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严？＇理学校代码：１０２８５‘遇２０１３４，．学号：眉４０胃襄１牡鲁ＩＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ＂＊＂．ｍ—一ｒ厂’长链非编码民ＮＡ－ＩＸＥＳＴ促姻亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建ｅ－ＴｈＭｅｃｈａｎｓｍｉｏｆＬｏｎＮｏｎｃｏｄＲＮＡＬＬＥＳＴＰｔｉｇｉｎｇｒｏｍｏｎｇＡｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎＡｃｕｔｅＭｙｅｌｏｉｄＬｅｕｋｅｍｉａａｎｄｓｌｎｃｔｏｎｏｆｔＶＣｏｎｉｉＬ甜ｉｖｉｒｕｓｅｃｔｏｒｓ研究生姓名糞芳指导教师姓名张日祁小飞专业名称血液病学研究方向白血麵基础巧院床＿－’―一．所在院部測鮮麵＾—醜论文提交日期２０１６年６月＊？？．？■？＇Ｔ成沒－？－；：媒化冷；别邸一＼心 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建中文摘要长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建中文摘要【目的】1、探究与正常人相比，LLEST在急性髓系白血病（AML）及骨髓增生异常综合征（MDS）中表达情况，明确LLEST在AML中的重要意义。2、研究LLEST促进凋亡机制。3、构建携带LLEST基因的慢病毒载体，初步进行慢病毒包装，并检验其有效性，为下一步探究LLEST在原代白血病细胞上的效应与功能提供理论与实验基础。【方法】通过对NCBI数据库中大样本基因芯片数据的分析，发现与正常人相比，LLEST表达在AML和MDS患者中水平较低。选择前期实验建立的高表达LLEST的K562细胞株（LLEST细胞株）和对照组K562细胞株（Vector细胞株）为实验对象，以基因芯片技术检测两种细胞株表达有差异的基因，同时运用生物信息学分析软件预测LLEST可能作用的基因。基于对BCL2基因的预测，选择4例AML患者治疗前后的标本、LLEST细胞株和Vector细胞株、LLEST细胞和Vector细胞裸鼠皮下成瘤实验所成的瘤块进行研究相关基因及蛋白表达水平进行研究。应用双荧光素酶报告基因技术对LLEST促凋亡机制进行深入探索。基于对XIAP基因的预测，选择18例初治AML治疗前后的骨髓标本以及LLEST细胞株和Vector细胞株，对LLEST和XIAP基因的表达进行初步研究。选择LV5慢病毒质粒为载体，构建携带LLEST基因慢病毒质粒，并初步进行慢病毒的包装，为下一步研究奠定基础。【结果】1、根据NCBI数据库Haferlach等对AML及MDS研究的基因芯片数据，经过分析发现，与正常人相比，LLEST在AML及MDS患者中的骨髓单个核细胞的表达水平下降。I 中文摘要长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建2、为了分析LLEST发挥作用的机制，首先通过基因芯片技术检测到在LLEST细胞株及Vector细胞株中表达有差异的基因，共1613个；通过生物信息软件预测了LLEST可能作用的基因，共1518个，同时存在于这两个数据集中共有11个基因。选择4例AML患者治疗前后的骨髓标本对这11个基因及LLEST进行检测，预测的基因只有BCL2基因水平一致性降低，LLEST明显升高。在LLEST细胞株和Vector细胞株中，BCL2基因的表达有明显差异，LLEST细胞株的BCL2基因明显低水平。在裸鼠成瘤组织中，LLEST细胞皮下成瘤组织中，BCL2蛋白明显比对照组表达低。荧光素酶基因实验表明LLEST对BCL2基因有直接抑制作用。3、18例AML患者中，有4例患者治疗后骨髓标本LLEST和XIAP水平同时降低。LLEST细胞株相较于Vector细胞株XIAP表达水平也明显较低。4、选择LV5慢病毒质粒为载体，成功构建了携带LLEST基因的重组慢病毒质粒LV5-LLEST，在293T细胞中完成慢病毒的包装，并转染K562细胞。经Q-PCR证实K562细胞实现了LLEST的高表达，结果表明重组质粒构建的有效性。【结论】1、AML与MDS病人中LLEST表达存在明显差异。2、LLEST对白血病细胞具有促凋亡作用，通过下调BCL2基因而介导。3、XIAP参与LLEST发挥促凋亡作用，但其机制尚需进一步研究。4、成功构建携带LLEST基因的慢病毒载体，并初步完成了慢病毒的包装，为下一步探究LLEST在原代白血病细胞上的效应与功能提供理论与实验基础。【关键词】LLEST；BCL2基因；XIAP；促凋亡；慢病毒作者：龚芳指导老师：张日祁小飞II 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建英文摘要TheMechanismofLongNoncodingRNA-LLESTPromotingApoptosisinAcuteMyeloidLeukemiaandConstructionofLentivirusVectorsAbstract【Objectives】1.ToanalysetheexpressionofLLESTinacutemyeloidleukemia(AML)andmyelodysplasticsyndromes(MDS)comparedwithnormal,andensuretheimportanceofLLESTinAML.AndtopredictthegenesassociatedwiththeimpactofLLEST.2.ToelucidatethemechanismofproapoptosisimpactofLLEST.3.ToconstructLentivirusVectorsthatcouldoverexpressLLEST,andpackagetheLentivirusandthenensuretheefficacyoftheLentivirusVector.Asaconsequence,itlaysafoundationforfollowingresearchoftheimpactofLLESTonprimaryleukemiacells.【Methods】LLESTdiversityexpressionwasgotinAMLandMDSthroughlargesamplegenemicroarrayanalysisinNCBIdatabase.ThetargetgenesofLLESTwerepredictedbyutilizinggenemicroarraytechnologyandbioinformaticssoftware.Wechosefourpatients’bonemarrowsamplesthatbeforeandafterachievingchemotherapy,K562celllinewhichoverpressedLLEST(LLESTcellline),K562celllinewhichservedascontrol(Vectorcellline)andtumorblocksthatcomefromnudemicesubcutaneoustumorformationbyLLESTcelllineandVectorcelllinetoexploreassociatedgenesexpressionandtheproteinsbasedontheBCL2genepredicted.ThenweconductedourresearchthatmechanismofLLEST’spro-apoptosisthroughdual-luciferasereporterassaytodeepenourunderstanding.Onthesametime,wechosethebonemarrowsamplesof18patientsLLESTcelllineandVectorcellline,andexploredtheexpressionofLLESTandXIAPbasedonthepredictionofthegeneofXIAP.Thelast,weconstructedrecombinantplasmidcontainingthegeneofLLEST,achievedthepackageofLentivirus,andlaythefoundationofthefollowingresearch.III 英文摘要长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建【Results】1.WerealizedtheexpressionofLLESTinthebonemarrowmononuclearcellsofAMLandMDSthroughHaferlach’sdatumaboutthegenemicroarrayoutcomesofAMLandMDSinNCBIdatabase.TheexpressionofLLESTinAMLandMDSwasobviousdecreasedcompaedwithnormal.2.Weattained1613geneswhichexpresseddifferentlyinLLESTcelllinebyutilizinggenemicroarraytechnology,andgot1518genesbypredictingpromisinggenebybioinformaticssoftware.Atlast,therewere11genesexistinginthetwodatabases.AndweonlyobservedlowerconsistentexpressionofBCL2geneinsamplesofAMLreceivingtreatmentcomparedtothesamplebeforereceivingtherapy,anditwasnotsamefortheothergenespredicted.TheexpressiondifferenceshowedalsoinLLESTcelllineandVectorcellline.LLESTcelllinepresentedlowerBCL2expressionlevelofgene.Inaddition,thetumorblockscomefromnudemicesubcutaneoustumorformationweretestedbywesternblottoexploretheexpressionofBCL2protein.ThetumorblocksresultingfromLLESTcelllinehadlowerexpressionproteinlevelofBCL2.Thefurtherresearchcarriedbydual-luciferasereporterassayshowedthatLLESTinhibitatedBCL2genedirectlyratherthanindirectly.3.ThegeneexpressionofgeneofLLESTandXIAPdeclinedsimultaneouslyin4outof18primaryAMLpatientsafterreceivingchemotherapy.LLESTcelllineshowedlowerexpressionofXIAPgenecomparedwithVectorcellline.4.WechoseLV5plasmidascarriertoconstructrecombinantplasmidcontainingthegeneofLLEST,LV5-LLEST,achievethepackageofLentivirusin293Tcellline,andthentransfectK562cellline.LLESTgenepresentedhighexpressioninK562celllinebyquantitativePCR.【Conclusions】1.LLESTexpressionisdifferentinAMLandMDS.2.LLESTplaysaroleofpro-apoptosisbyinhibitatingBCL2genedirectly.2.XIAPisassociatedwithLLEST’sroleofpro-apoptosis,themechanismisneededfurtherresearch.3.WehaveconductedsuccessfullyrecombinantplasmidcarringLLEST,LV5-LLEST,acheivedpackageofLentiviruspreliminarilyandlaythetheoreticalbasisandexperimentalIV 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建英文摘要foundationofthefollowingresearchinprimaryleukemiacells.