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分类号：R733密级：公开研究生学位论文墓头回水提物对白血病细胞周期的影响及相论文题目（中文）关分子机制的研究EffectandUnderlyingStudyofPatrinia论文题目（外文）HeterophyllaonLeukemiaCellCycle研究生姓名达晓静学科、专业内科学·血液病学研究方向白血病的基础与临床学位级别硕士导师姓名、职称赵丽教授论文工作起止年月2016年02月至2017年09月论文提交日期2017年10月论文答辩日期2017年11月学位授予日期2017年12月校址：甘肃省兰州市 墓头回水提物对白血病细胞周期的影响及相关分子机制的研究中文摘要目的：本研究探讨了墓头回水提物对白血病细胞株HL-60和K562细胞周期分布及部分相关基因表达的影响，进一步探讨墓头回水提物抑制白血病细胞增殖的机制。材料与方法：不同浓度的墓头回水提物作用于HL-60细胞和K562细胞24小时、48小时以后，应用流式细胞术（FCM）检测HL-60细胞和K562细胞的周期分布；利用qRT-PCR技术检测细胞周期部分相关调控基因CDK1、CyclinB1、CHK1、CDC25C的mRNA表达水平。结果：墓头回水提物可以导致HL-60细胞和K562细胞发生G2/M期阻滞。作用24小时后，随着墓头回水提物浓度的增加，G2/M期阻滞越明显，对HL-60细胞，药物浓度为10mg/ml时G2/M期细胞数达峰值（36.61%），较对照组G2/M期细胞（10.27%）明显增多（P＜0.05）。对K562细胞，药物浓度为20mg/ml时G2/M期细胞数达到峰值（54.22%），较对照组G2/M期细胞（14.7%）明显增多（P＜0.05）。随着作用时间延长至48小时，墓头回水提物对白血病细胞周期的阻滞作用较24小时无明显变化（P＞0.05）。墓头回水提物作用K562细胞24小时后CHK1mRNA表达增强（P＜0.05），CDK1、CyclinB1、CDC25CmRNA的表达下降（P＜0.05），随着作用时间延长至48小时，CHK1、CDK1、CyclinB1、CDC25CmRNA的表达水平均明显下降（P＜0.05）。结论：墓头回水提物可诱导HL-60细胞及K562细胞G2/M期阻滞，其诱导G2/M期阻滞作用可能与上调K562细胞CHK1mRNA水平，下调CDK1、CyclinB1、CDC25CmRNA的水平有关。关键词：墓头回，HL-60细胞，K562细胞，G2/M期阻滞，细胞周期调控基因I EffectandUnderlyingStudyofPatriniaHeterophyllaonLeukemiaCellCycleAbstractObjectivePatriniaheterophyllabunge.isatraditionalChinesemedicinewhichcouldprovideacureforleukemia.Here,wemainlystudiedtheeffectsP.heterophyllahasoncellcycle.Andfurtherinvestigatedthepossiblemechanism.MethodsTheHL-60cellsandK562cellsweretreatedfor24and48hourswithvariousP.heterophyllasolutionswhichdifferedinconcentration,tostudytheeffectsP.heterophyllahasoncellcycle.FlowCytometryandqRT-PCRwareemployedtodetectthechangesofcellcyclestatusandexpressionofCDK1、CyclinB1、CHK1、CDC25CmRNArespectively.ResultsP.heterophyllacouldarrestHL-60cellsandK562cellsinG2/MphaseandwefoundthatHL-60andK562cellsinG2/Mphaseincreasedinadose-dependentwaywhentreatedwithP.heterophyllafor24hours.ForHL-60cells,whentreatedwith10mg/mLP.heterophyllafor24hours,theproportionofG2/Mphaseshowedmuchhighervaluesthancontrol(36.61%vs10.27%,P＜0.05).AndforK562cells,theproportionofG2/Mphasewith20mg/mLP.heterophyllawassignificantlyhigherthanthecontrolgroup(54.22%vs14.7%,P＜0.05).ButitisworthtonotethattheproportionofcellsintheG2/Mphaseaftertreatedfor48hoursseemednochangescomparedwith24hours.(P＞0.05).Besidesthese,Theexpressionofcellcycle-correlatedmRNAwasalsoaffectedinK562cellswhentreatedwithP.heterophylla，includingtheincreasedexpressionofCHK1mRNAandthedecreasedexpressionofCDK1、CyclinB1、CDC25CmRNAaftertreatedwithP.heterophyllabothfor24hoursand48hours.ConclusionTheP.heterophyllacouldblockthecellcycleofHL-60cellsandK562cellsinG2/Mphase.ItcouldincreasetheexpressionofCHK1mRNAanddecreasetheexpressionofCDK1、CyclinB1、CDC25CmRNAinK562cells.KEYWORDSPatriniaheterophyllabunge.,HL-60cells,K562cells,G2/Mphaseblokage,CellcyclecontrollinggenesII 目录中文摘要..................................................IAbstract..................................................II第一章前言..............................................1第二章材料与方法.......................................52.1实验材料....................................................52.1.1实验细胞株............................................52.1.2实验药物..............................................52.1.3实验相关试剂..........................................52.1.4主要仪器设备..........................................52.1.5主要试剂的配制........................................62.2实验方法....................................................62.2.1细胞复苏与培养........................................62.2.2细胞计数法检测对数期..................................72.2.3细胞的冻存............................................72.2.4细胞的药物处理........................................72.2.5台盼蓝染色计算用药后细胞活力..........................82.2.6PI染色法流式细胞术检测细胞周期的变化..................82.2.7实时荧光定量PCR检测周期调控基因mRNA的表达...........82.2.8统计学分析...........................................10第三章结果.............................................113.1细胞计数法检测细胞生长.....................................113.2墓头回水提物对白血病细胞活力的影响.........................113.3墓头回水提物对白血病细胞形态的影响.........................123.4墓头回水提物对白血病细胞周期的影响.........................14 3.5墓头回水提物对K562细胞周期相关调控基因表达的影响..........20第四章讨论.............................................24第五章结论.............................................32参考文献.................................................33英文缩写词及中文对照....................................36综述.................................................37在学期间的研究成果......................................45致谢.................................................46 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究第一章前言白血病（leukemia）是多能干细胞或者很早期的祖细胞（髓系或者淋系）突变以后克隆引起的造血系统的恶性肿瘤，其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段，引起血细胞数量及功能的异常，并浸润至髓外造血系统。根据白血病细胞的自然病程和成熟程度，可将白血病分为急性白血病（acuteleukemia，AL）和慢性白血病（chronicleukemia，CL）两大类。根据白血病细胞的来源，AL可进一步分为急性髓系白血病（acutemyeloidleukemia，AML）和急性淋巴细胞白血病（acutelymphoblasticleukemia，ALL）。CL是由已分化成熟的有功能的细胞过度增殖引起，主要是由于信号传导异常，或增殖失控所致，并不存在成熟障碍，CL可分为慢性粒细胞白血病（chronicmyeloidleukemia，CML）和慢性淋巴细胞白血病（chroniclymphoblasticleukemia，CLL）。世界范围内成人白血病中最常见的是AML，AML是白血病患者中平均每年死亡数最多的疾病，流行病学显示，病毒感染、环境、遗传因素及职业均与AML的发病相关，2016年美国急性髓系白血病新发患者19950人，其中死亡人数10430[1]人，在2012年统计结果中显示其在20岁以下癌症患者中位居第二。上世纪80年代我国的流行病学调查显示，AML的发病率为1.6/10万人口。AML中位诊断年龄为67岁，其中54%的患者诊断年龄在65岁以上，并且1/3的患者诊断年龄大于75岁，由此可见，随着人口老龄化，AML发病率在逐年上升。AML的临床表现以发热和感染、贫血、出血及髓外浸润为主，治疗目前以化疗为主，包括诱导缓解和巩固治疗，对于预后中等及预后不良的患者，治疗以化疗后联合造血干细胞移植为推荐方案。近年来，随着多药耐药率的增加以及人口老龄化的加重，复发难治的AML患者比例明显增多，对于此类患者的治疗，除了常规化疗和造血干细胞移植外，一些去甲基化的药物等新型临床研究药物也逐渐成为备选药物。但是常规化疗包括心脏毒性在内的严重毒副作用、造血干细胞移植后早期的高死亡率以及新型药物的昂贵费用，仍然显著限制了患者治疗方案的选择。