姜黄素及其类似物对糖尿病小鼠脑组织炎症因子表达的影响

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学校代码：10229学号：X20141002210牡丹江医学院硕士学位论文论文题目：姜黄素及其类似物对糖尿病小鼠脑组织炎症因子表达的影响研究生姓名李超指导教师姓名郭艳芹学科专业名称神经病学招生类别国家统招同等学力□申请学位类型学术学位专业学位□论文提交日期2017.3.15 密级:(涉密论文填写密级，公开论文不填写）编号：分类号：硕士学位论文题目：姜黄素及其类似物对糖尿病小鼠脑组织炎症因子表达的影响研究生姓名：李超学科、专业：神经病学指导教师：郭艳芹单位：牡丹江红旗医院协助指导教师：袁晓环单位：医药研究中心论文答辩日期：2017年6月学位授予单位：牡丹江医学院学习期限：2014年9月至2017年6月学位授予单位：牡丹江医学院答辩委员会主席：评阅人： 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名年月日关于学位论文成果归属权的声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下自选课题或导师承担的国家立项资助的计划课题的一部分，系本人在导师指导和资助下独立进行研究工作所取得的成果，归属权为牡丹江医学院和本人导师所有。特此声明，本声明的一切法律责任由本人承担。论文作者签名研究生导师签名年月日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解牡丹江医学院有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权牡丹江医学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名研究生导师签名年月日 目录一、中文摘要...........................................1二、ABSTRACT...........................................2三、前言...............................................4四、文献综述...........................................6五、材料与方法........................................11六、结果..............................................22七、讨论..............................................29八、结论..............................................32九、参考文献..........................................33十、英文缩写..........................................37十一、致谢............................................39十二、攻读学位期间发表的学术成果......................40 摘要目的：本课题研究姜黄素及其类似物H8对2型糖尿病小鼠脑组织炎症因子表达的影响，为糖尿病脑病的治疗提供实验依据。方法：实验分为两部分：第一部分细胞实验，利用CCK-8法检测姜黄素及其类似物H8的细胞毒性，以脂多糖（LPS）诱导单核巨噬细胞（j774a.1）构建炎症细胞模型，并使用不同浓度的姜黄素或H8进行干预，通过qPCR法检测各组中炎症相关基因TNF-α、IL-6mRNA表达，ELISA法检测各组中炎症相关蛋白TNF-α、IL-6表达。第二部分动物实验，实验分为5组：以db/m小鼠作为对照组、db/db小鼠作为2型糖尿病模型组，分别给予姜黄素（curcumin，5mg/kg）、低剂量H8（h8-l组，5mg/kg）、高剂量H8（h8-h组，10mg/kg）灌胃治疗8周，对照组及糖尿病组在相同时间灌服相同体积的1%CMC（羧甲基纤维素钠）溶液。8周后，水迷宫检测小鼠学习记忆能力，HE染色及免疫组化检测小鼠脑组织形态学变化及炎症因子TNF-α、IL-6、IL-17表达变化。结果：1.H8在实验浓度范围内几乎无细胞毒性，而姜黄素在40μmol/L左右出现明显的细胞毒性，与对照组相比细胞存活率明显下降（P<0.001）。2.姜黄素和H8都能够抑制炎症因子TNF-α、IL-6表达，其中H8对炎症因子的抑制作用明显优于姜黄素。3.与糖尿病组相比，Cur组、低、高浓度H8组小鼠逃避潜伏期均明显缩短，且高浓度H8组缩短更明显，小鼠穿越平台次数明显增加（P<0.05）。4.HE染色显示糖尿病组小鼠脑组织有明显的病理学改变，经过高剂量H8治疗后小鼠脑组织病理形态明显得到改善。5.免疫组化染色显示：与糖尿病组相比，姜黄素组及高剂量H8组小鼠脑组织IL-6、TNF-α、IL-17表达水平均明显下降（P<0.05、P<0.01）。结论：姜黄素及其类似物H8都能够抑制糖尿病小鼠脑组织炎症因子表达，发挥抗炎作用，其中H8的抗炎效果更明显。并且它们二者都能够改善糖尿病小鼠的学习记忆能力，其中高浓度H8作用更明显。关键词：姜黄素；姜黄素类似物；糖尿病脑病；认知功能；炎症因子1 ABSTRACTObject：ThisstudywastoinvestigatetheeffectofcurcuminanditsanaloguesH8ontheexpressionofinflammatoryfactorsinthebrainoftype2diabeticmice,andtoprovideexperimentalevidenceforthetreatmentofdiabeticencephalopathy.Methods：Theexperimentwasdividedintotwoparts:thefirstpartisthecellexperiment.ThecytotoxicityofcurcuminanditsanalogueH8wasdetectedbyCCK-8method.Lipopolysaccharide(LPS)-inducedmonocyte-macrophage(j774a.1)wasusedtoconstructtheinflammatorycellmodel,andintervenedbycurcuminorH8,themRNAlevelsofTNF-αandIL-6weretestedbyqPCR.thesecretionlevelsofTNF-αandIL-6inculturesupernatantweredetectedbyELISA.Thesecondpartisanimalexperiments,theexperimentwasdividedintofivegroups:db/mmicewereusedasacontrolgroup,db/dbmiceinothertreatmentgroups,includingdiabeticgroup,Curcumingroup(curcumin,5mg/kg),H8-Lgroup(h8-l,5mg/kg)andH8-Hgroup(h8-h,10mg/kg).Exceptforcontrolgroupanddiabeticgroup.ThemicewerefedwithcurcuminandH8for8weeks.Thecontrolgroupandthediabeticgroupwerefedthesamevolumeofsalineatthesametime.After8weeks,MorriswatermazewasusedtodetecttheLearningandMemoryability.HEstainingandimmunohistochemistrywereusedtodetectthemorphologicalchangesofbraintissueandtheexpressionofTNF-α,IL-6andIL-17inmice.Results：1.H8hadalmostnocytotoxicityintheexperimentalconcentrationrange,andthecurcuminhadsignificantcytotoxicityatabout40μmol/L,andthecellsurvivalratewassignificantlylowerthanthatofthecontrolgroup(P<0.001).2.BothCurcuminandH8wereabletoinhibittheexpressionofTNF-αandIL-6,amongwhichH8hadbetterinhibitoryeffectoninflammatorycytokinesthancurcumin.3.Comparedwiththediabeticgroup,theescapelatencyoftheH8groupwassignificantlyshorterthanthatofthediabeticgroup,andtheshortenedH8groupwasmoreobviousandthenumberofcrossingtheplatformincreasedsignificantly(P<0.05).4.HEstainingshowedthatthebraintissueofdiabeticgrouphadobviouspathologicalchanges,andthepathologicalmorphologyofbraintissuewasimprovedafterhighdoseofH8treatment.5.Immunohistochemicalstainingshowedthatcomparedwithdiabetesgroups,thelevelsofIL-6,TNF-αandIL-17inbraintissueofcurcumingroup(5mg/kg)andhighdoseH8group(10mg/kg)weresignificantlydecreased.(P<0.05,P<0.01)2 Conclusions：CurcuminanditsanaloguesH8areabletoinhibittheexpressionofinflammatoryfactorstoplayasignificantanti-inflammatoryeffect，inwhichH8anti-inflammatoryeffectismoreobvious.Andbothofthemcanimprovethelearningandmemoryabilityofdiabeticmice,inwhichtheroleofhighconcentrationofH8moreobvious.Keywords:Curcumin;Curcuminanalogues;Diabeticencephalopathy;Congnitivefunction;Inflammatoryfactor3 前言糖尿病（Diabetesmellitus）是一种以血糖持续增高并伴有糖、脂、蛋白质代谢紊乱的慢性代谢性疾病，该病的主要机制为直接或间接的胰岛素分泌或作用不足。研究表明它对一些靶器官和系统如：心、眼、肾、血管组织、神经系统和大脑产生不利影响[1]，可引起多种并发症。其中以糖尿病引起的认知功能受损，并伴有大脑结构、神经生理及神经精神等方面的病理性改变被称之为糖尿病脑病[2]（diabeticencephalopathy，DE）。糖尿病脑病的发病机制比较复杂，具体的发病机制仍然不清，研究发现高血糖、高血压、血糖变异、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、氧化应激、胰岛素信号通路受损、β淀粉样蛋白沉积与高度磷酸化的tau蛋白等可能与糖尿病脑病具有一定的联系，这些代谢性改变可以增加tau蛋白磷酸化，加速神经原纤维缠结的形成[3]，并且由于胰岛素降解酶（insulin-degradingenzyme，IDE）缺陷导致淀粉样蛋白分解减少[4]，加速阿尔茨海默病发生[5]（Alzheimer’sdisease，AD）。异常的葡萄糖代谢可使脑中晚期糖基化末端产物（advancedglycationend-products，AGEs）异常积累，加重慢性持续性全身低度慢性炎症反应（low-gradechronicinflammation，LGCI），致使神经细胞凋亡增多，加速脑的衰老[6,7]，加快糖尿病脑病的进程。此外大量研究表明糖尿病脑组织中炎症反应与认知功能损伤密切相关[8]。糖尿病与认知功能损伤之间的联系已经早在1922年时就已经被提出[9]。在发生糖尿病时，脑中促炎细胞因子表达增加，小胶质细胞被激活[10,11]，激活的小胶质细胞能进一步促进炎症介质释放，导致神经元损伤[12]，此外促炎介质表达增加可诱导一氧化氮合酶（iNOS）、AGEs（晚期糖基化终产物）和NF-κB（核转录因子kappaB）受体上调[11]。AGEs可以使中枢血管炎症反应加重，损害认知功能。NF-kB可进一步激活肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素和C反应蛋白产生一系列炎症级联反应[13]。Dinel,A.L.[8]等以db/db小鼠为2型糖尿病模型，发现小鼠的空间识别记忆能力受损，可能与海马中促炎细胞因子（IL-1β，TNF和IL-6）表达增加及BDNF表达减少有关，这表明炎症因子与认知功能损伤有密切相关。姜黄素(curcumin)是一种低分子量酚类化合物，研究表明它具有十分出色的抗炎作用[14]，由于其毒性低，来源广泛，早已成为研究和开发的热点。然而，姜黄素在体内的生物活性偏低、代谢快、易降解、生物利用率低，极大地限制了它的应用[15]。因此，本4 实验室前期以姜黄素为母体去掉其β-二酮基团，设计了稳定的、分子量更小的戊-1,4二烯-3-酮类似物（H8），化学名称为：（2E,5E）-2,5-双亚苄基环戊酮，HPLC检测其纯度为99.3%。本实验首先利用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导小鼠腹腔单核巨噬细胞，建立内毒素诱导的细胞炎症模型，在此基础上检测姜黄素及其类似物H8的抗炎作用。进而以db/db小鼠为2型糖尿病模型，观察姜黄素及其类似物H8对小鼠脑组织炎症因子表达及认知功能的影响，为治疗和预防糖尿病脑病提供实验依据。5 文献综述糖尿病（DiabetesMellitus，DM）是一种以胰岛素抵抗、炎症反应、氧化应激、血管损伤及糖、蛋白质和脂质代谢等功能障碍为特征的慢性代谢性疾病。它对一些靶器官和系统如：心，眼，肾，血管组织，神经系统和脑产生不利影响，是终末期肾病，失明，神经病变和心血管疾病的主要病因[1]。此外，越来越多患有糖尿病的老年人表现出认知功能障碍和运动功能障碍，被称为糖尿病脑病[2]（diabeticencephalopathy，DE）。目前认为DE的病理生理学可归因于长期高血糖，高血压，高胰岛素血症，反复的低血糖发作和血脂异常。这些代谢改变可以增加tau蛋白磷酸化，加速神经原纤维缠结的形成[3]，并且由于胰岛素降解酶（insulin-degradingenzyme，IDE）缺陷导致淀粉样蛋白分解减少[4]，加速阿尔茨海默病发生[5]（Alzheimer’sdisease，AD）。此外，脑中晚期糖基化末端产物（advancedglycationend-products，AGEs）异常积累，慢性持续性全身低度慢性炎症反应（low-gradechronicinflammation，LGCI），细胞凋亡增加导致神经元丢失加速脑的衰老[6,7]。由于DE的病因及发病机制比较复杂，本文将几种可能危险因素及发病机制进行讨论和总结。1.糖尿病脑病的危险因素诱发糖尿病脑病的危险因素较多如：高血糖、高胰岛素血症、低血糖、血糖波动、糖化血红蛋白水平、糖尿病病程等。此外其他因素如，外周动脉硬化症、血管疾病、长期吸烟、受教育程度，遗传因素、性别、年龄等也在糖尿病脑病中起到重要作用。1.1高血糖升高的血浆葡萄糖水平是糖尿病最常见病理特征，也是产生糖尿病并发症的主要原因。最近的流行病学研究表明，高血糖增加痴呆的风险，并加速从轻度认知功能障碍MCI到AD的转变，表明体内葡萄糖平衡破坏可能是AD发生和进展的始动因素[16-18]。血中葡萄糖含量升高可激活山梨醇-醛糖还原酶途径，将过量的葡萄糖转变为山梨醇，异常的葡萄糖代谢可刺激糖化反应导致晚期糖基化终产物（AGEs）形成，致使视网膜，肾脏及神经系统微血管损伤，导致神经细胞功能障碍。Hernandez-FonsecaJP[19]等在STZ诱导的糖尿病大鼠大脑皮质和视网膜中发现山梨醇水平增加，当用醛糖还原酶抑制剂后治疗后，山梨醇积累显着减少，并且认知功能得到改善[20]。