河南省猪戊型肝炎病毒的分子检测和全基因组序列分析

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致谢本研究及学位论文是在导师张小霞副教授和梁振普博士的严格教诲和悉心指导下完成的。论文的选题、实验的开展、以及论文的撰写无不倾注着两位老师的心血和智慧。两位老师渊博的知识，严谨的治学态度，简朴的生活作风，对科学研究孜孜不倦的追求是我学习的楷模，深深的感染着我，激励着我加倍努力学习和工作。三年来，两位老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向恩师致以崇高的敬意和诚挚的感谢!在求学期间，得到了刘卫群教授、陈新建教授、王小纯教授等老师的指导和帮助，为我顺利完成学业提供了很大帮助，在此向他们送上我最诚挚的感谢和祝福。同时也十分感谢实验室祖向阳、程振云、乔冠华、张同勋、徐良、王丽薇、宋小风、邵新峰等师兄师姐或师弟师妹们。我还要感谢三年来朝夕相处的同学曹素梅、王菲、李高飞、陈晓慧等，与他们之间的友谊是我一生最宝贵的财富。感谢我的朋友高振兴、王根茂、原欢、赵旭等，在我三年求学生涯中，他们的鼓励和支持使我克服了许多困难并顺利完成了我的学业。借此机会，向我的父母表示最深情的谢意，焉得谖草，言树之背，养育之恩，无以回报，你们永远健康快乐是我最大的心愿! 目录摘要........................................................................................................................................11文献综述......................................................................................................................................21.1戊型肝炎和戊型肝炎病毒................................................................................................21.2HEV的基因组...................................................................................................................21.3HEV的基因型...................................................................................................................31.4HEV的传播途径...............................................................................................................41.5HEV的诊断手段...............................................................................................................41.5.1酶联免疫实验.........................................................................................................51.5.2RT-PCR检测...........................................................................................................51.6HEV的动物模型...............................................................................................................51.7HEV的细胞模型...............................................................................................................61.8HEV的疫苗研究...............................................................................................................61.8.1蛋白类疫苗.............................................................................................................61.8.2DNA疫苗................................................................................................................71.9我国HEV的流行情况......................................................................................................72引言..............................................................................................................................................93材料与方法..................................................................................................................................103.1试验样品、主要试剂、仪器以及引物..........................................................................103.1.1试验样品...............................................................................................................103.1.2主要试剂...............................................................................................................103.1.3主要仪器...............................................................................................................113.1.4引物.......................................................................................................................113.2方法..................................................................................................................................123.2.1血清检测...............................................................................................................123.2.2阳性样品检测.......................................................................................................123.2.2.1粪便样品处理............................................................................................123.2.2.2RNA提取...................................................................................................12 3.2.2.3RT-nPCR.....................................................................................................133.2.2.4序列分析....................................................................................................143.2.2.5遗传进化分析............................................................................................143.2.3HEV全基因组克隆和分析...................................................................................153.2.3.1RNA的提取...............................................................................................153.2.3.2反转录........................................................................................................153.2.3.3PCR.............................................................................................................163.2.3.45’RACE....................................................................................................163.2.3.53’RACE....................................................................................................163.2.3.6序列分析....................................................................................