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分类号：１０４１０：Ｓ８５５．３学校代码密级：学号：１２２２０１１００２鉍务采綮硕士学位论文江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｉｄｅｍｉｏｌｏａｎｄＣｏｍｌｅｔｅＧｅｎｏｍｅｐｇｙｐＳｅｕｅｎｃｅＡｎａｌｓｉｓｏｎＰｏｒｃｉｎｅＴｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓｑｙｉｎＪｉａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅｇ申请人：黎家祥指导教师：唐玉新教授学科专业：叶俊华研究员所在院（所）：动物科学技术学院论文提交日期：２０１８年６月 独创性声明过我的努力取得的成果，并且是自本人声明，是在指导教师指导下，通，所呈交的学位论文己撰写的，论文中不包含其他人。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外证书而使用过的发表或撰写过的研宄成果，也不包含在江西农业大学或其它教育机构获得学位或一了谢意。如被查有材料同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示。与我。严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任日期：学位论文作者亲笔签名：ｉｌ－喊论文使用授权的说明，本人完全了解江西农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，可以采用影印、缩印或其他复制允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容手段保存论文。。口保密，在年后解密可适用本授权书不保秘本学位论文属于不保密＝口，“”ｖ－（请在方框内打）学位论文作者亲笔签名：曰期：７＾１＾Ｌ＾＾－－、６乏日期－０１＾＾：３指导教师亲笔签名：＾ 目录目录摘要................................................................................................................................IAbstract..........................................................................................................................II缩略词表......................................................................................................................IV1.1病原学...............................................................................................................11.1.1概述.........................................................................................................11.1.2病毒分类地位.........................................................................................11.1.3病毒粒子结构与特性.............................................................................21.1.4基因组结构与功能.................................................................................31.1.5病毒感染和复制机理.............................................................................51.2流行病学...........................................................................................................61.2.1国外流行病学进展.................................................................................61.2.2国内流行病学进展.................................................................................61.3致病性与临床症状...........................................................................................71.3.1病毒致病性.............................................................................................71.3.2临床症状及病理变化.............................................................................81.4诊断方法...........................................................................................................81.4.1临床诊断.................................................................................................81.4.2实验室诊断.............................................................................................91.5预防与治疗.....................................................................................................102.1主要材料及试剂.............................................................................................122.1.1样品收集..............................................................................................122.1.2主要试剂..............................................................................................122.1.3主要仪器..............................................................................................122.1.4常用试剂、培养基的配制..................................................................132.2方法................................................................................................................132.2.1引物设计..............................................................................................132.2.2病毒核酸的提取...................................................................................142.2.3反转录...................................................................................................142.2.4聚合酶链式反应..................................................................................142.2.5目的片段的连接...................................................................................142.2.6连接产物的转化...................................................................................152.2.7重组菌液的鉴定...................................................................................152.2.8组织样品采集和组织病理学检查......................................................152.3结果.................................................................................................................162.3.1临床样品PTV检测结果....................................................................16i 目录2.3.2部分PTV江西株5'UTR测序结果与序列分析.................................172.3.3江西不同地区商业猪群中PTV感染率检测结果............................182.3.4江西各地区不同猪群中PTV感染率检测结果................................192.3.5江西各地区商业猪群中不同季节PTV感染率检测结果................202.3.6江西各地区猪群中PTV感染率与其他腹泻病毒的感染情况检测结果............................................................................................................................212.3.7猪脑脊髓灰质炎临床症状与病理解剖变化.......................................222.3.8大脑病理组织学HE染色观察结果....................................................232.4讨论................................................................................................................233.1试验材料和方法.............................................................................................253.1.1样品采集..............................................................................................253.1.2主要生化试剂......................................................................................263.1.3主要仪器...............................................................................................263.1.4试剂配制...............................................................................................263.2方法................................................................................................................273.2.1引物设计..............................................................................................273.2.2病毒核酸的提取..................................................................................273.2.3反转录..................................................................................................283.2.4聚合酶链式反应..................................................................................283.2.5全长扩增片段的回收和纯化...............................................................293.2.6目的片段的连接...................................................................................293.2.7连接产物的转化...................................................................................293.2.8重组菌液的鉴定...................................................................................303.2.9不同血清型毒株5'UTR序列比对分析.............................................303.2.10核苷酸同源性比对及序列拼接........................................................303.3结果与分析....................................................................................................313.3.1PTV江西株全基因组扩增与测序......................................................313.3.2PTV江西株全基因组序列分析..........................................................313.4讨论.................................................................................................................33参考文献......................................................................................................................36致谢..............................................................................................................................40ii 摘要摘要猪捷申病是由猪捷申病毒（porcineteschovirus,PTV）引起的各年龄阶段猪群以脑脊髓灰质炎、生殖障碍、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎等临床症状为基本特征的病毒性传染病。