Valente[21]等对人脑进行免疫组化分析发现脑中AGEs与Aβ（β淀粉蛋白）和神经纤维缠结（NFT）密切相关，患有6 糖尿病的AD病人与无糖尿病AD受试者相比，脑中AGEs含量更高。HudsonBI等在认知功能损伤的糖尿病小鼠脑白质和髓鞘中发现AGEs表达增加，ROS产生增多，神经元和神经胶质细胞中蛋白激酶C（PKC）被激活，这些改变参与了大脑的衰老过程[20,22]。Holtzman[23]等人发现高血糖可通过神经元电活动调节Aβ含量，研究者利用葡萄糖钳和体内微透析技术发现高血糖时电压依赖性KATP通道发生改变，致使Aβ含量增加。这项研究为葡萄糖代谢和AD之间的联系提供了重要的价值，表明KATP通道可能是AD患者代谢问题的治疗途径。此外，高血糖还可以通过抑制AβPP蛋白（amyloid-βproteinprecursor）的降解直接促进Aβ的产生[24]。总而言之，以上多种机制表明高血糖能够引起认知功能损伤。1.2血糖变异性与糖化血红蛋白糖化血红蛋白是反应阶段内平均血糖水平的重要指标。在糖尿病中，糖化血红蛋白（HemoglobinA1C，HbA1c）与疾病进展、靶器官损伤及视网膜、肾组织、外周神经中的微血管并发症密切相关，并且可加速动脉粥样硬化的大血管疾病进展，影响心、脑和下肢血管[25]。糖尿病患者血清中HbA1c水平与工作记忆，执行功能，学习和复杂的精神运动性能之间为反比关系，说明血糖控制不佳可能会导致认知功能相恶化[26]。在一项控制心血管病风险的糖尿病实验中，使用基线认知功能检测糖尿病患者记忆，结果发现，糖尿病患者记忆得分较低，与糖化血红蛋白水平升高密切相关[27]。因此控制血糖水平对预防糖尿病并发症及靶器官损伤具有重要意义。但过于严格的控制血糖也并不可取，研究表明患有2型糖尿病的老年人过度控制血糖会增加低血糖风险增，也会对认知功能造成损害[28]。1.3低血糖脑组织的能量来源于血液中的葡萄糖，其中海马区对血糖浓度的改变非常敏感。在急性低血糖发作期间，直接表现为言语和视觉记忆，工作记忆，记忆延迟，视觉运动和视觉空间能力以及认知功能受损。许多研究探讨了反复低血糖发作在认知损伤发展中的作用，一些学者通过糖尿病控制和并发症试验（DCCT）发现由于老年患者大脑对低血糖更为敏感，T1DM老年患者多发严重低血糖发作，会加重认知功能损伤[29]。在动物模型中，急性低血糖会加剧与认知过程相关的脑结构中神经元损伤，导致认知功能受损[30]，在低血糖状态下人体可以通过小动脉血管舒张增加脑血流量，由于糖尿7 病的慢性高血糖导致血管内皮改变管壁变硬，当发生低血糖时血管舒张功能降低，这放大了低血糖对脑损伤的作用。2.糖尿病脑病的发病机制2.1胰岛素抵抗与高胰岛素血症脑组织是一种胰岛素依赖性器官[31]，脑中胰岛素和胰岛素样生长因子-1（insulin-likeGrowthFactor，IGF-1）信号具有重要的神经营养作用，对葡萄糖利用、能量代谢、胆碱能基因及神经骨架蛋白的表达和磷酸化具有调节作用[32,33]。AirE.L[34]等研究发现适量的胰岛素能够促进突触代谢、蛋白质合成，参与神经元存活和长时程增强的建立。特别是在海马，胰岛素是能量和葡萄糖稳态，海马神经元可塑性和认知功能，以及神经发生的调节器[35,36]。研究发现IR（胰岛素受体）及其mRNA在大鼠脑中如：海马、额叶皮质、内嗅皮层、下丘脑、小脑，大脑皮层和杏仁核等学习记忆相关区域广泛表达[37]，表明胰岛素可能与学习记忆功能密切相关。越来越多的证据表明胰岛素/IGF抵抗在阿尔茨海默病发病机制和认知功能缺陷中扮演重要角色[32,33]。当发生胰岛素抵抗时，机体反射性地胰岛素分泌过多发生高胰岛素血症，过多的胰岛素会与胰淀粉蛋白竞争性结合IDE，导致β-淀粉样蛋白清除率下降（β-淀粉样蛋白是AD的特征性标志物）。反过来，过多的Aβ寡聚体可以通过JNK/TNF-α信号途径抑制胰岛素信号转导，在多个丝氨酸残基处诱导IRS-1磷酸化并抑制其生理功能，进而形成恶性循环[38]。WQQiu[39]等研究发现外周循环血液中慢性高胰岛素血症，以及脑组织中胰岛素摄入减少，可导致β-淀粉样蛋白和炎症的失调，最终导致认知功能损伤。在记忆功能受损的人和动物鼻内滴注胰岛素后记忆功能明显得到改善，表明胰岛素和IGF信号在学习和记忆过程中具有重要作用。在胰岛素抵抗的动物模型中发现，胰岛素受体功能受损，细胞骨架发生改变，导致突触损伤和神经元丢失[40]。2.2糖皮质激素T2DM患者下丘脑-垂体-肾上腺轴上调（HPA轴）容易引起与糖尿病相关的神经系统并发症，糖尿病患者糖皮质激素的基础水平升高，影响正常的CNS功能并促进认知功能障碍的发展[41]。此外，血浆糖皮质激素水平的缓慢增加可加重高血糖引起的症状，增加胰岛素抵抗。研究发现，皮质类固醇水平慢性升高诱导促肾上腺皮质激素释放激素受体的基因编码转录变化，导致突触可塑性损害，抑制树突分支，并抑制海马中神经元发生[42,43]。无糖尿病患者使用地塞米松，皮质酮和氢化可的松后在记忆测试中表现较差。8 2.3炎症炎症反应是指机体为应对外来生物刺激所引起的一种生理性防御反应，是许多慢性疾病如：糖尿病、癌症、心血管疾病、关节炎、肥胖、自身免疫性疾病进展的主要原因[44]。糖尿病患者血液中炎症标志物如C反应蛋白，α1-抗胰凝乳蛋白酶，白细胞介素-6和细胞间粘附分子-1与正常患者相比明显升高[10]，许多研究表明糖尿病患者会出现认知功能减退，随着糖尿病进展会逐渐发展为痴呆，并且它们之间炎症通路是被激活的[45]。Leonard,B.E.[46]以db/db小鼠为2型糖尿病模型，发现小鼠的空间识别记忆能力受损，可能与海马中促炎细胞因子（IL-1β，TNF-α和IL-6）表达增加及脑源性神经生长因子（BDNF）表达减少有关，有研究发现在认知功能相障碍的人和动物脑组织中促炎细胞因子的水平升高，这表明炎症因子与认知功能损伤之间具有一定联系[8]。在糖尿病条件下脑中促炎细胞因子表达的增加，小胶质细胞被激活，激活的小胶质细胞能进一步促进炎症介质释放，导致神经元损伤[12]。李新玲[47]等通过实验研究发现，2型糖尿病伴有认知功能障碍患者血清中TNF-α、IL-6水平均高于糖尿病非认知功能障碍患者组及正常对照组，且2型糖尿病患者的MoCA评分与TNF-α、IL-6水平呈负相关，提示炎症反应与2型糖尿病患认知功能障碍有密切联系。糖尿病动物中促炎介质表达增加可诱导一氧化氮合酶（iNOS）同种型AGEs和NF-κB受体的上调，AGEs可以使中枢血管炎症反应加重，损害认知功能。NF-kB可进一步激活肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素和C反应蛋白产生一系列炎症级联反应[10,11]。2.4氧化应激氧化应激时一些有害自由基包括活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）和活性氮的（reactivenitrogenspecise，RNS）的稳态遭到破坏。高水平的ROS或RNS积累可影响一系列生物分子，包括蛋白质，脂质和核酸，损害细胞完整性和功能并导致细胞死亡[48]。糖尿病脑病中，生理性氧化还原平衡受损，发生氧化应激，加速糖尿病并发症发展。这涉及多种潜在的机制，如葡萄糖自身氧化，抗氧化防御酶受损，葡萄糖毒性或胰岛素信号受损相关的转录因子活化，多元醇和PKC途径的活化[49,50]。这些与糖尿病相关的氧化应激机制引起神经元凋亡和脑组织炎症，最终导致神经退行性疾病发生。增加的多元醇和蛋白质糖基化产物进而引起ROS的产生[51]，ROS可以活化醛糖还原酶和蛋白激酶C（PKC）并增加晚期糖基化终产物（AGE）和二酰基甘油形成，损害神经元，导致认知功能损伤。9 此外，氧化应激可损伤胰岛素信号传导活性，不利于NF-κB的表达和易位，加重炎症反应，NF-κB同时也是ROS产生的调节剂，进而形成恶性循环[11,52]氧化应激还可引起线粒体功能障碍，导致能量缺陷，从而导致神经元损伤和神经变性[53]。2.5β淀粉蛋白和Tau蛋白AD的病理学特征是β样淀粉蛋白(amyloid-beta，Aβ)的沉积和高度磷酸化的tau蛋白形成的神经纤维缠结。T2DM患者的特点为胰岛β细胞丢失和胰岛淀粉样蛋白沉积，这与AD中所见到的Aβ沉积和神经元丢失相类似。炎症与小胶质细胞的激活可促进Aβ沉积，淀粉样蛋白前体蛋白（APP）的表达和氧化应激产物增加[54]。关于Aβ沉积虽然有很多可能的机制存在，但已经证实其与胰岛素信号受损有关。研究发现胰岛素对Aβ沉积的作用是双重的，一方面，胰岛素可增加β淀粉蛋白从神经细胞中释放。