基于RNA-Seq筛选抗绵羊肺炎支原体差异表达基因.pdf

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1、分类号：密级：学号：2015201726单位代码：10759石河子大学硕士学位论文基于RNA-Seq筛选抗绵羊肺炎支原体差异表达基因学位申请人杜智慧指导教师孙延鸣教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称临床兽医学研究方向动物疾病诊断与防治所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2018年6月ScreeningofdifferentiallyexpressedgenesagainstMycoplasmaovipneumoniaebasedonRNA-SeqADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPar

2、tialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByDuZhihui(ClinicVeterinary)DissertationSupervisor:Prof.SunYan-mingMarch,2018ShiheziXinjiangChina本研究受国家自然科学基金资助项目—《盘羊及其杂交羊SPLUNC1特性研究及抗肺炎支原体差异表达基因的筛选》（NO：31460686）资助。ThisresearchissurpportedbytheNationalNatural

3、ScienceFoundationofChinanamedbyDifferentialExpressionGeneScreeningofMycoplasmaOvipneumoniaeandCharacterizationStudyofSPLUNC1inArgaliandTheirHybridSheep(NO：31460686).摘要目的：本研究选择巴什拜羊及盘羊杂交羊为实验动物,人工感染绵羊肺炎支原体（Mycoplasmaovipneumoniae,MO），建立绵羊支原体肺炎病例模型，应用RNA-Seq技术对其进行高通量转录组测序分析，筛选相关

4、的差异表达基因（DifferentlyExpressedGenes,DEGs），为探析巴什拜羊和盘羊杂交感染MO的分子作用机制奠定基础。方法：（1）巴什拜羊与盘羊杂交羊对MO感染的比较：将6只巴什拜羊和6只盘羊杂交羊人工感染MO，分别观察其临床症状和病理解剖变化，用ELISA方法分别检测血清中IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的浓度，制作肺部组织切片，观察组织病理学变化，并用支原体肺炎动物模型的组织病理学评分系统进行组织病理学评分。（2）绵羊支原体肺炎病例模型的建立：巴什拜羔羊和盘羊杂交羔羊各9只，年龄2月，体重15-20kg，MOEL

5、ISA诊断试剂盒检测MO抗体均为阴性，用MO浓度约为6CCU=10/mL，2mL/只的剂量感染两种实验羊，每天记录观察临床表现并测量体温。采集感染MO后4d、14d实验羊的血液，分离血清，用MOELISA诊断试剂盒再次检测MO抗体。（3）巴什拜羊，盘羊杂交羊肺组织转录组学研究：分别屠宰0d、MO感染4d、14d的巴什拜羊和盘羊杂交羊，设置3个生物学重复，迅速采集其肺组织，液氮保存送回实验TM室，提取RNA。使用IlluminaHiSeq2500平台进行高通量测序，P值<0.05且Foldchange值>2或<0.667标准筛选差异表达基因、用G

6、OseqR软件包进行Geneontology(GO)富集分析和用KOBAS软件Kyotoencyclopoediaofgenesandgenomes(KEGG)富集分析。最后，再应用荧光定量PCR进行验证转录组测序结果。①通过以上方法对巴什拜羊感染MO前后进行转录组分析；②通过以上方法对盘羊杂交羊感染MO前后进行转录组分析；③以盘羊杂交羊为对照，巴什拜羊为实验组，通过以上方法对两种羊不同时间点肺组织进行比较转录组分析。结果（1）结果发现，感染后杂交羊比巴什拜羊表现出更严重的、典型的支原体肺炎的临床症状和病理解剖变化。组织病理学评分结果显示，杂交

7、羊显著高于巴什拜羊。相关细胞因子检测结果发现，杂交羊的血清中IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的浓度均显著高于巴什拜羊。这说明巴什拜羊对MO感染具有一定的抗性，而杂交羊对MO较易感。（2）建立绵羊支原体肺炎病例模型的结果：巴什拜羊体温一过性升高，而盘羊杂交羊的体温则呈长时间较高幅度的升高。盘羊杂交羊在临床症状和病理解剖变化上表现出更典型，更严重的支原体肺炎的现象。在感染MO后所有实验羊的血清用MOELISA诊断试剂盒检测MO抗体均为阳性。说明成功的建立了绵羊支原体肺炎病例。（3）转录组学分析结果。①巴什拜羊差异表达基因结果表明：巴什拜羊

8、感染MO4dpi和14dpi与0d相比较DEGs分别有1048个(上调575个，下调473个)和2823个(上调1362个，下调1461个)；KEGG