CML起病缓慢，患者早期常无显著症状，经常通过健康检查或因其他疾病就诊过程中发现，流行病学调查显示平均每年发病率为1/10万，美国2016年的普查显示，[1]慢性髓系白血病新发患者8220人，其中死亡1070人，男性患者略多于女性，中位生存期为5-7年。临床表现主要以乏力、消瘦、三系减低的症状以及脾脏肿大为主。CML的特点是9号染色体和22号染色体长臂发生易位，使得9号染色体上的原癌基因ABL与22号染色体的管家基因BCR形成BCR-ABL1融合基因，1 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究并转录翻译为Bcr-Abl1蛋白，该蛋白具有自身磷酸化能力，可诱导多条信号转导途径的异常激活，其中最主要的是促进细胞增殖及调节基因转录的Ras-MAPK[2]途径和调节基因转录的JAK/STAT途径，导致细胞无限增殖。酪氨酸激酶抑制剂（TyrosineKinaseinhibitors，TKIs）可阻止Bcr-Abl1蛋白磷酸化，以抑制细胞[3]死亡。目前，TKIs是治疗CML的一线药物，但是因为TKIs的作用机制，使得其影响正常细胞内酪氨酸激酶的作用，而出现消化系统、神经系统、心血管系[4,5]统的副作用，引起一些患者不能耐受的情况。此外，TKIs长期维持治疗的昂贵费用，以及BCR-ABL激酶区突变导致的药物耐受均是治疗过程中的现实问题。作为世界性的公共卫生问题，白血病严重的病情、过高的死亡率威胁着人类的生命。对白血病患者而言，虽然目前造血干细胞移植、免疫治疗、新型小分子靶向治疗等方法已逐步应用，且患者的缓解率和生存期亦取得了相应的改善，但是如上所述，仍然因为严重的毒副作用、多药耐药率的增加、供体的限制、移植的并发症、高昂的治疗费用、新型靶向药物治疗的局限性等实际问题影响着白血病的治疗效果，所以，化疗仍然是当前治疗白血病的常见方式，近二、三十年来，随着中草药在疾病治疗中作用的进一步探究和成功，使得中草药在白血病治疗中的研究也愈加火热，而国内外一些学者在中草药治疗白血病方面取得的疗效使得越来越多的血液病研究者热衷于开发高效低毒的抗白血病中草药制剂。墓头回是传统的药用植物，别名地花菜、墓头灰、脚汗草等，因其有起死回生之效而得名，是败酱属植物异叶败酱或糙叶败酱的根茎和根，主要分布于东北、华北等地，在«本草纲目»中早有记载，其性凉、味苦、微酸、涩，可清热解毒、收敛止血、燥湿止带，中医临床主要用于治疗肠痈、泄泻痢疾、疮疡肿毒、赤白带下、崩漏。墓头回的化学成分种类丰富，主要含三萜及其皂苷，活性成分包括常春藤皂苷元、齐墩果酸、软木三萜酮、海棠果醇、熊果酸、香树脂醇、东莨菪[6]内酯、异香豆素等。墓头回作用范围广泛，药理学研究发现其具有镇静、抗炎、抑菌、抗肿瘤、止血的效果，研究表明给予小鼠以1%的糙叶败酱挥发油灌胃，并于30分钟后给予腹腔注射戊巴比妥50mg/kg后，小鼠因戊巴比妥所致的睡眠[7]时间延长，但其作用强度较黄花败酱挥发油弱，相似的是，异叶败酱根及根茎制得的挥发油以0.25ml/kg灌胃给小鼠后，同样可显著延长腹腔注射戊巴比妥40mg/kg情况下的睡眠时间，而其强度等同于黄花败酱挥发油的作用，此外，异叶败酱根及根茎制得的挥发油还可以显著增加小鼠肝匀浆中细胞色素P-450的含[8]量。墓头回在抗菌方面有一定的作用，研究表明，墓头回1:1.5乙醇提取物与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及枯草杆菌共培养，37℃过夜后发现墓头回提取物可显著抑制这三种细菌的生长，有广谱抗菌作用，这对肿瘤合并感染的患者而言2 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究[9]是理想的治疗药物。在抗肿瘤方面，蒋秋燕等研究者发现，墓头回提取物对小鼠宫颈癌U14的生长有明显抑制作用，中、高浓度（750mg/kg·d、1500mg/kg·d）墓头回提取液灌胃后小鼠瘤重由1.95±0.09g变为1.25±0.13g、0.84±0.12g，而顺铂组为0.61±0.10g，小鼠存活时间由11.52±0.94d延长至17.55±0.81d、19.64±0.79d，顺铂组为21.16±0.89d，此外，可减少U14瘤体微血管密度、下[10,11]调组织bFGF及VEGF表达，糙叶败酱还可以降低宫颈癌U14荷瘤小鼠的乳酸脱氢酶表达水平，并使细胞周期阻滞在G1/S期，同时上调肿瘤组织中抑癌[12]基因P53、Bax，抑制癌基因Bcl-2的表达。在血液系统方面，墓头回也有广泛的应用，研究表明，墓头回水提物（5mg/mL）对急性粒细胞白血病部分分化型（AML-M2）和慢性粒细胞白血病加速期（CML-AP）患者的外周血单核细胞[13]有明显杀伤作用。有研究显示墓头回水提物（0.1mg/mL、1mg/mL、10mg/mL）对白血病细胞HL-60有明显的的抑制作用，存在显著的量效关系，且可促进[14]HL-60细胞向粒系和巨噬细胞分化，可提高细胞的吞噬率，尤以8mg/mL明显。墓头回提取物对白血病细胞K562也有明显的抑制作用，在一定浓度范围内（6.3~200mg/mL），存在明显的剂量依赖性，IC50为36.03mg/L，且可促进K562[15]细胞凋亡。墓头回主要成分齐墩果酸对HL-60细胞有明显的抑制作用，其中80umol/L的齐墩果酸作用48小时对HL-60细胞的抑制率达到50%以上，对HL-60诱导凋亡的作用呈明显的时间及剂量依赖性，并使HL-60细胞阻滞于G1[16]期。此外，浓度为0.01ug/ml的墓头回水提物可诱导脐血基质细胞的生长，促进基质细胞分泌粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、血小板生成素（TPO）、[17]白细胞介素-3（IL-3）、白细胞介素-6（IL-6）等细胞因子。免疫性血小板减少症（ITP）患者给予墓头回（儿童：2~4岁，15g/d；5~8岁，20g/d；9~11岁，25g/d；12~14岁，30g/d。成人：50g/d）治疗后治愈率为84.62%，治疗后血小[18]板抗体（PAIgG）表达降低，血小板数目增加。自上世纪50年代起，细胞周期作为细胞学上重大发现之一，在科研领域曾一度成为研究热点，1982年，TimHunt和TomEvans发现在细胞间期内有种可以周期性产生和消失的蛋白，在细胞分裂过程中出现，在分裂结束后即被水解，他们将这种蛋白质命名为周期蛋白（cyclin），这即是周期蛋白家族成员周期蛋白[19]B，自此以后，有许多研究者热衷于细胞周期及周期蛋白的研究，到目前为止，已发现的周期蛋白至少有21种，但是其中很多周期蛋白的功能尚待明确。周期蛋白在不同物种的组织、器官中以不同的形式表达，在细胞周期中，它们与周期蛋白依赖性激酶（cyclindependentkinase，CDK）结合形成复合物，该复合物经活化后可调控细胞周期的启动及各时相转化。当DNA损伤和复制不完全时，DNA损伤检查点（DNAdamagecheckpoints）和DNA复制检查点（DNAreplication3 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究checkpoints）通过活化细胞周期检测点激酶1（checkpointkinase1，CHK1）、细胞周期检测点激酶2（CHK2）和钝化CDC25磷酸酶阻滞细胞周期运行，提供修复时间。随着细胞生物学领域对细胞周期及周期蛋白研究的发展，细胞周期与肿瘤的关系也日渐明晰，哺乳动物体内，细胞的增殖与死亡的平衡稳定着各器官的功能，细胞增殖即是通过细胞周期完成，正常细胞分裂及分化过程中基因突变会导致基因组的不稳定，使突变基因数目增加，这些突变的基因多数是原癌基因，而这些原癌基因大部分又是细胞周期调控中的组份，在细胞分裂过程中，正常情况下通过细胞周期中的周期检控点保证基因的稳定性，当发生周期检控点基因突变时，细胞周期中基因的不稳定性会大大增加，并累积使细胞进入失控生长，现代医学根据细胞周期检控点的作用机制设计出许多抑制细胞增殖的新型抗癌药[20,21]，为未来肿瘤的治疗提供了新的思路。近年来大量研究报道了关于糙叶败酱及其不同提取物在体内外对肿瘤细胞强大的杀伤作用，但是大多数研究停留在对于挥发油和脂溶性物质，一些新近研究发现墓头回水提物能抑制白血病细胞的增殖，但对于墓头回对细胞周期的影响及其相关机制研究较少，因此，本实验以白血病HL-60细胞和K562细胞为研究对象，采用流式细胞术、qRT-PCR技术，观察墓头回水提物对白血病细胞株细胞周期进程及周期调控相关基因表达的影响，进一步探究墓头回的作用机制。4 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究第二章材料与方法2.1实验材料2.1.1实验细胞株人类急性髓细胞白血病细胞株（HL-60），人类慢性髓细胞白血病细胞株（K562），由兰州大学第一医院中心实验室提供。2.1.2实验药物墓头回（Patriniaheterophyllabunge.）采自甘肃省庆阳市，药用部位为根，经兰州大学中草药教研室鉴定为败酱科属植物糙叶败酱。2.1.3实验相关试剂RPMI1640培养液（美国HyClone公司）胎牛血清（美国HyClone公司）磷酸盐缓冲液PBS（北京生物制品研究所）青霉素、链霉素（美国HyClone公司）二甲基亚砜DMSO（美国Sigma公司）台盼蓝（美国Sigma公司）Trizol试剂（GIBICOL/BRL公司）特异引物设计及合成（宝生物工程（大连）有限公司）QuantcDNA第一链合成试剂盒（日本TaKaRa公司）逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司）SYBRPremixExTagTMII（日本TaKaRa公司）碘化丙啶（美国Sigma公司）2.1.4主要仪器设备超净工作台（美国Thermo公司）二氧化碳孵育箱（美国Thermo公司）恒温水浴箱（上海医疗器械七厂）倒置显微镜NikonEclipseTS100（日本尼康公司）低温高速离心机（德国Heraeus公司）-80℃超低温冰箱（美国Thermo公司）双蒸水制备仪（美国Barnstead公司）5 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究立式压力真气灭菌器（上海博迅实业有限公司）流式细胞仪（美国BD公司）Nano超微量核酸分析仪（上海精密科学仪器有限公司）实时荧光定量PCR仪（Lightcycle480）（英国罗氏公司）PE-2400PCR基因扩增仪（美国ABI公司）2.1.5主要试剂的配制（1）胎牛血清的灭活：配制培养基前，取出-20℃储存的胎牛血清,于常温或者4℃条件下解冻后，置于56℃恒温水浴箱中30min，期间每隔3-5分钟摇匀一次，使血清受热均匀，去活化其中的全部补体。然后在超净台内分装，于4℃保存待用。（2）完全培养基的配制：RPMI-1640与胎牛血清以9:1的比例混匀，其中每500ml培养液中加入5ml青霉素-链霉素溶液（100×）混匀，即胎牛血清终浓度为10%，青霉素-链霉素溶液终浓度为1%。（3）PBS缓冲液的配制：取0.02M袋装PBS混合晶体1袋，加入双蒸水定容至2L，置于磁力加热搅拌器上充分搅拌至晶体完全溶解，后以500ml/瓶分装，在121℃，103Kpa环境下高温灭菌30min，超净工作台内冷却至常温后置于4℃冰箱保存。（4）细胞冻存液的配制：取DMSO与胎牛血清以1:9的比例混合均匀，置于4℃冰箱中冷却备用，4℃避光条件下理论上可保存4周，但是通常情况下现配现用。（5）药物的配制：称取墓头回60g，加500ml双蒸水浸泡0.5h，添加双蒸水至1000ml，加热煮沸后常压煎煮2h，过滤。二、三次分别加入500ml双蒸水煮沸后煎煮1h，将三次滤液混合后加热浓缩至1g（生药）/ml，用0.22um的除菌器正压过滤除菌后，-20℃冷藏备用。2.2实验方法2.2.1细胞复苏与培养从液氮中取出冻存的HL-60、K562细胞，迅速置于37℃恒温水浴锅中，快速震荡1.5~2分钟，保证冻存管内的细胞以最短时间解冻，然后在超净工作台内迅速转移至10ml完全培养基中，800rpm离心5min，弃去上清，加入2-3mlPBS缓冲液充分洗涤，于800rpm再次离心5min，弃去上清，加入10ml的完全培养基，重悬细胞后转移至培养瓶，置于孵育箱（37℃、5%CO2）中常规培养。6 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究2.2.2细胞计数法检测对数期1.取生长状态良好的HL-60、K562细胞，PBS清洗；42.计数，用完全培养基配制成5×10/ml的细胞悬液备用；3.将细胞悬液精确地加入24孔板内，每孔2ml，取7个检测点，每个检测点3个复孔，共计21个孔；4.每天取3个孔的细胞进行计数，计算均值，培养3-5天后为未计数的细胞换液；5.