另一方面，胰岛素降解酶（IDE）既能降解Aβ又能降解胰岛素[55]。在胰岛素水平升高的情况下，胰岛素竞争性结合IDE，使Aβ分解减少。因此，胰岛素抵抗和高胰岛素血症的净效应分别是细胞内和细胞外β淀粉蛋白的水平都增加。Tau蛋白对调节微管稳定性，轴突运输和神经突生长中起主要作用。异常磷酸化的Tau蛋白是神经原纤维缠结的主要成分，是AD的主要病理学机制。糖尿病可以促进异常的tau蛋白修饰，高度磷酸化的Tau蛋白可导致管蛋白聚合成微管的作用消失，并丧失微管的稳定性，导致微管破坏，改变突触后生理学并导致突触功能障碍和认知缺陷[4]。总之，糖尿病脑病是由多因素、多环节共同作用的结果，其发病机理目前为止还没有阐释清楚。但可以肯定糖尿病脑病与阿尔茨海默病之间存在必然的联系，由于糖尿病脑病作为独立的危险因素，速脑老化进程，增加了老年痴呆的发病风险，随着其发病率的逐年上升，得到了越来越多的重视。因此，提前对糖尿病脑病的危险因素进行积极的控制，及早对糖尿病患者进行认知功能检查，并采取干预措施，可以预防或延缓老年性痴呆的发生，提高患者的生活质量。10 材料与方法1.实验材料1.1细胞株小鼠j774a.1细胞（小鼠单核巨噬细胞株细胞）购自上海酶研科技有限公司。1.2实验动物8周龄SPF级db/db小鼠及db/m小鼠。购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001，体重23-25g，饲养条件：温度18-25℃，湿度69%，12h交替照明。1.3主要试剂DMEM培养基美国Gibco公司青链霉素混合液美国Gibco公司胎牛血清美国Gibco公司胰蛋白酶美国Gibco公司PBS缓冲液武汉博士德生物有限公司无水乙醇哈尔滨试剂化工厂二甲基亚砜（DMSO）上海启迪化工有限公司RAPI裂解液碧云天生物有限公司CCK-8试剂盒上海同仁化工DOJINDOTrizol美国Invitrogen公司逆转录试剂盒美国罗氏公司RochePCR引物（TNF-α、IL-6、RPS16）上海生工生物工程股份有限公司SYBRGreen荧光染料美国罗氏公司RocheMouseTNF-αELISAkit深圳欣博盛生物有限公司MouseIL-6ELISAkit深圳欣博盛生物有限公司姜黄素美国Sigma-Aldrich姜黄素类似物H8本课题组合成Anti-TNFalphaantibodyAbcamab1156411 Anti-IL6antibodyAbcamab7737Anti-IL17antibodyAbcamab79056GoatAnti-RabbitIgGAbcamab97051RabbitAnti-RatIgGAbcamab6734伊红北京中生瑞泰科技有限公司苏木素北京中生瑞泰科技有限公司水合氯醛实验室配制羧甲基纤维素钠美国Sigma-AldrichDAB显色液碧云天生物技术有限公司中性树脂碧云天生物技术有限公司二甲苯天津市永大化学技术有限公司柠檬酸钠武汉博士德生物有限公司氢氧化钠天津渤瑞杰商贸有限公司盐酸哈尔滨试剂化工厂1.4主要仪器CO2恒温培养箱（HF240）美国ThermoFisher公司倒置光学显微镜（CX40-32H02）日本Olympus公司低温高速离心机（3K15）德国Eppendorf公司低速离心机（Mini-10K）中国飞鸽恒温水浴锅（HHD-2）上海比朗仪器有限公司超低温冰箱（900series）美国ThermoFisherScientific公司超净工作台（ESCOACB-4A1）德国ESCOPCR仪（S1000）德国Eppendorf公司酶标仪（M3）美国Bio-Rad公司分光光度计（BH4-231）美国Beckman公司荧光定量PCR仪美国ABIstepone分析天平（BS110）德国Sartorius电冰箱（BCD-248WSV）青岛海尔股份有限公司PCR自动系列化分析仪（S1000）美国Bio-Rad12 漩涡混合器（XH-D）上海汗诺仪器有限公司酸度计（PB-21）赛多利斯科学仪器有限公司RNA浓度分析仪（NanoDrop2000）美国ThermoFisherscientific公司旋转式切片机（LEICARM2145）美国莱卡包埋机（LEICAEG1160）美国莱卡烘片机（LEICAHI1220）美国莱卡高速离心机（22331）德国Eppendorf公司Morris水迷宫上海欣软科技有限公司Imagine-pro-plus图像分析系统上海欣软科技有限公司倒置显微镜（OlympusBX53）日本奥林巴斯通风厨（LABCONCO-4A1）美国LABCONCO磁力搅拌器（90-2）上海亚荣生化仪器厂微量移液枪德国Eppendorf公司制冰机（SIM-F124）日本Sanyo三洋血糖仪及试纸美国罗氏纯净水系统（SZ-93）美国Millipore公司高压灭菌锅（CLG-40M）日本ALP公司1.5主要试剂配制1.5.1DMEM高糖培养基的配制将DMEM培养基粉末13.4g溶于800ml三蒸水中，根据说明书加入3.7gNaHCO3粉末，缓慢磁力搅拌30min使其完全溶解，使用PH仪检测PH值并加入HCI或NaOH调节PH值至7.2-7.4之间，三蒸水定容至1L，继续搅拌30min。加入青霉素和链霉素混合液并使其终浓度为100U/ml，使用0.22μm微孔滤膜在超净工作台内过滤除菌分装，4℃保存备用，如果放置时间过久应补加L-谷氨酰胺，并重新调节PH值。使用前加入胎牛血清并使其终浓度为10%。1.5.2LPS配制将LPS（Lipopolysaccharide）粉末溶解于三蒸水中，配制成200μg/ml贮存液，分装，-20℃冰箱保存备用。1.5.30.25%胰蛋白酶配制13 称取0.25g胰蛋白酶溶于80mlPBS中，缓慢磁力搅拌20min至完全溶解，定容至100ml，使用0.22μm的滤器在超净工作台内过滤分装，于4℃冰箱中备用，-20℃保存。1.5.4PBS缓冲液配制将购买的PBS粉末包全部溶解到三蒸水中并定容到1000ml，用0.22μm的滤膜在超净工作台内过滤除菌后放于4℃冰箱中保存备用。1.5.5台盼兰染液称取台盼兰粉末4.0g，加蒸馏水至100ml，滤纸过滤，4℃保存。使用时稀释10倍。1.5.6细胞冻存液900μl纯胎牛血清中加入100μlDMSO使其使其终浓度为10％，4℃保存。1.5.7姜黄素及其类似物H8溶液的配制将姜黄素及其类似物H8粉末溶解于DMSO中，配制成20mol/L的母液，分装，存放于-20℃冰箱备用，临用前加入培养基稀释至所需浓度，并保证DMSO的终浓度<0.1%。1.5.8伊红（醇溶液）伊红2.0g，95%乙醇400ml，将伊红溶解于95%乙醇中，加入转子在电磁搅拌器上搅拌至完全溶解。1.5.90.5%盐酸乙醇溶液三蒸水150ml，95%乙醇350ml，盐酸2.5ml，依次加入到棕色清洁玻璃瓶中，充分混匀。1.5.10Harris氏苏木素称取苏木素5g，一氧化汞2.5g，硫酸铝钾100g，无水乙醇50ml，蒸馏水1000ml，冰乙酸40ml，首先将无水乙醇中加入苏木素，置于磁力搅拌器上使其充分溶解。向装有硫酸铝钾的烧瓶中加入蒸馏水，置于磁力恒温搅拌器上搅拌加热，硫酸铝钾完全溶解后，继续加热至温度约90℃左右时，加入预先溶解好的乙醇苏木素，继续加热至沸腾后持续加热3min，当溶液颜色逐渐变为紫红色后，停止加热，加入一氧化汞，继续加热使其充分氧化，当溶液变为深紫色，停止加热，将烧杯放入冰盒中，置于暗处，过夜后使用滤纸过滤，加入冰乙酸。1.5.114%多聚甲醛溶液称取40g多聚甲醛将其溶解于800mlPBS溶液中，在恒温磁力搅拌器上加热搅拌，14 当其变成乳白色悬浊液，加入NaOH调节PH值至7.0，此时溶液呈清亮状，最后加入PBS定容至1000ml，4℃保存备用。1.5.125%BSA称取5mgBSA加入100mlPBS中置于磁力搅拌器上充分搅拌混匀。1.5.131%CMC溶液配制称取10g羧甲基纤维素钠粉末，加入900ml三蒸水置于磁力搅拌器上搅拌至完全溶解，最终定容至1000ml。2.实验方法2.1细胞培养2.1.1细胞复苏（1）预先将恒温水浴锅加热至37℃。（2）从液氮罐中取出内含j774a.1细胞的细胞冻存管，迅速置于37℃恒温水浴中旋转搅动，使冻存管均匀受热，约1min左右可见冻存管内液体完全解冻。（3）将冻存管转移至超净工作台，用移液器将细胞悬液吸到15ml离心管中，并加入2ml含血清的DMEM培养基。（4）放入低速离心机中1000rpm离心5min后，弃上清。（5）在离心管中重新加入2ml含血清的培养基，轻轻吹打重悬细胞，并将细胞悬液转移至细胞培养瓶中，再加入适量的DMEM培养基，标记好日期和细胞名字及细胞代数后置于37℃、5%CO2培养箱中培养，于第二天观察细胞贴壁情况。