普洱茶对糖尿病前期患者脂肪因子的影响

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分类号：R587.1单位代码：10183研究生学号：2015744157密级：公开吉林大学硕士学位论文（专业学位）普洱茶对糖尿病前期患者脂肪因子的影响EffectofPu-erhteaonadipocytokinesinprediabeticpatients作者姓名：马漠类别：临床医学硕士领域（方向）：内科学指导教师：刘煜教授培养单位：吉林大学第二医院2018年4月 普洱茶对糖尿病前期患者脂肪因子的影响EffectofPu-erhteaonadipocytokinesinprediabeticpatients作者姓名：马漠领域（方向）：内科学指导教师：刘煜教授类别：临床医学硕士答辩日期：2018年5月31日 未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学博士（或硕士）学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容夕卜，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：ｇ議日期：ｈｉｓ年夂月Ｍ日 摘要普洱茶对糖尿病前期患者脂肪因子的影响目的：研究普洱茶对糖尿病前期患者病情进展中脂肪因子的影响，探讨普洱茶改善患者糖脂代谢的可能机制。为糖尿病前期患者提供比药物治疗更易接受的治疗方法。方法：在T2DM患者的直系亲属中筛选糖尿病前期患者约40例，将糖尿病前期患者随机分为对照组和饮茶组，饮茶组患者餐中饮用200-300ml温水调配1g茶粉，每日3次，持续12周。对照组患者餐中饮用200-300ml温水，每日3次，持续12周。研究期间嘱患者低糖低脂糖尿病饮食，每日运动至少30分钟，每2周电话或微信随访1次，随访患者喝茶、喝水及饮食运动情况。ELISA检测患者脂肪因子水平（脂联素、瘦素、IL-6、TNF-α），12周后再分别复测两组患者上述脂肪因子的水平，通过统计学方法，证明饮茶前后脂肪因子水平是否出现显著性差异。结果：（1）最终有31名患者参与并完成本实验研究：饮茶组13例（男4例，女9例），对照组18例（男5例，女13例）；（2）饮茶组脂联素显著增高（845.6±222.5pg/mlvs.1112±305.3pg/ml，P=0.0498），在对照组无明显变化（869.0±167.6pg/mlvs.820.1±203.2P=0.4819pg/ml）；（3）瘦素水平在对照组、饮茶组均下降（13.90±2.795ug/Lvs.13.18±2.520ug/L，P=0.3581；15.80±3.815ug/Lvs.14.78±3.756ug/L，P=0.2952），无显著改变；（4）IL-6水平在对照组、饮茶组均下降（36.46±5.374ng/Lvs.35.73±4.949ng/L，P=0.9211；33.74±3.855ng/Lvs.32.86±3.379ng/L，P=0.5482），但无统计I 学意义。（5）TNF-α在饮茶组、对照组均显著下降，饮茶组下降程度更高（654.9±74.72ng/Lvs.513.5±77.19ng/L，P=0.0003；685.4±99.52ng/Lvs.593.2±91.76ng/L，P=0.0334）。结论：（1）糖尿病前期患者饮用普洱茶可显著增高血清脂联素水平，降低血清TNF-α水平。（2）普洱茶可能通过调节糖尿病前期患者血清脂肪因子脂联素、TNF-α的水平，起改善糖尿病前期患者血糖、血脂代谢的作用，延缓糖尿病发病及其并发症的发展。关键词：普洱茶，糖尿病前期，脂肪因子II AbstractEffectofPu-erhteaonAdipocytokinesinprediabeticpatientsObjective：Tostudytheeffectofpu-erhteaonadipocytokinesinprediabeticpatientsandthepossiblemechanismofpu-erhteatoimproveglucoseaswellaslipidmetabolism.Toprovideamoreacceptabletreatmentforprediabeticpatientsthanhypoglycemicdrugs.Methods：Screeningofabout40patientswithpre-diabetesfromfirst-degreerelativesofpatientsdiagnosedasT2DMintotheresearch.Thepatientswithpre-diabeteswererandomlydividedintocontrolgroupandteagroup.Thepatientsintheteagroupdrank200-300mlwarmwaterfor1gteapowder,3timesadayfor12weeks.Inthecontrolgroup,200-300mlwarmwaterwasconsumed,3timesadayfor12weeks.Duringthestudy,patientswereinstructedtoeatalowfatdiet,exerciseforatleast30minutesdaily,andafollow-upsessionoftwoweeksoftelephoneorWeChat,followedbydrinkingtea,drinkingwateranddiet.Detectioninpatientswithadipocytokines(adiponectin,leptin,IL-6,TNFα)usingELISAkitsandretestthem12weeksafterthesurvey.Statisticalmethodswereusedtodeterminewhetherthereisasignificantdifferenceinadipocytokinesafterdrinkingpu-erhtea.Results：1)31patientsparticipatedandcompletedthestudy.Teagroup：13patients(4malesand9females)andcontrolgroup：18patients(5malesand13females)；2)Theadiponectinintheteagroupwassignificantlyincreased(845.6±222.5pg/mlvs.1112±305.3pg/ml,P=0.0498),andthereisnosignificantchangeinthecontrolgroup(869.0±167.6pg/mlvs.820.1±203.2，P=0.4819pg/ml);3)Leptinlevelsdecreasedinthecontrolgroupandtheteagroup（13.90±2.795ug/Lvs.13.18±2.520ug/L，P=0.3581；15.80±3.815ug/Lvs.14.78±3.756ug/L，P=0.2952），butthereisnosignificantchange;4)Thelevelofil-6wasdecreasedinthecontrolgroupandtheteagroup（36.46±III 5.374ng/Lvs.35.73±4.949ng/L，P=0.9211；33.74±3.855ng/Lvs.32.86±3.379ng/L，P=0.5482）.Nostatisticalsignificanceisfound.5)TNF-αdecreasedsignificantlyintheteagroupandthecontrolgroup（654.9±74.72ng/Lvs.513.5±77.19ng/L，P=0.0003；685.4±99.52ng/Lvs.593.2±91.76ng/L，P=0.0334）.Conclusion：1)Theserumadiponectinlevelwassignificantlyincreasedbydrinkingpu-erhteainpre-diabetespatients,andtheserumTNF-αwasdecreasedsignificantly.2)Pu-erhteamayimproveglucoseaswellaslipidmetabolism，thendelaythedevelopmentofdiabetesanditscomplicationsbyregulatingtheserumadiponectinandTNF-alphainpre-diabetespatients.Keywords：Pu-erhtea,Prediabetes,AdipocytokinesIV 中英文缩略词英文缩写英文全称中文全称T2DMtype2diabetesmellitus2型糖尿病T1DMtype1diabetesmellitus1型糖尿病IFGimpairedfastingglucose空腹血糖受损IGTimpairedglucosetolerance葡萄糖耐量减退IDFInternationalDiabetesFederation国际糖尿病联盟IL-6interleukin-6白细胞介素-6TNF-αtumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子-αELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定EGCGepigallocatechingallate表没食子儿茶素没食子酸酯TGtatolcholesterol总胆固醇TCtriglyceride甘油三酯LDLlowdensitylipoprotein低密度脂蛋白HDLhighdensitylipoprotein高密度脂蛋白AMPK一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一AMP-activatedproteinkinase腺苷酸活化蛋白激酶一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一GLUT4glucosetransporter4葡萄糖转运子4PPAR一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一peroxisomeproliferatoractivatedreceptor过氧化物酶增殖物激活受体一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一CRPC-reactiveproteinC反应蛋白AGEsadvancedglycationendproducts晚期糖基化终末产物一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一STAT一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一signaltransducersandactivatorsoftranscription信号转导与转录激活因子V一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 