【Keywords】LLEST;BCL2gene;XIAP;pro-apoptosis;LentivirusWrittenby:FangGongSupervisedby:RiZhang&XiaofeiQiV 目录引言........................................................................................................................................1第一部分长链非编码RNA-LLEST抗白血病机制的研究...................................................5材料与方法........................................................................................................................5结果..................................................................................................................................13第二部分LLEST抗白血病机制与XIAP......................................................................18材料与方法......................................................................................................................18结果..................................................................................................................................19第三部分携带长链非编码RNA-LLEST基因慢病毒质粒的构建..................................21材料与方法......................................................................................................................21结果..................................................................................................................................28讨论......................................................................................................................................32结论......................................................................................................................................38参考文献..............................................................................................................................39综述......................................................................................................................................41中英文对照缩略词表..........................................................................................................47攻读学位期间公开发表的文章..........................................................................................48致谢......................................................................................................................................491 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建引言引言急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，AML)是一组起源于造血干细胞的恶性肿瘤，具有高度异质性。白血病细胞在骨髓及其他器官组织中恶性增殖，干扰和抑制正常造血细胞的生长，最终影响造血及免疫系统，造成功能上的缺失，引发一系列的[1]临床表现，如贫血、出血、感染及组织浸润等。既往研究已经证实，AML的发生与基因突变，以及与染色体易位等有着密不可[2]分的关系。研究发现，基因突变主要通过三个机制促进AML的发生。第一，突变基因促进白血病细胞的生长，使其获得增殖优势，如FLT3，c-KIT，RAS等突变；第二，突变基因阻碍细胞的分化，如发生在AML1和CEBPA基因的突变；第三，突变基因影响[3]细胞周期或凋亡，如P53和NPM1突变。染色体易位造成的遗传物质表达水平的改变，是我们理解AML发生发展的另一[4]种机制。对于染色体断裂点处基因的辨识是第一步。在早期研究中，首先确定的断裂点的基因是癌基因，如MYC和ABL。不管是MYC对于Burkit淋巴瘤特征性的t(8；14)，还是ABL对于慢性髓系白血病的t(9；22)，这两个基因都起到了癌基因的作用。而也就解释了染色体易位在恶性增殖中的作用，同时也说明了癌基因的促白血病作用。因此，染色体易位导致的癌基因的激活在AML的发生发展中起着重要作用。虽然表观遗传学不涉及遗传物质的改变，但表观遗传的改变在AML的发生发展中占有重要地位。细胞核组蛋白的修饰与甲基化、乙酰化都会影响到染色质的状态，[5]而这些都将影响基因的转录，参与白血病的发生。但是，临床上尚有50%AML患者并没有克隆性的标志，这说明除了基因突变、染色体易位及表观遗传学外，还有其他因素参与疾病的发生发展。非编码RNA没有编码蛋白质的功能，在人类基因组序列中占高达98.5%的比例。其中，非编码RNA很大部分为长链非编码RNA(LongnoncodingRNAs，LncRNAs)。LncRNAs是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多种层面上调控基因的表达水平。不仅在细胞分化及个体发育中起到重要作用，而且与许多疾病有着密切的联系。1 引言长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建近年来，长链非编码RNA在血液淋巴系统疾病方面已成为研究热点，并取得了一些进展。Ronchetti等证实，在多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)患者中，肺腺癌转移相关因子1(metastasisassociatedlungadenocarcinomatranscript1，MALAT1)的基因水平明显升高。有研究显示MALAT1基因主要通过影响细胞周期，并在P53介[6]导的DNA损伤的修复与mRNA的成熟过程发挥负性作用，最终导致MM发生。而Rodríguez-MalavéNI等研究表明BALR-6(designatedB-ALLassociatedlongRNA-6)的高水平表达与急性B淋巴细胞白血病(B-acutelymphocyticleukemia，B-ALL)有着密切[7]的关系，该lncRNA主要通过转录后的调控导致疾病的发生。此外，PVT1被证实在急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，APL)中促进白血病细胞的增[8]殖，在APL患者中高表达。早期，本课题组在进行白血病基础与临床的研究时，通过基因芯片鉴定技术得到+了一个长链非编码RNA-LLEST。深入研究发现，LLEST在恶性血液病的CD34细胞中呈现出低表达态势。有趣的是，LLEST与AML有着密切的联系，LLEST表达量越高的AML患者其病情越轻、原始细胞比例越少、复发率低、预后好。体外实验也证实，LLEST对白血病细胞株的恶性生物学行为具有负性调控作用，它能抑制肿瘤细胞的生长，使细胞周期阻滞在G2/M期，促进细胞的凋亡和分化，在这一过程中，凋亡通路上的蛋白(如caspase9、BCL2)都出现了异常表达。但是，LLEST作用的相关机制尚不清楚，为了阐明LLEST的抗白血病机制，本课题组展开了此项研究。前期的实验研究发现转入LLEST基因后，K562细胞株BCL2蛋白表达水平下降。现有证据表明，BCL2家族对细胞凋亡的调节失控是肿瘤发生的重要原因。BCL2基因是BCL2家族的一员，是1984年由Tsujimto等从伴有t(14;18)的滤泡性淋巴瘤中发现的一种癌基因，其编码的蛋白质能抑制细胞凋亡，延长细胞寿命，而不影响正常细胞的分裂与增殖。BCL2蛋白在线粒体途径的细胞凋亡过程中发挥重要作用。BCL2[9][12]基因的异常表达可导致肿瘤的发生甚至耐药的形成。LLEST具有促凋亡作用，这与BCL2作用关系尚不清楚。为了探究BCL2与LLEST抗白血病作用的关系，我们进行深入研究。XIAP是凋亡抑制蛋白中的最具抑制活性的抗凋亡蛋白，具有抑制半胱氨酸蛋白[10]酶活性。它可以直接结合并抑制半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-3、7、9。我们在进2 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建引言行白血病相关研究时发现XIAP基因在AML和良性疾病中表达有差异，因此XIAP成为我们关注的一个重要的基因。凋亡抑制蛋白一般是通过调控caspase的活化发挥抗凋亡作用的。我们前期的实验结果示，在LLEST过表达的细胞株里，Caspase-9的[11]表达水平是增加的，而Caspase-9是XIAP的一个重要的作用靶点。我们推测LLEST的抗凋亡作用是否也有XIAP的参与。因此我们选取了前期脂质体转染建立的稳定高表达LLEST基因的K562细胞株（LLEST细胞株）和转染了空载体Vector的对照细胞株（Vector细胞株）以及AML患者的骨髓血标本进行研究，探求LLEST作用的相关机制。LLEST抗白血病作用在白血病细胞株和裸鼠中都得到了初步论证，但是，在原代白血病细胞中的作用及机制尚不明确。相关研究的深入需要建立过表达LLEST基因的原代白血病细胞模型。但是，原代白血病细胞分裂能力较低，常用的脂质体转染效率低下，而慢病毒转染原代细胞的效率就明显高得多。因此，我们构建可以携带LLEST基因的慢病毒质粒进行慢病毒的包装，以期有效转染原代白血病细胞，过表达LLEST，从而丰富和完善LLEST作用及功能的研究。参考文献[1]张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准.3版.北京：科学出社，2007:106-116．[2]ChenJ,OdenikeO,RowleyJD.Leukemogenesis:MoreThanMutantGenes.NatRevCancer,2010,10(1):23-36.[3]RennevilleA,RoumierC,BiggioV,etal.Cooperatinggenemutationsinacutemyeloidleukemia:areviewoftheliterature.Leukemia,2008,22(5):915-931.[4]RowleyJD.Chromosomaltranslocations:revisitedyetagain.Blood,2008,112:2183-2189.[5]VaissiereT,SawanC,HercegZ.EpigeneticinterplaybetweenhistonemodificationsandDNAmethylationingenesilencing.MutatRes,2008,659:40-48.[6]RonchettiD,AgnelliL,TaianaE,etal.DistinctlncRNAtranscriptionalfingerprintscharacterizeprogressivestagesofmultiplemyeloma.Oncotarget,2016,online.[7]Rodríguez-MalavéNI,FernandoTR,PatelPC,etal.BALR-6regulatescellgrowthandcellsurvivalinB-lymphoblasticleukemia.MolCancer,2015,14(1):214.[8]ZengC,YuX,LaiJ,etal.Overexpressionofthelongnon-codingRNAPVT1is3 引言长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建correlatedwithleukemiccellproliferationinacutepromyelocyticleukemia.JHematolOncol,2015,8(1):126.[9]YipKW,ReedJC.Bcl-2familyproteinsandcancer.Oncogene,2008,27(50):6398-6406.