验结合预实验情况，多次改进手术方法，熟练掌握操作过程，造模的成功率提高到83%左右，明显高于文献报道的71.4%[9]，可保证足够的模型大鼠进行实验。从实验结果的一般情况观察发现，结扎后大鼠出现呼吸困难、精神差、饮食少、消瘦、四肢紫绀等类似急性心衰症状与冠心病心肌梗死后心功能不全症状一致；实验取材时心肌梗死的图片，梗死部位苍白、纤维化，向外澎出，类似心肌梗死后的室壁瘤，个别与周围组织粘连，与临床冠心病心肌梗死后综合征相似。说明该方法完全可以模拟冠心病心肌梗死及梗死后的病理及病生过程，符合大鼠心肌梗死动物疾病模型的诊断和要求，可作为冠心病心肌梗死动物疾病模型进行相关研究。3.3壮通饮组方及现代研究3.3.1壮通饮方剂组成及单方研究壮通饮（Zhuangtongyin，ZTY）是广西壮族地区民间医生根据壮医理论从疏通人体“三道两路”的角度出发，用田七（参三七）、扶芳藤、黄花倒水莲3味广西特色壮药配伍而成，是民间治疗“龙路病”及“胸闷、心悸、气短”等心肌缺血症状（心肌缺血血瘀证）的传统经验方，该组方药味少而精炼、用药精专、配伍严谨，有广泛临床应用基础，用于治疗糖尿病肾病、高脂血症、风湿骨痛等病症，疗效确切，但其具体药理学、[17]毒理学机制及有效成分尚不十分清楚。多年来，ZTY中3味药物中单味药物已开展了多方面研究和有效成分的提取，备受国内外学者关注。现代研究发现，三七，其提取物[18]三七皂苷（PNS）对心血管疾病有广泛的药理作用，不仅具有改善心肌缺血-再灌注损伤、损伤后心功能障碍、心肌Ca2+运转、心率失常等抗冠心病作用，还具有降血压、血脂、血液粘稠度、抗血小板凝集和抗血栓形成、松驰血管平滑肌等作用，对多种心血管[19]疾病起到良好的预防和治疗作用，是现代治疗“三高”患者的临床常用药。WangY等研究发现，三七及其主要成分可通过一氧化氮和环氧合酶途径介导内皮依赖性舒张功能。[20]扶芳藤，从茎叶中分离可得到有效成分卫矛醇(dulcitol)，现代研究发现，其水提液、33 醇提液具有提高机体非特异性免疫功能、活血化瘀、补血、镇痛、抗心肌缺氧、抗氧化、改善微循环障碍、有效预防血栓形成等作用，其毒性甚微，临床用药安全可靠。黄花倒水莲(PolygalafallaxHemsl)，其皂苷成分五环三萜皂甙(ReiniosideC)，具有抗炎、抗凝、[21,22]免疫增强、调脂、耐缺氧、抗病毒等方面的作用，是现代治疗高脂血症习用药材。3.3.2壮通饮组方的现代研究壮医治疗疾病的关键是一个“通”字，经多年的临床试用发现，中药的单一用药常因药物的成份单一，作用局限，对疾病的干预效果较差，而复方治疗不仅能发挥中医的临床特色，还能从多种机制、多个靶点对多种小分子物质进行干预，药物之间起到协同[23]治疗作用，弥补单方力不能及的缺点。庞路路等在ZTY对心血管作用的研究进展综述中，总结近几年ZTY经验方及其各单味药对心血管作用的相关文献，发现ZTY可从4个方面（抗心肌缺血作用、抗心律失常作用、降低血黏度和防止血栓形成）对心肌缺[24]血有较好的保护作用。刘燕平教授用ZTY治疗浊脂瘀阻型高脂血症56例患者发现，ZTY治疗高脂血症有显著疗效，其具有降低血脂、血粘、防止血栓形成的作用。江旭锋[25]用ZTY对糖尿病肾病肾虚血瘀证大鼠肾脏保护作用的实验研究发现，其可抑制蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)活性和多种细胞因子的表达，起到改善血瘀证的作用。曾[26]庆春用ZTY干预糖尿病肾病大鼠氧化应激机制的实验研究发现，ZTY具有抗氧化应[27,28]激的作用。根据“病证结合”的原理，陈晓锋等用ZTY治疗脑梗死的临床观察及大脑海马区内源性神经干细胞(NSC)分化的实验研究发现，其可通过降低血小板聚集率、全血粘度、血浆粘度等作用治疗急性脑梗死，效果显著，并具有促进神经再生作用，推荐ZTY在临床上推广运用。ZTY临床应用价值部分已被认可和验证，而在心肌梗死及心衰中的具体分子机制和疗效有待进一步科学研究和考证。3.4心肌梗死炎症过程及ZTY干预后的影响3.4.1心肌梗死炎症反应的发生过程成人心脏主要由心肌细胞，心肌成纤维细胞及内皮细胞3种细胞构成，心肌组织内存在少量免疫细胞，这些细胞在心梗后迅速活化、释放细胞因子，并募集外周血中的相[29]关细胞（中性粒细胞、单核-巨噬细胞、肥大细胞、血小板等），共同构成了炎症反应34 的细胞基础，启动炎症级联放大反应，同时产生大量的ROS，激活补体系统，刺激P选择素的表达，上调细胞因子及趋化因子的合成及活化，从而激活NF-κB通路，促进白细[30]胞趋化，发挥促炎作用。冠心病患者危险因素（年龄、性别、吸烟、血脂异常、高血压、糖尿病、肥胖、家[31]族史、高酮型半胱氨酸血症等）长期刺激，使炎症反应持续存在，低度炎症状态可能是引起MMPs和组织蛋白酶蛋白水解活性激活的关键因素，其可促进细胞外基质的破坏，严重时可直接溶解斑块表面的纤维帽引起斑块破裂，继发血栓形成而引发心肌梗死[32](MI)，MI可以看作是炎症反应的一个“完美爆发”，其介导了局部和全身的炎症反应。心肌梗死后30分钟，中性粒细胞聚集在梗死部位，释放ROS和炎症因子，通过正反馈[33]机制引起炎症细胞趋化运动和炎症反应的发生，及时分解、清除梗死组织和细胞。中性粒细胞是一种参与早期炎症反应具有噬菌作用的循环粒细胞，并且是参与坏死组织清[34]除、心肌炎症修复及巨噬细胞表型转换的重要细胞，心肌梗死发生6h后，其在趋化因子的作用下大量迁移到受损组织中，迅速释放蛋白水解酶、氧自由基和活性氮中间体，杀伤外周血细胞，从而逐步对心肌细胞产生损伤。趋化因子和细胞因子对炎症的发生、发展过程同样不可或缺。巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）在大量炎症刺激过程中被认为是炎症反应的调整点，白细胞中高表达并促进动脉粥样硬化的发生和发展，在调节代谢[35]过程中，MIF也具有一定作用，MIF调节炎症细胞的激活并释放出其他促炎因子，使大量的炎症细胞浸润，释放炎症介质，因此，心肌梗死发生后，细胞因子包括TNF-α、[36]IL-1、IL-6在内的促炎因子，已成为经典生物标记和抗炎治疗的重要靶点。心肌梗死后3-7天，中性粒细胞通过细胞凋亡和抑制信号的级联反应负反馈调节缺血性梗死灶的炎症损伤，促进梗死愈合，中性粒细胞介导了此阶段的炎症反应，既清除坏死组织，又促进组织的修复和愈合。正确清除坏死细胞和组织，为组织的修复提供了很好的空间。