................174结果与分析.................................................................................................................................194.1河南样品检测分析..........................................................................................................194.1.1血清学检测结果....................................................................................................194.1.2粪便样品阳性率检测结果...................................................................................194.1.3序列对比与分析....................................................................................................214.1.4系统发育分析........................................................................................................224.2全基因组克隆..................................................................................................................224.2.13’RACE扩增结果.................................................................................................234.2.28个片段扩增结果.................................................................................................244.2.35’RACE..................................................................................................................264.2.4片段拼接...............................................................................................................264.2.5序列分析...............................................................................................................304.2.5.1ORF1...........................................................................................................304.2.5.2ORF2...........................................................................................................314.2.5.3ORF3...........................................................................................................324.2.5.4基因组水平分析.........................................................................................324.2.5.5基因组进化分析........................................................................................335结论和讨论..................................................................................................................................34参考文献........................................................................................................................................36 摘要戊型肝炎是一种由戊型肝炎病毒引发的急性肝炎疾病，主要经粪口传播，传播途径多种多样。HEV的宿主比较广泛，越来越多的证据表明戊型肝炎是一种人兽共患病。HEV可由动物传播给人。猪是HEV的主要宿主之一，HEV在猪群中携带率较高，严重威胁到人类的生命和食品公共卫生安全。本研究将对河南省猪戊型肝炎的流行情况进行初步调查。对从河南省郑州、洛阳、新乡、焦作、周口等5地市采集的133份血清样品进行戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus，HEV）IgG抗体分析；通过反转录聚合酶链式反应的方法(RT-PCR)对从郑州、中牟、新郑、济源和濮阳等5个地市采集的200份粪便样品进行HEVRNA检测。检测结果表明，79.70%的血清为HEV抗体阳性；7.5%的粪便样品为HEVRNA阳性。通过序列分析证明，4个测序的HEV河南分离株均为基因Ⅳ型。序列分析结果显示该片段与湖北株相应序列的同源性最高。为了进一步研究河南HEV的特点，设计8对引物，用RT-PCR的方法得到了HEV河南分离株JY40的近似全基因组序列，命名为“HN-JY40”。得到的序列去除polyA后全长7252bp，A/T含量为44.88%，C/G为55.12%。5’端非编码区有9个碱基，3’端非编码区全长69bp。ORF1全长5124bp，编码1708个氨基酸；ORF2全长2025bp，编码675个氨基酸，有信号肽；ORF3全长345bp，编码115个氨基酸。经过分析，HN-JY40与湖北分离株和新疆分离株同源性较高，为93%，为典型的Ⅳ病毒。关键词：猪，戊型肝炎病毒，分子检测，RT-PCR，序列分析1 1文献综述1.1戊型肝炎和戊型肝炎病毒戊型肝炎简称戊肝，是一种由戊型肝炎病毒（HEV,hepatitisevirus）引发的急性传染病。戊肝主要经水源污染传播，常见于粪口传播，在卫生条件不发达的发展中国家呈暴发流行；而在发达国家呈零星分布，主要由食物传播。戊型肝炎是一种自限性疾病，一般不转为慢性肝炎，但临床致死率较高，约为2.5%，远高于甲肝（0.1%）。戊肝对孕妇危害严重，致死率高达20%。戊型肝炎是一种人兽共患病，可经由动物传播给人。[1]戊型肝炎病毒（HEV）是一种无囊膜的正链RNA病毒，二十面体结构，直径27～34nm，可形成包涵体。在中性偏碱的PH环境下较稳定，对氯化铯、氯仿等比较敏感，冻融易降解。[2]ICTV第八次会议建议将HEV单独列为一个科：戊型肝炎病毒科。1.2HEV的基因组HEV基因组全长约7.2kb，5’端有帽子结构，3’端有polyA尾。HEV包含3个互相重叠的开放阅读框架（OpenReadingFrame,ORF）。ORF1长约5.1kb，主要编码一些和病毒复制有关的非结构蛋白，包括甲基转移酶、半胱氨酸蛋白酶、RNA解旋酶和RdRp以及两个功能未知的X结构域和Y结构域。甲基转移酶的出现表明HEV可能具有帽子结构；ORF2长约1.98kb，编码660个氨基酸，编码主要的结构蛋白；ORF3较小，与ORF2重叠（图1），[3][4]编码一个磷酸化蛋白，可能和病毒的释放有关。ORF2和ORF3组成的双顺反子叫[5]“subgenomicRNA”。和基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型相比，基因Ⅳ型在ORF3第二个AUG后面多了[6]一个“U”，导致ORF2增加了14个氨基酸，而ORF3减少了9个氨基酸。在ORF1和ORF2内各有一段序列差异较大的区域，该区域是目前国际上通用的HEV基因分型依据。图1HEV基因组示意图Fig.1OrganizationofthegenomicandsubgenomicRNAsofHEV2 1.3HEV的基因型目前，国际上通常采用的是将HEV分为5个基因型，即Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型以及[6]禽类单独分成的一个基因型（图2）。Ⅰ型主要分布在亚洲和非洲等发展中国家；Ⅱ型主要分布在墨西哥；Ⅲ型病毒的分布最广，广泛存在于除了非洲大陆之外的其他地区；Ⅳ型主要[6]分布在亚洲国家。在四种基因型当中，Ⅰ型和Ⅳ型病毒可以侵染人和猪；而Ⅲ型则主要侵[7]染猪、鹿等动物。图2基于全基因组序列的HEV进化树Fig.2Phylogenetictreebasedonthefull-lengthnucleotidesequencesofHEVisolatesHEV分布广泛,在世界各个地区都有报道。目前，HEV主要分布在亚洲和非洲等欠发达地区。欧美等发达国家地区主要以散发型病例为主。其中我国大陆和台湾地区报道的发病率占全世界的30.9%，为HEV的重灾区（图3）。3 图3HEV主要的世界分布图Fig.3HEVendemicareasandglobalseroprevalence1.4HEV的传播途径HEV的传播途径多种多样。一般在发展中国家，HEV主要是由水源污染引发大规模的暴发和流行。除此之外，HEV还可经过食物传播。在日本，曾经有研究人员发现从一位患[8]者体内分离到的HEV与从一头猪身上分离到的HEV之间有99.9%的同源性；血液传播，血液传播的例子并不多见。目前，临床上尚未报导有直接输血导致感染戊肝的病例。然而，[9]2000年，V.A.Vrankalle等人发现用感染HEV病人的血液感染健康人以后，健康人血液抗[10]体检测呈阳性；母婴传播。MélanieCaron等人研究发现在非洲的加蓬地区，怀孕妇女体[11]内抗戊肝的IgG含量很高。1995年，印度学者KhurooMS等人研究发现在感染HEV的孕妇所生小孩的血液中直接用PCR方法检测到了HEV病毒。这些例子都表明HEV可以经过血液垂直传播给下一代。而且，这样会造成较高的致死率；接触传播，目前并未有直接证据[12]表明普通接触可以传播HEV，但是Meng等的研究结果证明生猪饲养员血清中HEV抗体阳性率明显高于常人。WHO的调查表明，没有感染过HEV的人群受感染的机率要大一些。1.5HEV的诊断手段[13]早在1983年，人类首次使用电子显微镜利用免疫荧光技术观察到了HEV样本。随着科学技术的发展，HEV的检测手段多种多样，检验结果的可靠程度也越来越高。人们先后使用免疫荧光技术、免疫杂交手段（WesternBlot）、血清中和实验、酶联免疫吸附实验（ELISA）和RT-PCR等方法检测HEV。