通心络对缺氧预适应小鼠脑组织细胞凋亡因子表达的影响

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中国病理生理杂志ChineseJournalofPathophysiology2010，26(9)：1713—1717·17l3·[文章编号】1000—4718(2010)09—1713—05通心络对缺氧预适应小鼠脑组织细胞凋亡因子表达的影响吴相春，来静，李爱然，贾振华，王洪涛(河北医科大学中西医结合教研室，河北石家庄050017；河北中西医结合医药研究院络病研究室，河北石家庄050035；’石家庄市第三医院急诊科，河北石家庄050017)[摘要]目的：观察缺氧预适应小鼠脑组织细胞凋亡因子表达的变化以及通心络的干预作用。方法：将小鼠随机分为预适应组(对照组)与通心络组2组，通心络组按1．52g生药·kg～·d～，灌胃给药，5d后进行实验。2组动物分别进行0次(H。)、1次(H)、3次(H，)、5次()重复缺氧暴露，小鼠置于低氧密闭罐中，通过小鼠呼吸消耗罐内氧造成罐内低氧，以小鼠出现喘呼吸为低氧耐受极限，然后将小鼠转到另一低氧密闭罐中，依此类推，连续进行5次低氧。观察它们的缺氧耐受时问，以及脑组织缺氧诱导因子1(HIF—lot)、B细胞白血病／淋巴瘤相关抗原相关x蛋白(Bax)、B细胞白血病／淋巴瘤相关抗原2(Bcl一2)蛋白的表达。结果：随着缺氧次数的增加，对照组与通心络组缺氧耐受时间均依次增强，HIF一1ot、Bcl一2蛋白表达逐渐增强(P<0．01或P<0．05)；Bax蛋白在1次缺氧时明显增加，后逐渐降低(P<0．O1或P<0．05)。与对照组比较，通心络组各次缺氧时间增长，HIF一10【、Bcl一2蛋白表达增强，Bax蛋白表达下降(P<0．01或P<0．05)。结论：缺氧预适应具有强大的自适应能力，HIF—lot、Bcl一2蛋白表达增强和Bax表达下降可能是缺氧预适应小鼠缺氧自适应的机制之一。通心络能够明显增强机体的自适应能力，提高小鼠对急性缺氧的耐受性。[关键词]缺氧预适应；通心络；缺氧耐受；缺氧诱导因子一1；蛋白质Bax；蛋白质Bcl一2[中图分类号]R743[文献标识码]Adoi：10．3969／j．issn．1000—4718．2010．09．O11EfectsofTongxinluoonexpressionofapoptoticfactorsincerebraltissuesofhypoxieprec0nditionedmiceWUXiang—chun一，LAIJing，LIAi—ran，JIAZhen—hua，WANGHong—tao(DepartmentofIntegrativeTraditionalandWesternMedicine，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050017，China；ResearchDepartmentofCollateralDiseases，HebeiAcademyofIntegratedTraditionalandWesternMedicine，Sh~iazhuang050035，China；DepartmentofEmergency，TheThirdHospitalofShijiazhuangCity，Shijiazhuang050017，China．E—mail：wxc2222@163．com)[ABSTRACT]AIM：ToobservetheeffectsofTongxinluo(TXL)，aChinesemedicine，onhypoxictoleranceandexpressionofBcl—associatedX(Bax)andB—cellleukemia／lymphoma2(Bcl一2)inhypoxia—preconditionedmice．METHODS：Themicewererandomlydividedintogroupsofhypoxiapreconditioningwithout(controlgroup)orwithTXLtreatment(TXLgroup)．rI’}lemiceinTXLgroupwereadministeredwithTXLatdoseof1．