《苹果抗轮纹病品种鉴定及SA诱导后抗病差异表达基因的RNA-Seq分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学博士学位论文苹果抗轮纹病品种鉴定及SA诱导后抗病差异表达基因的RNA-Seq分析ScreeninggermplasmsresistanttoappleringrotandRNA-Seqanalysistodifferentiallyexpressedgenesinducedbysalicylicacid侯珲导师姓名：王生荣教授博导（甘肃农业大学兰州730070）学科专业名称：作物保护研究方向：植物病害综合治理论文答辩日期：学位授予日期：答辩委员会主席高世铭研究员评阅人杨洪强教授张俊华教授雷东阳教授2017年6月 甘肃农业大学2017届博士学位论文苹果抗轮纹病品种鉴定及SA诱导后抗病差异表达基因的RNA-Seq分析摘要随着苹果生产中主要的栽培品种的不断变化，导致苹果轮纹病成为我国当前苹果生产上最为严重的病害之一，使苹果产业受到巨大经济损失。本研究利用人工接种苹果轮纹病菌和田间自然发病调查相结合的方法鉴定主要品种的抗病性，并对抗病品种北之幸和感病品种礼泉短富利用SA进行诱导处理，测定诱导前和诱导后以及品种间与抗性相关的一些酶活性变化。进一步通过高通量RNA-Seq测序技术，明确不同处理间与抗轮纹病相关的差异表达基因，对筛选到的差异表达基因进行验证，取得了如下研究结果:1.对中国农科院郑州果树所苹果资源圃中的190个苹果品种进行了苹果抗轮纹病品种抗病性鉴定。（1）通过人工接种苹果轮纹病菌，发现不同苹果品种在不同程度上都感染了苹果轮纹病菌，没有免疫品种，但品种间抗性存在一定的差异。通过聚类分析，高抗品种有15个，占7.89%；中抗品种有77个，占40.53%；中感品种有80个，占42.11%；而高感品种有18个，占9.47%。（2）2012年，2013年连续两年对田间种植的190个供试品种做田间自然发病调查。2012年高抗品种占大多数，中感品种只有1个品种，即礼泉短富。在调查的190个供试品种中，有164个品种的病情指数都在30以下，占调查品种总数的86.32%，但礼泉短富病情指数超过了50。2013总体的抗病趋势与2012年的基本一致，在抗病品种中早熟品种占的比例较高，感病品种大多为富士系列品种，只有北之幸、1996-1-1和秦冠3个高抗品种。2012年和2013年的调查结果中均无高感品种。通过人工接种结合田间自然发病调查筛选出在两年的调查中都表现一致稳定的高抗病性品种北之幸和感病品种礼泉短富。2.以抗病品种北之幸和感病品种礼泉短富为材料，对不同浓度SA处理的苹果叶片进行抗性相关酶活性的测定。结果表明，SA处理北之幸和礼泉短富后，均可使植株体内低水平的PAL、POD、β-1,3-葡聚糖酶和PPO活性在短时间内提高，且I 甘肃农业大学2017届博士学位论文明显高于对照植株体内的酶活性。其中抗病品种北之幸的PAL活性较对照提高了1.36-2.73倍；POD活性提高了4.74-6.19倍；β-1,3-葡聚糖酶活性提高了1.71-2.04倍；PPO活性提高了1.88-2.32倍。而感病品种礼泉短富的PAL活性提高了1.32-1.70倍，高浓度处理的PAL活性上升较慢，在第11d达到最大值；POD活性上升速度也较北之幸慢，在第11d达到最大值，较对照升高了4.11-5.68倍；β-1,3-葡聚糖酶升高了1.53-1.82倍；而PPO活性上升比较早，在第7d达到最大值，较对照上升3.13-4.00倍。表明酶活性的增加在不同品种间存在差异，从PPO活性的测定结果中可以看出，在未经SA处理的不同苹果品种中，PPO活性本身就存在一定的差异，抗病品种较感病品种PPO活性高，即在轮纹病发生的初始阶段，抗病品种就能很好的抵御病原菌的入侵。3.以抗病品种北之幸和感病品种礼泉短富为材料，对SA处理前后的苹果样品进行RNA-Seq测序，分析苹果不同品种在SA诱导过程中，同一基因型在诱导前后和不同基因型在诱导前或诱导后的差异基因表达变化，构建了SA诱导不同抗轮纹病品种过程的数字表达谱。主要结果如下:（1）对北之幸和礼泉短富SA处理前后共4个样品进行Illumina测序，共得到35.30Mreads。（2）将各样品测序得到的reads与Unigene库进行比对，共得到差异表达基因2590个，其中最大差异表达基因1382个，最小差异基因150个，共表达基因有9个，分别是：MDP0000039357、MDP0000158474、MDP0000223968、MDP0000225361、MDP0000232908、MDP0000329063、MDP0000362305、MDP0000838695和MDP0000916403，在共表达的基因中MDP0000223968、MDP0000329063和MDP0000362305参与了防御机制和应答刺激。（3）在抗病品种北之幸处理组与对照组中，差异表达基因有257个，213个上调表达，44个下调表达。在感病品种礼泉短富处理组与对照组中，差异表达基因有150个，有110个上调表达，40个下调表达。在抗病品种北之幸处理组与感病品种礼泉短富处理组中，差异表达基因有828个，有356个上调表达，472个下调表达。而在抗病品种北之幸处理组与感病品种礼泉短富未处理组中，差异表达基因数目最多，有1382个，540个上调表达，842个下调表达。从结果中可以看出，在同一品种中，SA处理前后差异表达基因中上调表达的基因数目II 甘肃农业大学2017届博士学位论文多于下调表达的基因数目，而不同品种间的差异表达基因数目则是最多，且多于同一品种处理前后的差异基因数目。（4）通过对生物信息学的注释，共获得2202条Unigene的注释结果。差异基因数目最多的是整体功能类（Generalfunctionpredictiononly），而与抗性相关的功能注释主要涉及防御机制（Defensemechanisms）、信号转导机制(Signaltransductionmechanisms)、能量产生与转导(Energyproductionandconversion)和离子转运机制(Inorganiciontransportandmetabolism)。在感病品种礼泉短富中涉及防御机制的差异基因没有注释到。（5）对差异表达基因进行GO功能注释，主要参与的分类有：代谢过程(metabolicprocess)、应答刺激(responsetostimulus)、生物学调控(biologicalregulation)、免疫系统过程(immunesystemprocess)和抗氧化活性(antioxidantactivity)。感病品种礼泉短富参与的显著性功能GO分类种类少于抗病品种北之幸，且涉及到的差异表达基因数量也少于北之幸的。（6）对4个样品可能涉及或参与的代谢通路进行分析，结果显示，经SA诱导处理后，不同品种间本身存在的差异表达基因数量明显减少，但参与的显著性功能GO分类和代谢通路数量变化不大，且涉及的范围大致相同。主要涉及或参与的抗病相关代谢通路有：过氧化物酶体途径(Peroxisome，ko04146)、苯丙烷生物合成途径(Phenylpropanoidbiosynthesis，ko00940)、萜类化合物生物合成途径(Terpenoidbackbonebiosynthesis，ko00900)、植物与病原菌互作途径(Plant-pathogeninteraction，ko04626)、类黄酮生物合成途径(Flavonoidbiosynthesis，ko00941)、植物激素信号转导途径(Planthormonesignaltransduction，ko04075)、苯丙氨酸代谢途径(Phenylalaninemetabolism，ko00360)和核糖体途径(Ribosome，ko03010)。品种间和品种内的差别在于：在品种间参与的代谢途径有核糖体途径，没有类黄酮生物合成途径；而在品种内参与的代谢途径有类黄酮生物合成途径，没有核糖体途径。且感病品种礼泉短富参与的代谢通路明显少于抗病品种北之幸，而涉及到的与抗病相关的代谢通路则更少。SA诱导处理后，不同抗性品种所产生的差异基因数量明显不同，抗性品种产生的差异基因数量多，感病品种产生的差异基因数量相对较少，且涉及到的代谢通路也少，这与品种间本身的抗病性有关，同时也表明抗病品种的抗性相关基III 甘肃农业大学2017届博士学位论文因更易受到SA的诱导。（7）在筛选到的2590个差异基因中，几丁质酶相关基因有304个，其中有170个参与防御机制，120个基因与水杨酸应答有关；葡聚糖酶相关基因有39个，其中有2个基因参与防御机制，2个基因参与苯丙烷代谢途径，9个基因参与氧化还原途径；有2个NPR1相关基因，一个GO注释到参与防御机制；16个WRYK转录因子相关基因，其中5个基因参与防御机制，4个基因与应答刺激有关；3个PR1相关基因均与防御机制有关和1个TGA相关基因。（8）与植物抗病相关的代谢途径：苯丙烷氨类代谢途径和水杨酸信号途径中，都检测到有差异基因的存在，在SA处理前后苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）和4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）这3种酶基因不仅在抗病品种中存在差异表达，在感病品种间也存在差异表达。对于类黄酮、木质素、生物碱等具有抗菌活性的中间产物，在抗、感病品种间也存在差异表达。但在水杨酸信号途径中，感病品种礼泉短富差异基因的表达量都较抗病品种北之幸的低。说明除了品种之间本身存在的差异外，外源施用SA更易诱导抗病品种中与水杨酸信号途径相关的差异基因的表达量上调。（9）对6个共表达差异基因、1个葡聚糖转运蛋白基因和2个几丁质酶基因进行Q-PCR验证，验证结果与RNA-Seq测序结果基本一致，仅在表达差异倍数上，两者存在一定的偏差，但上下调表达趋势基本相同。关键词：苹果，轮纹病，抗病性，抗性相关酶活性，诱导，差异表达基因，代谢途径IV 甘肃农业大学2017届博士学位论文ScreeninggermplasmsresistanttoappleringrotandRNA-SeqanalysistodifferentiallyexpressedgenesinducedbysalicylicacidSummaryTheappleringrotdiseaseisoneofthemostseriousdiseasesinChinaappleproductionandtheappleindustrysufferedhugeeconomiclossesinrecentyear.ThestudywasaimedtoscreeningthehighlyresistantvarietiesbycombineartificialinoculationofBotryosphaeriaberengrianawithfieldinvestigation.ThenweusedSA（salicylicacid）totreatmenttwodifferentresistancevarietiesofapples,todeterminethechangesofsomeenzymeactivityassociatedwithresistancebeforeandaftertheinduction.Andwefurtherclarifiedgenesassociatedwithresistanceofdifferentiallyexpressindifferenttreatmentbyhigh-throughputsequencingtechnologyandvalidatedsomeofthesegenes.Theresultsareasfollows:1.Screeninggermplasmsresistanttoappleringrot.Thestudyfiltered190malusgermplasmsinthemalusgermplasmrepository.(1)Allmalusgermplasmswerefoundthathaveinfectedofappleringrotbyartificialinoculation.Thereweresignificantdifferenceintheresistanceamongvarietiesandnoimmunetoappleringrotofmalusgermplasmtestedwasfound.Byclusteranalysistherewere15highlyresistantvarieties,is7.89percentofininoculatedvarieties;77mediumresistantvarieties,40.53percentofthetotal;80mediumsusceptiblevarieties,42.11percentofthetotaland18highlysusceptiblevarieties,9.47percentofthetotal.(2)Thesurveyoffieldnaturalmorbidityfor190malusgermplasmsin2012and2013twoconsecutiveyearsshowsthatthereweremajorityofhighlyresistantvarietiesin2012,therewasonlyonemediumsusceptiblevarietynamedLiquanduanfu.Inthese190varietiesofthesurvey,therewere164varietieswhosediseaseindexarelessthan30,isabout86.32percentofsurveytotal.ButthediseaseindexofLiquanduanfuwasmorethan50.Theoverallresistancetrendsin2013consistentedwithitin2012,earlymaturingvarietiesaccountedforahigherproportionofresistantvarietiesandsusceptiblevarietiesaremostlyFujivarieties,andonlythreeresistantvarietiesV 甘肃农业大学2017届博士学位论文includetheKitanosach,1996-1-1andQinguan.Therewasnohighlysusceptiblevarietyinthefindingsof2012and2013.Combiningthetwo-yearinvestigation,thevarietyKitanosachwhichwasperformedstabilizedandhighresistanceandthevarietyLiquanduanfuwhichwassusceptible.2.WeusedresistantvarietyKitanosachandsusceptiblevarietyLiquanduanfuformaterialstotestresistanceenzymeactivityofappleleavesbytreatedwithdifferentconcentrationsofSA.thetestdemonstratedthatPAL,POD,β-1,3-glucanaseandPPOenzymeactivityofKitanosachandLiquanduanfuimprovedinashorttimeandsignificantlyhigherthanthecontrol.PALactivityofresistantvarietyKitanosachbySAtreatmentincreasedby1.36-2.73timesmorethanthecontrol;PODactivityincreasedby4.74-6.19times;β-1,3-glucanaseactivityincreasedby1.71-2.04times;PPOactivityreachedthemaximum,1.88-2.32timesmorethanthatofthecontrolatlate11thday.PALactivityofthesusceptiblevarietyLiquanduanfuhavingSAtreatmentincreasedby1.32-1.70times.Itincreasedmoreslowlyandreachedthemaximumat11thdayifhavinghighconcentrationtreatment;PODactivityincreasedslowerthanitofKitanosachsandreachedthemaximumvalueat11thday,higherthanthecontrolby4.11-5.68times;β-1,3-glucanaseenzymeincreased1.53-1.82timesandPPOactivityreachedthemaximumatearly7thdayandincreasedby3.13-4.00timesthanthecontrol.Itcouldincreasedtheactivityofpathogenesis-relatedproteinsenzymeandenhancedapple'sresistancetodiseasetoapplySAexogenously.Resistancesofdifferentvarietiesweredifferent.FromtheresultsofPPOactivitydeterminedthatthereweresomedifferencesinPPOactivityitself,havingnoSAindifferentapplevarieties.PPOactivityofdisease-resistantvarietieswashigherthansusceptiblevarieties.Thedisease-resistantvarietiesmayberesisttheinvasionofpathogens.3.WeusedresistantvarietyKitanosachandsusceptiblevarietyLiquanduanfuformaterialstodoRNA-SeqbeforeandafterSAtreatment.AndthedifferentexpressiongenesanddifferentgenetypeswereanalyzedaftertreatedbySA,thedigitalVI 甘肃农业大学2017届博士学位论文expressionspectrumwasbuiltwhenbyhavingSAtreatmentindifferentresistantvarieties.Theresultswereasfollows:(1)TheIlluminasequencingwasmadeforfoursamples:KitanosachandLiquanduanfubeforeandafterSAtreatment,andhavegotten35.30Mreads.(2)AllreadswhichobtainedbysequencingcomparedwithUnigenelibrariesandgot2,590differentiallyexpressedgenes.There1382werethemaximumdifferentiallyexpressedgenes,150theminimumdifferentiallyexpressedgenesand9co-expressedgenesare:MDP0000039357,MDP0000158474,MDP0000223968,MDP0000225361,MDP0000232908,MDP0000329063,MDP0000362305,MDP0000838695andMDP0000916403.Inco-expressedgenes,MDP0000223968,MDP0000329063andMDP0000362305wereinvolvedindefenseandresponsestimuli.(3)InthetreatmentgroupandthecontrolgroupofresistantvarietyKitanosach,therewere257differentiallyexpressedgenes,include213upregulatedgenesand44downregulatedgenes.InthetreatmentgroupandthecontrolgroupofsusceptiblevarietyLiquanduanfu,therewere150differentiallyexpressedgenes,include110upregulatedgenesand40downregulatedgenes.InthetreatmentgroupsresistantvarietyKitanosachandsusceptiblevarietyLiquanduanfu,therewere828differentiallyexpressedgenes,include356upregulatedgenesand472downregulatedgenes.IntheuntreatedgroupsresistantvarietyKitanosachandsusceptiblevarietyLiquanduanfu,therewere1382differentiallyexpressedgenes,include540upregulatedgenesand842downregulatedgenes.Ascanbeseenfromtheresults,inthesamevariety,thenumberofupregulatedgenesexpressionwasmorethanitofdownregulatedgenesexpressionafterSAtreatment.Andthenumberofdifferentiallyexpressedgenesbetweendifferentvarietiesisthemostandmorethanthesamevarietyofgenesaftertreatment.(4)Atotalof2,202resultsofUnigeneannotationsbybioinformaticsannotations,themajorityofdifferentiallyexpressedgenesweregeneralfunctionpredictiononly,andthefunctionalannotationsrelatedtothedefenseweremainlydefensemechanisms,signaltransductionmechanisms,energyproductionandconversionandinorganicionVII 甘肃农业大学2017届博士学位论文transportandmetabolism,butthegenesinvolveddefensemechanismsinsusceptiblevarietyLiquanduanfuwerenotannotated.(5)ByGOclassificationsmostaremetabolicprocess,responsetostimulus,biologicalregulation,immunesystemprocessandantioxidantactivity.SignificantclassificationtypesGOofsusceptiblevarietyLiquanduanfuarefewerthanresistantvarietyKitanosach,andthenumberofdifferentiallyexpressedgeneswaslessthanKitanosach.(6)TheanalysisforKEGGpathwaysshowsthatmetabolicpathwaysinvarietiesarealsomorethanitinspecies,andthenumberofdifferentiallyexpressedgenesdecreasedafterinducedbySAamongdifferentvarieties,butsignificantfunctionsGOclassificationandKEGGpathwayinvolvingthequantitychangedlittleandcoveredroughlythesame.Mainlyrelatedtoorinvolvedindiseaseresistancerelatedmetabolicpathwaysinclude:Peroxisome,Phenylpropanoidbiosynthesis,Terpenoidbackbonebiosynthesis,Plant-pathogeninteraction,Flavonoidbiosynthesis,Planthormonesignaltransduction,PhenylalaninemetabolismandtheRibosome.Thedifferenceamongorinvarietieswasthattherewasribosomebutnoflavonoidbiosyntheticamongvarieties,andtherewasflavonoidbiosyntheticbutnoribosomesinvarieties.TheKEGGpathwayofsusceptiblevarietyLiquanduanfuwassignificantlylessthanitofdisease-resistantvarietyKitanosachandthediseaseresistancerelatedKEGGpathwayswereless.AfterSAinducedtreatment,thenumberofdifferentialgenesofdifferentresistancecultivarswassignificantlydifferent.Resistancevarietieshadamorenumberofgenesandsusceptiblevarietieshadarelativelylessofit.AndtheKEGGpathwaysinvolvedinwereless,whichassociatedwiththeresistanceofthevarietiesitselfandalsosuggeststhatresistance-relatedgenesofdisease-resistantvarietieswereinducedeasilybySA.(7)Inthese2,590differencesgenehavefiltered,therewere304chitinenzymerelatedgenes,include170genesparticipatedefensemechanismand120genesrelatedtosalicylicacidresponse;therewere39glucanaserelatedgeneswhichinclude2genesparticipatedefensemechanism,2genesparticipatephenylpropanoidVIII 甘肃农业大学2017届博士学位论文metabolismand9genesparticipateoxidationrestore;therewere2NPR1relatedgenes,onewasannotatedtotheparticipationinthedefensemechanism;therewere16WRYKtranscriptionfactor-relatedgenes,ofwhich5genesinvolvedinthedefense,4genesresponsedstimulus-related;3PR1genesareassociatedwithdefensemechanismsandtherewasoneTGAgene.(8)TheKEGGpathwaysrelatedtoplantdiseaseresistance:Phenylpropanoidmetabolismpathwayandsalicylicacidsignalpathwaysweredetectedthepresenceofthegenes.BytreatingofSA,thegenesofphenylalanineammonia-lyase,cinnamicacid-4-hydroxylase(C4H)and4-coumaricacid-CoAligase(4CL)existnotonlydifferentialexpressionintheresistantvarieties,butalsoexistdifferentialexpressioninsusceptiblevarieties.Tointermediateproductsofflavonoids,ligninandalkaloidwithantibacterialactivity,thedifferencesbetweenresistantandsusceptiblevarietieswerealsoexpressed.InSalicylicacidsignalpathway,susceptiblevarietiesLiquanduanfudifferencesgenesexpressionwerelowerthanitintheresistantvarietiesKitanosach.ItshowedthatexogenousapplicationofSAaremorelikelytoinducegenesexpressionrelatedsalicylicacidsignalingpathwayinresistancewasraisedexcepttheinherentdifferencesbetweenvarieties.