由于实验环境的限制，样品制作成本的因素等等，到目前为止，HEV的检测主要是依靠酶联免疫吸附实验和RT-PCR方法来进行的。4 1.5.1酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验是基于抗体的检测手段来检测血清样品当中HEV的存在与否。该方法灵敏度较高，方便快捷，能够较快速的检测到血清中的抗体情况。但是该方法也有一定的局限性。由于HEV感染动物之后，一般不在体内存留很长时间，约6周以后，病毒会随着机体的排泄将病毒排出体外，此时在动物体内已经产生了抗体。因此，用这种方法检测只能说明动物曾经感染病毒，而检测时体内有无病毒却并不能有效说明。1.5.2RT-PCR检测这种方法是目前世界上应用最多，灵敏度最高的检测手段。根据基因组的一定区域设计引物，采集样品进行RNA的提取，反转录后用引物进行PCR检测。该方法不仅能检测到病毒的存在并且可以通过后期的序列比较得知感染的病毒基因型。在此基础上，通过巢式PCR方法得到目的基因片段，使得检测的可信性可达100%。HEV的检测手段多种多样。随着检测技术的不断进步，以试剂盒为主导的检测抗体的酶联免疫吸附法会有更大的改善并且会逐步成为一种主导手段。但是相对而言RT-PCR的灵敏度最高，准确性要好一些。2009年，我国上海地区报道了一个7个月大的婴儿感染戊肝[14]的情况，当时用血清学检测却并未发现有抗体的存在，然而RT-PCR的方法却在婴儿的排泄物当中发现了病毒核酸的存在。1.6HEV的动物模型[15]越来越多的证据表明HEV是一种人兽共患病。为了便于HEV的进一步深入研究，[13]研究人员建立了各种不同的动物模型来作为研究对象。1983年，Balayan等用HEV患者的排泄物感染2只食蟹猴，使其发生肝炎，进而建立了第一个HEV的动物模型。而后研究[16][17]人员使用多种非人灵长类动物成功建立了HEV的动物模型，包括黑猩猩、猕猴等。除[18]、[19-21]了灵长类动物，研究发现猪、鸟类啮齿类动物等均对HEV较敏感，可作为HEV的动物模型。[22]其中，家猪是目前发现的最大的携带HEV的动物种群。1990年，Balayan等成功使[16]用一株亚洲人类HEV毒株感染了家猪。1997年Meng等成功分离并鉴定了第一株动物HEV病毒—猪HEV。而后在世界各地均报道了猪自然感染出现的HEV病毒血症和／或粪便排毒。调查显示，猪群中HEV的分布没有年龄、地域的差异，但是各猪场之间的感染情况不同。[23][24]此外，其它多种和人类生活密切相关的动物，如牛、羊、鸡等动物都对HEV敏感。5 1.7HEV的细胞模型迄今为止，HEV研究侵染过程并没有被完全解释清楚，最主要的原因归结于没有合适的细胞系。和其它嗜肝性病毒相似，HEV的细胞培养十分困难。现阶段用于HEV研究的细胞主要是原代肝细胞和个别传代细胞系。[25-26]Tam等将稀释的含HEV的粪便悬液通过静脉注射接种到猕猴体内，然后分离肝细胞进行原代。在培养的65天中均能检测到HEVRNA片段。考虑到原代细胞培养的复杂性和操作的实际难度，研究人员一直致力于HEV传代细胞[27]的筛选和培养工作。Huang等发现HEV对人肺癌细胞A549敏感，HEV可以在该细胞系[28]中进行有效的增殖，但传到第9代就无法检测到病毒存在；Panda等人将构建的完整的cDNA克隆转染人肝癌细胞系HepG2中。培养72h后开始可以检测到病毒RNA，但是病毒[29]只能传到第6代，之后病毒滴度持续降低；Dong等将HEVSAR55株接种于多种细胞系，然后在同等条件下培养，发现病毒在PLC/PRF/5细胞系中繁殖能力最强，7天内即可使病毒的数量提高两个数量级。但该细胞系也不能有效维持病毒的复制。在培养至30天的时候，[30]已经不能检测到病毒存在。日本学者Kentaro等将一株Ⅲ型HEV病毒株（JE03-1760F）转染到21种不同的细胞系中。培养发现，JE03-1760F可以在PLC/PRF/5和A549细胞中稳定存在，在35.5℃培养时，病毒在PLC/PRF/5细胞系中的量达到最大。用两种浓度接种该细胞，在60天的时候，病毒的拷贝数达到最高。但目前的研究结果并不足以证明PLC/PRF/5细胞系可以为病毒的传代及增殖的有效工具。1.8HEV的疫苗研究针对HEV设计的疫苗有蛋白类疫苗和DNA疫苗两种。1.8.1蛋白类疫苗HEV有3个开放阅读框架，ORF1编码的主要是和病毒复制有关的非结构蛋白，没有免疫原性，因此针对ORF1蛋白进行疫苗研究是不现实的；而ORF3编码的小的磷酸化蛋白是否是结构蛋白仍不清楚。ORF3编码的蛋白具有免疫原性，但其产生的抗体在人体内存在时间很短，并且有基因型特异性，不同的基因型产生的抗体也不同。有进一步研究证明，[26]ORF3蛋白产生的抗体无法中和病毒。因此目前HEV的疫苗研究工作主要围绕ORF2编码的结构蛋白展开。由于HEV的研究没有合适的小型模式动物和细胞系，这给HEV疫苗的研究工作带来了很大困难，体外重组蛋白疫苗系统的开发就成了研究的重点，主要是大肠杆菌表达系统[31-36][37-40]和昆虫杆状病毒表达系统。昆虫杆状病毒表达系统表达的蛋白被应用于HEV的检测，但是表达的ORF2全蛋白不6 溶，并且对HEV反应迟钝。另外，杆状病毒表达系统表达的蛋白，会被细胞本身的加工系统进行修饰，可能会覆盖抗原表位，影响作用；而且细胞内源性蛋白酶的存在，对表达的蛋白也产生了不可估计的影响。[41]现有的研究证明，原核表达的截短的ORF2片段蛋白的免疫原性要比全蛋白好，可能和其更好的构象表位有关。针对这点，各国科学家展开了积极的研究，均获得了一定成果。[42][43]其中，我国厦门大学的夏宁邵率领的团队获得了较大的成功。他们在Zhang等的研究基础上，开发了免疫原性更强的颗粒体蛋白p239（aa368-606）。p239可在体外自发形成类病毒颗粒（virus-likeparticles,VLP）引发的构象变化，形成良好的戊肝中和表位。目前，该疫苗已经完成临床Ⅲ期实验，并组织了全球规模最大的志愿者实验，取得了很好的效果。1.8.2DNA疫苗[44-45]针对蛋白类疫苗的一些瓶颈，有关学者提出构建DNA疫苗来治疗HEV。目前的研究表明，将DNA重组到细胞因子（interleukin-2,granulocyte-macrophagecolony-stimulating[46-47]factor）基因上效果较好。但研究同时表明，DNA疫苗并不能十分有效的阻止HEV的感染。因此DNA疫苗的治疗效果和前景仍不如蛋白类疫苗。1.9我国HEV的流行情况我国曾是HEV的重灾区。早在1986～1988年，我国新疆地区暴发了一次大规模的戊型肝炎疫情，共计发病119280例，死亡707例，死亡率达到2.5%，其中414名孕妇死亡。之后在我国各地均发现有散发性的戊型肝炎病例。各个研究机构也陆续报道了他们的研究情况。[48-49]2004年，马勋等人收集新疆各地猪血清进行HEV抗体检测，共检测381份血清，其中抗体阳性率达到52.55%；检测70份粪便样品，其中13份为阳性，阳性率为18.57%。[50]2005年，马勋等设计引物，扩增得到新疆分离株swCH25的全长序列。经过分析，发现swCH25和人源T1株的同源性最高，达到89.8%，属于Ⅳ型病毒。在此基础上，2009年相[51]关人员又在新疆奶牛体内检测到了HEV，从而扩大了HEV的宿主范围。[52]在吉林，研究人员将分离到的5个猪源HEV病毒株和3个人源病毒株进行检测并测序。分析后证实5个猪源病毒株和3个人源病毒株都属于基因Ⅳ型，而且同源关系较高，推测其可能来源于同一株病毒，同时揭示了HEV存在种群交叉感染的可能。[53]上海研究人员检测了上海近郊收集的36份样品，检测得到5份阳性样品，阳性率达到13.9%。通过序列分析，发现上海猪HEV同样属于基因Ⅳ型。[54]2007年，陆一涵等人在我国华东地区的检测当中发现下了2个Ⅲ型病毒株，这是首次在我国大陆地区检测到Ⅲ型病毒的存在。[55][56]此外，在我国北京、甘肃、湖北等地都检测到了Ⅳ型HEV的存在。在我国广大南7 方地区，特别是在降水较多的广西、云南等地，HEV的发生率普遍较高。在我国大陆地区，HEV的主要流行类型是Ⅰ型和Ⅳ型。地域差异及时间的不同，导致各地病毒也存在一定差异。在新疆地区，早先的流行的为Ⅰ型病毒，而近年，研究人员检测到则以Ⅳ型为主。在我国其它地区，HEV以Ⅳ型为主。目前的研究表明猪是最大的HEV宿主源，有学者认为猪可能是HEV的源宿主，其它动物包括人源HEV都可能由猪源HEV演变而来。然而，HEV的感染以及物种间的传播机制仍然是一个未解的难题。8 2引言近年，在全球范围内暴发了多场大规模的人兽共患疾病，造成了巨大的财产损失，对人类的生命安全构成了极大的威胁，引起了所有人类疾病研究人员的注意。人兽共患疾病逐步成为研究人员研究的重点。戊型肝炎是一种典型的人兽共患病，宿主范围较广。长久以来，戊型肝炎作为一种自限性疾病，没有引起人们的足够重视。戊肝是一种病毒性肝炎疾病，由戊型肝炎病毒（HEV）引发，属自限性疾病。戊肝潜伏期一般为4～6周，随后大部分病毒经肠道排出体外。与甲肝类似，戊型肝炎为急性肝病，一般不发展成慢性肝炎。患者感染后，临床症状表现为畏寒、发热、食欲减退、恶心、疲乏等，并伴随肝脾肿大及肝功能异常，黄疸型病例高于无黄疸病例；临床致死率约为2.5%，高于其它肝炎，患者以青壮年居多。戊肝对孕妇危害极大，孕妇感染戊肝后引发急性肝炎，致死率高达20%。HEV传播途径多种多样，多由粪—口途径传播。在发展中国家，多见水源污染传播，在发达国家则以散发病例为主，多由食物传播。有学者认为猪是戊肝的源宿主。自Balayan分离到第一株猪源HEV病毒以来，包括我国在内的很多国家都进行了猪源HEV的研究。我国北京、上海、新疆等地的研究人员详细报道了当地猪源HEV的发展和流行情况，为当地HEV的预防工作提供了技术支持。然而，河南省猪源HEV的研究一直比较滞后，猪群中HEV的流行趋势及详细的带毒情况鲜有研究。这给我省的生猪出口和相关产业的发展造成的影响，乃至河南省的食品公共卫生安全都是一个极大的隐患。本文将对河南省部分地区猪HEV的有关情况进行调查，并分析河南省流行的猪源HEV的特征，为以后更深一步的研究提供数据基础。9 3材料与方法3.1试验样品、主要试剂、仪器以及引物3.1.1试验样品133份猪血清采自河南省郑州、洛阳、新乡、焦作、周口等5个地市，存于-80℃待检。200份粪便样品分别从郑州、中牟、新郑、济源、濮阳采集。其中，郑州粪便样品50份，中牟样品50份，新郑样品30份，济源样品共40份，濮阳样品30份。在各地市分别从猪栏里采集独立的新鲜粪便样品，低温保存，存于-80℃待检。3.1.2主要试剂主要试剂试剂来源RNAisoPlusTaKaRaRNA酶抑制剂TaKaRarTaqTaKaRadNTP(10mM)RocheM-MLVPromegaDEPCAmresco胶回收试剂盒上海捷瑞戊型肝炎病毒总抗体（HEV-Ab）诊断试剂盒北京万泰ViralRNAKitOmegaSuperScriptIIIFirst-StrandSynthesisSystemforInvitrogenRT-PCR1kbPlusDNALadderInvitrogenUltraPureAgaroseInvitrogenPlatinumTaqDNAHIFIPolymeraseInvitrogen100mMdNTPSetInvitrogenPureLinkQuickGelExtractionandPCRPurificationInvitrogenComboKitDL2000DNALadderTaKaRaGeneRacerkitInvitrogen-1PBS溶液：0.01mol.L，pH值为7.2～7.4（500mL：NaH2PO4·2H2O:0.2184g，Na2HPO4·12H2O：1.2893g，DEPC水定容至500mL）。