以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘细胞生长曲线；6.细胞计数时用75%的乙醇棉球清洁计数板和盖玻片，用吸水纸轻轻擦干，用10×物镜观察计数板四角大方格，调节焦距使视野清晰后，盖上盖玻片。然后吸取少量细胞悬液（6ul）滴加在计数板上盖玻片一侧边沿。用显微镜10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，仅计左、计上。则细胞数/ml=四角大方格中的细胞总数/4×10000×稀释倍数。2.2.3细胞的冻存细胞计数，当细胞密度达到传代密度且细胞活性在90%以上时，可以冻存细胞；在超净工作台将要冻存的细胞转移至离心管，800rpm离心5min；弃上清，加入2-3ml1×PBS洗涤细胞，800rpm离心5min，离心后弃上清，加入配置好7的细胞冻存液，调整细胞浓度约1×10个，加入冻存管中密封，注明细胞株名称、时间，于4℃冰箱内放置20min，转移至-20℃冰箱内继续放置约30min，继而转移至-80℃冰箱中过夜，次日取出后放入液氮中长期保存。2.2.4细胞的药物处理适量除菌后的1g/ml的墓头回水提物在避光条件下用完全培养基稀释，制成终浓度分别为2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml阶梯式浓度备用。复苏细胞常规培养并注意观察其形态及生长情况，收集对数生长期细胞，于800rpm离心5min后，用PBS缓冲液2-3ml洗涤1-2次，800rpm离心5min，弃去上清，加入RPIM-1640培养基转移至6孔板，每孔5ml细胞悬液，细胞数5目约5×10个，做好标记，培养12小时后，每孔分别加入适量胎牛血清，使血清中浓度为10%，轻轻混匀后分别加入不同浓度的墓头回水提物，对照组加入等量的完全培养基。后将六孔板置于孵育箱（37℃、5%CO2）中分别培养24小时，48小时后进一步实验。2.2.5台盼蓝染色计算用药后细胞活力1.原理：台盼蓝是细胞活性染料，当细胞发生损伤或者死亡时，台盼蓝可穿7 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其染色，而活细胞可以阻止染料进入细胞内。2.实验步骤①取上述经药物处理过的细胞800rpm离心5min，后用PBS缓冲液2ml清洗后离心备用；②加入500ul细胞平衡液，稀释细胞形成细胞混悬液；③取100ul细胞悬液并加入等量的0.1%的台盼蓝溶液，超净台中室温下染色3min；④取一滴染过色的细胞于载玻片上，加盖玻片后显微镜10×的物镜下观察；⑤计数至少500个细胞，并计数其中的染色细胞；⑥按公式计算出细胞存活率：细胞存活率（%）=未染色细胞/观察的细胞总数×100。2.2.6PI染色法流式细胞术检测细胞周期的变化1.原理：碘化丙啶（PI）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，是溴化乙啶的类似物，它无法穿过活细胞的细胞膜，但是可以穿过破损的细胞膜，与细胞内的DNA及RNA结合，如果采用RNA抑制剂消化RNA后，可通过流式细胞术检测与DNA结合的PI荧光强度，因为细胞周期各时相中DNA含量不同，故不同的PI荧光强度可反映相对应的细胞周期时相，其中G0/G1期DNA含量为2N，G2/M期DNA含量为4N，S期的DNA含量介于两者之间。2.实验步骤①收集上述处理并培养相应时间的细胞，800rpm离心5min；②PBS缓冲液2-3ml清洗1-2次，离心弃上清；③加入300ulPBS缓冲液重悬细胞后，边震荡边加入预冷的无水乙醇700ul，4℃过夜；④次日离心去除乙醇，PBS缓冲液清洗细胞后，用200ulPBS重悬细胞，加入PI、Triton、RNA酶，其中PI终浓度为50ug/ml，Triton终浓度为0.2%，RNA酶20ug/ml，避光染色30min；⑤上机检测。2.2.7实时荧光定量PCR检测细胞周期调控基因mRNA的表达1.总RNA的提取①收集上述完成处理的细胞于15ml离心管中，800rpm离心5min，弃上清后用PBS缓冲液清洗细胞；8 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究②每组离心管细胞中加入1mlTrizol用移液枪吹打，均匀后转至1.5ml无酶EP管中，室温静置5min；③加入0.2ml氯仿剧烈震荡15s，室温静置5min后，4℃，12000g离心15min；④转移无色水相至新的无酶EP管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃，12000g离心15min，弃上清；⑤加入75%的乙醇500ul，震荡使RNA沉淀洗涤，于4℃，12000g离心10min；⑥弃上清，超净工作台内打开离心管盖，室温干燥5min；⑦向管内加入DEPC水20-30ul，使RNA充分溶解，待用或保存于-80℃冰箱备用；⑧用核酸定量分析仪，检测所提取的RNA纯度及浓度，RNA纯度要求：A260/A280=1.8-2.0，筛选出符合要求的标本行后续实验。2.RNA逆转录为cDNA合成试剂购自中国大连宝生物有限公司，置于-20℃保存待用，取出解冻后将试剂置于冰板上，反应体系为20ul，5×PrimeScriptRTMasterMix4ul，RNA1000ng，余用RNaseFreeddH2O补齐，按照试剂盒内操作步骤依次进行，第一步条件为37℃，15min，为反转录反应，第二步条件为85℃，5s，使得反转录酶失活。3.qRT-PCR反应①引物的设计和合成：从GenBank数据库中搜索人β-actin、CDK1、CHK1、CyclinB1、CDC25C基因mRNA的全序列，利用PrimerPremier6.0设计引物，由大连宝生物有限公司合成及纯化，具体引物序列见表1。表1基因名称及对应的引物序列基因名称引物序列上游：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′β-actin下游：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′上游：5′-TCCTAGTACTGCAATTCGGGAAA-3′CDK1下游：5′-CAGATCCATGGAAAGAAACTCAAAG-3′上游：5′-AGCTTTTCCCAGCCCACA-3′CHK1下游：5′-CCATTGATAGCCCAACTTCTCAC-3′上游：5′-AACGGCTGTTGGTTTCTGCTG-3′CyclinB1下游：5′-TGCCATGTTGATCTTCGCCTTA-3′上游：5′-TTGGGCAGTCCCATTACTACTGTTC-3′CDC25C下游：5′-GCGATATAGGCCACTTCTGCTCA-3′9 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究②引物的配制：将引物干粉离心后根据引物含量加入相应量的RNaseFreeddH2O水，制成终浓度为100uM的母液，将母液分装后保存于-20℃备用。③qRT-PCR反应体系的配制及反应条件：将引物和模板于室温溶解后在冰板上进行操作，将引物再次用RNaseFreeddH2O稀释制成10uM的工作液，分别加至PCR管中，加入2×SYBRPremixExTaqII，反转录所得的cDNA，并用RNaseFreedH2O调至20ul体积，进行PCR扩增，反应条件：a.95℃预变性30s；b.95℃变性，5s；60℃退火20s,总循环数为40次（见表2）。表2qRT-PCR反应体系及反应条件试剂用量PCR反应条件SYBRPremixExTaqII（2×）10ul95℃95℃上游引物0.8ul30s5s下游引物0.8ul60℃DNA模板2.0ul20sRnase-free水6.4ul×40④数据处理：各样本设三个复孔，实验结束后用PCR仪扩增的数据分析扩增曲线以及溶解曲线。本实验中扩增的基因是管家基因β-actin，目的基因CDK1、CHK1、CyclinB1、CDC25C，目的基因相对表达量的计算方法采用E-△△CT法，其中△CT=（目的基因CT值-内参基因CT值），△△CT=△CT实验组-△CT对照组。2.2.8统计学方法采用SPSS21.0软件进行统计学分析，计量资料用X±SD，两组之间的比较采用独立样本T检验，多组组间的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05认为差异有统计学意义。10 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究第三章结果3.1细胞计数法检测细胞生长根据细胞计数法的结果，绘制HL-60细胞、K562细胞的生长曲线，随着时间的延长细胞数目逐渐增多，最终达到相对稳定状态，细胞形态稳定、生长状态良好（图1）。k562120hl-60906030Numberofcells/×10^4024487296120144t/h图1HL-60及K562细胞的生长曲线3.2墓头回水提物对白血病细胞活力的影响不同浓度的墓头回水提物（2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml）作用于白血病细胞24小时及48小时后，用台盼蓝染色判断细胞存活率，结果显示用药后HL-60细胞（图2）及K562细胞（图3）存活率均随着浓度及时间呈下降趋势，以浓度为20mg/ml时作用效果最明显，说明墓头回水提物对白血病细胞的增殖有抑制作用。11 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究图2墓头回水提物对HL-60细胞生长的作用表示与对照组相比较，P＜0.05图3墓头回水提物对K562细胞生长的作用表示与对照组相比较，P＜0.053.3墓头回水提物对白血病细胞形态的影响不同浓度的墓头回水提物处理HL-60细胞以及K562细胞24小时以及48小时以后，在倒置显微镜下观察细胞形态的变化。不同浓度的墓头回水提物可影响二者细胞形态，HL-60细胞形态的变化以药物浓度为10mg/ml时最为明显，K562细胞形态的变化以药物浓度为10mg/ml以及20mg/ml时最为明显，镜下可见细胞胞体变长，但细胞形态相对完整（图4）。12 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究A1A2A3B1B2B3C1C2C3D1D2D3对照组10mg/ml20mg/ml图4墓头回水提物对白血病细胞系形态的影响。A1—A3为墓头回水提物作用24小时后HL-60细胞形态的变化；B1—B3为墓头回水提物作用48小时后HL-60细胞形态的变化；C1—C3为墓头回水提物作用24小时后K562细胞形态的变化；D1—D3为墓头回水提物作用48小时后K562细胞形态的变化。其中白色箭头指用药后形态发生变化的细胞。13 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究3.4墓头回水提物对白血病细胞周期的影响不同浓度的墓头回水提物处理HL-60细胞以及K562细胞，经过24小时和48小时后用流式细胞术检测两种细胞系细胞周期的变化。PI染色DNA含量的细胞周期分析显示，墓头回水提物引起的白血病细胞系细胞周期的改变在低浓度时（2.5mg/ml、5mg/ml）主要影响细胞周期中G0/G1期和S期的改变，G2/M期改变不明显，随着药物浓度的增加，HL-60细胞及K562细胞的G2/M期的比例显著增加。不同浓度的墓头回水提物作用于HL-60细胞24小时后，细胞周期检测结果显示G2/M期细胞比例随药物浓度的增加而增加，以浓度为10mg/ml时最为明显，达到峰值占36.61%，较对照组的G2/M期细胞比例（10.27%）明显增多（P＜0.05），表现为明显的G2/M期阻滞，随着作用时间的延长，至48小时的G2/M期阻滞作用较24小时增加（48.68%），但差异无统计学意义（P＞0.05）（如图5、6，表3）。不同浓度的墓头回作用于K562细胞24小时后，细胞周期检测结果同样显示细胞周期以G2/M期阻滞为主，以浓度为20mg/ml时达到峰值（46.46%），较对照组G2/M期细胞水平（9.42%）明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），作用至48小时的G2/M期细胞比例较24小时的细胞比例下降（46.46%），但差异无统计学意义（P＞0.05）（如图7、8，表4）。