目录第1章绪论............................................................................................11.1研究背景.........................................................................................11.2文献综述.........................................................................................21.2.22型糖尿病与脂肪因子...........................................................21.2.2普洱茶与2型糖尿病..............................................................5第2章研究对象、材料、方法............................................................82.1研究对象.........................................................................................82.1.1入选对象..................................................................................82.1.2纳入标准..................................................................................82.1.3排除标准..................................................................................82.2实验试剂.........................................................................................92.3实验方法.........................................................................................92.3.1实验流程..................................................................................92.3.2检测方法..................................................................................92.4统计分析.......................................................................................10第3章结果..........................................................................................11第4章讨论..........................................................................................13第5章结论..........................................................................................16参考文献...................................................................................................17作者简介及在学期间所取得的科研成果..............................................24致谢.......................................................................................................25VI 第1章绪论第1章绪论1.1研究背景21世纪以来，糖尿病在全世界范围成为日益严重的公共健康问题，所花费的社会卫生保健成本也在逐年增加。据IDF估算，2014年全球糖尿病患者人数已达3.87亿，并预测到2035年为止，这个数字将上升至5.92亿。至2014年，中国已有9600万例成年糖尿病患者（20-79岁），其中未确诊的达5100万例，与此同时，只有25.8%的患者接受了糖尿病治疗，接受治疗的患者中也只有39.7%的患者血糖控制达标[1]。糖尿病前期是一种介于正常血糖和糖尿病的一种疾病。IFG和IGT是未达到糖尿病诊断标准的高血糖状态，即糖尿病前期。1995-2010年间，中国糖尿病前期人口可达15.5%[2]，到2013年，随着检测技术的进步，据流行病学调查显示，中国糖尿病前期患病率达35.7%，即约3.8亿中国成年人口处于糖尿病前期状态，并继续向糖尿病发展[3]。IFG和IGT及肥胖都是糖尿病和心血管疾病的危险因素[4]，故对糖尿病前期患者早期诊断和早期治疗是改善公共健康状况的重要措施。当前研究证明，尽早对糖尿病前期患者行饮食、运动等生活方式或二甲双胍、阿卡波糖、等药物干预，可以延缓其进展至糖尿病的速度[5]。普洱茶是在亚洲地区广泛饮用的一种茶品。目前，已有研究证明普洱茶中单一活性成分，如茶多酚、茶多糖、茶色素、咖啡因等，能够改善细胞、糖尿病动物模型的糖、脂代谢，降低糖尿病及肥胖患者的血糖、血脂，但其具体机制尚不明确[6]。研究发现脂肪因子脂联素、瘦素、IL-6、TNF-α等与胰岛素抵抗和糖尿病发展关系密切[7]，T2DM的一级亲属作为糖尿病发病的高危人群，也常存在脂肪因子紊乱[8]。本文旨在研究普洱茶对糖尿病前期患者病情进展中脂肪因子的干预效果，探讨普洱茶改善患者糖代谢和脂代谢的可能机制。