52g·kg～·dcrudedrugfor5days．Themousewasexposedtonormoxia(0run，H0)andacuterepetitivehypoxiafor1—5runs(Hl—H5)byplacingtheanimalinanair—sealedjar．Thehypoxieenvironmentwasestablishedinthejarthroughconsumptionoftheoxygenbytherespirationofthemouse．Agaspbreathwasregardedasthehypoxictolerantlimitofthemouseandtheanimalwasthentransferredtoanothernewjar．Themousewasexposedtohypoxiainthiswayfor5times．Ineachrunofhypoxicexposure，thetimeofhypoxietolerancewasmeasured．Westernblottingwasusedtomeasuretheproteinlevelsofhypoxiainduciblefactor—lot(HIF—lot)，BaxandBcl一2inthecerebralcortex．RESULTS：ThehypoxietolerancetimeincontrolandTXLgroupswasgraduallyincreasedrunby]fun(P<0．OlorP<0．05)．TheproteinlevelsofHIF—lotandBel一2inthetwogroupsweregraduallyincreased(P<0．01orP<0．05)．BaxincontrolandTXLgroupswassignificantlyincreasedinH1．AfterH1，Baxwasdecreasedrunbyrun(P<0．O1orP<0．05)．Comparedwithcontrolgroup，thetolerancetime，[收稿日期]2010—01—22[修回日期]2010—04—22[基金项目]国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(No．2005CB523301)△通讯作者Tel：0311—85901553；E—mail：wxe2222@163．corn theexpressionofHIF一1andBcl一2inthecerebralcortexinTXLgroupwereincreasedinHl，H3andH5．However，theexpressionofBaxWflSlowerthanthatincontrolgroupineveryrtln．CONCLUSION：Hypoxiapreconditioningmakestheorganismproduceastrongadaptiveresponse．TheincreaseinBcl一2andthedecreaseinBaxmaybeinvolvedinthemech-anismofadaptation．TXLobviouslyincreasestheadaptiveabilityofthemicetohypoxia．[KEYWORDS]Hypoxicpreconditioning；Tongxinluo；Hypoxietolerance；Hypoxia—induciblefactor一1；Pro—teinBax；ProteinBcl一2低氧或缺氧是心、肺、脑血管病等常见病患者的气、经过标定的约120mL广口瓶内，以橡皮塞密封、基本病理过程。预适应是生物界中普遍存在的生物计时，一旦动物出现喘呼吸时(小鼠在缺氧末期出现自我保护机能，缺氧预适应具有强大的保护和防御紫绀，翻正反射消失，痉挛样动作和喘呼吸，喘呼吸作用，效果极其肯定，但确切机制仍不明确。既往研后即呼吸停止)立即取出，并随即转移到另一容积相究证实通心络具有明显的保护血管和神经的作用，似、含有新鲜空气的广口瓶内密闭、记时，如此重复5但确切机制仍不明确。细胞凋亡是机体维持细胞群次。各次换瓶从密闭开始到喘呼吸出现的时间为体数量稳态的重要手段，细胞凋亡失调是心脑血管“原始耐受时间”，以min为单位。