G0/G146.04%G0/G153.76%S/44.01%S/39.19%G2/M9.95%G2/M8.05%24小时48小时14 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究G0/G149.06%G0/G153.63%S/39.41%S/35.50%G2/M11.52%G2/M10.87%G0/G156.50%G0/G162.78%S/28.91%S/28.67%G2/M14.59%G2/M8.55%G0/G118.59%G0/G17.44%S41.01%S45.68%G2/M/40.40%G2/M/46.88%24小时48小时15 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究G0/G150.84%G0/G149.81%S/35.24%S/41.53%G2/M13.92%G2/M8.67%24小时48小时图5不同浓度墓头回水提物对HL-60细胞周期的影响24小时16 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究48小时图6不同浓度墓头回水提物对HL-60细胞周期的影响表示与对照组相比较，P＜0.05表3不同浓度墓头回水提物对HL-60细胞周期的影响细胞周期分布（%）浓度G0/G1SG2/M（mg/ml）24小时48小时24小时48小时24小时48小时042.38±5.1756.14±3.3747.35±4.7136.36±4.010.27±0.457.98±0.092.550.09±1.4654.48±1.2039.93±0.7335.44±0.0811.52±4.3410.13±1.18556.33±0.2561.62±1.6431.9±4.2329.89±1.7211.77±3.988.47±0.111022.14±5.027.67±0.3341.25±0.3443.65±2.8836.61±5.3648.68±2.552052.23±1.9650.72±1.2935.04±0.2841.27±0.3712.73±1.688.01±0.926表示与对照组相比较，P＜0.05，差异有统计学意义G0/G137.06%G0/G139.01%S/50.37%S/50.39%G2/M12.58%G2/M10.06%24小时48小时17 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究G0/G138.90%G0/G138.62%S/47.92%S/47.74%G2/M13.18%G2/M13.64%G0/G136.52%G0/G135.35%S/48.52%S/49.68%G2/M14.96%G2/M14.96%G0/G135.95%G0/G131.35%S/46.39%S/52.08%G2/M17.66%G2/M16.57%24小时48小时18 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究G0/G18.14%G0/G17.65%S58.25%S/40.79%G2/M/33.61%G2/M/51.57%24小时48小时图7不同浓度墓头回水提物对K562细胞周期分布的影响24小时19 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究48小时图8不同浓度墓头回水提物对K562细胞周期的影响表示与对照组相比较，P＜0.05表4不同浓度墓头回水提物对K562细胞周期的影响细胞周期分布（%）浓度G0/G1SG2/M（mg/ml）24小时48小时24小时48小时24小时48小时041.38±1.2952.56±5.4643.93±1.0638.03±8.2814.70±0.239.42±2.822.539.28±1.2737.77±2.7443.81±0.7851.55±4.5416.91±0.4910.69±1.80536.03±1.5733.35±2.2048.86±3.0157.17±1.6115.11±1.449.50±0.621034.98±2.4532.66±1.4146.12±2.0053.75±8.2518.91±0.4513.6±6.842010.79±1.9926.65±1.4034.94±3.7726.89±3.4654.22±5.6946.46±4.87表示与对照组相比较，P＜0.05，差异有统计学意义3.5墓头回水提物对K562细胞周期相关调控基因表达的影响选取慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞，采用qRT-PCR检测不同浓度的墓头回水提物作用K562细胞后细胞周期相关调控基因的表达情况。3.5.1墓头回水提物对K562细胞CDK1和CyclinB1的mRNA表达水平的影响经2.5mg/ml墓头回水提物作用24小时后K562细胞CDK1mRNA表达水平即开始升高，但从浓度为10mg/ml开始CDK1mRNA的相对表达量出现下降，至20mg/ml时达到最低值，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），当作用时间延长至48小时，CDK1mRNA表达水平从10mg/ml开始下降，20mg/ml时达到最低值，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。（如图9，表5）。20 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究经墓头回水提物作用24小时后K562细胞CyclinB1mRNA表达水平即开始升高，从浓度为10mg/ml开始CyclinB1mRNA的相对表达量出现下降，至20mg/ml时达到最低值，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。当作用时间延长至48小时，CyclinB1mRNA表达水平均出现下降，药物浓度为20mg/ml时达到最低值，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（如图10，表5）。图9不同浓度墓头回水提物作用K562细胞24、48小时后CDK1mRNA的变化表示与对照组相比较，P＜0.05图10不同浓度墓头回水提物作用K562细胞24、48小时后CyclinB1mRNA的变化表示与对照组相比较，P＜0.0521 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究表5不同浓度墓头回水提物作用K562细胞24、48小时后CDK1、CyclinB的mRNA表达浓度基因相对表达量（）（mg/ml）CDK1CyclinB24小时48小时24小时48小时2.51.464±0.1691.268±0.3131.244±0.1460.589±0.09551.487±0.2351.281±0.1941.143±0.0760.617±0.058100.975±0.1380.536±0.1970.992±0.1380.406±0.089200.642±0.1010.485±0.1260.633±0.1120.369±0.046表示与对照组相比较，P＜0.05，差异有统计学意义3.5.2墓头回水提物对K562细胞CHK1和CDC25C的mRNA表达水平的影响经2.5mg/ml墓头回水提物作用24小时后K562细胞CHK1mRNA表达水平即开始升高，至浓度达到20mg/ml时CHK1mRNA的相对表达量达到峰值，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），作用时间延长至48小时后，CHK1mRNA表达水平明显下降，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（如图11，表6）。经墓头回水提物作用24小时后K562细胞CDC25CmRNA的表达水平以浓度为20mg/ml时出现下降，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），作用时间延长至48小时以后，墓头回水提物各浓度组的CDC25CmRNA相对表达量较对照组均有所下降，以20mg/ml时最为明显，差异有统计学意义（P＜0.05）（如图12，表6）。图11不同浓度墓头回水提物作用K562细胞24、48小时后CHK1mRNA的变化表示与对照组相比较，P＜0.0522 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究图12不同浓度墓头回水提物作用K562细胞24、48小时后CDC25CmRNA的变化表示与对照组相比较，P＜0.05表6不同浓度墓头回水提物作用K562细胞24、48小时后CHK1、CDC25CmRNA表达浓度基因相对表达量（）（mg/ml）CHK1CDC25C24小时48小时24小时48小时2.52.822±0.5830.902±0.1511.087±0.1460.938±0.04453.129±0.4561.238±0.0710.935±0.0770.717±0.030104.056±0.4210.794±0.1440.931±0.0210.753±0.036204.317±1.6020.627±0.1380.339±0.0330.555±0.018表示与对照组相比较，P＜0.05，差异有统计学意义23 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究第四章讨论细胞周期指细胞从一次分裂完成时开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为细胞间期和有丝分裂期，细胞间期可主要包括G1期、S期、G2期，在DNA复制前，一些G1期细胞可进入休眠状态，即细胞静息期G0期，人体内的大部分细胞都处于不生长、不增殖的G0期，但此期仍为DNA的复制、营养物质的[22]累积提供机会。细胞从G0期或者上一个M期进入G1期，开始合成各种蛋白质、脂类、糖类、RNA，为细胞生长做基本物质准备。G1期在细胞周期中是一个重要节点，在不同细胞中，G1期持续时间不等，因其在细胞周期中占大部分时间，故也决定了细胞周期的时长。当G1期完成DNA合成的准备工作后，进入DNA合成期S期，该时相主要用于合成所有的DNA，得到两套完整的二倍体染色体。在S期末至M期之间是G2期，该时相类似于G1期，同是没有DNA合成的时期，主要用于检查DNA复制的精准程度、是否存在未修复的DNA损伤以及周围环境是否适合进行有丝分裂活动等，只有细胞分裂的所有条件都得到满足时，细胞才会进入M期，开始有丝分裂。上述过程周而复始，实现细胞增殖。真核细胞的细胞周期是一项非常复杂而又精细的调节过程，与细胞的分化、生长及死亡息息相关，从最初始对酵母菌的研究，到如今对人类细胞周期的研究发现，细胞周期的关键基因高度保守。细胞周期作为维持真核细胞生存的基础，其能否有序无误的进行成为了真核细胞存亡的关键，而细胞周期完整的维持依赖于周期蛋白（Cyclin）和周期蛋白依赖激酶（Cyclin-dependentkinases，CDKs）以及细胞周期检控点。周期蛋白和CDK形成的周期蛋白/CDK复合物有序的激活和失活是驱动细胞周期运转的引擎分子，具有蛋白激酶活性，在细胞周期的不同时期，相应的周期蛋白/CDK复合物通过磷酸化特异的蛋白质，调控相应基因的表达或者调节相应蛋白的活性，进而促进细胞周期运行。与此同时，周期蛋白/CDK复合物的活性可以被CDK抑制蛋白（CDKinhibitor，CKI）抑制。周期蛋白在细胞周期中的表达变化很大，它们随着细胞周期的进程在需要时被诱导表达，不需要时被泛素化降解。CDK是细胞周期中发挥关键作用的因子，在细胞质中合成，需转运至细胞核中发挥作用，在整个细胞周期中以活性变化为主，含量无明显变化，其活性由周期蛋白，激酶WEE1、CAK，磷酸酶CDC25对其磷酸化或去磷酸化来进行调节的，或者受到变构抑制剂P21的作用以及在细胞中的定位和运输的影响。细胞周期的调节即通过调节各个时期的周期蛋白的丰度或CDK的活性来实24 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究现。目前至少有13种CDK被确定，分子质量约33~44kD，均为丝氨酸和苏氨酸激酶，它们与周期蛋白以1:1形成复合物，当复合物中CDK的苏氨酸-161被磷酸化后转变为活性形式。目前研究明确的在细胞周期中发挥重要作用的CDK主要有CDK4、CDK6、CDK2和CDK1。CDK4和CDK6是G1期发挥重要作用的蛋白激酶，二者有71%的氨基酸序列相似，作用可相互补偿，它们与周期蛋白D结合后形成的复合物，可促进视网膜细胞瘤蛋白（Retinoblastomaprotein，RB）的磷酸化，从而促进细胞周期由G1期进入S期，复合物的活性可被INK4家族[23]抑制。研究表明，CDK4缺失的小鼠可正常存活，但其体型较小，生育能力低[24]下，并且该小鼠胚胎成纤维细胞从静止进入细胞周期时存在S期延迟。