(9)WetookQ-PCRverifyfor6co-expresseddifferentialgenes,oneglucanasetransportergenesand2chitinenzymegenes.TherusultshowedthatitconsistedwiththeRNA-Seqsequencing,therewasacertainbiasonlyinexpressionmultiples,butthetrendofupregulatedanddownregulatedwerebasicallythesame.Keywords:Apple,Botryosphaeriaberengriana,resistant,enzymeactivity,induced,differentialexpressedgene,metabolismIX 甘肃农业大学2017届博士学位论文目录摘要...............................................................................................................................................ISummary..........................................................................................................................................V第一章文献综述...........................................................................................................................11.1苹果轮纹病的研究概况.....................................................................................................11.1.1苹果轮纹病病原菌研究..........................................................................................21.1.2苹果轮纹病的发生与危害......................................................................................21.1.3苹果轮纹病菌的生物学特性及侵染规律..............................................................31.1.4苹果轮纹病的防控技术..........................................................................................51.2寄主与病原菌的互作机制.................................................................................................61.2.1病原菌对寄主的致病途径......................................................................................71.2.2寄主对病原菌的抗病途径......................................................................................81.3植物抗病机制研究进展...................................................................................................111.3.1植物抗病基因........................................................................................................121.3.2病原菌致病基因....................................................................................................121.3.3病程相关蛋白........................................................................................................131.4苹果树抗病育种...............................................................................................................161.4.1苹果抗病育种........................................................................................................161.4.2苹果抗轮纹病种质资源的鉴定和评价................................................................171.5水杨酸在系统获得抗性研究中的应用...........................................................................181.6转录组学研究...................................................................................................................221.7选题目的和意义...............................................................................................................24第二章中国主要苹果种质资源对轮纹病的抗性鉴定...............................................................252.1材料与方法.......................................................................................................................252.1.1材料........................................................................................................................252.1.2人工接种方法........................................................................................................252.1.3人工接种调查与抗病性评价................................................................................262.1.4田间自然发病调查................................................................................................262.2结果与分析.......................................................................................................................272.2.1人工接种试验结果................................................................................................272.2.2不同苹果品种对枝干轮纹病的抗性鉴定............................................................292.3讨论...................................................................................................................................332.4结论...................................................................................................................................34第三章SA诱导对苹果抗性相关酶活性的影响分析.................................................................363.1材料与方法.......................................................................................................................363.1.1植物材料和处理............................................................................................................363.1.2测定方法................................................................................................................363.2结果分析...........................................................................................................................373.2.1苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性分析.....................................................................37X 甘肃农业大学2017届博士学位论文3.2.2过氧化物酶(POD)活性分析.................................................................................393.2.3β-1,3-葡聚糖酶活性分析......................................................................................413.2.4多酚氧化酶（PPO）活性分析.............................................................................433.3讨论...................................................................................................................................443.4结论...................................................................................................................................45第四章SA诱导苹果抗病相关基因的RNA-seq差异表达分析................................................474.1材料与方法.......................................................................................................................484.1.1植物材料和处理....................................................................................................484.1.2样品准备................................................................................................................484.1.3总RNA提取与质量检测.....................................................................................48TM4.1.4cDNA文库构建和IlluminaHiSeq2500测序.........................................................484.1.5数据基本处理与分析............................................................................................494.1.6RNA-Seq整体质量评估.......................................................................................494.1.7基因表达分析........................................................................................................504.1.8差异表达分析........................................................................................................504.1.9基因功能注释........................................................................................................514.1.10数据个性化分析..................................................................................................514.2结果与分析.......................................................................................................................544.2.1样品总RNA的质量检测.....................................................................................544.2.2测序结果统计........................................................................................................564.2.3RNA-Seq整体质量评估结果...............................................................................564.2.4不同苹果基因型差异基因分析(未处理).............................................................574.2.5不同苹果基因型SA诱导后差异基因分析(SA处理)........................................614.2.6同一苹果基因型SA诱导前后差异基因分析.....................................................644.2.7苯丙烷氨类代谢途径............................................................................................724.2.8水杨酸信号途径....................................................................................................734.2.9实时荧光定量PCR验证......................................................................................744.3讨论...................................................................................................................................764.4结论...................................................................................................................................77第五章结论与讨论.......................................................................................................................805.1结论...................................................................................................................................805.2讨论...................................................................................................................................83参考文献.........................................................................................................................................86致谢.........................................................................................................................................102个人简介.......................................................................................................................................103导师简介.......................................................................................................................................104XI 甘肃农业大学2017届博士学位论文第一章文献综述苹果（Malus）属世界性果品，在北温带，包括亚洲、欧洲和北美洲种植较[1]多。苹果因生态适应性强、营养价值较高、耐贮藏、供应周期长等特点，有很[2]多国家都将其做为主要消费果品。在世界上分别有35个种的苹果属植物，其中至少有24个是在我国自然分布或原产，新疆野苹果（M.sieversii）原产于我国的[1]天山山脉，现代栽培苹果（M.domestica）就是由它逐渐培育出来的。作为世界上最大的苹果种质资源国，我国早在1978年就启动并实施了国家级果树种质资[3]源圃的建设计划。1985-1995年，我国苹果产业得到了快速发展，2006年栽培2[4]面积就达190.0万hm，产量2400万t。到了2008年，我国苹果的栽培面积有199.22万hm，而产量也达到了2985万t，大约占世界苹果总产量的1/3。但与法国、意[3]大利相比，却也只有其产量的1/3，位于世界30位以后。通过苹果产业技术体系2反馈的数据，我国的苹果种植面积在2012年就已有222.1万hm，比上一年增长了[5]2%；产量为3370万t，增长6.7%，并呈逐年增加的趋势。目前我国苹果的生产不论是在栽培面积、产量，还是在人均的占有量以及对外的出口量上，在世界上[6-7]都是排第一，但达到出口要求的高档果品则不足20%。因此我们不但要提高苹果单位面积的产量，更要全面提升苹果的质量和效益。在苹果属植物的起源中，我国具有非常丰富的种质资源，是世界苹果的起源演化中心。新疆野苹果作为现代栽培苹果的前身，近几年的大量研究也发现，该品种在遗传方面具有丰富的多样性，而且具有非常大的利用和挖掘潜力。分布在四川的小金海棠（M.xiaojinensisChengetJiang），具有抗白粉病、耐旱、耐涝、耐盐碱、耐热等特点，同时还具携带铁高效利用基因，能够抗缺铁性黄叶病等优势；山楂海棠（M.komarovii），因其携带抗病基因，而对苹果腐烂病等多种病害[3]有抗性。因此利用品种间的抗性差异，深入挖掘新型抗病基因是拓宽苹果抗病育种的新途径。1.1苹果轮纹病的研究概况苹果轮纹病由苹果轮纹病菌（Botryosphaeriaberengrianaf.sp.piricola）引起，[8-9]能够危害苹果树的多个部位，如枝干、果实，是一种世界性病害，主要发生[10]在日本、韩国等国家。1928年，在我国辽宁首次发现苹果轮纹病，是我国苹果生产中的三大病害(轮纹病、腐烂病、斑点落叶病)之一。1 甘肃农业大学2017届博士学位论文近几年，随着人们生活条件的提高，在苹果生产中主要的栽培品种也不断发生变化，品质优良但易感染病害的品种也不断扩大种植面积，如富士系品种在中国的大面积推广，导致该病成为我国目前苹果生产过程中发生最重也最难防治的一种病害。该病在枝干上发生危害时，会产生病瘤、翘皮等症状，削弱树势，而[11]且还危害苹果果实，造成大量烂果，导致我国苹果产业受到巨大的经济损失[12-13]。1.1.1苹果轮纹病病原菌研究日本学者在1907年首次报道苹果轮纹病在日本的梨和苹果上有发生。1920年，中田觉五郎等在朝鲜的梨树上也发现了轮纹病。原摄祐在1925年时，用[14]MacrophomakawatsukaiHara对该病原菌进行命名。而朝鲜的野濑直毅在1933[15]年发现该病原菌的有性世代后，就又将该菌命名为PhysalosporapiricolaNose。上世纪八十年代初，小金泽硕城和佐久间勉通过不断的研究考证，认为该致病菌[16]更准确的应该是Botryosphaeria，而不是Physalospora。同时在1984年便提出，在形态特征上苹果干腐病病原菌虽然和苹果轮纹病病原菌极为相似，但它们之间存在一定的致病性差异，进而把苹果轮纹病菌单独作为一个专化型，并对其进行命名，即贝伦格葡萄座腔菌（BotryosphaeriaberengerianadeNotf.sp.piricola[17]（Nose）KoganezawaetSakuma）。在我国也有许多学者对苹果轮纹病菌进行了研究。牟惠芳、唐欣甫、张愈学[18-20]等都认为苹果轮纹病的病原菌是Macrophoma，但也有学者认为是B.[21]dothidea。苹果轮纹病菌和干腐病菌在形态特征上虽非常相似，但徐梅等认为，虽然这两种病原菌的菌丝是可亲和的，但在生物学角度上还是有许多性质存在差异，应该分为两种病菌。近几年，随着酯酶同功酶的比较以及RAPD基因组多态性的分析，也进一步证实两者之间虽然在遗传方面有较高的相似性，但还是存[22][23]在明显的差异。Slippers结合其培养性状、多基因序列分析等，证明B.berengeriana是B.dothidea的同物异名，而在日本和中国，使用B.berengeriana的研究人员较多。1.1.2苹果轮纹病的发生与危害苹果轮纹病是苹果树上最重要发生的病害之一，主要危害枝干和果实，但很少在叶片上发病。在发病严重的时候，大量病斑相互连接，呈“粗皮”症状，影响2 甘肃农业大学2017届博士学位论文养分输导，削弱树势，严重时会造成死枝、死树。果实上发病，一般先由皮孔开[24]始发生病变。随着苹果果实增大、表皮扩展，其气孔逐渐演变成皮孔。而苹果轮纹病菌经由气孔、皮孔都是可以侵入并造成危害的。在田间，苹果轮纹病菌在苹果坐果后便可进行侵染。但在生长前期，幼果尽管受到病原菌的侵染，但也不会表现出明显的症状，只有到苹果果实近成熟后或着进入储藏期才会表现出明显的症状。在条件适宜时，病情发展会很快，并且在发病后期，少数病果的表皮[25-29]中央会散生出黑色的小粒点，即子实体。因苹果轮纹病菌潜伏侵染的特性，病菌在幼果期侵入后扩展会受到抑制，以菌丝的状态进行潜伏，即被抑侵染(quiescentinfection)状态。进入成熟期后，果实的生理状况随之发生改变，大多会由抗病转变为感病，并处于果实呼吸跃变期[30]。果实随着呼吸作用的骤然增强而发生一系列的生化反应，在此时常伴有寄[31]主和病原菌的互作，最终将导致苹果果实的腐烂。因此，苹果轮纹病在苹果贮藏期也是重要的病害，很容易引起苹果采收后的腐烂。一般在不套袋果园里，病果率达到30-50%，在发病严重的果园里，病果率可达70%以上。由于该病难以控制，所以在苹果生长期需要多次喷药防治，一般不套袋果园要控制此病的发展，需用药次数多达10-14次以上，这就导致果品安全质量问题的突出，生产成本的增加，生态环境的恶化，从而严重威胁我国苹果产业的发展。套袋技术在近几年得到大面积的推广，由此果实轮纹病的发生得到了有效的[13]控制，但枝干轮纹病的发生却依旧严重，并有逐年加重的趋势。国立耘等对我国苹果枝干轮纹病的调查结果表明，苹果树枝干轮纹病的总体发病率在77.6%，随着树龄的增加，其发病率和病情指数都随之提高，就河南与山东两省的苹果枝干轮纹病，其发病率可达到100%。1.1.3苹果轮纹病菌的生物学特性及侵染规律1.1.3.1生物学特性B.berengeriana在很多种天然的或着半合成的培养基上都能正常生长，当温度在25-28℃，pH在7-8时，最适生长。在26-32℃条件下，病菌在病果中的扩[32]展速度最快。最适于B.berengeriana生长的碳素来源属蔗糖，氮素来源则是以天门冬素和硝酸钠为主，在菌丝的整个生长过程中，L-半胱氨酸可明显的抑制其[33]生长。3 甘肃农业大学2017届博士学位论文B.berengeriana分生孢子器须在有光照的条件下才能形成，而无光条件下在[14、34][33]任何材料上都不能产孢。短波黑光灯的照射有利于分生孢子器的形成。分生孢子器在15-35℃的条件下都可以产生，最适温度为25℃，低于15℃或高于35℃则不易形成。pH值在4-10的条件下均能产生分生孢子，pH5的弱酸环境是[33、35］最有利于分生孢子器的产生和成熟。分生孢子萌发不需供给外源营养，且[32]对温度要求不高，只要外界温度在15℃以上，即可在水中顺利萌发，最适的[21]萌发温度为28℃，此外对碳素营养的需要要明显强于氮素。分生孢子萌发对水分的要求比较严格，对于干燥比较敏感，这个特性在病害侵染流行过程中可能[36]起重要作用。1.1.3.2侵染规律越冬病菌是次年侵染的主要来源。菌丝的存活期很长，一般在枝干上的病组织中能够存活4-5年。菌丝在第二年春季可以直接进行侵染，而越冬病菌则需遇雨释放分生孢子，通过风雨传播进行侵染。[37]病原菌主要是通过植物皮孔侵入，枝干轮纹病在皮孔的发病概率可达90%以上，远远高于其他部位。但皮孔木栓化后，病菌就不再侵入。苹果轮纹病菌首先侵染枝干，苹果坐果后再侵染果实。在越冬枝干中，病菌可不断产生分生孢子，多次侵染果实。轮纹病菌具有潜伏侵染的特点，在果实死亡细胞层中能够存活但不侵染，在条件适宜时再继续扩展，引起发病。分生孢子的形成和散发时期，因各地气候条件的不同而稍有差异。黄河故道[38]地区，5-8月就可在田间捕捉到分生孢子。陈功友研究表明，北方地区5-6月分生孢子散发的较多，7-8月可达到高峰。在自然条件下，分生孢子侵染果实，侵染期可长达4个月。苹果生育前期是病菌分生孢子产生高峰期，高峰期的早晚[14、与降雨量有密切关系，一般空气中的分生孢子密度与降雨量的多少呈正相关27、39]。降雨量增多，分生孢子的散发量也逐渐增加。而5月份的降雨则是影响轮纹病菌分生孢子产生的关键因素。气温超过30℃时，苹果轮纹病菌分生孢子的[38]产生会受到抑制。一般每次雨后都会出现一次孢子散发的高峰，因此降雨量和降雨持续时间的长短，是影响分生孢子释放数量和时间的重要因素。