疾病的重要发病机制。本研究观察缺氧预适应小鼠2．4取材方法缺氧实验结束后，动物立即断头取自身凋亡机制的变化以及通心络的干预作用并对其血，即刻取脑并于液氮中速冻后于一80℃超低温冰机制进行探讨。箱中冻存。2．5观察指标材料和方法①标准耐受时间参照吕国蔚等的方法依下式1材料算出相当于100mL有效空气量下的“标准耐受时1．1动物标化动物雄性昆明小鼠80只，购于北间”T：原始耐受时间×Ioo／(120一小鼠体重／京大学医学部实验动物科学部，许可证号为SCXK0．94)，比较各次的耐受时间。(京)2006—0008。②Westernblotting方法检测脑组织HIF一1仅、Bax、1．2试剂及仪器缺氧诱导因子一1(hypoxiain—Bcl一2的蛋白表达从超低温冰箱中取出鼠脑，液duciblefactor一10【，HIF一1)抗体，购自Abcam；B氮中迅速研磨，加适量裂解液冰上裂解30rain，细胞白血病／淋巴瘤相关抗原相关x蛋白(Bcl—as—12000×g离心30min，取上清液分装利用BCAsociatedX，Bax)、B细胞白血病／淋巴瘤相关抗原2法进行总蛋白定量。加2×上样缓冲液配制样本，(B—cellleukemia／lymphoma2，Bcl一2)抗体，购自100℃加热10rain变性，从上述各组样品中分别SantaCruz；120mL广口瓶120个；秒表20个；橡胶120g的蛋白上样，用12％的SDS一聚丙烯酰胺凝塞60个。胶电泳。电泳结束后，用电转印仪将凝胶中的蛋白1．3药物通心络超微粉，为棕褐色粉末，味苦，质转印到硝酸纤维素膜上。将转印后的膜依次与I1．46g生药／g干粉，石家庄以岭药业有限公司提供。抗(抗HIF一1单克隆抗体，1：1000稀释；Bax抗2方法体、Bcl一2抗体1：200稀释)和Ⅱ抗(与辣根过氧化2．1动物分组按体重随机分为缺氧预适应组(以物酶标记的山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG，北京中山生下简称对照组)和通心络组，每组4O只。每组小鼠物技术有限公司，1：10000稀释)；孵育，化学发光显分别进行重复缺氧暴露0次(H。)，缺氧1次(H。)，影(化学发光检测试剂盒，ThermoScientific产品)。缺氧3次(H)，缺氧5次(H)。实验结果采用QuantityOne软件分析，扫描灰度值，2．2给药剂量及方法根据通心络超微粉提高小以目的蛋白与内参照p—actin的比值表示。鼠缺氧耐受性的时效、量效关系实验研究结果⋯，确3统计学处理定通心络组剂量为1．52g生药·kg～·d～，用数据用均数±标准差(±s)表示。采用SPSS0．5％羧甲基纤维素钠(CMC—Na)配制成浓度为：13．0统计软件包，组间比较采用t检验，组内比较采0．152kg生药几混悬液，按0．1mL／10g动物体重用配对t检验。灌胃。空白对照组，按0．1mL／10g动物体重用结果0．5％CMC—Na溶液灌胃。于实验前5d开始给药，末次给药1h后实验，实验周期为5d。12组小鼠缺氧标准耐受时间的变化2．3缺氧预适应方法参照吕国蔚等的方法，在与第1次缺氧比较，2组小鼠随着缺氧次数的增室温18—22o【=下，将小鼠称质量后放入含有新鲜空加，缺氧耐受时间明显增加(P<0．01或P<0．05)。 与对照组比较，通心络组各次的缺氧耐受时间明显增显增加(P<0．0l或P<0．05)。与对照组比较，通心加，差异显著(P<0．01或P<0．05)，见表l。络组各次缺氧HIF一1d表达更加明显，差异显著(P<0．01或P<0．05)。提示通心络组较对照组提前表1各组小鼠缺氧耐受时间的变化刺激机体表达HIF一1Ot；能够明显增加缺氧预适应Table1．Hypoxictolerancetimeofmiceintwogroups(min．±s．n=l0)小鼠HIF一1的表达，见图1。32组小鼠Bax的表达变化缺氧前小鼠脑组织有少量Bax表达，2组之问无明显差异。通心络组缺氧1次和3次，对照组缺氧1槲P<0．0lHlinthesanlegroup；△P<0．05H3inthe次、3次和5次Bax表达均比缺氧前增强，而2组缺samegroup；P<0．05．”P<0．