巨噬细胞也参与了炎症反应，M1型巨噬细胞在心梗后的最初1-3天起作用，M2型巨噬细胞在MI后4至7天起作用，并通过释放高水平的IL-10[37]和转化生长因子（TGF-β）[38]，介导胶原蛋白及纤维组织的无序生成，而巨噬细胞因其表型转换，效率不及中性粒细胞迅速，因此，早期的炎症对组织的破坏作用大于其修复作用，修复以中性粒细胞为35 主，可产生大量炎症介质及与明胶相关的脂质运载蛋白（NGAL），释放入血促进梗死心[39]肌愈合，后期修复是多种炎症细胞（主要是巨噬细胞）及因子综合作用的结果。3.4.2心肌梗死后炎症干预的益处心肌梗死一旦发生，固有免疫系统就会激活，为了适应炎症反应，短期内上调起炎症作用的炎症细胞和相关因子，这种内源性细胞和因子级联启动炎症小体（Toll样受体、炎性体等）及相对下游炎症细胞因子，对心脏和外周循环产生有害作用，并共同促进心肌梗塞后心室重构，影响心衰的进展。根据“炎症假说”，一些细胞因子已被认为是心肌[35]梗死潜在的生物标志物，甚至是心室重塑或心衰治疗的靶点。积极的炎症干预对心肌梗死及预后将有大有裨益，如：在缺血早期炎症阶段阻断炎症反应可减弱或阻止白细胞介导的心肌细胞损伤。阻止促炎信号不适当的激活，可能减少修复区心肌细胞的慢性凋亡。炎症的减弱可能抑制蛋白酶的激活，提高愈合瘢痕的抗拉强度，防止心肌不良重塑。抑制促纤维化炎症信号通路，可减弱心脏纤维化重构。选择性激活活化的依赖性祖细胞进入梗死区可能促进血管生成，甚至有助于心肌细胞再生。促炎信号通路与多种心律失常有关，减轻炎症可能抑制心律失常的发生。抗炎治疗可防止斑块破裂，减少冠状动脉再发事件的发生率等。阻断炎症对心肌损伤的上述各方面反应的关键作用表明，针对炎症信号靶向阻断治疗可防止急性心肌梗死患者的心力衰竭，降低死亡率，这为急性心肌梗死后的抗炎治疗提供了强有力的证据。3.4.3ZTY对心肌梗死大鼠心肌病理的影响通过结扎冠状动脉后，心肌发生坏死，炎症细胞（中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等）聚集在坏死部位，启动细胞凋亡、自噬，释放溶解酶、趋化蛋白，清除坏死组织，炎症细胞向炎症部位聚集，引发多种炎症反应并促进组织的修复。从心肌HE染色观察，可以发现模型组大鼠有大量炎症细胞浸润，坏死心肌被纤维组织、胶原蛋白代替，坏死周围心肌细胞形态学发生改变。ZTY干预后，各组炎症细胞浸润、纤维化减少，可能与药物的干预有关，由此可说明，ZTY具有一定的抗炎症细胞聚集及抗纤维化的作用。3.4.4ZTY对心肌梗死大鼠炎症因子的影响炎症因子的变化，是炎症反应的敏感指标，是引起级联放大效应的关键环节，对炎症36 的发生、发展和组织的修复不可或缺。炎症因子（如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、NO等）多由种炎症细胞释放，而这些因子中有促炎和抗炎之分，且有些具有双向性，其中TNF-α、IL-6是促炎因子，IL-10是抗炎因子。EskandariV等[40]研究发现，缺血性心脏病与非缺血性心脏病相比，TNF-α和IL-6水平升高。CHF患者血清TNF-α和IL-6水平与充血性心力衰竭的严重程度呈正相关，外周表达的促炎细胞因子TNF-α和IL-6，是慢性心脏病患者的严重程度和预后的重要指标。TabrezS等[41]研究发现，IL-10是一种抗炎细胞因子，参与冠状动脉炎症发生发展和相关的病理生理过程，IL-10的水平高低与心血管病患者并发症严重程度一致，且其启动子多态性与心血管病有显著的相关性，综上所述，心血管病变的严重程度与炎症因子的表达具有明显的相关性。本实验对TNF-α、IL-6、IL-10三个炎症因子作了观察，发现心肌梗死大鼠TNF-α、IL-6、IL-10明显升高，说明心肌梗死炎症反应明显，炎症因子升高，药物干预后，TNF-α、IL-6表达明显降低，说明ZTY具有抗炎作用。中、高剂量组、对照组较低剂量组降低明显，说明ZTY的抗炎效果与药物剂量呈一定的量效关系，但中、高剂量组、对照组差异不明显，可能ZTY中剂量组已达到有效量，不能随剂量增加再升高，且疗效与阳性药物对照组相似，高剂量组也可能超过了大鼠的最大代谢能力，其疗效不能再继续升高。IL-10的表达持续升高，可能与坏死后炎症的持续反应或维持斑痕组织的修复有关，且药物对其影响不大。通过上述实验结果分析可知，心肌缺血坏死，炎症细胞聚集并释放大量炎症因子，致使血清促炎因子升高，用ZTY干预后其结果发生相反的变化，说明ZTY具有对抗炎症细胞聚集和炎症因子释放的作用，对大鼠心肌缺血具有一定的保护作用，其机制可能与调节白细胞趋化运动、单核细胞、淋巴细胞等炎症细胞的聚集、炎症因子释放有关。实验中不同浓度的ZTY干预的效果差异，可能与药物有效成分的纯度、有效浓度、副作用、大鼠代谢及个体差异有关，低剂量可能药效不足，达不到最佳效果，而高剂量可能超过机体的代谢能力，因此，低中高剂量组间数据有一定的差异性。3.5心肌梗死后的继发性病变及ZTY对SNS、RAAS相关因子的影响3.5.1心肌梗死后的继发性病变37 心肌梗死发生后，依心肌梗死部位不同，受损部位的功能就会缺失，尽而影响心脏的整体结构（早期：心肌肥厚、晚期：心肌变薄、心脏扩大）改变和功能降低，随着时间的推移，不断向心衰方向发展，近年来，随着对心衰基础与临床研究的深入，心衰已不再被看成是单纯以血流动力学紊乱为特征的综合征，其发生不仅是心肌原发的病理过程，而且与不同的神经内分泌激活及代谢机制形成有关，神经体液系统、炎症细胞及炎症因子在心衰发生与发展过程中的作用逐渐受到人们的关注。在充血性心力衰竭时，现已知的心衰代偿机制主要有Frank-Starling机制、心肌肥厚、神经体液机制、血管活性物[42,43]质释放等多种代偿，然而，从长远来看，心肌肥厚是心力衰竭发展的主要危险因素，其转化过程与多种分子(特别是TGF-β)有关，引起心肌重构，在重构过程中导致失代偿性肥大和扩张，通过细胞凋亡或坏死的形式引起心肌细胞死亡，逐渐出现心肌纤维化、心肌细胞功能障碍，严重时心脏衰竭[44]。目前，细胞因子水平增高主要见于有显著心衰症状的患者，并且血浆肿瘤坏死因子和白细胞介素浓度与心衰的临床表现有关，但是，细胞因子与心衰之间的因果关系及具体机制目前尚不清楚，。神经体液系统的活性改变是机体对心排量减少的重要代偿机制之一，神经体液因素对于心衰的作用是多系统、多因子参与的复杂网络。在充血性心力衰竭时，血管加压素的分泌、SNS和RAAS的激活有助于调节前负荷，增加心肌收缩力，并通过增加体循环[45][46]血管阻力维持动脉压和血管的灌注。