在苹果落花后，病菌便开始侵染幼果，从座果的初期到成熟的整个生长阶段均都可被侵染，而幼果到果实迅速膨大期则最易感病，随着果实不断成熟，感病4 甘肃农业大学2017届博士学位论文[40-41][42]率逐渐递减。此外苹果轮纹病菌还具有前期侵染而后期发病的特点。侵染盛期在6月中下旬-8月中旬，到8月下旬以后，侵染的数量明显减少。病菌侵入果实后，会产生一系列的果胶酶，这是重要的致病物质，其中聚甲基半乳糖醛酸酶(polymethylgalacturonase，PMG)和多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，[43]PG）对果实细胞的细胞壁起降解作用，在整个侵染过程中具有重要作用。1.1.4苹果轮纹病的防控技术在苹果优质高产栽培的过程中，制约苹果产业发展的重要因素就是病害。近年来，在苹果生产中发生、危害较为严重的病害主要有轮纹病、腐烂病和早期落叶病等。对于苹果轮纹病防治的最主要措施就是保护其枝干不受轮纹病菌的侵染，这就要从苗期、幼树期就开始进行防治，阻止病原菌在枝干上的逐年积累。在病原菌侵染的高峰期，主要以喷药或涂药作为防治枝干轮纹病的常用方法，对于果实上发生的轮纹病的防治则主要以套袋为主。但随着果袋原材料和人工费用的上涨，果实套袋成本也在逐年上涨，因此进行无袋化栽培必将成为以后的一种趋势。但若想要在苹果种植上进行无袋化栽培，培育抗轮纹病新品种则是我们首先要解[44]决的问题。自1882年波尔多液出现，到现在已有100多年的时间，在这期间杀菌剂取得了突飞猛进的发展。由最开始的保护性剂逐渐发展到具有治疗作用的内吸性杀菌剂；从简单的无机杀菌剂逐渐发展到有机合成类杀菌剂；随着对可持续性农业发展的重视，从以前以剧毒、残留大为特点的杀菌剂也逐步发展到以高效、低毒、低残留且具有治疗作用的杀菌剂。目前化学药剂防治苹果病害仍被广大果农所采用，而为了降低病虫危害、减少经济损失，果农也愿增大化学防治上的投入。在苹果病害的化学防治上存在两大问题，杀菌剂的残留问题和药剂施用量过大，病[45]原菌易产生抗药性的问题。目前世界各国，尤其是发达国家对于无公害农业，无公害食品都十分重视，并推行了有害生物综合治理(IntegratedPestManagement，IPM)策略。随着对可持续发展的研究和对生态、环保的认识，开始逐渐向有害生物可持续管理(SustainedPestManagement，SPM)策略和有害生物生态控制(EcologicalPestManagement，EPM)策略方向发展。生物防治尽管对环境的污染较小、毒性较低，但因其药效过慢，不能起到快速降低病原菌的数量的作用，而化学药剂则可迅速降低菌源数5 甘肃农业大学2017届博士学位论文量，并有效控制病原菌的扩散。因此目前，国内外对于苹果轮纹病的防治仍以化[46-47]学药剂防治为主。随着我国IPM策略的推行，在生产上对常见的主要病害也做了一定程度的防治，但就防治效果来看，还存在很多问题。在病害综合防控上缺少协调统一的指导思想，在实际操作过程中还存在滥用农药等现象。为了寻求短期效应，将化学药剂防治摆在了主导地位；不是根据本国的实际情况进行防治工作，而是仿效或照搬别人的防治模式和防治经验，单一的追求用生物药剂防治来代替化学药剂防治，这都将制约着IPM的发展。在世界范围内，中国和南美是近20年里苹果发展最为迅速的国家和地区，但在质量水平上却相对较低。随着世界苹果品种更新换代速度的加快，传统品种[48、49]的主栽比例也逐渐下降。目前富士系苹果已成为世界第一主栽品种，其次[48、50、51]为元帅系、金冠系、嘎拉、青苹和乔纳金。苗木种植的发展趋势可以准[48、51]确的指明将来苹果生产的趋势。因此培育优良的抗苹果轮纹病新品种可以从根本上解决防治问题。在世界上，大部分先进国家都十分重视对新优品种的研究和开发，并将苹果新品种育种作为一项产业来经营，从而获取国际市场的垄断地位和竞争优势。如今中国已成为世界上最大的富士苹果生产国家，因此，改良、选育优良抗病新品种也是未来的必然趋势。1.2寄主与病原菌的互作机制在自然界生物的长期协同进化中，植物与病原物也在不断地互相选择，相互适应，从而产生了植物的抗病性，这种现象在整个植物界都是普遍存在的，但这种抗病性只是相对的性状，并不是绝对性状。植物在受到病菌的侵染时，就会产生或被诱导产生出可以催化一些诱导型抗病因素的合成或着直接作用于病原物的酶，从而使寄主细胞可以抵御活性氧伤害或有利于寄主提高自身细胞壁的机械强度、钝化病原菌产生的细胞壁降解酶或参与其它防御物质的形成，形成寄主复杂的生化防御系统。植物都具有不同类型、不同程度的抗病性。根据其抗病机制的不同，在类型上可以分为局部抗病性和系统抗病性。而从抗病程度上来分，则可从完全免疫或着高度抗病连续变化到高度感病。寄主-病原菌的互作机制也是高度错综复杂的，一方面病原菌侵染寄主，从寄主体内获取营养，并对寄主的结构和生理代谢产生一定影响；另一方面病原菌在侵染的同时，会激发寄主潜在的抗病能力，而这种抗病能力可以表现在细胞学、6 甘肃农业大学2017届博士学位论文组织学和生理化学等方面。1.2.1病原菌对寄主的致病途径1.2.1.1破坏寄主细胞结构病原菌侵染寄主，大多是通过皮孔或着伤口进入，菌丝在细胞间生长，释放出有毒害的物质，直接造成寄主细胞死亡，或产生特殊的侵染结构如附着胞，或[52]长出侵染钉，产生压力而戳入寄主的细胞，或在寄主细胞的表面产生软化酶[53-54]类物质，以软化消解寄主细胞壁，使寄主细胞内含物渗出，造成细胞的死亡。1.2.1.2对寄主细胞壁的降解植物的细胞壁对植物具有保护作用，可以防止病原菌的入侵，因此病原菌必须突破植物的细胞壁，才能侵染植物体。病原菌可以通过酶的降解使植物细胞壁等物质遭到破坏。而每种物质的破坏都是由病原菌分泌的一种或多种酶类作用所造成的。按照酶作用底物大体可分为以下几种：a．角质酶(cutinase)，主要起到破坏植物表面角质层的作用；b．果胶酶(pectinase)，主要可以破坏植物细胞的中胶层，如：聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)是以果胶酸和果胶质为基质的水解酶，果胶甲基反式消除酶(PMTE)和多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)则是以果胶酸和果胶质为基质的裂解酶；c．纤维素酶(eenulase)，可以降解细胞壁纤维丝；d．蛋白酶(protease)，主要降解植物细胞结构成分中的蛋白质，并影响寄主细胞的结构和功能。1.2.1.3产生毒素病原菌的致病过程是一个较为复杂的过程。病原菌通过产生毒素(phytotoxin)可以对寄主植物产生毒害作用，从而致病。这类由病原菌产生的致病因子，不仅具有毒性(toxicity)，也就是说对寄主植物是有毒的，而且还具有致病活性(pathogenicactivity)，即能够引起寄主植物产生相应病害的症状，因此Luke和[55]Wheeler把这类致病因子称为致病毒素(pathotoxin)。病原菌与寄主之间的相互作用具有特异性，根据这种特异性可以将植物病原菌毒素分为2类，即对寄主具有选择性的专化型毒素(host-specifictoxins，HSTs)7 甘肃农业大学2017届博士学位论文和对寄主没有选择性的非专化型毒素(non-host-specifictoxins，NHSTs)。HSTs通常被认作是一种致病因子(pathogenicityfactor)，它对病害发生起决定性作用；而[56]NHSTs则属于一种毒力因子(virulencefactor)，它能加重病害发生。不同病原菌所产生的毒素，其作用位点和作用方式也不同。寄主专化性毒素AM-Toxin是由引起苹果轮斑病的链格孢菌(A.mali)产生的，它的作用位点位于叶[57]绿体和细胞壁的表面，它对寄主诱导抗病性的产生具有抑制作用。在柑橘褐斑病时，柑橘链格孢橘致病型(A.citriTangerinepathotype)可以产生ACT-Toxin，[58-59]其作用位点在质膜上，可导致寄主细胞电解质的渗漏。炭色长蠕孢1号小种(H.carbonumrace1)在引起玉米圆斑病时产生的HC-Toxin是一种非寄主专化性毒素，它不会引起寄主植物细胞质膜的破坏，但通过刺激寄主的呼吸作用，可以加速植物体内CO2的暗固定，此外在植物对N和其他物质的吸收方面也有促进作用。HC-Toxin还能通过对寄主体内植保素-花色素苷合成的抑制，来达到对寄[55，60]主植物的致病作用。燕麦维多利亚叶枯病菌也能产生HV-Toxin，而且对于抗病品种和感病品种的毒性差异也很大。毒素不但可以破坏寄主叶片的细胞膜，对寄主体内的叶绿体、线粒体等器官结构也能破坏，此外对寄主植物的某些生理代谢也有影响。植物病原菌毒素可以引起寄主植物水分代谢产生变化，从而引起萎蔫；细胞膜透性发生变化，一般表[61]现在质膜电势能的超极化及去极化。有些毒素还可抑制DNA指导下的RNA[62]合成，干扰基因表达、抑制蛋白质的合成、影响光合作用等。毒素对植物的生长调节过程也有较明显的干扰作用。1.2.1.4影响植物激素植物激素是植物体内合成的微量有机物质，它在植物生长发育的各个阶段、生物或非生物胁迫适应性中都发挥着重要的作用。病原菌可以通过分泌某种或几种激素类物质，引起寄主体内激素水平的明显上升，并出现病态反应。病原菌还可通过破坏寄主体内激素水平的平衡，引起寄主生长异常。此外，病原菌侵染以后还能造成寄主体本身的激素如：叫哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)等激素水平的异常，影响寄主的正常代谢。1.2.2寄主对病原菌的抗病途径在寄主-病原菌的互作过程中，寄主受到病原菌的诱导，体内会产生对病原8 甘肃农业大学2017届博士学位论文[63]菌的抗性现象。根据抗病机制产生的不同，将寄主的抗病性分为局部诱导抗病性（Localinducedresistance）和系统诱导抗病性（Systemicinducedresistance），局部诱导抗病性是仅在诱导部位产生抗病性，而未被诱导的部位则不会产生抗病性。系统诱导抗病性与局部诱导抗病性不同的是，除了被诱导的部位会产生抗病[64-66]性外，在未被诱导的部位也会产生抗病性。产生系统获得抗病性（Systemicacquiredresistance，SAR）以后，植物除了对原致病菌有抗病性外，对其它包括真菌、细菌、病毒在内的病原物也具有广谱的抗病性。在自然界中，由于寄主—病原菌的相互作用，这两种抗病类型并不是单一的出现，一般都会同时出现。不同种类的植物和不同种类的病原菌相互作用，产生的植物抗病性也有一定的差异。若坏死型病原物侵染寄主，则寄主会出现过敏性坏死反应（HR），即植物受侵染部位的细胞死亡，这也是植物抗病性的一个重要标志。除此外细胞壁的[67-69]木质化，抗菌物质的产生等也是寄主产生的一系列反应。植物受病原菌侵染而产生的抗病性，在受到侵染的部位会产生，通过植物体内的系统信号途径，还可从植物的韧皮部逐渐传导至没有被侵染的部位，最终在这些没有被侵染的部位[70]也会产生抗病性。[71-72]植物在产生抗病性的过程中，还常伴有一系列生物学和细胞学的变化，以及生理生化的变化。多数植物对病原菌的生化防御主要表现在PAL、SOD、POD、PPO和CAT等几种酶活性的变化。1.2.2.1苯丙氨酸解氨酶（PAL）苯丙氨酸解氨酶可以作为一个生理指标，指示该植物是否具有抗病性，或抗[73]病性产生的强弱，它是一种与植物木质素合成有关的酶类，它还是苯丙酸类代谢和莽草酸途径的关键酶。PAL可以催化L-苯丙氨酸脱氨产生反式肉桂酸，并在酚类物质和木质素的合成中起重要的作用，与系统获得抗病性的表达也存在一定的相关性。PAL及其控制的苯丙酸类代谢产物如绿原酸、木质素在苹果的3个品种（系）：富士、鸡冠和国光抗苹果轮纹病中都起到一定的抗病作用，但与不同苹果品种（系）[74]在对苹果轮纹病产生抗性的关系中，并没有明显的正、负关系。有研究发现，在受到不同病原菌的侵染后，大部分植物的PAL酶活性都有所升高，但植物在没有受到病原菌的侵染或在正常的生理状态下，PAL基因的表9 甘肃农业大学2017届博士学位论文达量则是很弱的，只有在经过病原菌或一些诱导剂诱导后，经过一个短暂的中度表达后，PAL基因才会表达强烈。PAL有可能是最早表达的一种酶，它在寄主抵御轮纹病菌的过程中发挥着重要的作用。1.2.2.2过氧化物酶（POD）过氧化物酶在植物体内也参与抗病作用，是植物细胞内重要的防御酶。刘海英等分析了不同苹果品种体内POD活性与苹果果实轮纹病发生之间的相关性，[75]结果表明POD活性的变化与果实发生苹果轮纹病呈正相关。在植物产生抗病性的过程中，POD具有氧化寄主或寄主生物的重要代谢产物，如酶及毒素、酚类物质、IAA等的能力。在细胞壁中，它可催化形成木质素以抵御病原菌的侵袭。寄主在受病原菌侵染后所产生的ROIS，可激发大量的POD，[76]进一步催化合成木质素。-.此外，POD也是植物体内重要的内源活性氧清除剂，O2在经SOD歧化-.+-.（O2+2H→H2O2+O2）和Haber-Weiss反应（O2+H2O2→OH.+O2）后，能产生[77]对细胞危害更为严重的H2O2和OH.自由基，而POD活性与它们的清除均有关。POD在过氧化氢存在的情况下，可以催化许多单酚和芳香烃的过氧化，从而形成高毒性的醌。1.2.2.3多酚氧化酶（PPO）PPO普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，是铜金属酶。高等植物发生褐变主要就是PPO活动的结果。PPO作为酚类物质氧化的主要酶，在寄主体内参与木质素的合成，并可把酚类物质氧化成醌类，以增强寄主植物对病原菌的抵御[78]能力。正常情况下，PPO位于植物的叶绿体中，而底物酚是位于细胞质的液泡中，两者是隔离开的，在细胞受到破坏时，PPO便与底物接触，将酚氧化成棕[79]褐色的醌。醌类物质对病原物的呼吸酶系统可以起到钝化作用，使病原物不能够正常生长。醌对病原菌的毒杀作用要比酚强，醌还能聚合。醌聚合后，可与细胞内蛋白质的氨基酸反应，产生黑色或褐色的色素沉淀，导致水果等经济作物[80]的营养丢失和经济损失。PPO还可提高寄主对病原菌的抗性。如烟草对炭疽病、棉苗对枯萎病、苹果树对轮纹病、黄瓜对黑星病等的抗性。作为氧化还原酶，PPO还可调节叶绿体中[81-82]有害的光氧化反应速度，并参与电子传递。PPO的激活不需要依赖光，但逆10 甘肃农业大学2017届博士学位论文[83]境胁迫、衰老或病原菌（虫）的侵害都可引起PPO活性的变化。1.2.2.4抗氧化保护酶类在生长过程中，植物在受到环境胁迫的同时，体内会有大量活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)产生，ROS可通过破坏核酸、氧化蛋白来影响植物的细胞[84]功能，导致植物不能正常生长。自由基和活性氧对于植物的伤害是直接或间接启动膜脂过氧化作用，引起膜的损伤和破坏，最终造成植物细胞死亡。ROS[85-88][89]属于防御信号分子，Vine等认为H202可通过杀伤作用来引起超敏细胞的死亡，同时作为细胞间扩散信号，可诱导与细胞保护有关的基因的表达。在长期进化的过程中，生物体自身形成了完善的和复杂的酶类和非酶类的抗氧化保护系[90]统以清除活性氧。植物的抗氧化保护酶类主要有：过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、谷胱甘肽还原酶(GR)等。超氧化物歧化酶(SOD)是第一个在活性氧清除反应过程中发挥作用的抗氧化酶类，它处于核心地位。SOD在植物对各类逆境的生理生化反应中都有参与，在保护植物细胞免受氧化损伤过程中起重要作用，通常SOD活性被认为是植物抗病反应的生理生化指数。过氧化氢酶(CAT)在植株体内也广泛存在，它可清除[91]活性氧的膜保护，通过将活性氧转化为低活性的物质来保护细胞的膜系统。因为活性氧在对病原菌起杀伤作用的同时，对寄主植物细胞也有一定的毒害作用，所以SOD与CAT作为活性氧清除剂的酶类，其活性与植物抗病性间的关系至今还未取得一致的结论。1.3植物抗病机制研究进展在长期的生长发育过程中，寄主的抗病性与病原物的致病性间形成了一种动态的平衡。“基因对基因”假说（gene-for-genehypothesis）最早是由Flor在研究[92-93]亚麻与亚麻锈菌互作过程中提出的。随玉米抗圆斑病基因Hm1克隆的成功,学者们对“基因对基因”假说的研究也进入到了分子方面的研究，并为研究植物抗病性的分子生物学奠定了良好的基础。寄主植物对病原物的反应一般分为抗病和感病两类。植物通过产生防御反应免受病原菌的侵染,病原菌也会相应的改变自身的毒性或通过产生变异,来达到侵11 甘肃农业大学2017届博士学位论文[94]染植物的目的，引起植物发病。当具有相应抗病基因的寄主与具有无毒基因的病原物相遇时，植物就会表现抗病反应，即寄主R基因与病原菌Avr基因是[95-96]成对发生作用的。研究表明，R基因属于一类稳定的，在进化上保守的多基[97]因家族，寄主植物通过这些基因产物的多样性来识别各种病原物。在拟南芥、水稻和小麦等作物上，对植物与病原菌的互作机制已有较多的研究，为了提高抗病能力，转基因植物会过表达病程相关。1.3.1植物抗病基因在植物-病原菌互作中，抗病基因是研究抗病机制的基础。1992年，Briggs[98]和Johal首次从玉米中用转座子标签法克隆到抗圆斑病基因HM1。HM1基因的编码需依赖HC毒素还原酶，而此酶通过降解玉米圆斑病菌1号生理小种产生的毒素，来使玉米可以抵抗圆斑病。1993年通过作图克隆法分离得到的第二个[99]抗病基因就是番茄Pto基因，该基因的编码序列属一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可起接受和传递信号的作用。这些抗病基因的克隆为揭示植物抗病的内在机理与信号传递机制，以及利用抗病基因进行抗病新品种的快速培育奠定了理论基础。R基因之间的序列同源性虽然较低，但R基因编码的蛋白则具有某些相似的[100]结构特征。按结构特点，R基因可分为5大类：STK，NBS-LRR，LRR-TM，LRR-TM-STK和Hm1。（1）STK：番茄Pto基因，产物无LRR结构域，位于细胞质内的典型丝氨酸-苏氨酸激酶(Ser-Thrkinase)。Pto蛋白可与相应无毒基因avrPto的产物相互作用。（2）NBS-LRR：编码蛋白的近N端有核苷酸结合位点（nucleotidebindingsite,NBS），近C端有富含亮氨酸的重复序列（leucine-richrepeat,LRR）。（3）LRR-TM：基因产物是锚定于细胞膜上的糖蛋白受体，具有三个区域：LRR结构域，跨膜区域（transmembranedomain,TM）和胞内区域。（4）LRR-TM-STK：水稻抗白叶枯病基因Xa21，其编码的蛋白是受体蛋白激酶，产物具STK和LRR-TM两类基因的结构特点。（5）Hm1类：玉米抗HC-毒素基因Hm1。HC毒素还原酶可以降解玉米圆斑病菌产生的毒素。1.3.2病原菌致病基因12 甘肃农业大学2017届博士学位论文病原菌致病基因是决定对寄主致病的一类基因。一般可分为:无毒基因(avr)和毒性基因(vir)。无毒基因决定着病原菌小种与具相应抗病基因寄主间表现专化性不亲和；毒性基因决定着对寄主表现亲和性。[101]病原菌无毒基因的表达产物与致病的表现型并没有关系。病原菌含有的无毒基因遇到抗性寄主，因不亲和反应而不能够侵染寄主，但并不是说该病原菌[102]对其他任何植物也没也不具毒性。1984年Staskawicz等在细菌丁香假单胞杆菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)中克隆出的第一个无毒基因AvrA。番茄叶霉菌(Cladosporiumfulvum)Avr9基因是在真菌中被第一个克隆出来的无毒基因，[103]其对应的抗性基因是Cf9。含Cf9基因的植株虽然对某些特定菌系具有感病性，[104]但导入Avr9基因后，经过转化的植株对这些特定菌系产生了抗病性。病原菌的无毒基因可以决定病原小种的特异性(或寄主的特异性)，还可决定病原致病变种(或寄主植物种)的特异性。通过序列分析，发现病菌的无毒基因虽[105]然有不同的特异决定性，但是它们之间也具有同源性。因此，在植物中对应这些无毒基因的不同抗病基因也可能是同源保守的,并有相似的抗病机制。1.3.3病程相关蛋白植物在经受病原物的侵染或一些不利因素的刺激、胁迫的时候，会产生一类蛋白质，因这类蛋白质与植物的抗病性有关，因此称之为病程相关蛋白[106]（Pathogenesis-relatedproteins，PRs）。在1987年，烟草中的四个PRs及其生物学功能被Legrand等首次报道，使病程相关蛋白的研究取得了突破性的进展[107]。病程相关蛋白在健康植株中一般不存在或微弱表现，但植株一旦被病原菌感染或诱导后，病程相关蛋白就会快速产生并积累，通过电泳，我们可以看到有[108]新的蛋白带或有增强蛋白带的产生。在70年代初,首次在受TMV侵染的烟草叶片中检测到了一种蛋白，该蛋白只有在病理或相关条件下才能被诱导，并由PR基因所编码，而且它与过敏性反应有关。随后发现PRs与植物诱导抗病性有关，而它与过敏性反应、系统性获得抗病性间的关系以及信号传递和对诱导抗病性具有的协同作用等也不断引起[109]人们的关注。PRs在进化上是相对保守的，所以在不同种类的植物中，只要是同类PRs，那么他们的氨基酸序列也是相似。纯化过的PRs，绝大多数都具有几丁质酶和13 甘肃农业大学2017届博士学位论文β-1,3-葡聚糖酶的活性，虽然这两种酶只是以较低的水平在健康植株存在，但在经病原菌或着其他激发子诱导后就能够大量产生。1.3.3.1β-1,3-葡聚糖酶[110]β-1,3-葡聚糖酶在高等植物体内广泛存在，如精细胞壁、花粉管壁等。大多危害植物的病原菌也都含有β-1,3-葡聚糖，如真菌细胞壁中的β-1,3-葡聚糖和β-1,3-1,6-葡聚糖可被β-1,3-葡聚糖酶水解，由于真菌菌丝的尖部含有β-1,3-葡聚糖，因此是最易被降解的。β-1,3-葡聚糖酶对病原菌菌丝可直接进行降解，并促进酚类物质的合成，使病原菌的侵染受到抑制，寄主植物产生抗病性。经过水[111]解的寡糖产物也能成为植物防卫反应的激发子。对β-1,3-葡聚糖酶的研究，在上世纪70年代之前还主要集中在它对植物不同发育期的作用，随着分子生物学技术的应用，β-1,3-葡聚糖酶基因的抗病研究也得到了快速的发展。β-1,3-葡聚糖酶可分为外切酶和内切酶，目前研究较多的是内切酶。其的分子量是32-37kD，等电点从酸性到碱性。对以往研究进行分析，β-1,3-葡聚糖酶主要分为三类：定位在液泡的碱性类、胞外定位的酸性类、还有一类在序列上与前两类相差较远，单独成为一类。碱性类的β-1,3-葡聚糖酶一般具一个液泡定位的羧基末端多肽(CarboxylTerminalPolypeptide,CTPP)结构，主要在液泡中，体外有较强的抑菌活性。CTPP存在与否是B-1,3-葡聚糖酶分类的一个重要依据。酸性类β-1,3-葡聚糖酶则主要分布于细胞间隙，在体外没有抑菌活性。β-1,3-葡聚糖酶也是重要的病程相关蛋白，按PRs蛋白的分类，可将β-1,3-[112]葡聚糖酶归属于PR2类，它与植物的抗病反应关系密切。通过抑菌试验，发[113]现β-1,3-葡聚糖酶可以明显的抑制病原菌菌丝的生长。在体外β-1,3-葡聚糖酶就可抑制病原真菌Fusariumsolani的生长，在与几丁质酶联合作用时，其抗菌活性更强。但能够起到降解菌丝细胞壁、抑制菌丝生长作用的只有碱性葡聚糖酶，[114][115]而酸性葡聚糖酶并不能起到抑制病原菌生长的作用。杜良成等的研究证实，来源于病菌的激发子可以诱导植物β-1,3-葡聚糖酶的不同程度表达，水稻在受到稻瘟病菌孢子或菌丝的感染后，β-1,3-葡聚糖酶活性能提高3-5倍。病原菌可以诱导β-1,3-葡聚糖酶活性增强，但某些化学物质、非生物胁迫等也能起到诱导其活性升高的作用，如水杨酸(salicylicacid,SA)、脱落酸(abscisicacid,ABA)、乙烯[116-118](ethylene,ET)、茉莉酸甲酯(Methyljasmonate,MeJA)、干旱胁迫等。14 甘肃农业大学2017届博士学位论文1.3.3.2几丁质酶由N-乙酰-D-葡萄糖胺通过β-1,4糖苷键聚合而成的一种线性多糖就是几丁[119][120]质，也称壳聚糖，在地球上是仅次于纤维素的生物聚合物，它是大多数真菌细胞壁的主要成分。几丁质酶(EC,3,2,1,14)是可水解几丁质的一类糖基水解酶[121]，大小约为20-90kD。按水解切口的位置不同可划分为：内切几丁质酶（endochitinase）和外切几丁质酶（exochitinase），研究较多的是内切几丁质酶。几丁质酶是重要的病程相关蛋白，其与植物对病原物的抗性有关，。植物中的几丁质酶能够水解几丁质的β-l,4-糖苷键，通过破坏病原菌菌丝尖端新合成的几丁质来抑制其生长，而产生的细胞壁碎片也具有诱导作用，可以刺[122-123]激寄主的抗病反应，在防御病原菌侵害中起重要的作用。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和等点聚焦，M.Lortito从Trichodermaharzianum中分离得到有抗[124]真菌活性的内切几丁质酶，并对9种真菌有抑制作用。研究表明:几丁质酶只对幼嫩菌丝端部的作用敏感，对于成熟菌丝细胞壁的几丁质层则不易被降解。[125]Schlumbaum等研究发现，纯化的蚕豆几丁质酶可以高度抑制绿色木霉的生长。杜良成还发现水稻几丁质酶能够抑制稻瘟病菌Magnaporthegrisea的ZGI孢子[115]和芽管的伸展。Larena等利用产生几丁质酶的真菌来抑制桃树枯萎病菌(Fusariumoxysporum)。正常情况下，几丁质酶在植物体内是低水平表达的，其活性一般低于可检测水平。研究表明，几丁质酶是可以诱导的，高等植物在经受病原菌侵染后，或其它激发子等的诱导处理后，其体内的几丁质酶含量都会迅速升高，并对植物在一定程度上起到保护作用。Vine.vinifera几丁质酶基因可以被所有的病原菌诱导表[126]达，这一结果是NadiaRobert等在对葡萄果实进行研究时发现的。几丁质酶的表达不但依赖一定的诱导因子，并且它的表达还具有选择性。寄主几丁质酶的产生尽管与寄主的抗性有关，但它的表达还是具有时序性和组织特异性的。许多植物在一定的发育阶段或特殊组织中也会发现有几丁质酶的存在，一般几丁质酶在植物的老叶和根中含量较多。为了适应不利的环境条件，几丁质酶会在植物的[127]某些发育阶段或部位产生，以保护植物顺利的完成生长发育。几丁质酶也有碱性和酸性之分，碱性几丁质酶主要存在于液泡中，体外具有[128]比较强的抑菌活性；酸性几丁质酶主要在细胞间隙，在体外几乎没有抑菌活性。15 甘肃农业大学2017届博士学位论文几丁质酶一般在入侵到植物体内的菌丝周围进行积累，植物被病原真菌侵染以后，在细胞间隙的几丁质酶首先被诱导表达，而液泡中的几丁质酶则在细胞被裂解发生破裂以后才会起抗菌作用。几丁质酶在植物体内的不同表达定位，还会导致其抗菌性的特异性。此外，几丁质酶还需要与其他防卫蛋白如β-1,3-葡聚糖酶等协同作用，才能充分的发挥抑菌活性，几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶在植物或微生物体中都是普遍存在的，并且是由单基因所编码的，可以降解真菌的细胞壁，并在抑制真菌生长的过程中，二者具有协同的抗菌作用。研究还证明，两个基因的抑菌效果远远高于单个基因的抑菌效果。1.4苹果树抗病育种果树的抗病育种主要是通过杂交进行育种，在得到的具有双亲优良性状的后代中再进行选择，这种方法使育种工作有一定的局限性，速度较慢、抗病性状与优质、高产难以结合。上世纪三十年代，利用抗火疫病的沙梨和西洋梨品种进行杂交，美国育成了贵妃、佳宝、康德等抗病品种。中国农业科学院果树研究所通过用南果梨与巴梨进行杂交，育成了对腐烂病免疫的锦香。河北省石家庄果树研究所用雪花梨与新世纪进行杂交，育成了抗黑星病的品种黄冠梨。利用山葡萄进行种内杂交得到的F1，宋润刚等人选育出了在我国北方干旱、高湿地区对霜霉病具有良好抗性的4个品种，而且丰产稳产性较强。二十世纪八十年代末期，人们通过基因工程等手段，开始对转基因进行探索，对于比较理想的基因，采用转基因的方式转到栽培品种中，从而改良品种。1988[129]年，在世界上获得了第一个转基因果树即转基因核桃。此后又有很多果树被成功转化，而且具有很好的抗病性。1.4.1苹果抗病育种[130]自苹果成功实现转基因以来，已经对二十多个苹果品种进行了成功转化。在苹果抗病性的研究中，欧美国家在白粉病和黑星病等方面的研究比较多，普遍[131-133]认为苹果栽培品种对白粉病和黑星病的抗性是由多基因控制的。Dayton认[134]则为苹果之所以可以抗白粉病，是由一个显性基因作用的结果。Lesemann指出多数苹果品种对白粉病表现的抗性，都是数量性状，如果用栽培品种做为亲本进行杂交，那么在后代中就很难选出免疫类型。16 甘肃农业大学2017届博士学位论文美国在过去的几十年里，在苹果的抗病育种方面取得了显著的成效，尽管选育出了一些抗病品种，但品质却是一般；欧洲的一些国家则是以抗黑星病和优质[135]为主要的育种目标；日本、澳大利亚和新西兰等国家也以优质为主要育种目[136]标，但同时还兼顾抗病性。1992年随着第一个植物抗病基因的成功克隆，至今已有许多植物的抗病基因和防卫基因被克隆和分离出来，并且运用于分子育种中。目前在抗病基因工程上的研究，主要都集中在植物抗细菌、真菌、病毒等方[137-139]面，在苹果、番木瓜、柑橘等果树上也都成功的获得了转基因抗病植株。对于转基因苹果，研究较多的是抗火疫病，attacinE是从天蚕体中分离并得[140-142]到的一类裂解肽，在增强对火疫病的抗性上，attacinE基因的效果最明显。[137]1994年，Norelli将编码裂解细菌细胞的attacinE基因采用农杆菌介导的方法，转化到砧木M17和皇家嘎拉(RoyalGala)中，且得到的转attacinE基因苹果植株增强了对火疫病的抗性。随着对几丁质酶基因研究的不断关注，发现几丁质酶基因可以催化绝大多数[143]真菌的细胞壁，进而抑制病原真菌的正常生长。通过基因工程的方法，把不同来源的几丁质酶基因转入到植物体后以获得转基因植株，该植株体内高活性表[144][145]达的几丁质酶会使植株的抗病性增强。