菌种为大肠杆菌DH5α，克隆载体pMD-18T载体购自大连宝生物公司。10 3.1.3主要仪器仪器名称仪器来源型号台式高速冷冻离心机eppendorfCentrifuge5417RPCR仪Bio-radMyCycler稳压电源Bio-radPowerPacHC电泳仪TanonHE-120凝胶成像仪Tanon2500移液器Gilson各型号tip，离心管Axygen3.1.4引物HEV阳性样品筛选所用的反转录和巢式PCR的引物（表1）参考文献[55]。表1.检测用引物序列Table.1Sequenceofprimersfordetection引物Primer引物序列PrimersequenceA5’-TAYCGHAAYCAAGGHTGGCG-3’B5’-TGYTGGTTRTCRTARTCCTG-3’C5’-ACYTCHGGBGTBGCKGAGGA-3’D5’-GCTCGCCATTGGCTGAGAC-3’根据GenBank收录的序列设计HEV河南分离株的全基因组扩增引物（表2）。表2.HEV全基因组扩增用引物Table.2PrimerofgenomeforPCR引物Primer序列PrimerSequnces1F5’-GTCGACGCCATGGAGGCCCATCAGTTTA-3’1R5’-ACCGCCCGAACCCGCTCAATTACCAAC-3’2F5’-AGGCCATTTCTAAAGGGATGAAGAG-3’2R5’-CATTAACCAGCCAGGTGCACTCAGAC-3’3F5’-CCGGAACTTACCATACCACCTCA-3’3R5’-GAGGAAGCTACGGCAGCGACAA-3’4F5’-GAGTCTGAGTGCACCTGGCTGGTTAAT-3’4R5’-GCCAACTGATGGTAAGCACTGAACTGAC-3’5F5’-CCACGAAGTGGTGGCATCTTACTCA-3’5R5’-AGCAGCGTGCTATAACAGCCATGTTC-3’11 6F5’-GACACAGTTCTGGCTGCTGCTGTTG-3’6R5’-TGACGGCGCAAAATGGCGCCACGAGAAT-3’7F5’-TGGAGCTCGCCCTCGGCAGCCAGCCC-3’7R5’-CCTTGTCCTGCTGAGCATTCTCAACT-3’8F5’-GGTCGTGGTATTGCGCTAACCTTGT-3’8R5’-TCCAGGGAGCGCGGAACGCAGAAAA-3’3’RACE引物：正向引物为：5’-GAGAAYGCYCAGCAGGAYAA-3’反向引物为oligo（dT）5’RACE反向引物：5’-TATAAACTGATGGGCCTCCA-3’3.2方法3.2.1血清检测HEV血清抗体检测严格按照试剂盒说明书进行。检测时设2个阳性对照和3个阴性对照。3.2.2阳性样品检测3.2.2.1粪便样品处理-1将1g粪便样品溶于DEPC水配置的10mLPBS（0.01mol.L，pH值为7.2～7.4）中。-1使用涡旋震荡仪进行混匀，4℃，8000r.min离心8min。取上清液200μL进行RNA提取。3.2.2.2RNA提取按照RNAisoPlus说明书提取RNA。①取200μL处理好的液体样品加入到用DEPC水处理过的EP管中，加入1mLRNAisoPlus，涡旋混匀，室温静置5min；②加200μL的氯仿，涡旋震荡混匀，室温静置5min；-1③4℃，12000r.min离心10min，取上清转移到另一新的EP管中；④加入等体积的异丙醇，室温静置30min；-1⑤4℃，12000r.min离心15min，小心去除液体；12 ⑥加入1mL灭菌DEPC水配置的体积浓度为75%的乙醇溶液，轻轻转动摇晃EP管。4℃，-112000r.min离心10min；⑦重复第六步一次；⑧小心去除液体，加入20～30μL灭菌的DEPC水，使沉淀溶解。得到的RNA马上用于反转录或者-70℃低温保存。3.2.2.3RT-nPCR按照反转录酶说明书完成反转录体系。①取14μL溶解的RNA样品置于DEPC水处理灭菌的PCR管中，加入1μL反转录引物B，混匀后置于PCR仪中70℃，5min；②将PCR管取出置于冰上，然后加入以下组分：M-MLV5×ReactionBuffer5μLdNTP（10mM）2μLRnasinRibonucleaseInhibitor0.5μLM-MLVRT1μL灭菌DEPC水定容之25μL③将管中液体轻轻混匀，瞬时离心，置于PCR仪中，42℃，60min；然后75℃，5min；④取出PCR管，置于冰上放置2～3min，然后直接用于PCR或者-70℃低温保存。将反转录得来的cDNA用来做第一轮反应。反应体系为25μL，各组分配置及含量为：灭菌ddH2O18.3μL10×ReactionBuffer2.5μLdNTP1μL引物A0.5μL引物B0.5μLcDNA2μLrTaq0.2μL反应条件为：94℃，30s；53℃，30s；72℃，45s；共进行35个循环。反应结束后，取第一轮PCR产物为模板进行巢式PCR，PCR各组分及含量为：灭菌ddH2O19.8μL10×ReactionBuffer2.5μLdNTP1μL引物C0.5μL引物D0.5μL13 模板0.5μLrTaq0.2μL反应条件同第一轮PCR。将PCR结果在1%琼脂糖胶上电泳检测。检测后随机选取4个样品（JY6、JY10、JY40、ZZ9）进行测序验证。3.2.2.4序列分析将测序后的序列在NCBI进行同源搜索，验证是否为HEV序列。为进一步了解序列信息，使用DNAStar数据包中的比对软件Megalign将测序结果进行同源比对，分析序列同源性。3.2.2.5遗传进化分析根据测序结果，参照GenBank中的30条序列（表3），使用软件clustalx和MEGA4.0进行比对，采用Kimura-2-parameter法进行系统发育分析。表3系统发育分析比较的序列Table.3HEVstrainsusedinthephylogeneticandsequenceanalyses病毒株登录号宿主基因型病毒株登录号宿主基因型StrainAccessionHostGenotypeStrainAccessionHostGenotypeNo.No.BUR-82M73218人ⅠJMY-HAWAB074920人ⅢBUR-86D10330人ⅠHE-JA10AB089824人ⅢINDHARAF459438人ⅠJRA1AP003430人ⅢHYDO1AF076239人ⅠJJT-KanAB091394人ⅢTK15/92AF051830人ⅠswJ570AB073912猪ⅢMad-93X99441ⅠOsh205AF455784猪Ⅲ人Abb-2BAF185822人ⅠT1AJ272108人ⅣPAK-87M80581人ⅠHE-JK4AB099347人ⅣpSK-HEV-2AF444002人ⅠJSN-Sap-FH02CAB200239人ⅣCHN-87L25595人ⅠHE-JA1AB097812人ⅣMEX-86M74506人ⅡswJ13-1AB097811猪ⅣUS-1AF060668人ⅢHE-J14AB080575人ⅣUS-2AF060669人ⅢJAK-SaiAB074915人ⅣUS-SWAF082843猪ⅢJKK-SapAB074917人Ⅳ14 JKN-SapAB074918人ⅢCCC220AB108537人Ⅳ3.2.3HEV全基因组克隆和分析3.2.3.1RNA的提取按照Omega试剂盒进行。①将560μLQVLLysisbuffer，5.6μLCarrierRNA和10μL巯基乙醇加入到1.5ml离心管中；②然后加入处理好的样品140μL，涡旋30s彻底混匀，然后迅速将管壁上液体甩到管底；③将离心管放置在室温下静置5～10min，瞬时离心；④往离心管中加入560μL的无水乙醇（室温）混匀，瞬时离心30s；⑤取1个HiBindRNAcolumn放入到1个2ml的收集管中。吸取650μL样品混合物转移到HiBindRNAcolumn中。室温下10000g离心30s，弃管底液体；⑥重复第⑤步，将剩下样品混合物用完；⑦将HiBindRNAcolumn放入到另一个新的收集管中，加入500μL的RWAWashbuffer(事先加无水乙醇稀释)，10000g室温离心30s，弃管底液体；⑧再换收集管，加入500μL的RWBWashbuffer(事先加无水乙醇稀释)，10000g室温离心30s，弃管底液体；⑨将HiBindRNAcolumn重新放入收集管中，空管12000g室温离心3min；⑩将HiBindRNAcolumn转移到一个新的1.5ml的离心管中（自备），在HiBindRNAcolumn中加入30～50μLDEPC水（试剂盒中配套）。室温静置3～5min，室温10000g离心1min，将收集的RNA马上用于反转或者－70℃冻存。3.2.3.2反转录参照SuperScriptIIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR说明书进行。①取处理过的PCR管，加入约5ug的RNA；②加入50um的oligo(dT)201μL，10mM的dNTP1μL，加DEPC水（试剂盒）定容至10μL；③在PCR仪中65℃5min，然后取出冰上放置1～2min；④在管中加入以下组分：10×RTBuffer2μL25mMMgCl24μL0.1MDTT2μLRNaseOUT(40U/µl)1μLSuperScriptIIIRT1μL15 轻轻混匀后瞬时离心，50℃反应50min；⑤85℃，反应5min，然后置于冰上；⑥瞬时离心。加1μLRNase37℃反应20min；⑦得到的cDNA直接用于PCR或-20℃保存3.2.3.3PCR参照PlatinumTaqDNAHIFIPolymerase说明书进行。在Microtube中配制如下反应液：50μL体系：10×PCRBuffer5.0μLTemplateDNA1.0μLdNTP（10mM）1.0μLMg2+2.0μLprimerF（20μM）1.0μLprimerR（20μM）1.0μLDNAPolymerase（5U/μL）0.2μLddH2O38.8μL将配好的体系瞬时离心后进行PCR扩增，扩增条件为：94℃3min9430sec℃52℃30sec30cycles68℃3min6810min℃3.2.3.45’RACE5’RACE操作按照Invitrogen公司的GeneRacerkit进行操作。3.2.3.53’RACE在Microtube中配制如下反应液：25μL体系：10×PCRBuffer2.5μLcDNA2.0μLdNTP（10mM）1.0μL16 primerF（5μM）0.5μLoligo(dT)（5μM）0.5μLDNAPolymerase（5U/μL）0.2μLddH2O18.3μL将配好的体系瞬时离心后进行PCR扩增，扩增条件为：94℃3min9430sec℃4630sec3℃5cycles72℃3min7210min℃3.2.3.6序列分析测序和序列的拼接由上海Invitrogen公司完成。测序完成后，使用各种在线工具及生物软件对序列进行比对。①使用Expasy在线工具对3个ORFs进型分析，分析内容包括糖基化位点分析、功能域分析和信号肽分析；②使用DNAstar7.1软件包对拼接好的序列进行同源比对；③使用clustalx和MEGA5.0，对序列数据进行分析和处理，构建进化树。序列比对和构建进化树用到的29个各种基因型的序列信息见表4：表4系统发育和序列分析比较的序列Table.4HEVstrainsusedinthephylogeneticandsequenceanalyses登录号AccessionNo.基因型Genotype登录号AccessionNo.