王汉森、杨光敏在心力衰竭发病机制研究进展中指出，心衰时促炎症性细胞因子（ET-1、TNF-α、IL-1、IL-6）血浆浓度升高，使人们[47]认识到，促炎症性细胞因子可能在心衰发展中起一定作用。ToruOka等在心力衰竭的分子机制与再生治疗的综述中指出，从心肌肥厚到心力衰竭的发展与各种分子（NE、[48]AngII、ET-1、TNF-α、TGF-β等）机制有关。武元等在心力衰竭神经体液作用机制的研究现状中指出，SNS、RAAS、血管活性物质(ET、NO)、炎症因子(TNF-α)，白介素(IL-1)及免疫因素、利钠肽类（ANP、BNP）等神经体液因子的升高可增加动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）风险，而应用阿托伐他汀类药物后能降低血浆氧化应激和炎症引起的ASCVD风险，因此，抑制SNS、RAAS的活性及其相关因子的释放，可影响心[49]衰患者的预后。38 3.5.2ZTY对SNS、RAAS相关因子的影响心衰后神经体液（SNS，RAAS）通路激活和相关分子（NE、REN、AngII、ALD）的释放，作用于心肌细胞受体和蛋白，来维持心脏功能，而上述分子的持续刺激必然会导致心肌结构的改变，引发心室重构，加重心衰，造成恶性循环，因此，抑制心衰中SNS，[6]RAAS的激活和相关因子的释放，对缓解病情、改善预后、降低死亡率具有重大意义。本实验对心肌梗死4周后大鼠NE、REN、AngII、ALD、心率作了观察，发现模型组一般情况较差，NE、REN、AngII、ALD明显升高，心率加快，说明心梗后大鼠有心衰表现，用ZTY干预后表达明显降低，心率好转，一般情况好转，说明ZTY对其有一定的作用，其机制可能与抑制SNS，RAAS内分泌机制的激活有关，从而起到改善心功能、抑制心肌重构的作用。中剂量组效果优于低剂量组，说明ZTY疗效与浓度呈一定的量效关系，其疗效及作用形式与干预抗炎因子基本等同，并有一定的相似性。3.6ZTY对心肌梗死大鼠心肌ET-1、TGF-β1水平的影响3.6.1ZTY对心肌梗死大鼠心肌ET-1水平的影响ET-1对内皮功能障碍和血栓形成起重要作用，被认为是引起的冠脉痉挛及心绞痛发作的重要因子。在急性冠脉综合征中,特别是ST段抬高型患者，ET-1已被认为是一种[50]新的预后指标，稳定型冠心病患者，ET-1是心血管预后的独立危险指标。急性心肌梗死患者，ET-1早期升高，发病数小时达到高峰，以后逐渐下降，ET-1水平与有无并发症、心功能状态明显相关，冠心病所致心衰患者，ET-1浓度与冠心病的严重程度相平行，因此，降低冠心病和心衰患者ET-1的表达，对冠心病及心衰的预后具有一定的保护作[51]用。本实验用ELISA和WB两种实验方法对心肌梗死大鼠ET-1作了观察，发现模型组大鼠ET-1明显升高，用ZTY干预后表达明显降低，说明ZTY可减少ET-1的释放，从而起到改善心衰的作用。中剂量组效果优于低剂量组，说明ZTY疗效与浓度呈一定的量效关系。3.6.2ZTY对心肌梗死大鼠心肌TGF-β1水平的影响心肌梗死后，心肌细胞的突然坏死触发一种强烈的炎症反应，清除坏死组织死亡细39 胞和基质碎片，同时激活修复程序。越来越多的证据表明，TGF-β家族成员对梗死后的炎症和修复反应起关键性调节作用，其可调节心肌细胞的生存反应，促进单核细胞聚集，抑制巨噬细胞促炎基因的表达，抑制内皮细胞粘附分子的合成，促进肌成纤维细胞转化[52]及合成细胞外基质，并介导血管生成和抑制作用。TGF-β1主要由血小板和活化的巨噬细胞分泌，活化的TGF-β1可以趋化单核细胞、促进成纤维细胞的增生、移动和合成胶原及纤维黏连蛋白，后者又能抑制胶原的降解，对纤维化的发生发展起关键的作用。TGF-β1可能通过产生足够多的细胞外基质，加固纤维帽，从而达到抗炎的作用。而低水平的TGF-β1也是冠状动脉粥样硬化的危险因素，这说明TGF-β1可能作为保护因子参与了动脉粥样硬化的病理过程，但HanA等[53]通过结扎冠状动脉左前降支诱导的大鼠急性心肌梗死模型研究得出，抑制大鼠TGF-β1/Smad3和NF-κB通路的相关分子，也减少心肌的炎症和纤维化，从而保护心脏功能。LiY等[54]研究指出，AngⅡ诱导的心肌纤维化可通过TGF-β1通路失活导致AKAP12蛋白减少而阻止，说明心肌纤维化与TGF-β1高度相关。本实验通过免疫组化和RT-PCR两种方法对心肌梗死大鼠TGF-β1作了观察，发现模型组TGF-β1明显升高，用ZTY干预后表达明显降低，说明ZTY可减少TGF-β1的水平，而上述研究中提示TGF-β1的减少可减弱其保护作用，分析其降低的原因，可能与ZTY干扰TGF-β1的合成、表型发生转换或者后期梗死修复与TGF-β1浓度有关，或者组织的修复与炎症的不同阶段或其多效性有关，其原因不是很清楚，有待进一步研究。中剂量组效果优于低剂量组，说明ZTY疗效与浓度呈一定的量效关系。3.7炎症与抗炎的思考炎症与抗炎是一个矛盾体，在组织的损伤与修复中起重要作用，两者也可相互转化，虽然越来越多的实验证据表明，在MI患者中，促炎性细胞因子可能是有希望的治疗靶点，但它们的多效性和多功能效应，在组织损伤和修复中起重要的作用，在药物干预及治疗方面的影响也构成了的重大挑战，在冠心病中，TGF-β1是一种抗炎性因子，是因为其能促梗死区纤维化，稳定斑块或加速坏死组织纤维化，保持组织完整性，但在非梗死区却影响了心肌收缩与舒张功能，是不利的一面。实验中TGF-β1与组织的修复有关，40 故含量有所减少，但药物的干预后出现降低，是否影响了瘢痕的修复和愈合，是治疗方面的一个重要问题。TGF-β1的降低也可能在组织修复的后期，不需大量TGF-β1，仅与纤维组织的维持有关，而IL-10的升高与组织修复有关，干预后未出现降低，可能不是药物作用靶因子或其具有多态性发生逃逸有关，具体原因不是很清楚。在心肌梗死心脏的损伤和修复过程中，有一些复杂而关键的炎症信号通路与其有关，炎症通路在延长心肌细胞死亡和触发基质降解中起着重要作用，在清除梗死区坏死细胞的同时保留心室疤痕结构完整性的方面也起着关键作用。在炎症损伤的过程中，如果早期抑制一个起损伤作用的炎症信号通路，可能阻止组织本身的修复作用；延长或扩大炎症信号通路或通过激活蛋白酶降解细胞外基质的心脏，可能会加重心肌不良重塑，也可能通过心肌细胞间的信号转导引发心肌细胞凋亡反应的发生，并促进非梗死心肌纤维化信号的激活，对于一些修复不良的区域，可能边发生炎症反应边进行重新修复，以维持组织的完整性和功能，因此，损伤和修复可能是同时存在的一个过程。