Lorito等在生防真菌（Trichodermaharzianum）中分离并克隆了ThEn-42基因，该基因编码几丁质酶基因，将其转入到苹果中，所得到的转基因植株对苹果黑星病（Venturiainaequalis）有很强的[146]也抗性。Norelli等证明了几丁质酶基因表达水平越高，寄主抗疮痂病的能力也越高，但植株体内本身含有的几丁质酶基因的高表达则会抑制植株的正常生长[147]。1.4.2苹果抗轮纹病种质资源的鉴定和评价在抗轮纹病方面，苹果品种间存在很大的差异，其中最易感病的品种有富士、金冠等品种，中度感病的品种有乔纳金、元帅等，而比较抗病的品种有国光和首红，最抗病的品种则是鸡冠。但品种的抗病性也并不是绝对的，如国光较为抗病，[148]但若遇多雨年份或着管理不善，也会表现出不抗病。此外由于地理位置的差异和鉴定方法的不同，对于抗病性的鉴定结果也存在一定的分歧。阎振立等人的研究表明，北之幸是高抗品种、国光是中度感病的品种，但孙楚则认为北之幸是[149-154]中等抗性的品种，而国光是较为抗病的品种。17 甘肃农业大学2017届博士学位论文在田间枝干轮纹病调查中，17个苹果品种中具有高感病性的品种有4个：富士、华冠、金冠和红星；中度感病的品种有8个：华帅、国光、美国八号、嘎拉、澳洲青苹、乔纳金、GS4396和太平洋玫瑰；中抗品种有2个：GS4772和藤[155]牧1号；而高抗品种有3个:北之幸、秦冠和GS4354。在1年生枝条上的接种试验表明，北之幸、秦冠和GS4354具有较强的抗枝干轮纹病的能力，而富士、[156]华冠等4个品种抗枝干轮纹病的能力最弱。王昆等人对32份苹果品种进行果实轮纹病接种试验，发现夏绿和红月极不抗病；金冠、金冠芽变和以金冠为亲本而培育出的品种抗性也较弱；而元帅系品种则较为抗病。此外，苹果枝条皮孔的大小和密度与轮纹病的抗性之间也存在相关性。阎振[150]立等经研究发现，对1年生苹果枝条进行接种，皮孔的越大、单位面积内皮孔数量越多，则寄主的抗病性越弱。将单位面积内的皮孔数量与皮孔直径相乘，这个数值可作为指标，简单的评价寄主对枝干轮纹病的抗性。因此苹果皮孔的密度、皮孔直径以及大直径皮孔的多少都可作为苹果抗轮纹病新品种选育的生理指[155]标。随着社会的发展，培育质优、多抗的苹果新品种是广大果农的迫切需求。目前，虽然培育出的苹果品种很多，但几乎没有质优、多抗的品种。利用基因工程技术来进行抗病育种，还需要其他多个学科（如遗传育种、植物病理学、分子生物学等）的协同研究才能顺利完成。1.5水杨酸在系统获得抗性研究中的应用[157]早在1961年，Ross等人通过烟草上发现的抗病现象，就提出了系统获得抗病性(SystematicAcquiredResistance，SAR)这一概念，即植物的一种防卫反应，一般是病原菌侵染激发所致。植物被病原菌侵染后，寄主局部会发生坏死，并诱[158]导寄主整体产生一种较为持久的抗性反应—SAR。SAR主要强调的是受侵染植株获得的整体抗性能力，而大量研究也认为SAR是普遍存在，并具有广谱性的。随着对SAR的认识，普遍观点认为植物在受到病原菌的侵染或一些化学物质的诱导后，本身就会产生一种系统的，而且具有广谱、持久特点的抗性，而这种抗性的产生可以使寄主植物抵御该病原菌再次侵染或着其他病原菌的侵染[159-161]。这种持久性的抗病性有时能伴随寄主植物的一生，而且对多种病原菌都有抵抗作用。18 甘肃农业大学2017届博士学位论文SAR作为一种植物主动防御的机制，从开始发生过敏反应到寄主植物系统获得抗性的产生，都需要一系列的信号转导。而水杨酸(salicylicacid，SA)被普遍认为是诱导SAR的信号分子之一，它参与寄主植物的HR和SAR反应，并在[162]寄主植物的SAR信号转导中起关键作用。SAR的发生也常伴随着系统性SA含量的增加以及病程相关(pathogenesis-related，PR)蛋白的表达。SA可在植物的韧皮部中进行运输，它是在植物的体内就能进行合成的一类物质。SA的作用在很多种植物上都得到了体现，它以内源信号分子的形式在SAR信号转导途径中起作用。外源施用SA，可诱导烟草、马铃薯、菜豆、黄瓜等一[163]些重要农作物产生对由真菌、细菌和病毒等引起病害的局部或系统的抗病性。SA与植物的抗病性有密切关系。White利用SA对烟草品种Xanthi-nc进行[164]处理，观察到SA可以减轻由TMV引起的症状，并能够导致PR蛋白的积累。烟草受病毒感染后，其体内水杨酸的含量较未受侵染前增长了近50倍，此外在[165]18未被侵染到的部位，其SA含量也增长了近10倍。利用O2标记示踪，[166]Shulaev发现在上部没有被处理的叶片中也有SA的积累，且60-70%都是由下部被处理叶片产生并向上运输积累的，但是在经处理的叶片还未积累到足够的水杨酸之前，将其摘去，则上部的叶片也就不会出现SAR。[167]VanLoon在1983年就首次提出了SA与SAR之间有可能存在某种关系。外源SA处理可以使许多植物诱导出SAR基因，增加植物的抗病性。烟草中有9[168]种PR的mRNA可以被SA诱导产生，并通过转录过程对PR的合成进行调节。在烟草和黄瓜中都检测到，内源SA的提高与PR基因的诱导表达以及抗性的产[169-170]生都是有相关性的。在转基因植物的SAR产生过程中，水杨酸也起到重要作用。水杨酸羟化酶是由nahG基因编码的，导入nahG基因的拟南芥或着烟草，其体内不会积累高[171]水平的SA，就是通过接种也不能再诱导产生SAR。除此之外，在拟南芥的突变体(cpr,lsd,acd)中也检测到，在抗病性增强和PR基因表达的同时，SA水[172]平也有一定的提高。在1991年，Chen等就从烟草体内分离并纯化出一种可溶性水杨酸受体蛋白[173](SA-bindingprotein，SABP)，到1993年对这种蛋白进行纯化并克隆其cDNA基因，结果表明它与过氧化氢酶具有高度的同源性，并且具有催化过氧化氢(H2O2)19 甘肃农业大学2017届博士学位论文[174]的活性。由此可以看出，水杨酸可以诱导植物产生SAR，可能植物细胞中水杨酸含量升高，抑制了SABP，H2O2水平的升高，使得H2O2积累诱导的PR-1[175]基因的表达量也随之提高。但也有结果表明，H2O2不可能充当水杨酸的第二信使，在受到侵染的烟草上对非侵染的叶片进行检测，发现内源H2O2的水平与[176]SAR的产生无相关性，这也就说SAR的激活并不是通过产生活性氧来诱导PR蛋白基因表达的。在烟草中，水杨酸结合蛋白SABP2的活性在经水杨酸诱导处理后可以提高4-5倍，但SABP2基因的沉默同样会减弱局部抗性或抑制SAR反应，这说明SABP2是水杨酸的受体。转录因子在SAR信号转导的途径中，也具有一定的作用。在水杨酸下游就存在两类非常重要的转录因子即WRKY和NPR1(病程相关基因非表达子1，non-expresserofPR1)。NPR1可以调节植物的整体抗病性，是不同形式抗病信号传导途径的交叉点，。NPR1一般以寡聚体的形式存在于细胞质中，细胞内的还原势由于SA的积累而[177-178]增加，使NPR1由寡聚体的形式还原成单体形式，并在细胞核内产生积累。拟南芥突变体npr1虽然不能被诱导表达PR基因，但仍能积累高水平的SA，这[179-180]一现象说明NPR1是位于PR基因表达的上游，SA积累的下游。npr1突变体对病原菌更为敏感，这也说明NPR1在被侵染部位限制病原菌生长上发挥着非常重要的作用。NPR1的表达量在整个植物体中都是很低的，但经过病原菌侵[181]染或水杨酸处理以后，其mRNA含量便可提高2-3倍。在拟南芥中，NPR1过表达还能够提高寄主对丁香假胞杆菌、寄生疫霉菌和菊科白粉病菌的抗性，而[181]且对寄主本身并无明显的毒害作用。NPR1蛋白发生突变后就不能再产生SAR[182-183]而与转录因子之间的相互作用也会受到影响。因此，NPR1可以正向调节SAR的产生。NPR1因水杨酸而得到活化，寡聚体形式还原成单体形式，由细胞质中进入到细胞核内，并与富含bZIP的TGA因子相互作用，使下游的抗病基因得以表达[184]。TGA蛋白即可与其下游的PR-1启动子的TGACG序列结合，也可与其上[183,185]游的NPR1相结合，并且为PR-1基因和NPR1间提供直接的连接。NPR1上的四点突变，每个点都与NPR1与TGA间的相互作用有关，这也是SA介导[182]产生PR基因所必需的。在拟南芥中，NPR1虽然与TGA1和TGA4的作用比20 甘肃农业大学2017届博士学位论文较弱或着没有相互作用，但它与TGA2、TGA3、TGA5，TGA6和TGA7等因子[183，185，186]都可发生相互作用。在水稻和烟草中，NPR1与TGA因子也有相互作[187-188]用。NPR1介导的水杨酸信号转导过程中有TGA2的参与，而TGA2与NPR1[189]间的相互作用也是依赖于水杨酸的。但如果没有诱导因子进行处理，TGA2[190]则会抑制SA抗病信号的传递，植物在经诱导因子处理以后，体内的SA含量会上升，从而导致NPR1的单体化，并进入到细胞核中与TGA2直接发生作用，[191-192]进而解除了TGA2对抗病信号传递的抑制作用，同时还能促进TGA2与as-1[193]的结合，调控PR基因的表达。[192]Rochon等发现，NPR1/TGA2若要发挥作用，还需要有NPR1上的BTB/POZ结构域的存在以及其羧基端半胱氨酸的氧化。不同的TGA成员与NPR1相互作用的方式也不同，主要可以分为两种：第一，TGA和NPR1直接结合，正向的调控PR基因的表达以及抗性的产生，二者的结合强度、保持时间与PR基因的表达和抗性产生的强度是成正比的；第二，TGA内含有类似于NPR1[194]的单体—寡聚体的变化，能够增强PR基因的表达，从而提高植物的抗性。除了TGA转录因子外，NPR1与某些WRKY转录因子也可以互作，协同调控PR基因的表达。许多研究都表明，转录因子WRKY广泛参与了水杨酸下游的信号转导。WRKY通过绑定PR基因启动子区域的W-box(C/TTGACC/T)来起到调节基因表达的作用。通过WRKY转录因子还发现了NPR1的顺式作用元件[195][196]W-box，该元件能够导致PR-1基因的表达受到抑制。在SAR的调控过程中，NPR1和WRKY关系密切，WRKY转录因子的介导可以使NPR1得到表达，而这些WRKY转录因子也是依赖于NPR1起作用的。WRKY转录因子家族很多，其中WRKY70转录因子的过量表达，就可以诱导PR基因表达，这也说明WRKY70因子可以正向调控PR基因，此外WRKY70还能负向调控依赖于茉莉[197]酸(jasmonicacid,JA)的抗病反应。在开始的时候，WRKY70的表达不依赖于NPR1，只需要SA进行诱导，但若想让它持续表达则必须有NPR1。WRKY58可以识别低浓度的SA，阻止SAR的错误产生，但对已产生的SAR，若细胞中[198]SA处于低水平时，SAR也能及时得到终止，避免浪费能量。拟南芥中WRKY基因有72种之多，其转录产物在植物各种抗病反应中都有参与，有正向调节的[199]也有负向调节的，因此调控网络非常复杂。通过SA信号分子与NPR1、TGA21 甘肃农业大学2017届博士学位论文和WRKY等转录因子之间的调控，能够诱导寄主PR基因的表达，诱导寄主植物产生SAR。1.6转录组学研究继基因组学之后，转录组学成为一门新兴学科，它主要是在RNA水平上来研究生物体中各个基因的转录情况以及调控规律，从而阐明生物表型和生物功能的一门学科。转录组学可以定量的分析生物体在受到外界环境的影响、在不同的发育阶段或不同的组织之间，各个基因的表达变化。转录组学不仅可以对植物有无进行逆境处理的差异基因的表达进行对比，也可以对经过同一逆境处理的不同品种、不同组织或突变体间的差异基因的表达进行分析，并从中筛选出与抗逆性[200]有关的新基因。植物在受到不同生物的胁迫或非生物的胁迫以后，有许多抗逆基因的转录被激活，而且大多数是由植物激素信号传导通路所调节的，如水杨酸信号转导通路、乙烯(ET)信号转导通路和茉莉酸(JA)信号转导通路等都能共同[201]调控植物抗病的免疫系统。目前应用于转录组分析的技术主要有：基于序列分析的基因表达序列分析(Serialanalysisofgeneexpression，SAGE)；基于杂交技术的芯片技术(Genechip或microarray)；大规模并处理信号测序系统(Massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS)以及基于第2代或第3代深度测序的RNA-Seq技术(RNAsequencing)等。其中集测序通量高、信息量大、时间短、成本低等独特优点于一[202]身的RNA-Seq测序技术，在转录组表达谱分析上被越来越广泛的应用。因为不需要预先知到该物种与特定处理的相关基因信息，RNA-Seq就直接可以对由mRNA反转录生成的cDNA进行测序，并且高通量地得到其转录组中各个基因的表达信息，并以各个基因表达丰度的差异来筛选出所需的目标基因。到目前为止，研究人员已在拟南芥（Arabidopsisthaliana）、小麦（Triticumaestivum）、水稻（Oryzasativa）和玉米（Zeamays）等多种植物中鉴定得到了大量的与病原菌胁迫应答相关的基因，并对其作用机理进行研究。利用RNA-Seq[203]方法，Ward等对覆盆子根腐病（Phytophthorarubi）抗病和感病品系在受到病原菌侵染后的转录组表达谱做了研究，结果表明木质素的合成、病程相关蛋白编码基因、三羧酸循环相关基因和WRKY转录因子等的表达量都有所上调。对稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）侵染水稻（Oryzasativa）的转录组表达谱进行22 甘肃农业大学2017届博士学位论文分析，发现有大量的WRKY转录因子同时上调表达，也就是说这些转录因子都参与了水稻抗病的生理反应，而OsWRKY47还能够使水稻对稻瘟病的抗性增强。此外OsWRKY53、OsWRKY45、OsWRKY31和OsWRKY13过表达的植物也都表现出对稻瘟病抗性的增强，即这些WRKY转录因子可以共同参与水稻抗稻瘟[204][205]病的抗病过程。在辣椒（Capsicumannuum）中，Strau等分离并鉴定得到能够抗细菌黄单胞杆菌（Xanthomonasvesicatoria）的抗病基因Bs4C，这个基因可以调控寄主对AvrBs4的识别。同一个转录因子有可能会参与2个或2个以上的逆境应答反应，而且可能是正向调节，也可能是负向调节。如水稻的OsWRKY76转录因子在抗病过程中是[206]起负调节作用的，但在低温反应中则是起正调节作用的。葡萄（Vitisvinifera）中与耐热性相关的热激蛋白和热激转录因子在植物的耐热过程中起作用，在植物[207]的耐旱过程中也是起作用的，而且还能与AP2/ERF转录因子进行相互调节。不同的转录因子间也具有互相调节的作用机制，各种信号通路也都有各自相互关联的位置，从而使植物能够更准确地调节自身抗逆性以适应环境变化的要求。如在水稻被条螟虫（Procerasvenosatus）为害以后，水稻的转录因子OsERF3，可以正向调节2个WRKY转录因子和2个MAPK激酶的表达活性，还可通过JA[208]和SA信号传导通路来共同调节抗虫性和伤口的反应。表1.1参与植物抗逆反应的部分基因家族Table1.1Genefamiliesinvolvedinplantresponsestostress蛋白基因家族功能逆境胁迫参考文献GenefamilyFunctionStressReference病原、伤口、高盐、干旱、转录因子高温[204]，[206]，WRKYfamilyTranscriptionfactorPathogen,wound,salinity,[209]，[215-216]drought,heat.转录因子病原、干旱、低温MYBfamily[217-219]TranscriptionfactorPathogen,drought,cold.干旱、温度、高盐转录因子bZIPsfamilyDrought,temperature,[220-222]Transcriptionfactorsalinity.低温、干旱、病原、伤口AP2/ERFfamily乙烯响应转录因子Cold,drought,pathogen,[208]，[212-214]Ethyleneresponsivefactorswound.热激转录因子及热激蛋白HeatstresstranscriptionHeatshocktranscription温度[207]，[210]，[211]，factor(Hsf)familyfactorsandheatshockTemperature[223-225]heatshockproteinsproteins迄今为止，在果树上已完成了苹果、葡萄、草莓、香蕉、番木瓜、甜橙、梨、23 甘肃农业大学2017届博士学位论文桃等的全基因组测序。这些基因组序列信息的公开，对于开展相关物种上基因和启动子的挖掘、全基因组关联分析、分子遗传标记开发、比较基因组学等研究极为有利。利用RNA-Seq技术，对于寄主植物与病原菌相互作用的转录组，我们可以开展更为深入的研究工作，并通过分析诱导的寄主植物与病原菌的差异基因表达，为挖掘更多、更可靠的抗病相关基因资源和深入探索植物对病原真菌抗/感表型的遗传原因提供重要的信息。1.7选题目的和意义在苹果生产中，苹果轮纹病是极为重要的病害之一，而且次病原菌越冬的形式很多，越冬部位能够终年存活。在防治上，目前还没有铲除性杀菌剂可以彻底清除病菌，而潜伏的越冬也是次年侵染的主要来源。基因工程或分子育种在粮食作物育种上是重要的途径之一，但果树生产上推广应用的品种主要还是通过杂交、实生或芽变等常规育种途径选育而成。因此加强果树相关抗病基因的分离与克隆研究，可以为果树抗病分子育种的研究提供更为丰富的功能基因，特别是为转基因技术在果树抗病品种改良过程中提供更好的发展和应用。寄主植物的各种生理代谢过程可以通过多种途径由SA来调节，但在不同的植物或相同植物的不同品种、不同组织中，由SA诱导产生的SAR机制存在差异。利用高通量的技术手段，从转录组学水平上研究苹果不同抗轮纹病品种经SA诱导后的差异表达基因，有助于从整体上揭示苹果抗轮纹病系统中的代谢通路和分子调控机理，也有助于筛选与鉴定出起关键作用的功能基因。本研究拟通过田间接种鉴定和自然发病病情指数的评价，筛选出抗轮纹病品种和感轮纹病品种。然后利用SA诱导处理，测定诱导前和诱导后不同抗性品种间与抗性相关的一些酶活性变化特点。通过高通量测序技术，进一步明确SA不同处理间与抗病相关的差异表达基因，并对筛选到的差异基因进行验证。目的是揭示苹果抗病的分子机理，为今后苹果抗轮纹病育种提供理论基础。24 甘肃农业大学2017届博士学位论文第二章中国主要苹果种质资源对轮纹病的抗性鉴定由苹果轮纹病菌（Botryosphaeriaberengrianaf.sp.piricola）引起的苹果轮纹病是我国苹果生产上的三大病害之一，不仅危害枝干还可危害果实，但很少会在叶片上发病。近几年，随主栽品种的不断更换，质优但是感病的品种栽培面积也在不断的扩大，如易感轮纹病的苹果品种富士在中国的大面积推广，致使此病成[13]为我国当前苹果生产上最为严重的病害之一。国立耘等报道，目前河南、陕西、山东等省市的苹果枝干轮纹病，总体发病率都可达77.6%，病情指数在37.0-95.1。此外由于苹果轮纹病菌还具有潜伏侵染的特点，因此苹果轮纹病在苹果贮藏期也是主要病害，很容易引起苹果采收后发病腐烂。一般在不套袋的果园里，病果率为30-50%，在严重发病的果园里，病果率可达70%以上，从而严重的威胁着我国苹果产业的发展。因此为了给中国苹果的抗病育种工作打好基础，为抗苹果轮纹病苹果品种的选育提供材料，2012年和2013年在中国农科院郑州果树研究所苹果资源圃中进行了苹果抗轮纹病的品种鉴定工作。2.1材料与方法2.1.1材料供试植物材料：以中国农业科学院郑州果树研究所苹果品种资源圃的190份苹果种质资源为材料。供试菌种：苹果轮纹病菌ZZ26，采自郑州市十里铺果园枝干典型病瘤，经分离、纯化获得。菌种在PSA培养基上，于28℃下培养5-7d后，待菌丝长满培养皿后，备用。试验地点：中国农业科学院郑州果树研究所苹果资源圃，土壤沙质，有机质含量0.7%，无间作物，常规管理，苗龄一致。2.1.2人工接种方法选取当年新发出的枝条，待枝条有20cm以上长时进行接种。每个枝条上接3-4个点，每棵树接5个梢，重复3次，每处理共接45-60个点。采用菌饼接种法。将培养好的苹果轮纹病菌沿打成直径5mm的菌饼，用70%酒精对接种部位进行消毒，酒精挥发后，将菌饼的正面贴于接种点上，用湿润的25 甘肃农业大学2017届博士学位论文脱脂棉包裹，缠薄膜条进行保湿，并用油漆笔进行标记。2.1.3人工接种调查与抗病性评价接种一月后进行病害调查。每年的10-11月做最后1次调查，对调查数据进行统计分析，根据病情指数对各个品种做抗性评价。病害分级标准：0级1级3级5级7级9级∑（各级病斑数×各级代表值）病情指数=×100总病斑数×最高一级代表值根据病情指数公式计算相应的病情指数。2.1.4田间自然发病调查在苹果树发芽之前，对各个品种进行调查，每品种2株，分5级记录各树干在自然条件下的发病情况。病害分级标准：0级为免疫，基本无病；1级为高抗，感病轻微，主干上病斑呈分散状；2级为中抗，感病较轻，主干上少部分病斑已连成片、主枝病斑呈分散状；3级为中感，感病较重，主干上较多病斑、主枝上少部分病斑已连成片；4级为高感，感病严重，主干、主枝上病斑多已连成片、侧枝病斑较多呈分26 甘肃农业大学2017届博士学位论文散。对病情指数进行统计，根据不同级别枝条的分布情况，制定抗性评价标准：无病瘤，病情指数为0，即为免疫；病情指数小于25，不包括25，即为高抗；病情指数在25-50之间，不包括50，即为中抗；病情指数在50-75之间，不包括75，即为中感；病情指数大于75，即为高感。2.2结果与分析2.2.1人工接种试验结果对190个苹果品种一年生幼树进行苹果轮纹病接种工作，经过调查发现，不同品种之间抗性存在差异。供试品种都在不同程度上感染了苹果轮纹病菌，没有免疫品种，但品种间有较大的差异，早熟品种抗病性相对强些，病情指数在30以下的品种约占15.8%，其中北之幸、Seedling62、NY266和Summerland较抗病，病情指数均小于10。病情指数大于50的感病品种接近半数，占48.9%。其中有11个品种抗病性最弱，病情指数达到80-90（见表2.1）。通过对各苹果品种病情指数的比较，对各品种的抗轮纹病做出评价。根据聚类分析，可以看出接种的190个苹果品种共分4类：高抗、中抗、中感和高感。其中高抗品种有15个，占接种品种的7.89%；中抗品种有77个，占接种品种的40.53%；有80个中感品种，占接种品种的42.11%；而高感品种有18个，占接种品种的9.47%。表2.1人工接种190个苹果品种的抗轮纹病鉴定结果Table.2.1190varietiesresistanceevaluationinoculatedbyBotryosphaeriaberengriana病情抗性病情抗性病情抗性品种品种品种指数类别指数类别指数类别88943RNY2668.7HR美228138R356150SNY30620.9HR美229141.67R435479HSNY5371029.1R美553.71S439670SSeedling627.96HR美鲁斯35R470376HSSummerland9.09HR萌56S477251SWaitara11.67HR孟诺耶40R10--1930ROpalescent28.4R米勒矮生74S12-1735RRed13.4HR七月红55SDougherty12-3929RRedstark61S千秋67.86S27 甘肃农业大学2017届博士学位论文1--343RRegent42R青香蕉50S13-3065.71SCornollsweet61S秋富178HS1--760SF11-584HS酋长48R1978--1-170SF11-932R瑞光68.33S1996--1-135RF4-464S三岛富士70S1996--1-252SA14-1657S三门峡金冠实生74S2001富士67S艾达红30R世界一41R1996--1-672S安娜42R寿红富士58S4--146R昂林78HS双红064181HS3号红星58.17S奥勒冈矮生86HS斯达克矮生61S5号红星49.29R宝石橘苹43.33R斯达克早36R293-2339R北冠22HR四八60S293-2648R北之幸4.8HR松本锦13.33HR1996--1-2070S贝拉25R藤牧一号80HS1996--1-2180HS长富271.67S甜红玉71.67S1996--1-2243R成田71S未希65S72-2848R赤阳73S无毒甜十六46R78-17847R初津轻48.89R霞艳68.33S78-2163S岱绿58S夏红42R82NY51.67S短富3960S香红42R84NY42R多金15HR新红星51.43S87NY51.43S恩派53S新红星（日）80HSⅡ-3527.5R法W61S新红玉85HShongro65S伏翠21.67HR新倭巾48.33RFreedom26R伏红60S新星41.67RHiggs'b36R伏花皮45R秀水29RJonagold40R伏帅21.67HR延风64SJongrimes38.33R富短57.14S艳红74SKamhong70S富丽41.67R一斗金46.67RKinrei27.22R改良富士52S一系富士45RNero2638.57R共和富士61.43S依奈66.11SNJ5262S国光37R乙女45RNJ59558S哈蒂85.19HS意441331.67R58528-4947R哈威夷42R意大利早红80HS59329-245R寒富60S银红77HSAbas26.3R杭翠35R岳金53SCasa22.5HR杭伏41.67R岳帅90HSm.Fusca42.3R杭冠32R云霞70S红星64S杭锦53S早富68S华丽59S杭艳58.33S早红斯达克38.33R华美60S荷231149R早柯36R华帅58S轰系津轻50S早生旭47R欢喜76.67HS红奥71.67S泽西美35R黄王67S红宝石35R着色一系74.29S28 甘肃农业大学2017届博士学位论文极早红48.33R红冠68S自由66S碣石红18.33HR红将军72S花狸虎25.4R金冠41R红津轻40R秦冠16.8HR金坚41R红肉苹果67S新嘎拉47R红王将72S红世界一82HS早春艳50S静香29.6R理想29R卡佳28.33R金魁57S柳玉芽变50S克来兹65S金星75HS龙金蜜62S克鲁斯26.67R金源57S露香60S乐乐富士49R君袖40R麦艳44R礼泉短富69S里斯金53S注：HR代表高抗品种，R代表中抗品种，S代表中感品种，HS代表高感品种。Note:HRmeansHighlyResistant;RmeansMiddleResistant;SmeansMiddleSusceptible;HSmeansHighlySusceptible.2.2.2不同苹果品种对枝干轮纹病的抗性鉴定2012年，2013年连续两年对田间种植的190个供试品种做田间自然发病调查。从2012年冬季的调查结果来看（表2.2），190个供试品种在不同程度上均发病，但品种间发病程度存在差异，病情指数小于25的高抗品种占大多数，其次是中抗品种，而中感品种只有1个品种，即礼泉短富，这与苗木种植时间较短有关。从总体来看，被调查的190个供试品种中有164个的病情指数都在30以下，占调查品种总数的86.32%，只有礼泉短富病情指数超过50。根据聚类分析，在2012年的调查结果中高抗品种有145个，占调查品种的76.32%；中抗品种有44个，占调查品种的23.16%；有1个中感品种，占调查品种的0.53%；无高感品种。2013总体的抗病趋势与往年基本一致（见表2.3），在抗病品种中早熟品种占的比例较高，感病品种大多为富士系列品种，品种间的抗病程度有较大的差异。不同年份品种间的抗性也存在差异，如2012年的伏翠、伏帅属高抗品种，2013年的结果变为了中抗品种，红王将、哈蒂、hongro等由2012年的中抗品种变为了中感品种。但北之幸、秦冠、孟诺耶、乙女等14个品种在两年的调查中都表现高抗病性，礼泉短富在两年的结果都是感病品种。从病情指数总体来分析，2013年的病情指数整体较2012年的有所提高，病情指数在20以下的品种所占比例较少，只有北之幸、1996-1-1和秦冠3个高抗品种；病情指数20-30之间的抗性品种有31个，占16.32%左右；病情指数在30-40之间的品种有94个，占49.47%；病情指数在40-50之间的品种有47个，占24.74%；病情29 甘肃农业大学2017届博士学位论文指数大于50的品种有14个，占7.37%。由此可见，供试的190个品种中，中抗和中感品种占大多数，而高抗和高感品种占少数。根据聚类分析，2013年的调查结果中高抗品种有14个，占调查品种的7.37%；中抗品种有163个，占调查品种的85.79%；有13个中感品种，占调查品种的6.84%；无高感品种。