CDK6缺乏的小鼠可正常存活，这类小鼠细胞周期也可正常进行，研究发现，CDK6在造血细胞的转录中发挥着重要作用，在淋巴系统恶性肿瘤中发现存在高水平[25]CDK6的表达，说明CDK6与造血系统恶性肿瘤的发生存在密切联系。CDK2是细胞周期从G1期向S期转换中发挥重要作用的蛋白，可通过与周期蛋白A、E结合形成复合物被活化，在细胞周期由G1期向S期转化的过程中，CDK2与周期蛋白E形成的复合物发挥了重要作用，该复合物能够进一步磷酸化Rb蛋白，KIPICIPI促进细胞周期进入S期，p27或p21能够抑制这种作用。因此，CDK2活性的增加依赖于周期蛋白E基因的转录，周期蛋白D/CDK4及周期蛋白D/CDK6KIPICIPIKIPICIPI对p27或p21功能的抑制，以及泛素介导的p27和p21蛋白水解过程。CDK2具有活性亚基，WEE1可与该亚基结合，磷酸化CDK2的酪氨酸-15位点，使得CDK2失活，与此相反，CDC25家族中的CDC25A及CDC25B能够去磷酸化酪氨酸-15，活化CDK2。人类肿瘤中很少发现CDK2的突变，至于肿瘤的发生及维持是否需要CDK2目前尚不清楚。CDK1在细胞进入G2期的过程中发挥重要作用，主要与周期蛋白B结合成复合物发挥作用，其活性同样受到WEE1[26]和CDC25家族的调节。CDK1在生物体的生命活动中扮演重要角色，其表达[27]+/－与肿瘤的形成和进展有一定的相关性。研究表明，CDK1的小鼠相互交配，-/-不会产生CDK1的小鼠或者胚胎，说明CDK1影响胚泡的发育，但是肝细胞中缺乏CDK1的小鼠可以存活、表型正常，部分肝脏切除术后肝脏的再生过程亦不受CDK1的影响，该种小鼠可抑制因Ras基因激活和P53基因沉默引起的肝脏[26]肿瘤发生。周期蛋白是CDK的调节亚基，其浓度随着细胞周期的时相发生变化，在细胞周期中常见的重要周期蛋白有周期蛋白D、E、A、B。周期蛋白D是促进细胞从静息状态进入细胞周期的启动因子，包括D1、D2、D3，其中D1在细胞周期中发挥主要作用，其表达异常会引起细胞周期紊乱，细胞功能失常。人类的多种肿瘤细胞中可检测到周期蛋白D1的高表达，比如乳腺中过表达周期蛋白D125 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究[28]的转基因小鼠最终可进展为乳腺增生和乳腺癌，Hela细胞以及H2009肺癌细胞被RNA干扰减少周期蛋白D1的表达后，会增加对喜树碱和依托泊苷等化疗[29]药物的敏感性。周期蛋白E包括E1、E2，在G1晚期开始表达，于进入S期前达到高峰，可缩短G1期，减少生长因子的需要量。在一些肿瘤中FBW7基因的突变使得周期蛋白E过度表达，促进S期的进入。研究表明，周期蛋白E的过量表达与乳腺癌的雌激素受体阴性、低分化癌细胞、P53基因突变等浸润特征[30,31]以及预后不良密切相关，但可以抑制乳腺癌细胞的移动及侵袭性。周期蛋白A包括A1、A2，在G1期开始增多，于S期和G2期达峰值。周期蛋白A1在胚胎发生的较早期甚至减数分裂中表达，敲除后不影响小鼠的生长、发育，周期蛋白A2在体细胞中表达，敲除后会导致胚胎死亡。在一些肿瘤中，也发现了周期蛋白A的异常，比如乳腺癌、肝细胞癌等人类多种肿瘤中均可检测到周期蛋白A[32,33]的表达升高。周期蛋白B包括B1、B2、B3，在S期进入G2期的过程中发挥重要作用，其中周期蛋白B1/CDK1复合物可促进染色体浓缩、纺锤体装配以及核膜裂解，周期蛋白B2/CDK1可重组有丝分裂期高尔基体。周期蛋白B与肿瘤关系的研究中发现，周期蛋白B1或B2的过量表达会增加细胞对致癌物质的[34]敏感性，导致皮肤肿瘤及肺癌的发生。此外，周期蛋白B1在成人急性白血病中过度表达，表达水平高的患者有较高的治愈率、缓解率及生存率，但有较高的复发率，对急性白血病耐药患者的研究发现，耐药患者的周期蛋白B1及其mRNA[35,36]的表达水平明显低于敏感组。所有细胞的DNA均面临着各种损伤，内生性的来源比如自发性的胞嘧啶脱氨基作用、复制错误、细胞新陈代谢中自由基产生后对碱基的损害，外源性的作用比如紫外线、芳香烃、饮食毒素等，这些因素导致每天平均有累计10000-40000[37]单链损害和累计50对双链损害，为保证遗传的稳定性和正常的子代，人体内存在一个复杂并且精细的蛋白网络结构，即DNA损伤的响应系统（DNAdamageresponse，DDR），它包括DNA损伤监测系统及信号传导系统，当发生DNA损伤时即激活下游信号引起细胞周期阻滞为细胞提供修复时间或者进入细胞死亡[38]途径，该系统主要由细胞周期检控点、DNA修复系统及细胞凋亡机制构成。细胞周期检控点是指当DNA受到损伤时，细胞周期中的一些调控点经减慢或暂时中止细胞周期的进程使DNA有足够时间用于修复，保证基因组合理复制并阻止肿瘤的发生，它普遍发生在真核生物中，是进化中保守的信号通路，其作用除了为DNA修复提供时间外，还直接或者间接地参与或促进DNA的修复。细胞周期监测点中重要的检控点有：G1/S检控点，S期内检控点，G2/M检控点。细胞周期检控点的介导通过蛋白激酶ATM（ataxia-telangiectasiamutated）和ATR（ataxia-telangiectasiaandRad3-relatedprotein）及其下游的细胞周期检测点激酶126 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究（checkpointkinase1，CHK1）和细胞周期检测点激酶2（CHK2）密切配合来完成。研究表明，ATM主要在电离辐射引起的DNA双链断裂时被激活，ATR在几乎所有的DNA损伤中均能被激活，包括紫外线造成的DNA单链断裂和化学物质等引起的碱基的破坏和复制叉的停止，以及电离辐射引起的DNA双链断裂，ATM和ATR常常同时作用。在哺乳动物细胞中，CHK1主要是ATR的底物，CHK2主要是ATM的底物，CDC25、P53是其共同的作用底物。当检控点激活，[39]CDC25和p53被磷酸化，阻滞细胞周期。在上述检控点中，较为重要的是G1/S期检控点和G2/M期检控点，正常细胞中，G1/S检控点是保证细胞周期顺利进行的主要检查点，该检控点在DNA受到损伤时，激活ATM-CHK2-CDC25A或者ATR-CHK1-CDC25A通路以及p53-p21通路作用。这些通路激活后，周期蛋白D/CDK4及周期蛋白E/CDK2的活性受到抑制，使得Rb蛋白的磷酸化水平下降，导致其不能从转录因子E2F上释放，进而抑制E2F对多种基因的转录，抑制DNA的复制，最终使细胞阻滞在G1/S期。肿瘤细胞常常存在G1检控点的缺陷，常见的有p53或pRb抑癌基因的突变，或[40]者周期蛋白、CDK、CKI的失衡，所有肿瘤细胞通常依赖于S期及G2期检控点避免DNA的损伤及损伤后死亡，因此S期及G2期检控点是化疗及放疗抑制肿瘤细胞的敏感靶点。S期内检控点用于检测DNA在复制过程中是否受损，凋[41]亡抑制基因Survivin的沉默可诱导肿瘤细胞阻滞于S期。G2/M检控点的作用图13G1/S期及G2/M期检控点调解网络27 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究是，在DNA受到损伤时阻滞细胞进入有丝分裂，这一时期的进行受多重因素的调控，其中关键调控点是周期蛋白B1与CDK1形成的复合物，即成熟促进因子（MPF）。在有丝分裂间期，WEE1激酶磷酸化CDK1的酪氨酸-15残基，MIK1激酶磷酸化CDK1的苏氨酸-14残基，使得CDK1的活性受到抑制，MPF处于失活状态。同时磷酸酪氨酸磷酸酶CDC25A、B、C，主要是CDC25C可取消上述抑制性磷酸化激活CDK1，触发有丝分裂的开始，而MPF的活化可进一步增强CDC25C的活性，形成正反馈回路。在G2/M的调控作用中，P53和p21也起到[38,42]了重要的作用（见图13）。研究表明，细胞周期调控异常与肿瘤的发生密切相关，细胞周期检控点失调导致的基因组的不稳定性会大概率的导致具有致癌可能性的突变的发生，在肿瘤发生中具有重要作用，此外，许多细胞周期检控点基因同时也为抑癌基因，当其表达下降或发生丧失功能的突变时，会导致癌症的发生。因此，调节细胞周期调控机制成为治疗肿瘤的一个可行的新途径。白血病是一类造血干祖细胞的恶性克隆性疾病，白血病细胞在增殖、分化的过程中停滞在细胞发育过程的不同阶段，继而增生累积于骨髓和其他造血组织中，抑制正常造血并浸润其他器官和组织。白血病是一类严重影响患者生命的疾病，在恶性肿瘤所致的死亡率中，白血病位居第6~7位，对35岁以下成人及儿童而言，白血病的死亡率位居第一。对于这种凶险的疾病，治疗的办法包括化疗、造血干细胞移植、免疫治疗、靶向治疗等方法，鉴于现有治疗方法存在费用昂贵、毒副作用明显、易发生多药耐药等问题，白血病的治疗中往往需要考虑患者的意愿以及经济能力，在白血病治疗的探索中，一些中草药因具有抗肿瘤的作用以及廉价、低毒的特点，逐渐地进入广大医务工作者的视野。中医治疗白血病的历史由来已久，但真正得到医学工作者广泛认同的是从砷剂在白血病中取得巨大疗效开始的，现代中医学者认为肿瘤的发生是因为“热毒”、“淤血”、“淤毒”等机制，所以中药在治疗肿瘤方面的应用主要分为针对恶性肿瘤患者热证的“清热解毒类”如苦参碱、白花蛇舌草、青黛等；减少血小板聚集和改善微循环的“活血化瘀类”如赤芍、丹参、桃仁、红花等；增强或调节患者机体免疫功能、改善血象并增强骨髓功能的“扶正固表类”药物如山药、米仁等；针对甲状腺癌、肺癌等“化瘀散结类”中药，如半夏、瓜蒌、穿山甲等；针对癌性胸、腹腔积液患者的“利水渗湿类”药物，如五倍子、猪苓等。中药的抗肿瘤、调节免疫功能、减轻化疗副作用等功能使其受到一定的重视，近50年来，从各种中草药中分离的抗肿瘤化学成分可达400余种，但是目前临床中应用的提取成分却仅有十几种，主要有长春碱类、三尖杉碱类、喜树碱类、砷剂、苦参碱等。传统中药仍有待开发。墓头回是传统的中草药，药理作用广泛，具有抗肿瘤作用，研究表明，墓头28 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究回以及其主要成分齐墩果酸能够抑制肿瘤细胞增殖，可阻滞不同的肿瘤细胞的细胞周期于不同的时相。研究发现墓头回提取物环烯醚萜酯可以抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖，不同浓度的环烯醚萜酯作用于SGC-7901细胞24小时后，可发现SGC-7901细胞周期阻滞于G2/M期，进一步研究发现，环烯醚萜酯可引起[43]SGC-7901细胞剂量依赖性的周期蛋白B1水平的升高。齐墩果酸可以使人肝癌细胞株（HepG2）细胞周期阻滞于G2/M期，研究发现齐墩果酸通过下调HepG2细胞的CDK1mRNA和CyclinBmRNA表达水平，同时升高P21的表达水平，从而抑制周期蛋白B1/CDK1的活性，此外，ERK-p53信号通路在齐墩果酸引起[44]HepG2细胞周期阻滞的作用中也扮有重要角色。齐墩果酸可以使慢性粒细胞白血病细胞细胞株K562和急性T细胞白血病细胞株Jurket的细胞周期阻滞在G0/G1期，深入研究发现K562细胞中CDK4、CDK6和周期蛋白D1、周期蛋白E的表达下降，同时周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27表达水平升高，使得Rb蛋[45]白磷酸化水平下降，细胞周期阻滞。40ug/ml~60ug/ml的齐墩果酸可以抑制胰腺癌细胞Panc-28的增殖，使其细胞周期阻滞在S期和G2期，且呈浓度依赖性，但是与其他研究不同的是，该项研究发现齐墩果酸引起的胰腺癌Panc-28细胞的[46]周期阻滞中周期相关蛋白P21表达水平并未相应升高，具体机制尚不明确。此外，齐墩果酸的衍生物N-[(3β)-3-(acetyloxy)-28-oxoolean-12-en-28-yl]-glycinemethylester(AOA-GMe)可导致K562细胞及小鼠B16黑色素瘤细胞的细胞周期阻6滞于G0/G1期，用5~50×10M的AOA-GMe作用24小时以后，G0/G1期比例可从65.28%增加到78.81%，呈剂量依赖性，分子机制的研究显示周期蛋白D的表达水平、CDK4的表达水平及Rb蛋白的磷酸化水平均降低，而周期蛋白依赖[47]性激酶抑制剂p15的表达水平升高。本实验中观察到，2.5mg/ml~20mg/ml的墓头回水提物作用于HL-60细胞以及K562细胞24小时以后，G0/G1期和S期的比例逐渐减少，G2/M期的比例逐渐增加，HL-60细胞中药物浓度达到10mg/ml时，G2/M期的阻滞效应达到高峰，在K562细胞中当药物浓度达到20mg/ml时，G2/M期的阻滞效应达到了高峰，同时显微镜下观察细胞形态变化，发现细胞形态明显改变。