炎症在MI修复中起了重要的作用，但抗炎治疗也给MI的预后带来了挑战，如过早的抗炎可能干扰组织的修复，增加心脏破裂的发生率，而晚期抑制可能抑制促纤维化信号，改善舒张功能。在MI后抑制TGF-β1有促进薄弱部位动脉瘤破裂的严重风险。因此，抗炎治疗需要考虑到时间和空间重要性及用量大小等因素，在MI之后，是否有一个安全有效的靶向治疗[35]的机会之窗和抗炎药量的调整，有待进一步研究。3.8临床冠心病抗炎治疗的依据炎症现象作为临床冠心病的核心机制之一，人们一直在对其进行深入的研究，且临床冠心病的病理生理基础与内皮损伤和炎症高度相关，危险因素使机体持续处于低度炎症状态，粥样斑块在这种低度而持续炎症的内环境中易发生破裂而形成血栓引起心肌缺[55]血梗死。危险因素的炎症和心肌梗死的炎症合在一起，使炎症反应更加复杂而剧烈，[56]并发症明显，病情变化更快、预后更差，因此，临床冠心病的抗炎治疗更加关键，不但可起到减弱氧化应激、稳定斑块、防止血栓形成、减少并发症的发生、延缓病情进展等保护作用，还可起到改善疾病转归和预后，降低病死率的作用，这为临床冠心病的持续抗炎治疗提供了可靠证据，或许ZTY除了具有上述机制外，对危险因素引起的冠心41 病炎症也有一定的作用，对冠心病患者带来潜的在获益，重点集中于其抗炎活性。3.9ZTY量-效关系及作用机制的探讨3.9.1中药的量-效特点及ZTY量-效关系中药方剂含有多种成分，对疾病具有多靶点的作用，并能产生综合治疗效应。目前关于中药量效的研究仍主要停留在经验积累和个案分析探索阶段，临床用药时剂量与疗[57]效关系极为密切，具体药量、药效还需实验及临床数据来调整。在一定范围内同一药物随着剂量的递增，药物效应也相应增加，副作用会加大，因此，药物的安全性和有效性也是测验的重要指标。中医合理、规范用药可为提高临床疗效提供指导，为中药的开发和创新研究提供基础，也必将为中医药现代化水平的提升做出应有的贡献。中药的量效关系除具有一般药物所共有的属性，又具有基于整体观的用药规则，有所谓“中医不传之秘在于用量”的说法，在配伍中因用量不同，调其偏性，制其毒性，形成诸药相辅相成或相反相成的整体效应，对疾病产生切中病机的效果，甚至产生新的功能，从而发挥更大的治疗效应。中药方剂可因组方整体药量大小变化或组内药量的不同配比而产生[58]不同的量效关系和治疗效果，组方遣药配伍呈非线性的量效关系，精减方组方简单、配比固定，可因药量大小呈现线性的量效关系。本研究根据心肌缺血病症的经验用量，维持方剂中配伍关系和固定比例不变，按总体用量差异分了低、中、高三个剂量组，根据实验中一般情况、剂量和量效关系分析可知，中高剂量组降低炎症和神经体液因子的效果明显优于低剂量组，中高剂量组间效果无明显差异，但高剂量组大鼠一般情况最差，死亡率相对较高，可能与超过大鼠机体代谢或副作用加大有关，整体来说，中剂量组效果最佳。3.9.2ZTY治疗心肌梗死可能机制[59]关于中药抗心肌缺血作用机制，许波华等通过文献整理和分析发现，其机制与降低心肌耗氧、清除氧自由基、抑制钙超载、抑制细胞凋亡、调节血栓素A2(TXA2)/前列腺素I2(PGI2)和一氧化氮(NO)/内皮素(ET-1)的比值、促血管生成等方面有关。从本实验研究结果推测可知ZTY可改善大鼠一般状况、减少死亡，降低心肌炎症细胞聚集、减少炎症及神经体液相关因子释放，对冠心病心肌梗死有一定治疗作用，其机制可能与减42 少炎症细胞聚集、炎症（TNF-α、IL-6、ET-1、TGF-β1）及神经体液因子（NE、REN、AngII、ALD）的释放或干扰其合成有关，并以此减弱心室重构，延缓心衰发展，改善预后。4不足与展望本课题旨在大鼠冠状动脉结扎的基础上建立心肌梗死模型，模拟心肌梗死的发病机理，用ZTY干预后，从分子水平探讨其对心肌梗死的保护机制。作为实验阶段的初步研究，有一定的不足之处，仍需进一步的完善和改进。(1)因动物疾病模型与临床疾病仍有一定差距，动物疾病模型虽有一定的可控性，但因种属不同、实验过程复杂、操作步骤多，仍有一定的不可控因素和无法避免的实验误差。(2)重复实验较少，存在一定偶然性和不可预知因素，对实验结果有一定的影响，还需多次重复及大样本的研究，以便从更多技术和方法改进实验，使实验更加严谨、专业、系统、精准。(3)此心肌梗死疾病模型病因源于人为造成，起病因素单一，与多因素（社会-环境-生物）自然发病的临床冠心病仍有很大的区别。药物的制作方法、提纯工艺有待进一步提高，疗效和机制基于实验数据的推测，有待临床进一步验证。(4)本实验研究只是从心肌梗死后的细胞、炎症因子、神经体液因子角度进行探讨，但炎症分子之间的信号通路、网络关系、上下游因子变化情况、心肌内蛋白结构改变等其它作用机制尚不清楚，有待进一步深入研究和探索。43 结论1.本研究结果表明壮通饮具有改善大鼠一般状况，降低心肌炎症细胞聚集、减少炎症（TNF-α、IL-6、ET-1、TGF-β1）及神经体液相关因子（NE、REN、AngII、ALD）释放，提示其对冠心病心肌梗死及心衰的发展有一定治疗作用。2.本研究结果表明壮通饮干预冠心病心肌梗死大鼠的作用机制可能与其减少炎症细胞聚集、炎症（TNF-α、IL-6、ET-1、TGF-β1）及神经体液因子（NE、REN、AngII、ALD）释放或干扰其合成有关，且以中剂量组效果最佳。44 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综述氧化应激、炎症与冠状动脉粥样硬化关系的研究进展作者姓名：张世田导师姓名：黄岑汉冠心病（Coronaryheartdisease,CHD）主要是指冠状动脉粥样硬化性疾病，公认的是一种复杂的炎症性疾病，尽管在动脉粥样硬化疾病的介入和药理学治疗方面有所改进，但它仍然是导致死亡的常见疾病，其发生机制有多种原因和学说，如脂质浸润学说、氧化应激学说、炎症学说等，但发生机制尚未完全明了，治疗和预防仍是难点。随者免疫和分子生物学研究的进展、一些新的设备及检查技术的应用，冠状动脉粥样硬化的一些新的发病原理和影响分子不断被证实和发现，目前多数学者依然赞成冠状动脉粥样硬化[1]的形成是由氧化应激、炎症反应导致血管内皮细胞功能损伤导致的血管性病变，是促其发生的主要机制,下面就从冠状动脉内皮细胞的生理作用，氧化应激、炎症反应的角度对冠状动脉粥样硬化的发生和发展作一综述。1冠状动脉粥样硬化的病理过程及危险因素1.1冠状动脉粥样硬化的病理过程冠状动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）病理变化过程可分为脂质条纹期、纤维样[2]板块期，粥样斑块期及继发性改变期四个期，经过长时间的病变和发展，粥样斑块形成、破裂，最后导致管腔变窄，缺血缺氧，心肌坏死性病变，引发心绞痛、心肌梗死等冠心病的发生。