Olcontrolgroupatthesame氧3次和缺氧5次，较缺氧1次明显减少，差异显著hypoxiaexposuretimes．Hl：hypoxiaexposureonce；H3：hypoxia(P<0．01或P<0．05)。与对照组比较，通心络组各exposure3times；H5：hypoxiaexposure5times；controlgroup：次缺氧小鼠Bax表达明显减弱，差异显著(P<0．01hypoxiapreconditioninggroup．TXL：Tongxinluo(aChinese或P<0．05)。通心络组5次缺氧时Bax表达与缺氧medicine)group．前比较无明显差异(P>0．05)，见图2。22组小鼠HIF—let表达的变化42组小鼠Bcl一2表达变化2组小鼠在缺氧前脑组织有极少量HIF一1仪表2组小鼠在缺氧前脑组织有少量Bcl一2表达，达，2组之间无明显差异(P>0．05)；随缺氧次数增通心络组Bcl一2表达高于对照组(P<0．05)；随着加，HIF一10【表达逐渐增强。与缺氧前比较，对照组缺氧次数增加，2组Bcl一2表达均逐渐增强，差异显缺氧1次有增加，但无明显差异；缺氧3次、缺氧5次著(P<0．01或P<0．05)。与对照组比较，通心络组明显增加，差异显著(P<0．01或P<0．05)。通心络各次缺氧Bcl一2表达更加明显，差异显著(P<0．01组，缺氧1次、3次、5次HIF—l0【表达均比缺氧前明或P<0．05)，见图3。I．21．0———蝴HI0．80．6一●—●■—●●—l13-actinz04．0-2HlH3H5H”HHHOITXI．OHH．H，HControlHypoxiarunFigure1．TheexpressionofHIF—lotincerebraltissuesbyWesternblotting．露．4-s．n=3．P<0．05，P<0．01H0inthesamegroup；P<0．05，”P<0．0lVScontrolgroupatthesamehypoxiaexposuretimes．H0：nohypoxiaexposure；HI：hypoxiaexposureonce；H3：hypoxiaexposure3times；H5：hypoxiaexposure5times．control：hypoxiapreconditioninggroup．TXL：Tongxinluo(aChinesemedicine)group．图1脑组织HIF—let表达的变化1．41．21．O舀0．8∞060．4O．20．0ControlTXLl{I，HlHHsHypoxialainFigure2．TheexpressionofBaxincerebraltissueofmicebyWesternblotting．±s．n=3．’P<0．05，”P<0．01H0inthesamegroup；P<0．05，P<0．0lHlinthesamegroup；P<0．05controlgroupatthesamehypoxiaexposuretimes．H0：nohypoxiaexposure；Hl：hypoxiaexposureonce；H3：hypoxiaexposure3times；H5：hypoxiaexposure5times，control：hypoxiapreconditioninggroup．TXL：Tongxinluo(aChinesemedicine)group．图2脑组织Bax表达的变化比较 1．41．21．0Bcl一20．80．6—■●●——●—■}●一3-actin0．4HH．HHHH。HH0．2O．OcontrolTXLHypoxiarunFigure3．TheexpressionofBel一2incerebraltissuesofmicebyWesternblotting．±s．凡=3．’P<0．05，P<0．01sH0inthesalnegroup；P<0．05，P<0．01HJinthesamegroup；P<0．05controlgroupatthesamehypoxiaexposuretimes．H0：nohypoxiaexposure；I4l：hypoxiaexposureonce；143：hypoxiaexposure3times；145：hypoxiaexposure5times．