[10]DeverauxQL,TakahashiR,SalvesenGS,etal.X-linkedIAPisadirectinhibitorofcell-deathproteases.Nature,1997,388(6639):300-304.[11]HuangX,WuZ,MeiY.XIAPinhibitsautophagyviaXIAP-Mdm2-p53signaling.EMBOJ,2013,32(16):2204-2216.[12]TsaoT,ShiY,KornblauS,etal.ConcomitantinhibitionofDNAmethyltransferaseandBCL-2proteinfunctionsynergisticallyinducemitochondrialapoptosisinacutemyelogenousleukemiacells.AnnHematol,2012,91(12):1861-1870.4 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第一部分第一部分长链非编码RNA-LLEST抗白血病机制的研究材料与方法一、主要材料1、RoswellParkMemorialInstitute-1640(RPMI-1640)培养基为美国GIBCO公司产品。胎牛血清（FBS）购于杭州四季青生物工程材料有限公司。2、K562、293T、LLEST细胞株、Vector细胞株由本实验室保存。3、LV5慢病毒载体、包装质粒（R、VSV-G、Rev）、大肠杆菌TOP10由本实验室保存。4、脂质体lipofectamin2000购于Invitrogen公司，pGL3、pGL3-BCL2-3’UTR重组质粒和海肾质粒pRL-TK由焦旸老师惠赠。pcDNA-LLEST、pcDNA-3.1由本实验室保存。5、PfuDNA聚合酶、HotStartTaqPlusDNA聚合酶、MMLV逆转录酶均购于IBM公司。6、LLEST、BCL2基因的Q-PCR引物和探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成。LLEST、BCL2普通PCR所需引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。7、Anti-BCL2(Bcelllymphoma/leukemia-2)Antibody购自上海研生生化试剂有限公司，二抗β-actin购于碧云天公司。8、RIAP裂解液：碧云天生物技术研究所9、BCA蛋白浓度测定试剂盒为上海西唐生物公司产品。10、Dual-Luciferase⑧ReporterAssaySystem购于Promega公司。11、双萤光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Promega公司二、主要仪器1、超净工作台：苏州净化设备厂。2、不锈钢恒温水浴锅：英国Grant公司。3、水平离心机（LDZ-5）：北京医用离心机厂。4、CO2培养箱：美国Thermo公司。5、倒置相差显微镜：日本OLYMPUS公司。5 第一部分长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建6、9700型PCR基因扩增仪：PE公司。8、7500real-timePCR扩增仪：ABI公司。9、倒置相差显微镜：日本OLYMPUS公司。10、高速低温离心机：德国Heraeus公司产品。11、电泳和蛋白转膜设备：Bio-Rad公司。12、酶标仪：Bio-Rad公司。13、化学发光仪LB9507：BERTHOLD公司。三、方法1、应用NCBI数据库中Haferlach的基因芯片的数据进行分析，研究与正常人相比，LLEST在AML和MDS患者中的表达情况。Haferlach等曾利用基因芯片技术对542例AML及206例MDS患者与正常人的骨髓样本的单个核细胞进行分析，其数据收录在NCBI数据库中。我们利用收录其中的数据，分析LLEST在AML和MDS表达情况。2、基因芯片技术检测LLEST细胞株和Vector细胞株表达有差异的基因；利用生物信息学软件预测LLEST可能作用的基因。3、根据基因芯片技术及生物信息学软件预测LLEST可能作用基因的结果，存在于这两个数据集有11个靶基因，我们选取了其中的8个基因进行初步研究。以RT-PCR方法检测目的基因的表达水平。选取符合条件的4例初诊AML的患者治疗前后的骨髓标本（患者在化疗后均取得完全缓解）。用Ficoll法分离患者骨髓标本中的单个核细胞（bonemarrowmononuclearcells,BMNCs），溶于1mlTrizol吹打至细胞破碎，置-20℃备用。3.1TRIZOL一步法提取总RNA（整个过程应在冰块上进行）63.1.1将收集1×10个细胞，加入1mlTrizol充分溶解。3.1.2加入200μl氯仿，猛烈颠倒20余次，充分混匀。然后4℃、12000rpm离心15min。3.1.3转移上清到1.5mlEP管中，加入500μl异丙醇并混匀，在沉淀5分钟后，以4℃、12000rpm离心15分钟。3.1.4弃上清，加入600μl的70%乙醇（用DEPC水和无水乙醇按比例配制）混匀，4℃、12000rpm离心5分钟。6 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第一部分3.1.5弃上清，加入800μl无水乙醇混匀，4℃、12000rpm离心5分钟。3.1.6弃上清，干燥后加入DEPC水溶解，并将RNA浓度调整至500ng/μl。3.2将mRNA逆转成cDNA单个反应体系：管1试剂名称体积(μl)六随机引物2RNA4DEPC水9共15μl反应条件：70℃5min，4℃forever。管2试剂名称体积(μl)5×Buffer8MMLV1Rnasin0.5dNTP0.5DEPC水15将管2中的液体与管1中液体混合，共40μl。反应条件：37℃60min，95℃5min，4℃forever。3.3普通PCR单个反应体系：试剂名称体积(µl)HotStartTaqPlusDNA聚合酶0.510×Buffer(含Mg2+)5cDNA2.5dNTP(10mmol)2ddH2O38（共50µl）7 第一部分长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建扩增条件为：95℃预变性15min，循环条件为：95℃30s，55℃30s，72℃30s，共35个循环，72℃延伸10min。以1.5%琼脂糖电泳分析PCR产物，凝胶成像仪紫外光下成像并拍摄。4、Q-PCR法检测LLEST细胞株和Vector细胞株的LLEST、BCL-2的基因表达。实验组：脂质体转染的稳定高表达LLEST的单克隆K562细胞株，LLEST细胞株；对照组：脂质体空载体转染的K562细胞株，Vector细胞株。4.1复苏目的细胞株，每组各三株细胞超净台进行常规消毒，紫外线照射30min以上。恒温水浴箱37℃预热20min，备用带好手套和护目镜，从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，1min内使冻存液完全融化。然后将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（800r/min，5min）。离心结束后用含10%胎牛血清的1640培养液重悬沉淀细胞，调整细胞浓度，于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养（同时记录复6苏日期）并传代。以200ngμg/ml的G418筛选转染细胞，待细胞数量至约1×10个时收集细胞。用PBS冲洗两遍后，15000r/min离心1min，收集细胞在1.5ml的EP管里。4.2TRIZOL一步法提取总RNA（同本部分3.1）4.3将mRNA逆转成cDNA（同本部分3.2）4.4定量PCR检测AML患者及LLEST细胞株与Vector细胞株中LLEST转录水平。25μl的反应体系包括cDNA4μl、上下游引物各0.5μl、探针0.3μl、TaqMan通用PCRMastermix12.5μl、ddH2O7.2μl。反应条件为50℃2min，95℃10min，95℃15s、60℃1min，共40个循环。-ΔCt以β-actin作为内参，结果以2表示，实验设计三个复孔。5、Westernblot检测LLEST细胞株与Vector细胞株致裸鼠皮下成瘤肿块中BCL2蛋白的表达。5.1选取实验组LLEST和对照组Vector各2个瘤块组织，每个瘤块选取部分组织，尽量剪碎，加入RIPA蛋白裂解液500ul，充分研磨，直至组织呈匀浆状态。离心（4℃，12000r/min，10min）后吸取上清液，分装至EP管中，并置于-20℃冰箱保存备用。8 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第一部分吸取50ul用BCA法测定蛋白浓度，以确立上样时的样品剂量。5.2应用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，所有试剂于冰箱储存，待使用时再于室温环境中放置。首先配制25mg/ml的蛋白标准溶液，取适量稀释至终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。5.3根据样品数量，按BCA试剂A与BCA试剂B的比例为50:1配制适量BCA工作液，并充分混匀。5.4加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。5.5每孔加入200μlBCA工作液，37℃，放置30分钟。5.6酶标仪测定562nm波长下的吸光度(OD)，绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。5.7根据样本蛋白浓度确定补蛋白质裂解液至10μg/μl蛋白含量。加入等体积2×SDSLoadingBuffer（1ml1MTris-HClpH7.2，2ml甘油，4ml10%SDS，0.5mg溴酚兰，1ml2-Me或DTT，2mlddH2O总体积至10ml），煮沸5min。离心取上清含等量的总蛋白（40μg-80μg）进行电泳，其余放入-80℃贮存。5.8相关工作液的配置。5×SDS电泳液：Tris15.1g甘氨酸94gSDS5g定容至1000ml转膜液：Tris3g甘氨酸14.4g甲醇200ml定容至1000ml5×TBS：Tris60.57gNaCl45g定容至1000ml后，缓慢加入浓HCl将pH值调至8.0TBST：1×TBS1000ml加入1mlTween205.9分离胶：按下表加入定量试剂（最后加入20%APS及TEMED，加入后立刻吹打混匀并加入胶板中）。9 第一部分长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建10%及12%分离胶体系：试剂名称体积（μl）10%分离胶12%分离胶30%Arc-Bis133316001.5MTrisHClpH8.81000100010%SDS4040ddH2O1600132520%APS（现配现用）3232TEMED3.33.35.10分离胶加入2/3后，预留1-2cm空间，立即加入无水乙醇封胶，后静置，直到分离胶凝固，最后把封胶用的无水乙醇倒掉。5.11配置浓缩胶（最后加入20%APS及TEMED）。5%浓缩胶体系:试剂名称体积（μl）30%Arc-Bis2501.0MTrisHClpH8.816210%SDS15ddH2O105020%APS（现用现配）5TEMED1.55.12浓缩胶加入到溢出，插入梳子，待浓缩胶凝固。5.13标本取出至室温，开始加样。加入等含量的标本电泳。初始电压为80V，当标本跑至分离胶时调整电压至120V，直至蛋白跑至胶的底部，约2小时。5.14电泳结束前20min做好以下准备，剪适当大小PVDF膜，在左上角剪角标记正反，4张滤纸，PVDF膜置甲醇中浸泡15s，再转入转膜液中。将滤纸、转膜夹子、毡布都浸泡在转膜液中。5.15将胶卸下，割取目的蛋白分子量范围的胶，按顺序排放：毡布、2层滤纸、PVDF膜、蛋白胶、2层滤纸、毡布。蛋白胶在转膜夹黑色一面。5.16将转膜夹放入电泳槽，黑色面在中间，冰浴转膜。200mA或100V1小时。10 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第一部分5.17转膜结束后将膜取出，置于含5%脱脂奶粉的TBST中，封闭2小时。5.18将膜取出，加入BCL2抗体，4℃孵育过夜，同时以β-actin作为内参，其一抗为鼠抗人IgG。5.19洗涤，一抗孵育结束用TBST浸洗三次，每次10min。5.20结合二抗（辣根过氧化物酶偶联的兔抗鼠IgG1:1000），室温轻轻摇晃1小时。5.21TBST浸没并洗涤三次，每次5min。5.22化学发光，ECL发光液A、B液等体积混合后，滴于膜上并压片。5.23ECL显色，在暗室中曝光显影。5.24图像分析软件（Gel-ProAnalyzer4.5）对条带进行分析。6、LLEST促凋亡作用机制与BCL2基因将包含预测的LLEST作用位点在内的BCL2的3’UTR装载在pGL3载体上，构建重组质粒pGL3-BCL2-3’UTR质粒。实验所需质粒为lipofectamin2000reagent（购于Invitrogen公司），pGL3、pGL3-BCL2-3’UTR重组质粒和海肾质粒pRL-TK（由焦旸老师惠赠）。6.1LLEST在K562细胞株中与BCL2基因相互作用6.1.1重组质粒与作为内参的海肾质粒pRL-TK共转染LLEST和Vector细胞。6.1.2空载体pGL3与pRL-TK共转染对照。