在这些一系列病理变化过程中，大量脂质沉积内膜下，病变部位发现大量炎症细胞（巨噬细胞、白细胞、T细胞、泡沫细胞、增生的平滑肌细胞、肥大细胞等）和炎症因子（TNF、IL、INF等）始终伴随其发生和发展，充分说明AS是血管壁的一种慢性炎症性病变。1.2冠状动脉粥样硬化的危险因素[3]AS的形成是一个漫长的、受遗传和环境因素影响的复杂疾病,常见的危险因素有51 年龄（40岁以上多见）、血脂异常（血浆胆固醇水平的升高为主）、高血压、吸烟、肥胖、糖尿病、高同型半胱氨酸血症等，不同人群的冠心病的危险因素可能会有所不同，但有其独立性，如绝经期后的妇女、口服避孕药、有冠心病家族史的病人，均为导致AS发生的独立危险因素。2血管内皮细胞生理功能与冠状动脉粥样硬化的关系2.1血管内皮细胞的生理功能血管内皮细胞是血液与血管壁之间的天然屏障，表面光滑，由一层扁平的单层上皮细胞组成，内皮细胞具有高度代谢活性和内分泌调节功能，保证血液在血管壁内正常流[4]动。同时内皮细胞还不断受到血流切变力、炎症因子及自身代谢紊乱的影响，发生形态和功能的改变，导致内皮细胞结构和功能受损，引发AS的发生。内皮细胞能够合成和释放一氧化氮（NO）、前列环素（PGI2）、内皮源性超极化因子（EDHF）等具有舒张血管的活性物质和内皮素（ET-1）、血栓素（TXA），血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）等收缩血管的活性物质，两者处于一定的平衡状态，有助于血管紧张度、血流量的调节和血管内物质的转运，使内皮细胞具有一定的通透性和滤过功能，保证血管内正常的血容量。2.2血管内皮细胞与冠状动脉粥样硬化的关系在AS病变中，内皮依赖的血管舒张效应明显减弱，与NO的减少具有很大的关系。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）是内皮细胞NO合成的限速酶，血管内皮功能障碍一般与eNOS活性的表达有关，eNOS产生的NO对平滑肌细胞和内皮细胞本身有一定的调节作用，具有抗AS发展的作用，其活性下降将会导致NO合成减少，促进AS的发生。动物模型显示给予eNOS抑制剂加速AS进程，反之，给予外源性NO供体，延缓AS。还有研究发现，内皮功能受损时，在AS状态或炎症细胞因子刺激下，eNOS表达明显下降，内皮细胞受损，也是AS发生的一个重要因素。PGI2同样具有类似NO保护血管免受损伤的作用，其类似物具有调节胆固醇，抑制巨噬细胞聚集等作用，推测可知，舒张血管的这些物质，具有延缓AS的作用。内皮细胞在炎症因子和ox-LDL作用下，可诱发ET-1的产生，ET-1的含量与AS的52 严重程度呈正相关，平滑肌细胞、巨噬细胞和泡沫细胞在炎症的刺激下也可大量分泌ET-1，ET-1可引起冠状动脉收缩痉挛，使局部血流动力学紊乱，还可激活c-fos、c-myc等原癌基因的表达，促进平滑肌细胞增殖，刺激黏附分子分泌，趋化单核细胞聚集，引起[5]内皮细胞损伤，引起AS的发生。Haas.MJ等研究显示：血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）作为缩血管物质，可与糖尿病病人冠状动脉内皮细胞中血管紧张素Ⅱ受体1（AT1）结合，介导葡萄糖诱导内质网发生应激反应，产生超氧化物歧化酶，导致内皮细胞受损,促进AS的发生,推测可知，收缩血管的这些物质，具有引发AS的作用。核因子-κB（nuclearfactor-kappaB，NF-κB）是一种具有调控多项基因转录作用的[6]转录因子，参与各种炎症反应、免疫应答、细胞增殖和凋亡的调控，在AS中通过调控内皮细胞、平滑肌细胞及单核细胞中各种免疫和炎性相关因子的表达，对AS的病变起着促进作用。在AS病变的早期，NF-κB激活内皮细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和IL-8,介导单核细胞和淋巴细胞向管壁运动，促进炎症的发生和内皮细胞的损伤。受损内皮细胞大量表达E-选择素、P-选择素、细胞间黏附分子（ICAM-1）、血管细胞黏附分子（VCAM-1）等促进白细胞、淋巴细胞与内皮细胞之间的黏附聚集。血小板-内皮细胞粘附分子（PECAM-1），位于内皮细胞间的连接处,主要参与内皮细胞通透性和淋巴细胞的粘附。其他如血管内皮生长因子、血小板源性生长因子（PDGF）、转化生长因子（TGF）等多种活性因子，也对单核细胞，白细胞、淋巴细胞等炎症细胞具有一定的趋化作用，与内皮细胞一起参与炎症反应的发生。内皮细胞还可释放纤溶酶源激活物（PA）、血小板激活因子(PAE),VonWillebrand因子(vWF)血管活性物质，维持凝血系统和纤溶系统的平衡，防止血小板的聚集、凝血反应的发生和纤溶系统的激活，在AS血管损伤部位，采用光子显微镜可观察到内皮连续内弹力板的缺失和致密胶原-黏蛋白复合物的暴露,在斑块破裂出血时，胶原纤维暴漏，引发凝血系统和纤溶系统的激活，引起AS的继发性病变。研究发现，内皮细胞炎症因子的生成和炎症介质的分泌，不仅对内皮细胞自身具有调节作用，而且对平滑肌细胞也具有一定的刺激和调节功能，引起平滑肌细胞的增生和迁移，参与继内皮细胞损伤之后的病变，因此，内皮细胞功能和结构的改变及屏障功能受损，是AS始动因素。53 3氧化应激与冠状动脉粥样硬化的关系3.1氧化应激的意义氧化应激是机体代谢过程中产生的活性氧与内源性清除活性氧的抗氧化系统之间[7]失去平衡，对机体造成一定氧化损伤的病理反应，活性氧（ROS）主要包括氧自由基、过氧化氢、单线态氧和脂质过氧化物及其裂解的产物等。正常代谢过程中少量的ROS对机体的代谢有一定的保护作用，能够通过作用生物膜上脂质、蛋白质参与生物代谢，起到杀菌、抗肿瘤、氧化代谢等积极的防御作用，但是过量的ROS能使蛋白肽链断裂，破[8]坏细胞膜，促进自由基和其他生物活性物质产生氧化损伤的消极作用。3.2氧化应激引起冠状动脉粥样硬化的机制[9]在AS多种危险因素下，氧化应激可通过多种途径激发产生大量ROS，通过各种机制，启动血管周围炎症、损伤内皮细胞，造成内皮功能障碍。ROS可通过以下几个方面造成AS的发生和和发展：（1）干扰内eNOS活性的表达与代谢，使NOS底物（L-精氨酸）或辅助因子减少，NOS转为解聚状态，影响NO合成。氧化应激产生的超氧阴离子与NO反应形成氧化亚硝酸盐，合成的辅助因子减少，NO合成减少，引起内皮功能紊乱，促进AS的发生。