2.1.2细胞换液和传代（1）第二天细胞贴壁后进行细胞换液，弃去培养瓶中旧培养基重新加入新鲜适量的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，换液时间看细胞生长情况一般2-3天换一次液。（2）当细胞生长汇合度达到70%-80%时可进行细胞传代，传代比率为1:2。首先弃去旧培养瓶中的培养基，加入3mlPBS冲洗2遍，弃去PBS，加入1ml0.25%的胰酶旋转培养瓶使其均匀覆盖细胞，置于培养箱中消化约30s，置于显微镜下观察，待细胞回缩、变圆，细胞间隙变大时加入含血清的培养基终止消化。轻轻震荡并吹打瓶壁上的细胞使其脱落，使用移液器将细胞悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min。用新鲜培养基重悬细胞，将细胞悬液一分为二转移至细胞培养瓶中，分别加入适量培养基继续培养。细胞传代后第1天呈圆型，生长一定时间或15 密度较高时细胞呈现梭型。2.1.3细胞计数将处于对数生长期的细胞制备成单细胞悬液，使用移液器吸取20μl细胞悬液加入等量的预先配置好的台盼蓝溶液，充分混匀，加入细胞计数池与盖玻片的缝隙中。静置2min，在低倍镜下被台盼蓝染色的细胞为死细胞，应被剔除，计数原则按计左边、计上边压线细胞，细胞团内细胞大于2个时按一个细胞计算，计算四个大格中的细胞数。2.1.4细胞冻存选择2-3代左右处于对数生长期的细胞用于冻存，细胞冻存前24小时换液一次，按常规方法将细胞制备成细胞悬液，进行细胞计数，计数后将细胞悬液1000rpm离心5min，弃去上清，在离心管中加入配制好的细胞冻存液，吹打细胞，重悬调整细胞密度为5×106/ml，分装加入无菌冻存管，1ml/管，用封口膜封口，标明细胞名称、代数及冻存时间，先放置4℃冰箱20min，然后转移至-20℃冰箱2h，之后置于-80℃冰箱暂时保存，长期保存应放入液氮瓶中。2.2CCK-8法检测姜黄素及H8的细胞毒性将处于对数期生长的j774a.1细胞按4000个/孔的密度接种于96孔板，并使用含10%FBS的DMEM高糖培养基进行培养，待12h后细胞贴壁，换液。实验分为对照组、姜黄素组、H8组，每组5个复孔，姜黄素组与H8组的药物浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L，药物干预24h后，使用光学显微镜观察细胞形态及细胞存活情况，每孔中加入10μlCCK-8试剂，避光，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育4h，室温下避光振荡3min后使用酶标仪在450nm处测量OD值，最后根据OD值计算细胞存活率。2.3LPS诱导j774a.1细胞建立炎症细胞模型取对数期生长的j774a.1细胞按4×105/ml的密度接种于6孔板中，并以1μg/mL的LPS刺激j774a.1细胞建立炎症模型，实验分为6组（每组2个复孔）：（1）空白组：使用PBS处理；（2）LPS组：使用1μg/mLLPS处理；（3）LPS+姜黄素组1：加入1μg/mL的LPS和10μmol/L的姜黄素；（4）LPS+姜黄素组2：加入1μg/mL的LPS和20μmol/L的姜黄素；（5）LPS+H8组1：加入1μg/mL的LPS和10μmol/L的H8；（6）LPS+H8组2：加入1μg/mL的LPS和20μmol/L的H8。首先使用姜黄素或H8预先处理细胞2h，然后加入1μg/mL的LPS刺激22h，分别收集培养基上清液和细胞进行ELISA和qPCR检测。2.4Trizol法提取总RNA16 按2.3方法细胞经过LPS或药物作用24h后，将6孔板中的培养基上清收集到EP管中，分装置于-20℃冰箱保存备用，用于ELISA检测。细胞收集用于提取RNA，具体步骤如下：（1）使用PBS清洗细胞1次。（2）在6孔板内加入预冷的Ttizol试剂1ml/孔，并用枪头吹打细胞使细胞完全脱落，室温下放置10min，12000rpm，4℃下离心15min。（3）将上清转移至新的EP管中，按1mlTtizol加500μl氯仿的比例加入氯仿，震荡10s，室温静置5min，观察有无分层现象。（4）在高速离心机下4℃，12000rpm，离心15min，此时样品应分为三层：无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。小心吸取无色上清水相移至另一离心管，并记录体积。（5）向离心管中加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置5min，4℃，12000rpm离心15min。（6）弃去上清，加入1ml预先用DECP水配制的乙醇，轻轻混匀，4℃，12000rpm，离心15min。弃尽上清，室温干燥2min左右。（7）加入20-35μl65℃加热过的DEPC水溶解RNA沉淀。2.5RNA浓度测定取1.5μl制备的RNA溶液于Nanodrop2000定量分析仪检测RNA浓度及纯度，记录样本浓度，OD260/280比值介于1.9-2.0之间、260/230比值介于1.3-1.6之间，则根据逆转录成cDNA所需RNA的量配制浓度基本均一的RNA，即可进行下一步实验。2.6逆转录合成cDNA逆转录反应体系如下：第一步：ComponentVolume(13μl体系)RNAtemplate(1μg/μl)10μlRT引物工作液（62.5nm）3μl瞬时离心后，放入PCR仪中，65℃，10min，随后冰浴10min。第二步：将下表中试剂加入上步得到的13μl产物中17 ComponentVolume(总20μl体系)RTbuffer（5×）4μldNTPmix（2.5mM）2μlRNaseinhibitor（40μg/μl）0.5μlRT酶（200μg/μl）0.5μl瞬时离心后放入PCR仪中，50℃，1h。第三步：将逆转录完得到的cDNA每管稀释5倍，分装，并储存于-20℃电冰箱中。2.7qPCR检测姜黄素及H8对炎症相关基因表达的影响2.7.1引物的设计与合成通过pubmed查找TNF-α、IL-6、Rps16的基因序列，利用PrimerPrieimer5.0软件设计引物。以Rps16基因为管家基因，检测IL-6和TNF-αmRNA表达变化。各引物的序列如下：基因引物序列上游引物5’-GCCACCACGCTCTTCTGTCT-3’TNF-α下游引物5’-GGTCTGGGCCATAGAACTGATG-3’上游引物5’-ATGAAGTTCCTCTCTGCAAGAGACT-3’IL-6下游引物5’-CACTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC-3’上游引物5'-AAGTCTTCGGGAGGCAAGAAA-3'Rps16下游引物5'-TTGCCCAGAAGCAGAACAG-3'2.7.2引物的稀释将上游和下游引物于4℃，2000rpm离心10min，然后根据说明书所示在PrimersF中加入ddH2O，在PrimersR中加入ddH2O混匀；然后使用移液器在上游和下游引物中分别抽取5ul加入到45ul的ddH2O中即稀释10倍，充分混匀，-20℃保存备用。2.7.3real-timePCR过程real-timePCR使用20μl反应体系：ComponentVolume(20μl体系)SYBRGreenMix9μlTemplatecDNA2μl18 ForwardPrimer(10μmol/L)0.8μlReversePrimer（10μmol/L）0.8μlddH2O7.4μl瞬时离心后放入real-timePCR仪中TNF-α扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；58℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环，最后72℃延伸10min。IL-6扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。Rps16扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；58℃退火30s，72℃延伸30s，共24个循环，最后72℃延伸10min。以上基因每份样品做3个平行复孔。