6.1.3每组设置3个复孔同时进行检测，最后取平均值。6.1.4实验所需质粒为lipofectamin2000（购于Invitrogen公司），pGL3、pGL3-BCL2-3’UTR质粒和海肾质粒pRL-TK（由焦旸老师惠赠）。6.1.4.1选取对数生长期的LLEST细胞株和Vector细胞株，并以10％胎牛血清的RPMI-1640培养液在37℃、5％C02培养箱中培养，G418浓度调整为200μg/ml进行5稳定株筛选。转染前24h将2株细胞按照每孔2×10个的数量接种于24孔板中。设置3个复孔，共两组。6.1.4.2用50μl的RPMI-1640培养液（无血清）用来稀释2ul的Lipofectamin2000，并在室温下孵育5min，标记为A液；将600ngpGL3-BCL2-3’UTR质粒和pGL3分别与200ng海肾质粒pRL-TK稀释于50μl无血清RPMI-1640培养液中，混匀，分别标记为B1，B2。11 第一部分长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建6.1.4.3将稀释了A液和分别与B1，B2在室温下孵育20min，促使混合物的形成，标记为C1和C2。C1:pGL3-BCL2-3’UTR+pRL-TK+Lipofectamin2000C2:pGL3+pRL-TK+Lipofectamin20006.1.4.4将培养的LLEST细胞和Vector细胞换液，以无血清无抗生素的RPMI-1640培养培2小时。2h后，LLEST细胞株第一组的三个复孔每空加100μlC1液，第二组的三个复孔每组加100μlC2液，并轻轻前后晃动培养板使其混匀。同样，Vector细胞株第一组三个复孔每空加100μlC1液，第二组三个复孔每组加100μlC2液，并轻轻前后晃动培养板使其混匀。6.1.4.537℃、5％C02培养箱中进行培养，在孵育后的4-6h内更换培养液。培养细胞48h后进行荧光素酶活性检测。6.1.4.6荧光素酶活性检测移去培养液，用1×PBS漂洗转染的细胞两次，充分弃去PBS；向细胞中加入100μl×PLB，在常温下震荡15min，使细胞充分裂解；加100μlLARII，置于双报告系统荧光素酶检测仪中，读取数值，即萤火虫荧光素酶荧光值；加100μlStop，同样置于荧光检测仪中，读取数值，即海肾荧光素酶荧光值；根据每种细胞设置的3个复孔，计算相对荧光值。计算公式：相对荧光酶活性=萤火虫荧光素酶荧光值／海肾荧光素酶荧光值6.2LLEST在SHI-1细胞中与BCL2基因的作用。我们前期实验证实，SHI-1细胞LLEST的表达水平较高；将LLEST质粒或空载体质粒、重组质粒或对照质粒，与作为内参的海肾质粒pRL-TK共转染细胞；空载体pGL3与pRL-TK共转作为阴性对照。实验所需质粒为lipofectamin2000（购于Invitrogen公司），pGL3、pGL3-BCL2-3’UTR和海肾质粒pRL-T（由焦阳老师惠赠），LLEST质粒、Vector空载体由我们前期实验获得。每组设置3个复孔同时进行检测，最后取平均值。6.2.1选取对数生长期的SHI-1细胞株，并以10％胎牛血清的RPMI-1640培养液12 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第一部分5在37℃、5％C02培养箱中培养，转染前24h将2株细胞按照每孔2×10个接种于24孔板中，设置4组，每组3个复孔。6.2.2取重组LLEST或pcDNA3.1空载体质粒DNA各800ng，稀释在50µl无血清RPMI-1640中，轻轻混均，记作D液，分别记作D1，D2。（A液、B液如6.1所得）6.2.3将2倍的A液与B液和D液液体轻轻混均，并在室温下孵育20min，得到混合物。6.2.4SHI-1细胞分为4组，每组3个复孔。每孔pRL-TK作为荧光内参。pGL3-BCL2-3’UTR+pRL-TK+Lipofectamin2000+VectorpGL3-BCL2-3’UTR+pRL-TK+Lipofectamin2000+LLESTpGL3+pRL-TK+Lipofectamin2000+VectorpGL3+pRL-TK+Lipofectamin2000+LLEST6.2.5将混合物共200μl加入到接种好细胞的24孔板内，并前后左右移动使之混均。37℃、5%CO2培养，4-6h内更换培养液，培养细胞48h后进行荧光素酶活性检测。6.2.6荧光素酶活性检测。（同6.1.4.6部分）7、采用SPSS软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本的t检验。p<0.05认为差异有统计学意义。结果1、LLEST在AML及MDS患者骨髓单个核细胞中表达情况及其临床意义Haferlach等曾利用基因芯片技术对542例AML及206例MDS患者与74例正常人的骨髓样本的单个核细胞进行分析，其结果收录在NCBI数据库中。我们利用NCBI数据库中的数据进行分析，得到如图1所示结果：与正常人相比，LLEST在AML和MDS患者中的表达水平与正常人相比明显不同。13 第一部分长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建图1AML患者与MDS患者骨髓单个核细胞基因表达注：NMC正常人的骨髓单个核细胞2、利用基因芯片技术数据及生物信息学软件分析LLEST发挥作用可能靶点（1）基因芯片技术检测了脂质体转染的稳定高表达LLEST的K562细胞株（LLEST细胞株）与脂质体转染空载体K562细胞株（Vector细胞株），表达水平有差异的基因，共有1613个。（2）生物信息学分析软件，预测到LLEST可能作用的靶基因，共有1518个。（3）共有11个基因同时存在于以上所得的两个数据集中，包括6个下降的基因和5个上升的基因如图2所示。图2LLEST靶基因的预测14 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第一部分3、临床标本中LLEST及预测基因的表达RT-PCR方法扩增4例初治AML患者治疗前后的骨髓单个核细胞中LLEST与6个预测的基因，以GAPDH为内参，电泳分析PCR产物，结果如图3所示：在缓解后相较于治疗前，LLEST表达水平明显升高；预测的6个基因中，除BCL2基因表达呈现一致性降低外，其他基因表达水平的变化较为复杂。与LLEST基因表达水平升高，存在的是BCL2水平的下降。BCL2成为下一步研究重要基因。图34例AML患者中LLEST与预测基因的表达注P：病人N：治疗前R：缓解后4、LLEST细胞株和Vector细胞株中BCL2基因表达实验前期，我们利用脂质体2000转染、G418筛选建立了高表达LLEST的K562细胞株（LLEST）和空载体的单克隆K562细胞株（Vector）。以Q-PCR定量检测3株LLEST细胞和3株Vector细胞的BCL2基因表达水平。结果如图4所示，高表达LLEST的K562细胞株的BCL2基因水平明显较低（P＜0.05）。5、LLEST细胞株与Vector细胞株致裸鼠皮下成瘤肿块中BCL2蛋白水平Westernblot技术检测LLEST细胞株与Vector细胞株所致裸鼠皮下成瘤的肿块中BCL2蛋白水平，结果如图5：LLEST细胞株所致的瘤块中BCL2水平明显低水平。15 第一部分长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建图4LLEST影响BCL2基因表达图5LLEST影响BCL2蛋白表达6、LLEST促进细胞凋亡作用与BCL2基因（1）LLEST在K562细胞株中与BCL2基因相互作用前期研究发现K562细胞株中LLEST在中低水平表达，这也是我们构建过表达LLEST细胞株（LLEST细胞株）的基础，并转染空载体建立Vector细胞株作为对照。荧光素酶报告基因实验，结果示：将pGL3质粒转入LLEST细胞株和Vector细胞株后，相对荧光素酶（Luc+）活性在这两株细胞的的表达水平未见明显差异；但是转入携带BCL2-3’UTR的pGL3-BCL2-3’UTR重组质粒后，两株细胞中的相对荧光素酶活性明显不同，Vector细胞株较转入pGL3的细胞株的相对荧光蛋白酶活性未见明显改变，而LLEST细胞株与Vector细胞株相比，荧光蛋白酶活性水平明显较低。这说明pGL3-BCL2-3’UTR质粒的表达受到了抑制，而这种抑制是在BCL2-3’UTR重组质粒和LLEST的同时存在时发生。说明LLEST对于BCL2有直接作用。（如图6）16 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第一部分图6LLEST在K562细胞中Luc+相对活性图7LLEST在SHI-1细胞中Luc+相对活性（2）LLEST在SHI-1细胞株中与BCL2基因相互作用SHI-1是高表达LLEST基因的细胞株。对于我们研究LLEST与BCL2提供一个自然优势。如图7所示，我们可以看到，在pGL3分别与Vector及LLEST共转染SHI-1细胞后，Vector组与LLEST组的相对荧光素酶活性未见明显差异。在pGL3-BCL2-3’UTR分别与Vector及LLEST共转染时转染SHI-1细胞后，Vector组和LLEST组的相对荧光素酶活性明显下降。但是，在Vector与pGL3及pGL3-BCL2-3’UTR共转染SHI-1细胞后，pGL3组与pGL3-BCL2-3’UTR组的相对荧光素酶的活性并未见明显的改变。在SHI-1细胞的荧光素酶报告基因实验中也证实，只有在LLEST与pGL3-BCL2-3’UTR同时存在时，相对荧光素酶活性才会出现明显下降。因为SHI-1细胞本身高表达LLEST基因，K562细胞低表达LLEST，在转染空载体Vector的SHI-1细胞和K562细胞本身就存在一个LLEST量的差别，通过图6和图7的比较，转染了pGL3-BCL2-3’UTR这两株细胞，SHI-1-Vector细胞株的相对荧光素酶活性明显降低，更加印证了LLEST与pGL3-BCL2-3’UTR同时存在才会出现相对荧光素酶活性明显降低的情况，pGL3-BCL2-3’UTR是LLEST作用的靶点。17 第二部分长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第二部分LLEST抗白血病机制与XIAP材料与方法一、主要材料1、LLEST、XIAP实时定量PCR的引物和探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成。LLEST、XIAP普通PCR所需引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。2、PfuDNA聚合酶、HotStartTaqPlusDNA聚合酶、MMLV逆转录酶均购于IBM公司。3、LLEST细胞株、Vector细胞株。4、TRIZOL：购于PROMEGO公司。二、主要仪器1、超净工作台：苏州净化设备厂。2、不锈钢恒温水浴锅：英国Grant公司。3、水平离心机（LDZ-5）：北京医用离心机厂。4、CO2培养箱：美国Thermo公司。5、倒置相差显微镜：日本OLYMPUS公司6、9700型PCR基因扩增仪：PE公司。8、7500real-timePCR扩增仪：ABI公司。9、倒置相差显微镜：日本OLYMPUS公司。10、高速低温离心机：德国Heraeus公司产品。三、实验方法1、Q-PCR法检测LLEST细胞株和Vector细胞株的XIAP基因的表达实验组：LLEST细胞株，对照组：Vector细胞株。1.1收集LLEST细胞株和Vector细胞株的对数期细胞大约，用PBS洗涤两遍后，15000r/min离心收集细胞在1.5ml的EP管里。1.2TRIZOL一步法提取总RNA。（同第一部分）1.3将mRNA逆转成cDNA。（同第一部分）18 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第二部分1.4Q-PCR检测AML患者及白血病细胞株中LLEST转录水平1.57500RealTimePCRSystem进行Q-PCR检测，引物和探针由PrimerExpress2.0设计。25μl的反应体系包括cDNA4μl、上下游引物各0.5μl、探针0.3μl、TaqMan通用PCRMastermix12.5μl、ddH2O7.2μl。反应条件为50℃2min，95℃10min,95℃15s，60℃1min，共40个循环。以-ΔCtβ-actin表达作为内参，检测结果以2表示结果，实验重复3次。2、选择18例AML的患者治疗前后的骨髓标本，用Ficoll法分离患者骨髓标本中的单个核细胞，溶于1mlTrizol吹打至细胞破碎。RT-PCR检测治疗前后LLEST和XIAP的基因水平。2.1TRIZOL一步法提取总RNA。（同第一部分）2.2将mRNA逆转成cDNA。（同第一部分）2.3普通PCR。（同第一部分）2.41.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。（同第一部分）结果1、LLEST细胞和Vector细胞的XIAP基因表达实验前期，我们利用脂质体2000转染、G418筛选建立了高表达LLEST的细胞株（LLEST细胞株）和空载体的单克隆K562细胞株（Vector细胞株）。Q-PCR定量检测3株LLEST细胞和3株Vector细胞的XIAP水平。如图所示，LLEST细胞株的XIAP相较于Vector细胞株明显低水平（P＜0.05）。