给予糖尿病前期患者规律冲服各组分相对定量的普洱茶粉(每克含没食子酸：13毫克,咖啡因:60毫克,儿茶酚:6.0毫克,茶黄素:36毫克)，用Elisa法检测患者饮茶前后脂肪因子水平，与单纯控制饮食、运动比较，明确脂肪因子是否参与普洱茶对机体糖、脂代谢的调节作用，有可能为糖尿病前期患者提供比药物治疗更易接受的辅助治疗方法，减少口服降糖药用量和副1 第1章绪论作用，降低糖尿病前期人群发生糖尿病及心血管病变等并发症的风险，改善预后，提高患者生活质量。1.2文献综述1.2.12型糖尿病与脂肪因子T2DM的基本特征是胰岛素抵抗和胰岛功能缺陷所致的胰岛素分泌不足。肥胖与T2DM发病密切相关[9]，研究表明脂肪组织不仅能储存脂肪，提供能量，也是活跃的内分泌器官，还具有分泌多种脂肪因子的功能，包括一些激素，如脂联素、瘦素、抵抗素、内脂素、Apelin等，以及各种炎症因子，如IL-6、TNF-α等[10]。其中部分脂肪因子被证明与肥胖和T2DM、T2DM并发症的发生有关，它们能够影响胰岛β细胞的功能，调节外周组织，例如脂肪组织、肝细胞、肌细胞对胰岛素的敏感性，调控能量代谢和葡萄糖、脂质在机体内的代谢过程[11]。肥胖症的动物或人体中，肥大的脂肪细胞可引起脂肪细胞因子分泌失调，进而参与胰岛和脂肪组织间的相互作用，可能导致胰岛β细胞衰竭和T2DM。多项研究显示脂肪因子还可用于预测肥胖、T2DM、T2DM并发症的发生，评估上述疾病的治疗效果，还有实验将脂肪因子作为代谢性疾病治疗的靶点。根据脂肪因子对胰岛功能的影响，可将其分为胰岛素增敏因子（瘦素、脂联素、内脂素等）和胰岛素抵抗诱导因子（抵抗素、IL-6、TNF-α等）[12]。其中脂联素、瘦素、IL-6、TNF-α与T2DM、肥胖及其并发症，如心血管病变、糖尿病肾病等关系的研究进展综述如下。1.脂联素脂联素是主要由白色脂肪组织产生的激素蛋白，也可由棕色脂肪组织分泌。循证医学分析显示在人群中，血清脂联素水平与T2DM风险呈负相关，在肥胖患者，尤其是腹型肥胖患者中，脂联素水平显著下降[13],在多种动物模型中，血清脂联素水平降低先于T2DM发病，且与胰岛素敏感性下降程度呈平行关系，与脂联素直接应用于动物模型，也能起降血糖作用[14]。脂联素作用于肌细胞，如骨骼肌细胞、心肌细胞和肝细胞、脂肪细胞等，它的生理作用主要是调节脂肪合成、储存过程及外周组织对葡萄糖的利用情况。在人体内，脂联素具有抗糖尿病和抗动脉粥样硬化作用，其改善糖、脂代谢的机制为脂联素与脂肪细胞、肌细胞、2 第1章绪论肝细胞膜上的受体AdipoR1、AdipoR2结合后，经以下途径：①激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），促进葡萄糖转运子4（GLUT4）向肌细胞内转运葡萄糖[15]；②抑制肝细胞糖异生[16]；③抑制脂肪酸合成，促进脂肪酸氧化[17]。④激活过氧化物酶增殖物激活受体α（PPAR-α）通路，增加脂肪酸氧化和能量消耗[18]。实验证明脂联素能减低IL-6水平[19]，同时，脂联素可抑制TNF-α的mRNA表达[20]，说明脂联素可起抗炎和抗动脉粥样硬化作用。除调节血糖、血脂代谢和抗炎作用外，脂联素对糖尿病并发症的发生发展也能起抑制作用。研究表明，脂联素可以促进糖尿病小鼠胰岛β细胞分泌胰岛素，同时增加超过氧化物酶活性，起抗氧化作用，减少肾脏糖基化终末产物(AGEs)聚集，对高血糖导致的胰岛功能损伤和肾功能具有保护性作用[21]。有临床实验将脂联素作为早期预测糖尿病发病和糖尿病前期胰岛功能减退程度的检测指标，结果显示有统计学意义[22-23]。脂联素及其受体可能作为T2DM和T2DM并发症的预测、治疗的重要靶点。2.瘦素瘦素主要由白色脂肪细胞分泌，它的生理作用有调节摄食活动、能量消耗和脂肪蓄积，维持能量代谢的平衡[24]。早期研究表明在小鼠模型和人体中，瘦素可降低食欲、肥胖和胰岛素抵抗，改善T2DM的代谢紊乱，而瘦素缺陷的db/db小鼠早发糖尿病和肥胖[25]。瘦素与胰岛素受体不同，但它们的二级信号分子相同，故一般认为瘦素与胰岛素可能具有相似的下游反应。瘦素的表达和分泌与体脂量和脂肪组织体积密切相关，肥胖患者脂肪堆积可引起高瘦素血症，瘦素与胰岛细胞上的受体结合，激活ATP依赖的钾通道，使胰岛β细胞达到超极化状态，从而抑制胰岛素分泌，有效控制瘦素抵抗，进一步抑制T2DM的发生，但也有研究显示，低浓度抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌，高浓度则促进这一过程[26-27]。在大鼠模型中，瘦素被证实能够抑制下丘脑—垂体—肾上腺轴，减低血皮质醇水平，使脂肪分解、肝糖异生减少，从而控制高血糖状态[28]。瘦素还可作用于下丘脑，与下丘脑受体结合，抑制神经肽Y（NPY）转录，下丘脑弓状核神经元合成NPY减少，抑制食欲，增加机体代谢率，减少脂肪堆积[29]。瘦素还能激活内皮素-1和血管内皮细胞核转录因子NF-κB途径，引起血管收缩、局部炎症因子分泌增多，导致血管炎性损伤，参与动脉粥样硬化的形成[30]。3 第1章绪论3.IL-6IL-6是主要有单核-巨噬细胞等免疫细胞或内皮细胞、纤维细胞分泌的作用广泛的细胞因子，也可由脂肪细胞分泌，肥胖患者胰岛素敏感性下降的脂肪细胞分泌的IL-6增多，炎症反应与胰岛素抵抗、糖尿病均密切相关[31]，而T2DM患者IL-6水平较健康人显著增高数倍[32]。IL-6可通过抑制蛋白激酶Akt途径和胰岛素受体底物（IRS），减少IRS表达，引起肌细胞和脂肪细胞的胰岛素抵抗[33]。IL-6还可促进脂肪分解和游离脂肪酸释放，增加肝脏甘油三酯水平，研究发现将重组IL-6用于小鼠脑室内注射会引起高血糖及高胰岛素血症，但目前尚没有以IL-6为靶点来改善糖、脂代谢的研究[34]。IL-6能诱导C反应蛋白（CRP）生成，CRP可使血管内皮表面的凝血活性增强，且IL-6与可溶性受体结合能够诱导内皮表达单核细胞趋化蛋白和多种黏附分子,刺激白细胞凝集,除此之外，IL-6浓度升高还促进巨噬细胞释放TNF-α,加重血管内皮细胞的损伤[35]。