control：hypoxiapreconditioninggroup．TXL：Tongxinluo(aChinesemedicine)group．图3脑组织Bd一2表达的变化比较调节的靶基因(促红细胞生成素、VEGF等)的正面讨论作用所取代。内源性VEGF可以上调凋亡相关基因适应是机体在内外环境的变化中，通过改变自Bcl一2表达，防止毛细血管内皮细胞凋亡，对缺血脑身的机能、形态和结构以适应其变化，从而更好地生组织可能具有神经保护作用。缺氧预适应可以增强存下去。小鼠的缺氧耐受时间随缺氧暴露次数增加Bcl一2和降低caspase一3的表达。缺氧预适应可而显著延长J。动物整体缺氧耐受时间是衡量缺氧以通过稳定线粒体膜电位、升高Bcl一2和VEGF，促耐受的一个重要指标J。本研究结果显示，随着缺进ERK和AKT磷酸化，抑制间质干细胞凋亡而对心氧次数的增加，小鼠耐受缺氧的时间逐次增加。与肌起保护作用io]。本研究结果显示：随着缺氧次数对照组比较，通心络干预后，小鼠的耐缺氧时间明显的增加脑组织Bcl一2蛋白表达逐次增强，Bax蛋白增加。提示机体对缺氧等刺激具有强大的耐受能在1次缺氧时明显增强，在3次、5次缺氧时逐渐降力，缺氧预适应小鼠通过自身适应机制可以提高机低，提示机体具有自我调节能力。而与对照组比较，体的缺氧耐受性，而通心络能够提高缺氧预适应小通心络组各次缺氧脑组织Bcl一2蛋白表达增加，Bax鼠的自适应能力，提高缺氧预适应小鼠的缺氧耐受下降，提示通心络能够提高机体抗凋亡的作用。性。既往多项研究证实通心络对血管内皮细胞、神目前，人类对缺氧所触发的机体许多适应和不经元具有保护作用，而内皮细胞的保护对于心脑血适应的系统反应认识还很少J。1991年首次发现管疾病的防治具有重要意义。本研究结果提示机体HIF一1，作为诱导低氧反应基因和修复细胞氧内环通过激发自身的调节机制，抑制促凋亡因子的产生，境稳定的核心调节因子及其所诱导的一系列低氧反促进抗凋亡因子的表达，使机体逐渐达到自身的平应效应基因或靶基因的表达，研究发现HIF一1可以衡稳态。通心络能够明显增强缺氧预适应小鼠脑组诱导下游靶基因如血管内皮生长因子(VEGF)、Bcl织抗凋亡因子的表达，抑制缺氧预适应小鼠脑组织一2等的转录，从而产生一系列代偿反应，促进细胞促凋亡因子的表达，调节细胞凋亡失调的状态而达的生长和代谢j。缺氧诱导HIF一1高表达可显著到相对平衡状态，从而参与脑保护机制。提示通心减轻缺氧时HepG2细胞的损伤程度j。本研究结果络能通过提高机体的自调节作用，而提高机体自适显示：随着缺氧次数的增加，脑组织HIF一1Ot蛋白表应能力。通心络具有益气活血、通络止痛的功效，方达逐次增强。提示缺氧预适应小鼠通过自身的调中含有人参、全蝎、蜈蚣、水蛭、土鳖虫、蝉蜕、赤芍、节，逐渐达到自身的平衡稳态。而与对照组比较，通冰片等药物，现代药理研究证实通心络组方中的主心络组较对照组能够提前刺激机体表达HIF一1Ot，要药物均具有不同程度抗缺氧作用，人参总皂苷可能够明显增加缺氧预适应小鼠各次缺氧HIF一1的以显著增强小鼠大脑皮质HIF一1蛋白表达水平，表达，表明通心络具有提高机体自调节能力的作用。减轻小鼠大脑皮质的损伤程度，具有显著的保护作Baranova等l8J研究证实，在缺氧缺血急性期HIF用¨。人参皂苷Rbl能够减轻缺氧诱导的细胞损一1可促进细胞凋亡，但随后这种损伤作用就被其害和海马神经元损伤程度12]。水蛭提取物有明显抑 ·l7l7·]1=]]]]]制缺氧诱导的新生大鼠大脑皮层神经细胞凋亡的作[7]蒋春华，罗勇军，黄庆愿，等．缺氧诱导因子一la基因用，对大脑皮层神经细胞的缺氧性损伤具有明显的转染对缺氧损伤HepG2细胞的保护作用[J]．中国病保护作用l】。冰片能够透过血脑屏障，作为引药能理生理杂志，2010，26(1)：1—6．[8]Baranova0，MirandaLF，PichiuleP，eta1．Neuron—明显加强川芎嗪的抗急性缺氧作用¨。通心络显著specificinactivationofthehypoxiainduciblefactorhxin—的抗缺氧能力可能是方中药物综合作用的体现，为creasesbraininjuryinamousemodeloftransientfocal临床心脑血管疾病的治疗提供了实验依据。