19 第二部分长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建图8LLEST影响XIAP的表达2、初治AML治疗前后临床标本中LLEST与XIAP基因水平RT-PCR方法检测18例初治AML患者的治疗前后的骨髓细胞的LLEST和XIAP基因，电泳分析发现在缓解后相较于治疗前，有4例患者LLEST是明显升高，XIAP基因表达是降低的，说明XIAP在患者治疗后有下降的趋势。图94例临床标本化疗前后LLEST与XIAP的表达注P：病人N：治疗前R：缓解后20 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第三部分第三部分携带长链非编码RNA-LLEST基因慢病毒质粒的构建材料与方法一、主要材料1、限制性内切酶BamHI、T4DNA连接酶、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）均购于Promega公司。2、PfuDNA聚合酶、HotStartTaqPlusDNA聚合酶、MMLV逆转录酶均购于IBM公司。3、LLEST实时定量PCR的引物和探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成。4、质粒小量抽提试剂盒Wizard®PlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem、PCR产物纯化试剂盒Wizard®PCRPrepsDNAPurificationSystem均购自Promega公司。质粒大量抽提试剂盒PlasmidMaxiKit购于QIAGEN公司。二、主要仪器1、超净工作台：苏州净化设备厂。2、不锈钢恒温水浴锅：英国Grant公司。3、水平离心机（LDZ-5）：北京医用离心机厂。4、CO2培养箱：美国Thermo公司。5、倒置相差显微镜：日本OLYMPUS公司。6、9700型PCR基因扩增仪：PE公司。8、7500real-timePCR扩增仪：ABI公司。9、倒置相差显微镜：日本OLYMPUS公司。10、高速低温离心机：德国Heraeus公司产品。三、方法1、LLEST片段的制备与获得前期实验已利用CLONTECH公司SMARTRACE试剂盒克隆全长，并完成了进21 第三部分长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建行测序鉴定，并已制备完成重组真核表达载体pcDAN3.1-LLEST。我们以pcDAN3.1-LLEST为模板，制备LLEST基因片段。1.1设计引物因为所用质粒是LV5质粒（如图10所示），上面有多个酶切位点。在LLEST片段序列上搜索酶切位点，BamHⅠ是符合要求的酶切位点。所以在设计克隆LLEST的片段时在引物上下游端加上BamHⅠ的酶切位点序列，并加上酶切位点保护碱基CG。图10LV5质粒图谱引物序列上游引物CGGGATCCGGTGATGGGAAATTTCAGAC下游引物CGGGATCCCTTTTAAGTAGAGATGGGGT加粗部分为BamHⅠ的酶切位点，斜体字部分为保护碱基。1.2PCR反应扩增LLEST基因片段50μl反应体系如下（以Taq酶为聚合酶，在目的片段加A尾）：试剂体积（μl）TemplateDNA0.5primer（F+R）1.05×FastPfuBuffer1022 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第三部分2.5mMdNTP5.0Taqpolymerase1MgSO42PCRStimulant(5×）10ddH2O20.5PCR反应条件为：95℃预变性2min；95℃20s，56℃40s，72℃40s，共28个循环；72℃延伸5min。1.3割胶回收1.5%琼脂糖电泳分析PCR产物，凝胶成像仪紫外光下成像并拍摄。定位400bp大小左右Maker位置处的条带。1.3.1溶解胶块。以最小体积将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，切碎成块，称取凝胶重量。胶块中加入3倍凝胶体积的BufferPC。（例：凝胶重为100mg，其体积可视为100μl）。50℃孵育10分钟后，温和地上下颠倒离心管以充分溶解胶块。可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，促进胶块完全溶解。（胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。）1.3.2柱平衡:将吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入200μlBufferPS，12,000rpm（~13,400×g）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。1.3.3将步骤1溶解胶块中所得溶液加入到平衡好的吸附柱（已装入收集管）中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。1.3.4向吸附柱中加入650μlBufferPW（使用前确认已加入无水乙醇），12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。1.3.5将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。1.3.6将吸附柱放到一个新离心管中，向吸附膜中间位置加入30μlBufferEB23 第三部分长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建（pH=8.5），室温放置2分钟。12,000rpm离心2分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。1.4LLEST片段（加酶切位点）的制备1.4.1T-A连接（pMD19-T载体）T载体（T-Vector）是一种高效克隆PCR产物（TA克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，是一种快速、高效的非定向克隆。T载体的作用原理：绝大部分耐热的DNA聚合酶（如Taq酶）在参与PCR反应时都具有在PCR产物的3’末端加一个“A”的特性。因此，在线性化平末端载体的两端分别再人工加上一个额外的T碱基，因此可与PCR克隆性产物的A末端互补配对，可以提高PCR产物连接及克隆的效率。蓝白斑筛选原理：蓝白斑筛选原理是重组子筛选的一种方法:是根据载体遗传特征筛选重组子，现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列及前146个氨基酸的编码信息。在编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端，但是不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽然没有酶活性，但当它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，即α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点之后，几乎不可避免地导致产生无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。T-A连接反应体系：试剂体积（μl）T载体1LLEST片段4Solution524 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第三部分1.4.2LB培养基的制备及连接子转化感受态细胞LB液体培养基的制备以100ml培养基的制备为例，NaCl1g、胰蛋白胨1g、酶母提取物（YestExeract）0.5g、双蒸水100ml，搅拌均匀后高温消毒，待降至常温后置4℃冰箱保存。LB固体培养基的制备（含Amp）在上面的配方中额外加入0.5g的琼脂糖粉（Agar），高温消毒后待冷却至40◦C时，加入Amp200μl（Amp的浓度为50mg/ml）混匀，再倒入10cm的培养皿中，密封后于4℃冰箱保存。连接子转化感受态细胞的操作步骤:1.4.2.1-80℃冰箱取出冻存的TOP10感受态细菌于冰上融化。1.4.2.2将20μl连接产物与60μl感受态细胞轻轻混匀，冰上放置30min。1.4.2.3置42℃金属浴中热休克90s。1.4.2.4将混合物加到500μlLB培养基（不含Amp）中，以270rpm，37℃，置摇床中30min。1.4.2.53500rpm离心5min，弃去400μl上清，再加入X-gal1μl和PTG7μl将混合液吹打均匀，铺在已制备好的含有Amp的LB平板上。平板倒置于37℃温箱过夜。1.4.3含LLEST基因阳性克隆的扩增1.4.3.1将含4μlAmp的2ml无菌LB溶液分装到灭菌的试管内，以灭菌枪头挑取单个白色菌落，将枪头打进试管，封好管口。1.4.3.2置于37℃，250rpm/min恒温振荡培养箱中，过夜培养。1.4.3.3以WizardTMPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem小量质粒抽提试剂盒提取质粒，方法如下：将过夜细菌悬液于10000g离心5min，收集收集细菌，加入250ul细菌重悬液吹打混匀，然后加入250μl裂解液，迅速颠倒混匀4次，室温静置2-5min至溶液清亮，再加10μl碱性蛋白酶溶液，颠倒4次混匀，室温静置5min，加入350μl中和液，快速颠倒4次混匀，14000g离心10min，转移上清液至离心柱，14000g离心1min，弃去离心后液体，加入750μl洗柱液，14000g离心1min，加入250μl洗柱液，14000g离心2min，将离心柱转移至一灭菌的1.5mlEP管，加无DNA酶水100μl，10000g离心1min，-20℃保存备用。酶切鉴定LLEST的阳性克隆及测序25 第三部分长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建将小量抽提所得的质粒进行酶切，酶切体系如下：试剂体积（μl）质粒DNA10BamHⅠ内切酶1Buffer（10×）2双蒸水7配制1.5%琼脂糖凝胶，将酶切反应产物加入泳道内，110V电泳大约30min左右，在紫外线仪下分析目的条带。选择在400bpmaker和9000bpmaker处都有条带所对应的T-LLEST质粒送检，对LLEST片段进行测序。用WizardTMPCRPrepsDNAPurificationSystem试剂盒回收目的基因片段（方法见1.3），测定浓度，进行标记。2、病毒质粒（LV5-LLEST质粒）的制备2.1线性LV5质粒的获得试剂体积(μl)LV5质粒2ngBamHIE1.2Buffer（1×）2ddH2O补充至20μl加入CIAP2μl（去磷酸化），37℃，30min70℃，5min（使CIAP酶失活）2.2LV5与LLEST片段的连接试剂体积(μl)LV5质粒（线性）0.8LLEST片段6.2T4连接酶1Buffer（5×）237℃金属浴，1h。26 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第三部分2.3挑克隆。选择LV5与LLEST片段正确连接的克隆2.3.1连接子转化感受态细胞。（方法见1.4.2）2.3.2涂板。（方法见1.3.4）2.3.3挑6个单个菌落进行小揺，小量质粒抽提，对质粒进行编号。（方法见1.4.3）2.3.4将抽提的质粒进行测序，确认LV5质粒上连接LLEST片段与否，及连接方向的正确性。2.3.5选择LLEST与LV5质粒正确连接的质粒，进行重组质粒的大量制备。2.4重组质粒的大量制备。选取一个能扩增出条带的小抽得到的质粒，以及LV5空质粒，进行转化、铺板、挑取单个新鲜的菌落，加入到含有3μlAmp的约3ml的LB液体培养基中，置于摇床中，37℃，8小时，250rpm。吸取1ml的菌液，加入到含Amp的500mlLB培养液中，继续于摇床中37℃，250rpm，12小时。我们用PlasmidMaxiKit质粒大量抽提试剂盒进行质粒大量抽提把大摇后的菌液收集在大的离心管中，4℃，4000g，离心15min。弃上清，用10mlP1液重悬沉淀，再加入10mlP2液混匀，上下颠倒用力混均，再在室温下孵育5min。再加10mlP3，立即且彻底用力上下颠倒4～6次混匀，冰上孵育20min。取QIAGEN-tip500管放在一个烧瓶上，加入10ml的QBT液，使其在重力的作用下全部流出。将含有细菌的管子在4℃，13000rpm，离心15min，转移含质粒DNA的上清至QIAGEN-tip500管中，使其全部流出。再用60ml的QC液冲洗QIAGEN-tip管。将QIAGEN-tip管放在一个新的离心管上，再向其中加入15ml的BufferQF使其全部流出，洗提质粒DNA，这时质粒DNA就在离心管中了。向离心管中加入10.5ml室温下的异丙醇，混合后，4℃，13000rpm，离心30min后，小心倒去上清。再用5ml室温的70%乙醇洗质粒DNA沉淀，并且4℃，13000rpm，离心10min，小心弃上清（不要碰到沉淀物）。风干沉淀后，可加入双蒸水将其溶解，测定其浓度并标记，贮存在-80℃。同样的方法应用于获取三个公共质粒，ΔR，VSV-G，Rev，测定其大量抽提质粒浓度，并做标记。3、病毒的制备6第一天:将293T细胞铺板在直径为10cm的培养皿中（6×10/皿），确保每个细胞都是单个悬浮的。27 第三部分长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第二天:用7ml10%DMEM换液。更换培养液时，吸管注意不要触碰到培养皿底部，培养液时沿着培养皿壁缓慢加入，防止将细胞冲散。