（2）氧自由基的强氧化作用，直接或间接诱导内皮细胞损伤或毒性作用，引起内皮细胞坏死或凋亡，内皮损伤、丧失，导致内皮下胶原纤维暴露，引起血小板聚集和促凝的发生。[10]（3）ROS对脂质的氧化作用：氧自由基氧化细胞膜不饱和脂肪酸，生成大量脂质过氧化物和醛类分子，使细胞膜结构和功能发生改变。氧化内皮下间隙的LDL转变成ox-LDL,直接损伤内皮细胞，使内膜通透性增高，吸引循环中的LDL不断沉积于内皮下。ox-LDL与巨噬细胞上的清道夫受体结合，引起胆固醇在巨噬细胞内蓄积，形成经典的“泡沫细胞”。氧化应激导致低密度胆固醇的氧化修饰，在不稳定粥样斑块周围含有大量的ox-LDL，血清ox-LDL水平反映了心肌梗死的风险程度。体外实验证明，ox-LDL及其氧化型的胆固醇，能够刺激机体产生大量的炎症反应和细胞毒作用，诱导内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞的凋亡。54 （4）调节转录活化因子AP-1，NF-κB激活内皮细胞表达介导的VCAM-1、ICAM-1、单核-巨噬细胞趋化蛋白(MCP-1)生成，促进炎症细胞（单核细胞、T淋巴细胞、肥大细胞等）的聚集及与内皮细胞的相互作用，释放炎症因子，引起冠状动脉内壁的炎症反应。[11]（5）ROS还可引起其他活性因子的生成，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板生长因子（PDGF）、尿激酶纤溶酶源激动剂（uPA）等可刺激ROS的产生，促使VSMC增殖和迁移，活化基质金属蛋白酶（MMP-2和MMP-9）引起细胞外基质，导致纤维帽变薄和斑块破裂，引起AS的发生和发展。4炎症与冠状动脉粥样硬化的关系AS病变过程成的各个阶段，参与AS形成的炎症细胞（单核-巨噬细胞，泡沫细胞、白细胞、淋巴细胞、肥大细胞等）和炎症因子（TNF、IL、INF）中，既有促炎的因子，也有抗炎的因子，两者相互作用下，共同促进AS的形成和发展。越来越多的证据表明，炎症贯穿了AS发生和发展的整个过程，多数学者一致认为，AS是一种慢性炎症反应性疾病。4.1冠状动脉粥样硬化发生的原因研究发现，AS的发生原因可分为生物因素、免疫因素、化学性因素等，并与一些[12]免疫性疾病有关。据报道，在AS病变中检测到传染性病原体和含有类似病毒、细菌的特征性核酸和肽聚糖，口腔细菌的定殖与AS及脑血管事件的风险之间有一定的关联，支持AS与感染性病理生理学之间的联系,已经被确定的生物因素有肺炎衣原体、疱疹病毒、幽门螺杆菌、人类免疫缺陷病毒等。微生物可在内皮细胞（VECs）、平滑肌细胞及巨噬细胞内生长繁殖，释放毒素，引起内皮细胞死亡，平滑肌细胞增殖，胶原纤维暴露，引起血小板聚集和凝血、炎症因子释放等多种炎症反应；干扰细胞代谢发生炎症释放反应，可刺激内皮细胞释放内皮细胞源性生长因子（EDGF）、NO、花生四烯酸的代谢产物PGI2和TXA2分泌异常等引起血管壁的炎症反应，还可引起单核巨噬细胞聚集释放炎症因子如干扰素（INF）、肿瘤坏死因子（TNF）、白介素（IL）、血清中黏附因子、ox-LDL、C反应蛋白（CRP）、热休克蛋白等炎症因子增多，导致内皮细胞损伤和炎症55 细胞的聚集，参与AS的发生。临床中许多自身免疫性疾病常伴有AS，如系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，强直性脊柱炎等免疫性疾病往往伴有冠状动脉粥样硬化血管性心脏疾病，也说明AS的发生与免疫有关。4.2免疫-炎症与冠状动脉粥样硬化的关系免疫-炎症反应参与AS的形成过程，细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫反应及其细胞分化的亚群聚集在病灶部位，与抗原递呈细胞（APC）（树突状细胞、巨噬细胞等）一起，共同调控AS的形成和发展，免疫反应可分为固有免疫和获得性免疫两种。参与[13]固有免疫的主要是单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等，固有免疫对微生物和抗原起到直接识别、吞噬、杀伤的作用，单核细胞受到M-CSF和炎性趋化因子的作用可以发生趋化运动，转变成巨噬细胞，巨噬细胞可以通过其表面的清道夫受体识别并吞噬ox-LDL，转变成泡沫细胞，ox-LDL也具有免疫原性，产生相应抗体，结合在病变部位。巨噬细胞还可以通过表达TOLL样模式识别受体（TLRs）感知微生物，并激活NK-κB转录因子发生信号转导，释放炎症因子TNF、IL-1、IL-6、IL-12等，获得性免疫主要是B细胞产生抗体引起，两种免疫相互作用下共同调控AS的发生和发展。4.2.1固有免疫与动脉粥样硬化的关系在AS病变过程中，单核-巨噬细胞是固有免疫系统的代表细胞和引起炎症反应的[14]主要成分，单核细胞，能被巨噬细胞分泌的MCP-1趋化迁移。巨噬细胞主要通过吞噬作用来消灭外源性细菌，病毒和真菌感染。内源性炎症过程，巨噬细胞可促进白细胞趋化、聚集、释放炎症介质来促进AS的形成。固有免疫系统在AS的引发和增殖中起主要作用，单核-巨噬细胞是该过程的关键参与者。单核细胞是脂质负载的“泡沫”细胞巨噬细胞的前体，是AS斑块的关键组分，通过体外实验研究证实，单核细胞还具有极高的可塑性和运输功能，能够在适当的刺激下分化成上皮细胞、内皮细胞、软骨细胞、功能性成纤维细胞、心肌细胞和神经元细胞的不同细胞类型。单核细胞具有从循环中穿越到损伤/炎症区域的能力，推测单核细胞具有“运输、修复”功能，可能修复局部炎症失败或运输炎症物质重返回血液失败，在血管内皮细胞积聚，引起炎症反应，导致AS病变的发生。56 [15]单核细胞可促进纤维帽的不稳定导致斑块破裂，主要由基质金属蛋白酶（MMP）合成和释放引起。活化的巨噬细胞产生广泛的裂解酶，包括MMP（例如MMP-1，-2，[16][17]-3，-8-9和-14）。已经证明，在急性冠脉综合征（ACS）患者易损斑块区域中，MMPs升高，其表达和活性增强，斑块易破裂，并导致冠状动脉流向心肌的下游阻塞，引发心肌梗死。单核细胞在冠心病急性事件中的凝血级联反应及血栓形成和增大中具有促进作[18]用。单核细胞粘附于炎症处受损组织的细胞外基质，可诱导多种细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF-α），白细胞介素（IL-1和IL-6）（强效炎性细胞因子）的表达、血小板衍生的内皮细胞生长因子（成纤维细胞的有效化学引诱物和有丝分裂原）、转化生长因子（TGF）-α和-β（其通过刺激细胞外基质释放（其主要是来自心肌成纤维细胞的胶原）而促成纤维化）、巨噬细胞集落刺激因子（巨噬细胞存活所必需的细胞因子）和胰岛素样生长因子引发炎症反应。