表2.2田间调查190个苹果品种的抗轮纹病鉴定结果（2012）Table2.2190varietiesresistanceevaluationinfield（2012）病情抗性病情抗性病情抗性品种品种品种指数类别指数类别指数类别88940.37R安娜14.9HR理想15.56HR356123.33HR昂林11.18HR柳玉芽变9.63HR435446.85R奥勒冈矮生25.99R龙金蜜9.26HR439616.7HR宝石橘苹19.07HR露香12.96HR470321.5HR北冠11.64HR麦艳28.52R47728.95HR北之幸5.56HR美228124.35HR10--196.35HR贝拉11.85HR美229110.41HR12--176.56HR长富244.79R美529.26R12-3913.15HR成田14.26HR美鲁斯16.06HR1--310.74HR赤阳6.66HR萌17.18HR13-3010HR初津轻5.37HR孟诺耶5.6HR1--717.5HR岱绿8.37HR米勒矮生33.52R1978--1-112.9HR短富3942.22R七月红14.09HR1996--1-116.3HR多金12.41HR千秋27.78R1996--1-212.96HR恩派18.1HR青香蕉11.65HR2001富士18.61HR法W10HR秋富38.39R1996--1-613.7HR伏翠12.41HR酋长25R4--112.59HR伏红16.67HR瑞光19.26HR3号红星13.89HR伏花皮6.19HR三岛富士34.27R5号红星15.33HR伏帅11.85HR三门峡金冠实生12.22HR293-2314.51HR富短41.58R世界一16.87HR293-2627.04R富丽10.56HR寿红富士33.7R1996--1-2040.19R改良富士44.44R双红064121.81HR1996--1-2144.05R共和富士42.11R斯达克矮生17.59HR1996--1-2227.7R国光13.33HR斯达克早14.14HR72-2815.3HR哈蒂36.54R四八16.38HR78-17819.55HR哈威夷14.81HR松本锦8.15HR78--2144.63R寒富29.31R藤木一号26.63R82NY19.26HR杭翠14.07HR甜红玉27.04R84NY10.56HR杭伏17.09HR未希15.22HR87NY37R杭冠23.69HR无毒甜十六15.93HRII-3534.58R杭锦17.74HR霞艳18.59HRhongro32.22R杭艳28.65R夏红8.33HRFreedom10.86HR荷231124.44HR香红8.15HR30 甘肃农业大学2017届博士学位论文Higgs11.53HR轰系津轻25.03R新红星28.07RJonagold16.85HR红奥28.92R新红星（日）38.02RJongrime11.99HR红宝石17.78HR新红玉39.26RKamhong35.69R红冠10HR新倭巾13.33HRKinrei6.28HR红将军29.73R新星9.69HRNero2615.12HR红津轻16.67HR秀水7.22HRNJ5210.19HR红肉苹果12.59HR延风14.43HRNJ59515.88HR红世界一24.81HR艳红25.7R58528-4916.42HR红王将38.7R一斗金6.6HR59329-29.81HR红星9.07HR一系富士26.67RAbas15.56HR华丽11.54HR依奈10HRCasaNoval13.83HR华美24.52HR乙女5.74HRm.Fusca16.48HR华玉17.02HR意44137.96HRNY2669.44HR欢喜29.81R意大利早红11.85HRNY30618.84HR黄王36.67R银红17.09HRNY5371016.3HR极早红15.19HR岳金18.15HRSeedling6.67HR碣红石8.89HR岳帅（北16.3HRSummerla7.04HR金冠9.51HR云霞5.78HRWaitara11.48HR金坚13.09HR早富32.72ROpaleace13.6HR金魁26.67R早红斯达克16.13HRRed11.67HR金星13.33HR早柯7.73HRDoughertyRedstark16.48HR金源8.89HR早生旭7.04HRRegengt7.59HR君袖17.41HR泽西美15.8HRCornollsweet10.56HR卡佳17.04HR着色一系23.7HRF11-538.15R克莱兹15.37HR自由13.4HRF11-916HR克鲁斯15.74HR花狸虎9.63HRF4-412.22HR乐乐富士13.52HR秦冠5.93HRA14-1614.07HR礼泉短富59.71S嘎啦7.59HR艾达红16.11HR里斯金15.93HR早春艳16.4HR静香19.3HR注：HR代表高抗品种，R代表中抗品种，S代表中感品种，HS代表高感品种。Note:HRmeansHighlyResistant;RmeansMiddleResistant;SmeansMiddleSusceptible;HSmeansHighlySusceptible.31 甘肃农业大学2017届博士学位论文表2.3田间调查190个苹果品种的抗轮纹病鉴定结果（2013）Table2.3190varietiesresistanceevaluationinfield（2013）病情抗性病情指抗性病情抗性品种品种品种指数类别数类别指数类别88957S安娜45.93R理想37.56R356146.69R昂林42.41R柳玉芽变41.93R435465S奥勒冈矮生48.89R龙金蜜37.04R439642.22R宝石橘苹29.63R露香35.8R470341.11R北冠33.56R麦艳46.67R477234.07R北之幸7.59HR美228124.88HR10--1931.11R贝拉29.97R美229129.39R12--1742.22R长富2×53.33S美543.52R12-3923.66HR成田45.82R美鲁斯21.11HR1--326.3R赤阳43.89R萌34.26R13-3029.02R初津轻38.62R孟诺耶23.7HR1--727.96R岱绿30.74R米勒矮生47.2R1978--1-128.7R短富3956.69S七月红42.96R1996--1-119.07HR多金38.15R千秋41.11R1996--1-235.56R恩派33.89R青香蕉34.07R2001富士41.82R法W37.19R秋富145.73R1996--1-636.67R伏翠33.54R酋长36.67R4--132.85R伏红27.4R瑞光27.24R3号红星40R伏花皮37.22R三岛富士41.75R5号红星41.67R伏帅36.67R三门峡金冠实生38.89R293-2336.56R富短45.74R世界一35.19R293-2637.45R富丽26.48R寿红富士49.44R1996--1-2063.33S改良富士54.63S双红064142.96R1996--1-2158.92S共和富士52.2S斯达克矮生34.75R1996--1-2233.15R国光44.26R斯达克早26.22R72-2833.54R哈蒂51.63S四八34.07R78-17835.37R哈威夷32.22R松本锦33.7R78--2170S寒富45.56R藤牧一号28.7R82NY47R杭翠35.56R甜红玉34.63R84NY31.49R杭伏33.41R未希41.01R87NY39.63R杭冠40.74R无毒甜十六24.81HRII-3543.89R杭锦35.74R霞艳31.67Rhongro52S杭艳33.89R夏红32.96RFreedom34.02R荷231129.57R香红34.81RHiggs'b34.07R轰系津轻37.08R新红星33.52RJonagold24.81HR红奥33.89R新红星（日)41.11RJongrimes32.59R红宝石32.78R新红玉44.44RKamhong41.11R红冠37.22R新倭巾29.33RKinrei36.42R红将军44.63R新星30.56RNero2639.18R红津轻35.93R秀水38.33RNJ5236.3R红肉苹果41.67R延风36.67RNJ59531.05R红世界一49.75R艳红32.59R32 甘肃农业大学2017届博士学位论文58528-4938.08R红王将50.74S一斗金30.74R59329-240.49R红星34.44R一系富士37.96RAbas41.85R华丽40.53R依奈47.04RCasa29.63R华美38.52R乙女24.44HRm.Fusca32.7R华帅34.58R意441331.6RNY26633.62R欢喜37.04R意大利早红28.72RNY30629.92R黄王39.07R银红40.74RNY53710-9535.16R极早红26.94R岳金42.9RSeedling6233.89R碣石红30.56R岳帅(北13)40.4RSummerland36.67R金冠23.7HR云霞21.11HRWaitara30.25R金坚39.07R早富48.99ROpalescent36.14R金魁31.85R早红斯达克30.19RRed35.08R金星40.19R早柯35.01RDoughertyRedstark33.77R金源32.59R早生旭36.31RRegent26.26R君袖27.24R泽西美40.12RCornollsweet41.11R卡佳37.78R着色一系50.37SF11-540.67R克来兹36.48R自由43.33RF11-924.44HR克鲁斯39.77R花狸虎34.3RF4-434.38R乐乐富士34.1R秦冠20HRA14-1634.54R礼泉短富64.07S新嘎拉31.72R艾达红21.96HR里斯金40.93R早春艳34.2R静香34.92R注：HR代表高抗品种，R代表中抗品种，S代表中感品种，HS代表高感品种。Note:HRmeansHighlyResistant;RmeansMiddleResistant;SmeansMiddleSusceptible;HSmeansHighlySusceptible.2.3讨论不同苹果品种间对苹果轮纹病的抗性存在较大差异，一般富士系的品种最易感病，但抗病性也并不绝对，栽培管理方式不同、气候条件不同等都会影响到品种抗病性的表现，如国光虽然比较抗病，但若遇多雨年份或管理不善，也会表现出不抗病。在本研究中，2012年的伏翠、伏帅属高抗品种，2013年的结果为中抗品种，红王将、哈蒂、hongro等在2012年是中抗品种，但2013年为中感品种。此[150]外，枝条皮孔的大小和密度与轮纹病抗性之间也有一定的相关性。阎振立等研究发现，1年生枝条皮孔密度和皮孔大小与抗病性之间存在显著的负相关，且皮孔密度与其直径之积可作为一个形态指标，可用于对枝干轮纹病抗性的一个简单评价。因苹果属于高度杂合的树种，它的多数性状都是由多基因控制的数量性状，有性杂交后代又广泛分离，多表现非加性效应。且苹果轮纹病鉴定方法的不同和地理位置的差异，使得对苹果轮纹病抗性鉴定结果也存在一定的分歧，因此本研究对苹果资源圃中的190个苹果品种进行了连续两年的自然发病调查，并结33 甘肃农业大学2017届博士学位论文合人工接种试验，筛选出抗病性稳定的品种北之幸，和感病品种礼泉短富，为苹果轮纹病抗性机理的进一步研究打下基础。随着社会的发展，培育优质、多抗的苹果品种已成为广大人民的迫切需求。目前，培育出的苹果品种虽然很多，而优质、多抗的品种几乎没有。因此，要想选育出集优质、抗病、抗逆于一身的优良品种是一项艰巨的任务，还需我们不断的努力。2.4结论为了筛选出对苹果轮纹病有较好抗性的苹果品种，我们在苹果资源圃中对190个苹果品种进行了人工接种试验和田间自然发病的调查。从调查结果中可以看出：（1）人工接种苹果轮纹病菌后，苹果不同品种之间抗性存在一定差异，但在不同程度上都感染了苹果轮纹病菌，没有免疫品种，其中早熟品种抗病性相对强些。北之幸、Seedling62、NY266和Summerland较抗病，病情指数均小于10。有11个品种抗病性最弱，病情指数达到80-90。通过聚类分析，高抗品种有15个，占接种品种的7.89%；中抗品种有77个，占接种品种的40.53%；有80个中感品种，占接种品种的42.11%；而高感品种有18个，占接种品种的9.47%。（2）2012年，2013年连续两年对田间种植的190个供试品种做田间自然发病调查。2012年病情指数小于25的高抗品种占大多数，中感品种只有1个品种，即礼泉短富。被调查的190个供试品种中有164个的病情指数都在30以下，占调查品种总数的86.32%，只有礼泉短富病情指数超过50。2013总体的抗病趋势与2012年的基本一致，在抗病品种中早熟品种占的比例较高，感病品种大多为富士系列品种。2013年病情指数也整体较2012年的有所提高，病情指数在20以下的品种所占比例较少，只有北之幸、1996-1-1和秦冠3个高抗品种，但中抗和中感品种占大多数，而高抗和高感品种占少数。（3）根据聚类分析，2012年的调查结果中高抗品种有145个，占调查品种的76.32%；中抗品种有44个，占调查品种的23.16%；有1个中感品种，占调查品种的0.53%；而无高感品种。2013年的调查结果中高抗品种有14个，占调查品种的7.37%；中抗品种有163个，占调查品种的85.79%；有13个中感品种，占调查品种的6.84%；也无高感品种。34 甘肃农业大学2017届博士学位论文（4）通过人工接种试验与田间自然发病调查结合，筛选出在两年的调查中都表现高抗病性且抗性稳定的品种北之幸，和表现稳定的感病品种礼泉短富。35 甘肃农业大学2017届博士学位论文第三章SA诱导对苹果抗性相关酶活性的影响分析植物对病原物的反应可分为抗病和感病两类。水杨酸(salicylicacid，SA)作为诱发SAR产生的信号分子之一，也参与到植物应对生物及非生物胁迫的抗性反[162]应过程中，并且在植物的SAR信号转导中起关键作用。水杨酸可以通过调节与植物抗性相关酶类（如：超氧化物歧化酶、过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶等）的活性，来提高植物抗病性。此外，植物体内木质素含量的增加与POD、PPO酶[226]活性的提高也有一定的关系，它们可以起到阻止病原物入侵的目的。3.1材料与方法3.1.1植物材料和处理待新梢生长到20cm以上时，选取抗病品种北之幸（Kitanosach）和感病品种礼泉短富（Liquanduanfu）进行试验。用SA醇溶液以叶面喷雾的方式处理下部叶片，以湿润为标准。SA分为：10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L3个浓度处理，以无SA醇溶液处理为对照，每处理15个新梢枝条，3次重复。在处理后不同时间点（1、3、5、7、11、15d）采集上部未处理叶片，测定各酶活性。3.1.2测定方法3.1.2.1苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性采用分光光度计法测定PAL活性，以蒸馏水取代苯丙氨酸硼酸缓冲液做对照。ΔOD苯丙氨酸解氨酶活性（U/mg.h）＝×DFw.t其中Fw为样品鲜重，t为反应时间，D为稀释倍数。3.1.2.2过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定POD活性，以磷酸缓冲液作对照。以每分钟OD值变化0.01（升高）为1个酶活性单位（u）。POD活性(u/g·min)=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）其中，ΔA470为吸光值的变化；Vt为提取酶液总体积（mL）；W为样品鲜重(g)；Vs为测定时酶液体积（mL）；t为反应时间(min)。36 甘肃农业大学2017届博士学位论文3.1.2.3β-1,3-葡聚糖酶活性采用蒽酮法测定β-1,3-葡聚糖酶活性，以清水代替样品提取液为对照。w葡聚糖酶活性（mg/h）＝×DFw⋅t其中，w为反应生成葡萄糖的量，D为稀释倍数，Fw为样品鲜重，t为反应时间。3.1.2.4多酚氧化酶（PPO）活性测定用邻苯二酚法测定PPO活性，对照用磷酸缓冲液来代替酶粗提液。以每分钟OD值变化0.01（升高）为1个酶活单位（u）。ΔOD多酚氧化酶比活性（u/g(Fw).min）＝×D0.01Fw.t其中，Fw为样品含量，t为反应时间，D为稀释倍数。3.1.2.5蛋白质含量对苹果叶片中的蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250染色法进行测定。吸取0.5mL不同浓度的牛血清蛋白标准溶液，在10mL具塞试管中，分别加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合后放置2min，在紫外可见分光光度计595nm处测吸光值，制作通过原点的标准曲线。在0.05mL酶提取液中加入4mL考马斯亮蓝，反应2min后在紫外可见分光光度计595nm处测吸光值。3.2结果分析3.2.1苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性分析苯丙氨酸解氨酶可以作为一个生理指标，指示该植物是否具有抗病性，或抗[73]病性产生的强弱，它是一种与植物木质素合成有关的酶类，它与SAR的产生具有一定的相关性。在植物的正常生长状态下，PAL活性的表达量很弱，只有在受到病原菌侵染或诱导剂的诱导后，PAL才会强烈表达。一般随着苹果的生长，其体内的PAL活性呈略微增长状态。外源SA处理后，PAL活性在不同抗性品种的苹果叶片中都有明显提高（见图3.1、3.2、3.3）。SA处理7d后，抗病品种北之幸叶片中的PAL活性明显高于第1、3、5d的37 甘肃农业大学2017届博士学位论文酶活性，并且随着处理天数的不断延长，PAL活性也在逐渐升高，但到第11d时，PAL活性逐渐下降。经不同浓度SA诱导的植株，其体内PAL活性的升高也有所不同，10mmol/L和15mmol/LSA处理的植株，其PAL活性升高较慢，20mmol/LSA处理的植株，其PAL活性升高较快。在SA处理后第7d，北之幸叶片中的PAL活性较对照提高了1.36-2.73倍，其中以20mmol/LSA诱导植株PAL活性升高最快。SA处理感病品种礼泉短富7d后，10mmol/L和15mmol/LSA诱诱导PAL活性达到最高值，较对照提高了1.32-1.46倍。20mmol/LSA诱导的植株，叶片内PAL活性在11d时达到最高，较对照提提高1.7倍。随着处理时间的延长，各浓度处理的植株，其体内的PAL活性均逐渐下降。用20mmol/LSA诱导不同抗性品种苹果，测定叶片中PAL活性，结果表明在处理前期，两品种体内的PAL活性相差不大，且随处理时间的延长都有不同程度的升高，抗性品种北之幸在处理后7d，PAL活性达到最高，较感病品种高出2.35倍；而感病品种礼泉短富被诱导后，PAL活性升高较北之幸慢，在11d时才达到最高。SA诱导处理后，北之幸体内PAL活性较礼泉短富增长快且活性高。图3.1不同浓度SA对北之幸苹果叶片苯丙氨酸解氨酶活性的影响注：S1：10mmol/LSA，S2：15mmol/LSA，S5：20mmol/LSA，CK:对照。（下同）38 甘肃农业大学2017届博士学位论文图3.2不同浓度SA对礼泉短富苹果叶片苯丙氨酸解氨酶活性的影响图3.3SA对不同抗性苹果叶片苯丙氨酸解氨酶活性的影响3.2.2过氧化化物酶(POD)活性分分析过氧化物酶在植物体内也参与抗病作用，是植物细胞内重要的防御酶。在细胞壁中，它可催化形成木质素以抵御病原菌的侵袭。POD也是植物体内重要的内源活性氧清除剂。经SA处诱导理后，不同抗性品种苹果体内的POD活性都发生了变化（图3.4、3.5和3.6）。（1）随着处理天数的延长，POD活性迅速提升，不同抗性品种达到高峰的39 甘肃农业大学2017届博士学位论文时间有差异，北之幸在7d时达到高峰，而礼泉短富到11d达到高高峰，随后POD活性均有所下降。（2）在处理后第7d时，北之幸POD活性达到最大值，其中20mmol/LSA处理的植株，POD活性较对照增长了6.19倍，15mmol/LSA和10mmol/LSA处理的植株，POD活性增长了4.74-5.16倍。（3）在第11d时，礼泉短富体内的POD活性达到最大值，20mmol/LSA处理的植株，POD活性较对照增长了5.68倍，15mmol/LSA和10mmol/LSA处理的植株，POD活性增长了4.11-4.78倍。（4）POD活性随诱导剂浓度的升高而增强，以20mmol/LSA处理的植株，POD活性最大。用SA处理后，北之幸POD活性的增加较礼泉短富的快而且高，抗病品种POD活性较感病品种高出1.19-2.12倍。表明SA更易诱导抗病品种POD活性的提高。图3.4不同浓度SA对北之幸苹果叶片过氧化物酶活性的影响图3.5不同浓度SA对礼泉短富苹果叶片过氧化物酶活性的的影响40 甘肃农业大学2017届博士学位论文图3.6SA对不同抗性性苹果叶片过氧化物酶活性的影响3.2.3β-1,3-葡葡聚糖酶活活性分析[110]β-1,3-葡聚糖酶在高等植物体内广泛存在。大多危害植物的病原菌也都含有β-1,3-葡聚糖，如真菌细胞壁中的β-1,3-葡聚糖和β-1,3-1,6-葡聚糖可被β-1,3-葡聚糖酶水解。β-1,3-葡聚糖酶对病原菌菌丝可直接进行降解，并促进酚类物质的合成，使病原菌的侵染受到抑制，寄主植物产生抗病性。在正常生长条件下，苹果叶片中β-1,3-葡聚糖酶含量很低，且随着植株的生长，酶活性也没有明显的变化。用SA处理后，对苹果叶片内β-1,3-葡聚糖酶含量进行测定，结果表明（图3.7、3.8和3.9），不同抗性品种苹果叶片中中的β-1,3-葡聚糖酶活性都有提高，尤以处理后第7d的酶活性，提高幅度最大。经经不同浓度SA处理过的北之幸，叶片中酶活性在第7d时均达到最大值，较对照提高了1.71-2.04倍；而礼泉短富只有经10mmol/L和15mmol/LSA处理的β-1,3-葡聚糖酶活性在第7d达到最大值，较对照提高了1.53-1.82倍，经20mmol/LSA处理的礼泉短富，叶片中酶活性在第11d才达到最大值，较对照提高了1.81倍。经20mmol/LSA处理的不同抗性品种苹果，其叶片中β-1,3-葡聚糖酶活性，北之幸较礼泉短富的升高快，且高出0.94-1.29倍。41 甘肃农业大学2017届博士学位论文图3.7不同浓度SA对北之幸苹果叶片β-1,3-葡聚糖酶活性的影响图3.8不同浓度SA对礼泉短富苹果叶片β-1,3-葡聚糖酶活性的影响图3.9SA对不同抗性苹果叶片β-1,3-葡聚糖酶活性的影响42 甘肃农业大学2017届博士学位论文3.2.4多酚氧氧化酶（PPO）活性性分析PPO普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，是酚类物质氧化的主要酶。高等植物组织发生褐变也主要是PPO活活动的结果。PPO作为酚类物质氧化的主要酶，在寄主体内参与木质素的合成，并可把酚类物质氧化成醌类，以增强寄主植物对[78]病原菌的抵御能力。用不同浓度SA处理后，抗性不同的两个品种北之幸和礼泉短富叶片内的PPO活性随之发生变化，测定结果如图3.10、3.11和3.12所示。（1）不同浓度SA处理后，苹果叶片中PPO活性都有所提高，在处理后第7-11d间达到最大值，随后逐渐下降；抗病品种北之幸在第11d1达到最大值，感病品种礼泉短富在第7d达到最大值。（2）不同浓度SA处理苹果后，，北之幸和礼泉短富体内PPO活性均大于CKC。在第11d，北之幸的PPO活性较对照提高了1.88-2.32倍；在第7d，礼泉短富的PPO活性较对照提高了3.13-4.00倍。礼泉短富的增长幅度大于北之幸。（3）抗病品种北之幸体内PPO活性增长幅度之所以小于感病品种礼泉短富，其原因在于北之幸体内PPO活性未处处理组就高于礼泉短富，是礼泉短富PPO活性的1.60-2.56倍。（4）就不同抗性品种苹果而言，SA处理均可诱导PPO活性的升高，只是达到最大值的时间有差异，感病品种礼泉短富较抗病品种北之幸较早达到最大值。但北之幸体内PPO活性始终保持在相对较高的水平上，较礼泉短富高1.02-2.21倍。图3.10不同浓度SA对北之幸苹果叶片多酚氧化酶活性的影响43 甘肃农业大学2017届博士学位论文图3.11不同浓度SA对礼泉短富苹果叶片多酚氧化酶活性的影响图3.12SA对不同抗性苹果叶片多酚氧化酶活性的影响3.3讨论在寄主-病原菌的长期互作过程中，常伴随一系列与抗病性产生有关的生化防御酶活性的变化，如PAL、SOD、PPO、POD和CAT等。在植物体内，苯丙氨酸是大多数酚类物质合成的前提，因此对于酚类物质的合成来说，苯丙氨酸解氨[227]酶（PAL）更为重要。酚类物质及其氧化产物醌类对病原菌的毒素具有钝化[228]作用，在寄主植物植保素的合成中中也有参与。因此普遍认为PPAAL是一种植物防御酶。在本研究中，SA处理后抗病品种北之幸体内PAL酶活性升高的速度和幅44 甘肃农业大学2017届博士学位论文度都较感病品种礼泉短富的快而且高。多酚氧化酶在植物发生褐变的过程中起主要作用，作为酚类物质氧化的主要酶，在寄主体内也参与木质素的合成，并可把[78]酚类物质氧化成醌类，以增强寄主植物对病原菌的抵御能力。但不同品种间PPO含量存在差异，尽管经SA诱导后，感病品种礼泉短富体内PPO活性比抗病品种北之幸增长的快，但在未处理前抗病品种就已经比感病品种体内PPO活性高，即在病害发生的初始阶段，抗病品种就能很好的抵御病原菌的入侵。植物在遭受各种环境胁迫的时候，都会产生大量的活性氧和自由基，而活性氧和自由基对植物的伤害就是直接或着间接的启动膜脂过氧化作用，使膜受到损伤和破坏，最终导致植物细胞死亡。但作为氧化还原酶，PPO可以调节寄主叶绿体中有害的光氧[81-82]化反应速度，并参与其中的电子传递。POD是植物体内重要的内源活性氧清-.-.+-.除剂，O2在经SOD歧化（O2+2H→H2O2+O2）和Haber-Weiss反应（O2+H2O2→OH.+O2）后，能产生对细胞危害更为严重的H2O2和OH.自由基，而POD[77]活性与它们的清除均有关。刘海英等就认为苹果品种间的POD活性与果实发[75]生苹果轮纹病呈正相关。本研究同样发现，不同抗性品种经SA诱导后，POD达到高峰的时间有差异。大多危害植物的病原菌也都含有β-1,3-葡聚糖，如真菌细胞壁中的β-1,3-葡聚糖和β-1,3-1,6-葡聚糖可被β-1,3-葡聚糖酶水解。β-1,3-葡聚糖酶对病原菌菌丝可直接进行降解，并促进酚类物质的合成，使病原菌的侵染受到抑制，寄主植物产生抗病性。β-1,3-葡聚糖酶活性虽然在北之幸体内较礼泉短富升高的快，但在处理后3d，北之幸体内β-1,3-葡聚糖酶活性却略有下降，并较礼泉短富的稍低，随后又迅速升高，这可能与不同抗性品种的代谢过程略有差异有关。植物诱导抗病性的产生是一个复杂的过程，并不是一种或几种与抗性相关的酶活性发生变化的结果，因此对抗性相关酶活性的测定对研究植物诱导抗病机理可提供一定的依据。3.4结论用不同浓度SA处理抗性不同的两个苹果品种，均可使植株体内低水平的PAL、POD、β-1,3-葡聚糖酶和PPO活性在短时间内提高，且明显高于对照植株体内的酶活性。45 甘肃农业大学2017届博士学位论文SA处理抗病品种北之幸，其PAL活性较对照提高了1.36-2.73倍；POD活性提高了4.74-6.19倍；β-1,3-葡聚糖酶活性提高了1.71-2.04倍；PPO活性上升的较迟，在第11d才达到最大，较对照提高了1.88-2.32倍。SA处理感病品种礼泉短富，其PAL活性较对照提高了1.32-1.70倍，高浓度处理的PAL活性上升较慢，在第11d达到最大值；POD活性上升速度也较北之幸慢，在第11d达到最大值，较对照升高了4.11-5.68倍；β-1,3-葡聚糖酶升高了1.53-1.82倍；而PPO活性上升比较早，在第7d达到最大值，较对照上升3.13-4.00倍。试验结果说明，外源施用SA能诱导病程相关蛋白酶活性的增加，增强苹果对病害的抗性。而不同品种间之所以存在抗性差异，从PPO活性的测定中可以得到解释，在未经SA处理的不同苹果品种中，PPO活性本身就存在一定的差异，抗病品种较感病品种PPO活性高，也就是说，在病害发生的初始阶段，抗病品种能很好的抵御病原菌的入侵。46 甘肃农业大学2017届博士学位论文第四章SA诱导苹果抗病相关基因的RNA-seq差异表达分析在自然界生物的长期协同进化中，植物与病原物也在不断地互相选择，相互适应，从而产生了植物的抗病性，这种现象在整个植物界都是普遍存在的，但这种抗病性只是相对的性状，并不是绝对性状。在植物与病原物的互作中，植物的形态、生理生化、细胞、组织结构等都会发生复杂变化，而这些变化就会涉及到[97]各种信号的传递。苹果轮纹病由苹果轮纹病菌（Botryosphaeriaberengrianaf.sp.piricola）引起，目前是我国苹果生产中的三大病害之一，它既可危害苹果树[8-9]枝干，又可危害果实。近几年，随着人们生活条件的提高，在苹果生产中主要的栽培品种也不断发生变化，品质优良但易感染病害的品种也不断扩大种植面积，如富士系品种在中国的大面积推广，导致该病成为我国目前苹果生产过程中发生最重也最难防治的一种病害。由于该病难以控制，在苹果的生长期需要多次喷药，一般在不套袋的果园，病果率在30-50%，严重发病的果园，病果率可达70%以上。目前全国苹果枝干轮纹病的总体发病率在77.6%，而河南与山东两省的发病率则高达100%。在苹果与轮纹病病菌互作的研究中，多数学者都集中研究寄主的形态学、生理学和遗传学等，对于两者之间互作的分子机制研究还是比较少的，对于抗性相关基因的挖掘也较少，这在很大程度上制约了苹果抗轮纹病优良品种的选育。转录组学是在RNA水平上对生物体中的各个基因的转录情况以及其调控的规律进行研究，在生物体在受到外界环境的影响时，它可定量的分析生物体不同组织间或不同的发育阶段中体内各个基因表达的变化。作为一种新的转录组研究手段，RNA-Seq技术对cDNA可直接进行测序，并高通量地得到转录组的各个基因的表达信息，以表达丰度上存在的差异，筛选出相关的目的基因。利用此技术可以对各种胁迫下的植物差异表达基因进行分析，并挖掘新基因，从而解析植物[203、205、229、230]的抗病或感病机制。为探索不同苹果抗轮纹病品种抗性基因的抗病机制，本研究以第二章获得的对苹果轮纹病有明显抗性差异的两个苹果品种北之幸和礼泉短富为研究对象，采用IlluminaHiSeq2500高通量技术对SA处理前和处理后的两个品种样品进行测序。将每个样品中的CleanReads与苹果全基因组序列进行比对，对样品中所有基因的表达量进行检测，找出差异基因，根据差异基因的类型抗病相关基因，为苹47 甘肃农业大学2017届博士学位论文果抗轮纹病的选育工作奠定基础。4.1材料与方法4.1.1植物材料和处理由第二章筛选得到的对苹果轮纹病抗性有差异的两个品种：北之幸和礼泉短富的幼叶组织做为试验材料。用20mmol/LSA醇溶液以叶面喷雾的方式处理下部叶片，以湿润为标准，对照用无SA醇溶液代替。每处理15枝新梢，重复3次。4.1.2样品准备分别于处理后1、3、5、7、11、15d，随机取植株上部未经处理的嫩叶，用液氮速冻后，于-80℃冰箱中保存备用。4.1.3总RNA提取与质量检测利用Trizol法提取样品的总RNA，同一重复的不同时间段样品RNA进行混合，将RNA样品在冰上融化，离心并充分混匀，用RNAse-freeH2O对1μl样品按比例进行稀释后，70℃变性2min，用Agilent2100生物分析仪检测总RNA的RIN值以及28S：18S。