当进一步延长作用时间至48小时，发现引起G2/M期阻滞效应最明显的浓度和24小时的浓度一致，但G2/M期的阻滞率与24小时的阻滞率差异无统计学意义，考虑墓头回水提物对HL-60细胞以及K562细胞周期阻滞的效应是一个短时效应。HL-60细胞及K562细胞的细胞周期受到墓头回水提物作用阻滞在G2/M期后，无法进一步进入有丝分裂期，使得上述细胞的增殖活性受到抑制，这可能是墓头回水提物抗白血病的机制之一。G2/M检控点是细胞周期中关键的检控点之一，它决定着细胞是否能够进入到有丝分裂期，当在该期发生DNA损伤时，会导致细胞周期停滞，即发生G2/M29 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究期阻滞。G2/M期阻滞实质上是DNA的修复时期，给予细胞足够的时间通过DNA修复系统修复损伤的DNA，保证DNA复制的准确性，如果受损的细胞未能修复[48]损伤的DNA，则细胞进入凋亡状态。CyclinB1/CDK1复合物是G2/M期的关键因子，其中CDK1是细胞周期中必不可少的细胞周期蛋白激酶，编码基因是CDC2基因，该基因定位于10q21，编码的CDK1激酶分子质量为34KD。CDK1的活性通过G2期苏氨酸-161的磷酸化激活，其失活通过苏氨酸-14和酪氨酸-15的去磷酸化完成。周期蛋白B1是调控细胞周期的一种重要蛋白，是CDK1的调节亚基，对CDK1激酶的活性必不可少，二者复合形成MPF，MPF是细胞周期由G2期进入M期的关键蛋白。当细胞间期时相依次发展，周期蛋白B1水平逐渐累积并与非活性的CDK1结合，接着CDC25C脱去WEE1的磷酸化作用，激活周期蛋白B1/CDK1复合物，该复合物进一步转移至细胞核内，促进核膜破裂和纺锤体形成等有丝分裂事件，随即周期蛋白B1被泛素降解。当发生G2/M期阻滞时，CDC25C的表达水平下调，同时WEE1的表达水平上调，使得周期蛋白B1和CDK1的表达水平下调，失活MPF。目前有很多研究表明，在抗肿瘤药物引起肿瘤细胞增殖受抑出现G2/M期阻滞时，常常伴有周期蛋白B1和CDK1同等水平的下调。但是，也有一些研究发现，当发生G2/M期阻滞时伴有周期蛋白B1和CDK1表达水平的升高，进一步研究原因发现抗肿瘤药物使得周期蛋白B1和CDK1的表达水平上升，从而上调MPF的表达水平，促进MPF对微管结合蛋白MAP的磷酸化作用，多种MAP可在多个时机、多个位置调节有丝分裂过程中纺锤体动态结构的主要成分微管的动态变化，当MPF磷酸化活动增加时，MAP促进微管以稳定形式存在的作用被破坏，使得微管解聚呈游离的微管蛋白形式，不能形成稳定的纺锤体结构，有丝分裂受到抑制。另有研究显示，抗肿瘤药物使得肿瘤细胞周期阻滞于G2/M期的过程中出现CyclinB1mRNA的表达量升高，可能与泛素依赖性蛋白水解机制有关，在细胞有丝分裂期，活化的CDK1[49]可诱发泛素化系统的激活，CyclinB1被泛素化降解，促进有丝分裂的结束。当CDK1的活性受到抑制时，CyclinB1的降解过程受到抑制，从而使CyclinB1的表达升高。还有一些研究认为，某些抗肿瘤药物的使用，通过阻止CyclinB1的核转位，诱导CyclinB1定位于细胞质，使得CyclinB1的表达升高，细胞周阻滞于G2/M期。本实验中观察到，不同浓度的墓头回水提物作用于K562细胞，当浓度为10mg/ml和20mg/ml时，可下调CDK1mRNA和CyclinB1mRNA的表达，与流式细胞术结果一致，说明墓头回水提物可通过下调CDK1和CyclinB1的表达而使K562细胞阻滞于G2/M期。在细胞周期系统中，离DNA损伤信号最近的激酶是ATM和ATR，ATM和ATR是目前所知的最上游的分子，其活性受到严格控制，ATM并非细胞生长发30 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究育中必须的激酶，缺失ATM的患者仍然能够存活，正常情况下，ATM以二聚体形式存在，当DNA或者染色体受到损伤时，其1981位点丝氨酸被磷酸化，使其解聚为有活性的单体进而发挥作用。而ATR是细胞生长、发育所必需的，缺失后动物会死亡。正常细胞中，ATR有一定的表达量，在S期细胞中出现冈崎片段、单链DNA等固有的、暂时的DNA损伤时发挥监控作用，在DNA受到损伤的情况下，ATR的活性会进一步增加。在G2/M期，当细胞受到遗传毒性因子作用发生DNA损伤时，ATM/ATR被激活，并分别活化CHK2和CHK1，CHK2和CHK1磷酸化CDC25A和CDC25C使其失活，失活后的CDC25A和CDC25C无法进一步去磷酸化CDK1，使MPF活化受抑，细胞周期阻滞于G2/M期。此外，活化的CHK2和CHK1可促进WEE1磷酸化，活化的WEE1磷酸化CDK1，使CDK1处于失活状态，加固G2/M期阻滞。在本实验中，K562细胞经过不同浓度的墓头回水提物作用24小时后，从2.5mg/ml开始即出现CHK1mRNA表达水平的升高，至浓度为20mg/ml时，CHK1的表达水平达到最高水平，与流式细胞术结果相一致。当作用时间延长至48小时，高浓度下CHK1mRNA表达水平较对照组下降，考虑与作用时间较长，CHK1作用逐渐下降有关。进一步用qRT-PCR技术检测CDC25CmRNA的表达水平，结果显示，在低浓度时CDC25CmRNA的表达水平与对照组相比无明显变化，当药物浓度增加至20mg/ml时，CDC25CmRNA的表达水平下降，与流式细胞术结果相一致，说明墓头回水提物对K562细胞周期的阻滞作用机制之一可能是DNA的损伤引起ATR活化，进一步活化CHK1，抑制CDC25C的活性，使周期蛋白B1/CDK1复合物处于失活状态，从而使细胞周期阻滞于G2/M期。总之，本实验探讨了墓头回水提物对白血病细胞系HL-60和K562的细胞周期的影响，并进一步探讨相关分子机制，明确了墓头回水提物可通过激活ATR，活化CHK1，从而下调CDC25C的水平，使得CDK1的去磷酸化受到抑制，同时下调周期蛋白B1的表达水平，导致白血病细胞K562的细胞周期阻滞于G2/M期。鉴于越来越多的以细胞周期相关分子为靶点的药物处于研究中，墓头回做为毒副作用较小的中草药之一，有待于进一步深入研究。31 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究结论1.墓头回水提物可诱导HL-60细胞和K562细胞发生G2/M期阻滞。2.墓头回水提物引起K562细胞G2/M期阻滞可能与上调CHK1mRNA水平，下调CDK1、CyclinB1、CDC25C的mRNA水平有关。32 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究参考文献[1]R.L.Siegel,K.D.Miller,A.Jemal.CancerStatistics,2016.Ca-aCancerJournalforClinicians[J].Jan-Feb.2016.66.7-30.[2]J.S.Chang,R.Santhanam,R.Trotta,etal.HighlevelsoftheBCR/ABLoncoproteinarerequiredfortheMAPK-hnRNP-E2dependentsuppressionofC/EBPalpha-drivenmyeloiddifferentiation.Blood[J].Aug01.2007.110.994-1003.[3]J.F.Apperley.Chronicmyeloidleukaemia.Lancet[J].Apr11.2015.385.1447-1459.[4]L.Luciano.Progressiveperipheralarterialocclusivediseaseandothervasculareventsduringnilotinibtherapyinchronicmyeloidleukemia:asingleinstitutionstudy.Europeanjournalofhaematology[J].2013.6.[5]M.Baccarani,M.W.Deininger,G.Rosti,etal.EuropeanLeukemiaNetrecommendationsforthemanagementofchronicmyeloidleukemia:2013.Blood[J].Aug08.2013.122.872-84.[6]X.Lu,D.Li,N.K.Dalley,etal.StructureelucidationofcompoundsextractedfromtheChinesemedicinalplantPatriniaheterophylla.NatProdRes[J].Jul10.2007.21.677-85.[7]齐治，田珍，秦玉香，等.糙叶败酱挥发油镇静作用的研究.天然产物研究与开发[J].1989.82-84.[8]马越美，齐治，崔景荣，等.异叶败酱挥发油镇静作用的研究.中西医结合杂志[J].1987.671-673-646.[9]白润江，任娅，马端端.十种中药的抑菌作用.兰州医学院学报[J].1992.174-176+171.[10]蒋秋燕，方刚，苏莉鸣，等.墓头回提取液对小鼠移植瘤U14瘤体内微血管密度VEGF和bFGF表达的影响.中国临床新医学[J].2009.4-7.[11]蒋秋燕，唐乾利，方刚，等.墓头回提取液对小鼠宫颈癌U14细胞株抑制增殖的实验研究.中国妇幼保健[J].2009.2130-2132.[12]W.Z.Lu,G.X.Geng,Q.W.Li,etal.Anti-tumoractivityofpolysaccharidesisolatedfromPatriniascabraBungeonU14cervicalcarcinomabearingmice.AmJChinMed[J].2009.37.933-44.[13]孙万里，姚小健，卯新民，等.MTT检测墓头回对白血病细胞毒作用的实验研究.甘肃中医学院学报[J].1990.34-36.[14]万增智，杨文华，史哲新，等.墓头回对HL-60细胞诱导分化作用的实验研究.中国中医药科技[J].1999.415.[15]程卫东，李立.墓头回提取物诱导K562细胞凋亡的实验研究.北京中医药大学学报[J].2007.51-53+57.[16]张鹏霞，李鸿梅，陈东，等.齐墩果酸诱导人白血病HL-60细胞凋亡及细胞周期阻滞.中国病理生理杂志[J].2008.1909-1911.[17]马海珍，赵丽，刘蓓，等.墓头回诱导脐血基质细胞生长促粒-单系和红系造血祖细胞集落形成的研究.中国实验诊断学[J].2008.602-606.[18]马海珍，刘蓓，赵丽，等.墓头回治疗特发性血小板减少性紫癜的疗效与机制.兰州大学学报(医学版)[J].2008.72-74.[19]P.K.Jackson.Thehuntforcyclin.Cell[J].Jul25.2008.134.199-202.[20]T.Chen,P.A.Stephens,F.K.Middleton,etal.TargetingtheSandG2checkpointtotreat33 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墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究英文缩写词与中英文对照英文缩写英文全称中文全称AMLAcuteMyelocyticLeukemia急性髓细胞白血病ATMAaxia-telangiectasiaMutated毛细血管扩张性共济失调突变ATRAaxia-telangiectasiaandRad3-毛细血管扩张性共济失调症RelatedProteinRad3相关蛋白CDC25CellDivisionCycle25细胞分裂周期蛋白25CDKsCyclin-dependentKinases周期蛋白依赖性激酶cDNAcomplementaryDNA互补脱氧核糖核酸CHKCheckpointKinase细胞周期检测点激酶CKICDKInhibitor周期蛋白依赖性激酶抑制因子CMLChronicMyelocyticLeukemia慢性粒细胞白血病细胞DEPCDiethylpyrocarbonate焦磷酸二乙酯FCMFlowCytometry流式细胞术HL-60AcuteMyeloidleukemiacellline急性髓细胞性白血病细胞株K562ChronicMyeloidleukemiacellline慢性粒细胞性白血病细胞株MPFMaturePromotingFactor成熟促进因子PBSPhosphateBufferSaline磷酸盐缓冲液qRT-PCRQuantitativeReal-timePCR实时荧光定量PCR36 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究综述细胞周期检控点与肿瘤随着生命科学的研究进展，肿瘤的分子病理研究逐渐取得了实质性的进展，目前认为突变后的原癌基因及抑癌基因的累积，DNA损伤的响应系统（DNAdamageresponse，DDR）的异常参与肿瘤的发生过程，它们均是恶性肿瘤的重要分子标志。