[19]树突状细胞（DC），是专业的抗原递呈细胞（APC），专门捕获、处理和呈递抗原（病毒，细菌，ox-LDL和热休克蛋白等）,具有至关重要的作用，在免疫诱导和免疫控制过程中，幼稚T细胞可分化为效应性T细胞，树突状细胞具有重要的抗原递呈和调节作用。DC易在小鼠的易发生AS的内膜处发现，在不易发生AS的血管部位很少发现。DC与冠状动脉疾病的发病机制密切相关，在AS免疫反应及炎症中具有启动和调节的作用，参与AS的发生和发展。[20]自然杀伤细胞(NK),是启动和调节免疫反应的关键因素，调节T细胞介导的细胞免疫反应，为自身免疫系统提供保护，但是有关研究发现，氧化应激可导致冠心病患者外周血NK明显减少，单核细胞产生的H2O2能够诱导NK细胞凋亡，导致NK细胞活性下降，NK细胞与疾病的活动性及TNF的含量呈负相关。4.2.2获得性免疫与动脉粥样硬化的关系[21]T细胞和B细胞参与获得性免疫。T细胞可在内皮细胞、巨噬细胞释放的黏附因子、趋化因子及炎症因子的作用下，类似单核-巨噬细胞在AS斑块部位聚集，并且进一步分化、活化、分泌，与其他炎症细胞一起，产生炎症放大反应，参与粥样板块的形成、进展及恶化。在AS斑块周围，早期可以发现淋巴细胞参与局部细胞因子的应答，57 [22]Lhotak.S通过AS小鼠模型（ApoE−/−和LDLR−/−小鼠）和不同的生长阶段人，用原位增殖Ki67和5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）病变‐固有细胞染色的方法，评估其结果发现，早中期阶段病灶处单核巨噬细胞聚集增生明显，在细胞凋亡和坏死发生之前，就有大量炎症性的T淋巴细胞浸润，增殖性的T淋巴细胞为AS的发展和稳定起了重要的[23]+作用。研究发现，T细胞有不同的亚群，CD4T淋巴细胞分化为Th1、Th2和Th17细胞系，在转录因子T-bet、γ-IFN、IL-12、IL-18作用下促进Th1发生炎症及释放反应，促进AS的发展。γ-IFN可阻止平滑肌细胞的增殖，降低胶原的产生，促进纤维帽变薄。IL-18可刺激γ-IFN的产生，在血清中增加，是粥样斑块的稳定性比较强的预测因子。[24]正常冠状动脉组织内不表达CD40L,但是在人AS组织中内皮细胞，平滑肌细胞，巨噬细胞表达具有免疫性的CD40L，其基因多态性与冠状动脉斑块不稳定性及斑块的破裂有很大的关系,CD40-CD40L的相互促进Th1发生分化，参与AS的炎症反应。Th2细胞分泌IL-4，IL-5，IL-10和IL-13,并能激活B细胞产生抗体IgM，对Th1有一定的抑制作用，对AS有一定的抑制作用。在急性免疫反应中，调节性T细胞（Treg）能被IL-10和TGF-β诱导分化产生抗AS[25]的作用，IL-10刺激巨噬细胞产生TIMP-1（基质金属蛋白酶组织抑制剂），抑制金属[26]蛋白酶活性，具有抗AS的作用。Th17是一个新的细胞系，IL-17、IL-17F,IL-21和IL-22可刺激其产生,IL-23,IL-6和TGF-β可刺激Th17的分化产生IL-17和γ-IFN，不仅对细菌、真菌具有重要的防御作用，还具有稳定AS斑块的作用。[27]B细胞有抗AS的作用，可分为B1细胞和和B2细胞两个亚群，用抗CD20治疗后B2细胞明显减少，B1细胞没有变化，说明B2细胞具有明显致AS的作用。B2细胞[28]致AS的作用可能与IgG抗体和IgE有关,研究表明，冠心病患者的严重程度和心肌梗死患者中，循环复合物ox-LDL-IgG升高与其有一定的相关性，冠心病患者IgE抗体比正常人升高，并被Helsinki心脏病研究中心作为心肌梗死的一个先兆标志物。B1细胞产生IgM抗体，被证明具有很强的抗AS的作用。在凋亡细胞和ox-LDL表面表达的OSE（氧化特异性抗原决定簇）-IgM能识别抗原决定簇抗体，能抑制泡沫细胞的形成，并促进其坏死。大量数据证明人体内OSE-IgM抗体具有保护作用。抗ox-LDL-IgM抗体58 与心血管疾病的不良反应呈负相关。因此，我们可以通过减少B2细胞，增加B1细胞及其抗体的产生来预防AS。5小结与展望综上所述，在AS病变过程中，危险因素是诱因，氧化应激引发内皮功能障碍，炎症反应贯穿了动脉粥样硬化的始终，最终导致AS的形成。氧化应激、炎症反应及内皮细胞的功能损伤参与AS形成及发展，越来越被人们所接受和认识，早期阻止氧化应激和炎症反应，改善内皮功能是逆转AS斑块形成的关键。AS炎症反应涉及的病理机制复杂，需要我们继续不断的研究和探索，积极控制危险因素、阻断冠状动脉氧化应激和炎症反应的发生，对冠状动脉粥样硬化的防治具有重要的意义。59 参考文献[1]陆再英,钟南山.内科学[M].北京:人民卫生出版社,2012:268.[2]李玉林.病理学[M].北京:人民卫生出版社,2011:116-117.[3]BishnoiS,KaushikRM,RawatA,etal.RiskfactorsforangiographicallyprovencoronaryarterydiseaseinwomeninIndia[J].HealthCareWomenInt,2016,37(12):1357-1372.[4]王齐敏.血管内皮功能与冠状动脉粥样硬化关系研究的进展(综述)[J].心血管康复医学杂志,2003,12(2):187-189.[5]HaasMJ,Onstead-HaasL,LeeT,etal.AngiotensinIIreceptorone(AT1)mediatesdextroseinducedendoplasmicreticulumstressandsuperoxideproductioninhumancoronaryarteryendothelialcells[J].IntJCardiol,2016,220:842-850.[6]McgrathKC,LiXH,McrobbLS,etal.InhibitoryEffectofaFrenchMaritimePineBarkExtract-BasedNutritionalSupplementonTNF-alpha-InducedInflammationandOxidativeStressinHumanCoronaryArteryEndothelialCells[J].EvidBasedComplementAlternatMed,2015,2015:260530.