基因型GenotypeAF051830ⅠAF455784ⅢAF076239ⅠAY115488ⅢAF185822ⅠFJ653660ⅢAF444002ⅠFJ906895ⅢAF444003ⅠFJ906896ⅢAY204877ⅠFJ998015ⅢL08816ⅠAY594199ⅣM73218ⅠAY723745ⅣM74506ⅠFJ610232ⅣM80581ⅠGU119960ⅣM94177ⅠGU119961Ⅳ17 AY535004ⅡGU188851ⅣAF060668ⅢGU206559ⅣAF060669ⅢGU361892ⅣAF082843Ⅲ18 4结果与分析4.1河南样品检测分析4.1.1血清学检测结果用酶联免疫试剂盒对分离到的血清进行抗体检测，发现不同地区抗体的阳性率不同，且没有明显的分布规律；部分地区的抗体阳性率高达100%，抗体阳性率最低的也在61%以上（表5）。经过检测，血清样品中HEV抗体总阳性率达到79.70%。从结果可以看出，HEV有明显的地域分布特征。表5血清样品检测结果Table5.Resultsofserumdetected地区样品总数阳性数阳性率/%AreaTotalsamplesPositivesamplesPositiverate郑州Zhengzhou422661.90新乡Xinxiang373081.08洛阳Luoyang1010100焦作Jiaozuo292793.10周口Zhoukou151386.674.1.2粪便样品阳性率检测结果对200份样品进行RT-PCR，结果显示，在郑州采集的50份样品中只有1个为阳性；在新郑和中牟采集的80份样品均为阴性；在济源采集的40份样品中8份样品呈阳性；在检测的30份濮阳样品中6份样品呈阳性。HEVRNA总体阳性率达到7.5%。检测到的阳性样品均能在1%的琼脂糖凝胶上观察到436bp的条带，与预期大小一致（图4～7）。随机选取4个样品（JY6、JY10、JY40和ZZ9）的PCR产物送往上海生工进行测序验证。19 M123456789101112131415CK20001000750500250100图4济源阳性粪便样品检测结果Fig.4ResultofpositivefecalsamplefromJiyuanM:DL2000；泳道1-15:.检测的样品；CK:阴性对照M:DL2000;Lane1-15:Samplestested;CK:negativecontrolM123456789101112131415CK20001000750500250100图5郑州阳性粪便样品检测结果Fig.5ResultofpositivefecalsamplefromZhengzhouM:DL2000；泳道1-15:.检测的样品；CK:阴性对照M:DL2000;Lane1-15:Samplestested;CK:negativecontrolM1234567891011121314CK20001000750500250100图6濮阳阳性粪便样品检测结果-1Fig.6ResultofpositivefecalsamplefromPuyang-1M:DL2000；泳道1-14:.检测的样品；CK:阴性对照M:DL2000;Lane1-14:Samplestested;CK:negativecontrol20 M151617181920212223242526272829CK20001000750500250100图7濮阳阳性粪便样品检测结果-2Fig.7ResultofpositivefecalsamplefromPuyang-2M:DL2000；泳道15-29:.检测的样品；CK:阴性对照M:DL2000;Lane15-29:Samplestested;CK:negativecontrol4.1.3序列对比与分析将随机选取的样品进行测序，测序后在NCBI数据库中进行同源搜索，搜索结果证明测序的4个样品为HEV阳性。将4个河南分离株的测序结果进行序列同源对比（图8）。结果显示JY6与JY10和JY40同源性高达98%，与ZZ9同源性为84%；JY40与ZZ9同源性为83%。测序结果说明，选取的4个样品之间有一定的地域差异。*20*40*60*JY6.seq:..........-C...........................................-...................:73JY10.seq:................................................................T..........:75JY40.seq:..........-............................................-...................:73ZZ9.seq:...C..T..T-C...G...........C.....C..T.....A..C.....C...-..C..C.....A.......:73GCTtTGcATcCGGaTCACCTGTGAAtTCCTAtACcAATACgCCtTATACtGGTGCaCTtGGcTTgCTTGATT80*100*120*140*JY6.seq:...........................................................................:148JY10.seq:..............................................T.................T..........:150JY40.seq:..........................C.....................................T..........:148ZZ9.seq:.T..A........T........C.....G..............T..T..G..C..T..T..C........T..C.:148TcGCgCTCGAGCTcGAGTTTCGtAATtTaACACCTGGCAACACgAAACtCGtGTcTCcCGtTATCGAGcAGtG160*180*200*220JY6.seq:...........................................G...............................:223JY10.seq:...........................................G..............T................:225JY40.seq:..................................T.......................T................:223ZZ9.seq:.A.....T..A..G.....A...........T..T.....G.....T..............A.............:223CgCGCCAcAAgCTaCGCCGtGGACCTGATGGcACGCTGAaTTACcACTACTGCTGCACcCGCTTTATGAAAG*240*260*280*300JY6.seq:...........................................................................:298JY10.seq:...........................................................................:300JY40.seq:...........................................................................:298ZZ9.seq:....T..T.....G..A..C..C..............C..............AC.....T.......T.......:298ACCTcCAcTTTACaGGgACtAAtGGTGTTGGTGAGGTtGGTCGTGGTATAGCgtTAACCcTGTTTAAcCTTGCTG*320*340*360*JY6.seq:.............................................................T............:372JY10.seq:.............................................................T............:374JY40.seq:..........................................................................:372ZZ9.seq:.T.................T..........................A..T..G..A..C.....C........T:372AcACGCTTCTCGGTGGGCTaCCGACAGAATTGATTTCGTCGGCTGGtGGaCAaTTgTTtTATCtCGCCCCGTc图84个河南分离株的核苷酸同源性分析Fig.8NucleotidesequenceidentityofthefourHenanHEVstrains为进一步研究4个河南分离株的基因型，将其与NCBI中收录的部分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型HEV的相应核苷酸进行对比。比对发现，4个河南分离株JY6、JY10、JY40与ZZ9和HEVⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型同源性分别为77%～79%，74%～76%，76%～81%，79%～86%。结果显示，21 相对于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型HEV而言，4个河南分离株与Ⅳ型HEV的同源性较高。4.1.4系统发育分析使用表3中的相应序列，对得到的HEV河南株进行了系统发育分析（图9）。分析结果显示，分离到的4个河南分离株都属于Ⅳ型HEV。3个济源株（JY6、JY10、JY40）属于同一个亚型，郑州株（ZZ9）属于另一个亚型。图9基于ORF2中核苷酸序列的系统发育分析Fig.9Phylogenetictreeconstructedbybasedon436-ntnucleotidesequenceofORF24.2全基因组克隆由于各实验室筛选病毒时扩增长度不一样，并且扩增的位置也不一样，因此使用小片段来分析HEV的序列特征和基因型，是不科学的。为此，本实验室设计多对引物（表2）获取HEV河南分离株的全基因组序列。22 4.2.13’RACE扩增结果将3’RACE扩增片段在1%琼脂糖胶上进行电泳检测。PCR产物的理论值约800bp，电泳检测的条带和预想的大小一致（图10）。M120001000750500250100图103’RACE扩增结果M：DL2000,泳道1：3’RACE扩增结果Fig.10Resultof3’RACEM：DL2000,Lane1：3’RACE扩增结果将扩增结果进行克隆测序，测序结果证实扩增的片段为HEV片段。