PTV属于小RNA病毒科捷申病毒属，目前该病毒至少有13个血清型，包括家猪中检测到的PTV-1~PTV-12和野猪中检出的PTV-13。PTV-1的强毒株可导致严重的脑脊髓灰质炎，其他弱毒株及其他血清型能引起温和型或隐性感染，被世界动物卫生组织（OIE）列为B类传染病。早期爆发于欧洲的猪捷申病给规模化猪场造成了巨大的经济损失。目前我国对PTV的流行病学和基因组信息的研究报道较少，还未见关于江西地区猪群PTV流行病学和毒株遗传信息的报道。本研究利用一对针对猪捷申病毒的特异性引物，对2016年9月至2018年2月采集自江西省8个地区的537份粪便及肠道样品及297份脑、肺、淋巴结等内脏组织样品进行检测。结果表明PTV在我省猪群中普遍存在，粪便、肠道组织样品中的阳性率（49.5%）高于内脏组织的阳性率（35.0%）。不同猪群中阳性率存在较大差异，其中保育猪和育肥猪的阳性率最高，分别为56.08%和56.35%；哺乳仔猪阳性率最低，为22.34%。不同季节样品的阳性率也存在差异，冬末初春季节PTV感染率较夏季略微升高。同时，还发现该病毒与其它病毒共同感染的现象，其中与PEDV的共同感染率最高，为43.61%。为研究江西地区PTV与其他国家或地区PTV毒株的遗传变异关系，本研究根据GenBank中提交的PTV序列比对结果，设计了5对扩增PTV全基因组的特异性引物和2条针对5'和3'末端的RACE引物。根据设计的引物，分别对采集自江西吉安和江西九江两份样品中PTV毒株进行了全基因组扩增和测序，将两株毒株分别命名为CH/JX/JA株和CH/JX/JJ。两株PTV毒株CH/JX/JA和CH/JX/JJ的全长分别为7,107nt和7,098nt。用DNAStarLasergene(V7.0)和MEGA6.05软件对CH/JX/JA和CH/JX/JJ进行全基因组及各基因核苷酸和氨基酸序列同源性和遗传进化树分析。结果表明，2株江西株之间的核苷酸同源性高达81.9%，与24株参考株之间的同源性为80.5%～91.4%。与参考株相比，CH/JX/JJ和CH/JX/JA存在不同程度的变异，基因组的保守性较低，各参考株之间也存在不同程度的变异，变异位置各有差别。关键字：猪捷申病毒、分子流行病学、全基因组、序列分析、进化树分析I AbstractAbstractPorcineTeschendisease，causedbyporcineteschovirus(PTV),ischaracterizedbyavarietyofclinicalsymptomsincludingpolio,reproductivedisorders,pneumonia,diarrhea,pericarditis,andmyocarditisininpigsofallages.PTVisanon-segmented,positive-senseRNAvirus,belongingtothegenusTeschovirus,thefamilyPicornaviridae,theorderPicornavirales.PigsserveasnaturalhostsofTeschovirus.Todate,13serotypesofPTVwereidentifiedinpigs,includingvirusesinserotype1toserotype12fromdomesticpigsandserotype13fromwildboars.Thevirulentstrainofserotype1PTV(PTV-1)couldcauseseverepolioencephalomyelitisinpigs,whiletheattenuatedstrainscouldleadtomildorletentinfection.Thus,PTV-1hasbeenclassifiedasthesecond-classinfectiousagentbytheOrganizationforAnimalHealth(OIE).ThediseasecausedbyPTVintheearly20thcenturyinEuropehasledtosevereeconomiclossesinthepigindustry.However,therewaslimitedinformationontheepidemiologyandgenomeinPTVinChina.Inthisstudy,atotalof934samplesfrompigswithdifferentagescollectedinJiangxiProvincefromSept2016toFeb2018weretested.Ofwhich,537werefecalandintestinalsamples,and297werebrain,lung,andlymphnodessamples.ApairofspecificprimersforPTVwasdesignedfortheinvestigationoftheepidemiologyofPTVbytestingaforementionedsamples.TheresultsshowedthatPTVwasacommonvirusinfarmedpigsinJiangxi,andthepositiverateofPTVinfeceswasashighas49.5%,andtherateinbrain,lung,andlymphnodeswas35.0%.ThepositiveratesofPTVweredifferentinpigsduringdifferentgrowingstages.Thepositiverateofsucklingpigletswas22.34%,thelowestrate,andtheratesinnursingandfinishingpigswere56.08%and56.35%,respectively.SamplescollectedinwinterandspringshowedhigherdetectionratesofPTVthanthatinsummerandautumn.Co-infectionofPTVwithotherdiarrhealviruseswasalsoobserved,andthehighestco-infectioneventwasPTVandporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV),withapositiverateof43.61%.InordertoaddressthegeneticvariationsofPTVinJiangxiprovince,fivepairsofPTV-specificprimersweredesignedtoamplifythefulllengthofthegenomesequenceofPTV.ToamplifytheextremeendofthegenomeofPTV,twoRACEprimersweredesigned.TworepresentativestrainsofCH/JX/JAstrainandCH/JX/JJstrain,sampledfromJi'an,JiangxiProvinceandJiujiang,JiangxiProvince,respectively,wereamplified.EachamplifiedfragmentwasligatedintothepMD19-Tvectorandclonedandsequenced.SequencinganalysiswasperformedusingSeqManintheDNAStarLasergenesoftwarepackage;genome-widesequencesimilarityandphylogenetictreeanalysiswereperformedusingMEGA6.05andMegAlignfromtheDNAStarLasergenesoftwarepackage.ThetotallengthsoftheCH/JX/JAstrainandCH/JX/JJstrainwere7,107ntand7,098nt,II Abstractrespectively.HomologousanalysisofthetwostrainsofthevirusgenesshowedthatthenucleotidehomologybetweenthetwoJiangxistrainswas81.9%,andthehomologybetweenthetwostrainsandreferencePTVstrainsrangedfrom80.5to91.4%.Comparedwiththereferencestrains,CH/JX/JJandCH/JX/JAhaddifferentdegreesofvariation,theconservationofthegenomesequencesofofPTVswererelativelylow,andtherewerealsovariousvariationsamongthegenomesofthereferencePTVstrains.Keyword:Porcineteschovirus(PTV),Molecularepidemiology,Full-lengthgenome,Sequenceanalysis,phylogeneticalanalysisIII 缩略词表英文简写英文全称中文翻译PTVPorcineteschovirus猪捷申病毒BpBasepair碱基对cDNAComplementaryDNA互补DNACSFVClassicalswinefevervirus猪瘟病毒OIEOfficeinternationaldesépizooties世界动物卫生组织IRESintemalribosomeentrysites内部核糖体进入位点元件EDTAEthylenediaminetetraacid乙二胺四乙酸ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验FMDVFootandmouthdiseasevirus口蹄疫病毒RdRpRNAdependengtRNAploymeraseRNA依赖RNA聚合酶MHCMajorhistocompatibilitycomplex主要组织相容性复合物PRVPseudorabiesvirus猪伪狂犬病毒LAMPLoop-mediatedisothermalamplification环介导等温扩增PPVporcineparvovirus猪细小病毒ntNucleotide核苷酸ORFOpenreadingframe开放阅读框HEVHemagglutinatingencephalomyelitisvirus猪血凝性脑脊髓炎病毒PBSPhosphatebuffersaline磷酸缓冲盐溶液PCRPolymersechainreation聚合酶链式反应IFAIndirectimmunoinfluscentassay间接免疫荧光试验PEDVPorcineepidemicdiarrheavirus猪流行性腹泻病毒PK-15PorcineKidney-15cells猪肾细胞系EBPhenylmethylsulfonylfluoride溴化乙锭PRRSVPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus猪呼吸与繁殖综合征病毒qRT-PCRQuantitativereal-timePCR实时定量PCRRTReversetranscription反转录TGEVTransmissiblegastroenteritisvirus猪传染性胃肠炎病毒STCellSwinetestiscell猪睾丸细胞PDCoVPorcineDeltacoronavirus猪丁型冠状病毒UTRUntranslatedregion非编码区IV 第一章文献综述第一章文献综述1.1病原学1.1.1概述猪捷申病（Teschendisease）又称猪塔尔凡病(Talfandisease)、猪传染性脑脊髓炎(swineinfectiousencephalomyelitis)、猪脑脊髓灰质炎(Poliomyelitissuum)，是由猪捷申病毒（porcineteschovirus，PTV）引起的一种接触性病毒性传染病，主要引起猪的神经症状，如猪脑脊髓灰质炎；也可导致母猪繁殖障碍、腹泻、心包炎、心肌炎、皮肤损伤和肺炎等症状[1-4]。猪捷申病最早于1929年在原捷克斯洛伐克的捷申城被报道，当时疫情造成超过90%的发病猪死亡，主要表现为非化脓性脑脊髓炎，造成了严重的经济损失。从此次疫情猪群中分离出的病毒毒株被命名为Teschen，因故将该病命名为猪捷申病。英国在20世纪50年代发生该病，但发病率和死亡率均较低。此后，北美、澳大利亚、非洲和中国等地分别报道了猪捷申病的发生。我国最早在2003年报道了猪捷申病的发生，研究者从内蒙古地区某发病猪场分离鉴定出一株PTV。目前，猪捷申病已经成为世界范围的猪传染病之一，影响世界养猪业的正常生产，对猪捷申病毒的调查、诊断、预防和疫苗研发等相关研究值得广大研究者关注。1.1.2病毒分类地位早期，根据病毒引起的细胞病变、热稳定性和PH耐受不同，猪捷申病毒被分入小RNA病毒科肠道病毒属Ⅰ群。由于在分子结构及系统进化中与其他病毒成员相差较大，第十一届国际病毒学大会将猪肠道病毒属中的11个血清型归为捷申病毒属，与肠道病毒属（Enterovirus）、肝病毒属（Hepatovirus）、鼻病毒属（Rhinovirus）、口疮病毒属（Aphthovirus）、嵴病毒属（Kobuvirus）、马鼻炎B病毒属（Erbovirus）、人双艾克病毒属（Parechovirus）同属于小RNA病毒科[5]。已发现的家猪PTV血清型分别为PTV-1~PTV-12共12个血清型，在野猪中检出PTV-13，故目前共有13种血清型毒株[6-8]。不同血清型毒株在基因序列存在差异，13个血清型毒株可形成各自的进化树分支（图1-1和1-2）。据报道，不同血清毒株的毒力也存在差异，导致的临床症状也不同。PTV-1的强毒株可导致严重的捷申病毒脑脊髓灰质炎，被世界动物卫生组织（OIE）列为B类传染病，PTV-1的其他弱毒株及其他血清型能引起温和型或隐性感染[4]。1 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析图1-1各血清型基于PTV的VP1基因氨基酸序列的进化关系Fig.1-1ThephylogenetictreeofVP1aminoacidsequenceofPTVsfromdifferentserotypes图1-2各血清型基于PTV的衣壳蛋白（P1区）的氨基酸序列的进化关系Fig.1-2Thephylogenetictreeofnucleocapsidprotein(P1region)aminoacidsequenceofPTVsfromdifferentserotypes1.1.3病毒粒子结构与特性猪捷申病毒粒子呈球形或椭球形，直径约为25-30nm，该病毒无囊膜，由蛋白质2 第一章文献综述外壳和内部核心两部分组成。