（转染必须在换液后的2小时内完成）准备2.5MCaCl2，用0.2µM滤菌器过滤。准备2×HBS，调节PH值在7.05~7.10，用0.2µM滤菌器过滤。准备无菌水慢病毒包装体系质粒质量（µg）重组或空的慢病毒穿梭载体10ΔR6.5VSV-G3.5Rev2.5（1）将上述质粒混合，在EP管中加无菌水至450µl。（2）将CaCl2（2.5mM）50µl逐滴加入上述体系中。（3）将上述混合液逐滴加入到500µl的2×HBS中，加完吹打一次。（4）放入37℃培养箱孵育5min，吹打一次后，逐滴加入293T细胞上清中，混匀。第三天：以5ml10%DMEM换液。第四天：收集含有病毒的上清，800rmp，5min低俗离心机离心，将上清以0.2µM滤菌器过滤，于-80℃储存。4、病毒转染K562细胞5取对数生长期的K562细胞加入24孔细胞培养板中(1×10个/孔)。设置不同浓度病毒颗粒感染浓度，分别转染空载体或重组载体病毒上清，37℃，5%CO2培养24h后，PBS洗涤细胞两遍，转移细胞到培养瓶中继续培养72h后流式细胞仪检测感染率。Q-PCR检测LLEST的表达。结果1、LLEST片段的获得以脂质体重组真核表达载体pDAN3.0-LLEST为载体，根据BamHⅠ酶切位点序28 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第三部分列及保护碱基设计的引物扩增LLEST片段。1.5%琼脂糖电泳分析所得PCR产物，电泳结果如图11所示。图11扩增加BamHⅠ酶切位点的LLEST片段电泳结果2、T-LLEST重组质粒酶切电泳图T载体连接LLEST片段大量制备T-LLEST重组质粒，经BamHⅠ酶切后如图12所示在第5泳道有两条带。LLEST为431bp的片段，在500bpmaker左右处条带为酶切后的LLEST片段，接近上样孔的条带为T载体的电泳条带。选择此泳道对应的T-LLEST重组质粒，以对LLEST片段进行测序。图12T-LLEST片段BamHⅠ酶切电泳图3、T-LLEST重组质粒测序结果选择上述所得T-LLEST重组质粒进行送去测序，与经SEQUENCHER软件分析后与NCBI数据库LLEST片段序列比对，结果一致。如图13示。图13T-LLEST重组质粒测序结果29 第三部分长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建4、LV5-LLEST质粒测序结果将所得LLEST片段与LV5质粒与进行连接，由于LLEST两端均具有BamHⅠ酶切位点，在进行T4连接酶进行连接时，有可能出现LLEST片段与LV5质粒连接相反的情况，需要我们判断LLEST片段与LV5连接的正确性，包括连接和连接方向的正确性。我们应用测序方法检测LV5与LLEST连接的正确性，结果以SEQUENCHER软件进行分析，如图14，送检样本1，2，4，5均测序正确。图14LV5-LLEST质粒测序结果5、成功构建了携带LLEST片段的LV5-LLEST质粒（如图15）图15ALV5质粒BLV5-LLEST质粒6、LV5-LLEST包装慢病毒转染K562细胞在293T细胞中进行慢病毒的包装，我们获取病毒的上清，并对K562细胞进行转染，获得90%的阳性率，通过定量PCR的方法验证重组质粒的有效性。-ΔCt结果以2表示。我们可以看到，在LV5-LLEST病毒上清转染K562细胞与LV5病毒上清转染K562细胞相比较，其LLEST水平水平明显高水平，这也说明30 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建第三部分LV5-LLEST质粒构建的成功以及病毒包装的成功。图16转染LLEST慢病毒K562细胞LLEST基因表达31 讨论长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建讨论急性髓系白血病(AcuteMyeloidLeukemia,AML)是一类高度异质性的恶性血液病，由于造血干／祖细胞发生恶性变，分化、成熟障碍，细胞阻滞在不同的造血阶段，从而导致的造血系统恶性肿瘤。目前，AML的发病机制不断充实丰富，“二次打击”[1]学说是AML的主要发病机制已得到公认。二次打击学说主要涉及到两类基因突变，第一类突变主要累及信号转导途径中的酪氨酸激酶，如FLT3突变和C-KIT突变等，[2]这类突变予以造血前体细胞增殖及生存优势。第二类突变累及造血调控相关的转录因子，如AMLl-ETO融合基因等，使造血细胞分化阻滞以及随后的凋亡受抑。这两[3]类突变共同作用才导致了AML的发生。在AML中，这些分子水平上的改变一定程度上解释了白血病的发病机制。但是在AML患者中，尚有50%患者并未发现分子遗传学的改变。这提示我们，尚存在其他机制参与AML的发生及发展。非编码RNA在调节生物体生长发育、细胞定向分化、亚细胞结构分布、进化选[4]择等方面有重要的作用，其异常表达和疾病的发生重要联系。近年来，非编码RNA成为人们重要的研究热点。长链非编码RNA（LncRNA）是非编码RNA的重要组成部分，它不能编码蛋白质，最初被认为是转录过程的副产品。然而，经过多年来LncRNA功能的研究，证实LncRNA在细胞的多种生命过程中起到重要作用。LncRNA在细胞增殖、分化、凋[5-7]亡、迁移等细胞过程直接或间接参与其中。例如LncRNA-MT1JP通过调节P53信[10]号转导途径影响细胞周期。HULC作为一种长链非编码RNA加强PI3K/Akt/mTOR[11]通路的信号转导，从而促进细胞增殖。近年来，LncRNA与肿瘤的相关研究也取得了进展。研究发现，PVT1水平升高[8]预示胃癌更差的OS与DFS，对胃癌的早期诊断和预后有重要的指导意义；UCA1[9]基因在肾癌中发挥原癌基因的效应，参与癌症的发生；而MALAT-1作为一种lncRNA，在正常组织中广泛表达，但在多种肿瘤中，如前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等表达水平上调；有意思的是H19，在肿瘤中既可以发挥促癌作用，也可以发挥抑癌作用。LncRNA在淋巴造血系统疾病方面报道也不少见：HIS-1可以导致髓系白血病，32 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建讨论[12-13]而LUNAR1与弥漫大B细胞淋巴瘤的诊断与预后密切相关。LncRNA在淋巴造血系统的成为研究热点。LLEST是本课题组前期在进行白血病基础研究时发现的一种长链非编码RNA。研究发现，在骨髓CD34+细胞中，LLEST由良性疾病到恶性疾病呈现出低表达态势。通过AML骨髓标本的检测，LLEST呈现低表达，而且与疾病的病程及预后有着密切的关系，AML患者在经过化疗缓解后，LLEST的水平明显升高，高水平的LLEST也有着较好的预后。LLEST成为AML病程的一个重要标志。[14]Haferlach等曾经利用基因芯片技术研究骨髓单个核细胞的基因表达谱，以期寻找造血系统恶性疾病标记基因，其基因芯片的数据被收录在NCBI数据库中。我们利用Haferlach的数据进行分析，结果与本课题组的前期在骨髓CD34+细胞中研究结果相似。LLEST在AML和MDS患者的骨髓CD34+细胞中呈现低表达态势。而在骨髓单个核细胞中，与正常人相比，LLEST在恶性血液病AML及MDS中表达水平是明显下降的。这也体现了LLEST的低表达在AML中的重要意义。前期本课题组实验结果表明LLEST对白血病细胞有负性调控作用，它能够抑制白血病细胞株K562细胞的生长，将细胞周期阻滞在G2/M期，并能促进细胞的凋亡及分化。深入研究后发现，一些与凋亡相关的蛋白参与了LLEST抗白血病效应。在高表达LLEST的K562细胞株中，活性的caspase9增加，BCL2明显减少。凋亡在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。生理状态下，细胞凋亡主要通过细胞内途径和细胞外途径（线粒体途径）完成细胞的更新，取代衰老和异常的细胞。线粒体途径是重要凋亡通路之一，BCL2家族蛋白在此通路中起到重要作用。线粒体通路的凋亡主要是由非死亡受体刺激因素启动。这些刺激促使线粒体释放很多促进凋亡因子，包括：细胞色素酶C、Smac/Diablo、Htr2/Omi、核酸内切酶G等。细胞色素C释放到胞浆，促使Apaf-1与casepase-9酶原复合物的形成，并促使casepase-9活化，进而激活casepase-3、7，发挥促进凋亡作用。另外，释放的Smac/Diablo、Htr2/Omi通过释放IAP有利于casepase的活化。对于核酸内切酶G，它在细胞核发生凋亡时的[16]变化起到重要作用。长链非编码RNA通过多个水平发挥作用，包括对染色质的表观遗传学修饰，基[15]因转录的调控，mRNA稳定性的影响以及对基因翻译的调控等。本课题组前期对LLEST的功能进行了初步研究，但是其发挥抗白血病作用机制33 讨论长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建尚未明了。目前的研究表明，LncRNA主要是通过多种机制发挥在表观遗传学、转录、转录后等层面上影响基因的表达水平来发挥功能的，其中，转录水平的作用较为常见，也较为容易进行研究，因此我们将后续的研究重点放在基因上及其表达上。首先用基因芯片技术检测了稳定高表达LLEST的K562细胞株（LLEST细胞株）及对照组细胞株（Vector细胞株）中的基因，结果显示，两组细胞株有1613个基因的表达存在明显差异；另外根据生物信息学分析软件预测LLEST可能作用的基因，有1518个基因进入我们的视野。这两种方法得到了两个基因数据集，共有11个基因同时存在于这两个数据集中。这11个基因是接下来研究的重要基因。在这11个基因中，基因表达水平有高有低，BCL2、XIAP等6个基因在LLEST组细胞株中呈现下降趋势。众所周知，LncRNA对基因的作用主要是通过基因的3’UTR和5’UTR影响基因的表达的，因此，我们将表达下降的6个基因纳入我们的研究范围。然后选取临床病人标本对下降的6个基因进行进一步的研究。临床选取了4例初诊AML病人治疗前和缓解后的骨髓标本，缓解后的骨髓细胞LLEST表达水平明显升高。而在所关注的基因中，只有BCL2基因的表达水平在所有患者中呈现较为一致的趋势。这足以说明BCL2基因的表达与LLEST存在相关性。随之，检测BCL2蛋白在LLEST细胞株和Vector细胞株皮下成瘤实验的瘤块中的表达情况，显示LLEST细胞所致瘤块的BCL2蛋白的表达明显低水平。细胞实验、动物实验及在原代细胞水平上的实验均表明LLEST对BCL2存在某种调控作用。BCL2基因编码BCL2蛋白，是BCL2家族的重要一员，其编码的BCL2蛋白主要定位于线粒体膜，可以通过多种机制发挥抗凋亡作用。第一，BCL2通过抑制谷胱甘肽（GSH）的外泄，降低胞内的氧化还原电位来控制线粒体的膜电位来抑制细胞凋亡。第二，BCL2能调节线粒体膜对一些凋亡蛋白前体的通透性。BCL2蛋白封闭了Bax蛋白形成孔道的活性，使一些促进凋亡的小分子如细胞色素C不能自由通透，从而保护细胞。第三，BCL2能将凋亡蛋白前体Apaf-1等定位至线粒体膜上，使其不能[17]发挥凋亡作用。但是，BCL2基因对于LLEST，是直接作用的靶基因还是其间接调控的一个基因尚不清楚。荧光素酶报告基因是可以很好解决这个问题的实验技术。在荧光素酶报告基因实验中，将BCL2基因的3’UTR装载在pGL3载体上，即pGL3-BCL2-3’UTR质粒，转入到细胞。BCL2的3’UTR包含软件预测的LLEST的作34 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建讨论用位点。如果LLEST直接作用于BCL2基因，就会抑制荧光蛋白酶的表达，荧光强度就会减弱。若LLEST对于BCL2没有靶向作用，荧光蛋白酶活性不会受到影响，荧光强度不会有明显改变。我们选取的实验细胞株有两种，一种是K562细胞株，本身低表达LLEST基因，我们选取前期脂质体转染建立的稳定细胞系，高表达LLEST基因的K562细胞株，LLEST细胞株和转染空载体细胞的Vector细胞株；一种是SHI-1细胞株，本身高表达LLEST基因。结果表明荧光素酶的表达在LLEST细胞株和Vector细胞株中是没有明显差异的。而在转入pGL3-BCL2-3’UTR质粒后，LLEST细胞株的相对荧光素酶活性明显降低而Vector细胞株没有影响，这足以说明BCL2是LLEST的一个靶点，由于高水平的LLEST对BCL2的3’UTR产生了明显抑制，最终使荧光素酶活性降低。相似的结果我们也可以在SHI-1细胞株中看到。我们在SHI-1细胞中转染pGL3-BCL2-3’UTR质粒，空载体Vector质粒，由于细胞株本身高表达LLEST，因此，荧光素酶的活性较转入PGL3质粒和Vector质粒的细胞株明显减少。在共转pcDNA-LLEST质粒和pGL3-BCL2-3’UTR质粒后，更高水平的LLEST，并且存在LLEST的作用位点BCL2-3’UTR，这种荧光素酶活性降低的现象更为明显。荧光素酶报告基因实验阐明了LLEST直接作用于BCL2基因的3’UTR，结合我们之前的实验结果，这也可以解释，在细胞中，LLEST可以通过直接作用BCL2基因，影响转录后的翻译阶段，减少BCL2蛋白的生成，促进细胞凋亡发挥抗白血病细胞株的作用。LLEST通过直接抑制BCL2基因发挥促凋亡作用。此外，我们在研究LLEST的功能时，发现XIAP是LLEST调控的一个潜在基因。在LLEST细胞株和Vector细胞株中，两组的XIAP基因的表达水平存在明显差异。LLEST组XIAP基因表达水平明显低于Vector组。说明XIAP的表达水平与LLEST水平的表达可能存在相关性。