目前有较多关于IL-6可用于T2DM及微血管、大血管并发症的预测及治疗效果评估的研究。4.TNF-αTNF-α是主要由单核-巨噬细胞、T细胞、NK细胞产生的炎症因子，也可由内脏脂肪细胞产生，除了促炎作用外，TNF-α作为脂肪因子，在肥胖、胰岛素抵抗、T2DM患者中其水平均明显上升[36]。与健康人相比，T2DM患者血清TNF-α水平显著增高，且在糖尿病肾病患者中进一步提高[37]。TNF-α可抑制葡萄糖诱导的胰岛β细胞分泌胰岛素的过程，还通过促进脂肪分解和游离脂肪酸释放,抑制肝脏受体与胰岛素结合,促进糖异生，并诱导胰岛素受体底物丝氨酸的磷酸化,降低胰岛素敏感性[38]。TNF-α还具有免疫调节作用，参与局部炎症反应，可在T1DM发病中介导自身免疫反应，在T2DM中激活NF-κB通路，诱导胰岛β细胞的凋亡，破坏胰岛功能[39]。同时，TNF-α还能诱导胰岛β产生胰多肽，累积后形成胰岛β细胞破坏的潜在因素。研究证明，TNF-α升高与多种心血管疾病，如心肌炎、急性心肌梗死、慢性心力衰竭及动脉粥样硬化有关，它能激活NF-κB通路，还能使诱导型一氧化氮（NO）增多，抑制一氧化氮合酶，损伤内皮细胞，对心血管功能产生不利影响[40]。TNF-α与T2DM及并发症关系的具体机制尚需进一步研究。4 第1章绪论1.2.2普洱茶与2型糖尿病1.普洱茶的生物活性成分普洱茶是产自中国西南部的一种传统茶类饮料，属于中国特有的黑茶，由新鲜茶叶经微生物发酵加工而成[41]，富含茶多酚、茶多糖、茶色素、咖啡因等多种生物活性物质[42-43]。茶的保健作用依赖其特有的活性成分，大量研究显示，茶类饮料最主要的活性成分是茶多酚和咖啡因，其中茶多酚的单体成分表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）含量最高,被认为是最重要的有效成分，但其研究和提取的对象多以绿茶、乌龙茶为主[44]。近年来对普洱茶及其提取成分，茶多酚、茶色素、茶多糖保健作用的相关研究逐渐增多，其主要功能有抗氧化，减轻体重，改善糖代谢、脂代谢，改善代谢综合征，抗动脉粥样硬化，抗肿瘤等[45-48]。关于普洱茶及其提取物，还有不同类型茶类同种提取物的生理作用和分子机制研究综述如下。2.普洱茶对2型糖尿病代谢紊乱的作用肥胖、T2DM、T2DM并发症已经成为中国和世界各国的重要健康问题，故普洱茶对它们的有益作用可对公共健康产生巨大影响。现有多项动物实验证明普洱茶或普洱茶提取物对糖尿病小鼠模型的糖、脂代谢有明显的改善作用，可以降低体重，延缓或减少糖尿病和心血管疾病，多数研究认为发挥作用的活性物质是茶多酚和咖啡因。研究发现给予昆明种糖尿病小鼠模型连续30天普洱茶粉冲剂灌胃后，小鼠体质量、脂肪系数、血糖、血脂（TC、TG、LDL）及胰岛素抵抗均明显改善，α-葡萄糖苷酶活性也明显降低，有效调节血糖、血脂代谢[49-50]。普洱茶提取物也能降低ob/ob肥胖小鼠模型的体重和血脂水平，减少非酒精性脂肪肝的发生率[51]。普洱茶提取成分，茶色素也能显著降低小鼠体重、脂肪系数、TG、TC、LDL的水平，并显著升高HDL的水平，其降低血脂作用呈剂量依赖性[52]。普洱茶茶色素中茶褐素含量最高，Liu等直接向大鼠注射茶褐素，发现与高脂饮食组相比，脂代谢也明显得到改善[53]。目前普洱茶应用于T2DM患者的研究较少，苏静静等的实验证明，每日规律饮用普洱茶粉3个月后，T2DM患者血脂水平明显下降，与动物实验相似[54]，口服普洱茶片也能得到类似结果[55]。Kubota等给予超重患者12周规律随三餐饮用普洱茶后，其体质指数（BMI）、腹围、内脏脂肪均减少[56]。关于普洱茶的保健作用研究很多，但其分子机制尚需进5 第1章绪论一步探索。3.普洱茶改善代谢紊乱的作用机制目前对普洱茶改善血糖、血脂代谢的机制研究主要包括以下几个方面：①对糖、脂代谢过程中的酶活性进行调控；②对糖、脂代谢中涉及的分子信号通路发挥调节作用，以AMPK信号通路的相关研究最多；③抗氧化作用。④调节免疫，抑制局部的炎症反应。在营养摄入阶段，普洱茶中含量较多的茶多酚及其富含多酚的茶提取物可有效抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶等水解酶的活性，减少对多糖和寡糖的水解，从而减少肠道对葡萄糖的吸收[57]，并抑制脂蛋白相关性磷脂酶A2（Lp-PLA2）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）、胰脂肪酶活性，同时使卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（LCAT）活性增加[58]。进一步研究显示，普洱茶茶多糖在抑制小鼠肠道内α-葡萄糖苷酶活性的同时，与阿卡波糖相比，对α-淀粉酶的抑制作用更小，减少肠道内未彻底消化的碳水化合物堆积和气体生成，不发生消化道副作用，这一点优于阿卡波糖[59]。一些研究表明，普洱茶及其提取物还可经调节各种能量代谢及糖类、脂质分解、合成、转运相关信号通路，改善糖、脂代谢紊乱。例如，茶多酚能够激活AMPK信号通路,调节其下游糖、脂代谢酶的活性，减弱糖异生作用，促进糖原合成，降低高血糖[60]。Cai[61]等发现给予C57BL/6小鼠口服普洱茶提取物16周后，与高脂饮食组相比，小鼠内脏脂肪组织中炎症因子的水平降低，使GLUT4表达增加，且能够通过激活蛋白激酶Akt，增加骨骼肌细胞膜的葡萄糖转运，改善糖代谢[62]。茶多酚能增加心肌细胞IRS1、IRS2、GLUT1、GLUT2、糖原合酶的mRNA表达水平，减少炎症因子。茶叶提取物还可以作用于胰岛素抵抗的狗，上调肌肉细胞的PPARα和脂蛋白酶表达，诱导GLUT4转运葡萄糖。绿茶、乌龙茶、红茶都有与以上实验结果类似的相关报导。