TM4.1.4cDNA文库构建和IlluminaHiSeq2500测序样品总RNA提取后，进行mRNA的富集。将mRNA打断后做为模版，用于cDNA文库的构建。文库建好后用IlluminaHiSeqTM2500进行测序。RNA-Seq实验流程图（见图4.1）。总RNA用Oligo(dT)富集mRNAmRNA打断成短片段筛选片段末端修复、3'加A、加接头六碱基随机引物合成cDNATMPCR扩增IlluminaHiSeq2500测序图4.1RNA-Seq实验流程图Fig.4.1RNA-Seqexperimentalflowgraph48 甘肃农业大学2017届博士学位论文4.1.5数据基基本处理与与分析对测序得到的原始reads进行数据评估，过滤掉低质量和rRNA后，将reads序列与参考基因序列进行比对，对基因表达定量分析，再根据定量结果进行差异表达基因的分析，对得到的差异表达基因进行功能注释。数字表达谱生物信息分析流程见图4.2。图4.2数字表达谱生物信息分析流程Fig..4.2Digitalexpressionspectrumanalysisprocessofbiologicalinformation4.1.5.1测序质质量值分分布碱基的测序存在一定的错误率，碱基质量值越高则碱基测序的错误率就越低。4.1.5.2碱基分分布在RNA-Seq测序时，cDNA被随机的打断成片段，因此在整个测序过程由于互补配对原则，GC及AT含量理理论上应稳定不变，呈水平线。4.1.5.3测序数数据产出出统计对Q30质量值大于或等于30的碱基在总碱基中所占的百分比进行评估。4.1.6RNA-Seq整体质质量评估4.1.6.1与参考考基因组组比对[231]对过滤后的reads用Tophat软件与苹果参考基因组进行比对，并进行分类49 甘肃农业大学2017届博士学位论文注释。4.1.6.2cDNA片段随机性检验根据reads比对到参考基因序列上的分布情况进行评估，分布较均匀则测序随机性较可靠。4.1.6.3测序饱和度检验一般用RPKM>0.1作为衡量标准，当测序量达到一定标准时，表达基因的数量就会趋近饱和。4.1.7基因表达分析4.1.7.1基因表达定量[231][232]使用Tophat软件对各样品的reads进行比对。用Cufflinks/RSEM进行[233]表达量水平估计，RPKM值用来反映对应Unigenes的表达丰度，分析差异基因的表达量。对每个差异基因的长度、RPKM、比对上的Reads数等信息进行统计分析。maptheunigenereadsRPKM=mapallunigenesreads(million)×theunigenelength(kb)4.1.7.2不同样品表达量对比基因的表达水平由RPKM来量化，可直接用于比较样品间的基因表达差异。4.1.8差异表达分析4.1.8.1差异表达基因筛选以FDR<0.01且FoldChange>=2作为标准对差异基因进行筛选。用[234]Benjamini-Hochberg校正方法对得到的p-value进行校正，采用FDR作为差异基因筛选的关键指标。根据组合E1_vsE2、E3_vs_E4、E1_vs_E3和E2_vs_E4，即将北之幸SA处理组样品与未处理组样品的Unigene表达量进行对比；礼泉短富SA处理组样品与未处理组样品的Unigene表达量进行对比；北之幸未处理组样品与礼泉短富未处理组样品的Unigene表达量进行对比；北之幸SA处理组样品与礼泉短富SA处理组样品的Unigene表达量进行对比。最后得到样品间显著差异表达的基因，50 甘肃农业大学2017届博士学位论文并对差异表达基因进行数据统计。4.1.8.2差异表达基因聚类分析对筛选出的到的差异基因进行层次聚类分析，将表达行为相同或相似的基因进行聚类，用于判断差异表达基因的协同性和差异趋势。4.1.9基因功能注释4.1.9.1差异表达基因注释[235][236][237][238]使用BLAST软件对差异表达基因序列与nr，Swiss-Prot，GO，[239][240]COG，KEGG数据库进行比对，获得差异表达基因的注释信息。NR数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；Swiss-Prot数据库(http://www.uniprot.org/)；GO数据库(http://www.geneontologv.org/)；COG数据库(http://www.ncbi.nlni.nih.gov/COG/)；KEGG数据库(http://vww.genome.iD/kegg/)。4.1.9.2差异表达基因的GO分类根据CellularComponent、MolecularFunction和BiologicalProcess对基因进行GO分类。4.1.9.3差异表达基因的COG注释利用COG数据库对基因产物进行直系同源分类。4.1.9.4差异表达基因KEGG注释KEGG是有关Pathway的主要公共数据库，对Pathway的分析有助于进一步解读基因的功能。4.1.10数据个性化分析为了明确SA诱导后不同抗性苹果品种中差异表达基因的动态变化规律，我们进行了不同抗性品种SA处理前之间和SA处理后之间；同一抗性品种SA处理后与对照之间基因的差异表达情况的分析，深入探讨不同抗性品种的差异表达基因在SA诱导过程中所起的作用。4.1.10.1未SA处理差异基因分析51 甘肃农业大学2017届博士学位论文根据本章节4.1.8和4.1.9所述实验方法，分析抗病品种北之幸和感病品种礼泉短富未经SA处理的样品之间的差异表达基因，统计上调或下调差异基因的数量，对差异表达基因做GO分类分析、COG功能注释和KEGG富集分析，以获得不同抗轮纹病苹果品种差异基因的功能和调控网络信息。E1_vs_E3差异基因筛选GO与COG分析Pathway分析图4.3不同苹果基因型差异基因分析路线图Fig.4.3Routediagramofdifferentialexpressiongenesindifferentapplevarieties注：E1代表未处理的抗病品种北之幸；E3代表未处理的感病品种礼泉短富。Note:E1onbehalfoftheuntreateddisease-resistantvarietiesKitanosach;E3onbehalfoftheuntreateddisease-susceptiblevarietiesLiquanduanfu.4.1.10.2SA处理不同苹果基因型SA诱导后差异基因分析根据本章节4.1.8和4.1.9所述实验方法，分析抗病品种北之幸和感病品种礼泉短富经SA诱导处理后，样品之间的差异表达基因，统计上调或下调差异基因的数量，对差异表达基因做GO分类分析、COG功能注释和KEGG富集分析，以获得不同抗轮纹病苹果品种在SA介导后差异基因的变化和功能。E2_vs_E4差异基因筛选GO与COG分析Pathway分析图4.4不同苹果基因型SA诱导后差异基因分析路线图Fig.4.4RoutediagramofdifferentialexpressiongenesindifferentapplevarietiesinducedbySalicylicacid注：E2代表SA处理的抗病品种北之幸；E4代表SA处理的感病品种礼泉短富。Note:E2onbehalfofthetreateddisease-resistantvarietiesKitanosachbySA;E4onbehalfofthetreateddisease-susceptiblevarietiesLiquanduanfubySA.52 甘肃农业大学2017届博士学位论文4.1.10.3同一苹果基因型SA诱导前后差异基因分析根据本章节4.1.8和4.1.9所述实验方法，筛选北之幸或礼泉短富在SA诱导前、后样品中的差异表达基因，即统计同一品种在SA处理前和处理后的差异表达基因。对同一品种处理前、后的差异表达基因进行归类，对差异表达基因进行GO分类分析、COG功能注释和pathway富集分析。E1_vs_E2E3_vs_E4差异基因筛选差异基因筛选GO与COG分析Pathway分析GO与COG分析Pathway分析图4.5同一苹果基因型SA诱导前后差异基因分析路线图Fig.4.5RoutediagramofdifferentialexpressiongenesinsimilarapplevarietiesinducedbySalicylicacid注：E1代表未处理的抗病品种北之幸；E2代表SA处理的抗病品种北之幸；E3代表未处理的感病品种礼泉短富；E4代表SA处理的感病品种礼泉短富。Note:E1onbehalfoftheuntreateddisease-resistantvarietiesKitanosach;E2onbehalfofthetreateddisease-resistantvarietiesKitanosachbySA;E3onbehalfoftheuntreateddisease-susceptiblevarietiesLiquanduanfu;E4onbehalfofthetreateddisease-susceptiblevarietiesLiquanduanfubySA.4.1.11实时荧光定量PCR验证为验证有Illumina测序数据获得的差异表达基因的可靠性，本实验选取了6个在北之幸和礼泉短富中共同上调表达的差异基因MDP0000916403（oxidation-reductionprocess，氧化还原过程）、MDP0000223968（defenseresponsetofungus，真菌防御反应）、MDP0000039357（lipidtransport，脂质转运）、MDP0000158474（cell-cellsignaling，细胞信号传导）、MDP0000329063（cellwallmodification，细胞壁修饰）和MDP0000362305（defenseresponse，防御反应），以及1个葡聚糖转运蛋白基因(MDP0000306738)、2个几丁质酶基因(MDP0000218691和MDP0000321244)，共9个候选差异表达基因进行Q-PCR检测。以相同SA处理的北之幸和礼泉短富与清水处理的北之幸和礼泉短富（对照）的第一链cDNA(稀释8倍)为模板，用PrimerPremier5.0软件设计差异基因特异53 甘肃农业大学2017届博士学位论文[241]性引物（见表4.1），以管家基因多聚泛素酶基因UBQ为内参基因，在ABISteponeplus型荧光定量PCR仪上进行Q-PCR检测。反应体系总体积20µl，其中包含10µlSybrGreenqPCRMasterMix，0.4µl引物和2µl模板。反应条件为：95℃，3mm；95℃，7s，57℃，10s，72℃，15s，40次循环。设3次重复，用-(∆∆Ct)[242]无菌水作对照，采用2算法，对基因表达量进行分析。表4.1差异表达基因Q-PCR所用引物Table4.1PrimersusedforQ-PCRGeneIDForwardprimer(5'-3')Reverseprimer(5'-3')MDP0000916403TGTTGCTCAGCCTCAGAACGGCCCAAACCCTATCCCAGTAMDP0000223968TAATGGGCACGATTGGCTACATCTCGGGGTCTACGGTTTCMDP0000158474AGGAACCATTTACGACCGCCGTGGCATAGACCAAGACAGTMDP0000039357TGCTTGGTGGTGGTGATGTTGTGGTTTGAGCCAGGTTGTAGAMDP0000329063ACCAAAGGAAATGGCTGTCTCGTTGACGAGAGTGAGGATGGAMDP0000362305GTTTATTTCCAACCGTCTTCGTTCCTACCCTCAGCAACCATCMDP0000218691ACATCAGAACCTGCCAATCAAAAGCGGACTGACCACCTAAGAAMDP0000306738ACTTCGTATGGTGGGTGGTGTGCGTTGATGGGTTGGATMDP0000321244AAGACATCACAAGAGGAAAGGGCCATAAAAGCGGGAGCAATAUBQCTCCGTGGTGGTTTTTAAGTGGAGGCAGAAACAGTACCAT4.2结果与分析4.2.1样品总RNA的质量检测用Trizol法提取E1-E4样品总RNA，通过Agilent2100检测，结果表明：4个苹果RNA样品的28S/18S均大于1.0，RIN值均大于7（图4.6），说明RNA完整性好，可进行后续研究。54 甘肃农业大学２０１７届博士学位论文４７ＣＫ（Ｅｌ）４７ＳＡ（Ｅ２）＿：ｎ－ｉａ：｜＿；！Ｓ谫■｜—：－：：？ｉ？ｒ－ｇ：：：Ｍ；！？ｉ：ｎ；ｉ；；＇ｉＷｉ：ｉＬ＝Ｈｉ＇－ｖ茂；；ｌｉｉＡｉ；：、＇——■、ｉ一，，—；＾＿＿＿＿：＇———＾Ｊ｜＼＾＾＇＂一＇■．．－＂－－－——＾一■．ｙＣｒｔｆｔ鸢－：ｉ｜；ｒｆ；，．ＩｉＩＩｉｉＩｉＩＩ１ｉｉｓｍｍ３０３ｍｍ＿ａ挪鄉ｍｍ■闕ＯｖｅｒａｌｌＲｅｓｕｌｔｓｆｏｒｓａｍｐｌｅ＼１：４７ＣＫ（Ｅｌ）ＯｖｅｒａｌｌＲｅｓｕｌｔｓｆｏｒｓａｍｌｅ１１：４７ＳＡ（Ｅ２）ｐＲＮＡＡｒｅａ：８６７．７ＲＮＡＡｒｅａ：５８６．７ＲＮＡＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：５１３ｎｇ／ｉｌＲＮＡＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：３４７ｎ／ａｌ｜ｇｊｒＲＮＡＲａｔｉｏ［２５ｓ／１８ｓ］：４．２ｒＲＮＡＲａｔｉｏ２５ｓ／１８ｓ；３．２［］ＲＮＡＡ．ＮｕｍＩｎｔｅｇｒｉｔｙＮｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）：８．３（Ｂ．０２．０８）ＲＮＩｎｔｅｇｒｉｔｙｂｅｒ（ＲＩＮ）：８．４（Ｂ．０２．０８）ＲｅｓｕｌｔＦｌａｇｇｉｎｇＣｏｌｏｒ；１ＩＲｅｓｕｌｔＦｌａｇｇｉｎｇＣｏｌｏｒ：Ｉ１８３０ＲｅｓｕｌｔＦｌａｉｎＬａｂｅｌ：ＲＴＮ：．ＲｅｓｕｌｔＦｌａｉｎＬａｂｅｌ：ＲＩＮ：８．４０ｇｇｇｇｇｇＦｒａｇｍｅｎｔｔａｂｌｅｆｏｒｓａｍｐｌｅ１１：４７ＣＫ（Ｅｌ）Ｆｒａｇｍｅｎｔｔａｂｌｅｆｏｒｓａｍｐｌｅ１１：４７ＳＡ（Ｅ２）ＮａｍｅＳｔａｒｔＳｉｚｅ［ｎｔ］ＥｎｄＳｉｚｅ［ｎｔ］Ａｒｅａ％ｏｆｔｏｔａｌＡｒｅａＮａｍｅＳｔａｒｔＳｉｚｅ［ｎｔ］ＥｎｄＳｉｚｅ［ｎｔ］Ａｒｅａ％ｏｆｔｏｔａｌＡｒｅａ１８Ｓ１，６６６２，０５９６９．３８．０１８Ｓ１，６７５２，１５８６０．３１０．３２５Ｓ２，３９７３，６２０２９０．５３３．５２５Ｓ２，９３１３，６２０１９５．０３３．２２８３ＣＫ（Ｅ３）￣闕２８３ＳＡ（Ｅ４）闕：ｒｉ－ｎｐ－陡．．－：丨诺丨：丨；丨丨；－Ｉ：锻１：；：；；心；Ｈ－ｍｍＳｍｕｍ羁：ｔｓｍ，Ｊ：１；！１ｉ＾－ｉ：！？？：？：ｍｉｉ：ｊ；；，；；！．：：：：：：ｉ：；ｉ：：；－—Ｂｉ：Ａ，Ｕ＼；ｎ＿：＿＿＿＿ＬｌＪ一？Ｊ＿＾＿＿＿一—一丄０ｇＪ．１＾￣！ｊ：ＳＩＩＩ！ＨＩＩ２５ｍｍｉｍｍ＿ｎ遛锻蒯獼螂＿１ＯｖｅｒａｌｌＲｅｓｕｌｔｓｆｏｒｓａｍｐｌｅ１１：２Ｓ３ＣＫＣＥ３）ＯｖｅｒａｌｌＲｅｓｕｌｔｓｆｏｒｓａｍｐｌｅ１１：２８３ＳＡ（Ｅ４）ＩＲＮＡＡｒｅａ：７５０．５ＲＮＡＡｒｅａ：６９６．８ＲＮＡＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：４６２ｎｇ／ｊｉｌＲＮＡＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；４２９ｎｇ／ｉｌ｜ｒＲＮＡＲａｔｉｏ［２５ｓ／１８ｓ］：２．６ｒＲＮＡＲａｔｉｏ［２５ｓ／１８ｓ］：２．７ＲＮＡＩｎｔｅｒｉｔｙＮｕｍｂｅｒ（Ｒ１Ｎ）：８．９（Ｂ．０２．０８）ＲＮＡＩｎｔｅｒｉｔｙＮｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）：８．８（Ｂ．０２．０８）１ｇｇＲｅｓｕｌｔＦｌａｇｇｉｎｇＣｏｌｏｒ：１１ＲｅｓｕｌｔＦｌａｇｇｉｎｇＣｏｌｏｒ：１１ＲｅｓｕｌｔＦｌａｇｇｉｎｇＬａｂｅｌ：ＲＴＮ：８．９０ＲｅｓｕｌｔＦｌａｇｇｉｎｇＬａｂｅｌ：ＲＩＮ：８．８０Ｆｒａｇｍｅｎｔｔａｂｌｅｆｏｒｓａｍｐｌｅ１１：２８３ＣＫ（Ｅ３）Ｆｒａｇｍｅｎｔｔａｂｌｅｆｏｒｓａｍｐｌｅ１１：２８３ＳＡ（Ｅ４）ＮａｍｅＳｔａｒｔＳｉｚｅ［ｎｔ］ＥｎｄＳｉｚｅ［ｎｔ］Ａｒｅａ％ｏｆｔｏｔａｌＡｒｅａＮａｍｅＳｔａｒｔＳｉｚｅ［ｎｔ］ＥｎｄＳｉｚｅ［ｎｔ］Ａｒｅａ％ｏｆｔｏｔａｌＡｒｅａ１８Ｓ１，６７７２，１７３８９．９１２．０１８Ｓ１，６８２２，１８９７４．８１０．７２５Ｓ２，９４８３，６３８２３２．８３１．０２５Ｓ２，９７３３，６８７２０２．１２９．０５５ 甘肃农业大学2017届博士学位论文图4.6样品RNA的Agilent2100检测结果Fig.4.6TheresultsofgenedetectedbyAgilent2100注：E1代表未处理的抗病品种北之幸；E2代表SA处理的抗病品种北之幸；E3代表未处理的感病品种礼泉短富；E4代表SA处理的感病品种礼泉短富。Note:E1onbehalfoftheuntreateddisease-resistantvarietiesKitanosach;E2onbehalfofthetreateddisease-resistantvarietiesKitanosachbySA;E3onbehalfoftheuntreateddisease-susceptiblevarietiesLiquanduanfu;E4onbehalfofthetreateddisease-susceptiblevarietiesLiquanduanfubySA.4.2.2测序结果统计通过测序，共获得35.30Mreads，总碱基数为1.80G。碱基Q30均在88%以上（表4.2）。因此测序结果满足后续分析的要求。表4.2表达谱文库测序统计Table.4.2Thesequencingresultsofgeneexpressionprofilinglibrary测序总碱基数样品原始序列GC百分比Q30百分比TotalSamplesTotalreadsGCpercentageQ30percentagenucleotides(bp)E18,803,772448,931,16946.49%88.87%E28,727,853445,055,92146.88%88.47%E38,921,260454,916,14046.51%88.97%E48,845,306451,042,77146.25%88.56%4.2.3RNA-Seq整体质量评估结果从比对结果来看（表4.3），4个苹果样品的reads与苹果参考基因组的比对效率都较高，均在62%以上，表明测序及所选的苹果参考基因较好。表4.3比对结果统计Table.4.3TheresultsofmappedreadsUniquemappedMultiplemappedSamplesTotalreadsMappedreadsreadsreadsE18,803,7725,459,971(62.02%)5,065,767(92.78%)394,204(7.22%)E28,727,8535,440,598(62.34%)5,036,873(92.58%)403,725(7.42%)E38,921,2605,570,829(62.44%)5,157,613(92.58%)413,216(7.42%)E48,845,3065,522,632(62.44%)5,108,309(92.50%)414,323(7.50%)56 甘肃农业大学2017届博士学位论文图4.7苹果测序饱和度分析图Fig.4.7Saturationanalysisofsequencinginapple4.2.4不同苹苹果基因型型差异基因因分析(未处理未)4.2.4.1差异基基因筛选选不同抗性的苹果品种之间存在一定的差异表达基因。以FDR<0.01且FoldChange>=2作为标准，筛选差异基基因（DEG，differentiallyexpressedgenes），将各样品测序得到的reads与Unigene库进行比对，共得到差异表达基因1382个，有540个差异基因上调表达，842个是下调表达的差异基因。不同苹果基因型间下调表达的基因数多于上调表达的基因数，说明不同抗性品种间的差异表达基因在用SA处理前存在很大差异。4.2.4.2差异基基因功能能注释及分分类(COG/GO分析析)将Unigene与COG数据库进行比对，结果表明，共得到23个COG功能类别（见图4.8），差异基因数目最多多的（166个）是整体功能类（Generalfimctionpredictiononly），其次是转录功能类（Transcription）有82个差异基因。此外与抗性相关的功能注释信息有：16个差异基因参与防御机制（Defensemechanisms）、76个差异基因参与了信号转导机制(Signaltransductionmechanisms)、26个差异基因参与了能量产生与转导(Energyproductionandconversion)而参与离子转运机制(Inorganiciontransportandmetaboolism)的差异基因有27个。在差异表达基因中，参与的GO显著性功能分类有48项，富集数量最多是代谢过程(metabolicprocess)，共有799个、有373个应答刺激(responsetostimulus)、57 甘肃农业大学2017届博士学位论文3322个生物学调控(biologicalregulation)、免疫系统过程(immunesystemprocess)有36个和抗氧化活性(antioxidantactivity)有13个(见表4.4和图4..9)。图4.8不同苹果基因型差异表达基因COG功能分类Fig.4.8COGfunctionclassificationofdifferentialexpressiongenesindifferentapplevarieties图4.9不同苹果基因型差异表达基因GO归类Fig.4.9TheGeneOntologyofdifferentialexpressiongeenesindifferentapplevarieties58 甘肃农业大学2017届博士学位论文表4.4不同苹果基因型差异表达基因GO归类Table4.4TheGeneOntologybasedondifferentialgenesindifferentapplevarietiesGO-classifyAllUnigeneDEGUnigenecellpart14342634Cell14150623Organelle11913495Membrane6681343organellepart4057176membranepart2652156extracellularregion1199139macromolecularcomplex256096celljunction84263membrane-enclosedlumen3737extracellularmatrix224extracellularmatrixpart64Nucleoid402extracellularregionpart232Virion100virionpart100synapsepart30Synapse30catalyticactivity11467676Binding11818608transporteractivity159882electroncarrieractivity52956nucleicacidbindingtranscriptionfactoractivity82735enzymeregulatoractivity33116antioxidantactivity18513structuralmoleculeactivity56611moleculartransduceractivity35411receptoractivity1685proteinbindingtranscriptionfactoractivity562nutrientreservoiractivity382channelregulatoractivity21metallochaperoneactivity120proteintag70translationregulatoractivity20metabolicprocess15060799cellularprocess14192689responsetostimulus7360373biologicalregulation6508332developmentalprocess4003236cellularcomponentorganizationorbiogenesis3911235Localization418719159 甘肃农业大学2017届博士学位论文establishmentoflocalization4006178multicellularorganismalprocess3013168Reproduction2245125reproductiveprocess2222124Signaling165885multi-organismprocess140070Growth76848cellproliferation16539immunesystemprocess69836Pigmentation14319Death14312biologicaladhesion1324rhythmicprocess1034Locomotion353carbonutilization80viralreproduction170cellkilling204.2.4.3代谢通路分析对抗病品种北之幸和感病品种礼泉短富处理前差异基因可能涉及或参与的代谢通路进行分析，结果表明参与的代谢通路共有73个。而与抗病相关的代谢通路有7个（见表4.5），主要是：Peroxisome(过氧化物酶体途径，ko04146)有12个差异基因参与、Phenylpropanoidbiosynthesis(苯丙烷生物合成途径，ko00940)有8个差异基因参与、Terpenoidbackbonebiosynthesis(萜类化合物生物合成途径，ko00900)有5个差异基因参与、Plant-pathogeninteraction(植物与病原菌互作途径，ko04626)有5个差异基因参与、Planthormonesignaltransduction(植物激素信号转导途径，ko04075)也有5个差异基因参与、Phenylalaninemetabolism(苯丙氨酸代谢途径，ko00360)和Ribosome(核糖体途径，ko03010)分别有2个差异基因参与。其中，当P≤0.05时，分析到3条显著性抗病相关代谢通路，即：过氧化物酶体途径、苯丙烷生物合成途径和萜类化合物生物合成途径。60 甘肃农业大学2017届博士学位论文表4.5不同苹果基因型的差异表达基因通路分析Table4.5DiseaseresistancerelatedpathwayanalysisofdifferentialexpressiongenesindifferentapplevarietiesDEGswithpathwayPathwayp_valueko__idDifferentiallyexpressedgenesannotationPeroxisome12outof1630.000172ko04146MDP0000123488;MDP0000127652;MDP0000201853;7.36%MDP0000258717;MDP0000265684;MDP0000283767;MDP0000309331;MDP0000321336;MDP0000391825;MDP0000670256;MDP0000678891;MDP0000706975Phenylpropanoid8outof1630.043456ko00940MDP0000037251;MDP0000152900;MDP0000217844;biosynthesis4.91%MDP0000231809;MDP0000268045;MDP0000306738;MDP0000509949;MDP0000691789Terpenoidbackbone5outof1630.033772ko00900MDP0000197886;MDP0000219992;MDP0000242401;biosynthesis3.07%MDP0000265911;MDP0000302757Plant-pathogen5outof1630.648459ko04626MDP0000133343;MDP0000168498;MDP0000261979;interaction3.07%MDP0000321613;MDP0000871409Planthormonesignal5outof1630.924631ko04075MDP0000020317;MDP0000135392;MDP0000288983;transduction3.07%MDP0000296324;MDP0000871409Phenylalanine2outof1630.841095ko00360MDP0000509949;MDP0000691789metabolism1.23%Ribosome2outof1630.999845ko03010MDP0000467239;MDP00008369481.23%4.2.5不同苹果基因型SA诱导后差异基因分析(SA处理)4.2.5.1差异基因筛选SA处理后，对不同抗性苹果品种之间存在的差异表达基因进行分析，根据筛选标准，将各样品测序得到的reads与Unigene库进行比对，共得到差异表达基因828个，356个差异基因上调表达，472个差异基因下调表达。下调表达基因仍多于上调表达基因，说明不同抗性品种间的差异表达基因在SA处理后还存在较大差异。4.2.5.2差异基因功能注释及分类(COG/GO分析)对抗病品种北之幸和感病品种礼泉短富经SA诱导处理后的差异基因做COG分析，结果显示（见图4.10），差异基因数目最多的是整体功能类，为116个，其次是复制、重组和修复功能类有45个差异基因，碳水化合物转运与代谢功能类有42个差异基因。