[7]杨丽珍,张国刚.氧化应激与动脉粥样硬化[J].医学与哲学(B),2013,34(5B):54-56.[8]TibautM,PetrovicD.OxidativeStressGenes,AntioxidantsandCoronaryArteryDiseaseinType2DiabetesMellitus[J].CardiovascHematolAgentsMedChem,2016,14(1):23-38.[9]金惠铭,陈思锋.高级临床病理生理学[M].上海:复旦大学出版社,2010:42-43.[10]葛均波,方唯一,沈卫峰.现代心脏病学进展[M].上海:复旦大学出版社,2012:27-28.[11]TayalD,GoswamiB,TyagiS,etal.Interactionbetweendyslipidaemia,oxidativestressandinflammatoryresponseinpatientswithangiographicallyprovencoronaryarterydisease[J].CardiovascJAfr,2012,23(1):23-27.[12]刘俊田.动脉粥样硬化发病的炎症机制的研究进展[J].西安交通大学学报(医学版),60 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致谢时光荏苒，光阴似箭，三年的时光一晃即逝，在我即将完成这篇论文的时候，三年的研究生学习生活也即将接近尾声。三年来付出的是劳动和汗水，收获的是自身价值和能力的提高，三年中有踌躇、有失落、有迷茫，但有方向，收获和感慨颇多，谨以此文感谢三年中曾经给予我无私关爱和热心帮助的人们！首先要感谢导师黄岑汉教授，研究生复试中对我成绩的肯定，使我有机会步入医学科研的殿堂，入学后时常关心我的学习、生活和科研情况，在人生目标和方向上给予了正确的指导。黄岑汉教授勤奋严谨的治学态度、务实创新的科研精神、广博扎实的专业知识都使我受益匪浅，特别是导师为人师表、勤勉励志、教书育人的态度，都是我学习的榜样。感谢导师的知遇之恩，一日为师、终生为父，师恩深重、终身难忘!其次，感谢唐汉庆教授，从课题的选择到研究，从开拓我的科研思路到培养我的科研素养，唐汉庆教授都给予我无微不至的帮助，并多次在科研实验的方法、技巧、思路及论文修改、课题申报等方面给予充分的指导。衷心感谢唐汉庆教授在工作和生活中给予的无私关怀和帮助，并致以最诚挚的敬意！感谢在这三年中学校及右医附院临床科室的老师们，是在他们的引导下使我重新踏进为医奉献的大门，是在他们的教育下壮大了我救死扶伤的信念，是在他们指导下使自己的科研知识、专业知识和临床能力得以提升，并为将来人生和就业打下坚实的基础。感谢师兄王有科、庞路路，师姐冯悦、宁晚玲，同门黄小珊，师妹蓝凰齐及共同学习的同学们，在学习和科研过程中给予的协作和帮助，在此表示真诚的谢意！学业的完成离不开自己的努力、家人的支持、导师的指导、老师和同学们的帮助，更离不开右江民族医学院这个大家庭的培养。在此表示感谢学校这三年的培养，祝母校越办越好！最后感谢参加本论文评阅和答辩工作的专家们及参阅本论文的学者们，谢谢您们的批评指正!63 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果个人基本情况姓名：张世田性别：男民族：汉族出生年月：1980.1籍贯：山东潍坊政治面貌：群众学习工作经历起止时间所在院校或单位学历学位职称2004.9-2006.7济宁医学院本科/学士无2006.9-2015.9齐鲁医药学院本科/学士主治医师2015.9-2018.7右江民族医学院硕士研究生主治医师发表论文：[1]张世田,庞路路,唐汉庆,黄岑汉.大鼠心肌缺血模型制备方法的比较及改进浅析[J].中国比较医学杂志,2017,27(7):98-101.（核心期刊）[2]张世田,唐汉庆,黄岑汉,王有科,庞路路.氧化应激、炎症与冠状动脉粥样硬化关系的研究进展[J].右江医学,2017,45(2):235-239.（省级期刊）[3]张世田,黄小珊,庞路路,冯悦,唐汉庆,黄岑汉.壮通饮对大鼠心肌缺血血瘀证内皮素1表达的影响[J].云南中医学院学报,2017,40(3):11-14.（省级期刊）[4]张世田,庞路路,冯悦,宁晚玲,黄岑汉,王露瑶,黄小珊,唐汉庆.大鼠冠心病心肌梗死模型制备的新方法[J].右江民族医学院学报,2017,39(3):179-182.（省级期刊）[5]张世田,黄小珊,庞路路,冯悦,唐汉庆,黄岑汉.壮通饮对大鼠心肌缺血血瘀证血清炎症因子表达的影响[J].右江民族医学院学报,2017,39(4):251-255.（省级期刊）[6]张世田,周柳芳,言纬,黄岑汉,唐汉庆.病态窦房结综合征误诊一例分析[J].右江医学,2017,39(5):627-628.（省级期刊）[7]张世田,胡静,石登灵,黄岑汉,唐汉庆.PPI类药物诱发痛风急性发作1例分析[J].右江民族医学院学报,2017,45(5):392-393.（省级期刊）64 科研经历：主持课题：[1]项目名称：壮通饮对冠心病心肌缺血大鼠模型心肌纤维化相关分子机制的研究项目来源：2016年广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室开放课题（桂教规范〔2015〕5号）本人承担任务：主持课题参与课题：[1]项目名称：壮医针挑法与管理模式对哮喘患者疗效和远期康复效果的评价研究项目来源：广西科技厅课题（合同编号：桂科AB17195018）本人承担任务：文献查阅、实验操作[2]项目名称：木姜子和忍冬藤“公药”、“母药”相配改善哮喘ASMC病变和气道重塑的机制研究项目来源：国家自然科学基金项目（合同编号：81760759）本人承担任务：文献查阅、实验操作研究生期间获奖情况2015年右江民族医学院第一届研究生学术论坛PPT竞赛三等奖2015年右江民族医学院研究生校级学业奖学金三等奖2016年桂林医学院2016年研究生学术论坛优秀论文竞赛三等奖2017年右江民族医学院研究生校级学业奖学金三等奖2017年桂林医学院2017年研究生学术论坛优秀论文竞赛优秀奖2018年右江民族医学院研究生学院民族团结月PPT风采大赛优秀奖2018年2017年度右江民族医学院优秀研究生2018年2018届右江民族医学院优秀毕业生65
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