我们又对18例急性白血病患者的初诊和完全缓解后的骨髓标本进行检测，有4例患者的LLEST基因水平升高的同时，XIAP基因出现了下降。XIAP基因编码的XIAP蛋白是凋亡抑制蛋白IAP家族的一员，IAP蛋白主要促[18]进caspase蛋白的活化参与抑制凋亡。XIAP在IAP家族中的抑制凋亡的作用最强。35 讨论长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建XIAP的BIR3结构域可以与活化的caspase-9亚单位结合而抑制其活性。活化的caspase-9促进下游caspase的激活受到阻碍，因此抑制了线粒体途径的凋亡。另外XIAP还可通过竞争性和非竞争性结合来抑制凋亡过程中另一个关键性效应酶caspase-7的活性来发挥抗凋亡作用。但是，至于XIAP在LLEST抗白血病机制中的作用，尚需要进一步研究。我们已经初步完成LLEST在细胞株及裸鼠的效应及功能的研究，其在原代白血病细胞上的效应及功能尚不清楚。为了更好了探究LLEST在原代细胞上的作用，需要建立高表达LLEST基因的原代白血病细胞模型。既往，我们对于LLEST基因功能的研究都是通过脂质体转染的方法进行，在我们接下来的实验，我们选择构建LLEST基因的慢病毒载体，主要考虑的到慢病毒载体的以下优势：第一、慢病毒能作用于细胞周期的G0/G1期，而且具有嗜核性，所以有较高的转染效率，可以感染几乎所有的哺乳动物细胞，包括分裂和不分裂的细胞，如神经元细胞、原代细胞、干细胞等；第二、慢病毒载体基因组可以整合到细胞基因组中，实现稳定长效的表达；第三、慢病毒载体可以兼容多个转录启动子；第四、慢病毒载体还具有转移的基因片段容量较大。由于白血病原代细胞的特殊性，慢病毒转染会增加基因的转染效率，实现稳定长[19-20]效的表达，慢病毒是将LLEST基因转进白血病原代细胞的良好载体。慢病毒载体是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统。慢病毒载体的构建原理就是将HIV-1基因组中的顺式作用元件(如包装信号、LTR)和编码反式作用蛋白的序列进行分离，分别存放于3-4个不同的质粒中，即载体成分和包装成分，两者互补。载体成分含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点以及插入的目的基因；包装成分除顺式作用序列外，还能反[21]式提供产生病毒颗粒所需的蛋白。我们在目的基因两端添加了BamHI的酶切位点，这样使目的基因和载体能够实现连接，然后我们通过基因测序方法获得正向连接的使重组质粒。我们选择的慢病毒载体，有GFP作为报告蛋白，由于其较高的表达效率，我们可以通过流式细胞仪了解病毒颗粒包装情况及病毒感染细胞的效率。此外，该载体还携带抗氨苄青霉素的基因，有助于重组载体在大肠杆菌中的扩增以及菌落的筛选。病毒的包装是构建病毒重组载体的重要过程。病毒颗粒的包装细胞我们选择了36 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建讨论293T细胞，它作为包装细胞已被广泛用来制备慢病毒载体。该细胞由293细胞派生，表达SV40的大T抗原，使含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。转染方法是决定病毒颗粒包装成功的重要因素，目前常用的转染方法主要有DEAE-葡聚糖法、磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质体法等，各有优缺点。本研究选择了磷酸钙共沉淀法，该法操作较简单，成本低并且较易达到稳定的转染。而293T细胞用磷酸钙转染，效率可达50%以上。利用磷酸钙共沉淀法将重组慢病毒载体与其他三种质粒混合物共转染293T细胞来包装慢病毒颗粒，在转染细胞时，处于指数生长期的细胞以及合适的密度对于提高病毒载体的滴度十分重要。因此，转染前12小时必须进行293T细胞传代，调整细胞密度并重新接种，达到经过12小时细胞长成70%左右的单层细胞。此时再进行转染，可以获得更好的转染效果以及获取更高滴度的慢病毒颗粒。对于重组载体的鉴定，我们可以通过设置不同的病毒颗粒感染浓度转染K562细胞，以GFP为标记蛋白，流式细胞仪检测感染率，Q-PCR方法检测目的基因的表达。我们通过定量PCR检测后，发现LLEST的表达水平明显升高，这说明我们构建的重组慢病毒载体LV5-LLEST是成功的，这也为我们下一步研究LLEST在原代白血病细胞上功能提供了理论和实验基础。综上所述，LLEST在AML和MDS患者中存在差异性表达。目前已初步证实，LLEST的抗白血病机制主要是通过LLEST直接抑制BCL2基因，促进细胞凋亡实现的。XIAP基因也是参与LLEST促凋亡作用的重要基因，其机制还需更深入的研究。我们已经建立了携带LLEST基因的慢病毒载体，为下一步探究XIAP的机制及在LLEST在原代细胞上的作用及功能奠定了基础。37 结论长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建结论1、LLEST在AML与MDS的表达明显下降。2、LLEST对白血病细胞具有促凋亡作用，通过直接下调BCL2基因而介导。3、XIAP参与LLEST促凋亡作用，但其机制尚需进一步深入研究。4、成功构建携带LLEST基因的慢病毒载体，并初步完成了慢病毒的包装，为下一步探究LLEST在原代白血病细胞上的效应与功能提供理论与实验基础。38 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建参考文献参考文献[1]KellyLM,GillilandDG.Geneticsofmyeloidleukemias.AnnuRevGenomicsHumGenet,2002,3:179-198.[2]ReillyJT.ClassIIIreceptortyrosinekinases:roleinleukaemogenesis.BrJHaematol,2002,116(4):744-757.[3]TenenDG.Disruptionofdifferentiationinhumancancer:AMLshowstheway.NatRevCancer,2003,3(2):89-101.[5]HungT,WangY,LinMF,etal.ExtensiveandcoordinatedtranscriptionofnoncodingRNAswithincell-cyclepromoters.NatGenet,2011,43(7):621-629.[6]GuttmanM,DonagheyJ,CareyBW,etal.LincRNAsactinthecircuitrycontrollingpluripotencyanddifferentiation.Nature,2011,477(7364):295-300.[7]GuptaRA,ShahN,WangKC,etal.Longnon-codingRNAHOTAIRreprogramschromatinstatetopromotecancermetastasis.Nature,2010,464(7291):1071-1076.[8]LiCY,ZhuL,LiuZ,etal.AberrantexpressionoflongnoncodingRNAPVT1anditsdiagnosticandprognosticsignificanceinpatientswithgastriccancer.Neoplasma,2016[Epubaheadofprint][9]LiY,WangT,LiY.Identificationoflong-noncodingRNAUCA1asanoncogeneinrenalcellcarcinoma.MolMedRep,2016[Epubaheadofprint][10]LiuL,YueH,LiuQ,etal.LncRNAMT1JPfunctionsasatumorsuppressorbyinteractingwithTIARtomodulatethep53pathway.Oncotarget,2016[Epubaheadofprint][11]ZhuY,ZhangX,QiL,etal.HULClongnoncodingRNAsilencingsuppressesangiogenesisbyregulatingESM-1viathePI3K/Akt/mTORsignalingpathwayinhumangliomas.Oncotarget,2016[Epubaheadofprint][12]AskewDS,BartholomewC,BuchbergAM,etal.His-1andHis-2:identificationandchromosomalmappingoftwocommonlyrearrangedsitesofviralintegrationinamyeloidleukemia.Oncogene,1991,6(11):2041-2047.[13]PengW,FengJ.LongnoncodingRNALUNAR1associateswithcellproliferationandpredictsapoorprognosisindiffuselargeB-celllymphoma.BiomedPharmacother,2016,77:65-71.39 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长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建综述综述凋亡抑制蛋白XIAP在白血病中的研究进展龚芳综述祁小飞张日审校近年来，凋亡抑制蛋白XIAP（X-linkedinhibitorofapoptosisprotein）的功能受到重视，多项研究发现XIAP在肿瘤的发生发展中起着极为重要的作用。XIAP水平的下降不仅可以促进肿瘤细胞的凋亡，而且可以逆转肿瘤细胞耐药，增强肿瘤细胞化疗的敏感性。本文就XIAP的表达、功能以及与白血病的关系等方面做一综述。1.XIAP的生物学特性及功能XIAP在人体中除了外周血淋巴细胞，各组织均有表达。XIAP表达水平的平衡在维持内环境稳定及机体的健康方面起着至关重要的作用。在肿瘤细胞系中，XIAP的表达水平较正常组织细胞增加，而在耐药肿瘤细胞系中，XIAP表达水平高于亲代[1]细胞，提示XIAP与肿瘤的发生发展及耐药有密不可分的关系。但另一方面，XIAP[2]水平的降低甚至缺乏，将会导致X-连锁淋巴增生综合症2型，一种联合免疫缺陷病。XIAP是凋亡抑制蛋白（IAPs）中最具抑制活性的分子，它可以通过其BIR2（BaculovirusIAPRepeat2）结构域竞争性地与Caspase3/7的活性部位结合，直接抑[3]制激活。并能通过BIR3结构域与激活的Caspase9单体形成异源二聚体，保持Caspase9的单体结构，抑制其线粒体所诱导的活化，以致不能启动下游Caspase级联[4]激活，造成线粒体途径的凋亡抑制。另有研究发现XIAP的N端能保护细胞免于Fas诱导的凋亡，尽管其抗凋亡效果不及全长XIAP；C端虽然无此作用，但是能保[5]护细胞免于Bax诱导的凋亡。在卵巢癌患者腹水分离的T细胞中，可以检测到XIAP[6]的剪切片段，而在正常人中未检测到，提示XIAP的剪切片段可能参与肿瘤的形成。相关研究也证实XIAP的酶切作用有利于扩大其对凋亡的抑制作用，以更好地适应各种凋亡刺激。[7]通过对Caspase途径的抑制，XIAP能影响蛋白酶体功能。在AML细胞株中，XIAP水平的降低，最终会促进Caspase途径依赖的蛋白酶体活性的降低。41 综述长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建同时，XIAP蛋白亦通过调节抗氧化基因的表达来对活性氧介导的细胞凋亡进行[8]调节。HuangXing等研究结果证实，XIAP具有泛素E3连接酶功能，通过泛素化作用参与多个信号通路的信号转导。主要依赖于其RING结构域的泛素化功能，在BIR1结构域募集TAB/TAK1(转化生长因子激酶结合蛋白/转化生长因子激酶)激活信号转[10-16]导通路，例如NF-κB和MAPK通路等，来参与机体的炎症及免疫反应。也能[9]通过XIAP-Mdm2-P53途径抑制自噬形成肿瘤。在细胞增殖过程中XIAP通过抑制细胞周期蛋白A和D1及诱导周期蛋白依赖激Cip1/Waf1Kip1[17]酶抑制剂p21和p27，抑制细胞的增殖，进而抑制肿瘤的形成。2.XIAP在白血病中的意义XIAP蛋白水平的异常，可见于多种白血病亚型，如急性粒细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病及急性混合表型白血病等，与疾病的发生发展及耐药方面有着密切的联系。有关研究证实，XIAP高表达于急性髓系白血病，并且与耐药的产生密切相关。[16]2003年，Cater等对172名急性髓系白血病患者研究分析，发现XIAP的表达与患者细胞核型的异常，疾病缓解时间以及总体生存率并无明确联系。然而，Tamm研究团队随后分别对成人和儿童进行了研究。研究表明，在成人中，患者XIAP水平在M4/M5中有明显的差异，并且表达于正常的单核细胞中，而粒细胞中并未检测到。相对于有着预后较好的染色体核型患者，染色体核型预后较差及中等的患者，XIAP水平明显较高。在进行标准化治疗后，XIAP水平较低的患者有较高的总体生存率。这表明XIAP在成人急性髓系白血病的预后具有重要意义。与成人不同，研究证实在儿童急性髓系白血病中，XIAP高表达于M0/M1。而在细胞遗传学方面，XIAP在染[18-19]色体核型预后较好的AML的患者中表达水平较低。