Zhou[63]等研究证实茶叶提取物可改善高脂饮食肥胖大鼠模型的高瘦素血症和氧化应激、CRP水平，提高脂联素水平，降低PPAR-γ表达，具有抗炎、调节脂质代谢作用。普洱茶提取物茶多酚能通过升高T2DM患者胰高血糖素样肽-1（GLP-1），促进胰岛β细胞分泌胰岛素，减少胰高血糖素，降低体重，改善胰岛素抵抗[64]。茶多酚还能改善高糖、高脂或胰岛素抵抗环境下的IRS功能，改善糖代谢[65]。EGCG被证明能降低内6 第1章绪论皮素-1的表达，调节血管内皮功能，在糖尿病小鼠模型中，高剂量的EGCG（占饮食量的1%）可抑制其血管损伤。普洱茶提取物茶多酚也是强大的抗氧化剂，它能直接清除自由基，并通过螯合金属，阻止活性氧自由基形成；其主要活性成分EGCG可在线粒体形成活性氧(ROS)，起间接抗氧化作用。Zheng等发现，连续摄入1个月后，普洱茶粉可通过增加超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶水平，对顺铂诱导的大鼠肝脏氧化损伤产生保护性作用[66]。关于普洱茶或其提取成分如茶多酚的抗炎作用方面，也有大量研究。在亚洲人群横断面研究中，饮茶量与CRP水平呈负相关，证明了茶类饮料的抗炎作用，且具有剂量依赖性[67]。Ren等发现口服茶叶提取物可显著降低注射脂多糖（LPS）的大鼠模型的视网膜、玻璃体中炎症因子IL-6,TNF-α表达，且其抗炎作用被证明与茶多酚抑制信号转导与转录激活因子3（STAT-3）和NF-κB磷酸化有关[68]。Cai等给予脂肪肝小鼠模型普洱茶提取物后，也得到相同结论，即普洱茶可通过调节肝细胞IL-6/STAT-3信号通路影响肝脏的脂肪代谢紊乱、脂肪性肝炎和胰岛素抵抗[69]。在儿茶素治疗大鼠溃疡性结肠炎的实验中，儿茶素也显示出类似作用，它能够降低IL-6、TNF-α、NF-κB的mRNA表达，表现了茶多酚的抗炎、抗氧化作用[70]。还有研究推测，茶多酚可通过下调Toll样受体-4（TLR4）发挥抗炎作用[71]。在上述机制之外，普洱茶对糖脂代谢的作用仍在继续深入研究中。动物实验中，还有大剂量EGCG通过抑制食欲，延长激素肾上腺素、去甲肾上腺素作用于外周组织的时间，与茶叶提取物中富含的咖啡因共同作用，影响能量代谢的案例，但缺乏进一步证实。除此之外，也有关于普洱茶改变小鼠改变肠道菌群组成，从而改善血糖、血脂代谢的研究[72]。Yan等在普洱茶治疗小鼠糖尿病模型实验中，检测血糖水平未发生显著变化，但终末糖基化产物（AGEs）水平明显下降[73]，证明普洱茶对T2DM的微血管长期并发症，如糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病的发生也有保护作用。普洱茶及其组成成分对肥胖、胰岛素抵抗、T2DM、T2DM并发症的作用机制尚不完全明确，仍需进一步研究。7 第2章研究对象、材料、方法第2章研究对象、材料、方法2.1研究对象2.1.1入选对象在我院住院及门诊诊断为T2DM患者的直系亲属中筛选糖尿病前期患者，预计40例，行75g口服葡萄糖耐量试验明确诊断。2.1.2纳入标准1.本研究采用1999年WHO提出的糖尿病前期诊断标准：糖尿病前期包括：①IFG：静脉采血空腹血糖6.1-7.0mmol/L,75g葡萄糖负荷后2h血糖<7.8mmol/L。②IGT：静脉采血空腹血糖<7.0mmol/L,75g葡萄糖负荷后2h血糖7.8-11.1mmol/L。空腹血糖要求禁食8-14小时，期间可以饮水。口服糖耐量试验应在不限制饮食和正常体力活动2-3天后的清晨进行，应避免使用影响糖代谢的药物。采空腹血糖后，患者饮用含有75g葡萄糖的水约300ml，要求5分钟内饮用完毕。从开始饮用计算2小时，采集静脉血液标本检测其血糖值。2.年龄35-70岁之间，性别不限。2.1.3排除标准1.自行应用胰岛素、口服降糖药控制血糖或饮用其他茶类饮料者。2.无法配合实验要求，控制饮食、适当运动、每日规律饮茶和定期随访的患者。3.妊娠期女性或育龄期准备妊娠女性患者。4.急性感染性疾病、感染活动期、严重肝病、肾病或急重症。5.患有精神类疾病等不能配合实验者。8 第2章研究对象、材料、方法2.2实验试剂1.普洱茶粉：云南大叶帝红生物科技有限公司（YunnanTeaHomeBiotechnologyCoLtd）为本次实验提供的茶粉(BlackLabelPuerTeaPowder),实验中的茶粉是由云南农业大学设计制备的。茶粉中主要含有的植物化学成分:(每1克茶粉中)没食子酸：13毫克,咖啡因:60毫克,儿茶酚:6.0毫克,茶黄素:36毫克。2.脂肪因子水平Elisa检测应用R&D96T酶联免疫分析试剂盒（脂联素、瘦素、IL-6、TNF-α）。2.3实验方法2.3.1实验流程将糖尿病前期患者随机分为对照组和饮茶组，饮茶组患者餐中饮用200-300ml温水调配1g茶粉，每日3次，连续12周。对照组患者餐中饮用200-300ml温水，每日3次，持续12周。研究期间嘱患者低脂饮食，每日运动至少30分钟，每2周电话或微信随访1次，随访患者喝茶、喝水及饮食运动情况。初次时检测检测患者的血清脂肪因子（脂联素、瘦素、IL-6、TNF-α）的水平，分组进行饮食、运动控制或饮茶+饮食、运动控制3个月后，再次复测患者的血清脂肪因子（脂联素、瘦素、IL-6、TNF-α）水平，通过统计学方法，分析饮茶前后上述指标是否出现显著性差异。2.3.2检测方法1.血糖测定：行75g葡萄糖负荷口服糖耐量试验中，由吉林大学第二医院检验科UciCelDXC800生化分析仪检验测定空腹血糖、75g葡萄糖负荷后2h血糖值。2.脂肪因子测定：每次患者随访时，所有的糖尿病前期患者采集血液样本，离心后分离血清储存在-80°C冰箱中，用于检测脂肪因子脂联素、瘦素、IL-6、TNF-α水平。脂肪因子水平Elisa检测应用R&D96T酶联免疫分析试剂盒（脂联素、瘦素、IL-6、TNF-α）。步骤如下：9 第2章研究对象、材料、方法（1）标准品的稀释：将标准品按照说明书进行梯度稀释，等量的标准品加标准品稀释液，2倍稀释5次。