2.8酶联免疫吸附实验（ELISA）检测培养基上清TNF-α和IL-6水平按1.2.3方法细胞经过加药处理后，收集上清培养基于EP管中，1000rmp离心5min，将上清转移至新的EP管中，分装每管300μl，-20℃冻存，避免反复冻融。检测前将其取出室温融化并混匀，并从4℃冰箱取出ELISA试剂盒平衡至室温，按试剂盒中说明书进行操作，每孔加入不同浓度的标准品或上清液（100μl/孔），反应结束后，使用酶标仪在波长450nm处测量OD值，根据制作的标准曲线计算出培养基上清中TNF-α和IL-6的含量。大致步骤如下：（1）事先准备好所需要的试剂、标准品、微孔板从4℃冰箱中取出平衡至室温。（2）设立8个标准孔，每孔加入样品稀释液50μl，并将待测样品和不同浓度的标准品各50μl加入微孔内，用封口膜封住反应孔，室温孵育2h。（3）弃去板内液体，洗涤液清洗3次，每孔加入100μl酶标检测抗体，室温孵育2h。（4）加入洗涤液重复清洗各孔。（5）每孔内加入100μl显色液，室温避光孵育30min。（6）加入100μl终止液终止反应，使用酶标仪在450nm处检测吸光值，制作标准曲线并根据标准曲线计算样品浓度。2.9实验动物分组及给药方法8周龄SPF级db/db小鼠20只及db/m小鼠5只，分成5组，分别为空白对照组（db/m19 组）5只、糖尿病组（db/db组）5只、姜黄素给药组（curcumin组，5mg/kg）5只、H8低剂量给药组（H8-l组，5mg/kg）5只、H8高剂量给药组（H8-h组，10mg/kg）5只，治疗组每日上午固定时间给予姜黄素及其类似物H8灌胃，对照组及糖尿病组给予相同剂量的1%CMC（羧甲基纤维素钠）溶液，连续给药8周。实验用小鼠在SPF级动物房中饲养，使用的饲养笼、食物、饮用水都经过灭菌消毒，遵循无菌操作。小鼠自由进食、进水，每周换一次垫料。3.Morris水迷宫测试第8周末进行Morris水迷宫测试，实验分定位航行实验和探索实验两部分，实验前1天将所有小鼠进行适应性游泳2分钟（水温22-24℃），使其熟悉周围环境。之后实验连续进行5天，测试固定在上午9时开始，将水池分为四个象限，平台放置在第三限中心水面下1cm，分别以另外3个象限池壁中点作为入水点，将小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠从入水至找到平台的时间记录为逃避潜伏期（escapelatency），若60秒内未找到平台，将其引至平台学习10秒，逃避潜伏期记录为60秒。每只小鼠每日进行4次训练，同一次训练，每只鼠入水方向一致，取每只鼠的4次的平均值作为当天成绩，此项实验反映小鼠的学习能力。第6天撤去平台，选择平台所在象限的对角象限作为入水点，记录小鼠60秒内在平台所在象限穿越平台或停留在原平台位置的次数，作为反映动物空间记忆能力的指标。整个测试过程中，保证测试环境安静、实验室内光线程度、物品摆放始终不变，排除其他干扰。3.1标本采集Morris水迷宫测试结束后，取小鼠脑组织，具体方法为：使用10%水合氯醛将小鼠经腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，在左心室进行插管，同时剪开右心耳，快速注入预冷的生理盐水，至肝脏变白后，改注入10%中性甲醛固定液，至小鼠全身僵直，切取脑组织置于4%多聚甲醛中固定24h，进行石腊包埋。包埋后取一半脑组织，进行切片，切片厚度4μm，各组大鼠于处死前称取体重及尾静脉取血测量血糖、胆固醇、甘油三脂。3.2HE染色石蜡切片后按常规HE染色步骤完成染色，于OlympusBX53显微成像系统中观察并拍摄。染色步骤如下：（1）烘片：将切片置于烘片箱中62.5℃烘片4h，至石蜡完全融化。（2）脱蜡：将石蜡切片放入染色架内，置于二甲苯溶液Ⅰ3min→二甲苯溶液Ⅱ3min→20 酒精梯度脱水100%、95%、90%、80%、70%乙醇溶液中各3min→一蒸水2min。（3）将石蜡切片放入苏木素染剂中浸泡5min，流水稍洗。（4）放入0.5%盐酸乙醇溶液中分化3s，一蒸水稍洗10s。（5）放入伊红溶液沾一下取出。（6）酒精梯度脱水：70%、80%、90%、95%、100%乙醇各3min。（7）二甲苯溶液中通透3min。（8）封片：中性树脂滴在组织上，覆盖盖玻片，赶走气泡，防止影响组织的观察。3.3免疫组化染色染色步骤如下：（1）烘片：切片置于烘片箱中62.5℃烘片4h，至石蜡完全融化。（2）脱蜡：置于二甲苯溶液Ⅰ3min→二甲苯溶液Ⅱ3min→酒精梯度脱水100%、95%、90%、80%、70%乙醇溶液中各3min→一蒸水2min（3）抗原修复：3%过氧化氢溶液中浸泡5min→一蒸水清洗→80%乙醇浸泡5min→0.01mol/L柠檬酸钠溶液中煮沸10min后冷却至室温→PBS洗一次。（4）封闭：将石蜡切片放入5%BSA溶液中37℃孵育1h。（5）一抗孵育：擦干封闭液，分别滴加TNF-α抗体（1：200）、IL-6（1:100）、IL17抗体（1:100），保证完全覆盖组织，4℃冰箱过夜。（6）二抗孵育：PBS洗片3次，5min/次，滴加辣根过氧化物标记的二抗抗兔IgG（1：3000），保证完全覆盖组织，室温孵育1h。（7）显色：PBS洗片3次，5min/次，滴加DAB显色液5min左右后镜下观察，当出现褐色小滴后终止显色。（8）酒精梯度脱水：70%、80%、90%、95%、100%乙醇各3min。（9）二甲苯溶液中通透3min。（10）中性树脂封片，镜下观察并进拍摄。（11）采用Image-Pro-Plus6.0软件计数阳性显色的平均光密度值，作为反映强度的参数。3.4统计学分析实验结果统计处理均使用SPSS20.0软件，作图采用GraphPadPrism5.0，数据结果用均数±标准误（Mean±SEM）表示，多组间比较先进行方差齐性检验，若方差齐则进行单因素方差分析（one-wayANOVA）。进行多个样本均数间的两两比较则釆用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。21 结果1.姜黄素及其类似物H8的细胞毒性检测在进行细胞实验之前，首先对姜黄素及其类似物H8的细胞毒性进行考察，实验结果见图1，与对照组（DMSO）相比，不同浓度（1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L）的H8作用于细胞24h后，细胞存活率无明显变化，说明H8在检测浓度范围内对细胞几乎无毒性（图1B）。姜黄素浓度在40μmol/L时与对照组相比细胞存活率明显下降（P<0.001）（图1A）,说明高浓度姜黄素具有一定的细胞毒性，因此本实验采用低浓度的姜黄素进行后续实验。AB图1姜黄素及其类似物H8的细胞毒性(mean±sem,n=3)注：与对照组比较：***P<0.0012.姜黄素及其类似物H8对炎症因子基因表达的影响qPCR检测结果如下：从图2A中可以看出，与对照组相比，LPS组IL-6基因表达明显增加（P<0.001）；与LPS组相比，姜黄素10μmol/L+LPS组和姜黄素20μmol/L+LPS组IL-6基因表达明显降低（P<0.001），并且20μmol/L组下降趋势更明显。与LPS组相比，H810μmol/L+LPS组、H820μmol/L+LPS组IL-6基因表达均显著下降（P<0.001）。并且发现与姜黄素20μmol/L+LPS组相比较，H820μmol/L+LPS组IL-6基因有更为显著的下降（P<0.01）。从图2B中可以看出，与对照组相比，LPS组TNF-α基因表达明显增加（P<0.001）；与LPS组相比，姜黄素10μmol/L+LPS组和姜黄素20μmol/L+LPS组TNF-α基因表达均著降低分别为（P<0.01）（P<0.001）。与LPS组22 相比，H810μmol/L+LPS组、H820μmol/L+LPS组TNF-α基因表达均显著下降（P<0.001）。并且与姜黄素20μmol/L+LPS组相比，H820μmol/L+LPS组TNF-α基因下降更明显（P<0.001）。以上实验表明姜黄素类似物H8对IL-6、TNF-α基因表达具有显著的抑制作用并且优于姜黄素。AB图2姜黄素和类似物H8对LPS诱导的单核巨噬细胞TNF-α、IL-6基因表达的影响(mean±semn=3)注：与对照组比较：***P<0.001，与LPS组比较：##P<0.01###P<0.001，姜黄素20μmol/L+LPS组与H820μmol/L+LPS组比较：▲▲P<0.01▲▲▲P<0.0013.