病毒内部核心为单股正链RNA，基因组大约为7.2knt，编码一个大的开放阅读框（ORF）；蛋白质外壳由紧密排列的32个壳粒组成，呈二十面体对称结构，核衣壳上无脂蛋白，每个壳粒上均有VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白[9][10]。PTV的衣壳蛋白具有特异性抗原，可包装病毒RNA入衣壳内。PTV靠衣壳蛋白吸附于宿主细胞表面，然后与细胞表面的特异性受体结合而感染宿主细胞。病毒粒子进入宿主细胞内后再将病毒RNA释放入宿主细胞胞浆中，可在宿主细胞内复制和组装出新的病毒粒子，继而对宿主细胞造成损伤[11]。猪捷申病毒无囊膜，但衣壳的存在可保护病毒核酸，免受环境中核酸酶及其他理化因素破坏，使得病毒对环境的抵抗力增强。该病毒对多种消毒剂有不同程度的抵抗力，PTV耐酸性强，经氯仿和乙醚等有机溶剂处理后仍有活性；但次氯酸钠和70%酒精能使病毒完全灭活。对热也有抵抗力，可在15℃下存活168d，56℃下作用2h、60℃下作用15min都不能将该病毒灭活。因此，感染猪通过粪便等途径排毒后，可在猪舍中长期存在。Jones等人报道，在2℃储存6周的真空包装猪肉中仍可检出PTV[12]。由于无囊膜，冻干会使病毒滴度大大降低，因此不可用冻干法进行保存；一般将PTV储于50%的甘油中，4℃可长期保持毒力，-70℃也可长期保存。图1-3猪捷申病毒衣壳蛋白三维结构模型[13]Fig.1-3Modelofthe3-dimensionalstructureofthecapsidproteinofPTV1.1.4基因组结构与功能猪捷申病毒基因组全长大小约为7.2knt，基因组排列顺序为：5′UTR-L-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3′UTR。整5′末端和3′末端都有一段非翻译区（untranslatdregion,UTR），5′UTR长度远大于3′UTR；其中5′UTR含PolyC结构，具有一个分子量较小的基因连接蛋白VPg，而3′UTR含Poly(A)结构。整个基因组含有一个大的开放阅读框，经蛋白酶切割加工后形成P1、P2和P3种多肽前体，其中P1为衣壳蛋白的前体，经过加工成熟后为PTV的衣壳蛋白；P2和P3均为非结构蛋白的前体，成熟后形成一些中间前体产物，这些产物都非常稳定，参与病毒复制的各项生命活动（图1-4）[14]。3 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析3A图1-4猪捷申病毒基因组结构示意图Fig.1-4Theschematicdiagramofgenomestructureofporcineteschovirus小RNA病毒科的病毒基因组中5′UTR长度约为610~1200nt。猪捷申病毒的5′UTR非翻译区可分为两部分，一部分是与5′UTR共价相连的小RNA病毒都有的VPg蛋白，一部分是内部核糖体进入位点元件（intemalribosomeentrysites,IRES）[15]。多种动植物病毒都有VPg蛋白，但表现出较大的差异性和不规则性。PTV的VPg蛋白是一种非结构蛋白，由非结构蛋白基因的3B编码，该蛋白不仅能稳定PTV基因组的结构，还在病毒的生命活动中起重要作用[16,17]。例如，PTV的RNA依赖的RNA聚合酶（RNAdependengtRNAploymerase，RdRp）则以VPg蛋白为引物，启动负链RNA合成从而完成病毒的复制[18]。VPg还可能影响病毒的成熟与释放，Arias等对小RNA病毒VPg蛋白的研究表明，低拷贝的VPg重组病毒依然可在细胞中正常复制，但不能产生CPE[19]。根据IRES元件的结构和功能，可分为四种类型，其中小RNA病毒科病毒基因组的IRES元件有三种类型[20]。IRES元件在PTV基因组翻译过程中起调控作用，能够招募翻译起始因子和核糖体从而启动翻译过程。在小RNA病毒中IRES元件有四个特征：①在同一mRNA分子中，IRES介导的翻译效率与其所处的位置无关；②IRES介导的内部翻译过程不依赖于帽子结构；③IRES介导的翻译独立于同一条mRNA上的其他ORF的表达；④某些病毒蛋白可能影响IRES活性，但不参与IRES功能的发挥。猪捷申病毒蛋白的合成，是一种不依赖帽子结构的翻译模式[10,21,22]。猪捷申病毒的3′UTR末端与poly（A）尾相连，3′UTR的长度约为47~341nt，poly（A）尾一般为20个以上的腺嘌呤核糖核苷酸（A）残基。3′UTR内部可形成一些复杂的RNA结构，如发卡样X-Y茎-环结构、Z形茎-环结构和吻型结构，这些结构的改变可改变病毒的复制能力，甚至使病毒丧失复制能力。猪捷申病毒的3′UTR与poly（A）尾对病毒的感染性均有重要作用，不论是删除3′UTR或poly（A）尾或改变它们的长度，都会影响病毒的感染性[5,23]。同时5′UTR、3′UTR和poly（A）尾之间存在相互作用，三者作用可提供一些捷申病毒合成正链和负链RNA必须的细胞因子。3′UTR和poly（A）尾的相互作用也可促进IRES元件的活性，从而增强翻译起始效率[24]。不同的小RNA病毒中前导L蛋白（Leaderprotein）的长度不同，也有些小RNA病毒不编码L蛋白，如鼻病毒属、肝病毒属等。猪捷申病毒5′端编码序列上翻译的第一个蛋白成为前导L蛋白，该蛋白具有水解酶活性，可利用宿主细胞自身蛋白质翻译系统，为捷申病毒的复制和翻译4 第一章文献综述提供原料及场所[11]。P1编码区编码的VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白分别由262、279、242和74个氨基酸组成，这4种结构蛋白形成猪捷申病毒的衣壳。不同血清型PTV的VP1蛋白的氨基酸数可能不同，VP1氨基酸的变异是不同血清型PTV毒株毒力不同的主要原因[25]。VP1、VP2和VP3蛋白在病毒粒子表面，其中VP1不仅能维持病毒粒子的完整形态，还是决定病毒抗原性的主要成分，在病毒粒子与受体结合、病毒脱壳中起重要作用[26-28]。VP2与VP1末端结构可能是病毒的主要抗原决定簇，共同参与病毒-受体结合。VP4蛋白在病毒粒子内部，与病毒基因组RNA核心结合。P2（2A、2B、2C）和P3（3A、3B、3C和3D）编码的非结构区与病毒的复制有关。非结构区编码的蛋白都发挥各自作用，2A蛋白酶参与P1与P2之间的水解反应，对2A、2B进行裂解，与口蹄疫病毒（FMDV）的2A蛋白相似[29]；2B蛋白在宿主细胞的细胞质表面发挥其功能，调节宿主细胞膜的通透性；2C蛋白与捷申病毒RNA的合成有关，只有在病毒复制时才会产生，病毒感染宿主细胞后可改变细胞的膜结构，继而生成RNA复制复合体，为病毒复制提供平台，不同小RNA病毒属的病毒2C蛋白结构存在不同程度的差异[30]。3A通过对主要组织相容性复合物Ⅰ（MHCⅠ）的表达进行抑制作用，从而发挥对宿主细胞的免疫应答起调节作用[31]；3B基因编码VPg蛋白，在小RNA病毒中为病毒开始复制的识别信号，参与病毒的装配；3C蛋白主要功能是对大部分的多聚蛋白进行切割，与其他蛋白的相互作用依赖于3C水解蛋白酶的存在[32]；3D蛋白基因在小RNA病毒基因中最长，由1356个核苷酸组成，编码462个氨基酸，3D蛋白具有聚合酶活性，高度保守，可用于PTV的遗传进化分析，各个血清型的PTV氨基酸同源性在90%以上。3D基因编码的RNA聚合酶（RdEp），在病毒RNA正负链的合成中起关键作用，其机制为在RdEp的作用下病毒以正链RNA为模板，形成RNA复制中间体，然后以先合成互补负链，再合成正链RNA的方式完成病毒RNA双链的复制[33,34]。1.1.5病毒感染和复制机理与小RNA病毒的复制类似，猪捷申病毒的复制需先终止正链RNA的翻译，再开始负链的合成。其中3D蛋白酶催化RNA链延伸，激活VPg蛋白作为负链合成的引物，以负链为模板，在3′UTR的poly（A）尾为负链合成的起点，从而启动整个复制过程。此外，负链还可作为合成病毒蛋白的模板，在非依赖帽子结构机制的指导下合成病毒蛋白[15,35]。猪捷申病毒的复制与感染过程受许多因素的作用与影响，如蛋白与RNA相互作用、蛋白与蛋白间的相互作用；病毒为了感染宿主细胞，先改变宿主细胞细胞膜的通透性，导致囊泡与细胞膜发生的重排，抑制细胞信号传导及蛋白分泌；从而抑制宿主细胞的转录和翻译，导致骨架被破坏，细胞溶解作用[15,36,37]。吴波平通过反向遗传操作技术构建了PTV-1全长cDNA克隆，为研究PTV及其他小RNA5 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析病毒的感染复制机理、病毒与宿主细胞的相互作用及基因工程相关疫苗的研制等方面提供重要手段[34]。1.2流行病学猪是猪捷申病毒的唯一宿主，不同品种不同日龄猪只均可感染，其中血清抗体阴性猪较为易感，幼龄猪的易感性最高[38,39]。猪捷申病毒病具有地方流行性，隐性感染猪、病猪和康复猪为主要传染源，该病毒在猪群的感染呈波浪式。带毒猪通过排泄物持续散毒，污染饮水和饲料导致其它各个年龄段猪群经消化道、呼吸道等途径感染[40]。未妊娠母猪感染后，带毒期可达2个月，妊娠母猪带毒期约为3个月，可通过胎盘感染胎儿。公猪精液可带毒，但无证据表明精液中携带病毒可感染母猪[41,42]。虽然PTV的血清型众多，每个血清型毒株相互间没有交叉免疫性，不同血清型的毒株没有相互排斥。Chiu等用RT-PCR方法检测了猪不同器官的PTV，发现同一猪的不同器官可出现两种血清型的PTV共存的现象，说明不同血清型的PTV可通过不同感染途径感染同一猪的不同器官[3]。1.2.1国外流行病学进展1929年猪捷申病于原捷克斯洛伐克捷申小镇首次爆发，病死率高达80%以上，分离得毒株命名为Teschen，随着病毒的传播，给全球养猪业造成严重经济损失[43,44]。英国和丹麦于1955-1957分离得弱毒株命名为Talfan，与Teschen同属猪捷申病毒血清1型，此后西欧、美国、加拿大和澳大利亚等其他国家陆续有低病死率的猪捷申病报道[45]。自1996开始，白俄罗斯、日本、拉脱维亚、马达加斯加、俄罗斯和乌克兰等地纷纷向OIE报道由猪捷申病毒引起的严重脑脊髓灰质炎病例[46]。2009年海地共和国爆发严重的猪捷申病，发病猪只无发热表现，主要表现为后驱麻痹、眼球震颤等症状，剖检无明显病变，发病率和死亡率分别为60%和40%[47]。捷克2005至2011年间野猪与家猪PTV的阳性感染率报道分别为44.4%和27.1%，通常与其他肠道病毒混合感染，并且首次在捷克共和国检出PTV-11型[48]。2013年Daiane等报道首次在巴西猪群中检测到PTV感染[49]，2014~2015年对捷克203头野猪的流行病学调查中显示PTV的阳性感染率为20.2%，为所有病毒中最高[50]。1.2.2国内流行病学进展我国学者于2003年首次在内蒙古地区分离到PTV-1型毒株，与Talfan毒株有98.9%的同源性，随后我国研究人员开展了对PTV的一系列流行病学等研究[51]。2003年吉林省某猪场出现猪急性腹泻、呼吸困难及猪死亡，经病毒分离鉴定为PTV-8型毒株[52]。ZhengQiu对2008-2009年PTV相关流行病学调查显示我国北方各个省份PTV的阳性率分别为30%~90%[53]。BinWang对PTVJF613毒株进行病毒分离测序分析，提出PTV各毒株间存在同源重组，虽不一定改变毒株的毒力，但有利于病毒的进化[54]。据Wang报道2010年在北京分离到自然重组PTV-4毒株，经基因组序列比6 第一章文献综述对分析结果表明，分离10BJ02的4个交叉区域的基因组序列与血清型2、4、6、8株的基因组序列相似，说明PTV各毒株间发生了重组[55]。2014年对上海的322个样本进行PTVRT-PCR检测，结果有276个阳性样本，PTV的感染率为85.7%，并且首次在上海检出PTV-6、8型毒株[39,56]。2014年-2017年我国湖南省猪场PTV感染率的调查表明，来自29个猪场的261份粪便样及91份肠道组织样中PTV阳性率为19.03%，其中生长育肥猪的感染率最高，并且无腹泻症状的患病猪阳性率高于出现腹泻症状的患病猪[57]。对PTV的流行病学调查研究说明捷申病毒在我国分布广泛，但分布具有地域差异性，各个地区流行的血清型不同。虽然PTV未对我国养猪业造成严重影响，相关研究学者以及研究报道较少，但应对其潜伏感染引起高度重视，一旦PTV出现爆发性流行，将对我国养猪业造成严重损失。图1-5国内近年PTV流行病学情况Fig.1-5TheepidemiologyofPTVinChinainrecentyears1.3致病性与临床症状1.3.1病毒致病性捷申病毒有多种血清型，不同血清型的毒力不同，造成的临床症状也不同。PTV对外界环境的抵抗力较强，能长期存在于猪舍，常与猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等病毒混合感染，可能与其他病毒有协同作用，导致更严重的疾病，例如PTV与非典型性猪瘟病毒（APPV）共同感染，可加强对神经系统的损伤，造成更高的死亡率[58,59]。通过实验发现PTV可能是通过血管直接侵入中枢神经系统从而引起以脑脊髓炎为主的神经症状[14,60]。7 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析1.3.2临床症状及病理变化猪捷申病毒强毒株通常以引起猪一系列神经症状为主要特征，如猪脑脊髓灰质炎，也可导致母猪繁殖障碍，可引发严重的爆发流行[61]。弱毒株感染通常表现出多种临床症状，如皮肤损伤、腹泻、心包炎、心肌炎和肺炎等[62]。脑脊髓灰质炎：PTV1、2、3、5四种血清型均可引起一系列神经症状，以1型强毒株感染造成的脑脊髓灰质炎症状最严重，有较高的病死率，常造成严重经济损失。在发病前期引起机体体温急剧升高至41.5℃，并出现厌食、倦怠等症状；随着病情加重出现运动失调、角弓反张、眼球震颤、抽搐、痉挛；在发病后期机体麻痹瘫痪，呈犬坐式或卧地不起，常在发病后3-4d内死亡。PTV-1型弱毒株导致的脑脊髓灰质炎较温和，发病率和病死率较低。脑脊髓灰质炎除了慢性病例可见肌肉萎缩外，无眼观可见变化，组织病理变化以脊髓腹侧、小脑皮质和脑干最显著，表现为神经元进行性弥漫性染色质溶解，胶质细胞局灶性增生和血管周围袖套[63]。母猪繁殖障碍：PTV可通过胎盘感染胎儿，导致母猪不孕、产死胎和木乃伊胎等繁殖障碍。但感染母猪无特异性病理变化，偶尔可在脑干见轻度胶质细胞增生及形成血管周围套。母猪在妊娠前期感染PTV，通过胎盘感染胚胎，导致胚胎死亡后被吸收，母猪产仔率下降；妊娠中后期胎儿感染，母猪常产出木乃伊胎、死胎，畸形胎；死亡胎儿可见胸腔、心包积液，皮下和肠系膜水肿等，需与其他病毒引起的此类疾病相鉴别区分[64]。腹泻：捷申病毒虽可引起猪腹泻，但肠绒毛不萎缩。常在腹泻仔猪的粪便中分离到猪捷申病毒，人工感染复制的猪捷申病毒引起的腹泻较轻而短暂。心包炎、心肌炎和肺炎：PTV单独感染不引起明显的呼吸道症状，通常呈亚临床型。PTV通过人工感染可产生心包炎和心肌炎病理变化，PTV-3型可引起浆液纤维素性心包炎，感染严重的仔猪可出现局灶性心肌坏死。1.4诊断方法1.4.1临床诊断临床上可通过观察感染猪临床症状、病理变化以及剖检对PTV进行诊断。但须与其他可引起神经症状、母猪繁殖障碍的病毒相区分，如猪伪狂犬病毒（PRV）、猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪日本乙型脑炎病毒（JEV）。对感染猪剖检通常可见脑、脑膜充血、水肿，病死猪可见心肌坏死、纤维素性心包炎、肺实变、肺泡和支气管内有渗出液（表1-2）[65,66]。由于PTV常与其他病毒混合感染，引起的症状也与其他病毒类似，临床上难以鉴别诊断，还需通过实验室诊断进行确诊[67]。8 第一章文献综述表1-2猪捷申病毒与其他类似病毒引起的症状的鉴别Table1-2TheidengtificationofPTVandotherdisease病原相同点不同点都可引起脑脊髓炎、母猪繁殖障PRV可导致大猪表现呼吸症状，公猪睾丸猪伪狂犬病毒碍，出现神经症状，运动失调、肿胀、萎缩，丧失种用能力。