（2）加样：分别设置空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作与其他孔均相同）、标准孔和待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔准确加样稀释后的标准品各50μl，待测样品孔中先加依次样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样应将样品加于酶标板孔的底部，加样枪头尽量不触及孔壁。加样全部完成后轻轻晃动混匀。（3）温育：用封板膜封板后，置于37℃环境，温育30分钟。（4）配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用（5）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去孔中液体并甩干，每个孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，最后拍干。（6）加酶：每个孔加入酶标试剂50μl，注意空白孔除外。（7）温育：重复操作同3。（8）洗涤：重复操作同5。（9）显色：每个孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光，显色10分钟。（10）终止：每个孔加终止液50μl，终止反应（此时由蓝色立刻转变成黄色）。（11）测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。（12）计算：以标准物的浓度作为横坐标，OD值作为纵坐标，在坐标纸上绘制出浓度-OD值的标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线计算出相应的浓度；再乘以样品的稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释的倍数，即为样品的实际浓度。2.4统计分析血清脂肪因子水平数据分析应用了GraphPadPrism6.0软件，所有数据均用平均数±标准差（x±s）表示。普洱茶组和对照组实验干预前后的脂肪因子水平比较采用了配对t检验。P值＜0.05被认为具有统计学意义。10 第3章结果第3章结果此研究共纳入40例糖尿病前期的患者，其中有9人因自行应用口服降糖药，无法遵从实验要求饮茶或按规定时间随访，或饮用其它茶水原因而退出实验，最终有31名患者参与并完成本实验研究，分别为：对照组18人（男性5人，女性13人），年龄（52.22±1.739）岁；饮茶组13人（男性4人，女性9人），年龄（51.92±1.985）岁。上述两组患者实验前后脂肪因子改变及统计分析如图3.1及表3.1所示：1.饮茶组脂联素显著增高（845.6±222.5pg/mlvs.1112±305.3pg/ml，P=0.0498），在对照组无明显变化（869.0±167.6pg/mlvs.820.1±203.2P=0.4819pg/ml）；2.瘦素水平在对照组、饮茶组均下降（13.90±2.795ug/Lvs.13.18±2.520ug/L，P=0.3581；15.80±3.815ug/Lvs.14.78±3.756ug/L，P=0.2952），无显著改变；3.IL-6水平在对照组、饮茶组均下降（36.46±5.374ng/Lvs.35.73±4.949ng/L，P=0.9211；33.74±3.855ng/Lvs.32.86±3.379ng/L，P=0.5482），但无统计学意义。4.TNF-α在饮茶组、对照组均显著下降，饮茶组下降程度更高（654.9±74.72ng/Lvs.513.5±77.19ng/L，P=0.0003；685.4±99.52ng/Lvs.593.2±91.76ng/L，P=0.0334）。11 第3章结果图3.1饮茶前后脂肪因子统计学差异表3.1饮茶前后脂肪因子统计学差异对照组（n=18）统计饮茶组（n=13）统计指标干预前干预后t值P值干预前干预后t值P值脂联素（pg/ml）869.0±167.6820.1±203.20.71890.4819845.6±222.51112±305.32.1470.0498瘦素（μg/L）13.90±2.79513.18±2.5200.94460.358115.80±3.81514.78±3.7561.0870.2952IL-6（ng/L）36.46±5.37435.73±4.9490.099810.921133.74±3.85532.86±3.3790.61780.5482TNF-α（ng/L）685.4±99.52593.2±91.762.3270.0334654.9±74.72513.5±77.195.0730.0003一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一以上结果显示干预后饮茶组脂联素水平比干预前显著上升，对照组和饮茶组TNF-α水平均较干预前显著下降，而对照组、饮茶组组瘦素、IL-6均较干预前下降，但无统计学意义。12 第4章讨论第4章讨论糖尿病前期的流行程度与各个国家地区的饮食习惯、社会环境有关，若不采取干预措施，大多数糖尿病前期患者会在10年内发展为T2DM，而有效控制糖尿病危险因素可令其中58%避免最终发展为糖尿病[74]。早期发现和早期干预对避免或延迟糖尿病前期患者发展为T2DM具有长远意义，还能够减少T2DM发症，提高患者生活质量，降低发病率和患者的死亡率。糖尿病前期最主要的病理改变即胰岛素抵抗，主要涉及肝细胞、肌细胞和脂肪细胞，此时期常出现高胰岛素血症，因此增加胰岛素敏感性和限制机体对胰岛β细胞胰岛素需求量是治疗糖尿病前期的重要手段，能够减轻胰岛β细胞负荷，具有胰岛β细胞保护性作用，延迟T2DM的发病[75]。胰岛β细胞功能减退是糖尿病前期发展为T2DM的重要因素，所以改善胰岛β细胞的分泌功能和阻止胰岛β细胞的破坏也是重要的治疗途径[76]。