与抗性相关的功能注释主要有：信号转导机制（38个61 甘肃农业大学2017届博士学位论文差异基因）、离子转运机制(26个差异基因)、能量产生与转导（24个差异基因）和防御机制（7个差异基因）。在对差异表达基因的分析中，参与的GO显著性功能分类有46项，其中包括489个代谢过程(metabolicprocess)分类项、263个应答刺激(responsetostimulus)、2100个生物学调控(biologicalregulation)、18个免疫系统过程(immunesystemprocess)和13个抗氧化活性(antioxidantactivity)(见表4.6和图4.11)。图4.10不同苹果基因型SA诱导后差异表达基因COG功能分类Fig.4.10COGfunctionclassificationofdifferentialexpressiongenessindifferentapplevarietiesinnducedbySalicylicacid图4.11不同苹果基因型SA诱导后差异表达基因GO归类Fig.4.11TheGeneOntologyofdifferentialexpressiongeenesindifferentapplevarietiesinducedbySalicylicacid62 甘肃农业大学2017届博士学位论文表4.6不同苹果基因型SA诱导后差异表达基因GO归类Table4.6TheGeneOntologybasedondifferentialgenesindifferentapplevarietiesinducedbySalicylicacidGO-classifyAllUnigeneDEGUnigenecellpart14342392Cell14150385Organelle11913319Membrane6681203organellepart4057144membranepart265277macromolecularcomplex256075extracellularregion119955celljunction84233membrane-enclosedlumen37310Nucleoid402extracellularmatrix221extracellularmatrixpart61Virion100extracellularregionpart230virionpart100synapsepart30Synapse30catalyticactivity11467404Binding11818390transporteractivity159845electroncarrieractivity52932nucleicacidbindingtranscriptionfactoractivity82721structuralmoleculeactivity56614antioxidantactivity18513moleculartransduceractivity35410receptoractivity1687enzymeregulatoractivity3316nutrientreservoiractivity382proteinbindingtranscriptionfactoractivity560channelregulatoractivity20metallochaperoneactivity120proteintag70translationregulatoractivity20metabolicprocess15060489cellularprocess14192421responsetostimulus7360263biologicalregulation6508210cellularcomponentorganizationorbiogenesis3911154developmentalprocess4003146multicellularorganismalprocess3013108Localization4187102establishmentoflocalization400693Reproduction224585reproductiveprocess222285multi-organismprocess140055Signaling165853cellproliferation16534growth7681963 甘肃农业大学2017届博士学位论文immunesystemprocess69818pigmentation1436death1433biologicaladhesion1323locomotion352rhythmicprocess1032carbonutilization81cellkilling20viralreproduction1704.2.5.3代谢通路分析SA诱导处理抗病品种北之幸和感病品种礼泉短富后，差异基因可能涉及或参与的代谢通路共有71个。从结果中可以看出（见表4.7），与抗病相关的代谢通路主要有：Peroxisome(过氧化物酶体途径，ko04146)有6个差异基因参与、Planthormonesignaltransduction(植物激素信号转导途径，ko04075)有5个差异基因参与、Phenylpropanoidbiosynthesis(苯丙烷生物合成途径，ko00940)有3个差异基因参与、Terpenoidbackbonebiosynthesis(萜类化合物生物合成途径，ko00900)和Plant-pathogeninteraction(植物与病原菌互作途径，ko04626)分别有2个差异基因参与。发现经SA诱导处理后，不同品种间本身存在的差异表达基因数量明显减少，但参与的显著性功能GO分类和代谢通路数量变化不大，且涉及的范围大致相同。表4.7不同苹果基因型SA诱导后的差异表达基因通路分析Table4.7DiseaseresistancerelatedpathwayanalysisofdifferentialexpressiongenesindifferentapplevarietiesinducedbySalicylicacidDEGswithpathwayPathwayp_valueko__idDifferentiallyexpressedgenesannotationPeroxisome6outof1240.050655ko04146MDP0000123488;MDP0000127652;MDP0000258717;4.84%MDP0000309331;MDP0000321336;MDP0000391825Planthormone5outof1240.764262ko04075MDP0000092692;MDP0000135392;MDP0000143749;signaltransduction4.03%MDP0000296566;MDP0000585643Phenylpropanoid3outof1240.585459ko00940MDP0000268045;MDP0000563385;MDP0000750217biosynthesis2.42%Terpenoidbackbone2outof1240.404407ko00900MDP0000255398;MDP0000619097biosynthesis1.61%Plant-pathogen2outof1240.926503ko04626MDP0000184653;MDP0000321613interaction1.61%4.2.6同一苹果基因型SA诱导前后差异基因分析同一苹果品种经SA处理前后之间的差异，分为两组分析，一组是抗病品种64 甘肃农业大学2017届博士学位论文北之幸SA处理前后比较，另一组是感病品种礼泉短富SA处理前后比较，得到苹果中与SA诱导相关的苹果差异表达基因。4.2.6.1差异基因筛选将各样品测序得到的reads与Unigene库进行比对，在抗病品种北之幸处理组与对照组中，筛选出差异表达基因有257个，其中213个差异基因上调表达，44个差异基因下调表达。在感病品种礼泉短富处理组与对照组中，差异表达基因有150个，有110个差异基因上调表达，40个差异基因下调表达。从结果中可以看出，抗病品种北之幸处理前后得到的差异基因数量比感病品种礼泉短富处理前后得到的差异基因数量多，是礼泉短富的1.71倍。4.2.6.2差异基因功能注释及分类(COG/GO分析)对抗病品种北之幸SA处理前后的差异基因进行COG分析（见图4.12），从结果中可以看出，共得到19个COG功能类别，其中差异基因数目最多的还是整体功能类（24个），其次为次生代谢产物生物合成、运输和分解代谢功能类有21个差异基因。与抗病性相关的是：信号转导机制有9个差异基因、离子转运机制有7个差异基因、防御机制有5个差异基因和能量产生与转导有2个差异基因。在北之幸差异表达基因的分析中，参与的GO显著性功能分类有43项，其中代谢过程(metabolicprocess)分类项的富集数量最多，为171个、应答刺激(responsetostimulus)有91个、生物学调控(biologicalregulation)有58个、免疫系统过程(immunesystemprocess)有10个和抗氧化活性(antioxidantactivity)有4个(见图4.13，表4.8)。在感病品种礼泉短富SA处理前后差异基因的COG分析中（见图4.14），可以看出，得到的COG功能类别有16个，较北之幸的少，其中整体功能类的差异基因数目最多有18个，蛋白质翻译后的修饰、蛋白质折叠和分子伴侣功能类次之有16个差异基因。与抗病性相关的包括：离子转运机制(7个差异基因)、能量产生与转导（5个差异基因）和信号转导机制（4个差异基因），而涉及防御机制的差异基因没有注释到。感病品种礼泉短富差异表达基因参与的显著性功能GO分类共39项，较北之幸的功能分类数少，其中代谢过程(metabolicprocess)分类项为88个、应答刺65 甘肃农业大学2017届博士学位论文激(responsetostimulus)有49个、生物学调控(biologicalregulation)有23个、免疫系统过程(immunesystemprocess)有5个和抗氧化活性(antioxidantaactivity)有3个(见图4.15，表4.9)，均少于北之幸的差异基因数量。图4.12抗病品种北之幸SA处理前后差异表达基因COG功能分类Fig.4.12COGfunctionclassificationofdifferentialexpressiongenesofKitanosachinducedbySalicylicacid图4.13抗病品种北之幸SA处理前后差异表达基因GO归类Fig.4.13TheGeneOntologygofdifferentialexpressiongenesofKitanoosachinducedbySalicylicacid66 甘肃农业大学2017届博士学位论文表4.8抗病品种北之幸SA处理前后差异表达基因GO归类Table4.8TheGeneOntologybasedondifferentialgenesofKitanosachinducedbySalicylicacidGO-classifyAllUnigeneDEGUnigenecell14150114cellpart14342114organelle1191389membrane668158extracellularregion119946organellepart405727membranepart265224celljunction84212macromolecularcomplex256011membrane-enclosedlumen3732extracellularmatrix221extracellularmatrixpart61extracellularregionpart231nucleoid400virion100virionpart100synapsepart30synapse30catalyticactivity11467150binding11818121electroncarrieractivity52918transporteractivity159810enzymeregulatoractivity3315antioxidantactivity1854nucleicacidbindingtranscriptionfactoractivity8272moleculartransduceractivity3542receptoractivity1681proteinbindingtranscriptionfactoractivity560structuralmoleculeactivity5660channelregulatoractivity20metallochaperoneactivity120proteintag70translationregulatoractivity20nutrientreservoiractivity380metabolicprocess15060171cellularprocess14192137responsetostimulus736091biologicalregulation650858developmentalprocess40035767 甘肃农业大学2017届博士学位论文celllularcomponentorganizationorbiogenesis391151multicellularorganismalprocess301336reproduction224529reproductiveprocess222227loccalization418726multi-organismprocess140026establishmentoflocalization400625signaling165818growth76817immunesystemprocess69810pigmentation1437celllproliferation1656death1433loccomotion352celllkilling21carbonutilization81viralreproduction170biologicaladhesion1320rhythmicprocess1030图4.14感病品种礼泉短富SA处理前后差异表达基因COG功能分类Fig.4.14COGfunctionclassificationofdifferentialexpressiongenesofLiquanduanfuinnducedbySalicylicacid68 甘肃农业大学2017届博士学位论文图4.15感病品种礼泉短富SA处理前后差异表达基因GO归类Fig.4.15TheGeneOntologyofdifferentialexpressiongenesofLiquanduanfuinducedbySalicylicacid表4.9感病品种礼泉短富SA处理前后差异表达基因GO归类Tablee4.9TheGeneOntologyobasedondifferentialgenesofLiquanduanfuinducedbySalicylicacidGO-classifyAllUnigeneDEGUnigenecell1415056cellpart1434256membrane668141organelle1191341extracellularregion119918membranepart265216organellepart405711celljjunction8426macromolecularcomplex25604membrane-enclosedlumen3732nucleoid401virion100extracellularmatrix220extracellularmatrixpart60extracellularregionpart230virionpart100synapsepart30synapse30catalyyticactivity1146771binding1181860electtrroncarrieractivity52910transporteractivity15988antioxidantactivity1853receptoractivity168269 甘肃农业大学2017届博士学位论文structuralmoleculeactivity5662moleculartransduceractivity3542nucleicacidbindingtranscriptionfactoractivity8271enzymeregulatoractivity3311proteinbindingtranscriptionfactoractivity560channelregulatoractivity20metallochaperoneactivity120proteintag70translationregulatoractivity20nutrientreservoiractivity380metabolicprocess1506088cellularprocess1419267responsetostimulus736049developmentalprocess400323biologicalregulation650823cellularcomponentorganizationorbiogenesis391120localization418716establishmentoflocalization400616multi-organismprocess140014multicellularorganismalprocess301313reproduction224510reproductiveprocess222210signaling16589immunesystemprocess6985growth7685cellproliferation1653pigmentation1432cellkilling21carbonutilization80viralreproduction170death1430biologicaladhesion1320locomotion350rhythmicprocess10304.2.6.3代谢通路分析SA诱导处理抗病品种北之幸后与对照相比，差异基因可能涉及或参与的代谢通路共有40个。但与抗病相关的代谢通路主要有7个（见表4.10），即：Phenylpropanoidbiosynthesis(苯丙烷生物合成途径，ko00940)有7个差异基因参与、Phenylalaninemetabolism(苯丙氨酸代谢途径，ko00360)有5个差异基因参与、Flavonoidbiosynthesis(类黄酮生物合成途径，ko00941)和Peroxisome(过氧化物酶体途径，ko04146)分别有4个差异基因参与、Planthormonesignaltransduction(植物激素信号转导途径，ko04075)、Terpenoidbackbonebiosynthesis(萜类化合物生物合成途径，ko00900)和Plant-pathogeninteraction(植物与病原菌互作途径，ko04626)分别有1个差异基因参与。70 甘肃农业大学2017届博士学位论文对感病品种礼泉短富经SA诱导处理后差异基因所涉及的代谢通路进行分析，从结果中看出，可能涉及或参与的代谢通路只有16个，明显少于抗病品种北之幸。而与抗病相关的代谢通路主要有4个（见表4.11）：Phenylpropanoidbiosynthesis(苯丙烷生物合成途径，ko00940)、Plant-pathogeninteraction(植物与病原菌互作途径，ko04626)和Flavonoidbiosynthesis(类黄酮生物合成途径，ko00941)分别有2个差异基因参与、Peroxisome(过氧化物酶体途径，ko04146)有1个差异基因参与。虽然在大多数代谢途径中礼泉短富参与的差异基因较北之幸的少，但在植物与病原菌互作途径中，礼泉短富的差异基因多于北之幸的。结果显示，不同抗性品种在SA诱导处理后所产生的差异基因数量明显不同，抗性品种产生的差异基因数量多，而感病品种产生的差异基因数量相对较少，并且涉及到的代谢通路也少，这与品种间本身的抗病性有关，同时也表明抗病品种的抗性相关基因更易受到SA的诱导。表4.10抗病品种北之幸SA处理前后差异表达基因通路分析Table4.10DiseaseresistancerelatedpathwayanalysisofdifferentialexpressiongenesofKitanosachinducedbySalicylicacidPathwayDEGswithpathwayp_valueko__idDifferentiallyexpressedgenesannotationPhenylpropanoid7outof460.000101ko00940MDP0000037251;MDP0000218979;MDP0000229348;biosynthesis15.22%MDP0000261492;MDP0000306738;MDP0000388769;MDP0000691789Phenylalanine5outof460.001981ko00360MDP0000218979;MDP0000229348;MDP0000261492;metabolism10.87%MDP0000388769;MDP0000691789Flavonoid4outof460.002251ko00941MDP0000218979;MDP0000229348;MDP0000320264;biosynthesis8.70%MDP0000323864Peroxisome4outof460.016735ko04146MDP0000201853;MDP0000258717;MDP0000309331;8.70%MDP0000321336Planthormone1outof460.910304ko04075MDP0000296566signaltransduction2.17%Terpenoidbackbone1outof460.404341ko00900MDP0000242401biosynthesis2.17%Plant-pathogen1outof460.794593ko04626MDP0000168498interaction2.17%71 甘肃农业大学2017届博士学位论文表4.11感病品种礼泉短富SA处理前后差异表达基因通路分析Table4.11DiseaseresistancerelatedpathwayanalysisofdifferentialexpressiongenesofLiquanduanfuinducedbySalicylicacidPathwayDEGswithp_valueko__idDifferentiallyexpressedgenespathwayannotationPhenylpropanoid2outof200.083655ko00940MDP0000563385;MDP0000750217biosynthesis10%Plant-pathogen2outof200.144228ko04626MDP0000203499;MDP0000254260interaction10%Flavonoid2outof200.024339ko00941MDP0000320264;MDP0000323864biosynthesis10%Peroxisome1outof200.3547ko04146MDP00001276525%4.2.7苯丙烷氨类代谢途径苯丙烷类代谢途径是植物体内次生物质代谢的一条重要途径。在此途径中有三个关键酶：苯丙氨酸解氨酶（PAL，EC4.3.1.5）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H，EC1.14.13.11）和4-香豆酸-CoA连接酶（4CL，EC6.2.1.12）。通过分析发现（见表4.12，4.13），这3种酶基因在SA处理前后的同一苹果样品中存在差异表达，并且在苹果抗、感病品种中也存在差异表达。在SA处理北之幸前后，参与苯丙烷类代谢途径的基因均上调表达；而SA诱导礼泉短富的处理中未检测到参与苯丙烷类代谢途径的差异基因；品种之间比较，未处理前两品种间的差异基因较多，但礼泉短富较北之幸大多下调表达；SA处理后，礼泉短富的表达量仍较北之幸的低。具有抗菌活性的中间产物，如类黄酮、木质素、生物碱等在抗、感病品种中也存在差异表达，且水杨酸诱导抗病品种北之幸后上调表达的基因最多。表4.12参与苯丙烷代谢途径的差异表达基因Table4.12DifferentialexpressiongenesinvolvedinPhenylpropanoidmetabolismpathwayGeneIDE1_vs_E2E1_vs_E3E2_vs_E4MDP0000030527—downdownMDP0000143641——downMDP0000201058updown—MDP0000225338—up—MDP0000227393updown—72 甘肃农业大学2017届博士学位论文MDP0000260604—upupMDP0000376256—downdownMDP0000444205—down—MDP0000659907updowndownMDP0000691789updown—MDP0000827894updown—MDP0000899966updown—注：E1代表未处理的抗病品种北之幸；E2代表SA处理的抗病品种北之幸；E3代表未处理的感病品种礼泉短富；E4代表SA处理的感病品种礼泉短富。样品组合中前一个为对照组，后一个为实验组。Note:E1onbehalfoftheuntreateddisease-resistantvarietiesKitanosach;E2onbehalfofthetreateddisease-resistantvarietiesKitanosachbySA;E3onbehalfoftheuntreateddisease-susceptiblevarietiesLiquanduanfu;E4onbehalfofthetreateddisease-susceptiblevarietiesLiquanduanfubySA.Compositesamplefirstoneasthecontrolgroup,afteroneasexperimentalgroup.表4.13与苯丙烷途径中代谢产物相关的差异表达基因Table4.13DifferentialexpressiongenesassociatedwithmetaboliteinPhenylpropanoidmetabolismpathwayE1_vs_E2E1_vs_E3E3_vs_E4E2_vs_E4名称数量updownupdownupdownupdownPhenylalanine750050000cinnamate4-hydroxylase（C4H）2200000004-coumaryl:CoAligase（4CL）110010000Flavonoid2393970352lignin920143013alkaloid100010001注：E1代表未处理的抗病品种北之幸；E2代表SA处理的抗病品种北之幸；E3代表未处理的感病品种礼泉短富；E4代表SA处理的感病品种礼泉短富。样品组合中前一个为对照组，后一个为实验组。Note:E1onbehalfoftheuntreateddisease-resistantvarietiesKitanosach;E2onbehalfofthetreateddisease-resistantvarietiesKitanosachbySA;E3onbehalfoftheuntreateddisease-susceptiblevarietiesLiquanduanfu;E4onbehalfofthetreateddisease-susceptiblevarietiesLiquanduanfubySA.Compositesamplefirstoneasthecontrolgroup,afteroneasexperimentalgroup.4.2.8水杨酸信号途径植物抗病信号传导途径主要有水杨酸(salicylicacid，SA)，乙烯(ethylene，ET)和茉莉酸(jasmonicacid，JA)途径，它们所参与的抗性调控有所不同。水杨酸不但参与了植物的HR反应，还参与了植物的SAR反应，被普遍认为是SAR产生[162]的信号分子之一，在SAR信号转导过程中具有关键作用。位于SA下游的两类重要转录因子NPR1和WRKY也是重要的抗病因子。NPR1可调节寄主植物整体产生抗病性，SA可以促使NPR1的活化，使NPR1单体化，从而引起下游抗病基因的表达。处于SA下游信号转导的WRKY，可以通过绑定PR基因的W-box来调节基因的表达。73 甘肃农业大学2017届博士学位论文通过实验分析发现（见表4.14），经SA诱导后，在抗病品种和感病品种中都有差异基因参与水杨酸信号途径，且在感病品种中都上调表达；品种间的差异基因较多，感病品种礼泉短富较抗病品种北之幸无论SA诱导与否，差异基因的表达量大多都较北之幸的低。说明除了品种之间本身存在差异外，外源施用SA更易诱导抗病品种中与水杨酸信号途径相关的差异基因的表达量上调。表4.14水杨酸信号途径差异表达基因Table4.14DifferentialexpressiongenesinvolvedinsalicylicacidmediatedsignalingpathwayGeneIDE1_vs_E2E1_vs_E3E3_vs_E4E2_vs_E4MDP0000084184—down—downMDP0000145529—down—downMDP0000147201—down——MDP0000159747—down——MDP0000173092—up——MDP0000194460—down—downMDP0000204804———downMDP0000230967—up——MDP0000267169—down—downMDP0000291815———downMDP0000321244down———MDP0000388228———downMDP0000390627———downMDP0000509245—up——MDP0000589856—up—upMDP0000618065—down——MDP0000657536up———MDP0000676693——up—MDP0000930978—downup—注：E1代表未处理的抗病品种北之幸；E2代表SA处理的抗病品种北之幸；E3代表未处理的感病品种礼泉短富；E4代表SA处理的感病品种礼泉短富。