剖检可见肾（PRV）后躯麻痹，都可垂直传播感染胎脏针尖状出血点、扁桃体、肝脏和脾脏均儿。有散在白色坏死点。HEV不引起母猪繁殖障碍，可导致患猪反猪血凝性脑脊髓炎病都可引起脑脊髓炎、眼球震颤等复干呕和呕吐；PTV引起的脑脊髓炎的临毒（HEV）神经症状。床症状更为严重。PRRSV可导致病猪免疫抑制，呼吸症状，猪繁殖与呼吸综合征都可引起母猪繁殖障碍、仔猪肌部分病猪耳部发绀，剖检可见间质性肺（PRRSV）肉震颤、后躯麻痹。炎、肺脏肉样变。猪日本乙型脑炎病毒都有神经症状，导致母猪繁殖障JEV可导致公猪睾丸炎，一侧睾丸明显肿（JEV）碍。大。1.4.2实验室诊断1.4.2.1病毒分离鉴定PTV易在猪源细胞培养中生长，以元代或次代猪肾细胞或肾细胞系（PK-15、IBRS-2）最为常用，有些毒株还可在睾丸细胞（ST）、HeLa、BHK-21和Vero等细胞系繁殖，实验证明PTV-1型毒株在IBRS-2细胞上产生CPE时间比PK-15细胞短，病毒增殖效果更好[68]。不同毒株产生的细胞病变形态各异，主要特点为：细胞破碎、脱落或内部有颗粒形成，细胞呈圆形，周围呈星形突起。PTV引起的脑脊髓灰质炎病猪，在临床发病前期进行病毒分离可提高成功率，采集脊髓、脑干或小脑组织等制成组织培养用悬液，接种于PK-15等细胞，观察细胞病变（图1-6）。但病毒分离结果缺乏敏感性，耗时较久，需要至少3-4天[69]。A：病变细胞；B：正常细胞A:InfectedPK-15cells;B:normalPK-15cells图1-6PTV在PK-15细胞上引起的CPEFig.1-6ThecytopathiceffectcausedbyPTVonPK-15cells组织培养后的细胞可用于免疫酶染色法或荧光抗体染色直接检测组织中的病毒抗原。9 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析在发病后期出现麻痹症状时，其中枢神经系统、粪便中病毒含量较低，从中分离病毒意义不大。对于PTV引起的母猪繁殖障碍病例，可采集流产或死产的胎儿的肺组织进行病毒分离，而木乃伊胎不含活病毒。PTV在健康仔猪中普遍呈隐性感染，对于肺炎、腹泻发病猪，可从呼吸道或肠道组织分离病毒，但不能对其进行确诊[70]。1.4.2.2血清学诊断血清学诊断方法相较于病毒分离步骤简单、节省时间，有间接免疫荧光试验（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、补体结合试验、斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）等血清学诊断方法对PTV进行诊断。刘芹防建立的检测PTV抗体的IFA技术具有敏感、特异等优点，但只能检出PTV-1型和8型[71]。但PTV有多种血清型，易产生部分血清型的交叉，影响血清学诊断的敏感性，且PTV在猪群的普遍感染，血清学抗体检测对PTV的诊断意义不大。1.4.2.3分子生物学诊断随着分子生物学的不断发展，各项技术的不断成熟，各种检测方法的建立能够快速、准确的对PTV感染或PTV与其他病毒混合感染进行确诊，如RT-PCR、Nested-PCR、荧光定量PCR[72]、套式PCR、多重PCR[66]等，但都需要相关分子生物学操作技术，仪器需求较高，易污染导致成功率不高。WangBin等建立的环介导等温扩增方法（Loop-mediatedisothermalamplificationLAMP）检测PTV感染，具有条件简单，节省时间等优点，灵敏度是常规PCR反应的10倍以上，且不存在交叉反应[73]。王建峰在2016年建立的荧光定量RT-PCR检测PTV方法与普通PCR相比具有特异性强、不易污染等优点[74]。孟丽针对七种可引起猪消化道疾病的病毒设计了一种敏感性和特异性高的多重PCR，能够做到对PTV的快速鉴别诊断[65]。1.4.2.4免疫组化鉴定免疫组化指免疫组织化学技术（IHC），与Westernblotting、ELISA的原理相同，通过抗原抗体间的特异性结合，使与抗体相连的标记物显色或发光，继而对组织细胞内的抗原进行定量、定位或相对定量，广泛用于肿瘤诊断和鉴别诊断中，具有高度特异性、高敏感性及定位准确等优势。Yamada建立的免疫组化研究方法确定了组织细胞中PTV主要抗原的分布位置，可对PTV造成的病理现象开展深入研究[39]。1.5预防与治疗随着PTV毒力的降低，对养猪业的影响减小，猪场对PTV的重视程度越来越小。由于PTV在猪群主要为潜伏感染，母源抗体对仔猪有高效保护，PTV的血清型众多，以至对PTV的相关预防工作以及疫苗的研制、应用较少。在PTV感染严重的地区，疫苗接种是预防PTV最为有效的方法，对猪进行疫苗免疫，提高猪群的免疫力以减少PTV对猪场造成的损失。可通过后备种猪与隐性感染猪混养，使后备种猪产生免疫力，从而使仔猪获得来自母源抗体的高效保护，对PTV有预防作用。PTV对环境的抵抗力10 第一章文献综述较高，能长期存在于猪舍中，所以不适宜对感染猪进行隔离。可加强生物安全管理，改善饲养条件，制定有效的综合防治措施，提高猪群的免疫力从而预防PTV感染。目前无有效的治疗方法治疗猪捷申病毒病。对弱毒株感染导致发病的猪群，需防止、控制其他病原的继发感染。由PTV强毒株引起的发病死亡，需对猪场实行完全隔离、消毒，扑杀感染猪或同群猪。11 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析第二章江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及病理组织学观察猪捷申病是由猪捷申病毒（porcineteschovirus）引起的各年龄猪群发生一种以脑脊髓灰质炎、生殖障碍、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎等临床症状为基本特征的疾病[4]。该病曾在世界一些地区的猪群中流行，造成过巨大的经济损失[2]。1929年，在原捷克斯洛伐克暴发了一种传染性高、伴有神经症状的猪传染病，死亡率高达80%，为猪捷申病毒一型（Teschen毒株）感染所致。随后，在1956年英国发现了一种危害程度较轻的疾病，命名为塔尔凡病，由猪捷申病毒二型（Teschen毒株）感染引起，并代替高致病性的Teschen毒株在一些地区广泛流行[75]。其后，该病在美国、英格兰、日本以及中国等地陆续报道，并有更多的血清型毒株出现，同一血清型的毒株毒力也各有差别[2,48,50,76]。到目前为止，已有13种猪捷申病毒的血清型被发现，即PTV-1到PTV-13[6]。2003年，我国内蒙古首次分离到PTV-1，后又在其他省份分离到PTV-8和PTV-2，表明我国猪群存在PTV的感染[2,56,57]。因此，了解该PTV在中国猪群中的感染情况对当前猪捷申病毒病的研究及防控具有重要的意义。2.1主要材料及试剂2.1.1样品收集于2016年9月-2018年2月采集江西地区各猪场有猪脑脊髓炎、肺炎、腹泻、母猪繁殖障碍等症状的猪脑、肺及粪便等共834份，其中粪便及肠道样品537份，脑、肺、淋巴结等内脏组织297份。2.1.2主要试剂RNAisoPlus、M-MLV反转录酶、dNTPMixture、RibonucleaseInhibitor、rTaqDNA聚合酶、DL2000DNAmarker、胶回收试剂盒及pMD-19T载体等均购置宝日医生物技术(北京)有限公司，TOP10感受态细胞购自北京天根生化有限公司。氯仿、异丙醇购自西陇化工股份有限公司。氨苄青霉素钠、胰蛋白胨、酵母粉、琼脂粉购自北京索莱宝科技有限公司。一次性平板、EP管购自广州洁特生物过滤股份有限公司。琼脂糖、2×TSINGKEMasterMix购自北京擎科新业生物技术有限公司。2.1.3主要仪器小型台式高速冷冻离心机centrifuge5424REppendorf中国有限公司ThermoSorvallST16/ST16R通用台式离心机赛默飞世尔科技（中国）有限公司S1000PCR仪伯乐生命医学产品（上海）有限公司PurifierVerticalCleanBenches超净台美国Labconco仪器有限公司DK-8D数显恒温水浴锅金坛市医疗仪器厂12 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析震荡培养箱韶关市泰宏医疗器械有限公司超低温冰箱青岛海尔特种电器有限公司EnduroGelXL迷你电泳仪美国Labnet仪器有限公司超微量分光光度计（NanoDrop2000）赛默飞世尔科技（中国）有限公司电子天平北京赛多利斯仪器有限公司凝胶成像系统培清全自动凝胶成像分析2.1.4常用试剂、培养基的配制（1）氨苄青霉素钠（Amp+）贮存液（100mg/mL）：称量4g氨苄青霉素钠溶于50mLEP管中，移液枪准确加入40mLddH20，经0.45μm滤器过滤，分装于2mLEP管，-20℃保存备用。（2）LB液体培养基：胰蛋白胨3g、NaCl3g、酵母提取物1.5g，加入300mLddH20摇荡溶解，溶解完全后调节pH至7.2-7.6，115℃，30min高压灭菌。冷却至室温后置于4℃保存。（3）LB固体培养基（加Amp+）：胰蛋白胨3g、NaCl3g、酵母提取物1.5g，琼脂粉5.4g加入300mLddH20摇荡溶解，溶解完全后调pH至7.2-7.6，115℃，30min高压灭菌。高压完成后，置于50-55℃恒温水浴锅中20-30min，温度稳定后，于超净台中加入300μL氨苄青霉素钠贮存液，缓慢摇匀（避免产生气泡）后迅速倾注平板。放置4-8h后保鲜膜包好平板，置于4℃保存，1个月内用完。（4）50XTAE贮存液：称取tris60.5g、Na2EDTA.2H2O9.3g于500ml烧杯中，然后加入150ml的去离子水，充分搅拌溶解.加入14.3ml的冰乙酸，充分混匀。加双蒸水至容量瓶中定容至250mL，混匀后置于500mL细口玻璃瓶中密封室温保存。（5）1XTAE：量取10mL50XTAE贮存液于500mL容量瓶中，加双蒸水定容至500mL，上下颠倒混匀后室温保存备用。（6）溴化乙锭（EB）贮存液（10mg/mL）：称取150mgEB粉末于棕色磨砂口瓶中，加入15mlddH2O，轻轻摇均溶解，盖紧常温保存。（7）2%琼脂糖凝胶：称量4g琼脂糖于500mL锥形瓶中，量筒量取200mL1XTAE溶液于锥形瓶，微波炉大火加热5-8min至完全沸腾，加入5μlEB混匀，常温保存备用。2.2方法2.2.1引物设计选择PTV保守序列5UTR区域设计引物，参照文献[57]，上游引物序列为PTV-Fp：TGTTGTGTTTAAACACAGAAAT；下游引物序列为PTV-Rp：TTCAACTGACTATACAAAGTAC，预期扩增产物大小为307bp，并送至上海生工生物工程有限公司合成。13 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析2.2.2病毒核酸的提取采集猪脑、肺及粪便于1.5mLEP管，按1﹕2体积加入生理盐水后剪碎，反复冻融3次（每次冻融后的样品需涡旋混匀15s），8000rpm4℃离心5min；取300µL上清液加700μLRNAisoPlus于新1.5mLEP管，涡旋混匀1min后加入200μL氯仿，连续剧烈震荡1min；12000rpm4℃离心5min；吸取500μL上清液至新的DEPC处理的EP管中，加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒混匀1min；12000rpm4℃离心5min，弃上清；沉淀加入1mL经DEPC的75%乙醇；12000rpm4℃离心5min，弃上清；瞬离后再次吸干残留液体（可重复几次），加30μLDEPC处理过的水溶解沉淀（即RNA），-80℃保存备用。2.2.3反转录5×M-MLVBuffer4μLdNTPMixture（2.5mmol·L-1）2μLRibonucleaseInhibitor（40U·μL-1）0.5μLM-MLV反转录酶（200U·μL-1）1μLMg2+（25mmol·L-1）2μLRandom（10μmol·L-1）2μL2μLRNA2μLddH2O至20μL程序为：42℃50min，94℃5min；反应产物-20℃保存备用。2.2.4聚合酶链式反应以反转录的cDNA为模板，用引物PTV-Fp/PTV-Rp进行PCR扩增。PCR体系：10×PCRBuffer2.5μLdNTPMixture（2.5mmol·L-1）1μL上游引物PTV-Fp（10μmol·L-1）1μL下游引物PTV-Rp（10μmol·L-1）1μLrTaq（5U·μL-1）0.25μLcDNA模板2.5μLddH2O至25μL反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸35s，38个循环；最后，72℃延伸10min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果。2.2.5目的片段的连接目的片段与pMD19-T连接，连接体系如下：14 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析SolutionI5μLpMD19-T0.5μL胶回收产物4.5μL轻轻用枪头混匀，置于16℃连接120min。2.2.6连接产物的转化①从-80℃超低温冰箱中取出Top10感受态细胞，置于冰水中溶解；取25μl感受态细胞于无菌的1.5mlEP管中，再加入5μl连接产物，轻弹混匀；置于冰水中冰浴25-30min；并打开水浴锅，温度调至42℃。②将含感受态和连接产物的EP管快速、轻轻置于42℃水浴锅中热应激60-90s;并快速轻轻取出置于冰水中冰浴3-5min。③向离心管中加入1ml经高压灭菌的LB培养液，37℃180rpm振荡培养60min，并把LB平板（+Amp）置于37℃恒温培养箱中回温、烘干。④重组菌液6000rpm离心5min，弃800μl上清，用200μl枪头重悬菌体，取100μl菌液多点滴于LB平板（+Amp），用4mm高压灭菌的玻璃珠左右上下摇晃将菌液均匀涂布。保鲜膜包好置于37℃恒温培养箱正置培养10-20min，后倒置培养14-16h。2.2.7重组菌液的鉴定①从LB平板（+Amp）上随机挑取5个菌落于1.5mLEP管中500μlLB液体培养基中。②37℃200rpm振荡培养4-6小时至培养液出现云雾状浑浊。③以菌液为模板，上游引物M13F:CAGGAAACAGCTATGACC；下游引物M13R:TGTAAAACGACGGCCAGT进行PCR扩增。PCR体系：2×TSINGKEMasterMix12.5μL上游引物M13F（10μmol·L-1）1μL下游引物M13R（10μmol·L-1）1μLcDNA模板2.5μLddH2O至25μL反应程序：94℃预变性10min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸35s，36个循环；最后，72℃延伸10min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果。菌液PCR鉴定后各挑选三个阳性克隆菌液送北京擎科新业生物技术有限公司测序。2.2.8组织样品采集和组织病理学检查（1）发病濒死仔猪安乐死，剖检观察仔猪各个器官与肠道病变。采集脑组织后置于4%多聚甲醛固定48h以上。另取一份脑组织用于病毒检测，于-80°C保存备用。（2）病理切片制作：15 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析①将固定好的脑组织修成长度约0.5cm组织块，流水冲洗组织8-12h，以水能轻微冲动标本为准。②依次使用70%、80%、85%、90%、95%酒精脱水60min，无水乙醇脱水2次，每次40min。③用2/3酒精二甲苯溶液（V(酒精):V(二甲苯)=2:3）透明10min，再用1/3酒精二甲苯溶液（V(酒精):V(二甲苯)=1:3）透明5min，最后用纯二甲苯溶液透明1min。④将透明后的样品置于融化的软蜡中（熔点56-58°C）浸泡90min，再放入融化的硬蜡中（熔点58-60°C）浸蜡90min，使石蜡完全浸透组织。⑤在蜡盒中加入融化的硬蜡，将组织切面朝下放入蜡盒，过夜凝固。使用徕卡切片机将组织蜡块。