机体的新陈代谢反应以氧化反应为主，由此生成的氧自由基（reactiveoxygenspecies，ROS）成为常见的内源性DNA损伤源，此外，还有许多常见的外源性损伤源，包括紫外线、电离辐射、烷化剂及其他有机或无机的化合物。[1]ROS可引起DNA点突变、单链或双链断裂甚至染色体的缺失、易位和融合。DDR系统由细胞周期检控点、DNA修复系统和细胞凋亡机制共同构成，可以调控细胞周期阻滞、活化DNA修复系统、诱导细胞凋亡、调控端粒长度、活化关键转录因子，保证遗传信息的正确传递以避免肿瘤的发生。一、细胞周期检控点构成和作用哺乳动物的细胞周期分为G0、G1、S、G2期及M期，细胞周期过程的顺利进行依赖于周期蛋白（cyclin）-周期蛋白依赖性激酶（cyclindependentkinease，CDK）复合物。细胞周期的G1期由周期蛋白D/CDK4、CDK6复合物激活，随后在周期蛋白A/CDK2和周期蛋白E/CDK2复合物的调控下进入S期，接下来周期蛋白B/CDK1复合物调控细胞周期进入有丝分裂。上述过程周而复始，促进细胞的增殖。细胞周期中有两个最关键的时期是DNA合成期和有丝分裂期，前者使得遗传物质复制，后者可以将倍增后的遗传物质平均分配给两个子细胞，为保证整个细胞周期顺利有序的推进完成，细胞周期中有一套调控进程的机制，称为细胞周期检控点，其中主要的检控点包括：G1/S检控点、G2/M检控点、S期内检控点及有丝分裂检控点。当DNA受到损伤时，上述检控点则受到阻滞而延迟细胞周期进程。除此之外，在这些检控点中发挥作用的基因是生物体生存的关键基因，实验证实，如果这些基因缺失则会引起小鼠胚胎死亡，证明这些检控点基因不仅调控DNA的复制过程，还调控着细胞的生存。对细胞而言，DNA的损伤是导致肿瘤发生的重要及起始因素，流行病学研37 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究究证实DNA损伤和肿瘤发生的关系，因此，DNA的损伤以及进一步引起的细胞周期检控点的反应是肿瘤形成的分子病理机制。细胞周期检控点是一种调控通路，包含起始信号、感受因子、中介因子、信号转导因子和效应器，当DNA受损时，感受因子ATM和ATR接受信号，传递信号给中介因子和信号转导因子CHK1和CHK2，其中CHK1主要是ATR的底物，CHK2主要是ATM的底物，[2]二者进一步抑制效应器激酶或磷酸酶，比如p53和CDC25，以及BRCA1，进而发挥转导调控、DNA修复、细胞周期调控等作用。DNA损伤后各主要细胞周期检控点的作用过程如下：1）G1/S检控点通过CHK1/CHK2-CDC25A-CDK2通路，细胞周期从G1期向S期转换的过程中，CDK2/CyclinE复合物起着重要作用，该复合物可通过磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastomaprotein，Rb），活化转录因子E2F，使细胞周期通过“限制点”（R点），促进细胞周期的G1-S转换，完成细胞周期进程。CDC25A可以去磷酸化激活CDK2/CyclinE复合物，当DNA发生损伤时，CHK1和CHK2磷酸化CDC25A使其失活，失活的CDC25A无法活化CDK2/CyclinE，导致细胞周期阻滞于G1/S期。2）G2/M检控点通过CHK1/CHK2-CDC25C-CDK1通路，当DNA发生损伤时，如DNA双链断裂后，断裂的双链DNA被复制蛋白A包裹，进一步通过与ATR结合以促进ATR结合和活化功能的ATRIP蛋白招募ATR，ATR进一步激活DNA拓扑酶II结合蛋白1（TopBP1）和Claspin蛋白，通过诱导CHK1的丝氨酸317和丝氨酸345位点的磷酸化活化CHK1，丝氨酸345是CHK1激酶的活化和功能的关键位点，丝氨酸317起辅助作用，同时ATR磷酸化其他相关蛋白促进已停止的DNA复制叉和DNA修复的稳定，活化的CHK1进而磷酸化CDC25C使其失活，并上调WEE1的表达水平，CDC25C可以活化CDK1促进细胞周期从S期进入M期，被CHK1或CHK2磷酸化后，则被泛素化而水解，或者被阻止进入细胞核，或者被阻止与CDK/Cyclin相互作用而失去作用。WEE1可磷酸化CDK1的苏氨酸14和酪氨酸15位点，抑制CDK1的活性。CHK1介导的CDC25C的失活及WEE1的活化，导致细胞周期阻滞于G2/M。此外，CHK1可作用于Rad51、FANCD2和FANCE调节同源重组修复并稳定已停止的复制叉，[3]活化有丝分裂纺锤体检控点并抑制Caspase-3介导的凋亡。3）p53在WAFICHK1/CHK2-p53-p21-CDK中的作用，P53是G1/S检控点中的关键蛋白，DNA发生损伤后，p53可被ATM、ATR、DNA-PK、CHK1/CHK2磷酸化激活，活化WAFIWAFI的p53可以上调包括DDR基因在内的靶向基因，比如Gadd45和p21，p21的累积可抑制CDK2/CyclinE复合物的活性，阻止Rb蛋白的磷酸化，从而抑制WAFI转录因子E2F的活性，使细胞周期阻滞于G1期，此外，p53诱导的p21也可以抑制CDK1/CyclinB1复合物的活性使得细胞周期阻滞于G2期。38 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究二、MAPK’S对细胞周期检控点的调控除了上述描述的CHK1和CHK2对细胞周期的影响外，丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedproteinkinases，MAPK）家族在DNA损伤后的细胞周期调控中也发挥了重要作用。MAPK是一组调节细胞生长、发育、分化、凋亡等细胞生理过程的蛋白激酶，属于丝氨酸-苏氨酸激酶家族，主要用于介导细胞对外界的反应，各种细胞外刺激，如生长因子、细胞因子、环境应急和炎症刺激信号均可使其激活。MAPK信号通路包括3个关键的激酶：细胞外刺激激活MAPK激酶激酶（MAPkinasekinase，MKKK），然后MKKK激活MAPK激酶（MAPkinase，MKK），MKK通过对苏氨酸和酪氨酸双位点磷酸化激活MAPK。根据MAPKT-X-Y活性基团中X的不同及上游MEK/MEKK的差异，哺乳动物MAPK家族可分为三个亚型：细胞外信号调节激酶，ERK亚组；p38丝裂原活化蛋白激酶（p38mitogenactivatedproteinkinase，p38）；c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminalkinases，JNK）。MAPK家族成员在细胞周期检控点中的作用有：1）ERKMAPK在细胞周期检控点中的作用，ERK在G1到S期及整个S期的进程中发挥作用，活化的ERKWAFI介导p21表达的维持，引起G1期阻滞，着丝粒的ERK在纺锤体组装检控点中发挥作用，此外，ERK也可以通过磷酸化CDC25C使细胞周期阻滞于G2/M期。2）p38MAPK在细胞周期检控点中的作用，P38可在DNA受损后调控G1/SWAFI和G2/M检控点，活化的p38可诱导p53和p21的磷酸化，转录因子抑制剂HMG盒蛋白1的磷酸化、CyclinD1的磷酸化以及CDC25A的磷酸化，并上调[4]p16INK4a和p19ARF基因的表达使细胞周期阻滞于G1期。在G2/M检控点，WAFIp38MAPK的激活主要通过ATM和ATR，激活的p38通过活化p53-p21以及抑制CDC25B的活性使细胞周期阻滞于G2/M检控点，此外，p38MAPK可间接磷酸化CDC25的异构体，而p38MAPK活化的MAPK相关蛋白2（MAPKAP2）也可磷酸化CDC25的异构体。从这点看，p38MAPK通路失活CDC25磷酸酶的作用类似于ATR/ATM途径。3）JNK在细胞周期检控点中的作用，JNK在细胞周期中发挥作用仅限于在成熟组织及细胞因子、细胞应激等环境压力的情况下。其与G1期到S期转换、S期的进程及有丝分裂等过程的基本调控有关。JNK在DNA损伤后引起的G1/S期调控和G2/M期调控中也发挥一定作用，JNK可通过活化p53，诱导G1/S阻滞，在G2/M期，JNK可通过磷酸化CDC25C使其失活WAFI及诱导p21的表达使细胞周期阻滞于G2/M期。39 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究三、细胞周期检控点与癌症的发生癌症的发生是基因突变和非基因层次的突变逐渐积累和选择的过程，为防止致癌性的基因突变，细胞产生了一套防御机制，包括DNA修复细胞，及时修复受损的DNA；细胞周期检控点，为DNA的修复提供机会；细胞凋亡机制，在DNA修复失败后发生凋亡，以免不良影响扩大。因此，当细胞周期检控点失调后，会增加基因组不稳定性，大大提高具有致癌可能的突变的发生率。除此之外，许多细胞周期检控点基因是抑癌基因，其表达下降或者发生丧失功能的突变时，会导致癌症的发生。人体ATM的突变在人类肿瘤的发生中占有一定作用，ATM的突变基因被认为是乳腺癌易感性等位基因，一些肿瘤中可发现ATM突变率的增加，尤其在淋巴系统中。有研究表明，乳腺癌患者中可发现高达96%的ATM基因和蛋白的改变，ATM基因的改变率在雌/孕激素受体阴性的患者中更高，且与疾病的进展和[5]患者的预后明显相关。慢性淋巴细胞白血病（chroniclymphocyticleukemia，CLL）患者常常存在11号染色体长臂的缺失，进而引起ATM等位基因的缺失，一项针对92例复发难治CLL患者的研究发现，有30例患者（26.3%）存在ATM[6]突变，且影响着患者的完全缓解率。在102例前列腺癌患者中发现有11（10.8%）名患者存在相关基因的突变，其中包括ATM，说明ATM突变与前列腺癌的发生[7][8,9]有一定的相关性。此外，ATM的突变在结肠癌以及胰腺癌中也有发现。ATR突变后则主要表现为Seckel综合征，并未增加恶性肿瘤的发生率。CHK1是DDR系统中略远端的传导因子，其活性形式为磷酸化的CHK1，即pCHK1，CHK1在真核细胞中作用关键，已经证实CHK1的缺乏会导致早期胚胎死亡，故人类肿瘤中少见CHK1的纯合子突变。目前为止，仅在结肠癌、胃癌和子宫内膜癌中发现存在CHK1的突变。除此之外，在乳腺癌患者中可检测到pCHK1的表达，包括在细胞核的表达以及在细胞质的表达，进一步研究显示，存在细胞核表达的肿瘤细胞恶性程度低、细胞分裂活动弱、表达激素受体且Ki-67和PI3K的表达少，与之相反，胞浆中表达pCHK1的肿瘤细胞恶性程度高，故[10]pCHK1可作为乳腺癌预后因子。不同于CHK1，CHK2缺陷的小鼠能够存活，作为ATM的下游分子以及参与细胞增殖及凋亡的重要分子，CHK2基因的突变使得细胞周期检控系统功能异常，受损的DNA累积导致癌症发生。人类的CHK2由CHEK2基因编码，CHEK21100delC是欧洲乳腺癌患者中最普遍的基因突变，最早在李法美尼症综合征患者中发现，目前是乳腺癌的易感基因，同时会增加除[11,12]乳腺癌以外的其他癌症的发生率。CHEK2基因在高级别浆液性卵巢癌中的[13]表达显著高于输卵管组织，在上皮性卵巢癌细胞中的表达也明显增高，其突变40 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究是高级别浆液性卵巢癌的重要危险因素，该类患者预后不良，与低级别类型的患[14]者相比，5年总生存率明显下降（5%vs37%）。CHEK2基因的突变在前列腺癌中也有发现，研究表明，CHEK2I157T突变与前列腺癌有关，存在该基因突变较无突变者相比，前列腺癌的检出率为10.2%vs4.0%，增加2.5倍的检出风险，在携带CHEK2突变基因且存在家族史的患者前列腺癌检出率更高（12.7%），因[15]此，CHEK2突变的检测可作为诊断前列腺癌的一个方法。CHEK2基因的突变[16]可增加结直肠癌的发生率，一项关于CHK1、CHK2及其磷酸化活性状态在结直肠癌和结肠黏膜中的表达的研究中发现，在50%的结直肠癌患者中可检测到CHK2及其磷酸化CHK2水平的下调，进一步定量分析显示，磷酸化的CHK2在结直肠癌的早期阶段表达水平下调，但是肿瘤的淋巴结浸润与磷酸化的CHK2[17]有关，由此可见，CHK2的失活可能是结直肠癌的一个病理机制。在弥漫性大[18]B细胞淋巴瘤中也可以检测到CHEK2基因的突变。[19]目前研究发现BRCA1或BRCA2的突变可增加乳腺癌和卵巢的患病风险，且与前列腺癌的预后明显相关，研究显示携带BRCA基因突变的前列腺癌患者与无携带患者其3年、5年和10年的无转移率分别是（90%、72%、50%vs97%、[20]WAFI94%、84%），多因素分析显示BRCA突变是前列腺癌的独立预后因素。