测序结果为：TGAGAACGCCCAGCAGGATAAGGGTATAGCTATCCCCCACGATATTGATCTTGGTGAGTCCCGAGTTGTCATCCAGGACTATGATAACCAACACGAGCAGGACCGCCCCACCCCTTCTCCGGCTCCTTCCCGCCCCTTCTCTGTCCTTCGCGCTAATGACGTGCTCTGGCTGTCTCTTACAGCCGCTGAGTACGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACCAATCCTATGTATGTCTCTGACACTGTGACATTTGTTAATGTAGCCACTGGTGCCCAGGGAGTTTCCCGCTCTCTCGACTGGTCTAAGGTTACTCTTGATGGGCGCCCGCTTACTACTATCCAGCAATATTCTAAAACATTCTATGTCTTACCTCTCCGTGGTAAACTTTCCTTCTGGGAGGCCGGTACTACCAAGGCTGGCTACCCTTATAATTATAATACTACTGCTAGTGACCAGATTCTAATTGAGAACGCGGCTGGTCACCGTGTCTGTATCTCAACTTATACTACTAATCTTGGCTCCGGCCCTGTCTCTATTTCTGCTGTCGGTGTCCTCGCACCTCACTCTGCGCTGGCTGCTTTGGAGGATACCGTTGATTACCCCGCTCGTGCTCATACCTTTGATGATTTCTGCCCTGAGTGCCGTACACTCGGTCTTCAGGGCTGTGCATTTCAGTCAACTGTTGCTGAGCTGCAGCGTCTTAAAATGAAGGTGGGTAAAACTCGGGAGTATTGATTTATTTTGCTTGTGCCTCCCTTCTGCTTCGTCTCTTTTATTTCTCTTTTCTGCGTTCCGCGCTCCCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA23 4.2.28个片段扩增结果参考HEV河南分离株JY40的已知序列和NCBI收录的国内其它病毒株的序列，我们设计了8对引物进行扩增。经电泳检测，扩增得到的片段大小与预想的一致（图11～18）。M1M1CK12000500020001650200010008506505001000400750300200500100250100图12片段2扩增结果图11片段1扩增结果M:DL2000;泳道1:片段2扩增结果;M:1kbplus;泳道1:片段1扩增结果CK:阴性对照Fig.11Resultoffragment1Fig.12Resultoffragment2M:1kbplus;Lane1:Resultoffragment1M:DL2000;Lane1:Resultoffragment2;CK:negativecontrolM1M1CK12000500020001650100020008506505001000400300750200100500250100图14片段4扩增结果图13片段3扩增结果M:DL2000;泳道1:片段2扩增结果;M:1kbplus;泳道1:片段3扩增结果CK:阴性对照Fig.13Resultoffragment3Fig.14Resultoffragment4M:1kbplus;Lane1:Resultoffragment3M:DL2000;Lane1:Resultoffragment4;CK:negativecontrol24 M1CKM1CK2000200010001000750750500500250250100100图15片段5扩增结果图16片段6扩增结果M:DL2000;泳道1:片段5扩增结果;M:DL2000;泳道1:片段6扩增结果;CK:阴性对照CK:阴性对照Fig.15Resultoffragment5Fig.16Resultoffragment6M:DL2000;Lane1:Resultoffragment5;M:DL2000;Lane1:Resultoffragment6;CK:negativecontrolCK:negativecontrolM1CKM1CK2000200010001000750750500500250250100100图17片段7扩增结果图18片段8扩增结果M:DL2000;泳道1:片段7扩增结果;M:DL2000;泳道1:片段1扩增结果;CK:阴性对照CK:阴性对照Fig.17Resultoffragment7Fig.18Resultoffragment8M:DL2000;Lane1:Resultoffragment7;M:DL2000;Lane1:Resultoffragment8;CK:negativecontrolCK:negativecontrol25 将扩增的8个片段进行测序，结果在NCBI进行同源搜索，结果均为HEV片段。4.2.35’RACE为得到完整的5’端序列，本实验室进行了多次尝试，在反复优化条件后仍未得出有效的扩增产物。进过分析，推测可能是由于样品纯化过程中损失过多，导致样品浓度太低或者引物设计的不合理，而得不到理想的扩增产物。4.2.4片段拼接将扩增得到的8个PCR产物序列与3’RACE序列进行拼接，拼接后的结果如下：1GTCGACGCCATGGAGGCCCATCAGTTTATAAAGGCTCCTGGTGTCACTAC51TGCTATTGAGCAGGCAGCTCTAGCAGCGGCCAACTCCGCCTTGGCGAATG101CTGTGGTGGTTCGGCCTTTTCTATCCCGGCTACAGACAGAGATACTCATT151AACCTGATGCAGCCCCGGCAGCTTGTTTTCCGCCCTGAGGTCTTGTGGAA201CCACCCAATTCAGCGTGTGATCCACAACGAGCTCGAACAGTATTGTCGAG251CCCGAGCCGGCCGCTGCCTTGAAGTGGGTGCCCACCCACGATCCATCAAT301GACAACCCCAACGTCCTCCACCGCTGCTTTTTGAAACCTGTTGGCCGCGA351CGTTCAGCGGTGGTATACTGCCCCCACTCGTGGCCCTGCAGCGAACTGCC401GCCGGTCGGCTCTCCGTGGGCTCCCACCTGTTGACCGGACATATTGTTTT451GACGGCTTCTCCGGCTGCACGTTTGCTGCTGAGACGGGGGTTGCACTCTA501TTCACTGCACGACCTGTGGCCTGCCGATGTTGCTGAGGCCATGGCCCGCC551ATGGCATGACCCGGTTGTATGCAGCCCTCCACCTTCCTCCAGAAGTGCTG601CTCCCCCCCGGAACTTACCATACCACCTCATACCTTCTCATTCATGATGG651CGATCGTGCAGTAATTACATACGAGGGGGATTCTAGTGCTGGGTACAATC701ATGATGTGTCTATTCTCCGTGCCTGGATCCGCACTACTAAGGTCACCGGT751GACCACCCGCTAGTGATTGAGCGGGTCCGGGCAGTTGGCTGTCATTTTGT801GCTCCTCCTCACAGCCGCACCTGAGCCGTCGCCAATGCCCTATGTTCCAT851ACCCTCGTTCTACCGAGGTCTATGTTCGGTCCATCTTCGGCCCCGGCGGC901TCTCCATCCCTCTTTCCATCTGCCTGCTCCACTAAATCCACATTTCACGC951CGTCCCTGTGCACATATGGGACAGGCTTATGCTCTTCGGCGCGACCCTCG1001ACGATCAGGCCTTCTGCTGTTCGAGGCTAATGACATACCTCCGTGGCATT1051AGTTATAAAGTCACGGTCGGCGCTCTTGTCGCCAACGAGGGTTGGAATGC1101TTCCGAAGATGCACTGACTGCTGTGATTACTGCCGCTTATCTCACGATCT1151GTCATCAGAGATACCTCCGTACGCAGGCCATTTCTAAAGGGATGAAGAGG1201CTTGAGCTTGAGCATGCGCAAAAGTTCATAACACGCCTTTATAGCTGGCT26 1251GTTTGAAAAGTCCGGCCGTGATTACATCCCCGGTCGTCAGTTGCAGTTTT1301ATGCCCAATGCCGTCGGTGGTTATCTGCCGGCTTCCACCTTGACCCTCGT1351GTGCTCGTTTTTGATGAGGCGGCCCCTTGTCGCTGCCGTAGCTTCCTCCG1401TAAAGCTGCTCATAAATTTTGTTGCTTCATGCGGTGGCTCGGGCAGGACT1451GCACCTGCTTCCTCCAGCCTGTTGAGGGGAGGGTCGGCGAGCAAGGTTAT1501GATAATGAAGCGTTTGAAGGATCTGATGTTGACCCCGCTGAGGAGGCCGT1551TGTGAGCATTTCTGGATCTTATATTGTCACCGGTAGCCAGCTACAGCCCT1601TTTATCAGGCGCTTGGCATCCCTTCTGACCTTGCTGCTCGAGCCAGTCGG1651CTTACCGCTACCGTCGAAGTGACGGATGCCGATGGTCGCCTTATTTGTGA1701AACTACCATAGGCAATAAGACTTTTAAAACAGTTTTCACTGATGGCGCCC1751AGTTAGAGGCTAATGGACCAGAGCAATATGTGTTATCGTTTGATCCGGCC1801AAGCAGACCATGGCCGCTGGCCCACATAGTCTTAGTTATGCCTTGTCATC1851TACTGGCCTTGAGGTGCGTGTTGTCTCCGCCGGACTTGACTGCAAGGCTG1901TCTTCCCATCTGGTGTAGCGACCCCCTCCACCCCTGGGGAGGTGTCCGCT1951TTTTGTTCAGCCTTGTACAGGTTCAATCGCTGTGTCCAGCGGCATTCCCT2001TATTGGGGGCTTGTGGTATCACCCTGAGGGGCTAATTGGCCTGTTTCCGC2051CGTTTTCTCCCGGCCACGCTTGGGAGTCCGCCAATCCTTTCTGCGGGGAG2101AGTACCCTCTACACCCGGACCTGGTCGGTGTCAGGGTTCTCTAGCTGTTT2151CTCCCCGCCCGAGCCCTGCGTCCCGGACTCGTCACCGCCCGTTGAGACTG2201GTGTACCTGTTGCTATTAATGTTCCATCCCCAACCATTTCTGCATTGCCT2251CAGCCCCCAGCTTCCGAACAGGTGGCCCCATCATTAGACTTAGCTGATAG2301TAGTGCTGCTCCGGCCTTACCGGACGCCCCTGTTGTCCCCCCGGCTCCAA2351TGCAGCCCGTAACCCGCCTATCTGGGCCCCGCCGGCGGTTGCTTCATACT2401TATCCTGATGGCTCAAAGGTGTACGCCGGCTCCCTTTTTGAGTCTGAGTG2451TACTTGGCTGGTTAATGCATCCAACCCTGGCCACCGTCCCGGCGGTGGTC2501TGTGCCATGCATTCTACCAACGTTTCCCGGAGTCATTTGACCCCGCCGAG2551TTCATTATGTCTGACGGCCTTGCGGCTTATACCCTCACCCCCCGGCCTAT2601TATCCATGCTGTTGCTCCCGACTACCGGGTAGAACATAACCCTAAAAGGC2651TTGAGGCCGCTTATCGGGAGACGTGCTCTCGCCGTGGGACGGCTGCTTAC2701CCCTTGCTCGGCGCTGGTATATACAAAGTACCTGTTGGGCTGAGTTTTGA2751CGCCTGGGAGCGCAACCATCGACCCGGGGACGAGCTGTATCTTACTGAGC2801CAGCCATAGCTTGGTTTGAGGCTAACCGGCCCGCCCTCCCCGCTCTTACT2851ATCACTGAGGATACGGCACGCACAGCGAACCTGGCGCTGGAGTTGGACTC2901AGCTACCGAGGTTGGCCGGGCATGTGCTGGCTGTCGTGTTGAGCCTGGTG27 