切成厚度为0.4mm组织薄片，放入42°C温水中展开，用干净载玻片（HE染色使用普通载玻片、免疫组化试验使用防脱片载玻片）缓慢捞起蜡片，甩干水滴，置于50°C烘箱烘片。烘干后切片置于4°C保存备用。（3）切片HE染色：①切片脱蜡依次用二甲苯处理8min、二甲苯处理5min、无水酒精处理3min、无水酒精处理5min②用95%、90%、80%、70%、60%酒精复水各5min，再用自来水和蒸馏水各冲洗5min。③切片用苏木紫溶液染色8min，自来水冲洗10min。然后用醇酸浸泡30s进行切片分色，自来水冲洗10min，蒸馏水冲洗1min。④伊红溶液染色3min后95%酒精脱水2次，每次5min。⑤无水酒精脱水2次，每次5min，二甲苯浸泡8min后用树胶封片观察。2.3结果2.3.1临床样品PTV检测结果使用引物PTV-Fp/PTV-Rp对江西不同地区的规模化养猪场临床样品进行PCR扩增检测，扩增产物的大小约300bp，与预期目的片段大小一致（图2-1）。M：DNAMarkerDL2000；泳道1-24：部分临床样品PTVRT-PCR检测结果M：DNAMarkerDL2000；Lane1-24：PTVRT-PCRresultofrepresentativesamplesofpigs图2-1部分临床样品RT-PCR检测Fig.2-1RT-PCRresultsofrepresentativesamplesofpigs16 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析2.3.2部分PTV江西株5'UTR测序结果与序列分析挑选四个阳性克隆菌送至北京擎科新业生物技术有限公司测序，测序结果使用DNASTARLasergene序列分析软件，进行拼接分析。把拼接好的序列置于NCBIblast在线软件比对分析，比对结果表明所扩增的序列为PTV序列。其中，部分扩增结果序列如下：CHJX1/20175’-TGTTGTGTTTAAACACAGAAATTTTGTTATCTGGCTACAGATCTATTGGATTAACCCTTTTGAAAGACCTGCTCTGGCGCGAGCTAAAGCGCAATTGTCACCGGGTATTGCACCAATGGTGGCGACAGGGTGCAGAAGAGCAAGTACTCCTGACTGGGTAATGGGACTGCATTGCATATCCCTAGGTACCTATTGAGATTTCTCTGGGACCCACCAGCATGGAGTTCCTGTATGGGAATGCAGGACTGGACTTGTGCTACCTGACAGGGTCGCGGCTGGCCGTCTGTACTTTGTATAGTCAGTTGAA-3’CHJX2/20175’-TGTTGTGTTTAAACACAGAAATTTTGTTGTCTGGTTATGAATTCATAGGATCAATCCCTCTGAAAGACCTGCTCTGGCGCGAGCGAAAGCGCAATTGTCACCAGGTACTGCACCAATGGTGGCGACAGAGTGCAGAAGAGCAAGTACTCCTGACTGGGTAATGGGACTGCGTTGCATATCCCTAGGCACCTATTGAGATTTCTCTGGGGCCCACCAGCGTGGAGTTCCTGTATGGGAATGCAGGACTGGACTTGTGCTGCCTGACAGGGTCGCGGCTGGCCGTCTGTACTTTGTATAGTCAGTTGAA-3’CHJX3/20175’-TGTTGTGTTTAAACACAGAAATTTTGCTATCTGGTTACAGACCTCTTGGATTAACCCTTTTGAAAGACCTGCTCTGGCGCGAGCTAAAGCGCAATTGTCACCGGGTATTGCACCAGTGGTGGCGACAGGGTACAGAAGAGCAAGTACTCCTGACTGGGCAATGGGACTGCATTGCATATCCCTAGGTACCTATTGAGATTTCTCTGGGACCCACCAGCATGGAGTTCCTGTATGGGAATGCAGGACTGGACTTGTGCTACCTGACAGGGTCGCGGCTGGCCGTCTGTACTTTGTATAGTCAGTGAA-3’CHJX4/20175’-TGTTGTGTTTAAACACAGAAATTTGATTGTTTGGTTATGAATTCATTGGATTAACCCTCTGAAAGACCTGCTCTGGCGCGAGCTAAAGCGCAATTGTCACCGGGTATTGCACCAATGGTGGCGACAGGGTACAGAAGAGCAAGTACTCCTGACTGGGCAATGGGACTGCATTGCATATCCCTAGGCACCTATTGAGATTTCTCTGGGGCCCACCAGCATGGAGTTCCTGTATGGGAATGCAGGACTGGACTTGTGCTGCCTGACAGGGTCGCGGCTGGCCGTCTGTACTTTGTATAGTCAGTTGAA-3’随机挑选的样品测序进行同源性分析，分析结果表明，相互间同源性为98.8%；与其他PTV相应序列的核苷酸同源性为91.6%～97.7%。将本试验获得的PTV部分5’-UTR基因序列与26株其他国家不同血清型的PTV相应区域序列进行进化分析，结果显示扩增的序列之间进化关系差异较大，处于不同的分支（图2-2）。17 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析21CHJX2/20174Porcineteschovirus2Vir480/87(AF296109)5Porcineteschovirus11Dresden(AF296096)Porcineteschovirus9Vir2899/84(AF296094)16Porcineteschovirus1Teschen-Bozen654(AF231767)369Porcineteschovirus1Teschen-Konratice(AF231768)33Porcineteschovirus5D18/01(GQ293233)Porcineteschovirus6Vir3634/85(AF296115)116Porcineteschovirus4Vir2500/99(AF296113)29Porcineteschovirus10Vir461/88(AF296119)93Porcineteschovirus10Vir460/88(AF296095)5Porcineteschovirus4Vir918-19/85(AF296111)16Porcineteschovirus2Vir6793/83(AF296108)72Porcineteschovirus4Vir3764/86(AF296112)Porcineteschovirus7F43(AF296092)45Porcineteschovirus8Fuyu/2009/2(KC757344)99Porcineteschovirus8HB-2010(JQ664746)55Porcineteschovirus8Jilin/2003/2(JN710381)CHJX1/201799CHJX3/201732CHJX4/201776Porcineteschovirus2Vir6711-12/83(AF296107)Porcineteschovirus2JF613(GU446660)51Porcineteschovirus5F26(AF296090)2338Porcineteschovirus6PS37(AF296091)Porcineteschovirus825-T-VII(AF296118)17Porcineteschovirus3O2b(AF296088)15Porcineteschovirus2T80(AF296087)15Porcineteschovirus621-SZ(AF296117)Porcineteschovirus1Talfan(AF231769)0.01“●”表示本试验测序毒株Indicatesthestrainssequencedinthisstudy图2-2PTV不同血清型及毒株5’-UTR部分基因序列进化树Fig.2-2Phylogenetictreebasedonthepartial5’-UTRgenenucleotidesequencesofPTVsindifferentserotypes.2.3.3江西不同地区商业猪群中PTV感染率检测结果对2016年9月-2018年2月从江西省规模化猪场采集的834份样品进行猪捷申病毒的核酸检测，由表图可知，在检测的834份样品中，有370份阳性，总阳性率为44.36%。检测结果还显示，PTV的感染率普遍较高，达36.59%～51.06%；其中九江地区阳性率最高，达51.06%；感染率最低为新余地区，为36.59%，其次为吉安和抚州地区（表2-1和图2-3）。18 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析表2-1江西不同地区商业猪群中PTV感染率Table2-1ThedetectableresultofPTVofsubmittedsamplesindifferentareaofJiangXiprovince地区样品总数阳性数阳性率（%）九江28214451.06抚州1325239.39吉安752938.67赣州1968141.33宜春431944.19南昌653046.15新余411536.59总计83437044.36图2-3江西不同地区商业猪群中PTV感染率Fig.2-3TheinfectionratesofPTVinsamplesfromdifferentareasofJiangxiprovince2.3.4江西各地区不同猪群中PTV感染率检测结果对2016年9月-2018年2月从江西省规模化猪场采集的834份样品进行猪捷申病毒的抗原检测，由表图可知，在检测的834份样品中，不同猪群猪捷申病毒感染率差异较大。不同猪群之间，PTV感染率从低到高依次为哺乳仔猪（22.34%）、公猪（30.43%）、怀孕母猪（35.61%）、哺乳母猪（38.89%）、后备母猪（40.63%）、保育猪（56.08%）、育肥猪（56.35%）。从趋势上看，PTV感染率从哺乳仔猪开始，随着年龄的增长，PTV的感染率呈上升趋势；至育肥猪开始达到顶峰，并PTV感染率呈现下降趋势（表2-2和图2-4）。19 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析表2-2江西各地区不同猪群中PTV感染率Table2-2ThedetectionratesofPTVfromdifferentgrowthstagesofpigsinJiangxiprovince猪群样品数阳性数阳性率（%）公猪23730.43后备母猪963940.63怀孕母猪1324735.61哺乳母猪1084238.89哺乳仔猪942122.34保育猪25514356.08育肥猪1267156.35总计83437044.36图2-4江西各地区不同猪群中PTV感染率Fig.2-4ThedetectionratesofPTVfromdifferentgrowthstagesofpigsinJiangxiprovince2.3.5江西各地区商业猪群中不同季节PTV感染率检测结果对2016年9月-2018年2月从江西省规模化猪场采集的834份样品进行猪捷申病毒的核酸检测，按不同月份分析，由表图可知，在检测的834份样品中，各月份之间，猪捷申病毒的感染率有细微的波动。从总体调查情况来看，冬季和初春猪群中感染PTV的比例有所上升，最高为50.6%；夏季相对较低，最低为20%。从年份上看，猪群中PTV的感染率有略微上升，上升趋势不是特别明显（表2-3和图2-5）。20 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析表2-3不同月份PTV感染率Table2-3ThedetectionratesofPTVindifferentseasons月份样品数阳性数阳性率（%）2016.0915320.002016.1023730.432016.11702332.862016.121024948.042017.01833643.372017.02914549.452017.03441738.642017.04391948.722017.05301136.672017.0612541.672017.07000.002017.08000.002017.0918738.892017.10291344.832017.11432148.842017.121688550.602018.01512243.142018.0216743.75总计83437044.36图2-5江西各地区商业猪群中不同季节PTV感染率Fig.2-5ThedetectionratesofPTVindifferentseasons2.3.6江西各地区猪群中PTV感染率与其他腹泻病毒的感染情况检测结果对2016年9月-2018年2月从江西省规模化猪场采集的537份猪肠道及粪便样品进行猪捷申病毒抗原的RT-PCR检测，提取的总RNA，利用随机引物进行反转录成cDNA，再参照文献中的引物，检测其他的腹泻病毒。检测结果显示，PTV单独感染21 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析率为19.92%，与PEDV混合感染率为43.61%，与PDCoV混合感染率为20.30%，与TGEV混合感染率为1.13%，与PEDV、PDCoV三种病毒混合感染率为15.04%。检测样品中，均未检出PEAV（表2-4和图2-6）。表2-4PTV与其他腹泻病毒的混合感染Table2-4Theco-infectionratesofPTVandotherdiarrhealvirusesinsamples混合感染样品数阳性数阳性率（%）PTV+PEDV26611643.61PTV+PDCoV2665420.30PTV+PEDV+PDCoV2664015.04PTV+TGEV26631.13PTV2665319.92图2-6江西各地区猪群中PTV感染率与其他腹泻病毒的感染情况Fig.2-6Theco-infectionratesofPTVandotherdiarrhealvirusesinsamples2.3.7猪脑脊髓灰质炎临床症状与病理解剖变化本病自1929年Trefny氏最先发现于原捷克斯洛伐克的捷申地区以来，一直是困扰一些地区猪场的一个问题。猪捷申病毒力最强的PTV-1型感染后引起猪脑脊髓灰质炎，其发病率约为50%，而致死率为70%-90%，较轻型的发病率接近6%。2017年5月我省一大型法氏纯种猪场发生了这种以猪脑脊髓灰质炎为特征的捷申病，发病猪只见于50d以上的保育猪，第一天有发热，之后体温正常。病猪先后肢无力，走路身躯摇晃，后不能站立，瘫卧于地（图2-7）。取5头病死猪剖检脑组织病料进行PCR检测，有3头显示PTV为阳性，而HP-PRRSV和PRV全为阴性，对检出的PTV进行测序，证实为猪捷申病毒。剖检肉眼可见脑膜有充血，大脑实质有出血。22 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析A：后躯瘫痪B：脑回凹陷血管充血图2-7猪脑脊髓灰质炎猪症状及病变Fig.2-7Clinicalsignsofpiglets2.3.8大脑病理组织学HE染色观察结果大脑切片H.E染色主要表现为血管周围有一些淋巴细胞、浆细胞和胶质细胞浸润形成薄层“管套”，这种管套形成反应不如其他可致非化脓性脑炎的猪病（如高致病性蓝耳病）强烈。神经细胞变性、坏死和崩解，这一病变又比高致病性蓝耳病所形成的要更严重。初步认为，以上两点可供本病与高致病性蓝耳病在病理组织学上来鉴别，因为高致病性蓝耳病也可引起猪发生后躯瘫痪。神经胶质细胞增生，有的聚集于变性神经细胞周围，构成“卫星现象”；有的进入变性和坏死神经细胞内，构成噬神经现象。以上变化综合起来形成典型非化脓性脑炎病理组织学变化（图2-8）。A:大脑小血管周围薄层“管套”形成（箭头所示，40×）B:“卫星”现象和噬神经元现象（100×）A.Cervicalspinalcord,greymatter:presenceofaglialnodule.(40×)B:Haematoxylinandeosinstain.(100×)图2-8PTV感染的脑组织病理损伤Fig.2-8HistologicallesionsofBrainscausedbyPTVinfection2.4讨论猪捷申病又名猪传染性脑脊髓炎、猪脑髓灰质炎、猪塔尔凡病。