脂肪作为内分泌器官，能分泌脂联素、瘦素、IL-6、TNF-α等脂肪因子，影响胰岛素敏感性和胰岛β细胞功能，调节血糖、血脂代谢。本研究中糖尿病前期患者对照组采用单纯饮食控制、适当运动方法，而饮茶组除饮食控制、适当运动外，加规律饮用定量的普洱茶粉冲剂3个月。干预后饮茶组血清脂联素水平较干预前增高，有统计学意义（P=0.0498），对照组脂联素水平比干预前下降，但无显著性（P=0.4819）；两组瘦素水平都较最初有所下降，且都没有显著性意义；单纯生活方式控制和生活方式控制加饮用普洱茶组IL-6水平都比最初下降，两组都无统计学意义；两组TNF-α都比干预前显著下降，但饮茶组（P=0.0003）比对照组（P=0.0334）下降程度更明显。本实验的前期研究（待发表）已证明规律饮用普洱茶粉冲剂可使糖尿病前期患者的总胆固醇和LDL水平显著降低，并能够阻止患者75g葡萄糖负荷后2h血糖进一步上升，起延缓糖尿病前期发展为糖尿病和控制血脂水平的作用。上述实验数据显示，糖尿病前期患者规律饮用普洱茶3个月后血清脂联素水平显著上升，TNF-α水平显著降低，据文献报道高水平的高水平脂联素可激活AMPK，促进GLUT4转运葡萄糖，并激活PPAR-α通路，抑制糖异生和脂肪酸13 第4章讨论合成，促进脂肪酸氧化。TNF-α能抑制胰岛β细胞分泌胰岛素，并促进糖异生和脂肪分解,诱导胰岛素受体底物丝氨酸的磷酸化,抑制肝脏受体与胰岛素结合。脂联素和TNF-α降低都可增加外周组织，脂肪组织、肝细胞、肌细胞等的胰岛素敏感性，改善胰岛β细胞分泌胰岛素的作用，减少胰岛β细胞凋亡，调节血糖和血脂代谢，同时脂联素减少IL-6、TNF-α表达，起抗炎作用，保护胰岛β细胞功能和心血管系统，延缓T2DM进展，减少未来心血管和微血管并发症发生的可能性和发展速度。两组患者瘦素、IL-6水平都降低，但变化无统计学上的差异，可能原因：①与样本量不足有关，未来应继续扩大实验对象的数量，并长期随访；②普洱茶有效成分如EGCG摄入量尚不足以显著降低IL－6等水平，应进一步分析二者变化之间的联系。目前关于普洱茶改善机体糖、脂代谢机制的研究较少，动物试验中，茶多酚可显著增加肥胖大鼠模型的脂联素水平，降低脂肪系数[77]，普洱茶提取物可降低炎症因子IL-6、TNF-α水平[78]，证明本研究与多数实验得出的结果相符合。综上所述，本研究证明了普洱茶有可能通过调节糖尿病前期患者的脂肪因子，脂联素、TNF-α水平，恢复胰岛β细胞功能缺陷，减轻胰岛素抵抗，改善血糖、血脂代谢，具有延缓糖尿病及其并发症发展的功能，可在控制饮食、运动和口服降糖药以外，为糖尿病前期患者早期治疗提供新的更易被患者接受的有效辅助方法，减少药物治疗的用量和副作用，降低糖尿病前期人群发生糖尿病及心血管病变等并发症的风险，改善预后，提高患者的生活质量。本研究的不足之处是因实验条件有限，收集样本量过少，缺乏口服降糖药或其它类型茶类提取物的阳性对照。实验中遇到的问题还包括实验过程中如何提高患者的依从性，保证患者控制饮食、运动，规律饮茶，减少误差，保证得出的实验数据的可信性，我们通过增加随访次数和电话随访来增加依从性。普洱茶提取物及各单一组分改变脂肪因子水平的分子机制尚不明确，有研究推测可能与普洱茶提取物使白色脂肪组织棕色化有关[79]。除此之外，普洱茶对NF-κB、GLUT、PPAR-α等代谢通路的影响，还有对肠道菌群组成、免疫反应的影响等途径，也需要进一步完善。现阶段普洱茶及其提取物应用于T2DM、肥胖和糖尿病前期治疗的临床数据较少，也有研究显示结果并不显著[80]。因普洱茶非单一成分，故难以保证实验材料的一致性，本实验采用普洱茶粉，单位质量中的成分组成和各成14 第4章讨论分的含量、比重相对固定，每克含有没食子酸：13毫克,咖啡因:60毫克,儿茶酚:6.0毫克,茶黄素:36毫克，优于应用传统常用的茶叶热水直接冲泡法的研究，除确定摄入量一致性之外，其活性成分损失也更少，普洱茶应用于实验动物或人体中的研究仍需更多的探索。15 第5章结论第5章结论（1）糖尿病前期患者饮用普洱茶可显著增高血清脂联素水平，降低血清TNF-α水平。（2）普洱茶可能通过调节糖尿病前期患者血清脂肪因子脂联素、TNF-α的水平，起改善糖尿病前期患者血糖、血脂代谢的作用，延缓糖尿病发病及其并发症的发展。16 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作者简介及在学期间所取得的科研成果作者简介及在学期间所取得的科研成果作者简介：姓名：马漠性别：女出生日期：1992年07月17日民族：汉族籍贯：吉林省长春市教育背景：2015/09至今吉林大学内科学（内分泌学）硕士学位2010-2015吉林大学临床医学学士学位奖励荣誉：2015/09吉林大学研究生学业奖学金2015/09院优秀学生证书：CET-4CET-6国家执业医师资格证书在学期间所取得的科研成果：1、第一作者发表论文《肠道菌群与肥胖症的关系及其在肥胖症治疗中的应用研究进展》于中华糖尿病杂志，2017年11期。2、第二作者，论文《组织型转谷氨酰胺酶抗体对1型糖尿病患者乳糜泻的诊断价值及相关临床特点分析》于中华糖尿病杂志，2017年10期。24 致谢致谢首先衷心感谢我的导师刘煜教授！刘老师以精湛的学术知识、扎实的临床技能、严谨的临床思维和科研态度，求实的作风，以及精益求精的精神为我学习、工作树立了好榜样。感谢恩师在本论文选题、研究设计、实验过程及生活方面给予的帮助，研宄生阶段能得到其指导，我感到非常荣幸，这段时间的收获会使我受益终身。感谢内分泌科蔡寒青、张秀娟、赵岩教授，沈鸿、何杨芳、杨茂光等各位老师，李沫师兄、希希姐、程妍师姐在临床学习和工作上给予的指导！感谢李阳阳师姐和李沫师兄在实验设计、实验技术方法、数据统计方面给予的无私帮助和支持。我还要感谢父母、朋友、同学对我的学习的不断督促，生活的关心和研究的大力支持。最后感谢各位审稿、答辩委员会专家对本文的修正及指导。25