2951TCGTTCACTACCAATTCACGGCGGGTGTGCCCGGCTCCGGTAAGTCCCGT3001TCGGTTCAGCAGGGTGAGGTAGATGTGGTGGTGGTGCCTACTCGTGAGTT3051GCGTAATTCGTGGCGGCGCCGCGGGTTCGCAGCCTACACACCTCACACCG3101CGGCCCGTGTCACCCGTGGCCGCAGGGTTGTTATTGACGAGGCTCCATCA3151CTCCCACCGCATTTGCTTTTGCTCCATATGCAGCGAGCCTCGTCAGTCCA3201TCTTCTTGGTGACCCCAACCAGATCCCTGCCATTGATTTTGAGCATGCTG3251GCCTTGTCCCGGCGATCCGGCCCGAGCTTGTCCCAACGAAATGGTGGCAT3301CTTACACACAGGTGTCCTGCCGATGTTTGCGAGCTGATTCGTGGCGCGTA3351CCCAAAAATCCAGACCGCAAGCCGTGTCCTCCGCTCTTTGTTCTGGGGGG3401AGCCCCCCGTGGGCCAGAAGTTAGTATTTACCCAGGCAGCAAAGGCTGCC3451AACCCTGGTGCAATTACAGTTCATGAGGCCCAGGGTGCTACATTTACTGA3501AACTACTATTATTGCTACAGCAGATGCTCGCGGGCTAATTCAATCCTCCA3551GGGCCCATGCTATCGTGGCCCTGACGCGCCACACAGAGAAGTGTGTGGTT3601ATCGATGCCCCTGGGCTCCTTCGTGAGGTTGGCATTTCCGATGCTATCGT3651CAACAACTTTTTCCTCTCCGGCGGCCAGATTGGTCAACACCGCCCGTCAG3701TTATCCCACGCGGCACTGTTGACAGCAATGTTGACACGCTCGACGCATTT3751CCACCTTCCTGCCAATTCAGTGCCTATCACCAGCTTGCGGAGGAACTAGG3801CCATCGACCAGCCCCAATCGCTGCTGTTCTGCCCCCTTGCCCGGAGCTTG3851AGCAAGGTCTCCTTTATATGCCTCAGGAGTTGGCTACGTCTGATAGTGTG3901CTTACGTTTGAACTGACAGACATAGTGCACTGCCGTATGGCGGCACCCAG3951TCAGCGTAAAGCTGTCCTTTCCACCCTTGTCGGTAGGTATGGCCGCCGCA4001CGAAGCTGTATGAGGCTGCTCATGCGGATGTCCGTGGCTCCCTAAATCAC4051TTTATTCCTGAGCTTAGCCCTATTAGTGTTACCACCTGTGAGCTTTATGA4101GCTTGTAGAGGCTATGGTGGAGAAGGGCCAGGATGGCTCTGCAGTTTTAG4151AGCTTGACTTGTGCAGCCGTGATGTGTCTCGTATAACATTCTTTCAGAAG4201GATTGTAATAAATTTACAACAGGTGAGACGATAGCACACGGCAAGGTCGG4251GCAGGGGATATCCGCGTGGAGCAAGACCTTCTGTGCCCTGTTTGGTCCAT4301GGTTCCGCGCTATTGAGAAGGAGATCCTTGCGGCACTTGCGCCCAACGTA4351TTCTACGGCGACGCATATGAAGATACAGTCCTGGCTGCCGCTGTGGCTGG4401GGCCCCTGGCTGCAAGGTCTTTGAGGACGACTTCTCTGAGTTTGACAGTA4451CTCAAAATAATTTTTCACTCGGGCTGGAGTGTATAATCATGGAGGAGTGT4501GGCATGCCGCAGTGGATGATTCGGCTTTATCATCTTGTCCGCTCTGCTTG4551GGTGCTGCAGGCCCCAAAAGAGTCCCTACGGGGGTTTTGGAAGAAGCACT4601CAGGTGAGCCTGGCACGTTGCTGTGGAATACTGTTTGGAACATGGTGGTT28 4651ATTGCACACTGTTATGAGTTTCGTGATCTGAAAGTTGCAGCATTTAAGGG4701GGATGACTCTGTTGTGCTCTGTAGTGACTACCGGCAAAGCCGTAATGCGG4751CTGCACTAATTGCTGGCTGTGGGTTGAAACTTAAGGTGGACTTTAGACCC4801ATTGGATTGTATGCTGGTGTTGTTGTGGCCCCGGGTCTCGGGACCCTCCC4851TGATGTTGTTAGGTTTGCCGGGCGGCTCTCAGAGAAAAACTGGGGGCCGG4901GCCCAGAGAGGGCGGAACAGCTACGGCTGGCTGTCTGTGATTTTCTACGA4951AAGCTAACGAATGTGGCTCAGGTTTGTGTGGATGGTGTCTCGCAGGTCTA5001TGGTGTTAGCCCTGGCTTAGTACATAACCTGATCGGAATGCTCCAGACTA5051TTGCTGATGGTAAGGCACATTTTACTGAGACAATTAAACCCGTCCTTGAC5101CTTACTAGTTCCATTATATACCGGGTGGAATGAATAACATGTGCTTTTGC5151TCTGTGCATGGAGATGCCACCATGCGCTCTCGGGCTCTTTTGTTTCTGCT5201CCTCGTGTTTTTGCCTATGCTGCCCGCGCCACCGGCCGGTCAGCCGTCTG5251GCCGTCGTCGCGGGCGGCGCAACGGCGGTACCGGCGGTGGTTTCTGGGGT5301GACCGGGTTGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCCCCTATATTCATCCAACCAA5351CCCCTTCGCATCTGACATATCAACCGCCGCCGGGGCTGGAGCTCGCCCTC5401GGCAGCCGGCCCGCCCACTCGGTTCCGCTTGGCGTGACCAATCCCAGCGC5451CCCGCCGCTCCCGCCCGCCGTCGATCTGCCCCAGCTGGGGCTTCGCCGCT5501AACCGCCGTGGCCCCGGCCCCTGACACCGCTCCAGTCCCCGATGTTGATT5551CTCGTGGCGCCATACTACGCCGCCAGTATAATTTATCAACATCCCCGCTC5601ACGTCCACTATTGCTACTGGTACTAATCTTGTTTTGTATGCCGCCCCGCT5651GAGCCCCTTGCTCCCGCTTCAGGATGGAACTAATACTCATATTATGGCCA5701CTGAGGCTTCAAATTATGCCCAGTATCGTGTTGCCCGTGCCACCATCCGG5751TACCGCTCGTTAGTGCCGAATGCTGTTGGTGGGTACGCTATTTCCATCTC5801TTTTTGGCCCCAGACGACAACTACTCCAACATCTGTCGATATGAACTCTA5851TCACCTCCACTGATGTTCGAATTCTTGTCCAGCCCGGTATCGCCTCTGAA5901CTCGTGATCCCTAGTGAGCGCCTGCATTATCGTAATCAAGGTTGGCGTTC5951GGTTGAGACCTCTGGTGTCGCGGAGGAGGAGGCGACCTCTGGTCTTGTTA6001TGCTTTGCATCCACGGATCACCTGTGAATTCCTATACCAATACGCCTTAT6051ACTGGTGCACTTGGCTTGCTTGATTTCGCGCTCGAGCTCGAGTTTCGTAA6101TCTAACACCTGGCAACACGAACACTCGTGTCTCCCGTTATTCGAGCAGTG6151CGCGCCACAAGCTACGCCGTGGACCTGATGGCACTGCCGAATTAACCACT6201ACTGCTGCTACCCGCTTTATGAAAGACCTCCACTTTACAGGGACTAATGG6251TGTTGGTGAGGTTGGTCGTGGTATAGCGTTAACCCTGTTTAACCTTGCTG6301ACACGCTTCTCGGTGGGCTACCGACAGAATTGATTTCGTCGGCTGGTGGA29 6351CAATTGTTTTACTCTCGCCCCGTCGTCTCGGCCAATGGCGAGCCGACAGT6401GAAACTCTACACTTCAGTCGAGAATGCCCAGCAGGATAAGGGTATAGCTA6451TCCCCCACGATATTGATCTTGGTGAGTCCCGAGTTGTCATCCAGGACTAT6501GATAACCAACACGAGCAGGACCGCCCCACCCCTTCTCCGGCTCCTTCCCG6551CCCCTTCTCTGTCCTTCGCGCTAATGACGTGCTCTGGCTGTCTCTTACAG6601CCGCTGAGTACGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACCAATCCTATGTAT6651GTCTCTGACACTGTGACATTTGTTAATGTAGCCACTGGTGCCCAGGGAGT6701TTCCCGCCCTCTCGACTGGTCTAAGGTTACTCTTGATGGGCGCCCGCTTA6751CTACTATCCAGCAATATTCTAAAACATTCTATGTCTTACCTCTCCGTGGT6801AAACTTTCCTTCTGGGAGGCCGGTACTACCAAGGCTGGCTACCCTTATAA6851TTATAATACTACTGCTAGTGACCAGATTCTAATTGAGAACGCGGCTGGTC6901ACCGTGTCTGTATCTCAACTTATACTACTAATCTTGGCTCCGGCCCTGTC6951TCTATTTCTGCTGTCGGTGTCCTCGCACCTCACTCTGCGCTGGCTGCTTT7001GGAGGATACCGTTGATTACCCCGCTCGTGCTCATACCTTTGATGATTTCT7051GCCCTGAGTGCCGTACACTCGGTCTTCAGGGCTGTGCATTTCAGTCAACT7101GTTGCTGAGCTGCAGCGTCTTAAAATGAAGGTGGGTAAAACCCGGGGTA7151TTGATTTATTTTGCTTGTGCCTCCCTTCTGCCTCGTCTCTTTTATTTCTC7201TTTTCTGCGTTCCGCGCTCCCTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA7251AA4.2.5序列分析测序得到的序列去除polyA后全长7252bp，A/T含量为44.88%，C/G为55.12%。