p21WAFI在胞浆中的定位可促进细胞的生长，但肿瘤中并未发现p21的失活突变，而p53的突变却可以在50%的人类肿瘤中发现。MAPK信号通路对肿瘤细胞的增殖、生存、转移及浸润等各方面的行为均有调控作用，ERK通路在约1/3的人类肿瘤中表达水平升高，且与肿瘤的增殖等WAFI多个方面有关，ERK可通过活化p21和p27引起细胞周期阻滞，肿瘤细胞则通过Rho信号通路或者活化Akt来抑制ERK介导的细胞周期阻滞的作用。MAPK信号通路是iKras小鼠和KC小鼠胰腺癌的触发和维持因素，应用MEK1和MEK2[21]的抑制剂后可抑制胰腺上皮内瘤变。给予BRAF突变的黑色素瘤患者ERK激[22]酶及MEK2激酶的抑制剂，会明显改善患者的无进展生存率和药物反应率。ERK与卵巢癌也存在相关性，大多数低级别浆液性卵巢癌患者中均存在诱导[23]ERK活化的突变。p38MAPK是人类肺癌的关键成分，肺癌细胞的增殖依赖于p38MAPK，p38MAPK在基质成纤维细胞的活性可促进p38MAPK在肿瘤局部的[24]活化，进而促进KRAS驱动的肺癌的发生。另研究显示，在前列腺癌组织中[25]p38MAPK的表达水平明显高于正常组织，可作为前列腺癌的一个潜在靶点。JNK活化后与RAS诱导的肿瘤发生有关，但是有研究认为，尽管在体外实验中JNK与转化有关，但是在体内，JNK与肿瘤的发生无关，而且JNK的缺失会使体内肿瘤结节数目增多，并促进其生长，因此，体内JNK的功能是抑制肿瘤，这也与人类肿瘤中发现JNK存在无功能性突变的结果相一致。41 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究化疗和放疗是抗肿瘤最常见的方案，其主要作用是损伤了细胞的DNA，而DNA损伤后DDR系统的快速激活阻碍了药物的毒性作用，与此同时，肿瘤细胞的DNA修复系统在肿瘤的形成过程中逐渐缺陷，为保证细胞生存，肿瘤细胞大大增加了对ATR系统的依赖性，因此，针对细胞周期检控点的靶向药物逐渐成为抗肿瘤治疗中改善化疗和放疗效果的新方案。CHK1在DDR系统中起着关键作用，因此学术界将CHK1作为新型药物靶点来治疗肿瘤。在过去的几年里，许[26,多CHK1靶向抑制剂被开发，同时其他检控点激酶靶向药物也在进一步开发中27]。此外，因为ERK通路在肿瘤发生过程中的重要性，针对ERK的抗肿瘤药物也在开发中。P38活性的抑制可促进阿霉素和顺铂等药物对DNA损伤后及紫杉醇和长春碱等药物对微管损伤后的细胞凋亡。JNK抑制剂也可用于治疗肿瘤，这与它能够干扰DNA修复有关，此外，因JNK具有促凋亡作用，故可直接抑制肿瘤，JNK抑制剂可能存在抗凋亡作用，但是其有效性仍存在争论。四、结论在过去的数年里，对检控点通路的研究进展迅速，DNA检控点的功能失调在人类肿瘤中的作用也逐渐清晰。DDR系统中的关键分子ATM、ATR、CHK1、CHK2、BRCA1以及BRCA2与肿瘤的发生关系密切，突变引起的这些关键分子基因的改变可引起相应肿瘤的发生，如ATM、CHK2的变化与淋巴瘤有关，ATM、CHK2、BRCA1、BRCA2的变化与卵巢癌有关，CHK2与结肠癌、前列腺癌和李法美尼症综合征有关，ATR与Seckel综合征有关，而因为CHK1在细胞生存中的重要作用，其突变仅在结肠癌、胃癌和子宫内膜癌的少数患者中发现。除突变以外，DDR系统的翻译后磷酸化在肿瘤的发生中也起重要作用，比如磷酸化后的ATM可在人骨髓淋巴细胞、成人睾丸精母细胞和胚胎性癌中发现，磷酸化WAFI的ATM和CHK2在前列腺癌的癌前状态中发现，磷酸化的p21可促进HER-2/neu过表达细胞的生存，可见，DDR组分的磷酸化是肿瘤形成的另一个机制。MAPK通路功能失常在人类肿瘤的发生中也占有重要地位，但是，激活MAPK发挥促肿瘤功能的具体环境应激尚不清楚，因此，MAPK信号通路的改变程度与MAPK在DDR系统中功能紊乱和人类肿瘤发生的关系仍需进一步研究。42 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究参考文献[1]A.Roessner,D.Kuester,P.Malfertheiner,etal.Oxidativestressinulcerativecolitis-associatedcarcinogenesis.Pathology-ResearchandPractice[J].2008/07/25/.2008.204.511-524.[2]J.H.Lee,A.A.Goodarzi,P.A.Jeggo,etal.53BP1promotesATMactivitythroughdirectinteractionswiththeMRNcomplex.EMBOJ[J].Feb03.2010.29.574-85.[3]Y.Dai,S.Grant.Newinsightsintocheckpointkinase1intheDNAdamageresponsesignalingnetwork.ClinCancerRes[J].Jan15.2010.16.376-83.[4]T.M.Thornton,M.Rincon.Non-classicalp38mapkinasefunctions:cellcyclecheckpointsandsurvival.IntJBiolSci[J].2009.5.44-51.[5]N.Bhattacharya,N.Mukherjee,R.K.Singh,etal.FrequentalterationsofMCPH1andATMareassociatedwithprimarybreastcarcinoma:clinicalandprognosticimplications.AnnSurgOncol[J].Dec.2013.20Suppl3.S424-32.[6]R.Guieze,P.Robbe,R.Clifford,etal.Presenceofmultiplerecurrentmutationsconferspoortrialoutcomeofrelapsed/refractoryCLL.Blood[J].Oct29.2015.126.2110-7.[7]P.G.Pilie,A.M.Johnson,K.L.Hanson,etal.Germlinegeneticvariantsinmenwithprostatecancerandoneormoreadditionalcancers.Cancer[J].Oct15.2017.123.3925-3932.[8]N.J.Roberts,Y.Jiao,J.Yu,etal.ATMmutationsinpatientswithhereditarypancreaticcancer.CancerDiscov[J].Jan.2012.2.41-6.[9]S.Seshagiri,E.W.Stawiski,S.Durinck,etal.RecurrentR-spondinfusionsincoloncancer.Nature[J].Aug30.2012.488.660-4.[10]M.M.Al-Kaabi,A.T.Alshareeda,D.A.Jerjees,etal.Checkpointkinase1(CHK1)isanimportantbiomarkerinbreastcancerhavingaroleinchemotherapyresponse.BrJCancer[J].Mar03.2015.112.901-11.[11]C.Naslund-Koch,B.G.Nordestgaard,S.E.Bojesen.IncreasedRiskforOtherCancersinAdditiontoBreastCancerforCHEK2*1100delCHeterozygotesEstimatedFromtheCopenhagenGeneralPopulationStudy.JClinOncol[J].Apr10.2016.34.1208-16.[12]M.K.Schmidt,F.Hogervorst,R.vanHien,etal.Age-andTumorSubtype-SpecificBreastCancerRiskEstimatesforCHEK2*1100delCCarriers.JClinOncol[J].Aug10.2016.34.2750-60.[13]K.Lawrenson,E.S.Iversen,J.Tyrer,etal.CommonvariantsattheCHEK2genelocusandriskofepithelialovariancancer.Carcinogenesis[J].Nov.2015.36.1341-53.[14]G.S.Ow,A.V.Ivshina,G.Fuentes,etal.IdentificationoftwopoorlyprognosedovariancarcinomasubtypesassociatedwithCHEK2germ-linemutationandnon-CHEK2somaticmutationgenesignatures.CellCycle[J].2014.13.2262-80.[15]C.Cybulski,D.Wokolorczyk,W.Kluzniak,etal.Apersonalisedapproachtoprostatecancerscreeningbasedongenotypingofriskfounderalleles.BrJCancer[J].Jun25.2013.108.2601-9.[16]M.B.Yurgelun,M.H.Kulke,C.S.Fuchs,etal.CancerSusceptibilityGeneMutationsinIndividualsWithColorectalCancer.JClinOncol[J].Apr01.2017.35.1086-1095.[17]M.Stawinska,A.Cygankiewicz,R.Trzcinski,etal.AlterationsofChk1andChk2expression43 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墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究在学期间的研究成果一、发表论文达晓静，胡新新，张亚男，郭鸿，赵丽.雷那度胺联合地塞米松对多发性骨髓瘤治疗疗效及安全性的系统评价，临床血液学杂志.（已录用）二、参与课题《甘肃地道中草药墓头回组分分析及其治疗白血病的实验与临床研究》甘肃卫生行业科技计划管理项目省科技计划项目（项目编码：GZK-2012-3）45 墓头回水提物对白血病细胞周期兰州大学硕士研究生学位论文的影响及相关分子机制的研究致谢光阴似箭，日月如梭，转眼间硕士研究生的生活就要结束了。期间的学习，让我对学术和科研有了全新的认识和体会。回顾整个硕士阶段,有困惑，有烦躁,当然也有感动,有欣慰,有喜悦,有激动,所有的一点一滴都会让我铭记在心。值此论文完成之际，谨向所有关心帮助我的各位表示最诚挚的谢意，感谢所有关心和帮助过我的老师们、亲人们和同学们，你们在日常生活中给予的支持和帮助给我莫大的鼓励和信心，我将继续秉承兰大百年的校训，认真走下去。衷心感谢导师赵丽教授对我不倦的教诲、殷切的培养和悉心的指导，从最初的选题、实验的完成再到论文的写作，蕴含了老师大量的心血。老师深厚的理论基础，丰富的实践经验，活跃的思想，严谨的治学态度，极具个性的人格魅力都将对我今后的人生道路产生深远的影响，使我受益终身，老师您辛苦了，祝愿您在未来的日子里，平安喜乐，健康如意!其次，感谢中心实验室的各位老师们，你们渊博的知识和精益求精的探索精神，鼓励着我努力走进科研的世界，你们对本学科敏锐的洞察力以及活跃的思维总能帮助我从迷茫中找到方向。本论文的顺利完成，承载了各位老师在实验方面严格的要求、细心的指导以及在写作方面认真反复的修改。在此，我向中心实验室的全体老师致以最诚挚的谢意！再次，感谢郭鸿师姐、凌春师兄，胡新新、张亚男以及我的师弟师妹们，你们的支持和鼓励帮助我一次又一次充满勇气，努力去克服学习和生活中的困难，也带给我快乐、充实的美好时光。这是我最宝贵的回忆。祝愿你们在今后的人生旅程上能取得一个又一个辉煌。最后，感谢我的家人，感谢你们在我求学过程中默默的付出以及坚定的支持，你们是我最强大的后盾。在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从不知道毕业论文怎么写，到开始进入课题到论文的完成，再到顺利完成了毕业论文答辩稿，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意!论文中出现的疏漏与不足之处，诚请各位专家和老师批评指正！46