cerebralischemia[J]．JNeurosci，2007，27(23)：6320[参考文献】—6332．[9]张颜波，吕国蔚，杨明峰，等．低氧预适应小鼠皮层吴相春，来静，吴以岭，等．通心络超微粉提高小鼠Bcl一2和caspase一3的表达变化[J]．生理学报，缺氧耐受性的时效、量效研究[J]．辽宁中医杂志，2008，60(2)：249—253．2009。36(11)：1986—1987．[10]WangJA，ChenTL，JiangJ，eta1．Hypexicprecondition—吕国蔚，史美棠，李凌．急性重复缺氧对小鼠缺氧ingattenuateshypoxia／reoxygenation—inducedapoptosis耐受性的影响及其机制的初步探讨[J]．中国病理生inmesenchymalstemcells[J]．ActaPharmacolSin，理杂志，1992，8(4)：425—429．2008，29(1)：74—82．谢胜男，李昕，李尧华，等．急性重复低氧对小鼠脑[11]王万银，沈慧，赵敏，等．人参总皂苷对缺氧小鼠组织血氧饱和度、线粒体功能以及ATP水平的影响脑皮质HIF表达影响[J]．中国公共卫生，2008，24[J]．中国病理生理杂志，2008，24(4)：755—758．(6)：711—712．ZhangSXL，MillerJJ，GozalD，eta1．Wholebodyhy-poxicpreconditioningprotectsmiceagainstacutehypoxia[12]柯荔宁，王玮，赵小贞，等．人参皂苷Rbl抗SD大鼠海马神经元的缺氧损伤作用[J]．山西医科大学学byimprovinglungfunction[J]．JApplPhysiol，2004，96(1)：392—397．报，2009，40(8)：688—692．GrocottMP，MartinDS，LevettDZ，eta1．Arterialblood[13]林明宝，黄湘，张进．水蛭提取物对体外培养大gasesandoxygencontentinclimbersonMountEverest鼠大脑皮层神经细胞缺氧性凋亡的影响[J]．华西药[J]．NEnslJMed，2009，360(2)：140—149．学杂志，2008，23(5)：543—545．PowellFL，FuZ．HIF一1andventilatoryacclimatization[14]王晖．冰片加强川芎嗪抗小鼠急性缺氧作用[J]．tochronichypoxia[J]．RespirPhysiolNeurobiol，2008，中药药理与临床，2006，16(4)：13—15．164(1—2)：282—287．黄苓甙在吸烟致炎模型中能通过抑制NF—KB减弱炎症反应黄苓甙是植物黄苓根中的提取物。许多研究显示黄苓甙有抗炎、抗菌、抗病毒活性。将大鼠暴露在香烟的烟雾(cigarettesmoke，cs)中建立慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)模型，36只sD大鼠随机分为对照，cs，地塞米松，黄苓甙(20mg／kg，40mg／kg，80mg／kg)6个实验组，观察肺组织的病理学变化以及计数支气管肺灌洗液内的白细胞，并通过动物体积描记器测量肺功能。用ELISA测定细胞因子的含量，用免疫组化检测NF—KBp65蛋白的表达水平。实验结果显示：CS暴露组胞浆和支气管灌洗液中的IL一8、IL一6、TNF一(表达均显著增加，NF—KBp65表达增强。黄苓甙治疗后显著减弱cs的致炎效应。通过用香烟提取物刺激II型肺泡细胞建立细胞模型，将II型肺泡细胞也分为对照，CS，PDTC组，黄苓甙组(5(tool，10(mol，20(too1)6组。用ELISA测定细胞因子水平，用蛋白印迹实验检测IKB的表达和p65的磷酸化作用，用EMSA检测NF—KB与DNA的结合活性。结果显示cS导致IL一8、IL一6和TNF一(的表达与NF—KB激活。黄苓甙对cs的促炎作用呈现剂量依赖的抑制效应，对cs诱导的COPD鼠活体模型和细胞模型均有显著的抗炎作用。PulPharmTher，2010，23(5)：411—419(张芸)