测序所得的5’端非编码区有9个碱基，3’端非编码区全长69bp。ORF1全长5124bp，编码1708个氨基酸；ORF2全长2025bp，编码675个氨基酸；ORF3全长345bp，编码115个氨基酸。在ORF1中，第35～389个氨基酸编码甲基转移酶（methyltransferase），第432～592个氨基酸编码半胱氨酸蛋白酶（cysteinepeptidase），第818～910个氨基酸编码木瓜蛋白酶，第988～1198个氨基酸编码解旋酶（Helicase），第1357～1651个氨基酸编码RdRp。4.2.5.1ORF1将测序得到的ORF1序列和国内其他分离株（湖北、上海、广西、新疆、甘肃）进行比对。在核酸水平上，HN-JY40-ORF1和湖北分离株的同源性最高，为93%，与长春、广西、甘肃和上海分离株同源性为82%，与新疆分离株同源性为81%；在氨基酸水平，30 HN-JY40-ORF1与湖北分离株同源性为97%，与上海、甘肃、广西分离株同源性为94%，与新疆和长春同源性为93%。通过比对，HN-JY40-ORF1的第720～789个氨基酸之间为高突变区（图19）。680*700*720HN-JY40-OR:IGLFPPFSPGHAWESANPFCGESTLYTRTWSVSGFSSCFSPPEPC:720hubei.pro:IGLFPPFSPGHAWESANPFCGESTLYTRTWSVSGFSSCFSPLEPR:720shanghai.p:VGLFPPFSPGHSWESANPFCGESTLYTRTCSVSGFSSCFSPLEPG:720xinjiang.p:VGLFPPFSPGHSWESTNPFCGESTLYTRTWSVSGFSSCFSPLEPR:720changchun.:VGLFPPFSPGHSWESTNPFCGESTLYTRTWSVSGFSSCFSPLEPR:720gansu.pro:VGLFPPFSPGHSWESANPFCGESTLYTGTWSVSGSSSCFSPLEPC:720guangxi.pr:VGLFPPFSPGHSWESANPFCGESTLYTRTWSVSGFSSCFSPLEPC:7206GLFPPFSPGHWESNPFCGESTLYTrTwSVSGfSSCFSPlEP*740*760HN-JY40-OR:VPDSSPPVETGVPVAINVPSPTISALPQPPASEQVAPSLDLADSS:765hubei.pro:APDLSPPVETDTPVAINAPPQTISALPQPPASERAAPSLDLVDSG:765shanghai.p:GPDPPPLVETDTSIVADTLPPVVSVPP-----EQIAPLPDPVDKA:760xinjiang.p:APELPPSGHTDMSVVTDTPPLVPPVQTQPQTPGPVASPSDLADGG:765changchun.:APELPPSGDIDMPVTIDTSPSVPLVQTQPPTPGRVAPPPDLVDGG:765gansu.pro:APSVLPPAEANIPVVPNTSPSEITKQAQLPALEPAAPPPDSADSS:765guangxi.pr:IPDTPPPVNINLPNDVPLPVTPVQTQP--PAPEQVAPPLDLPDRG:763PPApDD*780*800*HN-JY40-OR:AAPALPDAPVVPPAPMQPVTRLSGPRRRLLHTYPDGSKVYAGSLF:810hubei.pro:AVSALSDAPVAPPAPVQPVTYLSGSRRRLLHTYPDGSKVYAGSLF:810shanghai.p:AGLTPSSTPVVSPAPVQSVAQSPGPRRRLLHTYPDGSKVYAGSLF:805xinjiang.p:AGPGLTSAPAEPPAPVQLVTQPG-PRRRLLHTYPDGSKVYAGSLF:809changchun.:ASPGLTSVSVEPPASAQPVGQPG-PRRRLLHTYPDGSKAYAGSLF:809gansu.pro:INPIPPSSPAAPPAPVQPVTRLSEPRRRLLHTYPDGSKVYAGSLF:810guangxi.pr:ASPTSTNVLVAPPAPPQSITRLSEPRRRLLHTYPDGSKVYAGSLF:808apPApQ6pRRRLLHTYPDGSKvYAGSLF图19HEV河南分离株HN-JY40-ORF1氨基酸的高突变区（氨基酸水平）Fig.19AminoAcidvriationofHN-JY40straininHenan4.2.5.2ORF2ORF2编码主要的病毒衣壳蛋白，在ORF2结构中有典型的信号肽结构。通过在线软件预测，我们得到ORF2的第1～37个氨基酸为信号肽结构，第20～38个氨基酸为主要的跨膜区；在ORF2氨基酸中有2个N-糖基化位点，分别是第324和576个氨基酸位点。将测序得到的ORF2片段于国内几个分离株的相应片段进行比对，与ORF1相同的是，HN-JY40-ORF2核酸与湖北分离株同源性最高，为94%，与长春、甘肃、广西、新疆分离株同源性则为86%，与上海分离株同源性为85%；相对核酸而言，在氨基酸水平,ORF2比较保守。HN-JY40-ORF2和长春、甘肃、广西、新疆以及湖北分离株的同源性为97%，与上海分离株同源性为95%。31 4.2.5.3ORF3HEV的ORF3片段较小，Ⅳ型病毒的ORF3完全包含在ORF2里。经分析，本实验室得到的ORF3完全包含在ORF2里。将ORF3编码的氨基酸和国内其它分离株相应片段进行比对（图20）。从图中可以看出，HN-JY40-ORF3与湖北分离株的对应片段同源性最高，为96.5%。图20HN-JY40-ORF3与国内其它代表株同源性分析Fig.20AminoacididentityofotherHEVstrainsinChina由此可见，3个ORFs和不管是从氨基酸水平还是核酸水平，都和湖北分离株同源性较高。4.2.5.4基因组水平分析HN-JY40的基因组5’端UTR长9bp，3’端UTR长69bp。ORF3完全“包裹”在ORF2内，ORF3和ORF1之间有一段长28个碱基的序列，ORF1和ORF2有4个碱基的重叠，为典型的Ⅳ型病毒的特点。总结以上信息，我们绘制了HN-JY40的基因组结构示意图（图21）。GenomicRNA5’3’SubgenomicRNAMCpHRORF2ORF3图21:HEV河南分离株基因组结构示意图Fig.21TheorganizationofHN-JY40M:methyltransferase;C:cysteinepeptidase;P:Appr-1-pprocessing;H:HelicasedomainR:RdRp32 4.2.5.5基因组进化分析将HN-JY40和国际上典型的HEV分离株进行比对，比对结果显示，HN-JY40和禽类HEV（AY535004）同源性最低，只有47%，而和我国的2个猪源HEV同源性最高为93%。两个猪源HEV分别为新疆分离株（GU119961）和湖北分离株（GU188851），两者核酸同源性为95%。根据比对结果，构建HEV河南分离株的系统进化树(图22)。由构建的进化树可以看出，HN-JY40是典型的Ⅳ型病毒，和GU119961和GU188851两个病毒株进化关系最近。图22HN-JY40的系统进化树Fig.22PhylogenetictreeofHN-JY4033 5结论和讨论家猪在人们的日常生活中占据着比较重要的位置，是一种重要的经济元素和人类主要的肉食来源。家猪感染HEV后不表现出明显的临床症状，其隐蔽性的感病表型可能给人们的食品及公共卫生安全造成极大隐患。现有的证据足以表明猪戊型肝炎病毒可以通过各种途径传播给人。然而由于认识的不足以及重视不够，河南省猪源HEV的流行情况及发病特点仍未见详细报道。本研究就河南省猪源HEV进行了初步的分子研究，并首次得到了HEV河南分离株HN-JY40的近似全基因组的序列，为下一步实验提供了数据支持，并为河南省的戊型肝炎病毒的研究提供了一定的理论基础。结果显示，HEV抗体的总阳性率达到79.70%，个别地方甚至达到100%。调查发现抗体阳性率的分布有明显的地域分布特征。对采集的猪粪便样品进行病毒RNA检测，阳性率为7.5%。病毒携带率和抗体阳性率差异较大，但都说明HEV在河南猪群中可能广泛存在。对检测到的阳性样品进行抽样测序，测序的4个分离株经分析都为Ⅳ型病毒。分离株JY6、JY40与ZZ9三者同源性较高，而与JY10同源性较低，推测JY10可能是不同的亚型病毒。由于病毒检测得到的序列较短，且各个实验室分析的片段位置和大小都各不相同，因此，分析结果并不能进行很好的说明河南HEV的具体特征。在已有的研究基础上，本实验室通过RT-PCR的方法得到了HEV河南分离株JY40近似全基因组的序列。在已有的数据库中，HEVⅣ型病毒5’端通常有25个碱基，而本实验室得到了9个碱基的序列。考虑到HEV5’端非编码区序列的高度同源性，已有的序列分析基本可以确定HN-JY40的基本特征。测序得到的HN-JY40序列去除polyA后全长7252bp，A/T含量为44.88%，C/G为55.12%。5’端非编码区有9个碱基，3’端非编码区全长69bp。ORF1全长5124bp，编码1708个氨基酸；ORF2全长2025bp，编码675个氨基酸；ORF3全长345bp，编码115个氨基酸。在ORF1中，第35～389个氨基酸编码甲基转移酶（methyltransferase），第432～592个氨基酸编码半胱氨酸蛋白酶（cysteinepeptidase），第818～910个氨基酸编码木瓜蛋白酶，第988～1198个氨基酸编码解旋酶（Helicase），第1357～1651个氨基酸编码RdRp。同源性分析显示HN-JY40和我国国内的2个猪源HEV分离株同源性最高。在我国大陆地区，猪源HEV以Ⅳ型为主，新疆地区有Ⅰ型和Ⅳ型两种基因型。陆一涵等在上海地区猪群中检测到了Ⅲ型HEV病毒。这说明在同一地区会有不同型别HEV病毒并存的可能。本实验研究得到的是Ⅳ型病毒，但不排除河南省仍有其它基因型病毒存在的可能性。越来越多的研究结果表明HEV是一种人兽共患病，由于缺乏合适的模式动物和有效的传代细胞系，HEV的复制及侵染过程至今尚不清楚。随着研究的不断深入，HEV的跨种感[52]染机制将会是各国研究人员下一步研究的重点。孙中锋等人的研究结果表明，长春地区34 人源HEV和猪源HEV具有很高的同源性，同源性超过90%。本实验得到的HN-JY40与人源HEV（AY204877，Ⅰ型病毒）同源性只有74%。由于未对人群HEV进行检测，河南猪源HEV对人的影响还没有直接的数据来说明。HEV主要存在于猪的内脏器官，特别是肝脏部位，也会在血液中暂存，因此食用未加工成熟的猪肉食品可能会增加感染HEV的几率；在我省农村，个别饲养环境简陋，养猪产生的排泄物可能污染地下水源，这也会增加感染HEV的几率。在我省，目前只有医院系统对人源HEV进行检测，而可能是人HEV来源的猪HEV并未引起足够的重视，这给HEV的预防工作带来了一定隐患。据报道，由厦门大学主持研发的HEV疫苗已经完成了临床三期实验。然而，由于基因型别的差异以及抗原漂移的影响，疫苗的实际效果可能会受到影响。因此，HEV短期内仍不会有十分有效的治疗措施。根据目前已有的研究结果，拟展开以下工作研究：一、完成5’RACE的克隆及测序工作，得到完整的病毒基因组；二、以ORF2为诱饵蛋白，研究其靶标位点；三、研究ORF2和ORF3之间的关系及相互作用；四、研究HEV的跨种感染机制。35 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