本病是由猪捷申病毒引起的一种接触传染病，以损害中枢神经系统从而引起共济失调，肢体麻痹和肌23 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析肉抽搐等相关联的神经症状为主要特征[4,46]。猪捷申病毒按大类可分为三个亚型：第一个亚型代表毒株为Bozen毒株和Konratice毒株，第二个亚型代表毒株为Tyrol毒株和Talfan毒株，第三个亚型代表毒株为Reporyje毒株。按血清型分类可划分为13个血清型，但是，血清型的划分与各毒株之间的毒力无关；比如Talfan毒株属于第二亚型，但其只能引起轻症疾病，而Tyrol毒株毒力却非常强，经常引起猪群爆发严重的疾病，并可引起较高的死亡率[43]。目前，常用的检测病原的方法有免疫电镜、间接ELISA、胶体金技术、PCR/RT-PCR技术等。其中间接ELISA技术和PCR/RT-PCR技术是目前实验室用的最广泛的检测病原的技术；基于间接ELISA技术需要特定抗体，对操作环境的温度有一定要求，不适合一些新发及致病力较弱病原的研究。而PCR/RT-PCR技术发展至今已经30年历史，技术日趋成熟，已成为分子生物学研究的一项重要的技术，其优点在于拥有成本低、特异性强、敏感性高，可简单、快速的检测出样品中是否有该病原的存在，致使这项技术在病原检测应用最为广泛。本试验应用一对PTV的特异性引物，对临床上834份样品进行RT-PCR检测，检测结果可知猪捷申病毒在猪群中的感染非常普遍，猪捷申病毒在猪群中的感染率高达44.36%。在保育猪和育肥猪群中的感染率相对较高，分别为56.08%和56.38%，哺乳仔猪的感染率最低，为22.34%，其原因可能是由于在生长过程中，保育猪和育肥猪的生长环境相对开放，有更多的几率接触到PTV病毒；而哺乳仔猪由于母猪感染后，母猪乳汁中存在PTV抗体，可中和PTV病毒，而使仔猪的感染率较低；并且猪场对于母猪的保健措施相对较好，也是致使母猪的PTV感染相对育肥猪偏低的原因。从一年中各个月份上看，温度较低且温差变化较大的冬末初春，PTV的感染率会相对偏高，推测原因可能是温度较低的季节，猪舍的通风条件不佳，容易造成猪舍氨气和粉尘含量过高，损害猪群的呼吸系统，继发其他的一些疾病，从而引起免疫力低下，使PTV获得流行的机会。猪捷申病毒广泛存在于猪群中，但大多数的血清型是不会或者只会引起轻微的疾病症状。在肠道中的PTV病毒极少可单独引起猪群发生腹泻，一般均是几种腹泻相关病毒综合才引起腹泻的。为了调查研究猪捷申病毒与当前几种主流的腹泻病毒的协同感染情况，本试验对临床上537份小肠及粪便样品进行调查，结果表明猪捷申病毒单独感染猪群的感染率相对较低，为19.92%，与PEDV的混合感染率最高，为43.61%，其次为与PDCoV的混合感染率。研究表明，PTV虽然是引起猪群发生腹泻的一个次要原因，但要预防猪群发生腹泻，提高猪群中腹泻猪群的存活率和饲料报酬率，控制PTV病毒在腹泻猪群中的流行仍具有重要的研究意义。24 第三章猪捷申病毒CH/JX/JJ株和CH/JX/JA株基因组全长测序与序列分析第三章猪捷申病毒CH/JX/JJ株和CH/JX/JA株基因组全长测序与序列分析猪捷申病毒(PTV)属于小核糖核酸病毒科捷申病毒属的一种无包膜、单股正单链RNA病毒。PTV有13种已知的血清型，各血清型之间的毒力差异也较大，且猪群可以同时感染一种甚至多种PTV血清型，所以健康猪群也广泛存在猪捷申病毒感染。其中，PTV-1型毒性最强，可引发严重的脑脊髓炎。而PTV-2型、PTV-3型、PTV-5型，可引起较弱的脑脊髓灰质炎，与“塔尔凡病”(又称良性地方性轻瘫)有关，是脑脊髓灰质炎的一种温和表现。猪捷申病毒所引起的脑脊髓炎，早期猪只出现体温升高、精神萎靡、食欲减退、共济失调，后期出现不同程度的神经麻痹，与其感染的PTV的毒力相关，感染后大约3-4天死亡，急性的在24小时内就可引起猪只死亡。流产以及死胎，木乃伊胎等母猪的繁殖障碍性疾病，均已被证实与PTV其他血清型感染相关。猪捷申病毒基因组全长大小约为7.2knt，基因组排列顺序为：5′UTR-L-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3′UTR。整5′末端和3′末端都有一段非翻译区（untranslatdregion,UTR），5′UTR长度远大于3′UTR；其中5′UTR含PolyC结构，具有一个分子量较小的基因连接蛋白VPg，而3′UTR含Poly(A)结构。整个基因组含有一个大的开放阅读框，经蛋白酶切割加工后形成P1、P2和P3种多肽前体，其中P1为衣壳蛋白的前体，经过加工成熟后为PTV的衣壳蛋白；P2和P3均为非结构蛋白的前体，成熟后形成一些中间前体产物，这些产物都非常稳定，参与病毒复制的各项生命活动。不同血清型毒株之间基因组在遗传进化上存在较大差异，可在据此分成不同的进化分支。研究基因组信息将有助于了解本地区流行于猪群中的PTV毒株信息，为该病毒的致病机理、药物和疫苗研制以及防控方法的创制提供试验依据。3.1试验材料和方法3.1.1样品采集随机挑选一份猪脑脊髓灰质炎、一份猪腹泻粪便猪捷申病毒阳性样品，做全基因组测序。25 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析3.1.2主要生化试剂PhantaMaxSuper-FidelityDNA南京诺唯赞生物科技有限公司Polymerase(1U/μl)GoScript逆转录酶普洛麦格（北京）生物技术有限公司5×GoScriptbuffer普洛麦格（北京）生物技术有限公司MgCl2(25mM)普洛麦格（北京）生物技术有限公司RnaseInhibitor(40U/μl)普洛麦格（北京）生物技术有限公司dNTPMix(10mMeach)普洛麦格（北京）生物技术有限公司2×PhantaMaxBuffer南京诺唯赞生物科技有限公司dNTPMix(10mMeach)南京诺唯赞生物科技有限公司10×Loadingbuffer南京诺唯赞生物科技有限公司DL2000DNAmarker宝日医生物技术(北京)有限公司Trans1-T1PhageResistantChemically北京全式金生物技术有限公司CompetentCellpEASY-BluntZeroCloningKit北京全式金生物技术有限公司TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNA宝日医生物技术(北京)有限公司ExtractionKitVer.5.0氨苄青霉素钠北京索莱宝科技有限公司胰蛋白胨（OXOID）、酵母粉（OXOID）北京索莱宝科技有限公司PremixTaq(TaKaRaTaqVersion2.0宝日医生物技术(北京)有限公司plusdye)SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒上海生工生物工程有限公司3.1.3主要仪器徕卡自动染色机德国徕卡显微系统股份公司徕卡自动包埋机德国徕卡显微系统股份公司徕卡切片机德国徕卡显微系统股份公司显微镜日本尼康公司超净工作台美国LABCOBCO公司其他仪器参见第二章。3.1.4试剂配制（1）1%琼脂糖凝胶：称量2g琼脂糖于500mL锥形瓶中，量筒量取200mL1XTAE溶液于锥形瓶，微波炉大火加热5-8min至完全沸腾，加入5μlEB混匀，常温保存备用。26 第三章猪捷申病毒CH/JX/JJ株和CH/JX/JA株基因组全长测序与序列分析（2）PBS（PH=7.2-7.6）的配制：称取11.65gNa2HPO4，1.65gKH2PO4，9gNaCl溶于1000ml去离子水，溶解后用加入100μL0.1M氢氧化钠调PH值到7.4。（3）4%多聚甲醛的配制：普通电子天平称取2g多聚甲醛于锥形瓶中，加入500mlPBS溶液（PH=7.2-7.6）置于磁力搅拌器上加热搅拌溶解，温度调至60℃，转速为300rpm，并滴加适量的氢氧化钠加速溶解。溶解完全后，分装至塑料瓶中常温保存备用。3.2方法3.2.1引物设计选择PTV保守序列区域设计PTV全长引物，参照文献[57]，引物序列如下，并送至上海生工生物工程有限公司合成（表3-1）。表3-1PTV全基因组扩增引物Table3-1PrimersforamplificationofthecompletegenomeofPTVstrains引物名称序列（5'-3'）位置目的片段（bp）P1-FAGRGTACAGAAGAGCAAG144–1611624P1-RTGCACRTAATCARAAAATTCWCCWGGCA1767–1794P2-FATACCCAARNTWGAYATTGATGC1661–16831852P2-RGGRTCWGTYTTNGCAAATTTCTT3512–3534P3-FTGGAAATCHCTTCATGAYCCHATGAC3413–34381555P3-RCCTTTDGGYCCTTGCATCTCAAC4967–4989P4-FAAACARCAAGCYGTCACAATWATTGA4231–42561804P4-RTTCCACARGTCAGTCCGGCGCAAGCCYTTCTT6034–6057P5-FTGGGGCATHCGWTGGGCCTCATA5789–58111300P5-RTTTTGCTCAACTAAAACTACT7088–71083.2.2病毒核酸的提取病毒RNA提取使用宝日医生物技术(北京)有限公司的TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0提取，具体步骤如下：1）采集猪脑、肺及粪便于1.5mLEP管，按1﹕2体积加入生理盐水后剪碎，反复冻融3次（每次冻融后的样品需涡旋混匀15s），8000rpm4℃离心5min（以下离心均在4℃）；2）将SpinColumn安置于CollectionTube上，溶液移至SpinColumn中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。3）将500μl的BufferRWA加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。4）将700μl的BufferRWB加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。27 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析注）请确认BufferRWB中已经加入了指定体积的100%乙醇。请沿SpinColumn管壁四周加入BufferRWB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。5）重复操作步骤4。6）将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心2分钟。7）将SpinColumn安置于新的1.5mlRNasefreecollectiontube上，在SpinColumn膜的中央处加入30～50μl的RNasefreedH2O，室温静置5分钟。（注）洗脱制备膜上的RNA时，请使用RNasefreedH2O。8）12,000rpm离心2分钟洗脱DNA/RNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到SpinColumn膜的中央或再加入30μl的RNasefreedH2O，室温静置5分钟后，12,000rpm离心2分钟洗脱DNA/RNA。3.2.3反转录吸取提取的总RNA2.5μL，随机引物1μL，再分别：1号转录产物，加入0.5μLP2-A-R和0.5μLP2-B-R；2号转录产物，加入0.5μLP3-A-R和0.5μLP3-B-R；3号转录产物，加入1μLP4-R；4号转录产物，加入0.5μLP5-R和0.5μLolig(dt)。枪头轻轻混匀后，置于PCR仪上，70℃5分钟，后立即置于冰上冷却3～5分钟。按如下配比混好反应mix。5×GoScriptbuffer4μLdNTPMixture（10mmol·L-1）1μLRibonucleaseInhibitor（40U·μL-1）0.5μLGoScript逆转录酶1μLMg2+（25mmol·L-1）2μLddH2O7μL冷却的各个样品再加入15.5ulmix，轻轻搅匀。42℃50min，94℃5min；反应产物-20℃保存备用。3.2.4聚合酶链式反应猪捷申病毒全基因组扩增，按照如下方式，以反转录产物的进行PCR。以反转录产物为模板，分别以引物P1-F/P1-R、P2-F/P1-R、P3-F/P1-R、P4-F/P4-R、P5-F/P5-R进行PCR扩增。PCR体系如下：2×PhantaMaxBuffer2.5μLdNTPMixture（10mmol·L-1）1μL上游引物（10μmol·L-1）1μL下游引物（10μmol·L-1）1μLPhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase(1U/μl)0.25μL28 第三章猪捷申病毒CH/JX/JJ株和CH/JX/JA株基因组全长测序与序列分析cDNA模板2.5μLddH2O至25μL反应程序：94℃预变性3min；94℃变性15s，51℃退火15s，72℃延伸2min，35个循环；最后，72℃延伸5min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳并观察结果。3.2.5全长扩增片段的回收和纯化使用Promega胶回收试剂盒回收各预期大小片段条带，步骤如下：①通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5ml离心管中，称重。②根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖（如胶块不足100mg则用水补充至100mg）加300-600µl的比例加入BufferB2。③将离心管置于50℃水浴5-10min，间或混匀，直至胶块完全溶化。④（可选步骤）当目的片段小于500bp时，加入所使用的BufferB2体积1/3的异丙醇，混匀。当目的片段大于500bp时，此步骤可以省略，直接进行步骤5。⑤将溶化好的溶液全部移入吸附柱，10,000rpm离心30sec。倒掉收集管。中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。⑥向吸附柱中加入300μlBufferB2，10,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。⑦向吸附柱中加入500μlWashSolution，10,000rpm离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。⑧重复步骤7一次。⑨将空吸附柱和收集管放入离心机，10,000rpm离心2min。⑩在吸附膜中央加入30μlElutionBuffer1-2min，10,000rpm离心2min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。3.2.6目的片段的连接目的片段与pEASY-BluntZero载体连接，连接体系如下：pEASY-BluntZero（10ng/μL）1μL胶回收产物0.5-4μL（最佳摩尔比例载体：目的片段=1:7）ddH2O补齐至5μL轻轻用枪头混匀，置于25℃连接15-20min。3.2.7连接产物的转化①从-80℃超低温冰箱中取出Trans1-T1PhageResistantChemicallyCompetentCell感受态细胞，置于冰水中溶解；取25μl感受态细胞于无菌的1.5mlEP管中，再加入2.5μl连接产物，轻弹混匀；置于冰水中冰浴25-30min；并打开水浴锅，温度29 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析调至42℃。②将含感受态和连接产物的EP管快速、轻轻置于42℃水浴锅中热应激30s;并快速轻轻取出置于冰水中冰浴2min。