姜黄素及其类似物H8对炎症因子蛋白表达的影响ELISA试剂盒检测结果：如图3A所示，与对照组相比，LPS组培养基上清中IL-6含量显增加（P<0.001）。与LPS组相比，姜黄素10μmol/L+LPS组、姜黄素20μmol/L+LPS组、H810μmol/L+LPS组、H820μmol/L+LPS组上清中IL-6表达均明显降低（P<0.001）。与姜黄素20μmol/L+LPS组相比H820μmol/L+LPS组上清中IL-6含量降低更明显（P<0.001）。图3B中所示：与对照组相比，LPS组上清中TNF-α表达明显增加（P<0.001）；与LPS组相比，姜黄素10μmol/L+LPS组和姜黄素20μmol/L+LPS组TNF-α基因表达均著降低分别为（P<0.05）（P<0.001）。与LPS组相比，H810μmol/L+LPS组、H820μmol/L+LPS组TNF-α基因表达均显著下降（P<0.001）。并且与姜黄素20μmol/L+LPS组相比，H820μmol/L+LPS组TNF-α基因下降更明显（P<0.05）。以上实验证明了姜黄素类似物H8对LPS诱导的炎症模型IL-6、TNF-α蛋白表达具有显著的抑制作用并优于姜黄素。23 AB图3化合物H8对LPS诱导单核巨噬细胞TNF-α、IL-6表达水平的影响(mean±sem,n=3)注：与对照组相比：***P<0.001，与LPS组相比：#P<0.05###P<0.001，姜黄素20μmol/L+LPS组与H820μmol/L+LPS组相比：▲P<0.05▲▲▲P<0.0014.姜黄素及其类似物H8对糖尿病小鼠血糖血脂的影响在实验过程中可以发现，糖尿病组小鼠的一般状态较差，毛色灰暗，多饮多食多尿的症状比较严重。H8组的小鼠与糖尿病组相比一般状态明显较好。各组小鼠在处死前进行血糖、甘油三酯、胆固醇检测，结果如表1所示：与对照组相比，糖尿病组小鼠血糖明显升高（P＜0.001）；与糖尿病组相比，姜黄素组血糖无明显变化，而低剂量与高剂量H8组血糖明显下降分别为（P＜0.01）（P＜0.001）；血清中总胆固醇（TC）：显示与对照组相比，糖尿病组小鼠胆固醇（TC）水平明显升高（P＜0.001），而与其他各组血清胆固醇水平相比无统计学意义。血清总甘油三酯（TG）显示：与对照组相比糖尿病组TG水平明显升高（P＜0.05），经过姜黄素及H8治疗后甘油三酯水平均有不同程度的降低，其中以姜黄素组最为明显（P＜0.001）。以上数据表明姜黄素类似物H8对糖尿病小鼠的血糖具有明显的改善作用，而姜黄素对降低甘油三酯效果显著。表1各组小鼠GLU、TC、TG变化（mg/dL）组别GLU(mg/dL)TC(mg/dL)TG(mg/dL)对照组118.3±4.2114.1±5.383.5±2.1糖尿病组440.1±32.32▲▲▲171.2±13.1▲▲▲108.7±7.83▲姜黄素组440.1±47.3▲▲▲149.2±6.571.1±8.1***低剂量H8组234.0±22.1***###▲149.2±6.581.3±4.1*高剂量H8组196.4±24.7***###136.0±11.477.2±3.5**24 注：与对照组相比：▲P＜0.05,▲▲▲P＜0.001；对糖尿病组相比：*P＜0.05,**P＜0.01，***P＜0.001；与姜黄素组相比：###P＜0.0015.行为学测试结果各组小鼠Morris水迷宫检测结果：表2所示：第一天各组小鼠逃避潜伏期无明显差异，从第二天到第五天各组开始出现差异。与对照组相比，糖尿病组逃避潜伏期明显延长（P<0.01，P<0.001），说明糖尿病组小鼠学习记忆能力明显下降；与糖尿病组相比，Cur组及低浓度H8组逃避潜伏期均明显下降（P<0.05），高浓度H8组在第四天及第五天有更明显的下降（P<0.01），表明经过姜黄素及H8治疗后小鼠的学习记忆能力得到改善，其中高浓度H8组更加明显。空间探索实验（图4A、4B），与对照组相比，糖尿病组小鼠穿越平台的次数明显减少（P<0.001），小鼠的游泳轨迹多无目的性，且多在迷宫边缘，表明小鼠的学习记忆能力受损；与糖尿病组相比，高浓度H8组小鼠穿越平台次数明显增加（P<0.05），并且小鼠的游泳轨迹具有一定的目的趋向性，说明小鼠的学习记忆能力得到改善。表2Morris水迷定位航行试验各组小鼠逃避潜伏期（mean±sem）逃避潜伏期（s）组别第一天第二天第三天第四天第五天对照组49.76±4.3239.14±3.1332.65±3.1922.95±2.9620.64±2.63糖尿病组54.47±3.5249.94±4.09**43.40±2.53***39.17±2.24***34.38±2.15***姜黄素组53.17±3.5245.23±2.31*38.74±2.10*#33.83±3.81**#28.81±1.97**#低浓度H8组53.17±4.0345.61±2.82*38.69±1.56*#33.47±1.11**#28.53±1.83**#高浓度H8组52.41±3.7243.36±2.43#37.96±2.39*#28.50±2.66*##24.95±2.87*##注：与对照组相比：*P<0.05**P<0.01***P<0.001，与糖尿病组相比：#P<0.05##P<0.0125 图4A第6天撤去平台后各组小鼠图4B各组小鼠穿越平台次数注：与对照组相比：***P<0.001，与糖尿病组相比：#P<0.05游泳轨迹6.姜黄素及H8对db/db小鼠脑组织IL-6、TNF-α、IL-17表达的影响各组小鼠脑组织免疫组化染色结果：从图5、6中可以看出，与对照组相比，糖尿病组小鼠脑组织IL-6、TNF-α、IL-17表达水平均明显增加（P<0.001）；与糖尿病组相比，姜黄素组（5mg/kg）、高剂量H8组（10mg/kg）小鼠脑组织IL-6、TNF-α、IL-17表达水平均明显下降分别为（P<0.05、P<0.01）；与糖尿病组相比，低剂量H8组（5mg/kg）IL-6、TNF-α表达水平均明显下降，而IL-17无明显变化。ABC图5各实验分组小鼠脑组织免疫组化染色（IHC×200）注：A.IL-6免疫组化；B.IL-17免疫组化；C.TNF-α免疫组化；26 图6各组小鼠脑IL-6、TNF-α、IL-17平均光密度值注：与对照组相比：***P<0.001，与糖尿病组相比：#P<0.05##P<0.017.HE染色正常对照组小鼠海马CA1区神经细胞形态正常排列整齐、致密、胞质着色均匀、核仁清晰、胞体呈圆形（图7A）。糖尿病组小鼠CA1区神经细胞密度较正常组明显下降，细胞排列疏松、紊乱、胞核固缩、深染、核仁不清（图7B）；姜黄素组（图7C）及低剂量H8组（图7D）上述病理学改变较糖尿病组减轻，但无明显差异；高剂量H8组（图7E）小鼠脑组织病理形态明显得到改善，细胞密度较糖尿病组相比明显增加，细胞形态趋于正常，细胞排列较整齐。27 图7姜黄素及其类似物H8对糖尿病小鼠海马CA1区形态的影响（HE，×200）注：A.正常对照组；B.糖尿病组；C.姜黄素组；D.低剂量H8组；E.高剂量H8组28 讨论糖尿病中枢神经系统并发症是以脑组织退行性病理改变为主要特点，以学习、记忆、认知功能明显受损为主要临床表现，被称为糖尿病脑病（DE）。DE的具体发病机制不明，其中所涉及的机制可能与高血糖、高血压、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、氧化应激、神经元损伤、胰岛素信号通路受损有关，此外大量研究表明神经炎症与糖尿病脑病认知功能损伤密切相关。炎症反应是指机体为应对外来生物刺激所引起的一种生理性防御反应，研究表明炎症是许多慢性疾病（如：糖尿病、癌症、心血管疾病、关节炎、肥胖、自身免疫疾病等）进展的主要原因。当致炎因子进入机体时，体内的单核-巨噬细胞等免疫细胞被激活，同时会分泌多种内源性生物活性物质，如白三烯、前列腺素、一氧化氮、组织胺等，导致血管通透性增加，炎症细胞渗出、吞噬和趋化，从而诱导炎症的发生[56]。近年来寻找安全、有效的新型抗炎药物已经成为人们研究的热点。炎症反应可由多种因素引起，其中细菌脂多糖（LPS）为最常见的致炎因子，它可以剌激体内单核巨噬细胞合成和释放多种炎性介质如TNF-α、IL-6等，它们可以触发瀑布式炎症级联反应，进一步激活炎症细胞，诱导炎症反应发生[57]。GUIMAR[58]等通过实验证明了姜黄素能够抑制脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子TNF-α和IL-6释放并呈剂量依赖性。