样品组合中前一个为对照组，后一个为实验组。Note:E1onbehalfoftheuntreateddisease-resistantvarietiesKitanosach;E2onbehalfofthetreateddisease-resistantvarietiesKitanosachbySA;E3onbehalfoftheuntreateddisease-susceptiblevarietiesLiquanduanfu;E4onbehalfofthetreateddisease-susceptiblevarietiesLiquanduanfubySA.Compositesamplefirstoneasthecontrolgroup,afteroneasexperimentalgroup.4.2.9实时荧光定量PCR验证通过对生物信息学的注释，共获得2588条Unigene的注释结果。我们选取了9个基因进行Q-PCR分析，来验证Illumina测序结果的可靠性。其中有6个差异基因是两个抗感品种中共表达的，主要涉及到氧化还原过程74 甘肃农业大学2017届博士学位论文（MDP0000916403）、真菌防御反应（MDP0000223968）、脂质转运（MDP0000039357）、细胞信号传导（MDP0000158474）、细胞壁修饰（MDP0000329063）和防御反应（MDP0000362305），以及1个葡聚糖转运蛋白基因(MDP0000306738)、2个几丁质酶基因(MDP0000218691和MDP0000321244)。从Q-PCR结果中(图4.16)可以看出：验证的9个差异表达基因的实时荧光定量检测结果与RNA-Seq测序结果基本一致，但由于RNA-Seq测序比Q-PCR灵敏[113]度高，因此仅在差异表达的倍数上，存在一定的偏差。但是总的来说，Q-PCR验证的结果与RNA-Seq测序的表达趋势基本一致，说明本研究中RNA-Seq的测序的结果是可靠的。图4.16部分差异表达基因的Q-PCR验证Fig.4.16PartofdifferentialexpressedgenevalidatedbyQ-PCR75 甘肃农业大学2017届博士学位论文4.3讨论在自然界生物的长期协同进化中，植物与病原物也在不断地互相选择，相互适应，从而产生了植物的抗病性，这种现象在整个植物界都是普遍存在的，它贯穿植物的生长发育、生理调节等一系列过程，涉及的相关代谢途径复杂且相关基因数目庞大。RNA-Seq技术在无需预先知晓该物种与特定逆境处理相关基因信息的情况下，可直接测序cDNA，高通量得到转录组基因的表达信息，从各基因间表达丰度存在的差异，筛选出目的基因。通过Illumina技术不但能够得到丰富的RNA转录本信息，并且具有极高的精确度，目前不仅在植物研究中具有十分[243-246][247]广泛的应用，在动物中也有研究。本研究利用RNA-Seq技术对抗病和感病的两个苹果品种在SA诱导前和诱导后四个样本进行研究。通过测序，获得了35.30Mreads，且与参考基因组的比对效率均在62%以上。说明我们获得的测序及所选参考基因较好，测序结果满足后续分析的质量要求。将所有的unigene与Nr、COG、GO、KEGG数据进行blast，共获得2202条Unigene的注释结果。分析发现获得注释的unigene主要参与到植物的代谢、信号转导、防御机制、能量产生与转导、应答刺激、免疫系统过程等方面。[248]抗性不同的植物品种在一些病程相关基因上也存在差异，Zhang等对具有不同抗性的两个玉米品种，在感染玉米丝黑穗病菌后的转录本进行分析，发现抗真菌蛋白、几丁质酶、蛋白酶等病程相关基因在抗病品种中都呈上调表达，而引起木质素含量降低的CCoAOMT基因则下调表达，这有可能是感病品种无法抵御病原菌入侵的原因。在我们的研究中，感病品种礼泉短富参与的显著性功能GO分类种类少于抗病品种北之幸，且涉及到的差异表达基因数量也少于北之幸的，且在礼泉短富中涉及防御机制的差异基因没有注释到。说明感病品种体内涉及防御机制的基因少于抗病品种的。SA诱导处理后，抗性品种产生的差异基因数量较多，感病品种产生的差异基因数量相对较少，涉及到的代谢通路也少，说明抗病品种的抗性相关基因更易受到SA的诱导。研究表明，不同品种的苹果在SA诱导处理下，有很多与抗病相关的基因得到表达，通过对这些抗病基因的获取和研究，结合后续的功能验证等手段，最终对苹果抗性品种的遗传育种会起到一定的作用。76 甘肃农业大学2017届博士学位论文4.4结论本研究对抗性不同的2个苹果品种在SA处理前后共4个样品进行Illumina测序，共得到35.30Mreads。将各样品测序得到的reads与Unigene库进行比对，共得到差异表达基因2590个，其中最大差异表达基因1382个，最小差异基因150个，共表达基因有9个，分别是：MDP0000039357、MDP0000158474、MDP0000223968、MDP0000225361、MDP0000232908、MDP0000329063、MDP0000362305、MDP0000838695和MDP0000916403，在共表达的基因中MDP0000223968、MDP0000329063和MDP0000362305参与了防御机制和应答刺激。对6个共表达差异基因、1个葡聚糖转运蛋白基因和2个几丁质酶基因进行Q-PCR验证，验证结果与RNA-Seq测序结果基本一致，仅在表达差异倍数上，两者存在一定的偏差，但上下调表达趋势基本相同。在抗病品种北之幸处理组与对照组中，差异表达基因有257个，213个上调表达，44个下调表达。在感病品种礼泉短富处理组与对照组中，差异表达基因有150个，有110个上调表达，40个下调表达。在抗病品种北之幸处理组与感病品种礼泉短富处理组中，差异表达基因有828个，有356个上调表达，472个下调表达。而在抗病品种北之幸处理组与感病品种礼泉短富未处理组中，差异表达基因数目最多，有1382个，540个上调表达，842个下调表达。从结果中可以看出，在同一品种中，SA处理前后差异表达基因中上调表达的基因数目多于下调表达的基因数目，而不同品种间的差异表达基因数目则是最多，且多于同一品种处理前后的差异基因数目。通过对生物信息学的注释，共获得2202条Unigene的注释结果。差异基因数目最多的是整体功能类（Generalfimctionpredictiononly），而与抗性相关的功能注释主要涉及防御机制（Defensemechanisms）、能量产生与转导(Energyproductionandconversion)、信号转导机制(Signaltransductionmechanisms)和离子转运机制(Inorganiciontransportandmetabolism)。不同品种间注释到的COG功能类别较多，同一品种SA处理前后注释到的较少，在感病品种礼泉短富中涉及防御机制的差异基因没有注释到。在差异表达基因中，参与的显著性功能GO分类主要包括：代谢过程(metabolicprocess)、应答刺激(responsetostimulus)、免疫系统过程(immune77 甘肃农业大学2017届博士学位论文systemprocess)、生物学调控(biologicalregulation)和抗氧化活性(antioxidantactivity)。感病品种礼泉短富参与的显著性功能GO分类种类少于抗病品种北之幸，且涉及到的差异表达基因数量也少于北之幸的。对4个样品可能涉及或参与的代谢通路进行分析，结果显示，参与的代谢通路同样是品种间的多于品种内的，并且发现经SA诱导处理后，不同品种间本身存在的差异表达基因数量明显减少，但参与的显著性功能GO分类和代谢通路数量变化不大，且涉及的范围大致相同。主要涉及或参与的抗病相关代谢通路有：Peroxisome(过氧化物酶体途径，ko04146)、Phenylpropanoidbiosynthesis(苯丙烷生物合成途径，ko00940)、Terpenoidbackbonebiosynthesis(萜类化合物生物合成途径，ko00900)、Planthormonesignaltransduction(植物激素信号转导途径，ko04075)、Plant-pathogeninteraction(植物与病原菌互作途径，ko04626)、Flavonoidbiosynthesis(类黄酮生物合成途径，ko00941)、Phenylalaninemetabolism(苯丙氨酸代谢途径，ko00360)和Ribosome(核糖体途径，ko03010)。品种间和品种内的差别在于：在品种间参与的代谢途径有核糖体途径，没有类黄酮生物合成途径；而在品种内参与的代谢途径有类黄酮生物合成途径，没有核糖体途径。且感病品种礼泉短富参与的代谢通路明显少于抗病品种北之幸，而涉及到的与抗病相关的代谢通路则更少。SA诱导处理后，不同抗性品种所产生的差异基因数量明显不同，抗性品种产生的差异基因数量多，感病品种产生的差异基因数量相对较少，且涉及到的代谢通路也少，这与品种间本身的抗病性有关，同时也表明抗病品种的抗性相关基因更易受到SA的诱导。本研究中筛选到的2590个差异基因中，几丁质酶相关基因有304个，其中有170个差异基因参与防御机制，120个基因与水杨酸应答有关；葡聚糖酶相关基因有39个，其中有2个基因参与防御机制，2个基因参与苯丙烷代谢途径，9个基因参与氧化还原途径；有2个NPR1相关基因，一个GO注释到参与防御机制，另一个未被注释到；16个WRYK转录因子相关基因，其中5个基因参与防御机制，4个基因与应答刺激有关；3个PR1相关基因均与防御机制有关和1个TGA相关基因。与植物抗病相关的代谢途径：苯丙烷氨类代谢途径和水杨酸信号途径中，都检测到有差异基因的存在，在SA处理前后苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶78 甘肃农业大学2017届博士学位论文（C4H）和4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）这3种酶基因存在差异表达，在抗、感病品种间也存在差异表达。对于类黄酮、木质素、生物碱等具有抗菌活性的中间产物，在抗、感病品种间也存在差异表达。在水杨酸信号途径中，感病品种礼泉短富在SA诱导后，差异基因均上调表达，但在品种间存在的差异基因较多，且无论SA诱导与否，感病品种礼泉短富差异基因的表达量大多都较抗病品种北之幸的低。说明除了品种之间本身存在的差异外，外源施用SA更易诱导抗病品种中与水杨酸信号途径相关的差异基因的表达量上调。79 甘肃农业大学2017届博士学位论文第五章结论与讨论5.1结论本研究利用人工接种苹果轮纹病菌和田间自然发病调查相结合的方法筛选出抗病性稳定的高抗品种北之幸和感病品种礼泉短富。利用SA对筛选出的两个抗性不同的苹果品种进行诱导处理，测定诱导前和诱导后以及品种间与抗性相关的一些酶活性变化。通过高通量RNA-Seq测序技术，进一步明确不同处理间与抗轮纹病相关的差异表达基因，并对筛选到的差异基因进行验证。通过人工接种苹果轮纹病菌，发现在苹果不同品种之间抗性存在一定的差异，并且不同程度上都感染了苹果轮纹病菌，没有免疫品种。北之幸、Seedling62、NY266和Summerland较抗病，病情指数均小于10。有11个品种抗病性最弱，病情指数达到80-90。通过聚类分析，高抗品种有15个，占7.89%；中抗品种有77个，占40.53%；中感品种有80个，占42.11%；而高感品种有18个，占9.47%。2012年，2013年连续两年对田间种植的190个供试品种做田间自然发病调查。2012年病情指数小于25的高抗品种占大多数，中感品种只有1个品种，即礼泉短富。2013总体的抗病趋势与2012年的基本一致，在抗病品种中早熟品种占的比例较高，感病品种大多为富士系列品种。2013年病情指数也整体较2012年的有所提高，只有北之幸、1996-1-1和秦冠3个高抗品种，但中抗和中感品种占大多数，而高抗和高感品种占少数。通过人工接种鉴定与田间自然发病调查结合，筛选出在两年的调查中都表现高抗病性且抗性稳定的品种北之幸，和表现稳定的感病品种礼泉短富。不同浓度SA处理北之幸和礼泉短富，均可使植株体内低水平的PAL、POD、β-1,3-葡聚糖酶和PPO活性在短时间内提高，且明显高于对照植株体内的酶活性。SA处理抗病品种北之幸，其PAL活性较对照提高了1.36-2.73倍；POD活性提高了4.74-6.19倍；β-1,3-葡聚糖酶活性提高了1.71-2.04倍；而PPO活性上升的较迟，在第11d才达到最大，较对照提高了1.88-2.32倍。SA处理感病品种礼泉短富，其PAL活性较对照提高了1.32-1.70倍，高浓度处理的PAL活性上升较慢，在第11d达到最大值；POD活性上升速度也较北之幸慢，在第11d达到最大值，较对照升高了4.11-5.68倍；β-1,3-葡聚糖酶升高了1.53-1.82倍；而PPO活性上升比较早，在第7d80 甘肃农业大学2017届博士学位论文达到最大值，较对照上升3.13-4.00倍。外源施用SA可以诱导病程相关蛋白酶活性的增加，增强苹果对病害的抗性。但不同品种间存在抗性差异，从PPO活性的测定结果中可以看出，在未经SA处理的不同苹果品种中，PPO活性本身就存在一定的差异，抗病品种较感病品种PPO活性高，即在病害发生的初始阶段，抗病品种就能很好的抵御病原菌的入侵。对北之幸和礼泉短富SA处理前后共4个样品进行Illumina测序，我们共得到35.30Mreads。将各样品测序得到的reads与Unigene库进行比对，共得到差异表达基因2590个，其中最大差异表达基因1382个，最小差异基因150个，共表达基因有9个，在共表达的基因中MDP0000223968、MDP0000329063和MDP0000362305参与了防御机制和应答刺激。在同一品种中，SA处理前后差异表达基因中上调表达的基因数目多于下调表达的基因数目，而不同品种间的差异表达基因数目则是最多，且多于同一品种处理前后的差异基因数目。通过对生物信息学的注释，我们共获得2202条Unigene的注释结果。差异基因数目最多的是整体功能类（Generalfimctionpredictiononly），而与抗性相关的功能注释主要涉及防御机制（Defensemechanisms）、能量产生与转导(Energyproductionandconversion)、信号转导机制(Signaltransductionmechanisms)和离子转运机制(Inorganiciontransportandmetabolism)。不同品种间注释到的COG功能类别较多，同一品种SA处理前后注释到的较少，在感病品种礼泉短富中涉及防御机制的差异基因没有注释到。同时在差异表达基因的分析中，参与的GO显著性功能分类主要包括：代谢过程(metabolicprocess)、应答刺激(responsetostimulus)、免疫系统过程(immunesystemprocess)、生物学调控(biologicalregulation)和抗氧化活性(antioxidantactivity)。感病品种礼泉短富参与的显著性功能GO分类种类少于抗病品种北之幸，且涉及到的差异表达基因数量也少于北之幸的。对4个样品可能涉及或参与的代谢通路进行分析，结果显示，参与的代谢通路同样是品种间的多于品种内的，并且发现经SA诱导处理后，不同品种间本身存在的差异表达基因数量明显减少，但参与的显著性功能GO分类和代谢通路数量变化不大，且涉及的范围大致相同。主要涉及或参与的抗病相关代谢通路有：Peroxisome(过氧化物酶体途径，ko04146)、Phenylpropanoidbiosynthesis(苯丙烷81 甘肃农业大学2017届博士学位论文生物合成途径，ko00940)、Terpenoidbackbonebiosynthesis(萜类化合物生物合成途径，ko00900)、Planthormonesignaltransduction(植物激素信号转导途径，ko04075)、Plant-pathogeninteraction(植物与病原菌互作途径，ko04626)、Flavonoidbiosynthesis(类黄酮生物合成途径，ko00941)、Phenylalaninemetabolism(苯丙氨酸代谢途径，ko00360)和Ribosome(核糖体途径，ko03010)。品种间和品种内的差别在于：在品种间参与的代谢途径有核糖体途径，没有类黄酮生物合成途径；而在品种内参与的代谢途径有类黄酮生物合成途径，没有核糖体途径。且感病品种礼泉短富参与的代谢通路明显少于抗病品种北之幸，而涉及到的与抗病相关的代谢通路则更少。SA诱导处理后，不同抗性品种所产生的差异基因数量明显不同，抗性品种产生的差异基因数量多，感病品种产生的差异基因数量相对较少，且涉及到的代谢通路也少，这与品种间本身的抗病性有关，同时也表明抗病品种的抗性相关基因更易受到SA的诱导。本研究筛选到的2590个差异基因中，几丁质酶相关基因有304个，其中有170个差异基因参与防御机制，120个基因与水杨酸应答有关；葡聚糖酶相关基因有39个，其中有2个基因参与防御机制，2个基因参与苯丙烷代谢途径，9个基因参与氧化还原途径；有2个NPR1相关基因，一个GO注释到参与防御机制，另一个未被注释到；16个WRYK转录因子相关基因，其中5个基因参与防御机制，4个基因与应答刺激有关；3个PR1相关基因均与防御机制有关和1个TGA相关基因。通过对代谢途径的分析，结果显示与植物抗病相关的代谢途径：苯丙烷氨类代谢途径和水杨酸信号途径中，都检测到有差异基因的存在，在SA处理前后苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）和4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）这3种酶基因不仅在抗病品种中存在差异表达，在感病品种间也存在差异表达。对于类黄酮、木质素、生物碱等具有抗菌活性的中间产物，在抗、感病品种间也存在差异表达。在水杨酸信号途径中，感病品种礼泉短富在SA诱导后，差异基因均上调表达，但在品种间存在的差异基因较多，且无论SA诱导与否，感病品种礼泉短富差异基因的表达量大多都较抗病品种北之幸的低。说明除了品种之间本身存在的差异外，外源施用SA更易诱导抗病品种中与水杨酸信号途径相关的差异基因的表达量上调。82 甘肃农业大学2017届博士学位论文为了验证测序实验数据的准确性，我们对6个共表达差异基因、1个葡聚糖转运蛋白基因和2个几丁质酶基因进行了Q-PCR验证，验证结果与RNA-Seq测序结果基本一致，仅在表达差异倍数上，两者存在一定的偏差，但上下调表达趋势基本相同。5.2讨论苹果作为世界性果品，具有生态适应性强、营养价值高、耐贮藏且供应周期长等特点，是世界上很多国家的主要消费果品。我国作为世界上最大的苹果种质资源国，在1985-1995年苹果产业得到了快速的发展，并且我国是世界苹果属植物起源演化的中心，具有极为丰富的种质资源。近几年，随着人们生活条件的提高，在苹果生产中主要的栽培品种也不断发生变化，品质优良但易感染病害的品种也不断扩大种植面积，如富士系品种在中国的大面积推广，导致该病成为我国目前苹果生产过程中发生最重也最难防治的一种病害，使苹果产业受到巨大经济损失。因此利用我国丰富的种质资源，根据品种间的抗性差异，挖掘新型抗病基因是拓宽苹果抗病育种的新途径。在自然界生物的长期协同进化中，植物与病原物也在不断地互相选择，相互适应，从而产生了植物的抗病性，这种现象在整个植物界都是普遍存在的，但这种抗病性只是相对的性状，并不是绝对性状。本研究对190个苹果品种进行人工接种试验和田间自然发病调查相结合的方法，结果发现不同品种间抗性也存在一定的差异，在抗病品种中早熟品种占的比例较高，感病品种大多为富士系列品种。并且随着气候环境、栽培管理模式的变化以及树龄的增加，都会引起苹果抗性的变化，如2012年的伏翠、伏帅属高抗品种，2013年的结果为中抗品种，红王将、哈蒂、hongro等在2012年为中抗品种，但在2013年为中感品种。在寄主-病原菌的长期互作过程中，寄主会产生对有害病原菌的抗性现象，如局部抗病性和系统抗病性。此外植物在受到病菌或化学诱导剂诱导后，还会产生、催化一些诱导抗病因素的合成或直接作用于病原菌的酶，如抗病相关生化防御酶活性的变化，从而使寄主细胞能够抵御活性氧伤害、提高寄主细胞壁的机械强度、钝化病原菌产生的细胞壁降解酶及其它防御物质的形成，进而构成寄主复杂的生化防御系统。苯丙氨酸是植物体内大多数酚类物质合成的前提，因此PAL[227]对于酚类物质的合成尤为重要。而酚类物质及其氧化产物醌类物质对植物病83 甘肃农业大学2017届博士学位论文[228]原菌有很高的毒性，它可钝化病原菌产生的毒素，也可参与植保素的合成。因此认为PAL是一种植物防御酶。SA诱导处理后，北之幸体内PAL活性较礼泉短富增长快且活性高。多酚氧化酶在植物发生褐变的过程中起作用，也是酚类物质氧化的主要酶，主要参与木质素的合成，并把酚类物质氧化成醌类，从而提[78]高寄主对病原菌的抵抗能力。但不同品种间PPO含量存在差异，抗病品种北之幸较感病品种礼泉短富体内的PPO活性本身就高，即在病害发生的初始阶段，抗病品种就能很好的抵御病原菌的入侵。PPO除了以氧化还原酶的形式调节叶绿[81-82]体中的光氧化反应，还在电子传递过程中有一定的参与。植物在遭受各种环境胁迫时，会产生大量的活性氧和自由基，而活性氧和自由基对植物的伤害就是直接或间接启动膜脂的过氧化作用，导致膜的损伤和破坏，最终导致植物细胞死亡。POD是植物细胞内重要的内源活性氧清除剂。H2O2和OH.自由基对植物[77]细胞危害严重，而POD活性与它们的清除有关。在细胞壁中，POD还可催化形成木质素以抵御病原菌的侵袭。刘海英等就认为不同苹果品种间POD活性与[75]果实发生苹果轮纹病呈正相关。不同抗性品种经SA诱导后，POD活性达到高峰的时间也有差异。大多危害植物的病原菌也都含有β-1,3-葡聚糖，如真菌细胞壁中的β-1,3-葡聚糖和β-1,3-1,6-葡聚糖可被β-1,3-葡聚糖酶水解，使病原菌的侵染受到抑制，寄主植物产生抗病性。在本研究中，用SA处理北之幸和礼泉短富后，植株体内低水平的PAL、POD、β-1,3-葡聚糖酶和PPO活性在短时间内均有所提高，并且明显高于对照植株。但在抗病品种北之幸体内，这几种抗病相关酶活性提高的幅度明显高于感病品种礼泉短富，且酶活性上升的速度也较快，一般在诱导后7d，抗病品种北之幸体内的酶活性就达到最大值，而感病品种礼泉短富到11d才达到最大值。植物诱导抗病性并不是一种或几种与抗性相关的酶活性发生变化的结果，而是一个复杂的过程，但对抗性相关酶活性的测定对研究植物诱导抗病机理可提供一定的依据。植物抗病性贯穿植物的生长发育、生理调节等一系列过程，涉及的相关代谢途径复杂且相关基因数目庞大。以前由于研究方法少、范围小，因此使得找出的差异表达基因不够准确，且工作量大，效率低，植物抗病研究受到了很大的限制。但随着基因组学的出现，植物抗病性研究进入了一个崭新的阶段，由对单个基因的研究转向对大量基因的研究，此外还方便了对代谢通路的研究。84 甘肃农业大学2017届博士学位论文RNA-Seq技术在无需预先知晓该物种与特定逆境处理相关基因的信息的情况下，就可直接进行cDNA测序，高通量地得到转录组基因的表达信息，从各基因表达丰度上存在的差异，筛选出目的基因。通过Illumina技术不但能够得到丰富的RNA转录本信息，并且具有极高的精确度，使得这项技术不仅用于植物研究，在动物[243-247]研究中也有应用。本研究利用RNA-Seq技术对抗病和感病的两个苹果品种在SA诱导前和诱导后四个样本进行研究。通过测序，共获得了35.30Mreads，且与参考基因组的比对效率均在62%以上。将所有的unigene与Nr、COG、GO、KEGG数据进行blast，共获得2202条Unigene的注释结果。分析发现获得注释的unigene主要参与到植物的代谢、信号转导、防御机制、能量产生与转导、应答刺激、免疫系统[248]过程等方面。不同抗性的植物品种在一些病程相关基因上存在差异，Zhang等对具有不同抗性的两个玉米品种，在感染玉米丝黑穗病菌的转录本进行分析，发现抗真菌蛋白、几丁质酶、蛋白酶等病程相关基因在抗病品种中是呈上调表达的，而引起木质素含量降低的CCoAOMT基因则是下调表达的，这有可能是感病品种无法抵御病原菌入侵的原因。在我们的研究中，感病品种礼泉短富参与的显著性功能GO分类种类少于抗病品种北之幸，且涉及到的差异表达基因数量也少于北之幸的，且在礼泉短富中涉及防御机制的差异基因没有注释到。SA诱导处理后，抗性品种产生的差异基因数量较多，感病品种产生的差异基因数量相对较少，涉及到的代谢通路也少，说明抗病品种的抗性相关基因更易受到SA的诱导。研究表明，不同品种的苹果在SA诱导处理下，有很多与抗病相关的基因得到表达，通过对这些抗病基因的获取和研究，结合后续的功能验证等手段，最终对苹果抗性品种的遗传育种会起到一定的作用。85 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甘肃农业大学2017届博士学位论文致谢首先，我要诚挚的感谢恩师王生荣教授。导师在我课题的开展上倾尽了心血，对每一个方案都认真过目，并进行指导。导师严谨的治学态度、宽阔的胸怀为我树立了终生的学习典范，他的教诲与鞭策将激励我在科学研究的道路上不断前行。其次，感谢中国农业科学院郑州果树研究所周增强副研究员、张恒涛副研究员、闫振力研究员、王丽老师和王珂老师在我课题开展和论文撰写过程的各方面提供的帮助。感谢刘长仲教授、徐秉良教授、王森山教授、钱秀娟副教授和苏平博士对我论文撰写，博士培养，论文评审，答辩考核等各个方面提供的帮助和支持。感谢我的父母、爱人和朋友几年来对我博士学业的支持。最后，感谢各位答辩委员对我论文的指导和质疑。侯珲二零一七年六月于甘肃农业大学102 甘肃农业大学2017届博士学位论文个人简介侯珲，女，河南郑州人，副研究员。2000年毕业于甘肃农业大学，获农学学士学位；同年继续攻读植物病理学硕士，并于2003年获得硕士学位。2003年7月至今，在中国农业科学院郑州果树研究所果树病害课题组工作。主要从事果树病害综合治理的研究。2012年主持郑州市科技攻关项目“矿物营养对鲜食葡萄采前采后病害的作用及贮藏保鲜技术研究”；2013年主持郑州市重点科技攻关项目“三唑类杀菌剂对苹果树主要病害的防治效果及机理研究”；2015年主持河南省基础与前沿技术研究“利用RNA-seq技术探索苹果轮纹病菌致病相关基因的功能”；2007至今参加国家科技支撑，行业专项、苹果产业体系、葡萄试验站等多个科研项目。博士期间作为第1作者发表论文2篇：侯珲，周增强，王丽，王生荣.硅酸钠对葡萄炭疽病的防治效果，植物保护学报，2016，（5）:836-841侯珲，周增强，张恒涛，王丽，阎振立，王生荣.苹果种质资源对枝干轮纹病抗性评价，园艺学报，2017，（已定稿）103 甘肃农业大学2017届博士学位论文导师简介王生荣，甘肃省榆中县，农学博士，现任甘肃农大草业学院植物病理学教授，博士生导师。曾先后赴联邦德国、韩国、加拿大、泰国及台湾等国家和地区学习、研究和考察。先后担任中国植物病理学会会员，中国菌物学会理事，植物病原真菌专业委员会委员，甘肃省植保学会副理事长。甘肃省教育厅跨世纪学科带头人，甘肃省“333”人才工程一、二层次人选。长期从事植物病理学的教学和研究工作,主讲《农业植物病理学》课程，主要研究植物病原真菌的分类和鉴定工作，开展了甘肃省小麦根病的试验研究和防治示范，保护地黄瓜病害的防治研究，甘肃省植物病原白粉菌和黑粉菌的分类和区系研究，万寿菊和苜蓿叶斑病病原研究，马铃薯晚疫病防治研究等国家、省级科研项目。先后在《MycologicalProgress》、《Mycotaxon》、《真菌学报》、《植物保护学报》、《植物保护》、《中国生态农业学报》、《草业学报》、《中草药》等国内外学术刊物上发表研究论文90余篇，其中SCI收录刊5篇。主编(副主编)全国农业院校教材《农业植物病理学》、《园林植物病理学》、《普通植物病理学实验》等教材专著5部，参编多部教材著作。研究命名和报道了植物病原真菌的4个新物种和10个国内新记录种，先后获甘肃省科技进步二等奖2次，三等奖2次，局级科技奖励5项。先后为本科生、研究生讲授《植物病理学》、《真菌分类学》、《菌物学概论》、《科技论文写作》等课程。104 原创性声明本人声明所呈交的学位论文是木人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除／文屮特别加以标注和致谢的地方外，论文中＋包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得甘肃农业大学；一或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均ｄ在论文屮作了明确的说明并衣不谢意。学位论文作者签名：ｆ签字日期年／月日／学位论文版权认定和使用授权书本人完全了解甘肃农业大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校Ｉ保存并向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权甘肃农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关＇＿Ｍ。数据库进行检索，］以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文本人离校…后发表，、使用论文或￥该论文也接相关的学术论文或成果时第作者及通讯作者署名单位为甘肃农业大学。．＾保密的学位论文在解密后遵守此规定。学位论文作荇签名：导师签名：作峰＾多表丨Ｉ６７签字円期：年月曰签字日期年３月日ｊ＾少
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