③向离心管中加入500μl经高压灭菌的LB培养液，37℃200rpm振荡培养60min，并把LB平板（+Amp）置于37℃恒温培养箱中回温、烘干。④重组菌液1500rpm离心1min，弃350μl上清，用200μl枪头重悬菌体，取100μl菌液多点滴于LB平板（+Amp），用4mm高压灭菌的玻璃珠左右上下摇晃将菌液均匀涂布。保鲜膜包好置于37℃恒温培养箱正置培养10-20min，后倒置培养12-14h。3.2.8重组菌液的鉴定①从LB平板（+Amp）上随机挑取5个菌落于1.5mLEP管中500μlLB液体培养基中。②37℃200rpm振荡培养4小时至培养液出现云雾状浑浊。③以菌液为模板，上游引物M13F:CAGGAAACAGCTATGACC；下游引物M13R:TGTAAAACGACGGCCAGT进行PCR扩增。PCR体系：PremixTaq(TaKaRaTaqVersion2.0plusdye)12.5μL上游引物M13F（10μmol·L-1）1μL下游引物M13R（10μmol·L-1）1μL重组菌液2.5μLddH2O至25μL反应程序：94℃预变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，36个循环；最后，72℃延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果。菌液PCR鉴定后各挑选三个阳性克隆菌液送北京擎科新业生物技术有限公司测序。3.2.9不同血清型毒株5'UTR序列比对分析用在线BLAST比对软件（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），将测序获得的序列与NCBIGenBank数据库序列进行比对，以确定所扩增的序列是否为PTV。并且，利用MEGA6.0软件比对分析，构建构建本试验获得的代表性PTV5'-UTR部分序列与其他不同国家地区及PTV不同血清型之间的进化树，分析本试验得到的序列与与其他不同国家地区及PTV不同血清型之间的进化关系。3.2.10核苷酸同源性比对及序列拼接用在线BLAST比对软件进行比对，将测序获得的各基因组片段序列用DNAStarLasergene7.10软件包中的SeqMan进行拼接。从NCBIGenBank数据库中选择代表性的不同血清型的PTV毒株序列，应用MEGA6.05和DNAStarLasergene软件包的MegAlign进行全基因组核苷酸序列相似性和遗传进化树分析。30 第三章猪捷申病毒CH/JX/JJ株和CH/JX/JA株基因组全长测序与序列分析3.3结果与分析3.3.1PTV江西株全基因组扩增与测序选择了一份猪脑脊髓灰质炎、一份猪腹泻粪便猪捷申病毒阳性样品分别进行全基因组扩增，经RT-PCR、5顶头设计引物及锚定PCR技术扩增获得了7条目的片段，片段大小与预期一致（图3-1）。PCR产物经纯化、T-A克隆及鉴定后进行测序。图3-1PTV江西株全基因组扩增电泳图Fig.3-1TheelectropherogramofampliconsofPCRforthefull-lengthgenomeofPTVsequenceofJiangxistrains3.3.2PTV江西株全基因组序列分析应用DNAStarLasergene软件包中的SeqMan将获得的7个片段及5'/3'UTR序列进行组装，获得了2条完整的PTV全基因组序列，分别命名为CH/JX/JJ和CH/JX/JA。除了polyA尾序列，CH/JX/JJ和CH/JX/JA基因组全长分别为7,107nt和7,098nt。用DNAStarLasergene软件包中的MegAlign和MEGA6.05将2株江西株与PTV参考株进行全基因组核苷酸序列相似性和遗传进化树分析（图3-2）。结果表明，2株江西株之间的核苷酸同源性高达81.9%，与24株参考株之间的同源性为80.5%～91.4%。与参考株相比，CH/JX/JJ和CH/JX/JA存在不同程度的变异，基因组的保守性较低，各参考株之间也存在不同程度的变异，变异位置各有差别。应用MEGA软件的邻近法（Neighbor-Joining,NJ）算法将2株江西株与24株PEDV参考株共同构建遗传进化树。结果表明，在核苷酸水平24株PEDV全基因组序列可分为2个大的分支，血清1型、血清3型、血清5型、血清9型、血清10型和血清11型为一个大的分支；其他的血清型为一个大的分支。按进化树分析结果可知，CH/JX/JJ与AF296112亲缘关系最近，属于血清4型；CH/JX/JA与AF231769亲缘关系最近，属于血清1型（图3-3）。31 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析100Porcineteschovirus2Vir6793/83(AF296108)93Porcineteschovirus2Vir480/87(AF296109)77Porcineteschovirus2Vir6711-12/83(AF296107)23Porcineteschovirus2JF613(GU446660)Porcineteschovirus2T80(AF296087)6998Porcineteschovirus7F43(AF296092)Porcineteschovirus825-T-VII(AF296118)Porcineteschovirus8HB-2010(JQ664746)64100100Porcineteschovirus8Jilin/2003/2(JN710381)99Porcineteschovirus8Fuyu/2009/2(KC757344)Porcineteschovirus6Vir3634/85(AF296115)100Porcineteschovirus621-SZ(AF296117)CH/JXJJ/2017Porcineteschovirus4Vir3764/86(AF296112)75100Porcineteschovirus4Vir918-19/85(AF296111)89Porcineteschovirus4Vir2500/99(AF296113)Porcineteschovirus9Vir2899/84(AF296094)Porcineteschovirus5D18/01(GQ293233)79100Porcineteschovirus10Vir461/88(AF296119)68Porcineteschovirus10Vir460/88(AF296095)100CHJXJA/20179956Porcineteschovirus1Talfan(AF231769)Porcineteschovirus3O2b(AF296088)99Porcineteschovirus11Dresden(AF296096)70Porcineteschovirus1Teschen-Bozen654(AF231767)100Porcineteschovirus1Teschen-Konratice(AF231768)0.02Thetreeswereconstructedbythedistance-basedneighbor-joiningalgorithmusingMEGA6.05software.Bootstrapwassetin1,000replicateswithavalue>70%toassessthesignificanceofthetreetopology.Abarof0.002/0.005indicatesnucleotideoraminoacidsubstitutionspersite.“▲”indicatesthestrainsidentifiedinthisstudy.图3-2PTV江西株与参考株全基因组核苷酸进化树Fig3-2PhylogenetictreebasedonntsequenceofthecompletegenomesequenceofPTVstrains32 第三章猪捷申病毒CH/JX/JJ株和CH/JX/JA株基因组全长测序与序列分析图3-3PTV全基因核苷酸同源性分析Fig.3-3AnalysisofPTVcompletegenomenucleotidehomology3.4讨论本研究测定了2株江西PTV毒株（CH/JX/JJ和CH/JX/JA）的全基因组序列，并系统地分析了江西株与PTV不同血清型的分子特征和遗传进化关系。除去polyA尾，CH/JX/JJ和CH/JX/JA全基因组序列均为7,104nt（不含polyA），与其他PTV毒株基因组结构一致，基因组5′端和3′各有一段非翻译区，分别是5′-UTR和3′-UTR。ORF编码聚合蛋白，多聚蛋白可裂解为结构蛋白及非结构蛋白。结构蛋白包括VP1、VP2、VP3和VP4，非结构蛋白包括2A、2B、2C及3A、3B、3C和3D，且在5′-UTR和VP4基因之间存在一个前导序列L。从5'到3'依次为5′UTR-L-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3′UTR。将江西株与其他24株参考序列。分析可知，2株江西株属于不同分支，CH/JX/JJ属于血清4型，CH/JX/JA属于血清1型。猪捷申病毒的衣壳由VP4、VP2、VP3、VP1四种结构蛋白结构蛋白，分别由74、279、242和262个氨基酸组成。不同的捷申病毒毒株，VP1蛋白的氨基酸数可能不同。Sun等人认为，PTVVP1基因的平均进化速率为每个位点每年2.46×103个替换，高于目前研究中获得的多聚蛋白基因；然而，较长的基因序列被认为比用于估计PTV的核苷酸取代率的短区域更好[43,56]。遗传多样性的程度和RNA病毒准种的适应性代表了正向或负向选择与随机遗传漂移之间的平衡[77]。最近的一项研究表明，重组也在小核糖核酸病毒和其他哺乳动物正链RNA病毒的遗传多样性中发挥重要作用[78]。事实上，在小核糖核酸病毒中已经广泛地观察到重组事件[79]，并且近期报道的PTV重组都来源于不同血清型之间的重组[54]。Kaku等人利于软件对PTV衣壳结构进行预测，结果显示病毒的VP1C末端突起结构、VP1GH2环及VP2突起结构为病毒的主要抗原决定簇，能诱导产生中和抗体[13]。对于猪捷申病毒的氨基酸替换，特别是对于衣壳蛋白和RNA聚合酶基因中的变异，可能影响PTV的复制、抗33 江西省猪捷申病毒的分子流行病学调查及全基因组序列分析原表位和毒力，然而，这些病毒蛋白质变化的生物学意义还需要进一步研究。总的来说，目前的结果表明PTV进化史的重组事件，只有少数的重组病毒可以在世界范围内流行。总之，猪捷申病毒表现出高度的遗传多样性，对GenBank中所有的PTV序列进行遗传分析，结果揭示病毒的重组在病毒进化中起重要作用。然而，这种潜在病原体的致病性和临床影响尚未被研究。所以，对猪群中的不同毒株和具有不同变异特征的PTV毒株进行分离培养，并对其进行复制、抗原表位和毒力等一系列病毒特征进行研究，对于研究PTV具有重要意义，可进一步为临床预防和治疗PTV打下坚实基础。34 全文小结全文小结1、本研究完成了江西省猪群猪捷申病毒的分子流行病学调查，调查结果表明，江西省不同日龄、不同地区和不同季节猪群中均普遍存猪捷申病毒感染。2、本研究流行病学调查结果表明江西省猪群中不但普遍存在猪捷申病毒感染，而且该病毒还常与其它病毒共同感染猪仔。3、本研究完成了两株猪捷申病毒江西株全基因组扩增和测序，系统地分析了江西株与PTV不同血清型的分子特征和遗传进化关系。序列分析表明两株江西毒株的核苷酸和氨基酸同源性以及其与其它参考株之间的同源性不高，进化关系较远。35 参考文献参考文献[1].Villanova,F.,etal.,Analysisoffull-lengthgenomesofporcineteschovirus(PTV)andtheeffectofpurifyingselectiononphylogenetictrees.ArchVirol,2016.161(5):p.1199-208.[2].Feng,L.,etal.,Isolationandmolecularcharacterizationofaporcineteschovirus1isolatefromChina.ActaVirol,2007.51(1):p.7-11.[3].Chiu,S.C.,etal.,Theroleofporcineteschovirusincausingdiseasesinendemicallyinfectedpigs.VetMicrobiol,2012.161(1-2):p.88-95.[4].Possatti,F.,etal.,Virusesassociatedwithcongenitaltremorandhighlethalityinpiglets.TransboundEmergDis,2018.65(2):p.331-337.[5].申识川,猪捷申病毒Swine/CH/IMH/033'末端序列的克隆和VP1蛋白的表达及其免疫原性研究,2009,东北农业大学.第54页.[6].Cano-Gomez,C.,etal.,TeschovirusesandsapelovirusesinfaecalsamplesfromwildboarinSpain.VetMicrobiol,2013.165(1-2):p.115-22.[7].Cano-Gomez,C.andM.A.Jimenez-Clavero,CompleteCodingGenomeSequenceofaPutativeNovelTeschovirusSerotype12Strain.GenomeAnnounc,2016.4(2).[8].Cano-Gomez,C.,etal.,Evaluationofafluorogenicreal-timereversetranscription-polymerasechainreactionmethodforthespecificdetectionofallknownserotypesofporcineteschoviruses.JVirolMethods,2011.176(1-2):p.131-4.[9].申识川等,猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03株VP1蛋白的原核表达及其反应原性.中国兽医科学,2009(10):第847-851页.[10].张峰等,小RNA病毒致病机理的研究.安徽农业科学,2013(23):第9541-9543页.[11].Jones,T.H.andV.Muehlhauser,SurvivalofPorcineteschovirusasasurrogatevirusonporkchopsduringstorageat2°C.InternationalJournalofFoodMicrobiology,2015.194(194):p.21-24.[12].Kaku,Y.,etal.,Antigenicpropertiesofporcineteschovirus1(PTV-1)TalfanstrainandmolecularstrategyforserotypingofPTVs.ArchVirol,2007.152(5):p.929-40.[13].Yamada,M.,etal.,Experimentalteschovirusencephalomyelitisingnotobioticpigs.JCompPathol,2014.150(2-3):p.276-86.[14].王瑶,猪捷申病毒的分离鉴定及血清学初步调查,2010,黑龙江八一农垦大学.第44页.[15].刘光清,Vpg在单股正链RNA病毒生命活动中的作用.中国动物传染病学报,2013(04):第61-66页.[16].单兴娜等,猪札幌病毒VPg基因的原核表达及免疫原性研究.中国畜牧兽医,2015(04):第816-822页.[17].Ryu,W.S.,MolecularVirologyofHumanPathogenicViruses.2016.[18].Armando,A.,etal.,DeletionMutantsofVPgRevealNewCytopathologyDeterminantsinaPicornavirus.PlosOne,2010.5(5):p.e10735.[19].卢杰等,RNA病毒翻译调控元件——内部核糖体进入位点(IRES).中国生物化学与分子生物学报,2007(07):第513-518页.36 参考文献[20].