Tamm等对儿童长期随访研究发现，XIAP水平较高患儿有着较差的预后及更短的生存期。我国学者舒美蓉等通过对儿童急性淋巴细胞白血病研究发现，XIAP阳性患者的持续缓解率较低，推测XIAP与疾病的发生发展有关，XIAP的高水平表达是儿童急淋不良预后的一个指标。日本学者曾对急性混合表型白血病（AMLL）进行小样本的研究，通过RT-PCR方法检测XIAP的表达水平。相比于正常人，AML患者不同于ALL患者，其XIAP42 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建综述[20]水平是显著提高的。而对于AMLL患者，其XIAP表达水平更为高。XIAP与p-糖蛋白共表达与慢性粒细胞性白血病的有着较为密切的关系。在研究中发现，虽然XIAP对于慢性粒细胞白血病的疾病进展未见明显联系，但是XIAP与[21]p-糖蛋白高水平共表达卻与CML耐药有着密切关系。波兰学者曾将100位初诊慢性淋巴细胞白血病患者纳入研究，结果发现，虽然患者XIAP水平较正常人是呈下降趋势，但是，在疾病进展及复发患者中，其XIAP水[22-23]平较正常人显著升高，提示XIAP水平升高预示着CLL的疾病进展及较差的预后。3.XIAP与白血病的治疗Cater等曾用XIAP的反义寡核苷酸转染HL60细胞，结果使XIAP的mRNA及蛋白质水平下降，并且对于阿糖胞苷的敏感性较前升高。目前，第二代XIAP的第二[24]代ASO（AEG35156）已进入了临床实验。SMAC(secondmitochondria-derivedactivatorofcaspases)是存在于线粒体里的一种促凋亡蛋白，通过与XIAP结合发挥促凋亡作用。在白血病细胞株K562成功转入SMAC后，发现其紫外线诱导凋亡的敏感性提高，Caspase9和Caspase3活性也升高了。并且，在生物学效应上，细胞株的增殖、克隆形成等都受到了抑制。SMAC类似物，主要启动细胞死亡，或者协同增强其他化疗药物的细胞毒作用，现在已进入临床试验。作为XIAP的抑制剂，polyphenylureas可直接刺激Caspase的活化，直接诱导肿瘤细胞的凋亡，同时也增加了肿瘤对化学药物的敏感性。同时，这类化合物能够抑制[25]小鼠肿瘤的生长，而对正常组织未发现毒性。另一种XIAP抑制剂蒽贝素，可以诱[26]导白血病细胞的凋亡，并且可以减轻肿瘤细胞的耐药性，增加凋亡的敏感性。4.结语XIAP与白血病有着密切的联系，通过多种途径抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，最终导致了疾病的发生。随着对XIAP研究的深入，针对XIAP为靶点抗癌药物的研发，相关治疗方式及手段的应用，最终会为治疗白血病提供新的方向。43 综述长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建参考文献[1]TammI,KornbluSM,SegallH,etal.ExpressionandprognosticsignificanceofIAPfamilygenesinhumancancersandmyeloidleukemia.ClinCancerRes,2000,6(5):1796-1803.[2]AguilarC,LatourS.X-linkedInhibitorofApoptosisProteinDeficiency:MorethananX-linkedLymphoproliferativeSyndrome.JClinImmunol,2015,35(4):331-338.[3]DeverauxQL,TakahashiR,Salvesen,etal.X-linkedIAPisadirectinhibitorofcell-deathproteases.Nature,1997,388(6639):300-304.[4]ShiozakiEN,ChaiJ,RigottiDJ,etal.MechanismofXIAP-mediatedinhibitionofcaspase-9.MolCell,2003,11(2):519-527.[5]SuzukiY，NakabayashiY，NakataK，etal.X-linkedinhibitorofapoptosisprotein(XIAP)inhibitscaspase-3and-7indistinctmodes.JBiolChem,2001,276(29):27058-27063.[6]JohnsonDE,GastmanBR,WieckowskiE,etal.InhibitorofApoptosisProteinhILPUndergoesCaspase-mediatedCleavageduringTLymphocyteApoptosis.CancerRes,2000,60(7):1818-1823.[7]CarterBZ,MakDH,WangZ,etal.XIAPdownregulationpromotescaspase-dependentinhibitionofproteasomeactivityinAMLcells.LeukRes,2013,37(8):974-979.[8]ReschU,SchichlYM,SattlerS,etal.XIAPregulatesintracellularROSbyenhancingantioxidantgeneexpression.BiochemBiophysResCommun,2008,375(1):156-161.[9]HuangX,WuZ,MeiY.XIAPinhibitsautophagyviaXIAP-Mdm2-p53signaling.EMBOJ,2013,32(16):2204-2216.[10]LatourS,AguilarC.XIAPdeficiencysyndromeinhumans.SeminCellDevBiol,2015,39:115-123.[11]PhilpottDJ,SorbaraMT,RobertsonSJ,etal.NODproteins:regulatorsofinflammationinhealthanddisease.NatRevImmunol,2014,14(1):9-23.[12]SabbahA,ChangTH,HarnackR,etal.ActivationofinnateimmuneantiviralresponsesbyNod2.NatImmunol,2009,10(10):1073-1780.[13]KapoorA,FormanM,Arav-BogerR.Activationofnucleotideoligomerizationdomain2(NOD2)byhumancytomegalovirusinitiatesinnateimmuneresponsesandrestrictsvirusreplication.PLoSOne,2014,9(3):e92704.[14]BertrandMJ,DoironK,LabbéK,etal.CellularinhibitorsofapoptosiscIAP1and44 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综述长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建TRAILthroughXIAPinhibitionandNF-κBinactivation.CellBiochemBiophys,2015,71(1):291-297.46 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建中英文对照缩略词表中英文对照缩略词表英文缩写英文全称英文全称LncRNAsLongnoncodingRNAs长链非编码RNAAMLacutemyeloidleukemia急性髓系白血病C-KITv-kitHardy-Zuckerman4feline猫肉瘤病毒原癌基因sarcomaviraloncogenehomologMMmultiplemyeloma多发性骨髓瘤BCL2B-cellleukemia/lymphoma2B细胞淋巴瘤/白血病-2XIAPX-linkedinhibitorofapoptosisXIAPproteinFLT3fms-liketyrosinekinase3FMS样酪氨酸激酶3MALAT1metastasisassociatedlung肺腺癌转移相关因子adenocarcinomatranscript1ITDinternaltandemduplication内部串联重复JAK2Januskinase2Janus激酶2PCRpolymerasechainreaction多聚酶链反应RT-PCRReversetranscription-ploymerase逆转录聚合酶链反应chainreactionTKtyrosinekinase酪氨酸激酶MDSmyelodysplasticsyndromes骨髓增生异常综合征PBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液Apaf-1ApoptotisProteaseActivating凋亡蛋白酶激活因子-1Factor-1NPM1nucleophosmin核磷蛋白BMNCsbonemarrowmononuclearcells骨髓单个核细胞miRNAmicroRNA小分子RNAcDNAcomplementaryDNA互补DNA47 攻读学位期间公开发表的文章长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建攻读学位期间公开发表的文章1.龚芳，张日等，异基因造血干细胞移植治疗T淋巴母细胞性淋巴瘤10例临床观察，中国实验血液学杂志，已录用。2．龚芳，祁小飞，张日等，凋亡抑制蛋白XIAP在白血病中的研究进展，临床血液学杂志，已录用。3.WangTong,GongFang,ZhangRi,etal.PulsatillasaponinAinducesdifferentiationinacutemyeloidleukemia.Hematology,hasbeenaccepted.(共同第一作者)4.ChenHeng,ShenYunfeng,GongFang,etal.HIF-αPromotesChronicMyelogenousLeukemiaCellProliferationbyUpregulatingp21Expression.CellBiochemistryandBiophysics,2015,72(1):179-183.48 长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建致谢致谢光阴荏苒，转眼之间，三年研究生学习生涯即将结束，回首往事，万千感慨涌上心头，值此论文完成之际，请允许我向一直关心帮助我的老师、同学致以衷心的感谢。首先感谢我的恩师张日教授三年来对我的悉心爱护与栽培，成为您的学生，是我一生中最幸运和骄傲的事。是您引领我走进医学世界的又一片天地，启迪我的思维，点拨我的思路，在学习上给了我悉心的教导，让我三年研究生生活收获良多。您严谨求实的治学态度，精湛的医术，勤勉敬业的奉献精神，渊博的知识及您对待患者的细心爱心耐心深深地感染了我。您是我终身学习的标杆，我的每一步成长。同时我也特别感谢我的指导老师祁小飞教授，在科研学习上的悉心指导。实验课题的进展与完成离不开您的认真指导，您在引导我进入科研领域的同时，也教会了如何为人处事，在此我对他表示真心的感谢！您一直是我学习的榜样。感谢阮长耿院士、吴德沛教授、陈子兴教授、王兆钺教授等血研所各位前辈，你们渊博的知识和辛苦的付出，不断激励着我们进取，培养着我们的科学精神。感谢白血病研究所岑建农老师在实验中给予我精心指导和无私帮助，感谢沈宏杰老师、王元元老师、姚利老师、陈艳老师、马超老师、王曼老师等给予的热情帮助。感谢唐仲英血液病研究中心的赵昀老师、张秀艳老师、马文娟老师在我实验中给予的帮助及指导，让我丰富了知识。感谢放射医学中心的焦旸老师在质粒构建中给予的帮助。感谢血液科医生韩悦、张旭辉、薛胜利、马骁、徐杨、何雪峰、唐晓文、金正明、吴倩、周慧芬、石森森、陈晓晨、徐明珠等老师在临床工作上的悉心指导和帮助，您们给予我许多宝贵的临床经验，促进我知识体系的完善，在此致以我最衷心的感谢。感谢王彤、赵林艳、周洁、李正、桂晓敏、江凤、吴夏等师兄师姐给予的热心帮助，感谢费琴雯、何川、叶碧波、周莹莹、瞿伟伟等师弟师妹给予的大力支持，感谢同窗好友白莎莎、植立婷、顾彩虹、郦梦云、田长玉、赵勤勤、黄曼、胡星星、韩伟、刘磊、颜霜、朱文娟、刘彬、胡芳、郑佳佳、季诗梦、徐良静、曹晶、崔巍、王攀峰、王强力、鲍协炳、丁文静、孙妍珺、肖伦、张鹏善给予的大力帮助，感谢我的室友闞延婷、郭圆圆、植立婷、朱文娟，有你们的帮助与支持才让我的研究生生活充满乐趣，49 致谢长链非编码RNA-LLEST促凋亡机制的初步研究及慢病毒质粒的构建与你们相处的三年时光将成为我最宝贵的回忆。最后感谢我的家人与亲朋好友，你们默默的支持是我前进的最大动力。愿好人一生平安。谢谢！50 尸？＊＂ＩＩ＇ｗｍｇ４Ｓ，？，－、＊－＇．－＿？ｐ？’苏州大学？．；，．：；’Ｉ＇硕壬学位论文．沾．Ｉ（学术学位）‘！’，邻姆记＼＇？＊＊？如，Ｉ；ｓ押■？－－■．ｒ；：ｌｊ’？，．记Ｖ？？ｉ＇＂？＂＇：：－：：：ｓ：？■＾．：：＊！：＞：＼Ｖ＾ｒ＂＂＾＇＞＾＾．：；ｉ：＾记：；；；：：＼＂＇＇＇＾■－＇＂３：；■＾：Ｖ；：，；．．：；：；豐尋琴麵尹爭Ｈ：；：：；醜．■ＨＢＨＨｉｊＷＨｌｌｌＩＷｉ奪、’ｎ＾Ｈ－ｉｉｉｉｉｉｍｆｃｉＨＨ■■Ｉ■，ｉ—ｋ．■．ｌｌｌｌｌｌＨｆｃｉ，？Ｍ苏州大学研《如统－巾巾ｊ■＾１