本实验首先以脂多糖（LPS）诱导小鼠单核巨噬细胞建立体外炎症模型，探究姜黄素及其类似物H8对炎性细胞因子TNF-α、IL-6表达的影响，结果发现使用姜黄素及H8作用于炎症细胞模型后都能明显降低炎症因子TNF-α和IL-6基因和蛋白的表达，并且相同浓度的姜黄素组和H8组相比，H8组表现出更强的抗炎作用。此外，本实验前期通过HPLC法证明了姜黄素类似物H8的稳定性优于姜黄素，并且发现高浓度的姜黄素具有一定的细胞毒性，而相同浓度下H8并未发现明显的细胞毒性。因此说明，姜黄素类似物H8具有良好的稳定性及安全性，并能有效抑制炎性因子表达，发挥抗炎作用，但其中的具体作用机制尚需进一步研究。一些学者提出炎症反应与糖尿病脑病之间有着密不可分的关系，研究证据表明糖尿病和AD之间的炎症通路是被激活的[45]。由于糖尿病脑病与AD病理改变相似，有学者推测可以通过抗炎治疗改善AD患者的认知功能[59,60]。因此，在接下来的实验中进一步观察姜黄素及其类似物对糖尿病小鼠脑中炎症因子表达的变化及对其认知功能的影响。29 糖尿病时小胶质细胞被激活，活化的小胶质细胞能释放过量的促进炎细胞因子及细胞毒性物质，导致细胞死亡，进而加重炎症反应[12,61]，此外促炎介质表达增加可诱导一氧化氮合酶、晚期糖基化终产物、NF-κB受体上调，加重血管炎症反应，损害认知功能。过度的炎症反应还可增加氧化应激水平，进而导致神经细胞凋亡，最终导致认知功能受损。DinelA.L.等以db/db小鼠作为2型糖尿病模型，发现小鼠的空间识别记忆能力受损，可能与海马中促炎细胞因子（IL-1β，TNF和IL-6）表达增加及BDNF表达减少有关[8]。李新玲[47]等通过实验研究发现，2型糖尿病伴有认知功能障碍患者血清中TNF-α、IL-6水平均高于糖尿病非认知功能障碍患者组及正常对照组，且2型糖尿病患者的MoCA评分与TNF-α、IL-6水平呈负相关，提示炎症反应与2型糖尿病患认知功能障碍有密切联系。本实验中db/db小鼠的血糖一直维持在较高水平，甘油三酯及胆固醇水平较正常组也明显升高，同时具有多饮多食多尿的症状，毛色灰暗，一般状态较差，证明糖尿病小鼠模型是成功的，同时通过水迷宫实验发现与对照组小鼠相比，糖尿病小鼠逃避潜伏期明显延长，游泳轨迹混乱无规则，穿越平台次数减少，说明糖尿病小鼠的学习记忆功能明显受损。经过HE染色显示糖尿病小鼠脑组织海马CA1区神经细胞排列紊乱、疏松、神经细胞密度减少，细胞核固缩。免疫组化染色发现糖尿病小鼠脑组织中炎症因子如TNF-α、IL-6、IL-17表达明显增高。姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学活性，其中抗炎活性尤为突出[62]。但姜黄素在体内的活性偏低、水溶性差、口服后体内代谢过快、生物利用度低[15,63]，这主要是由于姜黄素结构中β-二酮结构片段的不稳定性造成的[64,65]。因此本实验室通过化学合成方法设计了姜黄素类似物H8，并在前期实验中通过HPLC法检测姜黄素降解率大约是姜黄素类似物降解率的3倍，证明姜黄素类似物具有更强的稳定性，这为进一步开发应用姜黄素奠定了基础。有研究表明2型糖尿病脑病大鼠经过姜黄素治疗后学习记忆能力明显改善，水迷宫实验逃避潜伏期明显缩短[66]。本实验结果与其相一致，经过姜黄素及其类似物H8灌胃治疗后，与糖尿病组相比，Cur组及低浓度H8组小鼠逃避潜伏期均明显下降（P<0.05）其中高浓度H8组在第四天及第五天有更明显的下降（P<0.01）；与对照组相比，经过高浓度H8灌胃治疗后的小鼠穿越平台次数也明显增加。说明姜黄素类似物H8能明显改善糖尿病小鼠的学习记忆能力。此外，经过姜黄素及其类似物H8灌胃治疗后的小鼠脑组织海马CA1区神经细胞形态得到明显改善，免疫组化染色发现经过姜黄素及H8治30 疗后小鼠脑组织中炎症因子表达明显降低。另外，本实验还发现姜黄素类似物H8对糖尿病小鼠的血糖具有明显的改善作用，而姜黄素对降低甘油三酯效果显著。近年来关于糖尿病的相关并发症的研究已引起人们的重视。糖尿病脑病的发生发展有多因素参与，病理过程复杂，到目前为止发病机制也未完全阐明，治疗上更是缺乏安全有效的药物，本实验通过观察姜黄素及其类似物H8对糖尿病小鼠认知功能及脑中炎症因子的影响，证实了姜黄素类似物H8具有稳定的性质并且能有效抑制炎症反应，改善小鼠学习记忆能力，缓解糖尿病认知功能障碍。但其具体作用机制还需进一步研究。由于化合物H8具有结构稳定、安全性高，抗炎效果好等优点，因此姜黄素类似物H8具有很好的开发前景，它可能会为糖尿病脑病的研究带来新的进展，治疗提供新的思路。31 结论1.高浓度姜黄素具有一定的细胞毒性，而姜黄素类似物H8在实验浓度范围内几乎无细胞毒性，表明姜黄素类似物H8的安全性较好；2.姜黄素及其类似物H8都能够抑制脂多糖诱导的炎症因子表达发挥抗炎作用，其中H8的抗炎效果更为明显；3.姜黄素类似物H8对糖尿病小鼠的血糖具有明显的改善作用，而姜黄素能够降低糖尿病小鼠的甘油三酯水平，发挥降脂作用；4.经过高剂量H8治疗后，糖尿病小鼠海马C1A区病理形态得到明显改善，表明姜黄素类似物H8能够逆转糖尿病造成的脑损伤，发挥脑保护作用；5.姜黄素及其类似物H8都能够抑制糖尿病小鼠脑组织炎症因子IL-6、TNF-α、IL-17表达表达，改善糖尿病小鼠的认知功能，其中高浓度H8作用更明显。32 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英文缩写英文缩写英文全称中文全称ADAlzheimer'sdisease阿尔茨海默病BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白BCABicinchoninicacid二金鸡纳酸DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜FBSFetalbovineserum胎牛血清HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶ODOpticalDensity光密度值PBSPhosphatebuffersolution磷酸盐缓冲液ROSReactiveOxygenSpecies活性氧簇DMDiabetesMellitlls糖尿病ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验TNF-αtumornecrosisfactoralpha肿瘤坏死因子αAPPacutephaseprotein淀粉样前体蛋白Aβamyloidbetaβ淀粉蛋白IL-6interleukin-6白细胞介素-6IL-10interleukin-10白细胞介素-10NF-κBnuclearfactorkappaB核因子κBNOnitricoxide一氧化氮DEdiabeticencephalopathy糖尿病脑病37 IDEinsulin-degradingenzyme胰岛素降解酶AGEsadvancedglycationend-products晚期糖基化末端产物慢性持续性全身低度慢性LGCIlow-gradechronicinflammation炎症IGF-1insulin-likeGrowthFactor胰岛素样生长因子-1RNSreactivenitrogenspecise活性氮38 致谢转眼间三年的硕士研究生生活就要结束，在这三年的学习和生活中，我得到了许多来自老师们、同学们、家人的关怀与帮助，在此向你们表示我最诚挚的感谢。首先要衷心的感谢我的两位老师郭艳芹教授和袁晓环教授，感谢你们不厌其烦的精心指导与帮助。本研课题的选择、设计、实施以及论文撰写都凝结着你们的心血与汗水。感谢导师三年来对我学习、工作、以及生活上的无微不至的关怀与帮助，从导师那里我不仅学到了丰富的知识，更学会了做科研的方法与态度。在此向这两位老师表示我最衷心的感谢！同时特别感谢朱梅教授给予的许多有益的指导和帮助。感谢牡丹江医学院医药研究中心所有老师在实验过程中给予我耐心的指导和帮助，感谢实验室的同学们给予我的关心和照顾，同时特别感谢李鲁新同学给予我实验方面的指导与无私帮助。感谢所有在这里未提及但曾经帮助给我的老师以及同学们。最后要感谢我的家人,对我的支持,使我顺利完成三年的研究生学业。39 攻读学位期间发表的学术成果1.李超,朱梅,毕鹏翔.姜黄素治疗阿尔茨海默病的作用机理及研究进展[J].中华临床医师杂志(电子版),1-3.2.李超,毕鹏翔,董妍,雷佳宇,袁晓环,郭艳芹.姜黄素类似物对Aβ25-35诱导的AD细胞模型细胞凋亡的影响[J].中国现代医生,2017,(10):1-4.40