舒波,病毒RdRP的转位和底物选择的结构基础,2017,中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所).第107页.[21].李公启,张晓杰与韩俊,小RNA病毒对宿主细胞蛋白翻译的影响.疾病预防控制通报,2013(04):第84-87+90页.[22].高荣远等,脑心肌炎病毒IRES置换不影响口蹄疫病毒的复制和毒力.中国预防兽医学报,2015(11):第834-837页.[23].梁瑞英等,小RNA病毒3′非编码区结构与功能的研究进展.病毒学报,2014(04):第463-469页.[24].哲名家等,单股正链RNA病毒基因组非编码区结构与功能研究进展.中国动物传染病学报,2012(04):第79-86页.[25].胡峰等,猪捷申病毒8型rVP1-ELISA检测方法的建立.中国兽医科学,2012(03):第258-263页.[26].申识川等,猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03株VP1蛋白的原核表达及其反应原性.中国兽医科学,2009(10):第847-851页.[27].郭容利等,猪捷申病毒的分离鉴定及其VP1基因的序列分析.中国兽医杂志,2017(03):第43-46页.[28].胡峰,猪捷申病毒8型VP1基因重组腺病毒的构建与免疫原性分析,2012,黑龙江八一农垦大学.第47页.[29].Kuzmich,A.I.,etal.,[Quantitativecomparisonofexpressionforgeneslinkedinbicistronicvectorsviairesor2A-peptideofporcineteschovirus-1sequence].BioorgKhim,2013.39(4):p.454-65.[30].唐晓思,程安春与汪铭书,小RNA病毒2C基因及其编码蛋白的研究进展.中国人兽共患病学报,2017(11):第1024-1028页.[31].张盛勇,程安春与汪铭书,小RNA病毒3A基因及其编码蛋白研究进展.中国人兽共患病学报,2016(02):第177-181页.[32].王宏,谢广成与段招军,小RNA病毒3C蛋白酶研究进展.病毒学报,2014(05):第579-586页.[33].吴波平等,猪捷申病毒3D蛋白的原核高效表达及其反应活性.中国兽医科学,2007(02):第131-134页.[34].吴波平,猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03全长cDNA克隆的构建及其3D蛋白的表达,2007,东北农业大学.第71页.[35].周珊,程安春与汪铭书,自噬在小RNA病毒感染中的作用.中国细胞生物学学报,2017(12):第1619-1625页.[36].Zell,R.,etal.,Linkagemapofprotein-proteininteractionsofPorcineteschovirus.JGenVirol,2005.86(Pt10):p.2763-8.[37].魏衍全等,参与小RNA病毒感染和复制的宿主及病毒蛋白功能研究进展.中国人兽共患病学报,2013(01):第82-85+90页.[38].赵国洪等,云南猪群中猪捷申病毒感染分子生物学诊断.养猪,2017(02):第113-115页.[39].Yamada,M.,etal.,Immunohistochemicaldistributionofviralantigensinpigsnaturallyinfectedwithporcineteschovirus.JournalofVeterinaryMedicalScience,2008.70(3):p.305-308.[40].于新友等,猪捷申病毒SD株的分离与鉴定.广东畜牧兽医科技,2015(06):第36-38页.[41].Lin,W.,S.CuiandR.Zell,Phylogenyandevolutionofporcineteschovirus8isolatedfrompigsin37 参考文献Chinawithreproductivefailure.ArchVirol,2012.157(7):p.1387-91.[42].孟丽等,猪7种腹泻相关病毒的临床检测及猪嵴病毒的遗传进化分析.生物工程学报,2017(08):第1292-1303页.[43].Cano-Gómez,C.,etal.,AnalyzingthegeneticdiversityofteschovirusesinSpanishpigpopulationsusingcompleteVP1sequences.InfectionGenetics&EvolutionJournalofMolecularEpidemiology&EvolutionaryGeneticsinInfectiousDiseases,2011.11(8):p.2144.[44].Trefny,L.,MassiveillnessofswineinTeschenarea.1930.[45].Salles,M.W.,etal.,PorcineteschoviruspolioencephalomyelitisinwesternCanada.JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigationOfficialPublicationoftheAmericanAssociationofVeterinaryLaboratoryDiagnosticiansInc,2011.23(2):p.367.[46].Takahashi,M.,etal.,Apigletwithconcurrentpolioencephalomyelitisduetoporcineteschovirusandpostweaningmultisystemicwastingsyndrome.JournalofVeterinaryMedicalScience,2008.70(5):p.497-500.[47].Deng,M.Y.,etal.,DiagnosisofPorcineteschovirusencephalomyelitisintheRepublicofHaiti.JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigationOfficialPublicationoftheAmericanAssociationofVeterinaryLaboratoryDiagnosticiansInc,2012.24(4):p.671-678.[48].Prodelalova,J.,Thesurveyofporcineteschoviruses,sapelovirusesandenterovirusesBinfectingdomesticpigsandwildboarsintheCzechRepublicbetween2005and2011.InfectGenetEvol,2012.12(7):p.1447-51.[49].Donin,D.G.,etal.,FirstreportofPorcineteschovirus(PTV),Porcinesapelovirus(PSV)andEnterovirusG(EV-G)inpigherdsofBrazil.TropAnimHealthProd,2014.46(3):p.523-8.[50].Moutelikova,R.,etal.,EpidemiologicalsurveyofentericvirusesinwildboarsintheCzechRepublic:FirstevidenceofcloserelationshipbetweenwildboarandhumanrotavirusAstrains.VetMicrobiol,2016.193:p.28-35.[51].冯力等,猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03分离株细胞适应性和致病性研究.中国预防兽医学报,2012.34(7):第530-533页.[52].Zhang,C.F.,etal.,IsolationandcharacterizationofthefirstChinesestrainofporcineTeschovirus-8.JournalofVirologicalMethods,2010.167(2):p.208-213.[53].Qiu,Z.,etal.,TheprevalenceofporcineteschovirusinthepigpopulationinnortheastofChina.JVirolMethods,2013.193(1):p.209-14.[54].Wang,B.,etal.,Isolationofserotype2porcineteschovirusinChina:evidenceofnaturalrecombination.VetMicrobiol,2010.146(1-2):p.138-43.[55].Wang,M.J.,etal.,IsolationandIdentificationofPorcineTeschovirus.ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,2012.[56].Sun,H.,etal.,NewserotypesofporcineteschovirusidentifiedinShanghai,China.ArchVirol,2015.160(3):p.831-5.[57].Yang,T.,etal.,EpidemiologyandmolecularcharacterizationofPorcineteschovirusinHunan,China.TransboundEmergDis,2018.65(2):p.480-490.[58].Wang,L.,etal.,Thesurveyofporcineteschoviruses,porcinecircovirusandporcinetransmissible38 参考文献gastroenteritisvirusinfectingpigletsinclinicalspecimensinChina.TropAnimHealthProd,2013.45(5):p.1087-91.[59].刘杉杉等,猪捷申病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立及应用.中国预防兽医学报,2011(09):第704-708页.[60].Yamada,M.,etal.,Immunohistochemicaldetectionofporcineteschovirusantigenintheformalin-fixedparaffin-embeddedspecimensfrompigsexperimentallyinfectedwithporcineteschovirus.JVetMedAPhysiolPatholClinMed,2007.54(10):p.571-4.[61].李娟与冯力,猪捷申病毒的感染及防制.养猪,2006(04):第43-44页.[62].李广德,猪捷申病的流行、诊断与防治.现代畜牧科技,2016(03):第105页.[63].林慧,王丽与桑学波,猪捷申病的防控.畜牧兽医科技信息,2010(06):第71页.[64].王宇,刘芳萍与崔尚金,猪捷申病毒的诊断方法.畜牧兽医科技信息,2012(09):第81页.[65].孟丽,猪腹泻病原多重PCR检测方法的建立及主要病毒进化分析,2017,上海海洋大学.第68页.[66].朱丽娜,2007年江苏地区猪高热病病例中PCV2、PPV、PRV、PRRSV、CSFV、JEV、EMCV、PEV、PTV的检测和区分猪瘟野毒、疫苗毒荧光定量RT-PCR方法的尝试,2008,扬州大学.[67].黎少国等,一株猪捷申病毒全基因组序列测定及分析.广东畜牧兽医科技,2017(05):第35-37+44页.[68].冯力等,猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03分离株细胞适应性和致病性研究.中国预防兽医学报,2012.34(7):第530-533页.[69].庄金秋等,猪捷申病毒检测方法研究进展.动物医学进展,2013(07):第80-83页.[70].王美君等,一株猪捷申病毒的分离与鉴定.中国畜牧兽医,2012(06):第212-214页.[71].刘芹防等,检测猪捷申病毒抗体的间接免疫荧光方法的建立与初步应用.中国预防兽医学报,2011(01):第70-72页.[72].Zhang,C.,etal.,ThesurveyofporcineteschovirusesinfieldsamplesinChinawithauniversalrapidprobereal-timeRT-PCRassay.TropAnimHealthProd,2013.45(4):p.1057-61.[73].Wang,B.,etal.,Developmentofareversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationassayfordetectionofPorcineteschovirus.JVetDiagnInvest,2011.23(3):p.516-8.[74].王建峰等,猪捷申病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用.畜牧与兽医,2016(06):第126-129页.[75].USA,C.F.F.S.,Teschovirusencephalomyelitisandporcineteschovirusinfection.PhysicalReviewBCondensedMatter,2009.80(22):p.308-310.[76].Ge,F.F.,etal.,EpidemiologicalsurveyofporcineepidemicdiarrheavirusinswinefarmsinShanghai,China.ArchVirol,2013.158(11):p.2227-31.[77].Domingo,E.,etal.,PopulationdynamicsintheevolutionofRNAviruses.AdvancesinExperimentalMedicine&Biology,1998.440:p.721.[78].J,K.N.,Porcineentericpicornaviruses.DiseaseofSwine,2006.:p.337-345.[79].Oberste,M.S.,K.MaherandM.A.Pallansch,EvidenceforfrequentrecombinationwithinspecieshumanenterovirusBbasedoncompletegenomicsequencesofallthirty-sevenserotypes.JVirol,2004.78(2):p.855-67.39 致谢致谢感谢恩师唐玉新教授多年来对我生活上无微不至的关心和学业上的悉心指导。没有恩师的精心指导，支持，鼓励，我不可能完成这篇硕士论文，再次向恩师唐玉新教授表示衷心的感谢！感谢花象柏教授对我病理实验上的帮助；感谢、宋德平老师对我硕士研究生期间学习和实验方面的指导和帮助，以及对我硕士论文的撰写和修改所提供的帮助；感谢黄冬艳老师、叶昱老师、丁珍老师和吴琼老师对毕业论文相关事宜的定力帮助。感谢预防兽医学教研室的何后军教授、王萍教授、邓舜洲教授、邬向东副教授、张锦华副教授，张文波副教授、戴益民老师对我的帮助和教诲。感谢张帆帆博士和硕士生袁为锋对我实验和论文撰写上提供的大量支持和帮助，感谢李凯博士、李指全、毕箴、陈佳佳、郭楠楠、张敏、雷丹、龚旺、李昊、罗素贤对我实验的帮助，谢谢你们在我需要帮忙的时候挺身而出及生活上对我的关心。研究生的学习终于要结束了，感谢一路无怨无悔支持我的父母、老婆和孩子等家人，向帮助我的老师，同学和朋友表示感谢！再次向帮助和支持我的朋友，同学，亲人表示感谢！40
